SU1381158A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к урокиназе человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области биотехнологии и может быть использовано дл  выделени , очистки и определени  урокиназы в биологических жидкост х . Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток мыгаи Miis mtisculus, продуцируюгчего моноклональные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повьпченной константой св зывани  с антигеном и взаимодействующие с двум  молекул рными формами фермента. .Штамм NG получают гибридизацией спленогштов мьпией линии Balb/c, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы X63-Ag8-653. Он хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 34Д и характеризуетс  следующими признаками. Среда дл  культивировани ; среда RPMI-I640 с 10% эмбриональной тел чьей и 10% лошадиной сыворотки, посевна  доза 10 кл. в мл,кратность рассева 1:10 каждые 3-4 дн , культура суспензионна . 1 1тамм перевиваетс  в виде асцита на мыиах линии Balb/c не менее 3 раз. Содержание МА в культуральной жидкости на 4 день культивировани  составл ет 20-30 мкг/мл, в зрелом асците 2-3 мг/мл. МА относ тс  к классу IgG , (К),имеют константу св - зьшани  с антигеном 10 М ,инги- бируют активность урокиназы, взаимодействуют с двум  ее молекул рными формами. МА используютс  дл  определени  и очистки урокиназы. 1 табл. t (/ СО 00 ел 00

Description

Изобретение относитс  к области биотехнологии и может быть использовано дл  выделени , очистки и определени  урокиназы в биологических жидкост х.

Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные анти- тела (МА ) к урокиназе человека, обладаю1цие повышенной константой св зывани  с антигеном и взаимодействующие с двум  молекул рными формами фермента, Штамм получают следующим образом. Мышам линии Balb/c провод т 3 еженедельные подкожные инъекции урокиназы из расчета 30 мкг фермента на мышь. Иммунизацию провод т смесью высоко- и низкомолекул рных форм фермента. Перва  иммунизаци  осуществл етс  в полном адъюванте Фрейн- да, втора  и треть  - в неполном. Четвертую иммунизацию провод т внут- рибрюгаинно введением 50 мкг урокиназы в физиологическом растворе за трое суток до гибридизации. Гибриди- зуют 10 клеток селезенки иммунных мьш1ей с 4 10 клеток миеломы Х63- Ag8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликол  с мол.мае.1500. После гибридиза,ции клетки высевают; в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. Дл  культивировани  и се- лекции гибридом используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, гипоксантина 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений , высева  по 1 клетке на лунку После второго клонировани  более 90% полученных субклонов продуциру- ют антитела к урокиназе.

Продуктивные клоны вьшод т в массовую культуру и обозначают UNG. Штамм UNG хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)34Д и характеризуетс  следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда дл  культивировани  - среда RPMI-I640 с добавлением 10% эмбриональной тел чьей сыворотки,10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутами

0 5 0 с 0

0

на, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/ /мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натри , 0,05% меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% COj. Посевна  доза - lO клеток в 1 мл.

Клетки пассируют раз в 3-4 дн . Кратность рассева 1:10. Культура суспензионна . Клетки штамма инъецируют в/брюшинно в количестве 10 кл в 1 мл среды Игла мышам линии Balb/c, предварительно обработанным приста- ном. Асцит образуетс  через 12- 16 дней. JllTaMM перевиваетс  на мышах не менее 3 раз.

Продуктивность штамма.

Содержание моноклональных антител в культуральной жидкости на 4-й день культивировани  составл ет 20-30 мкг/мл культуральной среды, а в зрелом асците - 2-3 мг/мл асци- тической жидкости.

Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы влено при окрашивании красител ми на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.

Характеристика целевого продукта.

Моноклональные антитела относ тс  к классу Ig G,(K), имеют константу св зывани  с антигеном 10 М ин- гибируют активность урокиназы человека , взаимодействуют с двум  ее молекул рными формами.

Криоконсервирование.

2-10 клеток штамма консервируют в 1 мл тел чьей змбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсуль- фоксида в пластиковых ампулах. Зайо- раживание ведут по следующей схеме: снижают температуру до 4 с, а затем по в 1 мин до -40°С. Клетки хран т в жидком азоте. Размораживают быстро при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживани  составл ет 70-80%.

Использование штамма UNO иллюстрируетс  следующими примерами.

Приме р 1. Клетки штамма UNG помещают в пластиковый флакон объемом 75 см по 5-10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки,10% лошадиной сыворотки , 4 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина , 10 мМ пирувата натри , 0,05% меркаптозтанола при в атмосфере 5% CO. Клетки культивируют 4 дн  Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение 10 мин при 800 g Супернатант тестир /тот на присутствие антител к урокиназе по следующей схеме: 100 мкл раствора высоко- либо низкомолекул рной урокиназы с концентрацией 10 мкг/мл внос т в  чейки полистиролового планшета дл  иммунологического анализа и инкубируют при А С в течение 12-15 ч. Затем планшет промывают 10 мМ фосфатным буфером iрН 7,4), содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% Твин-20 (раствор А ). В  чейки с сорбированной на полистироле урокиназой внос т по 100 мкл культуральной среды и инкубируют . I ч при комнатной температуре, после чего отмывают от несв завшегос  белка раствором А. Специфично св завшиес  антитела вы вл ют с помощью меченных радиоактивным I (удельна  активность 100000 иип/мин-мкг ) кроличьих антител против иммуноглобулинов мьпии, добавл   их по 2 мкг в лунку в 100 мкл раствора А. В качестве отрицательного контрол  используют препарат неиммунньгх иммуноглобулинов мыши вместо культуральной среды штамма.

Результаты радиоиммунодогичеекого анализа преде г авлены в таблице .

Результаты, представленные в таб- лице, свидетельствуют о том, что полученные моноклональные антитела обладают высокой спе1 1фичностью по отношению как к высоко-, так и низко молекул рной формам урокиназы человека .

Пример2. 100 мл культуральной среды, полученной по примеру 1, нанос т на колонку с иммобилизованными кроличьими антителами против иммуноглобулинов мьшш, колонку про- мьгоают раствором А (см.пример I) и элюируют специфично св завшиес  антитела к урокиназе глициновым буфером (рН 2,8 J. Получают 2 мг препарата очищенных антител к урокиназе, которые иммобилизуют на сефарозе 4В

по .т андартной методике с использо- вар1ием бромциана. На 100 мкл иммуно- сорбента, содержащего 2 мг антител/ /мл гел , накос т 0,5 л человеческой мочи, промывают сорбент раствором А и злюируют фермент глициновым буфером ( рН 2,8). Анализ содержани  фермента в элюате провод т на фибрино- вых пластинках, содержащих плазмино- ген. 100 мкл иммуносорбента с 90%- ной эффективностью св зывают в данных услови х всю урокиназу, содержащуюс  в моче. Конечный выход фермента , очищенного в одну стадию, составл ет не менее 60%, удельна  активность препарата составл ет 150000 МЕ/мг, что соответствует гомогенному препарату урокиназы. Электрофорез показьшает, что на иммуно- сорбенте выдел ютс  низко- и высокомолекул рна  формы урокиназы.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток мьшш Mus musculus ВСКК/П/ N 34D, используемый дл  получени  мо- ноклональных антител к урокиназе человека .

   об

   Количество св занных антител кролика, имп/мин

   35

   Культуральна 

   среда UNG

   высокомолекул рна  форма урокиназы

   низкомолекул рна  форма урокиназы

   Неиммунные иммуноглобулины мыщи /20 мкг/мл/ /контроль/

   59001300

   60001300

   360140

   ВЮиПИ Заказ 1164/27

   Ироизн.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

   Тираж 520 Подписное