CN103597073B - 低岩藻糖细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用作表达重组蛋白宿主细胞的具有零岩藻糖水平的细胞的选择方法。该方法包括:(d)使CHO细胞接触氨甲喋呤(MTX)从而在CHO细胞的细胞群中导入基因突变;(e)使含有突变细胞的CHO细胞群接触无毒岩藻糖结合剂一定的时间量,使岩藻糖结合剂结合于该细胞群细胞膜的岩藻糖部分,其中所述一定的时间量不会导致杀伤细胞;和(f)清除含突变细胞的细胞群中结合该岩藻糖结合剂的细胞亚群,从而选出细胞用作表达重组蛋白的宿主细胞,所选细胞的岩藻糖含量为零。本发明还公开了用作表达重组蛋白宿主细胞的细胞和细胞系。
Description
发明领域和背景
本发明在其某些实施方式中涉及CHO细胞系,产生该细胞系的方法及其应用。
重组的治疗性抗体在治疗各种各样疾病中已发挥了重要作用。估计下一个十年中可能约30%新出现的药物基于抗体。已批准了30种重组抗体和Fc融合物进入市场,2008年销售额达到350亿美元。
抗体含有由重链和轻链可变区组成的靶抗原特异性区域。抗体的这个部分可结合和中和可溶性靶抗原或膜结合的靶抗原。
Fc部分通过抗体依赖的细胞毒(ADCC)机制、补体依赖的复合体(CDC)和新生受体FcRn机制负责效应器功能。通过效应分子与铰链区和Fc的CH2区的相互作用介导了这些效应器功能。CH2区含有一个位于抗体297位N糖基化位点的寡糖,已知其在结合效应细胞中起着重要作用。该寡糖通常由具有相当大异质性的双触角型复合体如核心戊糖与附加的可变外糖残基一起组成。
ADCC是一种重要的抗体结合靶细胞膜配体的杀伤机制。白细胞上表达的FcγR能结合抗体的CH2区。一旦结合,与靶细胞上的抗原产生免疫复合体而启动白细胞活化。这种活化可包括吞噬和细胞介质的释放,这些介质导致细胞通透增加和死亡。ADCC活性一方面依赖于IgG同种型,另一方面依赖于特异性的FcγR。IgG1和IgG3可诱导这种活性,而IgG4则不能。能结合IgG并对ADCC激活机制重要的FcγR称为FcγRIIIa,其表达在NK细胞和巨噬细胞上。在许多情况下通过NK细胞与靶细胞的结合所获得的ADCC活性并不足以实施对靶细胞的杀伤。其原因是FcγRIIIa对IgG1的亲和力低。
与表达FcγRIIIa-158Phe的患者相比,见于10-15%人群的表达高亲和力同种异型FcγRIIIa-158Val的患者中,发现ADCC活性增强。也可通过对IgGFc操作来获得ADCC增强。利用计算机设计算法对抗体进行工程改造,并用高通量筛选来选择高亲和力抗体。这一工作产生了在体外显示效应器功能增强大于2个数量级的抗体(Lazar,Dang等;2006),虽然测得突变的IgG1(含S239D、A33OL和I332E的IgG1)热稳定性降低。获得ADCC增强的抗体的另一种方法是产生寡糖上297位的岩藻糖水平低的抗体。先前曾发现该寡糖上的岩藻糖残基可干扰Fc与FcγRIIIa的结合(Shinkawa,Nakamura等;2003)。获得低岩藻糖水平抗体的一种方法是采用具有这种天然能力的控制细胞,如大鼠杂交瘤YB2/0细胞(Shinkawa,Nakamura等;2003),然而这些细胞产生的重组蛋白的岩藻糖含量水平是可变的。几种可能采用的其他非哺乳动物细胞包括Vivalis类的禽细胞,Biolex公司工程改造的水生植物浮萍(Cox,Sterling等;2006)和Igeneon公司的变种Physocmirtella苔藓(Nechansky,Schuster等;2007)。此外,GlycoFi制备了具有几种糖基化能力包括增强ADCC的多种毕赤酵母细胞系(Hamilton,Davidson等;2006)。也可采用几种哺乳动物细胞来制备具有各种通用糖基化能力特别是增强ADCC的抗体。Glycotope创造了多种糖基经工程改造的人细胞系以产生糖基优化的生物治疗剂。罗氏公司通过导入一种能催化形成涉及抗体依赖性细胞毒(ADCC)的二等份寡糖的糖基转移酶,β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII),获得了Glycart,一种能产生岩藻糖水平降低的重组抗体的基因工程细胞系,(Umana,Jean-Mairet等;1999)。Biowa公司制备了岩藻糖转移酶基因(Fut8)被敲除的CHO DG44细胞以降低岩藻糖水平(Yamane-Ohnuki,Kinoshita等;2004)。
近年研究证明在胞质内异源表达的原核酶,GDP-6-脱氧-D-来苏糖-4-已酮糖还原酶,能阻断中间体GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖转变成终末产物,这在脊椎动物细胞中通常不会发生。因此,用这种方法修饰的CHO细胞分泌的抗体缺乏核心岩藻糖(von Horsten,Ogorek等;)。另一种方法是制备能在毒性岩藻糖特异性凝集素存在下存活的凝集素抗性突变体。Lec13细胞是基于在毒碗豆岩藻糖特异性凝集素存在下培育CHO细胞所产生的一种CHO细胞系(Ripka和Stanley,1986)。Lec13细胞缺乏GDP-甘露糖4,6-脱水酶活性,导致表达的人IgG1缺乏岩藻糖(Shields,Lai等;2002)。
美国专利申请No.2010/0081150报告了用化学方法处理和选择显示变体糖基化模式的细胞(包括用高剂量岩藻糖杀伤细胞以降低岩藻糖基化)所产生的CHO细胞突变体,以产生用于表达抗体的细胞。
美国专利申请No.2010/0304436报告了通过突变Fx蛋白和调控外源岩藻糖的利用度产生岩藻糖基化降低的CHO细胞系,以指导细胞岩藻糖基化多肽的能力。
Kanda等(Kanda,Imai-Nishiya等,2007)公开了GMD和FUT8基因被敲除的宿主细胞系。该GMD敲除细胞具有与GMD外显子5,6和7区相应的基因组缺失。
Ripka等(Ripka和Stanley,1986)公开了4种凝集素抗性CHO突变细胞。通过用N-甲基-N-亚硝基胍培育产生这类突变。
Shields等(Shields,Lai等;2002)公开了Lec13(岩藻糖缺陷的CHO)细胞系产生的IgG1提高了与FcγRIIIa的结合高达50倍,其ADCC也增强。
Kanda等(Kanda,Yamane-Ohnuki等,2006)公开了Lec13细胞可产生50-70%岩藻糖基化的抗体,然而该已知的细胞系不能稳定产生抗体。因此Lec13细胞系不适合作为生产细胞系。
发明概述
按照本发明某些实施方式的一个方面,提供选择CHO细胞用作表达重组蛋白的宿主细胞的方法,该方法包括:
(a)使CHO细胞接触氨甲喋呤(MTX)从而在CHO细胞的细胞群中导入基因突变,
(b)使含有突变细胞的CHO细胞群接触无毒性的岩藻糖结合剂一定量的时间,使该岩藻糖结合剂结合于该细胞群细胞膜上的岩藻糖部分,其中所述一定量的时间不会导致杀伤细胞;和
(c)清除含突变细胞的细胞群中结合该岩藻糖结合剂的细胞亚群,从而选出细胞用作表达重组蛋白的宿主细胞,所选细胞的岩藻糖含量为零。
按照本发明某些实施方式的一个方面,提供按本发明上述方法产生的分离的CHO细胞。
按照本发明某些实施方式的一个方面,提供经基因修饰能表达具有如SEQ ID NO:23和/或24所示氨基酸序列的突变的GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)的分离的CHO细胞。
按照本发明某些实施方式的一个方面,提供含有本发明分离细胞的CHO细胞系。
按照本发明某些实施方式的一个方面,提供含有本发明分离的CHO细胞的细胞培养物和没有异种污染物的细胞培养液。
按照本发明某些实施方式的一个方面,提供一种产生重组蛋白质的方法,即用含有编码该重组蛋白的核酸序列的聚核甘酸转染本发明分离的CHO细胞,在适合表达该重组蛋白的条件下培养该转染的CHO细胞和分离该蛋白质。
按照本发明某些实施方式的一个方面,提供一种经基因修饰的分离的CHO细胞,使其中所表达的蛋白质的岩藻糖基化含量呈线性依赖于外部岩藻糖浓度。
按照本发明某些实施方式,岩藻糖结合剂对突变的CHO细胞群无毒性。
按照本发明某些实施方式,岩藻糖结合剂附着于可检测部分或亲和部分。
按照本发明某些实施方式,在CHO细胞群中导入基因突变是通过使细胞接触能引起岩藻糖合成通路中GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因突变的诱变剂而实施的。
按照本发明某些实施方式,使突变的细胞群接触岩藻糖结合剂的时间量不长于60分钟。
按照本发明某些实施方式,当岩藻糖结合剂附着于亲和部分时,所述方法还包括使突变的CHO细胞群接触其他物质,该其他物质含有与该亲和部分同类的结合部分。
按照本发明某些实施方式,所述亲和部分包括生物素。
