SU1315473A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека - Google Patents
Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека Download PDFInfo
- Publication number
- SU1315473A1 SU1315473A1 SU853996711A SU3996711A SU1315473A1 SU 1315473 A1 SU1315473 A1 SU 1315473A1 SU 853996711 A SU853996711 A SU 853996711A SU 3996711 A SU3996711 A SU 3996711A SU 1315473 A1 SU1315473 A1 SU 1315473A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- cells
- monoclonal antibodies
- strain
- ace
- mus musculus
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано в биологии и экспериментальной медици.- не. Целью изобретени вл етс получение штамма гибридных культивируемых юцеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела к определенному эпитопу ;ангиотензинпревра щающего фермента легких человека (АПФ). Штамм А-АСЕ-9В9 получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALE/с клетками миелоны Х63-А 8-653. Штамм хранитс в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 28D Клетки культивируют на среде РРМ1-1640 с добавлением 10% тел чьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки при 37 С в атмосфере 5% COj. Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дн , кратность рассева 1:10. Секреци моноклональных антител на 3-4 день культивировани составл ет 15-20 мкг/мл культуральной жидкости и 4-6 мг/мл асцитической жидкости. Моноклональные антитела относ тс к классу IgG( . Они используютс дл вы влени АПФ на срезах тканей, культивируемых клетках, биологических жидкост х и т.д. 2 табл. § (Л со сд СО
Description
I13
Изобретение относитс к биотехно- логии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии .
Целью изобретени вл етс полу- чени е штамма гибридных культивируемых клеток мьши Mus musculus, используемого дл получени моноклональных антител к определенному эпитопу ан гиотёнзинпревращающего фермента легких человека (АПФ).
Штамм получают следующим образом.
Мьшей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 80 мкг ангиотензинпревращающего фермента, вьщеленного из ткани легких человека , в 0,2 мл забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащего 30% полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дней иммунизацию повтор ют введением внутрибрюшинно 60 мкг антигена в ЭФР без адъюванта. Через неделю мышам ввод т 60 мкг фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Через 3 дн после зтого 15x10 клеток селезенки иммунных мьш1ей гибридизуют с 5х 10 клеток миеломы мьши X63-Ag8-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45% (объем/объем) полиэтиленгликол (ПЭГ) мол. массы 3350 и 15% ди- метилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные панели по 2x10 клеток в лунку. Дл культивировани и селекции гибридов используют среду RPM1-1640 с добавлением 10%-ной лошадиной и 1Ь%-ной тел чьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4x10 М аминонтерина и 1,6x10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высева по I клетке в лунку, содержащую 4x10 клеток селезенки . После 2-го клонировани практически 100% субклонов продуцируют антитела к.ангиотензинпревращающему ферменту. Продуктивные клоны обозначают А-АСЕ-9В9.
Штамм А-АСЕ-9В9 хранитс в Специализированной коллекции перевиваемых самотических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) № 28 D и характеризуетс следующими признаками.
Культуральные признаки. Среда дл культивировани - среда RPM1-164D с добавлением 10%-ной тел чьей эмбриональной сыворотки и 10%-ной лошадиной
32
сыворотки, 4 |UM L-глютамина, 10 щ М пирувата натри , 100 мкг/мл пенициллина , 100 мкг/мл стрептомицина, обогащенна аминокислотами дл базальной
среды Игла, витаминами дл среды Игла и О,05 р М меркаптоэтанола.
Клетки культивируют при З7 с в атмосфере 5% СО. Посевна доза 100 тыс.кл./мл, клетки пассируют I раз
в 3-4 дн , кратность рассева 1:10. Культура суспензионна . Штамм продуцирует антитела на прот жении 8 пассажей в культуре.
Дл выращивани гибридомы в асцитной форме клетки ввод т в брюшную полость мышей BALB/c, обработанных пристаном, в количестве 2-510 клеток на мьш1ь. Асцит образуетс через 12-16 дней. Штамм на животных не пе
ревивают.
