CN102533656A

CN102533656A - 一种细胞株的筛选方法

Info

Publication number: CN102533656A
Application number: CN2010106197335A
Authority: CN
Inventors: 薛建华; 应勖
Original assignee: GENOR BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: GENOR BIOPHARMA CO Ltd
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明公开了一种细胞株的筛选方法，包括将轻重链序列转入不同质粒载体，然后转染细胞和利用选择标记进行细胞筛选的步骤，将所述的重链序列插入带有选择标记的筛选基因的载体，将所述的轻链序列插入带有抗性基因的载体上，二者共同转染共扩增基因表达系统细胞后，先用抗性培养基筛选阳性克隆，然后进行压力筛选扩增表达，最终获得了稳定高表达的细胞株。

Description

一种细胞株的筛选方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术，特别涉及在CHO哺乳动物细胞中重组表达单克隆抗体，并筛选稳定的高表达细胞株的工艺。

背景技术

目前单克隆抗体已越来越广泛地用于治疗传统药物难以治愈的疾病，如自身免疫疾病、肿瘤等对人类密切相关的疾病。由于抗体药物在临床使用时需要的剂量大，而且主要是通过静脉滴注进入人体，因此高表达和高纯度是抗体进入临床应用的必要环节(Doner et al.1989，J Bio Chem，264：20602-7；Malm，1987，J Immunol Methods，104：103-9)。所以获得稳定高表达的细胞株成为非常关键的因素(Nature Biotechnology，2004，22：1393)。

常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr^-)，CHO(dhfr^-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点。选择标记和基因扩增CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是neo等非扩增基因。另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase，DHFR)，谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase，GS)。

目前，真核细胞DHFR表达系统主要是通过生长代谢选择压力来获得高表达的细胞株(Birch and Racher，Advanced Drug DeliveryReviews 2006，58：671)。通过增加MTX的培养浓度来增加DHFR基因在染色体年拷贝数，来达到增加外源基因的表达水平的，而更高的MTX浓度更易导致细胞株的不稳定(Kim et al.1998，BiotechnologyBioengineering，58：73-84)。所以选择低的MTX浓度有利于筛选得到稳定的细胞株。抗体的表达很大程度上依赖于轻链的表达，合适的H/L比例可以促进完整抗体的分泌(Schlatter et al.，2005，Biotechnology Progress，21：122-133)。目前，国内报道的真核细胞表达人源化抗体的产量均较低，难以实现产业化并实际应用。抗体产量最好在50mg/L以上(Beidler et al，1988，J Immunol，141：4053-60)，如此才能达到产业化的最低要求。

发明内容

本发明是针对现有细胞表达系统效率低，难以获得稳定高表达细胞株的问题，公开了一种引入抗性筛选的细胞表达系统。

一种细胞株的筛选方法，包括将轻重链序列转入不同质粒载体，然后转染细胞和利用选择标记进行细胞筛选的步骤，其特征在于，将所述的重链序列插入带有选择标记的筛选基因的载体，将所述的轻链序列插入带有抗性基因的载体上，二者共同转染共扩增基因表达系统细胞后，先用抗性培养基筛选阳性克隆，然后进行压力筛选扩增表达。

所述重链序列插入带有DHFR筛选基因的载体，所述轻链序列插入带有Zeocin抗性基因载体上。

在一个实施方案中，所述的抗性筛选培养基为含有Zeocin抗性筛选培养基。所述的Zeocin筛选浓度为100-400ug/ml，优选为200-250ug/ml。

在本发明的实施例中，应用CHO细胞DHFR表达系统，将轻重链分别插入二种表达载体中共转染CHO细胞，为保证细胞能同时表达HL链，也为了增加筛选概率，同时加入了Zeocin抗性筛选。抗体的表达水平很大程度上依赖于轻链的表达，所以在高表达的细胞株中，轻链的过度表达有利于完整抗体分子的分泌，且有利于后续工艺中的蛋白纯化。

本发明的一具体实施例的筛选方案包括以下工艺步骤：

在一个实施方案中，筛选培养基选用含有HT成分的DMEM/F12培养基。为获得高表达的细胞株，选择合适的培养基同样非常重要，在本发明的一实施例中，筛选培养基选用含有HT成分的DMEM/F12培养基，以补偿单细胞培养过程中DHFR缺陷型细胞的代谢，有利于克隆的形成，进而筛选到高表达的细胞株。

随培养的时间延长，不断增加MTX的浓度。待细胞恢复活力后，以有限稀释法进行单克隆的筛选工作，以每孔1个细胞的密度铺96孔板，每孔加入150ul的培养基培养。待培养5天后，加入MTX终浓度为100nM的DMEM培养基，继续培养至克隆形成。取培养的单克隆细胞上清，进行ELISA测定，然后挑取表达高的克隆，分别依次扩增到24孔板、6孔板、T75细胞培养瓶。培养的细胞克隆继续在无血清培养基302中驯化成悬浮培养，并冻存细胞株于液氮中。