按照本发明某些实施方式,所述同类的结合部分附着于一可检测部分。
按照本发明某些实施方式,所述可检测部分包括荧光基团或磁性基团。
按照本发明某些实施方式,通过FACS分拣实施所述清除。
按照本发明某些实施方式,通过磁性分离实施所述清除。
按照本发明某些实施方式,通过至少三轮顺次清除实施所述清除。
按照本发明某些实施方式,所述CHO细胞选自CHO-S、CHO-K1、DUXB11、CHO/DG44和Pro-5细胞。
按照本发明某些实施方式,所述岩藻糖结合剂是橙黄网孢盘菌(aleuriaaurantia)凝集素(AAL)或米曲霉菌1-岩藻糖特异性凝集素(AOL)。
按照本发明某些实施方式,所述分离的CHO细胞可表达野生型岩藻糖基转移酶-8(Fut8)。
按照本发明某些实施方式,所述分离的CHO细胞可表达野生型GDP-酮基-6-脱氧甘露糖3,5-差向异构酶,4-还原酶(FX)。
按照本发明某些实施方式,所述突变的GMD具有SEQ ID NO:23和/或24所示的氨基酸序列。
按照本发明某些实施方式,所述分离的CHO细胞可表达突变的GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)。
按照本发明某些实施方式,所述分离的CHO细胞具有至少370群体倍增的稳定岩藻糖表型。
按照本发明某些实施方式,所述CHO细胞可表达感兴趣的重组蛋白。
按照本发明某些实施方式,所述细胞培养液含有岩藻糖。
按照本发明某些实施方式,所述细胞培养液不含岩藻糖。
按照本发明某些实施方式,转染在存在外源性岩藻糖时进行。
按照本发明某些实施方式,所述方法还包括在转染后用含岩藻糖的培养液培养本发明的分离的CHO细胞。
按照某些实施方式,所述重组蛋白是抗体。
按照某些实施方式,所述重组蛋白是Fc融合蛋白。
按照某些实施方式,所述抗体具有增强的ADCC。
按照某些实施方式,所述CHO细胞经基因修饰能表达突变的GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)。
按照某些实施方式,GMD的至少一个等位基因携带了至少一个可导致功能缺失的突变。
按照某些实施方式,GMD的各个等位基因携带了至少一个可导致功能缺失的突变。
按照某些实施方式,当外部岩藻糖浓度为零时,所述蛋白的岩藻糖基化量为零。
按照某些实施方式,所述分离的CHO细胞的活细胞积分浓度(IVCC)比非突变的CHO细胞高20%。
除非另有说明,本说明书所用的所有技术和/或科学术语具有本发明所涉及领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然在实施或测试本发明实施方式时可采用与本说明书所述相似或等价的方法和材料,但是以下描述的是示范性的方法和/或材料。当发生冲突的情况下,本专利说明书,包括定义,将会予以控制。此外,所述材料、方法和实施例只是说明性的,并不意味着是必需的限制。
附图的简要说明
这里仅通过实施例并参见附图和图像,描述本发明的某些实施方式。现在具体参见附图细节,要强调的是通过实施例来显示详情,目的是说明性地讨论本发明的实施方式。在这方面,通过附图进行的描述可使得本领域技术人员明白本发明的实施方式可如何进行实施。
在附图中:
图1是用于获得表达零水平或低水平岩藻糖多肽的细胞的实验方法流程图。
图2是完整的和单体抗-EGFR mAb纯化过程的流程图。
图3是通过Octet作动力学分析的示范性概况。
图4是分离低岩藻糖ITL-LF1细胞(没有外源性岩藻糖时其岩藻糖含量为零)示范性方法的说明图。将CHO-S细胞与诱变剂氨甲喋呤(MTX)一起培育,然后用生物素化岩藻糖特异性凝集素(生物素化AAL)标记细胞,分离除去不结合链霉亲和素包被磁珠的细胞,对低岩藻糖细胞作二轮选择。此步骤后是又一轮选择,其中用生物素化岩藻糖特异性凝集素(生物素化AAL)和荧光链霉亲和素标记细胞,用FACS选择低荧光细胞。
图5是分离低岩藻糖ITL-LF1细胞的示范性方法的说明图。将CHO-S细胞与诱变剂MTX一起培育,然后进行4轮用生物素化岩藻糖特异性凝集素(生物素化AAL)和荧光链霉亲和素标记细胞,再用FACS分拣低荧光细胞。
图6是用磁珠分离后用FACS分析经MTX处理和未处理CHO细胞的岩藻糖水平的说明图。用生物素化AAL标记与MTX一起培育或未一起培育的CHO-S细胞,与链霉亲和素包被磁珠混合。用磁铁分离细胞,使不附着磁铁的细胞进一步增殖。用生物素化AAL标记细胞,然后用荧光链霉亲和素染色进行FACS分析。未标记的MTX处理的CHO-S细胞(□),与MTX培育标记了AAL的CHO-S细胞(○),与MTX一起培育用珠分拣的低岩藻糖CHO-S细胞(△),用珠分拣的CHO-S细胞(◇)。
图7A是用磁珠分离的ITL-LF1细胞上岩藻糖水平FACS分析的说明图。将与MTX培育的CHO-S细胞用生物素化AAL标记,与链霉亲和素包被磁珠混合。用磁铁分离细胞,使不附着磁铁的细胞进一步增殖。重复此步骤二次,然后用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记细胞,使FACS分拣的低荧光细胞进一步增殖。通过用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记细胞进行FACS分析。未标记的MTX处理的CHO-S细胞(□),经MTX处理的CHO-S细胞(○),经MTX处理然后一轮珠分离的CHO-S细胞(△),经MTX处理然后二轮珠分离的CHO-S细胞(◇),经MTX处理然后二轮珠分离及一轮FACS分拣的CHO-S细胞(▼)。
图7B是对用米曲霉菌1-岩藻糖特异性凝集素(AOL)所选细胞的岩藻糖水平作FACS分析的说明图。未标记的CHO-S细胞(□),CHO-S细胞(○),经MTX处理和一轮珠分离的CHO-S细胞(△),经MTX处理和二轮珠分离的CHO-S细胞(◇),经MTX处理然后二轮珠分离及一轮FACS分拣的CHO-S细胞(▼)。
图8A是不同培养液培养的ITL-LF1细胞岩藻糖水平FACS分析的说明图。在ProCHO5和C6614中培养增殖ITL-LF1细胞,然后在用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记细胞后作FACS分析。未标记的经MTX处理的CHO-S细胞(□),ProCHO5培养增殖的CHO-S细胞(○),ProCHO5培养增殖的ITL-LF1细胞(△),C6614培养增殖的ITL-LF1细胞(◇)。
图8B是经MTX处理后用磁珠和FACS分离的CHO-S细胞的岩藻糖水平FACS分析说明图。将与MTX培育的CHO-S细胞用生物素化AOL标记,与链霉亲和素包被磁珠混合。用磁铁分离细胞,使不附着磁铁的细胞进一步增殖。重复此步骤二次,然后用生物素化AOL和荧光链霉亲和素标记细胞,用FACS分拣低荧光细胞并进一步增殖。用生物素化AOL和荧光链霉亲和素标记细胞进行FACS分析。未标记的CHO-S细胞(□),CHO-S细胞(○),经MTX处理然后一轮珠分离的CHO-S细胞(△),经MTX处理然后二轮珠分离的CHO-S细胞(◇),经MTX处理然后二轮珠分离及一轮FACS分拣的CHO-S细胞(▼)。
图9是不同培养液培养的ITL-LF1细胞唾液酸水平FACS分析的说明图。分析了用ProCHO5和C6614培养液培养的ITL-LF1细胞中的唾液酸水平。用偶联FITC的唾液酸结合特异性凝集素(MAA)标记细胞作FACS分析。未标记的CHO-S细胞(□),MAA-FITC标记的CHO-S细胞(○),经ProCHO5培养用MAA-FITC标记的ITL-LF1细胞(△),经C6614培养用MAA-FITC标记的ITL-LF1细胞(◇)。
图10是评价ITL-LF1细胞岩藻糖稳定性的说明图。对完成分离步骤后不同时间点ITL-LF1细胞表面的岩藻糖水平作FACS分析,以评价低岩藻糖表达的稳定性。为了分析,用生物素化ALL和荧光链霉亲和素标记该细胞。
图11是评价ITL-LF1细胞生长速率的说明图。使ITL-LF1细胞按363群体倍增水平(PDL)增殖,测定每次传代后的生长速率。
图12是用连续FACS分拣分离得到的ITL-LF2细胞FACS分析的说明图。用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记经MTX培育的CHO-S细胞。用FACS分拣低荧光细胞并使其进一步增殖。重复此步4次。用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记细胞进行FACS分析。未标记的MTX处理CHO-S细胞(□),经MTX处理的CHO-S细胞(○),第一次分拣后经MTX处理的CHO-S细胞(△),第二次分拣后经MTX处理的CHO-S细胞(◇),第三次分拣后经MTX处理的CHO-S细胞(▼),第四次分拣后经MTX处理的CHO-S细胞(■)。
