CN113331177B - 一种干细胞冻存液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干细胞冻存液，其包含一种Caspase单克隆抗体，该单克隆抗体具有较好的结合Caspase蛋白的能力。通过在冻存液中添加相应的抗体后，能够有效的提高细胞冻存后的存活率，有利于脐带间充质干细胞的保存及应用，具有较好的应用价值。

Description

一种干细胞冻存液
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种干细胞冻存液。
背景技术
脐带血中造血干细胞和间充质干细胞含量相对丰富，且其间充质干细胞可在一定条件下在体外诱导分化成为多种组织细胞，利于修复病变或损伤的组织细胞，广泛应用于临床，目前主要应用于血液系统恶性肿瘤、软骨及骨的修复再生、损伤神经的修复，以及肝脏疾病的治疗等。
近年来，脐带血干细胞移植已逐渐成为应用于临床治疗多种恶性和非恶性血液系统疾病的重要手段之一。既往研究认为干细胞白血病SCL基因和急性T淋巴细胞白血病TALl融合基因在造血系统中扮演着重要角色，有学者将SCL以及TALl基因通过病毒转染进入脐带血CD34+干细胞中，实验发现脐带血CD34+干细胞中SCL以及TALl基因以及MEK/ERK磷酸化都对机体造血功能产生影响，且SCL以及TALl基因在其中占主导作用，其可以调节信号通路MEK/ERK磷酸化。同时，因脐带血中同时含有大量间充质干细胞，其可以通过细胞间作用、分泌造血生长因子及细胞因子等作用.促进造血干细胞的增殖及分化。曾有人将间充质干细胞联合脐带血治疗造血干细胞移植失败的血液系统疾病患者.实验结果发现移植联合脐带血的间充质干细胞是一种有效的治疗方法，且其可以减少移植物排斥反应的发生以及减少血液肿瘤的再发生几率。同样，有研究者通过将脐带血间充质干细胞和淋巴细胞联合培养，发现联合培养后淋巴细胞的增殖能力被抑制，尤其是CD8+淋巴细胞亚型.但CD4+T淋巴细胞亚型明显增加，另外脐带血间充质干细胞能够减少Thl和Tcl细胞群，增加Th2和Te2细胞群，所以认为脐带血干细胞在抑制和减少临床移植物抗宿主病方面具有较大的潜力。总的来说，越来越多的临床案例发现同种异体造血干细胞移植存在一定的移植物抗宿主反应等不良反应，近年研究表明利用UCBT可以明显减少上述不良反应.而且其具有来源丰富、免疫原性低以及分化成多种造血细胞的潜力等优点，还可通过释放各种趋化因子、细胞因子、黏附因子促进HSCs归巢，在促进机体造血微环境成熟、加快造血系统重建等方面具有明显促进作用，成为目前血液系统疾病研究的热点之一。
虽然脐带血干细胞具有来源丰富、采集方便、对供者无伤害，不受伦理、法律的限制、分化能力更强、免疫原性更低等诸多有点，使得其在上述疾病的治疗方面表现出了可观的临床前景，但是在临床技术成熟前所面临的问题还有很多。因脐带血中干细胞绝对值偏低，限制了其在临床的应用.所以如何改进培养方法、提高培养成功率特别是冷冻保存的方法是急需解决的问题。
此前的研究表明，随着对低温冻存理论的深人认识，人们发现细胞凋亡参与了细胞冷冻损伤的分子机制，造血干细胞凋亡严重损害其克隆形成能力和移植后的造血重建功能。Caspase家族成员是凋亡级联反应的重要效应蛋白酶，抑制Caspase表达能改善多种细胞冻存后的存活率。使用Caspase抑制剂zVAD-fmk对干细胞进行冻存，发现具有较好的冻存效果。但是目前的研究中，Caspase抑制剂的种类还不够丰富，可供选择的类型还不够多，而且zVAD-fmk本身对于细胞并不是完全没有活性的影响，使得研究Capase抑制剂变得迫在眉睫。
发明内容
本发明克服现有技术缺陷，提供了一种Capase单克隆抗体及其用。
一方面，本发明提供一种Capase单克隆抗体，所述单抗的轻链可变区和重链可变区序列分别如下所示：
轻链可变区(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0003095233140000021
重链可变区(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003095233140000022
进一步的，本发明提供一种脐带间充质干细胞，其制备方法为：取15mL脐带血，肝素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取50mL离心管，先加入15mL密度1.077g/mL的Percoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐带血，2000r/min离心25min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物(富含单个核细胞)，800r/min离心洗涤2次，5min/次，沉积细胞用含15％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为l×109个/L，接种于25T的培养瓶内，放置在37℃、体积分数为0.05的C02饱和湿度培养箱中培养。