附图说明

图1为本发明一实施例的克隆筛选工艺流程图。

图2为构建的分别表达重组抗体轻重链的质粒：图2a为表达重组抗体轻链的质粒。图2b为表达重组抗体重链的质粒。

图3为本发明一实施例的Western Blotting检测结果。其中，图3a为非还原Western Blotting 结果：1-8为1G2，7A3，4H5，7B7，5H9，2C12，5F1，7D7克隆样品的培养上清；9为蛋白Marker；10为阳性对照。图3b为还原Western Blotting结果：1-8为1G2，7A3，4H5，7B7，5H9，2C12，5F1，7D7克隆样品的培养上清；9为蛋白Marker；10为阳性对照。

图4为本发明一实施例的细胞悬浮培养的生长曲线图。

图5为本发明一实施例的抗体表达水平的检测图。

图6为本发明一实施例连续培养60天的细胞生长和表达情况。

具体实施方式

本发明的技术方案包括分子构建，转染CHO细胞，克隆筛选，细胞驯化等过程，通过在转染后的初期，待细胞活性恢复后，先加入Zeocin压力筛选Zeocin抗性的细胞；然后将阳性克隆转入含MTX的筛选培养基进行筛选，方法如图1所示。

本发明的一具体实施例的筛选方案包括以下工艺步骤：

1)、用二个表达载体分别构建抗体的轻重链序列，其中H链序列插入带有DHFR筛选基因的载体，L链序列插入带有Zeocin抗性基因的载体上，二者共同转染CHO DHFR-细胞；

2)、在10cm培养皿中细胞培养，选择压力的使用是先用Zeocin抗性筛选阳性细胞，然后用MTX压力梯度提高的方式来增加表达；

3)克隆扩增的培养基选用DMEM/F12培养基，其中F12培养基是含HT的培养基。对于单细胞形成克隆过程中，细胞此时的生长是处于不利的条件下，对于高表达的细胞而言，外源提供H、T成分，提供营养更为丰富的培养基更有利于克隆的形成；

4)扩增的细胞克隆经302培养基驯化后，进行细胞表达检测和连续培养，观察细胞的生长和表达稳定性；

5)冻存筛选到的稳定高表达细胞株。

本发明描述的有关附图，其中显示了本发明的优选实施方案。本发明能够以不同方式体现并且不应该解释为本发明局限于本文列出的实施方案。更确切地说，提供了这些实施方案能充分公开、彻底和全面完全地向本领域的技术人员传递本发明的范围。此外，文中所建议的对实施方案的多种变更和补充对于本领域的技术人员是显而易见的，其不脱离本发明所要保护的范围。

除非另外定义，本文中所使用的所有技术科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在本发明描述中使用的术语只是为了描述特定实施方案，而不是旨在对本发明进行限制。

如在本文中所使用的“轻、重链”，是指构成抗体的肽链结构。抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。轻链有κ和λ两种，重链有μ、δ、γ、ε和α五种。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于″Y″的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些区域称高变区，也叫CDR区。高变区位于分子表面，高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性(通常包括CDR1、CDR2和CDR3三个高变区)。

不同种属来源的抗体在结构上有很大的相似性，包含有可变区、恒定区，特别在恒定区，有着同源性非常接近的序列。不同抗体之间的差别主要在于可变区的序列，而这一部分仅占抗体分子的一小部分。本发明所用的抗体轻重链序列有一定的代表性。

实施例

1.表达载体的构建

以人工合成的轻重链作为模板(抗体的轻链DNA及氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；抗体的重链DNA及氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。当然在不同的具体实施方式中，所述的轻重链可以是根据具体实验设计需要而人工合成的，或者是野生型。

PCR扩增相应的轻重链片段，割胶回收目标片段，HindIII/XhoI酶切，将H链片段连入经相同酶切的pZ1。pZ1载体改造自pcDNA3.1表达载体(购自Invitrogen公司)，采用常规方法，用合成的DHFR基因片段(Genebank accession number：NM_010049)替换(XmaI/Csp45I)pcDNA3.1上的Neomycin基因；L链片段连入经相同酶切的pcDNA4载体上(购自Invitrogen公司)。当然，在符合本发明目的情况下，还可以选用其他种类质粒。

转化DH5α感受态细胞，铺氨卞抗性的LB平板，37℃培养过夜挑取阳性菌落，摇床培养过夜，提取质粒，并进行酶切鉴定。对于阳性的克隆进行测序鉴定。最终分别表达H、L链的载体如图2所示。

