CN100509848C - 抗人ox40l单克隆抗体制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7，其制备方法以及这些单克隆抗体在抑制混合淋巴细胞反应、刺激T细胞增殖、诱导树突状细胞分化成熟、刺激T细胞依赖性B细胞分化及抗体分泌中的应用。

Description

抗人OX40L单克隆抗体的制备及其应用

发明的领域

本发明涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7，其制备方法以及这些单克隆抗体在抑制混合淋巴细胞反应、刺激T细胞增殖、诱导树突状细胞分化成熟、刺激T细胞依赖性B细胞分化及抗体分泌中的应用。

发明的背景

已知有许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性、非MHC限制性的第二信号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此可以认为，第一信号决定了T细胞活化的特异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行(Noelle RJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：6550，1992；Allen RC et al.，Science.259：990，1993)。

近年来，分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。根据其结构，这些共刺激分子可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL、OX40/OX40L、RANK/RANKL和Fas/FasL等。另一类是免疫球蛋白超家族，如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(Korthauer U et al.，Nature，361：539，1993)。这些共刺激分子以受体和配体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达，一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫应答。

人OX40配体(OX40L或CD134L)是1991年由Miura等人克隆的，它属TNF超家族，为分子量约34-40KD的II型跨膜糖蛋白。人OX40L主要在成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(ECV)、脐带静脉血管内皮细胞和巨噬细胞等细胞表面上，以及心、骨骼肌、睾丸和肺等组织器官中表达。OX40/OX40L途径主要在T细胞反应的晚期发挥作用，具有促进活化的CD4⁺T细胞克隆增生、增强细胞效应、延长细胞存活期以及增加记忆T细胞的数量等功能。另外，OX40/OX40L还能传递逆向信号促进B细胞扩增分化为浆细胞，分泌各型抗体。在OX40/OX40L信号作用下使M₀期树突状细胞(M₀-DC细胞)表型CD80、CD86、CD54、CD40的表达上调，促进分泌型CD40L(sCD40L)活化的IL-4-M₀-DC细胞分泌IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子，表明OX40L可增强sCD40L活化未成熟IL-4-Mo-DC的能力，促进DC成熟。

近年来研究表明，OX40/OX40L信号通路可在介导抗肿瘤免疫应答、抗移植排斥反应和自身免疫性疾病的过程中发挥重要作用。在多种自身免疫性疾病的炎症部位，都能分离到OX40⁺的CD4⁺T细胞，而且这些炎症部位的OX40⁺T细胞就是自身抗原特异性T细胞(WeinbergAD et al.，Semin Immunol，1998；10：471)。这些抗原特异性T细胞最终可引起自身免疫反应，出现临床症状。在小鼠实验性脑脊髓膜炎(EAE)模型中，阻断OX40/OX40L通路能够明显地缓解动物的症状(Chiyoko N et al.，J Immunol，2001，166：2108)。同样，阻断OX40/OX40L通路亦可显著地延长皮肤移植及心脏移植小鼠的生存时间(Gulcin D et al.，J Immunol，2004；172：1691；YuanX et al.，J Immunol，2003；170：2949)。另外，肿瘤组织相应部位的肿瘤特异性OX40⁺T细胞在机体抗肿瘤中也具有重要作用(Vetto JT et al.，Am J Surg，1997；174：258)。动物实验已证实，增强OX40信号可阻止小鼠肿瘤形成，同时提高荷瘤小鼠的生存率(Kjaergaard J et al.，JImmunol，2001；167：6669)。OX40只在炎症和肿瘤浸润部位的抗原特异性T细胞上特异性高表达，使其成为一个理想的免疫干预的靶分子。因此，抗OX40L单抗将有希望成为临床干预自身免疫性疾病、移植排斥反应和肿瘤的理想的诊断和治疗剂。

尽管有关OX40/OX40L受体配体结合对的T细胞刺激功能、OX40或OX40L抗体的制备及它们的其他免疫学功能都是已知的，但如本发明的新的抗人OX40L单克隆抗体及其相对比较简单的制备方法却未见报道。而且，国外文献报道的抗人OX40L单克隆抗体大多是用来抑制T细胞增殖、阻断B细胞分泌的阻断型抗体(Morimoto S et al.，J Immunol，2000；164：4097)，Morimoto报道加入抗人OX40L单抗明显抑制了T细胞依赖性B细胞分泌IgG，而本发明的抗人OX40L单克隆抗体则具有不同的生物学功能。国内文献则没有相关报道。