孵育72h后更换培养基，去除红细胞及其他未贴壁细胞，三天换液1次。间充质干细胞约于7周相互汇合达培养瓶底70％～80％的生长表面，此时进行传代培养。倒掉旧培养基，加入2mL0.25％的胰酶消化，作用30s后弃掉大部分，留置少许于瓶中，适当用力振荡培养瓶，整瓶细胞放入培养箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞解离程度，以细胞突起缩回、细胞间隙增大、细胞近乎圆形为度，加入含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，用吸管轻柔吹打瓶底，800r/min离心洗涤2次，5min/次,收集细胞即为传代的脐带间充质干细胞。
进一步的，本发明提供一种脐带间充质干细胞冻存保护液，由IMDM培养基、胎牛血清和二甲基亚砜按7:2:1体积比混合，其中添加单抗30μmol/L。
进一步的，本发明的冻存液的使用方法为，在冻存保护液中调整细胞密度至1x105/ml，按下列程序置于液氮中保存:4℃下15min，-20℃下2h，-80℃下过夜，最后置人-196℃下冻存。细胞在-196℃下冻存4周后，立即放人40℃水浴箱中，2min内融化完毕，以IMDM培养基(其中添加实施例1单抗(30μmol/L)洗涤备用。
在冻存后的细胞中检测caspase蛋白的表达抑制情况可以发现，蛋白的表达量和未添加抗体相比的冻存后细胞相比，抑制率达到97％以上。所述抗体能够提高冻存后的复活率，并且所述冻存液在冻存2年后，细胞复活率仍能达到90％。
进一步的，所述冻存液中还可以添加常用的其他冻存保护剂。
有益效果
本发明提供了一种Caspase单克隆抗体，具有较好的结合Caspase蛋白的能力，通过在冻存液中添加相应的抗体后，能够有效的提高细胞冻存后的存活率，有利于脐带间充质干细胞的保存及应用，具有较好的应用价值。
附图说明
图1Sox9 mRNA相对表达水平结果图
图2Sox9蛋白相对表达水平结果图
具体实施方式
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。
实施例1Caspase单抗的制备
动物免疫：将纯化的重组人Caspase-3蛋白5mg(BioVision，货号1083-5)蛋白与等体积的Freund完全佐剂充分混合,BALB/c小鼠皮下多点注射融合蛋白50μg/只。初次免疫4周后背部皮下多点注射加强免疫,4周后再次加强免疫,每次所用免疫原50μg/只。第3次免疫后8～10d尾静脉采血ELISA测血清抗体效价。于融合前4d选择抗体滴度最高的1只小鼠腹腔注射无佐剂抗原150μg加强免疫。细胞融合与筛选：无菌取加强免疫BALB/c小鼠脾细胞,以50％聚乙二醇作为融合剂,按1：5-1：10将Sp2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞进行融合,加入HAT选择性培养液,接种96孔板,置37℃、5％CO2培养箱中培养,第7-10天后吸取生长克隆孔中的培养上清,用靶蛋白作为包被抗原用ELISA进行筛选,筛选出只与靶蛋白反应的阳性杂交瘤细胞18株,对其中阳性反应最强的2株杂交瘤采用有限稀释法进行4轮亚克隆，直至所有单克隆均为阳性时，扩大培养和建株。
单克隆抗体的制备与纯化：摇BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1×106-2×106个/只,约7d后待小鼠腹部显著膨隆,吸取腹水,2000r/min,离心20min,取上清。经平衡缓冲液稀释后,0.45μm滤器过滤。将过滤后腹水以1ml/min流速通过Purify蛋白纯化仪,平衡缓冲液洗去杂蛋白,洗脱液(甘氨酸-盐酸pH2.8
100mmol/L)洗脱抗体,收取OD280>0.5的抗体,经PBS4益透析后进行SDS-PAGE电泳鉴定。
单抗Westernblot检测：将免疫蛋白分别加入2×SDS裂解液,每泳道5ng上样。SDS-PAGE后,将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；5％脱脂奶粉(TBST配制)室温封闭2h后,分别与单抗(2μg/ml)4益孵育过夜。次日洗涤后,加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1：2000),室温孵育50min,ECL化学发光显色。
在Westernblot实验中,结果显示，所述单抗可与相应的免疫蛋白特异结合,不与其他蛋白结合。
采用常规的抗体序列鉴定方法，获得了所述单抗的轻链可变区和重链可变区序列分别如下所示：
轻链可变区(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0003095233140000051
重链可变区(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003095233140000052
