SU1496266A1

SU1496266A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител против ангиотензин-превращающего фермента из легких человека

Info

Publication number: SU1496266A1
Application number: SU874352832A
Authority: SU
Inventors: С.М. Данилов; Е.Ю. Алликметс; И.Ю. Сахаров; Е.А. Духанина; А.К. Молдобаева; Е.Н. Аточина; И.Н. Трахт
Original assignee: Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР; Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов
Priority date: 1987-12-30
Filing date: 1987-12-30
Publication date: 1991-01-07

Abstract

Изобретение относитс к ,биотехнологии и может быть использовано в медицине и биологин дл вы влени антигена - а«гиотензин - превращающего фермента (АПФ). Цель изобретени - получение нового штамма гиб- ридомы, продуцирующего специфические моноклональные антитела (МАТ) против АПФ из.легких человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (II) № 180Д. Секреци МАТ на 3-4-й день культивировани составл ет 20-40 мкг/мл нультуральной среды и 4-6 мг/мл ас- цитической жидкости. МАТ относ тс к AgGj подклассу и, специфически св зывают АПФ из легких человека. 2 табл.

Description

Изобретение относитс к биотехнологии н может быть использовано в медицине и биологии дл вы влени антигена - ангиотензин-превращаюшего фермента (АПФ).

Цель изобретени - получение нового штаммд гибр}|домы, продуцирую- В(его специфичные моноклональные антитела (МАТ) Лротив АЛФ из легких человека, .

получают следующим образом. Мьшей линии BALB/C иммунизируют .внутрибрюшинным введением 80 мкг аы- гнотензин - превращающего фермента.

вцделенного из ткани легких человека , в 0,2 мл забуференного фосфатами физиологическего раствора (ЗФР), содержащего 30% полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дней иммунизацию повтор ют введением внутрибрююинно 60 мкг антигена в ЭФР без адъюванта. Через неделю мышам ввод т 60 мкг

фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Через 3 ди после этого 1510 клеток селезенки иммун1/ых мьшей гибри- дизируют с 5-10 клеток миеломы X63-Ag8-653 в присутствии 0.,7 мл раствора, содержащего 4555 (об./об.)

3149

полиэтиленгликол (ЮГ) мол, массы 3,350 и 15% диметилсульфоксида в течение i мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа, клетки высевают в 96-луночные панели по 210 клеток в лунку. Дл культивировани и селекции гибридов используют среду RPMI-I640 с добавлением 10%-ной лошадиной и 10%-ной тел чьей эмбрио- нальной сыворотки, 10 М гипоксантина , А- Ю М аминоптерина и 1, тимидина. Гибриды - продуценты клонируют 2 раза методом конечных разПродукци антитела сохран етс как минимум в течение 20 пассажей в

ведений, высева по I клетке в лунку, 15 культуре, стабильна секреци сохрасодержащую 4-10 клеток селезенки. После 2-го клонировани практически 100% субклонов продуцируют антитела к АПФ.

Получен В)1Й штамм обозначают А-АСЕ- 20 ЗА5, он хранитс в специализированной крллекции перевиваемых соматических JcneroK позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(Ы) № 180Д и характеризуютс следующими 25 признаками.

Культуральиые признаки. Стандартные услови культивировани . Дп вы- рапшвани используют пластиковую посуду - среда RPMI-I640 с добавлением 10%-ной тел чьей эмбриональной сыворотки и 10%-ной лошадиной сыворотки , 4 мМ L-глютамина, 10 i пиру- вата натри , 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокис- лотаки дл базальной среды Игла и 0,05 мМ меркаптоэтанола, при в атмосфере 5%-ной углекислоты.

Посевна доза 10-10 клеток в мл, Клетки пассируют в дозе 10-100 тыс. 1 раз в 5 дней, или в дозе ЮОоТЫС, и 5олее 1 раз в 3 дн . Культура сус- пенэиоина , в микрообъемак может выращиватьс --как монослойна .

н етс до 8-го пассажа in vitro и при культивировании в виде асцитной опухоли,

Криоконсервирование,

Дл длительного хранени гибри- домные клетки могут быть заморожены в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10%-ного диметилсуль- . Режим замораживани в минуту до , затем l в минуту до -40 С, затем клетки перенос т в жидкий азот. Размораживают клетки, перенос ампулу из жидкого азота в

lO.