图13是不同培养液培养的ITL-LF2细胞岩藻糖水平FACS分析的说明图。在ProCHO5和C6614培养液中培养增殖ITL-LF2细胞,用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记后作FACS分析。未标记的CHO-S细胞(□),用ProCHO5培养的CHO-S细胞(○),用ProCHO5培养的ITL-LF2细胞(△),用C6614培养的ITL-LF2细胞(◇)。
图14是ITL-LF2细胞唾液酸水平FACS分析的说明图。分析了用ProCHO5培养的ITL-LF细胞的唾液酸水平。用偶联FITC的唾液酸结合凝素(MAA)标记细胞,作FACS分析。未标记的CHO-S细胞(□),MAA-FITC标记的CHO-S细胞(○),经ProCHO5培养用MAA-FITC标记的ITL-LF2细胞(△)。
图15是分离步骤完成后不同时间点ITL-LF2细胞表面岩藻糖水平FACS分析的说明图,用以评价低岩藻糖表达的稳定性。为了分析,用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记细胞。
图16是ITL-LF2细胞生长速率的说明图。使ITL-LF2细胞按363群体倍增水平(PDL)增殖,测定每次传代后的生长速率。
图17是评价ProCHO5培养的ILA-LF2细胞最高细胞浓度的说明图。在一个批处理中接种0.2x106个细胞,每二天测定一次细胞数。CHO-S细胞(○)和ITL-LF2细胞(△)。
图18是外源性岩藻糖对ITL-LF2细胞岩藻糖基化水平影响的说明图。在ProCHO5培养液中以0.2x106细胞/ml浓度接种ITL-LF2细胞,其中加入不同浓度的L-岩藻糖,在含CO2的温箱中37℃、320rpm振摇培养。
图19A是在一个批处理中培养的ITL-LF2和CHO-S细胞活力的说明图。在一个批处理中以0.2x106细胞/ml浓度在含添加剂的ProCHO5培养液中接种细胞,分析该过程中的细胞活力。CHO-S细胞(○)和ITL-LF2细胞(△)。
图19B是在一个批处理中培养的ITL-LF2和CHO-S活细胞浓度的说明图。在ProCHO5培养液和添加剂中在一个批处理中以0.2x106细胞/ml浓度接种细胞,分析该过程中的细胞数。CHO-S细胞(○)和ITL-LF2细胞(△)。
图19C是在一个批处理中培养的ITL-LF2和CHO-S活细胞积分浓度(IVCC)说明图。在一个批处理中以0.2x106细胞/ml浓度在含添加剂的ProCHO5培养液中接种细胞,检测该过程中的活细胞浓度。根据测得的细胞浓度计算出IVCC。CHO-S细胞(○)和ITL-LF2细胞(△)。注意CHO-S与ITL-LF2细胞系二者相一致,但CHO-S细胞达到此浓度只需9天而ITL-LF2细胞需12天才达到。
图19D是在一个批处理中培养的ITL-LF2和CHO-S细胞的乳酸浓度说明图。
图20是蛋白质岩藻糖基化通路和潜在酶(用方块标出)mRNA分析的说明图。
图21是说明岩藻糖基化通路基因RT-PCR分析的照片。分离得到CHO-S(C)和ITL-LF2(LF)细胞的总RNA,采用polydT然后是基因特异性引物,对其进行RT-PCR。取所得产物作琼脂糖凝胶电泳,紫外光检测后用SyberSafeTM染色。预计大小:Fut8—1.7kb;GMD—1.1kb;FX—1.2kb;GFPP—1.7kb;M—DNA标记物。
图22A-B是全长GMD与剪接变体之间的蛋白质序列比较。将从CHO-S和ITL-LF2细胞提取的RNA经RT-PCR制成cDNA,作凝胶电泳,分离并测序。用CloneMagagerTM软件将该DNA序列翻译成蛋白质序列。将剪接变体1(SV1;图22A;SEQ ID NO:23)和剪接变体2(SV2;图22B;SEQ ID NO:24)的蛋白质序列与GMD基因的全长(SEQ ID NO:25)作比较。虚线表示缺失区域。文本表明各剪接变体中所缺失的外显子。
图23A-B说明这两种GMD剪接变体的限制性酶切分析。图23A—GMD剪接变体中独特限制性酶位点的位置。图23B—琼脂糖凝胶显示限制性酶切后的条带。以下实施例章节的表7详述了它们的大小和解释。
图24是ITL-LF2细胞与CHO-S细胞的岩藻糖基化通路基因表达水平Q-PCR分析的说明图。制备ITL-LF2和CHO-S(对照)细胞RNA的cDNA,采用位于外显子5-6(存在于全长GMDmRNA和两种剪接变体中)上的基因特异性引物和探针对其作Q-PCR分析。从4个不同日期接种细胞的4种不同RNA提取物获得各个基因的结果。从每个提取日期制备的cDNA用Q-PCR检测所有基因。所有样品一式三份进行操作,并按内部对照β-肌动蛋白基因进行标准化。上面的短棒数字表示用配对T检验统计分析计算出的各基因的P-值。P-值<0.05表明有显著性(差异)。
RQ—与对照相比,表达变化的倍数。
图25是载体MB-129(pCMV-P-GMD)的概况图。将野生型CHO-S细胞的全长GMD cDNA克隆到载体p-CMV-P、pCMVpr-人CMV启动子中。IVS=hCMV IE基因的内含子A。PAC=嘌呤霉素抗性基因。
图26是用野生型GMD cDNA转染后ITL-LF2细胞重获岩藻糖基化的说明图。用含岩藻糖的C6614培养液培养以含GMD cDNA(pCMV-P-GMD)载体转染的ITL-LF2细胞。细胞用生物素化AAL和荧光链霉亲和素标记后作FACS分析。未标记的CHO-S细胞(□),CHO-S细胞(○),ITL-LF2细胞(△),GMD转染的ITL-LF2细胞(◇)。
图27是含质粒-PGL3抗EGFR mAb-EMCV-PAC1-DHFR串联序列的抗EGFR mAb的说明图。用含抗EGFR mAb的LC和HC区的线性质粒转染CHO-S和ITL-LF2细胞。mCMV=鼠巨细胞病毒启动子,EMCV=脑心肌炎病毒,IRES=内部核糖体进入位点,PAC=嘌呤霉素N-乙酰转移酶,DHFR=二氢叶酸还原酶,HC=重链,LC=轻链,SV40=猿病毒40,PA=聚腺苷酸化。
图28是ITL-LF2和CHO-S细胞池稳定表达抗EGFR mAb的说明图。用含抗EGFRmAb的载体(PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR串联)转染ITL-LF2和CHO-S细胞。回收后评价细胞池的产率。
图29是抗EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞岩藻糖水平的FACS分析说明图。分析去除岩藻糖前后在C6614中增殖的抗EGFRmAb转染细胞细胞膜的岩藻糖水平。未标记的CHO-S细胞(□),ProCHO5培养增殖的CHO-S细胞(○),C6614培养增殖的ITL-LF1细胞(◇),含岩藻糖C6614培养的抗EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞(▼),无岩藻糖C6614培养的抗EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞(△)。
图30是抗EGFRmAb转染ITL-LF2细胞唾液酸水平的FACS分析说明图。分析在ProCHO5中增殖的抗EGFRmAb转染细胞细胞膜的唾液酸水平。用偶联FITC的唾液酸结合凝集素(MAA)标记细胞,并作FACS分析。未标记的CHO-S细胞(□),CHO-S细胞(○),ITL-LF2细胞(◇),抗EGFRmAb转染的CHO-S细胞(▼),抗EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞(△)。
图31A-B说明瞬时转染到ITL-LF2中的载体结构。以载体pTT5为骨架构建了载体Mb-127和MB-128。抗EGFRmAb-LC=EGFRmAb的轻链;抗EGFRmAbANTI EGFR mAb-HC=EGFRmAb的重链。
图32是说明ITL-LF2和CHO-S细胞瞬时表达抗EGFRmAb的条形图。在ProCHO5培养液中用含抗EGFRmAb的pTT5载体瞬时转染ITL-LF2和CHO-S细胞。转染条件为细胞类型特异性条件。转染后ITL-LF2细胞添加VPA并移到31℃,CHO-S细胞添加VPA后培养细胞增殖24小时。
图33描述用FACS分析抗体的糖残基水平。取粗制收获物或纯化抗体样品与G蛋白包被的磁珠混合,然后结合荧光标记的凝集素。用FACS根据荧光测定岩藻糖水平。
图34是对ITL-LF2和CHO-S细胞瞬时表达的抗EGFRmAb作岩藻糖水平FACS分析的说明图。取粗制收获物样品与G蛋白包被磁珠混合,然后结合生物素化AAL和荧光链霉亲和素混合物。用FACS根据荧光水平测定岩藻糖水平。磁珠(□),CHO-S转染细胞产生的抗EGFR(○),ITL-LF2转染细胞产生的抗EGFR(△)。