采用常规的亲和力鉴定方法，鉴定得到本发明的抗体与免疫蛋白的亲和力为2.3nM。
实施例2脐带间充质干细胞的制备
脐带血间充质千细胞的分离培养：取15mL脐带血，肝素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取50mL离心管，先加入15mL密度1.077g/mL的Percoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐带血，2000r/min离心25min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物(富含单个核细胞)，800r/min离心洗涤2次，5min/次，沉积细胞用含15％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为l×109个/L，接种于25T的培养瓶内，放置在37℃、体积分数为0.05的C02饱和湿度培养箱中培养。孵育72h后更换培养基，去除红细胞及其他未贴壁细胞，三天换液1次。间充质干细胞约于7周相互汇合达培养瓶底70％～80％的生长表面，此时进行传代培养。倒掉旧培养基，加入2mL 0.25％的胰酶消化，作用30s后弃掉大部分，留置少许于瓶中，适当用力振荡培养瓶，整瓶细胞放入培养箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞解离程度，以细胞突起缩回、细胞间隙增大、细胞近乎圆形为度，加入含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，用吸管轻柔吹打瓶底，800r/min离心洗涤2次，5min/次,收集细胞即为传代的脐带间充质干细胞。
免疫荧光法检测脐带间充质干细胞免疫学表型。常规脐带间充质干细胞爬片，0.1M PBS冲洗5min3次，4％多聚甲醛固定30min，0.1M PBS冲洗5min3次，血清封闭30min，滴加一抗CD44和CD105(1:100)37℃1h或4℃过夜，0.1M PBS冲洗5min3次，滴加FITC标记的二抗，室温避光孵育30min，0.1M PBS冲洗30min，PE染核，荧光显微镜下观察、照相。结果发现在荧光显微镜下观察发现呈现CD44－FITC，CD105－FITC阳性，说明分离传代获得的是脐带间充质干细胞。
实施例2脐带间充质干细胞的冻存实验
将细胞分为三组，分别加入以下3种不同组成的冻存液(各组中的配方均为体积比)。
A组用冻存液(由IMDM培养基、胎牛血清和二甲基亚砜按7:2:1混合)
调整细胞密度至1x105/ml，按下列程序置于液氮中保存:4℃下15min，-20℃下2h，-80℃下过夜，最后置人-196℃下冻存。细胞在-196℃下冻存4周后，立即放人40℃水浴箱中，2min内融化完毕，以IMDM培养基洗涤备用(常规冻存组)。
B用冻存液(由IMDM培养基、胎牛血清和二甲基亚砜按7:2:1混合，其中添加zVAQ-fmk(30μmol/L)，调整细胞密度至1x105/ml，按下列程序置于液氮中保存:4℃下15min，-20℃下2h，-80℃下过夜，最后置人-196℃下冻存。细胞在-196℃下冻存4周后，立即放人40℃水浴箱中，2min内融化完毕，以IMDM培养基(其中添加zVAQfmk(30μmol/L)洗涤备用。
C组用冻存液(由IMDM培养基、胎牛血清和二甲基亚砜按7:2:1混合，其中添加实施例1单抗(30μmol/L)，调整细胞密度至1x105/ml，按下列程序置于液氮中保存:4℃下15min，-20℃下2h，-80℃下过夜，最后置人-196℃下冻存。细胞在-196℃下冻存4周后，立即放人40℃水浴箱中，2min内融化完毕，以IMDM培养基(其中添加实施例1单抗(30μmol/L)洗涤备用。
将细胞按冻存前的数量调整至5×105/mL，台盼蓝染色后，普通光学显微镜下每组随机选取6个视野，计数被台盼蓝染色的细胞数，计算细胞的成活率＝[(细胞总数-台盼蓝染色细胞数)/计数细胞总数X100％。结果如下表1所示。
表1不同组冻存液复苏细胞的成活率的影响
组别 细胞成活率％
A 80.25±2.1
B 93.4±3.1
C 95.2±2.9
从表1可以看出，本发明的单抗能够与zVAQ-fmk capsase抑制剂具有相似的保护细胞冻存的效果。
实施例3冻存后细胞的诱导分化实验
脐带血间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化：取冻存后三组复活的细胞，按密度为5X107L-1接种于24孔培养板(孔内置无菌盖玻片)中，第2天换液，其中半数培养孔用诱导软骨细胞培养基(15％胎牛血清的DMEM，含终浓度为100pg/L胰岛素样生长因子1)进行培养，3d换培养液1次，诱导12d。