发明目的

本发明的一个目的是提供一组选自9H10、4C12和1E7的抗人OX40L单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，抗人OX40L单克隆抗体9H10和4C12的重链和轻链分别具有如序列表中SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示氨基酸序列，并且抗人OX40L单克隆抗体1E7的轻链具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7是抗可溶性人OX40L的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供制备如上限定的抗人OX40L单克隆抗体的方法，该方法包括：

(1)用预制备的高表达人OX40L分子的转基因细胞作为免疫原免疫动物；

(2)分离被免疫动物的脾淋巴细胞并在适于产生杂交瘤细胞的条件下与适当的骨髓瘤细胞融合；

(3)筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；

(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，其中产生抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7的杂交瘤细胞株的保藏编号分别为CGMCC No.1167、CGMCCNo.1168和CGMCC No.1169。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人OX40L单克隆抗体9H10和4C12在抑制单向和双向混合淋巴细胞反应中的应用。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人OX40L单克隆抗体9H10在诱导树突状细胞分化和成熟中的应用。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人OX40L单克隆抗体9H10和4C12在刺激T细胞依赖性B细胞分泌抗体中的应用。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人OX40L单克隆抗体1E7在体外激活T细胞中的应用。

附图简要说明

图1显示L929/OX40L转基因细胞的构建示意图。

图2显示以流式细胞术分析抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7对转基因细胞上OX40L分子的识别。其中灰色峰为阴性对照，一抗为小鼠IgG，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示转基因细胞与抗人OX40L单抗反应的结果，其中第一抗体分别是商品化抗人OX40L单抗TAG-34(阳性对照)及我们自己制备的3株抗人OX40L单抗9H10、4C12和1E7，第二抗体是荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。

图3显示9H10、4C12和1E7杂交瘤细胞株染色体的核型分析(×1000倍)。

图4显示以流式细胞术分析9H10、4C12和1E7识别成熟DC及活化的B细胞上的OX40L分子。A：美洲商陆(PWM)活化3天的B细胞。其中灰色峰为阴性对照，B细胞首先与小鼠IgG反应，然后加入二抗荧光素FITC标记的羊抗鼠IgG，最后加入荧光素PE标记的鼠抗人CD19直标单抗；透明峰为B细胞分别与3株抗人OX40L单抗9H10、4C12和1E7反应后再加荧光素FITC标记的羊抗鼠IgG作用，最后加入荧光素PE标记的鼠抗人CD19直标单抗。B：抗人CD40单抗激发2天的DC。其中灰色峰为阴性对照，一抗为生物素标记的小鼠IgG，二抗为PE标记的抗生蛋白链菌素(Streptavidin-PE)；透明峰为DC分别与生物素标记的3株抗人OX40L单抗9H10、4C12和1E7反应后再加入Streptavidin-PE作用。

图5显示以流式细胞术分析单抗9H10、4C12和1E7识别的抗原位点的竞争性抑制。1：灰色峰为阴性对照，其中一抗为生物素标记的小鼠IgG，二抗为Streptavidin-PE。虚线透明峰为阳性对照，其中一抗为生物素标记的4C12，二抗为Streptavidin-PE；实线透明峰显示9H10与4C12对位点的竞争性抑制。将9H10加入L929/OX40L反应后再与生物素标记的4C12作用，最后加入Streptavidin-PE。2：灰色峰为阴性对照，其中一抗为生物素标记的小鼠IgG，二抗为Streptavidin-PE；虚线透明峰为阳性对照，其中一抗为生物素标记的1E7，二抗为Streptavidin-PE；实线透明峰显示9H10与1E7对位点的竞争性抑制，将9H10加入L929/OX40L反应后再与生物素标记的1E7作用，最后加入Streptavidin-PE。3：灰色峰为阴性对照，其中一抗为生物素标记的小鼠IgG，二抗为Streptavidin-PE；虚线透明峰为阳性对照，其中一抗为生物素标记的1E7，二抗为Streptavidinn-PE；实线透明峰显示4C12与1E7对位点的竞争性抑制，将4C12加入L929/OX40L反应后再与生物素标记的1E7作用，最后再加入Streptavidin-PE。