图35是对培养的ITL-LF2和CHO-S细胞稳定表达的抗EGFRmAb粗制收获物作岩藻糖水平FACS分析的说明图。取粗制收获物样品与G蛋白磁珠混合,然后结合生物素化AAL和荧光链霉亲和素混合物。用FACS根据荧光水平测定岩藻糖水平。磁珠(□),CHO-S转染细胞产生的抗EGFRmAb(○),ITL-LF2转染细胞产生的抗EGFRmAb(△)。
图36是对培养的ITL-LF2和CHO-S细胞稳定表达的抗EGFRmAb粗制收获物作唾液酸水平FACS分析的说明图。取粗制收获物样品与G蛋白磁珠混合,然后结合偶联FITC的MAA。用FACS根据荧光水平测定唾液酸水平。磁珠(□),从CHO-S转染细胞得到的粗制收获物(○),从ITL-LF2转染细胞得到的粗制收获物(△)。
图37是对ITL-LF2和CHO-S细胞稳定表达的抗EGFRmAb作岩藻糖水平FACS分析的说明图。取纯化的抗体样品与G蛋白磁珠混合,然后结合生物素化AAL和荧光链霉亲和素混合物。用FACS根据荧光水平测定岩藻糖水平。磁珠(□),CHO-S转染细胞产生的抗EGFRmAb(○),ITL-LF2转染细胞产生的抗EGFRmAb(△)。
图38是对ITL-LF2和CHO-S细胞稳定表达的抗EGFRmAb作唾液酸水平FACS分析的说明图。取纯化的抗体样品与G蛋白磁珠混合,然后结合偶联FITC的MAA。用FACS根据荧光水平测定唾液酸水平。磁珠(□),CHO-S转染细胞产生的抗EGFR(○),ITL-LF2转染细胞产生的抗EGFR(△)。
图39是对纯化的完整抗EGFRmAb作岩藻糖水平Octet分析的读出。使CHO-S和ITL-LF2细胞的抗EGFRmAb纯化产品(OD280测定的浓度为225μg/ml)与事先已附着预包被链霉亲和素生物传感器的生物素化AAL(2μg/ml)相结合。此图提供了用Octet QK系统作动力学分析的有关步骤,每条曲线代表用箭头指出的一个具体样品。
图40是对纯化的完整抗EGFRmAb作唾液酸水平Octet分析的读出。使CHO-S和ITL-LF2细胞的抗EGFRmAb纯化产品(OD280测定的浓度为115μg/ml)与事先已附着预包被链霉亲和素生物传感器的生物素化MAA(10μg/ml)相结合。此图提供了用Octet QK系统作动力学分析的有关步骤,每条曲线代表用箭头指出的一个具体样品。
图41是对纯化的抗EGFR Fc单体岩藻糖水平的Octet分析图。使CHO-S和ITL-LF2细胞产生的抗EGFRmAb的Fc部分(OD280测定的浓度为40μg/ml)与事先已附着预包被链霉亲和素生物传感器的生物素化AAL(1μg/ml)相结合。此图提供了用Octet QK系统作动力学分析的有关步骤,每条曲线代表用箭头指出的一个具体样品。
图42是纯化的抗EGFR Fc单体唾液酸水平的Octet分析图。使CHO-S和ITL-LF2细胞产生的抗EGFRmAb的Fc部分与事先已附着预包被链霉亲和素生物传感器的生物素化AAL(1μg/ml)相结合。此图提供了用Octet QK系统作动力学分析的有关步骤,每条曲线代表用箭头指出的一个具体样品。
图43显示抗EGFRmAb纯化产品带电模式的iCE280分析结果。用iCE280分析CHO-S细胞(■)和ITL-LF2细胞(▲)产生的抗EGFRmAb纯化产品(OD280测定的浓度为0.4μg/ml)。点线代表iCE280模式中同种型抗体的峰面积%(注意图中的线条并不代表连续函数,加入它只是为了更容易追寻同一产品的同种型)。
图44是提供抗EGFR Fc部分聚糖模式的表格。
图45是外源性岩藻糖对EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞岩藻糖水平影响的说明图。取抗EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞以0.2x106细胞/ml的浓度接种在含不同浓度L-岩藻糖的ProCHO5培养液中,在含CO2的37℃培养箱中320rpm摇动培养。
图46是外源性岩藻糖对EGFRmAb岩藻糖基化水平影响的说明图。
图47是依据外源性岩藻糖(量)的EGFRmAb岩藻糖基化水平的校准曲线。
图48A-B是用Octet检测纯化的抗EGFR Fc单体岩藻糖水平的校准曲线。将CHO-S和ITL-LF2细胞产生的抗EGFRmAb Fc单体部分混合制成样品,OD280测定浓度为40μg/ml。使该样品结合于事先已附着预包被链霉亲和素生物传感器的生物素化AAL(1μg/ml)。此图提供了用Octet QK系统作动力学分析的有关步骤,每条曲线对应于样品(A)中的岩藻糖具体%。线状曲线代表(B)。
图49是部分岩藻糖基化抗EGFR Fc单体部分的Octet分析。使CHO-S细胞和ITL-LF2细胞的抗EGFRmAb Fc单体部分结合于事先已附着预包被链霉亲和素生物传感器的生物素化AAL(1μg/ml)。此图提供了用Octet QK系统作动力学分析的有关步骤,每条曲线对应于一个具体样品。
本发明具体实施方式的描述
本发明在其某些实施方式中涉及岩藻糖含量为零的CHO细胞和细胞系,产生该细胞和细胞系的方法及其应用。
在详述本发明至少一种实施方式之前,必需理解不是要将本发明的申请范围限制于本说明书的以下详述或实施例所列举的细节,本发明可以有其他实施方式或以各种不同方式进行实施。
为了降低重组蛋白质如抗体的岩藻糖水平以得到增强的ADCC功能,本发明人开发了经修饰能在其细胞表面表达变体糖基化模式的CHO-S细胞衍生的细胞系。这是通过在存在MTX时培育细胞然后有效地选出细胞膜岩藻糖水平最低的细胞而实现的。
采用对抗体Fc糖基化位点上αFuc1-6GlcNA残基具有高亲和力的岩藻糖特异性凝集素(如橙黄网孢盘菌(aleuria aurantia)凝集素,AAL)或米曲霉菌1-岩藻糖特异性凝集素(AOL),通过磁珠分离和FACS分拣(图7A-B)或单独FACS分拣(图12)进行这种选择。
虽然可根据细胞膜的岩藻糖水平选择零表达岩藻糖的细胞,但用各种方法分析发现这些细胞表达的重组抗体(抗EGFR mAb)的岩藻糖水平仍相同(图33-41)。
通过用含岩藻糖的培养液培养细胞,本发明人证明其中所表达的重组蛋白的岩藻糖水平是可调控的。此种结果显示有可复制性(图49)。
此外,还发现本发明细胞表型的370PDL测试稳定(图15)。因此当需要高于100PDL时这类细胞本身可用作重组蛋白质的生产细胞。
在岩藻糖稳定性试验中测定岩藻糖零表达细胞(命名为ITL-LF2细胞)的生长速率,发现该生长速率导致群体倍增时间(PDT)为约15-20小时(图11),与衍生该ITL-LF2细胞的CHO-S细胞相似。
对已知参与岩藻糖基化的关键蛋白质的分析揭示,在本发明所选细胞中GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)的mRNA大小短于其对应的野生型细胞(图20),测序揭示它有两种剪接变体。从该细胞提取的mRNA分子缺乏第三和第四外显子,或缺乏第八和第九外显子(图21A-B和图22A-B)。
本发明人提议,本说明书描述的用于产生和鉴定特定类型细胞的方法可用来选择其他有用的细胞类型。
因此,按照本发明的一个方面,提供选择用作表达重组蛋白宿主细胞的CHO细胞的方法,该方法包括:
(a)使CHO细胞接触氨甲喋呤(MTX)从而在CHO细胞群中导入基因突变,
(b)使含有突变细胞的CHO细胞群接触岩藻糖结合剂一定的时间量,使该岩藻糖结合剂结合于细胞群细胞膜的岩藻糖部分,其中所述接触的时间量不会导致杀伤细胞;和
(c)消除该细胞群中结合该岩藻糖结合剂的细胞亚群,从而选出细胞用作表达重组蛋白的宿主细胞,所选细胞的岩藻糖含量为零。
适合本发明的中国仓鼠卵巢组织衍生的CHO细胞或细胞系可以是从中国仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢组织建立的细胞系中的任何细胞。例子包括以下文献中所述的CHO细胞,如Journal of Experimental Medicine,108,945(1958);Proc.NatAcad.Sci.USA,60,1275(1968);Genetics,55,513(1968);Chromosoma,41,129(1973);Methods in Cell Science,18,115(1996);Radiation Research,148,260(1997);Proc.Nat Acad.Sci.USA,77,4216(1980);Proc.Nat Acad.Sci.,60,1275(1968);Cell,6,121(1957);Molecular Cell genetics,Appendix I,II(883-900页),等等。此外,本发明也可采用在ATCC(美国典型培养物保藏中心)中注册保藏的CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUXB11(ATCC CCL-9096)和Pro-5(ATCC CCL-1781)细胞系以及CHO-S(Life Technologies公司,Cat#11619)或使这些细胞系适应各种培养液而获得的亚细胞系。
