SU1402617A1 - Способ получени моноклональных антител к легким @ -Цеп м иммуноглобулинов человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  диагностики аутоиммунных заболеваний человека. Целью изобретени   вл етс  повышение чистоты целевого продукта путем использовани  в качестве источника моноклонапьных антител (МКА) штамьюв гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ЗД5Е4 или 6Е7Д7. Штаммы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 получают гибридизацией спленоцитов мышей BALB/C, иммунизированных легкими д&- цеп ми иммуноглобулинов человека, с клетками миеломы X63-Ag 8-653. Оба штамма культивируют на среде RPMI 1640 с добавлением 10% донорской тел чьей сыворотки, пассируют один раз в 3-4 дн  с кратностью рассева 1;10. Способ осуществл ют, культивиру  штаммы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 в питательной сред е, выдел   целевой продукт и тестиру  его на специфическое взаимодействие с. легкими ее-цеп ми иммуноглобулинов человека. Повышение чистоты целевого .продукта достигаетс  использованием в качестве партнера дл  гибридизации при получении штаммов ЗД5Е4 и 6Е7Д7 . миеломы X63-Ag 8-653, не продуцирующей иммуноглобулинов или их легких цепей. 1 табл.

Description

4iii О

ьа

Р)

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  диагностики аутоиммунных заболеваний человека,

Цель изобретени  - повьппение чистоты целевого продукта.

Способ заключаетс  в том, что в , качестве источника моноклональных антител используют штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ЗД5Е4 или штамм гибридных культивируемых клеток животных: Mus musculus 6Е7Д7.

I Штамм ЗД5Е4 получают следующим .об-

разом.

; { Ьзцпей линии-BALB/C иммунизируют ; внутрибрюшинным введением 100 мкг легких -цепей человека, вьщеленных из мочи в 6,5 мл физиологического I раствора, забуференного фосфатами I (ЗФР) (5 мМ Na-фосфатньш буфер, рН ; 7,2-7,4, 150 мМ NaCl) без адъюванта, I Иммунизацию повтор ют через 40 дней, I ввод  внутрибрюшинно 100 мкг легких I -цепей (препарат Lk) в ЗФР без адъ- юванта. Через 3 дн  после этого 1 ч

в

: ;tlO клеток селезенки иммунных мьшей гибридизуют с 6-10 клеток миеломы мьшш X63-Ag 8-653 с помощью 0,4 мл 45%-ного раствора полиэтиленгликол  (ПЭГ) мол. массы 2000, содержащего 10% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмьшки : клеток от ПЭГа клетки высевайт в |96-луночные панели по 2-10 клеток, . в лунку. Дл  культивировани  и селекции гибридов используют среду RPMI- 1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% тел чьей эмбриональной сыворотки 10 М гипоксантина, 4-10 М аминопте рина и 1,6-10 М тимидина.Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высева  по I клет ке в лунку, содержащую 4-10 клеток селезенки. После двутс клониройаний практически 100% субклонов продуцируют антитела к легким,ф-цеп м иммун у-лобулинов человека.

Наиболее продуктивный клон вывод  S массовую культуру и обозначают ДЗЕ4. Штамм ЗД5Е4 хранитс  в специ- 4лизированной коллекции перевиваемых Соматических.клеток позвоночных Ин- . с|титута Цитологии АН СССР под номеро В;СКК(П) 72Д и характеризуетс  сле- ющими признаками.

0

5

Q

5

5

0

0

0

Культуральные приз.наки.

Среда культивировани  - среда RPMI-I640 или DMEM с 10% донорской тел чьей сыворотки, 4 мМ L-глутами- на, 100 мкг/мл пенициллина, 100мкг/мл стрептомицина, 0,05 Ш меркапто- этанола. Дл  выращивани  штамма используют пластиковую лосуду, посевна  доза 10 Кл/мл, клетки выра- щивают при 37°С в атмосфере 5% COg, пассируют один раз в 3-4 дн , кратность рассева 1:10. Культура суспензионна .

Дл  вьфащивани  асцита пригодны мьшги BAI3/C. Мьшам за 7-30 дней до инъекции клеток ввод т внутри- брющинно 0,5 мл пристана.

Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5-10 Кл/мл среды Игла. Асцит формируетс  через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреци  моноклональных антител (МКА) на 34день культивировани  составл ет 10- 15 мкг/мл культуральной среды и 35мг/мл асцитической жидкости. Продукци  антител сохран етс  до 20 пассажей in vitro и 3 in vivo.

Характеристика полезного продукта МКА ЗД5Е4 относ тс  к IgM классу.Они специфически св зываютс  с легкими эе-цеп ми иммуноглобулинов человека.

Контаминаци .

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и по характеру включени  тимидиновой метки.

Криоконсервирование.

Дл  длительного хранени  клетки штамма замораживают в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживани ; 4 с в минуту до 4 С, затем I С в минуту до . После замораживани  клетки перенос т в жидкий азот. Размораживание на вод ной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживани  70-80% по окрашиванию трипановым синим.

Штамм 6Е7Д7 получают следующим образом .