图6显示Westernblot免疫印迹分析。M为分子量标准(KD)；2、4、6为诱导表达GST-OX40L融合蛋白工程菌的菌体蛋白，其中加入的抗体2为9H10，4为4C12，6为1E7；1、3、5为以未诱导的菌体蛋白作为阴性对照，其中加入的抗体1为9H10，3为4C12，而5为1E7。

图7显示以3H-TdR掺入法分析单抗9H10和4C12抑制混合淋巴细胞反应。其中纵坐标为cpm值，横坐标为不同反应组。A：为单向混合淋巴细胞反应，即抗人OX40L单抗9H10和4C12及其联合抗人B7-1单抗抑制成熟树突细胞(CD)对T细胞的促增殖作用。B：为双向混合淋巴细胞反应。其中1：人外周血单个核淋巴细胞(PBMC1)样品；2：另一份人外周血单个核淋巴细胞(PBMC2)样品；3：PBMC1+PBMC2；4：PBMC1+PBMC2+IgG；5：PBMC1+PBMC2+9H10；6：PBMC1+PBMC2+4C12。

图8显示流式细胞仪分析9H10对DC细胞成熟的促进作用。灰色峰显示阴性对照，其中使用荧光素PE标记的小鼠IgG直标单抗；透明峰显示DC与PE标记的不同直标单抗(CD80-PE、CD86-PE、CD83-PE和CXCR4)的反应。

图9显示酶联免疫法分析9H10激发的DC促进T细胞分泌细胞因子。横坐标为细胞反应天数，纵坐标为细胞因子的含量。

图10显示酶联免疫法分析单抗9H10和4C12促进T细胞依赖性B细胞分泌IgG。纵坐标为人IgG含量，横坐标为不同反应组。

图11显示以³H-TdR掺入法分析单抗1E7对T细胞的促增殖作用。纵坐标为cpm值，横坐标为不同反应组。

发明的具体内容

本发明涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7，其制备方法以及这些单克隆抗体在体外抑制混合淋巴细胞反应、刺激T细胞增殖、诱导树突状细胞分化成熟、刺激T细胞依赖性B细胞分化及抗体分泌中的应用。

本发明进一步涉及使用抗OX40L单克隆抗体生产用于提高人或哺乳动物的免疫反应的药物组合物。在T细胞被其所接触的特定抗原激发后，投用这样的药物组合物可有效地增加宿主体内细胞因子的产生量和记忆T细胞的数目，通过加强T细胞对抗原的识别能力提高免疫系统针对特异性抗原(例如肿瘤细胞或其他病原因子)的免疫反应。

本说明书中所说的“OX40受体”是指抗原活化的CD4⁺T细胞表面上表达的蛋白质；OX40配体是某些哺乳动物细胞上表达的可与OX40受体特异结合的蛋白质。

术语“OX40L”包括完整的OX40配体、可溶性OX40配体及包括OX40配体之功能活性部分的融合蛋白。术语“抗OX40L抗体”可以是OX40特异性单克隆或多克隆抗体或它们的免疫学活性部分。本发明中，优选的是单克隆抗体，特别是小鼠抗人OX40L抗体。

可以按照本领域已知的常规方法制备本发明的抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7(参见Kohler and Milrtein，Nature 256：495-96，1975；Harlowand Lane，Antibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要时，也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗OX40单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，最好使用被携带人OX40L基因的表达载体转化的并可在适当的培养条件下高效表达人OX40多肽的重组体细胞作为制备本发明单克隆抗体的免疫原。

因此，为了制备本发明的抗人OX40L单克隆抗体，首先构建高表达人OX40L的转基因细胞(L929/OX40L)。高表达人OX40L分子的转基因细胞L929/OX40L具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。另外，由于L929细胞是鼠源性的成纤维细胞，细胞表面其他分子具有相对较弱的抗原性，因此用该细胞作为免疫原将会减少非特异性抗体的产生，使单克隆抗体的筛选更为方便并大大提高阳性检出率。