在某些实施方式中,宿主细胞是CHO-1E5、CHO-S、CHO/DG44、CHO-3F或CHO-2,6克隆细胞。
诱变剂MTX可引起岩藻糖合成通路中所涉及的基因或多肽发生突变。
如上所述,可通过使突变的CHO细胞群接触岩藻糖结合剂使之结合于突变细胞的细胞膜而实现本发明一个方面所述的方法。
本说明书所用的短语“岩藻糖结合剂”指能以至少1x10-5Kd结合细胞表面岩藻糖部分的任何物质(如凝集素)。按照一种实施方式,该岩藻糖结合剂以至少1x10-3Kd(Matsumura,Higashida等;2009),例如至少1x10-4Kd,至少1x10-5Kd,至少1x10-6Kd或至少1x10-7Kd,结合于αFuc1-6GlcNA残基。
按照一种实施方式,该岩藻糖结合剂是多肽,如凝集素。
本发明考虑的示范性凝集素包括但不限于:橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)或米曲霉菌1-岩藻糖特异性凝集素(AOL)和荆豆凝集素(UEA)及(Oda,Senaha等,2003;Tateno,Nakamura-Tsuruta等;2009,它们的内容纳入本说明书作为参考)中披露的那些凝集素。
如上所述,在能使岩藻糖结合剂与细胞膜的岩藻糖结合的条件下进行所述接触。按照一种实施方式,在凝集素不会导致其结合细胞死亡(即消除细胞)的条件下进行所述结合。
按照一种具体实施方式,在凝集素不会导致其结合细胞的50%以上死亡的条件下进行所述结合。
按照一种具体实施方式,在凝集素不会导致其结合的40%以上细胞死亡的条件下进行所述结合。
按照一种具体实施方式,在凝集素不会导致其结合的30%以上细胞死亡的条件下进行所述结合。
按照一种具体实施方式,在凝集素不会导致其结合的20%以上细胞死亡的条件下进行所述结合。
按照一种实施方式,进行所述结合不超过3小时,优选不超过2小时,甚至更优选不超过1小时。
按照一种实施方式,本发明此方面的岩藻糖结合剂附着于能使该物质结合的细胞群(直接或间接)消除的功能部分。
因此,该岩藻糖结合剂可附着于可检测部分,包括但不限于荧光部分或磁性部分。
示范性的荧光部分包括荧光黄或其衍生物,例如,异硫氰酸荧光黄(FITC)、俄勒冈绿、东京绿、SNAFL、羧基萘荧光素(CFSE)、羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)、DyLight488、Alexa荧光素488、绿荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白(PE)、多甲藻素叶绿素1蛋白(PerCP)、PE-Alexa荧光素700、PE-Cy5(TRI-COLOR)、PE-Cy5.5、PE-Alexa荧光素750、PE-Cy7、别藻兰素(APC)、APC-Cy7,及其衍生物。
或者,岩藻糖结合剂可附着于亲和部分。
本说明书所用的术语“亲和部分”指能与关联分子的结合部分选择性相互作用的分子,例如生物素/亲和素,配体/受体等。
使岩藻糖结合剂附着于亲和部分或可检测部分的详细方法可在以下实施例章节中找到。
应明白如果岩藻糖结合剂附着于荧光部分(直接或间接通过相应的结合分子),就可采用已知的细胞分拣方法,如采用荧光激活细胞分拣仪(FACS)来消除突变细胞群中不想要的细胞。
可商品化购得多种流式细胞仪,包括,例如Becton Dickinson FACScan和FACScalibe(BD Biosciences,Mountain View,CA)。可用于FACS分析的抗体在SchlossmanS BoumeII L等(白细胞分型V,纽约:牛津大学出版社,1995)中有所描述,并可商品化广泛购得。
如果岩藻糖结合剂附着于磁性部分(直接或间接通过相应的结合分子),就可利用磁性激活细胞分离法来消除突变细胞群中不想要的细胞。
如果岩藻糖结合剂附着于亲和部分,就可通过采用相应结合分子的亲和纯化方法来消除突变细胞群中不想要的细胞。因此,例如,如果岩藻糖结合剂附着于生物素,可采用链霉亲和素珠或柱纯化来消除突变细胞群中不想要的细胞。例如,如果岩藻糖结合剂附着于抗体或抗体的Fc部分,可用A蛋白珠或柱来消除突变细胞群中不想要的细胞。
如本说明书以上所述,可使相应的结合分子本身附着于可检测部分,加入该相应的结合分子后通过FACS或MACS进行所述消除。
应明白可通过数轮(如2、3或更多轮)顺次消除来进行不想要细胞群的消除。此外,消除步骤可包括用同一方法(如只用FACS珠分离法)的数轮顺次消除,或可联用不同方法(如磁珠分离,然后荧光分离)。
按照一种实施方式,选择的消除轮数和具体方法能使岩藻糖结合剂结合的细胞基本上被去除。
术语“基本上被去除”意味着至少约50%或更高的特定类型细胞,如至少约75%、约80%、约90%、约95%或约97%,包括至少99%、99.5%、99.9%或更多的特定类型细胞被去除。
按照一具体实施方式,基本上去除了岩藻糖结合剂结合的细胞,只保留了其细胞膜岩藻糖为零的细胞。
如果在上述去除后加入外源性岩藻糖,可获得含一定量岩藻糖的不同细胞,这取决于加入的岩藻糖量。
因此按照另一种实施方式,可获得与野生型细胞(即氨甲喋呤处理前)相比其细胞膜岩藻糖低于50%的CHO细胞。
按照另一种实施方式,可获得与野生型细胞(即氨甲喋呤处理前)相比其细胞膜岩藻糖低于40%的CHO细胞。
按照另一种实施方式,可获得与野生型细胞(即氨甲喋呤处理前)相比其细胞膜岩藻糖低于30%的CHO细胞。
按照另一种实施方式,可获得与野生型细胞(即氨甲喋呤处理前)相比其细胞膜岩藻糖低于20%的CHO细胞。
按照另一种实施方式,可获得与野生型细胞(即氨甲喋呤处理前)相比其细胞膜岩藻糖低于10%的CHO细胞。
本发明的细胞群经分离后,可在任何用于培养生长的装置(包括发酵罐或生物反应器)中培养生长。细胞可生长成单层或贴附于表面。或者,分离的细胞群可悬浮生长。
可用无血清培养液培养细胞。该培养液可以是商品化购得的培养液,例如但不限于:ProCHO5(Lonza,Catalogue#BE12-766Q)、CHO DHFR-粉状培养基(SAFC Bioscinces,Catalogue C6614)或Opti-CHO(Invitrogen,Cat alogue12681),其中添加了谷氨酰胺,如8mM L-谷氨酰胺。
按照一种实施方式,该培养液无异源污染物,即无动物衍生组分。
按照一种实施方式,在允许无限增殖的条件(如培养液和空间)下,培养细胞成为细胞培养物,即增殖成细胞系。
该分离的CHO细胞在大量传代培养中可维持其变种糖基化模式(即岩藻糖低表达),即具有高度稳定性。按照一种实施方式,发现经修饰的CHO宿主细胞甚至在370代后仍能维持其变种糖基化模式。
本发明人发现,按照本说明书所述方法选出的CHO细胞具有特定的表型,如可表达负责细胞膜低岩藻糖基化的突变的GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)。
诱变后的细胞可包含至少一个可导致功能缺失的突变的GMD等位基因。
本说明书所用术语“等位基因”指一个基因座的任何一种或多种替代形式,所有的等位基因都与性状或特征相关。在二倍体细胞或生物中,一给定基因的两个等位基因占据了一对同源染色体上的相应基因座。
“导致功能缺失的突变”是基因序列中可导致基因产物(通常为蛋白质)的功能降低或完全缺失的突变。例如,由于移码或无义突变而产生的截短基因产物可导致功能缺失的突变。与含有导致功能缺失突变的等位基因相关的表型通常是隐性的,但也可以是显性的。
应明白本发明也考虑了其中两个GMD等位基因都携带有导致功能缺失的突变的细胞。在这样的情况下,GMD可以是纯合子形式或杂合子形式。按照此种实施方式,纯合子的情况是GMD基因座两个等位基因以核苷酸序列相同为特征。杂合子指GMD基因座的基因情况不同。
具体说,本发明人发现经本发明的诱变和选择步骤后的CHO细胞可表达SEQ IDNO:23和24所示的两种变体形式的GMD,分别对应于缺失外显子3和4、缺失外显子8和9的GMD基因。
因此,按照本发明的另一方面,提供经基因修饰能表达具有SEQ ID NO:23和/或24所示氨基酸序列的突变GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)的分离的CHO细胞。