Продуктивность штамма. Секреци моноклональных антител на 3-4-й день культивировани составл ет 15-20 мкг/
/мл культуральной жидкости и 4-6 мг/ /мл асцитической жидкости.
Характеристика моноклональных антител .
Моноклональные антитела относ тс
к классу IgGy, . Они специфически взаимодействуют с определенньм эпитопом ангиотензинпревращающего фермента легких человека. Специфичность оцениваетс с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ELISA) и теста на обогащение.
Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и тимидиновой метке культу- ральной среды.
Криоконсервирование. 1-5-10 клеток штамма консервируют в 1 мл тел чьей эмбриональной сыворотки с до- бавпением 10% диметилсульфоксида. Температуру снижают по.4°С в минуту
до 4 и по 1 С в минуту до -40 С.
Клетки хран т в жидкЪм азоте. Жизнеспособность после размораживани составл ет 70-80%.
Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5x10 в 5 мл среды RPM1-1640 с 10%-ной эмбриональной тел чьей сывороткой, 10%-ной лошадиной сывороткой, 4 JU М глютамина, 10 К М пирув.ата натри , 100 мкг/мл
31
пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 ц М меркаптоэтанола. Клетки культивируют 3-4 дн при в атмосфере, содержащей 5% СО. Куль- туральную среду собирают, центрифу- гируют в течение J О мин при 800g и 4 С. Полученный супернатант используют как реагент дл изучени специфичности взаимодействи антитела с ангиотензинпревращающим ферментом легких человека с помощью ELISA-ме- тода.
На полистироловую 96- чеечную панель дл микротитровани собирают АПФ - 1 мкг на чейку в 50 мкл кар- бонатного буфера (100 |Ц М, рН 9,6) при 4 С в течение ночи. После насыщени панели 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) дл уменьшени неспецифического св - зывани антител пластиком в чейки панели внос т 50 мкл культуральной среды штамма А-АСЕ-9В9 (на 1 ч при 37 С). После этого панель отмывают 4 раза по 100 мкл ЗФР с О,2%-ным БСА и 0,05%-ным Твин-20 и внос т конъю- гат антител кролика против иммуноглобулинов мыши.ковалентно св занных с пероксидазой (на 1 ч при 37 С После окончани инкубации несв завшиес продукты реакции отмывают указанным способом, а св завшуюс пер сидазу, а значит и антитела против АПФ, определ ют количественно по ращеплению субстрата () в присут- ствии хромогена - ортофенилендиамин Положительна реакци про вл етс коричневым окрашиванием и просчитыветс при 490 нм.
Результаты опыта по изучению спе цифичности св зывани иммуноглобулинов из культурал ьной среды штамма А-АСЕ-9В9 с АПФ легких человека, собированном на пластике, представлен в табл. 1 (приведено среднее из тре независимых определений).
Таблица
А-АСЕ-9В9 1
1:10 1:100
0,70 0,39
0,25
Продолжение табл.Г
1:1000
1:10
1
0,13
0,09 0,07 О „08
5 0 5
0
0
Если вместо АПФ в чейке сорбирован БСА., то количество иммуноглобулинов из штамма А-АСЁ-9В9, cop6:-ipo- ванных на БСА и вы вленных методом ELISA, - на уровне негативного контрол .
Результаты, приведенные в табл, 1, свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма А-АСЕ 9В9, к АПФ легких человека.
Пример 2. На полистироловую 96- чеечную панель дл микротитровани сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 100 мкл на чейку в концентрации 20 мкг (пои 4 С на ночь), затем после забнвки плашки 0,2%-ным раствором БСА в ЗФР дл уменьшени неспецифического св зывани антител пластиком сорбируют иммуноглобулины мьши из культуральной .среды от клеток штамма А-АСЕ-ЭВЭ, полученной как указано в примере . После отмывки панели О,2%-ным раствором БСА в ЗФР от несв завшихс иммуноглобулинов в чейки внос т раствор АПФ (100 мкл, концентраци фермента 7 мкл/мл). АПФ, св завшийс с моноклональным антителом, вырабатыва- емь1м штаммом А-АСЕ-9Б9, определ ют количественно в чейках дл мпсро- титровани с помощью флуоресцентного метода, использу в качестве суб- страта Hip-His-Leu.
Результаты опыта по изучению спе- 5 цифичности взаимодействи МкАТ, вы- рабатываемых клетками штамьш А-АСЕ- 9В9 с АПФ в растворе, представлены в табл. 2 (приведено среднее кз трех независимых определений).
5
Т а б
лица 2
1
1 1
1 1;
1
10
100
1000
10
7,82 6,37 2,77 0,84 0,330
0,340
0,324
Составитель М. Серова
Редактор Н.Егорова1 ХЕ Б 9Р1.. Корректор Л. Па тай
Заказ 2316/26 Тираж 499Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4
1315473
Результаты, приведенные в табл.2, свидетельствуют о высокой специфичности монокпональных антител, вырабатываемых клетками штамма А-АСЕ-9В9 по отношению к АПФ, и показывают возможности их применени дл вы влени АПФ в растворах (в биологических жидкост х , зкстрактах тканей и т.д.).
ГО ф
о р м у ла изобретени
Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus ВСКК (П) № 28D (специализированна коллекци перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР), используемый дл получени монокло- нальных антител к ангиотензинпревра- щающему ферменту легких человека.
Claims (1)
- Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus muscuius ВСКК (Π) № 28D (специализированная коллекция 15 перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР),! Используемый для получения моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU853996711A SU1315473A1 (ru) | 1985-12-25 | 1985-12-25 | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU853996711A SU1315473A1 (ru) | 1985-12-25 | 1985-12-25 | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1315473A1 true SU1315473A1 (ru) | 1987-06-07 |
Family
ID=21212433
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU853996711A SU1315473A1 (ru) | 1985-12-25 | 1985-12-25 | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1315473A1 (ru) |
-
1985
- 1985-12-25 SU SU853996711A patent/SU1315473A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Auerbach R. etc. all. Proc. . Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79, p. 7891-7895. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SU1315473A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека | |
SU1308625A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека | |
SU1312097A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека | |
SU1514769A1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО | |
SU1595903A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. продуцент моноклональных антител к инсулину | |
SU1530638A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека | |
SU1744107A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена V F-системы крупного рогатого скота и родственных ему видов | |
RU2319742C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к конформационно-зависимым детерминантам опухоль-ассоциированного антигена muc i человека | |
RU2342428C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных - продуцент моноклональных антител крысы к гипогликозилированным и дегликозилированным изоформам опухоль-ассоциированного антигена человека muci | |
RU2265051C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. pkkk (п) 679d-продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену yersinia enterocolitica о3 и о9 сероваров | |
SU1413132A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к митохондриальной креатинфосфокиназе человека | |
SU1496266A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител против ангиотензин-превращающего фермента из легких человека | |
SU1521776A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора некроза опухолей-альфа | |
RU2265658C2 (ru) | Штамм гибридных клеток животного mus musculus l. 9e2, используемый для получения моноклональных антител к белку e вируса западного нила штамм wnv/leiv-vig99-27889 | |
SU1507791A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS-продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека | |
SU1604849A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к бактери м рода BRUceLLa | |
SU1752764A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к бактери м рода BRUceLLa | |
SU1446154A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека | |
RU2014358C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к формиатдегидрогеназе pseudomonas sp.101 | |
SU1381158A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к урокиназе человека | |
RU2008350C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg человека | |
SU1514768A1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ клеток животных ми5 миБсиьи5-продуцент моноклонального антитела к ре2 КОМБИНАНТНОМУ ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-БЕТА ЧЕ | |
SU1479510A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS-продуцент моноклональных антител к гемагглютинину вируса гриппа А/Ленинград/385/80 (H3N2) | |
SU1742326A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к МYсовастеRIUм воVIS | |
SU1362746A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к поверхости эндотелиальных клеток пупочной вены человка |