30

35

40

вод ную баню на 37 С.

Контаминаци .

Контаминаци бактери ми, грибками и микоплазмой не обнаружена.

Использование штамма иллюстрируетс следующими примерами.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковьй флакон площадью 25 см по 5 IО в 5 мл среды RPMI-1640 с 10%-ной эмбриональной тел чьей сывороткой, 10%-ной лошадиной сывороткой, 4 кМ глютамина, 10 мМ пирувата натри 100 мкг/мл пенициллина , 100 мкг/мл стрептомицина и 0,03 мМ меркаптоэтанола, клетки культивируют 3-4 дн при в 45 мосфере, содержащей 5% СО. Дп получени асцитной опухоли 2-5-10 гиб- ридомных клеток ввод т в брюшную полость мьш1ей BALB/C, обработанных пристаном. Через 2-3 недели собирают

Дл выращивани гибpидo &l в асцитной форме клетки ввод т в брюшную полость мышей BALB/C, обработанных за 10 дней до инъекции пристаном, в

количестве 2-5-10 клеток в I мл cpe ды Игла на мьш1ь. Опухоли развиваютс у мышей через 12-15 дней. Продуктивность . Секреци МАТ на 3-4-й день культивироваки в зависимости от посевной дозы составл ет от 20 до 40 мкг/мл культуральной среды и 4- 6 мг/мл асцитической жидкости (кон- -цвнтрации определ ют методом торможени иммуноадсорбции).

Характеристика полученного продукта - штлмм продуцирует моноклональное антитело, относ щеес к IgG подклассу и св зывает АПФ легких человека, не затрагива его активный центр. Специфичность взаимодействи МАТ с АПФ вы вл ют в твepдciфaзнo радиоиммунном или иммуноферментном анализах или методами, основанными на определении активности фермента

Стабильность продукции.

Продукци антитела сохран етс как минимум в течение 20 пассажей в

культуре, стабильна секреци сохра0 5

Криоконсервирование,

lO.

0

5

0

Q асцитную жидкость,

вод ную баню на 37 С.

Контаминаци .

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковьй флакон площадью 25 см по 5 IО в 5 мл среды RPMI-1640 с 10%-ной эмбриональной тел чьей сывороткой, 10%-ной лошадиной сывороткой, 4 кМ глютамина, 10 мМ пирувата натри 100 мкг/мл пенициллина , 100 мкг/мл стрептомицина и 0,03 мМ меркаптоэтанола, клетки культивируют 3-4 дн при в 5 мосфере, содержащей 5% СО. Дп получени асцитной опухоли 2-5-10 гиб- ридомных клеток ввод т в брюшную полость мьш1ей BALB/C, обработанных пристаном. Через 2-3 недели собирают

и иммуноглобулины осаждают сульфатом натри « Осадок раствор ют в 0,2 М боратном буфере (рН 8,1) с 0,15 М NaCl и диали- зуют против того же буфера., Полу- 5 ченные антитела используют как реагент дл излучени специфичности взаимодействи антитела с ангиотензин- превращающим ферментом легких чело- .

а. Elisa метод:

На полистироловую 96-р.чеечную панель дл микротировапи сорбируют АФП - 1 мкг на чейку в 50 мкл карбонатного буфера (100 мМ, рН 9,6) при в течение ночи. После насыщени панели 0,2%-иым раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА), дл уменьшени неспецифического св зывани антител пластиком, в чейки панели внос т 50 мкл асцитной жидкости штамма А-АСЕ-ЗА5 с концентрацией белка 1, 10, 100 мкг/мл (1 ч, 37°С).