发现本发明此方面的细胞能表达功能性岩藻糖转移酶-8(Fut-8)。该功能性Fut8可以是具有SEQ ID NO:29所示多肽序列的野生型Fut8。
此外,本发明的细胞可表达功能性GDP-酮基-6脱氧甘露糖3,5-差向异构酶,4-还原酶(FX)。该功能性FX可以是具有SEQ ID NO:30所示多肽序列的野生型FX。
本发明人证明了按照本说明书所述方法产生的CHO细胞可用于生产糖蛋白,如可收获或收集抗体或Fc融合蛋白。可分泌的这种糖蛋白显示变体岩藻糖基化模式,和/或如本说明书进一步所述具有治疗用途。这种糖蛋白可以是抗体,例如,如本说明书进一步所述,与未修饰的亲代宿主细胞产生的相应抗体相比其ADCC活性增强的抗体。
本说明书所用的术语“抗体依赖的细胞介导的细胞毒”(ADCC)指表达FcR的效应细胞(如自然杀伤细胞(NK)、中性白细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体随后导致该靶细胞溶解的细胞介导反应。介导ADCC的主要细胞包括NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。NK细胞通常主要表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinrt的Annu Rev Immunol,9:457-92(1991)中小结了造血细胞上的FcR表达。
“效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应器功能的白细胞。优选地是,这种细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。能介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、细胞毒T细胞和中性白细胞,优选PBMC和NK细胞。效应细胞可从天然来源(如血液,或本说明书所述的PBMC)分离得到或采用本领域的已知方法进行体外增殖。
在一种实施方式中,本发明CHO细胞系产生的抗体与亲代宿主细胞产生的相应抗体相比,在存在人效应细胞和当所述抗体应用的量相当时,能更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)。一般而言,采用本说明书所述方法可确定ADCC活性,但也考虑测定ADCC活性的其他试验或方法,例如在动物模型上,等等。纳入本说明书作参考的美国专利公开公报No.2010/0081150中进一步描述了在体内或体外测试系统中,从本发明的CHO细胞系得到的抗体比亲代抗体在介导ADCC上更有效。
因此,对本发明公开的经修饰能产生变种岩藻糖基化模式的分离的细胞群或细胞系,可作进一步修饰以使之包含异源聚核苷酸序列。这类序列包括:基因或基因片段的编码或非编码区、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶等。该异源序列可编码蛋白类分子,即蛋白质、多肽、肽、氨基酸序列,包括任何长度的氨基酸聚合物。该异源聚核苷酸序列通常操作性连接于启动子(即连接到表达载体中)而能表达重组蛋白质。
按照一种实施方式,在存在外源性岩藻糖时进行本发明的CHO细胞转染。考虑的岩藻糖浓度包括1-20μg/ml,例如10μg/ml。
如图45和48所示,可通过在岩藻糖存在时培育转染细胞来控制重组多肽的岩藻糖含量。考虑的岩藻糖浓度包括1-10μg/ml,例如2.5-5μg/ml至例如3.5μg/ml。
因此,提供细胞膜上无岩藻糖和能表达不同程度岩藻糖基化蛋白质的CHO细胞,岩藻糖基化量取决于细胞转染时和转染后培养液中的岩藻糖含量。这种重组多肽的岩藻糖基化量范围为0-100%。
该插入的编码序列除包含转录和翻译所必需的元件外,所采用的表达构建物还可包含经工程改造能提高所表达多肽的稳定性、产生、纯化、产量或毒性的序列。例如,可工程改造表达包含本发明某些实施方式的蛋白质和异源蛋白质的融合蛋白或可切割的融合蛋白。可设计这类融合蛋白使之易用亲和层析分离,如通过固定于对该异源蛋白特异性的层析柱。经工程改造可在蛋白质与可切割融合蛋白之间产生一个切割位点,用能破坏该切割位点的相应酶或物质处理,使该可切割融合蛋白从层析柱上释放出来(例如,参见Booth等(1988)Immunol Lett.19:65-70;和Gardella等(1990)J Biol Chem.265:15845-15859)。
按照一个实施方式,在不存在外源性岩藻糖时进行纯化。
可用各种常规重组技术和合成方法制备核酸。本领域熟知的标准重组DNA和分子克隆技术在以下文献中有描述:Sambrook J.,Fritsch E.F.和Maniatis T.的“分子克隆:实验手册”冷泉港实验室出版社,冷泉港(1989)(Maniatis);T.J.Sihavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist的“基因融合实验”,泉港实验室出版社,冷泉港(1984);和Ausubel,F.M.等的“分子生物学当前方案”,Greene联合出版社和Wiley-Interscience(1987)。简言之,可制备的主题核酸有基因组DNA片段、cDNA和RNA,均可直接从细胞抽提获得或用各种扩增方法(包括但不限于PCR和RT-PCR)重组产生。
如上所述,本发明的CHO细胞可用作宿主细胞以产生抗体。所述抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
在某些实施方式中,所述抗体是抑制性抗体。抑制性抗体可抑制与其结合的抗原的一种或多种生物学活性。例如,抑制性抗体通过抑制抗原的活性或其表达,可下调相应抗原的信号转导。在某些实施方式中,所述抗体是中和抗体。中和抗体可降低或破坏可溶性抗原或活生物体(如感染剂)的某些生物学活性。中和抗体可与天然的配体或受体竞争其抗原。在某些实施方式中,所述抗体是刺激性或激活性抗体。刺激性或激活性抗体可以是激动性抗体,它结合抗原时可激活相应抗原的信号转导从而活化或上调该抗原的活性,或上调所述抗体结合的抗原的表达。
本发明所用的术语“抗体”包括完整的分子及其功能片段,如Fc融合蛋白,其定义如下:经遗传工程改造的含有直接或通过合适的多肽接头与另一多肽或蛋白质相连接的(抗体)重链恒定区的分子。
非人(例如,鼠)抗体的人源化形式,是含有最少非人免疫球蛋白衍生序列的人免疫球蛋白、免疫球蛋白各链或片段的嵌合分子。人源化抗体包括具有所需特异性、亲和力与结合能力的人免疫球蛋白(受者抗体),其中受者的互补决定区(CDR)残基被非人动物(如小鼠、大鼠或家兔)免疫球蛋白(供者抗体)的CDR残基所取代。在某些例子中,人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所取代。人源化抗体也可包含受者抗体或输入的CDR或框架序列中均没有的残基。一般而言,所有的人源化抗体基本上包含至少一个,通常两个可变区,其中所有的或基本上所有的CDR区与非人免疫球蛋白的这些区相当,而所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白的共有序列。优化的人源化抗体也至少包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分,通常是人免疫球蛋白恒定区的一部分[Jones等,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等,Nature,332:323-329(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
在一实施方式中,可将轻链和重链(基因)分别转化入经修饰的同种或不同种分离宿主细胞培养物中。在另一种替代实施方式中,可用含轻链和重链(基因)的不同质粒共转染一种经修饰的培养的宿主细胞。在另一实施方式中,可用含有轻链和重链两种基因并能表达该两种基因的一种表达质粒转化入一种经修饰的培养的宿主细胞中。
当重链和轻链在同一宿主中共表达时,设计的分离方法应能回收重构建的抗体。这可通过常规的抗体纯化方法,例如A蛋白-琼脂糖凝胶层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析而实现。
可用本发明细胞产生的这种重组抗体具有变体岩藻糖基化模式从而增强了该抗体的效应器功能。优选本发明重组抗体的Fc单体上与ADCC相关的岩藻糖残基含量低,从而该抗体的抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性增强。
按照一实施方式,所产生的抗体是IgG1或IgG3类抗体。
