SU1446154A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл .очистки рекомбинантного интер- лейкина- 2 (РШ1-2) человека. Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к мембранному белку Е.соИ м.м. 45 кД, содержащемус  в препарате частично счищенного РИЛ-2 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, .иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы X63-Ag.B-653. Штамм продуцирует МКА в концентрации 25-30 мкг/мл культу- ральной среды и 10-12 мг/мл асцити- ческой жидкости. МКА относ тс  к классу IgGi. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком E.coli 45 кД. Содержание примесного белка E.coli в РИЛ-2 человека после очистки на сорбенте, содержащем по- .лученные МКА, составл ет 10%.1 табл. i (Л

Description

с

05

сл

4

11А

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  очистки рекомбинантного интерлейки- на-2 человека.

Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к мембранному белку E.col м.м, 45 кД, содержащемус  в препарате частично очищенного рексмбинантно го интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека.

Штамм получают следующим образом,

Мышей линии Balb/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД РИЛ-2 человека в 0,15 мл 0,15 М NaCl в-смеси С равным объемом полного адьюванта Фрейнда, Иммунизации повтор ют 3 раза через 14 дней тем же ко- личеством антигена в смеси с неполным адьювантом Фрейндаг За 3 дн  до сли ни  РИЛ-2 ввод т внутрибрюшинно 0,S мл 0,15 М NaCl, Гибридизацию 1x10 клеток селезенки иммунных мы- шей и 3x10 клеток миеломы мыши X63-Ag: .8-653 провод т 50%-ным раствором полиэтиленгликол  мол,массы 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида, в течение 1,5 мин. После гибридиза- ции и отмывки клеток от полиэтилен- гликол  клетки высевают в 96-луноч- ные панели по 1x10 спленоцитов в . лунку. Дл  культивировани  и сапе:кци гибридом, используют среду 1МДМ(мо- дифицированна  Iskove s среда Дуль- бекко) с добавлением 10 эмбрионал - ной тел чьей сыворотки (ЭТС), гипоксантина, 4x10 М аминоптерина и 1, тимидина, Ги6риды проду- центы клонируют 2 раза методом конечных разведений, высева  по 1 клетке в лунку, содержащую 4x10 клеток селезенки . После 2 клонирований практически 100% субклонов продуцируют МКА к антигену E,coli,

Наиболее продуктивный, штамм вывод т в массовую культуру и обозначают 22А1,2, Штамм 22А1,2 хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоноч- ных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) N 112Д, и характеризуетс  следующими признаками,

Культуральные признаки. Среда культивировани  - среда-ТМДМ с 10% донорской тел чьей сыворотки, 2 мМ L-гнютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ

с 0 5 0 д

5

5

542

меркаптоэтанола, при и в атмосфере 3% СО 7.

Дл  выращивани  штамма используют стекл нную посуду, посевна  доза 200 тыс. клеток на 1 мл клетки пассируют один раз в 2-3 дн , кратность рассева 1:6 , 1:8,

Культура суспензионна .

Культивирование в организме животных . Дл  выращивани  асцита пригодны мыши Balb/c, Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма ввод т внутрибрюшиннно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-540 клеток в 1 мл среды 1МДМ, Асцит формируетс  через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреци  моноклональных антител на 2-3 день культивировани  составл ет 25-30 мкг в 1 мл культуральной среды и 10- 12 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полезного продукта . Штамм продуцирует моноклональные антитела изотипа IgGI. Специфичность - мембранный белок E,coli с мол,массой 45000, содержащийс  в пре парате РИЛ-2 человека. Методы оценки сохранени  специфичности; тест на св зывание МКА с иммобилизованным частично очищенным РИЛ-2 (иммунофер- ментный анализ).

Продукци  МКА- сохран етс  как ми- )нимз до 10 пассажей in vitto, В асцитной форме штамм не пассируетс  более одного раза.

Контаминаци , Бактерии и грибы в культуре 1(не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено по характеру включени  тимидиновЪй метки,

Криоконсервирование, Дл  длительного хранени  , клетки штамма замораживают в эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида . Режим замораживани ; 1 С в 1 мин до -70°С, После замораживани  клетки перенос т в жидкий азот. Размораживание - на вод ной бале при . Жизнеспособность клеток после размораживани  70-80% по окрашиванию трипановьм синим.

