SU1384614A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток мыши мUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к урокиназе человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  выделени , очистки и определени  урокиназы в биологических жидкост х. Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши MUS musculus, продуцирующего моноклрнальные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повышенной константой св зывани  с антигеном и взаимодействующие с двум  молекул рными формами фермента. Штамм UIG получают гибридизацией спленоци- тов мышей линии Balb/c, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы X63-Ag8.653. Он хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером BCKK(n)35D и характеризуетс  следукнцими признаками. Среда дл  культивировани  - среда RPMI-1640 с 10% змбриональной тел чьей и 10% лошадиной сыворотки, посевна  доза 10 кл. в 1 мл, кратность рассева 1:10 каждые 3-4 дн , культура суспензионна . Штамм перевиваетс  в виде асцита на мышах линии Balb/c не менее 3 раз. Содержание МА в куль- туральной жидкости на 4 день культивировани  составл ет 20-30 мкг/мл, в зрелом асците - 2-3 мг/мл. МЛ отно- с тс  к классу 1 G, t(K-5, имеют кон- S станту св зьгоани  с ант йгеном , ингибируют активность урокиназы, взаимодействуют с двум  ее молекул рными формами. МА используютс  дл  определени  и очистки урокиназы. I л СлЭ 00 4 а

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  выделени ,, очистки и определени  урокиназы в биологических жидкост х.

Цель изобретени  - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повышенной константой с в зывани  с антигеном и взаимодействующие с двум  молекул рными формами фермента.

Штамм получают следующим образом.

Мышам линии Balb/c провод т 3 еже- . недельные подкожные иньекции урокиназы из расчета 30 мкг фермента на мышь.Иммунизацию провод т смесью высоко- и низкомолекул рных форм фермента . Перва  иммунизаци  осуществл етс  в полном адьюванте Фрейнда, втора  и треть  - в неполном. Четвертую иммунизацию провод т внутрибрю- шинно, введением 50 мкг урокиназы в физиологическом растворе за 3 сут до гибридизации. Гибридизацию провод т сли нием 10 клеток селезенки иммунных мышей с 4-10 клеток миеломы ХбЗ - Ag 8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликол  с мол. массой 1500 усл. ед. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. Дл  культивировани  и селекции гибридом используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной тел чьей сыворотки , 10% лошадиной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М тимидйна. Гибриды - продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высева  по 1 клетке на лунку. После второго клонировани  более 90% полученных субклонов продуцируют антитела к урокиназе.

Продуктивные субклоны вывод т в массовую культуру и ббозначают UIG. Штамм UIG хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П 35D и характеризуетс  следующими признаками .

Культуральные признаки.

Среда дл  культивировани  - среда с добавлением 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 10% ло- п адиной сыворотки, 4 мМ Ь-гл.утамина 100 ед/мл пенициллина, ТОО мкг/мл стрептомицина, 10 пирувата натри 

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

0,05% меркаптоэтанола при в атмосфере 5% CO-J . Посевна  доза 10 клеток в 1 мл. Клетки пассируют раз в 3-4 дн , кратность рассева 1:10. Культура суспензионна .

Клетки штамма иньецируют в/брюшин- но в количестве 10 кл в 1 мл среды. Игла мышам линии Balb/c, предварительно обработанных пристаном. Асцит образуетс  12-16 дней. Штамм перевиваетс  на мьш1ах не менее 3 раз.

Продуктивность штамма.

Содержание моноклональных антител в культуральной жидкости на 4 день культивировани  составл ет 20-30 мкг/ /мл культуральной среды, а в зрелом асците - 2-3 мг/мл асцитической жидкости .

Контаминаци .

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.

Характеристика целевого продукта.

Моноклональные антитела относ тс  к классу In G , (К-) , имеют константу св зывани  с урокиназой человека 10 М , ин гибируют активность данного фермента, взаимодействуют с его двум  молекул рными формами.

Криоконсервирование клеток штамма.

2-10 клеток консервируют в 1 мл тел чьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ведут по следующей схеме: снижают температуру до 4°С, а затем по 1 С в мин до -40°С. Клетки хран т в жидком азоте. Размораживают быстро при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживани  составл ет 70-80%.

Использование штамма UIG иллюстрируетс  следунлцими примерами.

Пример 1. Клетки штамма UIG помещают в пластиковый флакон объе- мом 75 см по 5- 10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 ед/ /мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина , 10 мМ пирувата натри , 0,05% меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% СО. Клетки культивируют 4 дн . Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение 10 мин при

800 g. Супернатант тестируют на присутствие антител к урокиназе по следующей схеме: 100 мкл раствора высо- комолекул рной либо низкомолекул р- ной урокиназы с концентрацией 10 мкг /мл внос т в  чейки полистиролового планшета дл  иммунологического анализа и инкубируют при 4 С в течение 12-15 ч. Затем планшет промывают 10 мМ фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05%-Твин-20 (раствор А). В  чейки с сорбированной на полистироле урокиназой внос т по 100 мкл культуральной среды и ин- кубируют 1 ч при комнатной температуре , после чего отмывают от несв завшегос  белка раствором А. Специфично св завшиес  антитела вы вл ют с помощью меченных радиоактивным I (удельна  активность 100000 имп/мин fMKr) кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, добавл   их по 2 мкг в лунку в 100 мкл раствора А. В качестве отрицательного контрол  используют препарат неиммунных иммуноглобулинов мьши вместо культуральной среды штамма.

Радиоиммунологлческий анализ культуральной среды штамма UIG на присут- ствие антител к урокиназе следующий.

Анализируемый Св залось антиобразец тел кролика против иммуноглобу- . линов мыши, имп/ /мин

Культуральна  среда штамма

высокомолекул рна  форма

урокиназы низкомолекул рна  форма

урокиназы Неиммунные иммуноглобулины

J5 0 5

Q

5

0

5

мьшш (2U мкг/

/мл) (контроль)

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности полученных МЛ при взаимодействии их как с высоко- так и с низкомолекул рной формами урокиназы .

П р и м е р 2. 100 мл культуральной среды, полученной по примеру 1, нанос т на колонку с иммобилизованными кролич-ьими антителами против иммуноглобулинов мыши, колонку промывают раствором А (см. пример 1) и злюируют специфично св завшиес  антитела к урокиназе глициновым буфером рН 2,8. Получают 2 мг препарата очищенных антител к урокиназе, которые иммобилизуют на сефарозе 4В по стандартной методике с использованием бромциана. На 100 мкл иммуносорбента, содержащего 2 мг антител/мл гел , нанос т 0,5 л человеческой мочи, промывают сорбент раствором А и элюируют фермент глициновым буфером рН 2,8. Анализ содержани  фермента в элюате провод т на фибриновых пластинках, содержащих плазминоген. 100 мкл иммуносорбента с 90%-ной эффективностью св зывают в данных услови х всю уро- киназу, содержащуюс  в моче. Конечный выход фермента, очищенного в одну стадию, составл ет не менее 60%, удельна  активность препарата составл ет 150000 МЕ/мг, что соответствует гомогенному препарату урокиназы. Электрофорез показывает, что на иммуносорбенте выдел ютс  и низко- и высокомолекул рные формы урокиназы .

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм Гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus BCKK(n)N35D, используемый дл  получени  монокло- нальных антител к урокиназе человека.