具有变种岩藻糖基化模式和/或由本说明书所述经修饰的CHO宿主细胞所产生的抗体可结合任何抗原,如癌抗原。所述癌抗原可选自:HER2、免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1、CD20、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、NGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、粘蛋白1、粘蛋白16、内皮因子、间皮素受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3、α和β整合素。
本发明细胞所产生的示范性抗体包括但不限于:阿达木单抗(HumiraRTM)、阿仑珠单抗(CampathRTM)、巴利昔单抗(SimulectRTM)、贝伐单抗(AvastinRTM)、西妥昔单抗(ErbituxRTM)、达珠单抗(ZenapaxRTM)、dacetuzumab、依法珠单抗(RaptivaRTM)、依帕珠单抗、替伊真单抗(ZevalinRTM)、替伊莫单抗、如英昔单抗(RemicadeRTM)、莫罗莫那-CD3(OKT3)、奥马佐单抗(XolairRTM)、帕利珠单抗(SynagisRTM)、奥戈伏单抗(OvaRexRTM)、利妥昔单抗(RituxanRTM)、曲妥珠单抗(HerceptinRTM)、ocrelizumab、帕妥珠单抗、huM195Mab、抗-淀粉样蛋白、抗-CD4、抗-氧化LDL、曲妥珠单抗-DM1、apomab、rhuMAb、GA101、抗-OX40L、伊匹单抗(ipilimumab)、优特克诺单抗、戈利木单抗、木单抗、zalutumumab、莫维珠单抗、依美昔单抗、MDX101、4B5、TNX-901、IDRC-114和能诱导ADCC的抗原特异性Fc抗体任何片段。
本说明书所用的术语“约”指±10%。
术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”及他们的结合意指“包括但不限于”。
本申请书通篇中,本发明的各种实施方式可以一种范围格式呈现。应理解这种范围格式的描述只是为了方便和简短,不应被解释为对本发明范围的僵化限制。因此,一个范围的描述应被视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如,描述的范围是1-6应被视为具体公开了子范围如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等以及该范围内的各个数值。
每当本说明书示出一个数值范围,就意味着包括该示出范围内的任何引用数值(分数或整数)。短语第一个字指出的数字到第二个字指出的数字“之间的范围”,与“范围”为从第一个字指出的数字到第二个字指出的数字,在本说明书中可互换使用,意味着包括第一个和第二个指出的数字及它们之间的所有分数和整数数字。
本说明书所用的术语“方法”指可用于完成某给定任务的方式、方法、技术和程序,包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业者已知的那些方式、方法、技术和程序,或易于从已知的方式、方法、技术和程序开发的方式、方法、技术和程序。
应理解,为清晰起见,在上下文不同的实施方式中描述的本发明某些特征也可被组合在一个单一实施方式中提供。相反,为简短起见,在上下文单一实施方式中描述的本发明各种特征也可单独或以任何适当的子组合、或在任何其他描述本发明实施方式中提供。上下文各种实施方式中描述的各种特征不应认为是这些实施方式的必要特征,除非没有这些元素该实施方式不起作用。
本说明书上面描述的和权利要求中要求保护的本发明各种实施方式和各方面内容可在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参见以下实施例,与上面的描述一起以非限制方式说明本发明的某些实施方式。
一般而言,本说明书所用的命名法和本发明所用的实验方法包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。文献中有这些技术的充分说明。例如,可参见Sambrook等的“分子克隆:实验手册”(1989);Ausubel,R.M.主编的“分子生物学当前方案”第I-III卷(1994);Ausubel等的“分子生物学当前方案”,John Wiley和Sons出版社,巴尔的摩,马里兰州(1989);Perbal的“分子克隆实践指南”,John Wiley和Sons出版社,纽约(1988);Watson等的“重组DNA”,科学美国人丛书(Scientific American Books),纽约;Birren等主编的“基因组分析,实验手册丛书”,1-4版,冷泉港实验室出版社,纽约(1988);美国专利4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中所阐述的方法;J.E.等主编的“细胞生物学,实验手册”I-III卷,Cellis出版社(1994);Freshney,Wikey-Liss,N.Y.的“动物细胞培养-基础技术手册”,第3版,纽约(1994);Coligan.J主编的“免疫学当前方案”I-III卷(1994);Stites等主编的“基础和临床免疫学”,第8版,Appleton&Lange,Norwak,CT(1994);Mishell和Shiigi主编的“细胞免疫学的选择方法”,W.H.Freeman公司,纽约,(1980);以及专利和科学文献中广泛描述的现有免疫试验,参见,例如美国专利No.3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,645;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5,281,521;Gait,M.J.主编的“寡核苷酸合成”(1984);Hames,B.D.和Higgins,S.J.主编的“核酸杂交”(1985);Hames,B.D.和Higgins,S.J.主编的“转录和翻译”(1984);Freshney,R.I.主编的“动物细胞培养”(1986);“固定的细胞和酶”,LRL出版社(1986);Perbal,B.的“分子克隆实践指南”(1984)和“酶学方法”1-317卷,Academic出版社;“PCR方法,方法指南和应用”,Academic出版社,San Diego,CA(1990);Marshak等的“蛋白纯化和特征分析的策略-实验室课程手册”,CSHL出版社(1996);以上所有文献均纳入本说明书作参考。相信上述方法为本领域所熟知并为方便读者而提供。文献中包含的所有信息纳入本说明书作参考。
通用材料
细胞:
建立了适应于Sigma C6614培养液的CHO-S细胞(GibcoBRL,Cat.#11619);
含200nM MTX的C6614培养的CHO-S细胞;
C6614培养的CHO-Dukx细胞;
ProCHO-5培养的CHO-S1细胞。
质粒:PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR串联-872;pTT5载体;pCMV-P。
试剂
AccuPrime Pfx Invitrogen的DNA聚合酶Cat.No.12344-024;
分子生物学认证的琼脂糖:IBI琼脂糖Cat.#1B70042;
牛血清白蛋白组分溶液(BSA),7.5%,Sigma,Cat.#A8412;
橙黄网孢盘菌凝集素AAL;1mg/ml,Cat.L-1390,Vector;
米曲霉菌1-岩藻糖特异性凝集素AOL,5mg/ml,Cat.L0169,EY;
氨苄青霉素-Sigma Cat.#A9518;
ELISA用抗体:包被抗体:山羊抗人IgG(H+L),Jackson Immuno Research Cat.#109-005-088(USA);检测抗体:山羊抗人IgG Fc(Fab2)Jackson Immuno Research Cat.#109-036-098(USA);
β肌动蛋白试验需要的Q-PCR探针和引物,ABI Cat.#RN00667869_ml;
生物素(NHS-PEG4-生物素,No-WeighTM Format,Cat.21329,ThermoCat.#21329;
生物素化AAL,1mg活性偶联物,Vector,Cat.#B-1395;
生物素化MAL,1mg,EY,Cat.#BA-7801-2;
牛血清白蛋白(BSA),Bovostar.Bovogen Cat.#BSAS.01;
细胞增强剂,HyClone,Cat.#SH30866.01;