Пример 1, Гибридомные клетки помещают в стекл нный ф.пакон объемом 50 мл по 1x10 клеток в 5 мл среды 1МДМ с 10% ЭТС, 2 мМ ь-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина , 0,05 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Клетки культивируют 2-3 дл  при в атмосфере 5% СО. Полученный супер- натант используют в качестве реаген- g та в иммунохиьшческих реакци х (как препарат МКА),

Антигены высушивают в лунках 96- чеечных микроплат при 37°С или 20 С в следующих количествах: частич- ю но очищенный РИЛ-2 (150 нг в 20 мкл бидистиллированной воды) мембранна  фракци , растворимые белки E.coli и бычий сывороточный альбумин (ЕСА) - по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной 15 воды. После отмывок в  чейки внос т по 50 мкл культуральной среды штам- ма 22А1,2. Панель инкубируют 2 ч при , затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой к внос т по 20 50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченые перок:сидазой, разведенные 1/2500 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 1% БСА

сутствии додецилсульфата натри  (ДСН-ПААГЭ) провод т с использован ем аппарата дл  вертикального элек рофореза. 10 мкг РИЛ-2 в буфере дл образца, содержашем или не содержа Мэ (редуцирующие и нередуцирующие услопи ) и эквивалентное количеств лизата E.coli в буфере дл  образца с Мэ I прогревают 2 мин при 100°С и нанос т в  чейки гел . Электрофо рез осуществл ют при посто нной си ле тока 50 мА.

Электроперенос разделенных комп нентов из гел  на нитроцеллюлозу (НЦ)-с диаметром пор 0,45 мкм пров д т в течение 1 ч. После переноса промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набор дл  иммуноблотинга. Неспецефическу сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС буфере рН 7,4 с 0,5 М NaCl (ТБР), содержащем 3% же латины. После этого НЦ промывают

(ЗФР-БСА). После инкубации в течение 25 2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР)

1 ч при 20°С плату отмывают и в лунки добавл ют субстрат - ортофенилен- диамин гидрохлорид (0,6 мг/мл) в цитратно-фосфатном буфере рН.4,7, содержащем 0,09% ) о Реакцию оста- зо навливают через 10 мин Ш . серной кислотой и учитывают на спектофото- метре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты исследований представлены в таблице

и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДНС-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих усло ви х и лизата E.coli, помещают в стекл нные пробирки емкостью 15 мл и добавл ют 10 мл супернатанта ККА 22А1.2.

Инкубацию с ЖА продолжают 2 ч при 20°С на . аппарате с горизонтал ным перемешиванием. После этого НЦ

35 отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, одо бавл ют козьи антимышиные антитела разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20°С с переме шиванием. После 2 отмывок ТТБР и о ной отмьшки ТБР реакцию про вл ют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор-1-нафтол и 0,015% , в т чение 20 мин. Дл  хранени  и фотографировани  НЦ промывают в дистил

Антигены

Культурапьна  среда щтам- ма 22А1.2 А492, х 10

2143

509

1573

171

Результаты, представленные в таблице , свидетельствуют о высокой спе- 55 эффективно использованы дл  очистки

цифичности МКА полученного штамма к мембранному белку E.coli,

П р и М е р 2. Электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натри  (ДСН-ПААГЭ) провод т с использованием аппарата дл  вертикального электрофореза . 10 мкг РИЛ-2 в буфере дл  образца, содержашем или не содержаще Мэ (редуцирующие и нередуцирующие услопи ) и эквивалентное количество лизата E.coli в буфере дл  образца с Мэ I прогревают 2 мин при 100°С и нанос т в  чейки гел . Электрофорез осуществл ют при посто нной силе тока 50 мА.

Электроперенос разделенных компонентов из гел  на нитроцеллюлозу (НЦ)-с диаметром пор 0,45 мкм провод т в течение 1 ч. После переноса НЦ промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набора дл  иммуноблотинга. Неспецефическую сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС буфере рН 7,4 с 0,5 М NaCl (ТБР), содержащем 3% желатины . После этого НЦ промывают

2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР)

и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДНС-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих услови х и лизата E.coli, помещают в стекл нные пробирки емкостью 15 мл и добавл ют 10 мл супернатанта ККА 22А1.2.

Инкубацию с ЖА продолжают 2 ч при 20°С на . аппарате с горизонтальным перемешиванием. После этого НЦ

отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, одо- бавл ют козьи антимышиные антитела, разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20°С с перемешиванием . После 2 отмывок ТТБР и одной отмьшки ТБР реакцию про вл ют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор-1-нафтол и 0,015% , в течение 20 мин. Дл  хранени  и фотографировани  НЦ промывают в дистил-

лированной воде и высушивают на воз- ДУхе.

Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии полученных антител с белком E.coli с м.м, 45 кД. Электрофоретическа  подвижность белка E.coli при ДСН-ПААГЭ одинакова в редуцирующих и нередуцирующих услови х . Полученные антитела могут быть

РИЛ-2 человека. Содержание примесного белка E.coli в РИЛ-2 человека после очистки на сорбенте, содержащем полученные МКА, составл ет 10%.

5 1АА61546

Формул а и 3 о б р е т е н и   чени  моноклонал1Л1ых антител к мемШтамм гибридных культивируемых бранному белку Escherichia coli в клеток животных Mus musculus ВСКК препарате рекомбинантного интерлей- (II) N 112D, используемый дл  полу- кина-2 человека.

Claims (1)

1. Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (II) N 112D, используемый для полу чения моноклональных антител к мембранному белку Escherichia coli в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека.