SU1744107A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена V F-системы крупного рогатого скота и родственных ему видов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в племенном животноводстве дл  определени  групп крови крупного рогатого скота (КРС). Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моно- клональные антитела (Мон-АТ), против эрит- роцитарного антигена V F-системы КРС, повышение их специфичности и устойчивости при хранении. Полученный штамм депонирован под номером ВСКК(П) 188D и получил название IC8/18/2, Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мыши Balb/c, иммунизированной эритроцитами КРС, содержащими Г-антиген F-системы КРС, с клетками мышиной миеломы SP 2/0- Ад 14. Клетки Mus. musculus IC8/18/2 культивируют в услови х in vitro или in vivo в мышах Balb/c дл  получени  супернатантов культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки крови мышей, содержащих Мон-АТ против антигена V F-системы КРС, которые составл ют основу реагента, используемого дл  определени  антигена V. Мон-АТ представл ют собой иммуноглобулины класса G3, накапливаютс  в асцитической жидкости в концентраци х, определ емых титрами 1: 4000 - 1:100000, не снижают активности при хранении в составе асцитической жидкости в течение 9 мес цев при (-10)-( 12)1 °С при трехкратном замораживании - оттаивании и лиофилиза- ции. Помимо основной отрасли изобретение может найти применение в научных исследовани х и в судебной медицине С/ с vj 4 О v|

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в племенном животноводстве дл  определени  групп крови крупного рогатого скота.

Цель изобретени  - получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моно- клональные антитела (Мон-АТ) против эрит- роцитарного антигена V F-системы крупного рогатого скота (КРС), повышение их специфичности и устойчивости при хранении .

Штамм получают следующим образом.

Спленоциты мыши линии Balb/c, имми- ниэированной эритроцитами КРС, содержащими V антиген F-системы КРС, гибридизируют с клетками мышной миеломы SP2/0-Ag 14 при соотношении числа спленоцитов к клеткам миеломы 14:1. Штамм отселектируют после двукратного реклонировани  и к моменту депонировани  провод т через 33 пассажа fn vitro и два пассажа in vfvo.

Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 188Д и получил название IC8/18/2.

Штамм характеризуетс  следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки округлой формы, диаметром 20-30 мкм, располагаютс  раздельно, комками, гроздь ми . Ядро одно,  дрышек 1-3. В кариоти- пе имеютс  хромосомы, подтверждающие происхождение от клеток нормальной мыши и мышиной миеломы SP2/0-Ag14.

Физиологические признаки. В услови х культивировани  in vitro культура растет суспензионно на минеральных питательных средах, условно обозначаемых ПС, НПС и КС.

Культивирование на ПС при посевной дозе 200-300 тыс,клеток/мл обеспечивает оптимальную плотность 600-700 тыс.клеток/мл через 24-30 ч и максимальную - 800-900 тыс.клеток/мл через 34-38 ч (в зависимости от условий культивировани ). Культура характеризуетс  слабыми адгезивными свойствами к стекл нной и пластиковой .поверхности.

В услови х культивировани  In vivo в мышах Balb/c после внутрибрюшинной инокул ции 5 106-10 клеток в мышь гиб- ридомы образуют солидную, асцитную или смешанную формы опухоли. Асцитическа  жидкость выдел етс  в количестве 2-6 мл из одной мыши. Секретирующа  активность клеток характеризуетс  титром антител в культуральной среде. При оптимальной концентрации клеток в среде титр варьирует в пределах 1:2000-1:4000; при максимальной плотности - 1:4000-1:8000; в асцитической жидкости - от 1:10000 до 1:64000 и в сыворотке крови мышей с развившимис  опухол ми от 1:20000 до 1:130000.

После криоконсервации при - 196°С в культуре сохран етс  70-75% жизнеспособных клеток, при условии замораживани  их в количестве 1-5 млн. в 1 мл эмбриональной сыворотки коров с добавлением 10% диметилсульфоксида (ДМСО),

Свойства секретируемого клетками продукта. Клетки штамма секретируют иммуноглобулины класса G3, определ емого изоферментным методом с использованием панели кроличьих антител против и изотопов в мышиных иммуношлобулинов: М, G1, G2a, G2e. Мон-АТ отличаютс  высокоспецифическим средством к антигену V F-систе- мы эритроцитов КРС, что доказываетс  про влением гемолизирующей активности антител а отношении эритроцитов, на мембранах которых идентифицирован V -анти- ген, и отсутствием реакции с эритроцитами, негативными по данному антигену. Гемолиз

происходит в присутствии комплемента кролика (слабее при использовании комплемента морской свинки) при 35-37°С через 1-2 ч или при через 6-24 ч после

добавлени  комплемента кролика к смеси МонАТ с эритроцитами.

Активность Мон-АТ остаетс  без изменений в составе асцитической жидкости или сыворотки крови мышей при хранении пре0 паратов при (-70) и (-20)°С или в лиофилизированном состо нии при 4°С в течение 24

мес. Титр препарата не снижаетс  после

трехкратного замораживани -оттаивани .

Пример 1.1млн клеток штамма после

5 криоконсервации освобождают путем центрифугировани  (1000 об/мин в течение 10 мин) от среды криоконсервации; пипеткой (1 мл) распредел ют клетки по 200 тыс. в лунки (2 мл) 24- чеечного планшета (Flow)

0 на среду ПС, кондиционированную предварительно посе нными макрофагами. План- шет помещают в атмосферу 95% воздуха и 5% С02 при абсолютной влажности и 37°С. Через 48 ч клетки из каждой лунки перено5 с т во флаконы Каррел  в 4-5 мл среды ПС, соблюда  при этом оптимальную посевную дозу 200-300 тыс.клеток в 1 мл. При достижении культуральной плотности 600-700 тыс. клеток/мл их рассеивают в свежую среду

0 (ПС) во флаконы. В третьем пассаже ПС замен ют НПС или НПС с добавлением КС.

Культуру пассируют до накоплени  25- 50 млн.клеток, отдел ют от среды, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин,

5 отмывают в растворе Хэнкса (или ФР), центрифугиру  10 мин при 1000 об/мин, концентрируют 25-50 млн клеток в растворе Хэнкса (или ФР) и ввод т 8-10 недельным самцам мышей Balb/c внутрибрюшинно по

0 5-10 млн. клеток в мышь. Животных подготавливают к инокул ции клеток за 3-14 сут. введением внутрибрюшинно по 0,5 приста- на (2,6,10,14-тетраметилпентадекан). Через 12-14 сут мышей декапетируют, 1,5-2 мл

5 крови нестерильно собирают в чашку Петри с раствором Хэнкса с добавлением 0,005 мг/мл гепарина, форменные элементы крови устран ют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об./мин. Из брю0 шинной полости стерильно извлекают асцитическую жидкость во флакон с гепари- низированным раствором Хэнкса. При этом соотношение асцитической жидкости и буферного раствора может варьировать в пре5 делах 1:1-1:4. Клетки гибридомы из асцитической жидкости отдел ют центрифугированием (10 мин при 1000 об/мин), супернатант смешивают с сывороткой крови мышей, устанавливают титр Мон-АТ, до- авл ют 0,02-0,01% азида натри  или

меркаптоэтанола и используют как реагент. Клетки, выделенные из асцитической жидкости , а также извлеченные из солидных опухолевых узлов, используют дл  повторной инокул ции. В результате первого пассажа гибридомных клеток In vivo количество асцитической жидкости составл ет 2- 4 мл/мышь и увеличиваетс  до 3-6 мл/мышь во втором пассаже.