бент (10 мкл сорбента - 5 мкг ЛПФ) и 200 мкл низкоемкой целлюлоп1 1. Дл -меньшенн неспецифического с св зывани сорбент обрабатывают

0,2%-ным раствором БСЛ в ЗФГ. Через 10-15 мин сорбент осаждают центрифугированием , супернатант сливают, В пробирки в объеме 250 мкл внос т 10 иммуноглобулины в ЗФР-БСА в различной концентрации, выделенные из асцитной жидкости мышей BALB/C, которым введены клетки штамма A-ACE-3G8 A-ACE-5F1, А-АСЕ-9В9, А-АСЕ-ЗА5. Че

После этого панель отмывают 4 раза по 5 рез 30 мин инкубации при комнатной

100 мкл ЗФР с 0,2% БСА и 0,05% Твин-20 и внос т конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мы- ши, ковалентно св занных с перокси- даэой (2 мкг/мл, , I ч).После окончани инкубации несв завшиес продукты реакции отмывают указанным вьше способом, а св завтуюс-е перокси даэу, а эначит и антитела против АПФ определ ют количественно по расщеплению субстрата () в присутствии хромогена - ортофенилендиами- на. Положительна реакци про вл етс коричневым окрашиванием и просчитываетс при А90 нм.

П р и м е р 2. Тест на специфичность взаимодействи МкАТ с АПФ в растворе.

На полистнроловую 96- чеечную панель дл микротитровани сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов ыши: 100 мкл на чейку в концентрации 20 мкг/мл ( ночь), затем после забивки плашки 0,2% раствором БСА в ЗФР, дл уменьшени неспецифического св зывани антител с пластиком, сорбируют иммуноглобулины мьпни из асцитной жидкости штамма А АСЕ-ЗА5, полученной как указано в примере I. После отмывки панели 0,2% раствором БСА в ЗФР от несв завшихс иммуноглобулинов, в чейки внбс т раствор АПФ (100 мкл, концентраци фермента 7 мкг/мл). АПФ, св завшийс с моноклональным антителом, вырабатываемым штаммом А-АСЕ-ЗА5, определ ют количественно в чейках ;дп микротировани с помощью флуоресцентного метода.

Результаты опыта представлены в табл. 1.

ПримерЗ. В маленькие пробирки дл гамма-счета внос т АПФ-сор962666

0,2%-ным раствором БСЛ в ЗФГ. Через 10-15 мин сорбент осаждают центрифугированием , супернатант сливают, В пробирки в объеме 250 мкл внос т 10 иммуноглобулины в ЗФР-БСА в различной концентрации, выделенные из ас- цитной жидкости мышей BALB/C, которым введены клетки штамма A-ACE-3G8, A-ACE-5F1, А-АСЕ-9В9, А-АСЕ-ЗА5. Четемпературе в эти пробирки внос т мо- ноклональные антитела, вырабатываемые клетками штамма ЗА5, меченные изотопом 1 , с удельной активностью

30010 срп/мкг белка антител. Через 1 ч несв завшиес иммуноглобулины отмывают 0,2%-ным раствором БСА в ЗФР и количество св |авшихс меченых антител просчитывают в счетчике радиоактивности (табл. 2).

Результаты этого примера, представленные в таблице, однозначно свидетельствуют, что антитела, вырабатываемые клетками А-АСЕЗА5 , взаимодействуют с эпитопом на молекуле АПФ, отличным от эпитопов, распознаваемых антителами, вырабатываемыми клетками штаммов A-ACE-3G8, А-АСЕ 9В9, А-АСЕ 5FI.

Результаты приведен} « гх примеров свидетельствуют о 1 ысокой с11спифич- ности св зывани моноклонального лн- тйтела, вырабатываемого клетками штамма А-АСЕ ЗА5, с АПФ, что может

быть использовано при определении и вы влении АПФ как в иммобилизованном состо нии, так и в растворе. Кроме того, обнаружение еще одно антигенной детерминанты на молекуле АПФ,

вы вл емой антителом, вырабатываемым клетками штамма А-АСЕ-ЗА5, позволит начать работы по антигенному картированию молекулы АПФ, что важно дп исследоваЛгУт регул ции активности АПФ и лечени гипертонии.

Claims

Формула изобретени

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(II) № 180Д - продуцент моноклональных антител, протнв ангиотензннпревра- щающего фермента из легких .

Таблица

Специфичность МАТ, вырабатываеьых штаммом А-АСЕ-ЗА-5, против АПФ из легких человека

Таблица 2

Специфичность моноклональных антител против АПФ

Концентраци немеченых антител, мкг/мл

425 Св зывание

меченых антител ЗА5 с АПФ-сорбен- том (имп/мин)