Мышей линии BaLB/c иммунизируют внутрнбрюшинным введением i 00 мкг легких ее-цепей человека, выделенных из мочи в 0,5 мл физиологического раствора , забуференного фосфатами (ЭФР)

(5 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4, 150 bdt KaCl), без адъюванта. Иммуни- ациго повтор ют через 40 дней, ввод  . нутрибрюшинно 100 мкг легких ее-цепей j (препарат Lk) в ,ЗФР без адъюванта. ерез 3 дн  после этого 1-10 клеток селезенки иммунных мышей гибриди- зуют с 6-10 клеток миеломы мьши X63-Ag 8-653 с помощью 0,4 мл 45%-но-10 го раствора полиэтиленгликол  (ПЭГ) мол. массы 2000, содержащего 10% ди- метилсульфоксида, в течение 1 мин, После гибридизации и отмьшки от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели 15 по 2-10 клеток в лунку. Дл  культивировани  и селекции гибридов используют среду BPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% тел чьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксанти-20 на, 4-10 М аминоптерина и 1 6-10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высева  по I клетке в лунку, содержащую 4-10 клеток селезенки. После 25 двух клонирований практически 100% субклонов продуцируют антитела к лег- . КИМ де-цеп м иммуноглобулинов человека . Наиболее продуктивный клон вывод т в массовую культуру и обозначают 30 6Е7Д7. Штамм 6Е7Д7 хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 71Д и характеризуетс  следу- 35 ющими признаками.

Культуральные признаки. Среда культивировани  - среда RPMi-i640 или DMEM с 10% донорской тел чьей сыворотки, 4 мМ Ъ-глутами- 40 на, 100 мкг/мл пенициллина, 100мкт/мл стрептомицина, 0,05 Ш меркаптоэтано- ла. Дл  выращивани  штамма используют пластиковую посуду, посевна  доза 10 Кл/мл, клетки выращивают при 37°С 45 а, атмосфере 5% СО, пассируют один раз в 3-4 дн  кратность рассева 1:10, Культура суспензионна . Дл  выращивани  асцита пригодны мыши BALB/c. МмА, шам за 7-30 дней до инъекции клеток JQ штамма ввод т внутрибрюшинно 0,5 мл . пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 -10 КЛ/МЛ среды Игла, Асцит формируетс  через дней.

Продуктивнбсть штамма. Секреци  моноклональных антител (МКА) на 34 день культивировани  составл ет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости Продукци  антител сохран етс  до 20 пассажей in vitro и 3 in vivo.

Характеристика полезного продукта, МКА 6Е7Д7 относ тс  к Ig61 классу. Они специфически св зываютс  с легкими эе-цеп ми иммуноглобулинов человека.

Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и по характеру включени  тимиди- новой метки.

Кр оконсервирование. Дл  длительного хранени  клетки штамма замораживают в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживани : в минуту до 4 С, затем 1 С в минуту до -40 С. После замораживани  клетки перенос т в жидкий азот. Размораживание - на вод ной бане при З7 с. Жизнеспособность клеток после размораживани  70- 80% по окрашиванию трипановьпч синим.

П р им ер. Гибридомнь1е клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 кв.см по 5-10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной тел чьей сывороткой, 4 мМ глютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл

стрептомицина, 0,05 мМ.меркаптоэтано- ла. Клетки культивируют 2-3 дн  при 37 С в атмосфере 4% СО. Получеиньй супернатант используют в качестве

реагента в ш мунологических реакци х

(как препарат МКА). МКА тестируют с

помощью радиоиммунного аналнза.

На полистирольные 96- чеечныё панели дл  микротитровани  сорбируют антиген - 2 мкг на  чейку в 100 мкл ЗФР при 4 С в течение ночи. После на- сьш1ени  панелей 0,05%-ным раствором Твин-20 в ЗФР дл  уменьшени  неспецифического св зывани  антител с пластиком , в  чейки внос т по 100 мкл

культуральной среды штаммов ЗД5Е4 и 67ДЕ7 к инкубируют 1 ч при . После этого панели отмьшают три раза по 250 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 и внос т кроличьи антимышиные антитела меченые I по методу Бейл  и др. (препарат с удельной активностью 1,1-10 срт на мкг, по 0, орт в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 на

лунку дл  штамма 67ДЕ7 к с активностью 0,9-10 срт на мкг, по 0,2 : 10 срт в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 на лунку дл  штамма ЗД5Е4),

После инкубации в течение 1 ч при панель.промьгоают ЗФР с 0,05%-ным   просчитывают на счетчике.

Результаты исследований представлены в таблице (цифры приведены за йычетом сорбции меченых антител после инкубации антигена с нормальными им- йуноглобулинами мыши),

: Реззтаьтаты приведенные в таблице, Свидетельствуют о том, что МКА ЗД5Е4 6Е7Д7 специфически взаимодействуют 4 легкими es-цепнми иммуноглобулинов Человека.

I Повышение их чистоты достигаетс  9ja счет того, что в качестве партне- р|а дл  гибридизации при получении С., mlraMMOB ЗД5Е4 и 6Е7Д7 используют ли , нию X63-Ag8-653, не синтезирующую иммуноглобулинов или их легких цепей,

Claims (1)

1. Формула изобр е тени 

   Способ получени  моноклональных антител к легким ае-цеп м иммуноглобулинов человека, заключающийс  в культивировании гибридомы в питательной среде с последующим вьщелением и очисткой целевого продукта, о т л и ч а- ю чц и и с   тем, что J, с целью повьше- ни  чистоты целевого продукта, в качестве гибридомы используют штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus, musculus BCKK(n)N7lD или штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus, musculus BCKK(n)N72D,

   IgG3 Н&т(зе) IgG4,Tar(«6) IgM В en (50) IgE(se) Ig A2()

   окрашивани  нет

   4- -I- -(Ig A к) Ig ) IgG3 ИЛ(5&) IgG4 ЖБЛ() IgGA БРО(э&) IgM. БОБ(эе)

   Качественные данные получены методом ELISA с применением конъюгата пероксидазы с кроличьими антимышиньщ , антителами.

   Н.И

   н,и

   Н.И Н.И,