为了制备L929/OX40L细胞，可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour，1989)进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养。例如，首先，通过RT-PCR技术从成熟的树突状细胞中扩增出人OX40L基因。将OX40L基因装入逆转录载体pEGZ-Term，得到重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/OX40L。然后，使用重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/OX40L与辅助病毒pHIT456和pHIT60一起共转染293T细胞。48小时后，收集含病毒颗粒的293T细胞培养物上清，以其感染L929细胞，连续感染3天。最后，用含Zeocin的选择培养基筛选，待抗性单克隆生长至足够大，挑取单克隆集落进行扩大培养。按上述方法获得的转基因细胞的OX40L表达率高达97％以上。

已按照布达佩斯条约和中国专利法实施细则第25条的规定，于2004年6月2日将产生抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7的杂交瘤细胞株保藏在中国北京中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号分别为CGMCC No.1167、CGMCC No.1168和CGMCC No.1169。

可以按照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein，Nature 265：495-497，1975)制备本发明的抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7。简单地说，用转基因细胞L929/OX40L免疫BALB/C小鼠。当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，分离动物的脾细胞并制备单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞。例如，可以将脾细胞悬液加到OX40L抗原蛋白质包被的平板或小孔内，表达OX40L多肽特异性免疫球蛋白的B细胞即结合到平板上，而不能被其余的悬液洗掉。然后可以收集所得到的B细胞或所有解离的脾细胞，并在适当的融合剂例如聚乙二醇的诱导下与骨髓瘤融合以形成杂交瘤，并在选择性培养基例如HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞。然后，用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。于体外(例如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌抗人OX40L抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化所需的抗体。

核苷酸序列分析结果显示，本发明的纯化的三株抗人OX40L单克隆抗体9H10和4C12重链和轻链的核苷酸编码序列分别如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示，并且抗人OX40L单克隆抗体1E7轻链具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸编码序列；根据单克隆抗体9H10和4C12的核苷酸编码序列推测的重链和轻链氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示，并且抗人OX40L单克隆抗体1E7轻链具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。其中所有氨基酸序列都是以氨基酸的标准三字母缩写符表示的。

流式细胞仪分析结果显示，本发明提供的抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7均能不同程度地识别成熟DC和活化B细胞表面上表达的OX40L分子。竞争抑制试验结果进一步显示，本发明的抗人OX40L单克隆抗体9H10与4C12可识别部分相同的抗原位点，而1E7则识别完全不同的抗原位点。因此，有可能利用9H10和1E7或4C12和1E7制备用于检测可溶性人OX40L的试剂盒。

为了鉴定本发明的抗人OX40L单克隆抗体的生物学功能，本发明首先进行了混合淋巴细胞反应。混合淋巴细胞反应是一种用于判断移植术是否适合进行和监测移植后排斥反应的程度的重要试验。我们的单向和双向混合淋巴细胞反应结果表明，本发明的抗人OX40L单克隆抗体9H10和4C12均能阻断OX40/OX40L结合，以剂量依赖方式抑制T淋巴细胞的增殖，并且能够与抗人B7-1阻断型单抗发挥协同作用。移植排斥反应和自身免疫性疾病都表现为T细胞的过度活化，因此，可利用本发明的这两株阻断型抗人OX40L单克隆抗体抑制T细胞的活化增殖，进而抑制T细胞免疫应答，以预防和治疗移植排斥反应和自身免疫性疾病。

本发明的另一株抗人OX40L单克隆抗体1E7则具有相反的生物学活性。实验表明，该抗体能够与激发型CD3单抗协同促进T细胞的增殖。众所周知，肿瘤发生是因细胞逃避免疫监视而发生恶性增殖的结果。免疫逃避机制之一是由于机体抗原递呈细胞特别是树突状细胞在数量和功能上的异常，致使机体的肿瘤抗原特异性T细胞处于免疫耐受状态。因此，有可能利用本发明的激发型抗人OX40L单克隆抗体1E7改变T细胞免疫耐受状态，并激发机体特异性抗肿瘤免疫反应，以清除和控制肿瘤细胞。

树突状细胞(DC)是活体内专门化的抗原递呈细胞，为原发和继发免疫反应的开启者。DC是唯一可以激发幼稚性T细胞的抗原递呈细胞，其抗原递呈能力较其他抗原细胞(包括巨噬细胞和B细胞)大100倍以上，因此在诱导机体特异性细胞免疫中起着极其重要的作用。在使用低剂量CD40单抗激发的基础上，本发明的抗人OX40L单克隆抗体9H10能进一步上调DC上的共刺激分子CD80、CD86、CD83以及趋化性细胞因子受体CXCR4分子的表达。也就是说，9H10可促进DC的分化成熟。而且，与单独使用CD40单抗激发的DC相比，联合抗入OX40L单抗(9H10)激发的DC能促进T细胞分泌更多的IL-2和IFN-γ，而IL-4和IL-10的变化则不大。这些研究结果说明，抗人OX40L单抗能进一步促进T细胞向Th1方向分化。

使用DC体外激发，或同时负载肿瘤抗原或者目的基因转染的DC作为疫苗，免疫接种后可有效地激发机体的特异性抗肿瘤主动免疫反应，对肿瘤细胞产生特异性杀伤作用。在应用DC进行肿瘤治疗中关键的技术之一是设法在体外获得大量用于治疗目的的DC。体外扩增树突状细胞所采用的方法通常是在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人重组白细胞介素4(IL-4)存在下体外培养单核细胞，刺激6天后再加入激发型抗人CD40单克隆抗体。我们的研究发现，如果同时加入抗人OX40L单抗9H10，可更有效地促进DC的成熟。这些DC不仅能够增强对T细胞的激发作用，而且还可促进T细胞向Th1分化，从而增强T细胞的抗肿瘤免疫反应。

B细胞在体液免疫中起着重要的作用。在T细胞依赖的美洲商陆(PWM)激发的B细胞培养体系中，本发明的抗人OX40L单克隆抗体9H00或4C12的培养上清IgG含量明显增加，表明这两株单抗有助于B细胞的分化并能促进T细胞依赖性B细胞的抗体分泌。

以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节。但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1：抗人OX40L单克隆抗体的制备

本实施例描述本发明的抗人OX40L单克隆抗体9H10、4C12和1E7的制备。

(1)转基因细胞L929/OX40L和L929/mock的建立

(a)人OX40L基因的克隆：使用TRIZOL试剂(Gibco，BRL)抽提抗原诱导成熟的DC的总RNA。按照MBI逆转录试剂盒使用说明书推荐的方法，将mRNA逆转录成cDNA。取5μlcDNA为模板，使用上游引物5’-AACTG CAGATG GAA AGG GTC CAA CCC-3’(SEQ ID NO：11)，和下游引物5’-CG GGATTC TCA AAG GAC ACA GAA TTC-3’(SEQ ID NO：12)进行PCR扩增(94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸5分钟)。纯化后，在T₄DNA连接酶作用下直接将PCR产物与pMD18-T载体连接过夜。用所得连接产物转化感受态细菌TOP10，并对筛选的阳性克隆进行PCR和酶切鉴定以及DNA测序。结果显示，所获得的cDNA序列与GenBank中注册的人OX40L cDNA序列完全一致。

(b)重组逆转录病毒载体的构建：分别用核酸内切酶PstI和BamHI消化测序正确的pMD18-T/OX40L质粒和逆转录病毒载体pEGZ-Term(现代免疫学，2004，24(2)：99-103)(37℃，4小时)。回收含目的基因的片段，并用连接产物转化感受态细菌。用上述方法鉴定证实后，将所获得的重组逆转录病毒载体定名为pEGZ-Term/OX40L。

(c)稳定表达人OX40L的L929转基因细胞的构建：按照图1所示的流程，首先以试剂盒操作手册推荐的脂质体法，用重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/OX40L和辅助病毒pHIT456与pHIT60(现代免疫学，2004，24(2)：99-103)(体积比2：1：1)共转染6孔板中60-70％汇合生长成片的293T细胞。48小时后收集含病毒颗粒的293T培养上清，以其感染L929细胞。加入polybrene至终浓度为8ng/ml，继续37℃感染6小时。再加入含10％胎牛血清(FCS)的1640培养基(2ml/孔，隔天换液)。重复感染3次后收集细胞，将1：6稀释的细胞培养物置于含Zeocin(Invitrogen，500μg/ml)的选择培养基中筛选培养2周。待抗性单克隆生长至足够大，挑取单克隆菌落进行扩大培养。同时制备用作阴性对照的转基因细胞L929/mock。流式细胞仪检测显示，L929/OX40L细胞膜上人OX40L蛋白的表达率约为97％。

(2)抗人OX40L单克隆抗体的制备

使用如上得到的高表达OX40L分子的转基因细胞(L929/OX40L)作为免疫原，三次免疫接种Balb/c小鼠(10⁷/500μl/只)(间隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株进行细胞融合(共20块96孔板)。以高表达OX40L分子的L929/OX40L为阳性对照及表达OX40L分子的L929/mock为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定(参见图2)。阳性克隆经3次有限稀释后，克隆的阳性率达到约95％。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人OX40L的杂交瘤细胞株，并分别被命名为9H10(CGMCC No.1167)、4C12(CGMCCNo.1168)和1E7(CGMCC No.1169)。这些杂交瘤细胞经体外持续传代(40代)后，仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株9H10、4C12和1E7的染色体分析显示，这三株杂交瘤细胞的染色体数目为80-110(参见图3)。

(3)抗人OX40L单克隆抗体的生产与特性鉴定

(a)采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞(1×10⁷/只)，同时再次腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物(0.2ml/只)。5-10天后收获腹水，并离心取上清于-80℃保存。

(b)腹水型单抗的纯化和定量。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8～10mg/ml。间接免疫荧光法分析，纯化后单抗的效价为1:1000以上。

(c)Ig亚类鉴定。采用试纸快速测定(Argen公司)法，鉴定Ig亚类，结果显示9H10和1E7均为小鼠IgG1型，4C12为IgG2b型。

(d)间接免疫荧光法分析OX40L在活化B细胞及成熟DC上的表达。取出美洲商陆(PWM)活化3天的扁桃体淋巴细胞，加入单抗9H10、4C12或1E7(每管2μg)，4℃孵育30分钟。洗涤后用FITC标记的羊抗鼠IgG处理细胞并用PE标记的CD19直接标记抗体，4℃孵育30分钟后进行流式细胞分析。结果可见，三株单抗均能识别活化B细胞上表达的OX40L分子(图3)。同样，用相似方法检测的结果证实，本发明的三株单克隆抗体也均能识别成熟DC上表达的OX40L分子(参见图4)。

(e)抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验。在L929/OX40L细胞(5×10⁵/管)悬液分别加入单克隆抗体(每管2μg)，4℃孵育45分钟。洗细胞后依次加入生物素标记的单抗，和streptavidine-PE，并分别4℃孵育30分钟。再次洗涤后用流式细胞仪分析，同时设阳性和阴性对照。如图5所示，单抗9H10部分阻断单抗4C12与L929/OX40L细胞上OX40L分子的结合，单抗9H10和4C12均不能阻断单抗1E7与L929/OX40L细胞上OX40L分子的结合。由此表明，9H10与4C12识别的OX40L分子抗原位点不完全相同，而1E7则具有不同于9H10和4C12的抗原识别位点。

(f)单抗的Westem印迹鉴定。0.1μg表达GST-OX40L工程菌的菌体蛋白经12％SDS-PAGE电泳，并电转移(0.65mA/cm²)至硝酸纤维膜上，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。翌日加入纯化的抗体室温孵育1小时。用TBST溶液洗去未结合的抗体，加入AP标记的二抗，30分钟。孵育后加入底物显色。如图6所示，9H10、4C12和1E7均能与OX40L蛋白特异性结合，形成阳性条带。表明这三株单抗均具有识别OX40L分子的良好特异性。

实施例2：抗人OX40L单克隆抗体9H10和4C12抑制单向和双向混合淋巴细胞反应

本实施例描述以³H-TdR掺入法检测单克隆抗体9H10和4C12对混合淋巴细胞反应的抑制作用。

(1)外周血单个核细胞(PBMC)、T细胞和树突状细胞(DC)的制备：取正常志愿者外周血100ml(得自苏州红十字血站)，分离(Ficoll)得到单个核细胞。洗细胞后，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基稀释至3×10⁶/ml。置于6孔培养板(2ml/孔)中培养2小时(5％CO₂，37℃后)轻轻吸出悬浮细胞，即得到PBMC。在培养板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)和含10％FCS的RPMI1640培养基继续培养，3天换液一次。第6天加入激发型抗人CD40单抗(本室研制，5μg/ml)继续培养。第8天用常规方法收集成熟的DC。T细胞同样取自正常志愿者外周血并按照常规绵羊红细胞结合法分离获得(纯度>90％)。

(2)单向混合淋巴细胞反应：将T细胞(1×10⁵/孔)和体外诱导成熟的DC以20：1比例加入96孔板中。加入不同浓度的单抗9H10或4C12，每组设3个复孔，同时设小鼠IgG同型对照。于培养第5天加入³H-TdR(0.5μCi/孔)，继续培养16-18小时。培养后将细胞收集于49^#玻璃纤维纸上，烘干并测定放射性核素的每分钟闪烁计数值(cpm)。结果可见，两株单抗均能按剂量依赖方式不同程度地抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用(参见图7A)。

(3)双向混合淋巴细胞反应：将得自于两个献血员的外周血单个核细胞(PBMC)等比例加入96孔板中(1×10⁵/孔)，然后向各孔内加入单抗9H10或4C12(10μg/ml)，每组设3个复孔。于培养第7天再加入³H-TdR(0.5μCi/孔)并继续培养16-18小时。培养后将细胞收集到49^#玻璃纤维纸上，烘干并测定放射性核素的每分钟闪烁计数值(cpm)。结果可见，两株单抗均能不同程度地抑制双向混合淋巴细胞反应(参见图7B)。

实施例3：抗人OX40L单克隆抗体9H10促进树突状细胞(DC)成熟并进而激发T细胞

本实施例描述分别以流式细胞术和酶联免疫法检测单克隆抗体9H10对DC的促分化作用。

(1)抗人OX40L单克隆抗体9H10促进DC分化成熟：取正常志愿者外周血200ml(得自苏州红十字血站)，分离得到单个核细胞。洗细胞后，用含10％小牛血清(FCS)的RPMI1640培养基将细胞稀释至3×10⁶/ml，并置于6孔培养板(2ml/孔)中培养2小时(5％CO₂，37℃)。然后轻轻吸出悬浮细胞，在培养板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)和10％FCS的RPMI1640培养基继续培养，3天换液一次。第6天加入激发型抗人CD40单抗(为本室研制，2μg/ml)和抗人OX40L单抗9H10(5μg/ml)继续培养。两天后取出DC，用流式细胞仪检测CD80、CD86、CD83和CXCR4的表达。结果可见，在抗人CD40单抗激发的基础上，单抗9H10能上调DC表面上某些分子如CD80、CD86、CD83和CXCR4的表达，，表明9H10能进一步促进DC成熟(参见图8)。

(2)以1：20比例在DC细胞培养物中加入T细胞，分别于第1、3、5、7天取培养物上清，用酶联免疫法检测其中细胞因子的存在。如图9所示，与单用抗人CD40单抗或OX40L单抗激发的DC相比，联合使用9H10和CD40单抗激发的DC能促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ，而对IL-4和IL-10的分泌水平则变化不大。此结果表明抗人OX40L单抗激发的DC能促进T细胞向Th1方向分化。

实施例4：抗人OX40L单克隆抗体9H10和4C12促进T细胞依赖性B细胞的抗体分泌

本实施例描述以酶联免疫法检测单克隆抗体9H10和4C12对受激发的B细胞IgG分泌水平的影响。

(1)扁桃体淋巴细胞的制取：剥离手术切除的扁桃体的包膜，常规制备单细胞悬液，并从中分离(Ficoll)扁桃体淋巴细胞(B细胞纯度约为50％)。

(2)酶联免疫法检测人IgG水平：将所得到的B细胞加入24孔板中(5×10⁵/孔)，同时加入PWM(4μg/ml)以活化B细胞。向各孔中加入抗人OX40L单克隆抗体9H10或4C12，培养10天后收集培养物上清，并以酶联免疫法检测其中的人IgG水平。结果显示，抗人OX40L单抗9H10和4C12均能不同程度地促进T细胞依赖性B细胞的IgG分泌(参见图10)

实施例5：抗人OX40L单克隆抗体1E7用于体外扩增T细胞

本实施例描述以³H-TdR掺入法检测单克隆抗体1E7对T细胞的促增殖作用。

(1)T细胞制备：使用常规绵羊红细胞结合法从正常志愿者外周血淋巴细胞中分离T细胞(纯度>90％)。

(2)单抗1E7对T细胞的促增殖作用：将激发型抗人CD3单抗(0.5μg/ml)加入96孔板中包板，4℃孵育过夜。用PBS洗细胞(两次)后，向其中加入T细胞，并加入不同浓度的抗人OX40L单抗1E7(2.5、5和10μg/ml)。于培养第3天再加入³H-TdR(0.5μCi/孔)并继续培养16-18小时。然后将细胞收集到49^#玻璃纤维纸上，烘干并测定放射性核素的每分钟闪烁计数值(cpm)。结果显示，本发明的抗人OX40L单抗1E7能够以剂量依赖方式显著地促进T细胞的增殖，(参见图11)。

杂交瘤样品保藏

鉴于阳性杂交瘤特别是以高产率产生本发明单克隆抗体的杂交瘤筛选的偶然机遇性，也是作为对本说明书文字描述部分的补充，本申请人在保藏用作免疫原的转基因细胞的同时，还在同一微生物保藏机构(中国普通微生物保藏管理中心，CGMCC)保藏了分别产生本发明的单克隆抗体9H10、4C12和1E7的三个杂交瘤细胞株，它们的保藏编号分别为CGMCC No.1167、CGMCCNo.1168和CGMCC No.1169。

序列表

<110>苏州大学生物技术研究所

<120>抗OX40L单克隆抗体制备及应用

<140>

<141>

<160>12

<210>1

<211>468

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人OX40L单克隆抗体9H10重链的核苷酸编码序列。

<400>1

<210>2

<211>345

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人OX40L单克隆抗体9H10轻链的核苷酸编码序列。

<400>2

<210>3

<211>456

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人OX40L单克隆抗体4C12重链的核苷酸编码序列。

<400>3

<210>4

<211>348

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人OX40L单克隆抗体4C12轻链的核苷酸编码序列。

<400>4

<210>5

<211>342

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的抗人OX40L单克隆抗体1E7轻链的核苷酸编码序列。

<400>5

<210>6

<211>156

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人OX40L单克隆抗体9H10的重链核苷酸编码序列推测的重链氨基

     酸序列。

<400>6

<210>7

<211>156

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人OX40L单克隆抗体9H10的轻链核苷酸编码序列推测的轻链氨基

     酸序列。

<400>7

<210>8

<211>115

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人OX40L单克隆抗体4C12的重链核苷酸编码序列推测的重链氨基

     酸序列。

<400>8

<210>9

<211>115

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人OX40L单克隆抗体4C12的轻链核苷酸编码序列推测的轻链氨基

     酸序列。

<400>9

<210>10

<211>

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的抗人OX40L单克隆抗体1E7的轻链核苷酸编码序列推测的轻链氨基酸

     序列。

<400>10

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>7

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>8

Claims (4)

1、一种抗可溶性人OX40L的单克隆抗体，其为单克隆抗体9H10或4C12，其中产生单抗9H10的杂交瘤细胞株的保藏登记号为CGMCC No.1167，产生单抗4C12的杂交瘤细胞株的保藏登记号为CGMCC No.1168。

2、根据权利要求1的单克隆抗体在体外抑制单向和双向混合淋巴细胞反应中的应用。

3、根据权利要求1的单克隆抗体在体外刺激T细胞依赖性B细胞的抗体分泌中的应用。

4、根据权利要求1的单克隆抗体在体外诱导树突状细胞分化和成熟中的应用。

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