2.转染哺乳动物细胞

大量抽提质粒pZ1-H和pcDNA4-L DNA，以总量40ug DNA，以H∶L＝1∶2的摩尔比例，电击转染处于对数生长期的CHO DHFR-细胞(ATCC，CRL-9096)，(Bio-Rad GenePulse，参数300V，900uF)。取电击后的细胞放置于含有10％dFBS的DMEM培养基(PAA，E15-810)的培养皿中，加入HT培养。

3.抗性筛选

上述的细胞培养24小时后换细胞上清，不加入HT培养，加入终浓度为200ug/ml的Zeocin培养；连续培养3代以上。

4.分板筛选

转染后的细胞，加入终浓度为5nM MTX加压培养，随培养的时间的延长，不断增加MTX压力，最终MTX的浓度为100nM。用胰酶消化转染的CHO细胞，在血红细胞计数板上计数，以1细胞/孔的细胞密度铺96孔细胞培养板，培养基为含10％dFBS DMEM/F12＝1∶1，终体积为150ul，37℃，5％CO₂后培养5天后，加入50ul含有终浓度为100nM的MTX的DMEM培养基，继续培养10天左右，至克隆形成。然后取细胞培养上清进行表达水平的检测。

5.表达水平的检测：

(1)ELISA筛选：以羊抗human IgG1 kappa多抗包被ELISA板，5％脱脂奶粉封闭过夜，清洗后，加入以PBS 20倍稀释的细胞培养上清，37℃反应1小时，洗板三次后，加入抗human IgG1Fab-HRP抗体，37C反应1小时，洗板三次后，加入TMB显色液，15分钟后加入2％H₂SO₄终止反应，于酶标仪上45nm处读数。结果见表1。

(2)Western Blotting：取培养一段时间后的细胞上清，加入loadingBuffer后，进行12％SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入相应的抗体反应1小时后，PBS洗，加入Dab显色。结果见图3，与阳性对照相比较，筛选的细胞的上清可以清楚地看到表达，无论是还原的还是非还原的Western Blotting蛋白大小与对照蛋白大小相一致。

(3)HPLC Protein A检测抗体表达：取细胞上清，离心弃沉淀，上清0.45um过滤后，过Protein A柱，A280检测抗体的峰面积，与标准品比较来计算抗体的表达水平。

表1、96孔板ELISA检测结果(部分，浓度单位：ug/ml)

6.细胞扩增及驯化

依据ELISA筛选结果，分别挑取表达水平较高的孔，扩增到24孔板中，然后扩大培养到6孔板，T25，T75培养瓶中培养。然后加入302无血清培养基驯化培养，转移到100ml摇瓶120rpm，37℃，5％CO₂摇床培养。待细胞完全适应无血清培养后，取细胞以3×10⁵/ml的接种密度接种于250ml的摇瓶中连续培养，每天取细胞进行计数、细胞活力和表达水平的检测，结果见图4。说明此细胞比较适合大规模培养，可用于生物反应器中进行大规模发酵。

7.细胞表达稳定性检测

取细胞以3×10⁵/ml的接种密度接种于250ml的摇瓶中连续培养，每隔2-3天待细胞生长至1×10⁶密度时，换液维持细胞3×10⁵的密度接种，每天取细胞进行计数、细胞活力和表达水平的检测，结果见图5。在连续近60天的培养过程中，细胞活力基本上保持＞95％的水平；而表达水平基本上维持一个比较稳定的水平，在细胞密度达到1×10⁶时，细胞的表达水平基本上接近20mg/L的水平。

Claims

1.一种细胞株的筛选方法，包括将轻重链序列转入不同质粒载体，然后转染细胞和利用选择标记进行细胞筛选的步骤，其特征在于，将所述的重链序列插入带有选择标记的筛选基因的载体，将所述的轻链序列插入带有抗性基因的载体上，二者共同转染共扩增基因表达系统细胞，先用抗性培养基筛选阳性克隆，然后进行压力筛选扩增表达。

2.如权利要求1所述的细胞株的筛选方法，其特征在于，所述重链序列插入带有DHFR筛选基因的载体，所述轻链序列插入带有Zeocin抗性基因载体。

3.如权利要求1所述的细胞株的筛选方法，其特征在于，所述的抗性培养基为含有Zeocin的培养基。

4.如权利要求3所述的细胞株的筛选方法，其特征在于，所述的Zeocin筛选浓度为100-400ug/ml。

5.如权利要求3所述的细胞株的筛选方法，其特征在于，所述的Zeocin筛选浓度为200-250ug/ml。

6.如权利要求1所述的细胞株的筛选方法，其特征在于，所述的表达系统为CHO细胞DHFR扩增系统，通过在转染后的初期，待细胞活性恢复后，先加入Zeocin压力筛选Zeocin抗性的细胞；然后将阳性克隆转入含MTX的筛选培养基进行筛选。

7.如权利要求1-6任一项所述的细胞株的筛选方法，其特征在于，所述的筛选培养基选用含有HT成分的DMEM/F12培养基。