Пример 2. Дл  установлени  специфического сродства Мон-АТ к V -антигену эритроцитарной мембраны КРС (или близкородственных видов) готов т 1,5%-2,5% взвесь эритроцитов в 0,85% ФР из крови 10-20 животных, генотипически положительных по У-антигену F-системы (V+) и от 1-3 животных в эритроцитах которых не содержитс  V антиген (V-) животные ти- пируютс  ранее с использованием стандартных реагентов). В лунки планшетов дл  иммунологическихх реакций внос т по 20 мкл ФР. Путем переноса из первой лунки в последующие получают разбавлени  реагента , кратные 2. Эритроцитарную взвесь внос т по 10 мкл в лунку, перемешивают встр хиванием, добавл ют в каждую лунку по 20 мкл комплемента кролика, перемешивают встр хиванием, оставл ют при 37- 38°С на 1 ч, встр хивают и оставл ют еще на 1 ч. Полный гемолиз определ ют по по влению оранжевато-оплесцирующей окраске жидкости в лунках при одновременном исчезновении оформленных эритроцитов. Анти- V специфичность обнаруживают по про влению гемолиза в лунках с эритроцитами от V+ - животных и отсутствию соответствующей реакции с V- -эритроцитами. Параллельно с Мон-АТ в тех же услови х став т аналогичную реакцию между V+ и V- эритроцитами и стандартным реагентом против V антигена. Получают результат , аналогичный результату с Мон-Ат дл  V+ эритроцитов, но отличающийс  значительно более низким титром дл  стандартного препарата. Титр Мон-АТ-1С8 в составе асцитической жидкости с добавлением сыворотки мышей колеблетс  в зависимости от условий постановки реакции от 1:500 до 1:130000.

Пример 3. Дл  использовани  Мон- АТ в качестве реагента жидкости, полученной путем культивировани  клеток in vivo, разбавл ют буферным раствором Хэнкса 1:2-1:4, добавл ют 0,01-0,02% азида натри  или мертиолата, устанавливают титр антител, фасуют в ампулы по 1 мл, замораживают при (-10), (-12), (-20) или (-70)°С. При v двух последних указанных температурах хран т более двух лет, при (-10), (-12)°С - 8-12 мес. После размораживани  реагент 5 разбавл ют ФР до титра 1:4-1:8 непосредственно перед употреблением. В случае необходимости хранени  более 12 мес разбавленного реагента (титр 1:200-1:500) при оптимальных услови х реакции гемоли0 за) к ФР или раствору Хэнкса добавл ют 10-7% бычьего сывороточного альбумина (ЈСА) и замораживают при тех же температурах ,

Сохранность активности реагента в те5 чение сроков более двух лет при 4-б°С обеспечивают тем, что асцитическую жидкость, разбавленную раствором Хэнкса в 2-4 раза, лиофилизируют в вакууме при -70°С и конической температуре 25°С. В цел х использо0 вани  в качестве реагента Мон-АТ, полученных при культивировании клеток in vitro, из культуральной среды антитела осаждают насыщенным раствором сульфата аммони , отмывают 0,01 фосфатным бу5 фером (ЗФР, рН 7.2), диализуют против буфера, разбавл ют раствором Хэнкса, добавл ют 0,01-0,02% азида натри  или мертиолата устанавливают титр, замораживают или лиофилизируют, хран т как описано вы0 ше.

Таким образом в результате предлагаемого изобретени , используемого в качестве источника Мон-АТ, получают реагент, характеризующийс  высокой специфично5 стью к V антигену F-системы КРС и родст- - венных ему видов, активность которого в 50-5000 раз превышает активность стандартного препарата той же специфичности, производимого путем изоиммунизации ко0 ров эритроцитами животных того же вида, устойчивый к длительному хранению в услови х криоконсервации при периодическом оттаивании - повторном завораживании или в услови х лиофилизации, и обеспечи5 вают возможность практически бесконечного получени  реагента против эритроцитарного фактора V F-системы КРС и родственных ему видов.

Claims (1)

1. 0- Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus ВСКК(П) 188Д - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена VF-систеМы

   5 крупного рогатого скота и родственных ему видов.