分别收集软骨诱导12d的细胞团，吸弃培养基，PBS轻洗2遍，加入适量RNAisoplus，反复吹打，使细胞充分裂解。提取总RNA后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRGreen MasterMix试剂进行real-time PCR，检测目的基因的表达情况。所用引物序列如下所示。
β-actin引物序列(5′→3′)
F：AGATGTGATCAGCAAGCAG
R：GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA
hSox9引物序列(5′→3′)
F：CACGGAGCAGACGCACATC
R：GGCTGCACGTCGGTTTTGG，结果如图1所示。
在诱导分化过程中，与未诱导组(空白对照组)相比，软骨分化标志基因Sox9在诱导12d后，mRNA水平表达均显著升高。特别是C诱导组中添加了抗体冷冻处理后的mRNA表达水平提高达到了34，效果明显。
分别收集成软骨诱导12d的细胞团，吸弃培养基，PBS轻洗2遍，加入适量的含有蛋白抑制剂的蛋白裂解液，反复冻融，使细胞充分裂解。根据说明书，使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。每孔30μg蛋白经12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，半干法转膜至PVDF膜。用TBST配制5％脱脂奶粉溶液封闭2h，加入相应一抗4℃孵育过夜。第2天用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2h，最后均匀滴加ECL发光液于膜上，室温孵育1min后在凝胶成像仪中曝片拍照。
Western blot检测软骨分化标志基因Sox9的表达情况，结果如图2所示，含有抗体处理的冻存液处理组中Sox9蛋白水平表达显著增加,C组表达量最高达到了3.50。以上结果说明单抗处理后的干细胞其细胞活性保持较好，可更好的促进干细胞的成软骨分化，提高软骨分化能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京戴域生物技术有限公司
<120> 一种干细胞冻存液
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Ile Ser Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Val Val Ala Trp Pro Ala Cys Phe Thr
20 25 30
Gln Val Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Thr Arg Glu Val Ser Val Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Ala His His Gln Met Ala
85 90 95
Pro Glu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Met Arg
20 25 30
Glu Ser Cys Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Asp Gly Gln Cys Arg Lys Ala Val Ile Gly Ser Gly His Gln
50 55 60
Leu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Met Glu Asn Ser Pro Gly Glu Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115

Claims (5)

1.一种Caspase单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的Caspase单克隆抗体在制备脐带血间充质干细胞冻存液中的用途；其中，所述冻存液由IMDM培养基、胎牛血清和二甲基亚砜按7:2:1体积比混合，其中添加权利要求1中的单克隆抗体至终浓度为30μmol/L。
3.一种脐带血间充质干细胞冻存液，其中，所述冻存液由IMDM培养基、胎牛血清和二甲基亚砜按7:2:1体积比混合，其中冻存液中还添加权利要求1中的单克隆抗体至终浓度为30μmol/L。
4.权利要求3所述的冻存液在冻存脐带血间充质干细胞中的用途；其中冻存液的使用方法为，在冻存保护液中调整细胞密度至1 x 105 /ml，按下列程序置于液氮中保存:4℃下15 min，-20℃下2h，-80℃下过夜，最后置入-196℃下冻存,细胞在-196℃下冻存4周后，立即放入40℃水浴箱中，2 min内融化完毕，以添加有30μmol/L权利要求1中所述的单克隆抗体的IMDM培养基洗涤备用。
5.如权利要求3所述的冻存液，其中还添加其它冻存保护剂。
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