CHO CD有效饲料TM A,Invitrogen,Cat.#A10234-01;
CHO CD有效饲料TM B,Invitrogen,Cat.#A10240-01;
柠檬酸,Sigma,Cat.#C-1909;
硫酸葡萄糖钠盐,Sigma,Cat.#D4911;
DH5α感受态细菌-Life-Technologies,Cat.#18263-012;
DMSO,Merck,Cat.#1.02931.1000;
DNA阶梯:1kb的DNA阶梯-Biolabs,Cat.#3232L;
DNA阶梯:100bp的DNA阶梯-Biolabs,Cat.#3231L;
DTT,Cat:D9779,Sigma;
EDTA,Sigma,Cat.#E7889;
乙醇,Merck,Cat.#00983.1000;
NHS-PEG4-生物素,No-WeighTM Format,Cat:21329,Thermo FisherScientific Inc.USA;
FACS Accudrop珠,Becton Dickinson,Cat.#MAB345249;
岩藻糖,Sigma,Cat.#F2252;
葡萄糖,Sigma,Cat.#G7021;
谷氨酰胺,Biological Industries,Cat.#03-020-1A;
谷氨酰胺,Sigma,Cat.#G5972;
甘氨酸,Merck,Cat.#4201;
盐酸胍,Cat.#G3272,Sigma;
Hepes1M,Invitrogen,Cat.#15630-056;
高能cDNA逆转录试剂盒,Applied Biosystems,Cat.#4368814;
HTX50,Biological Industries,Cat.#03-085-1C;
盐酸,Merck,Cat.#UN-17891.00317.2500;
iCE280甲基纤维素1%,Cat.#102220和101876,Convergent Biosciences,(Canada);
iCE280两性载体3-10,Cat.#10-0456-01,GE Healthcare(Germany);
iCE280pI标记6.14和9.5,Cat.#分别为102220和101996,ConvergentBiosciences,(Canada);
iCE280系统适用性试剂盒,Cat.#102093-j,Convergent Biosciences,(Canada);
iCE280IEF试剂盒,Convergent Biosciences;
IMag缓冲液,Becton Dickinson,Cat.#552362;
IMag SA颗粒加-DM,Becton Dickinson,Cat.#557812;
碘乙酰胺,Cat.#11149,Sigma;
ITSX100,Invitrogen,Cat.#51500-056;
LB+氨苄青霉素板-Hy-Labs Cat.#PD178;
L-半胱氨酸,Cat.#C7352,Sigma;
脂质转染胺,Invitrogen,Cat.#50470;
怀槐凝集素1mg/ml,Cat.#L8025,批号:036k4075,Sigma;
MAA-FITC,2mg/2ml缓冲液,EY,Cat.#F-7801-2;
马来酰亚胺,Cat.#129585,批号:S56783-278,Sigma;
Na2PO4.2H2O,Merck,Cat.#6580;
NaH2PO4.H2O,Merck,Cat.#6346;
Octet QK系统,动力学缓冲液x10,Cat.#18-5032,Fortebio.Fortebio Inc.USA;
木瓜酶,Cat.P3125,Sigma,以0.05M乙酸钠(pH4.5)溶液提供,含0.05%瑞香草芬;
酚红,Sigma,Cat.#P0290;
泊洛沙姆(Pluronic)F-68,Sigma,Cat.#P5556;
聚乙烯亚胺粉末,Linear MW25000,Polysciences,Cat.#23966;
蛋白酶抑制剂混合物,Sigma,Cat.#P8340;
蛋白酶抑制剂,Sigma,Cat.#P8340;
A蛋白琼脂糖凝胶(Sepharose)-Mab Select Xtra,Cat.#17-5269-07,批号:#10011545;
G蛋白磁珠,Biolabs,Cat.#S1430;
嘌呤霉素,Invitrogen,Cat.#Ant-pr5;
嘌呤霉素,Sigma,Cat.#P8833;
参比样品:5mg/ml灌注溶液,Merck,Serono,批号:#7820907;
限制性酶购自:新英格兰生物实验室(New England Biolabs);
R-藻红蛋白偶联链霉亲和素(SA-PE),0.2mg/ml,Biolegend,Cat.#405203;
R-藻红蛋白偶联链霉亲和素(SA-PE),Jackson,Cat.#016-110-084;
脱脂奶粉,Fluka,Cat.#70166;
碳酸氢钠,Merck,Cat.#6329;
碳酸钠,Merck,Cat.#6392;
氯化钠,Merck,Cat.#6404;
氢氧化钠颗粒,Merck,Cat.#1.06498.500;
III细胞直接cDNA合成试剂盒,Invitrogen,Cat.#18080-051;
SYBR安全DNA凝胶染料,10000x用DNSO配制,Invitrogen,Cat.#S33102;
TMB溶液,Cat.#1928,Savyon Diagnostics;
TransIT-PRO试剂盒,Mirus,Cat.#Mir5700;
Tris-HCl,Cat.#T3038,批号:037K8402,Sigma;
吐温20,Cat.8.17072,Merck;
丙戊酸钠盐,Sigma,Cat.#P4543。
溶液
生物素化AAL-SA-PE混合液:含20μg/ml生物素化AAL和2μg/mlSA-PE的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液;
1%漂白剂-FACS清洗液,Becton Dickinson,Cat.#340345;
ELISA试验缓冲液:含1%脱脂奶粉的PBS;
ELISA封闭缓冲液:含1%BSA/0.05%吐温-20的PBS;
ELISA捕获(包被)缓冲液:用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)将山羊抗-人IgG(H+L)按1:900稀释至最终浓度2mcg/ml;
ELISA标准曲线样品:用试验缓冲液将参比样品Erbitux(EMD,批号-7820907,5.0mg/ml)稀释至100ng/ml,然后作2倍系列稀释至1.56ng/ml,每个标准点浓度制备最终体积至少1ml的溶液;
ELISA洗涤缓冲液:含0.05%吐温-20的PBS;
配方缓冲液:取氯化钠11.7g(100mM),柠檬酸4.2g(10mM),甘氨酸15g(100mM),溶于WFI水,加氢氧化钠使pH=5.8,加WFI水使体积达到2升;
iCE280电泳贮存液:取70mcl1%甲基纤维素、1mcl6.14和9.5pI标记物、8mcl两性载体(pH3-10),加100ml WFI;
木瓜酶切割缓冲液:0.1M Tris-HCl,4mM EDTA,5mM甘氨酸,pH7.6,甘氨酸每次应新鲜制备,用此缓冲液按厂商说明书稀释木瓜酶至1mg/ml;
PBS(磷酸盐缓冲液):10mM磷酸钠、150mM氯化钠,pH7.2,用10xPBS作1:10稀释而制得;
含0.1%泊洛沙姆的PBS;
PBS,(ITL制剂,BR R0450V01);
PBS-0.05%吐温-20:0.5ml吐温-20与1升PBS x1混合而成;
20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5):1.8g Na2PO4.2H2O和1.38g NaH2PO4.H2O溶于1升水;
A蛋白洗脱液:20mM乙酸,pH=3.2;
A蛋白平衡/洗涤缓冲液2:50mM乙酸钠,pH=6.8;
A蛋白洗涤缓冲液1:50mM乙酸钠+1.5M氯化钠,pH=6.8;
还原缓冲液x2:8M盐酸胍,100mM Tris-HCl,10mM DTT,pH8.8(每次新鲜制备)。
细胞培养液
3.5%细胞增强6贮存液;
CHO克隆培养液,Cat.#6366,Sigma;
CHO DHFR-培养基粉末,SAFC Bioscinces,Cat.#C6614(ITL制品R0461V01);
DMEM-F/121:1X1,Invitrogen,Cat.#21331-020;
FEME培养液(DMEM/F-12(1:1)(Invitrogen,Cat.#32500_043)添加8ml/L ITS-X(Invitrogen,Cat.#51500-056);
极限必需培养基Eagle,Sigma,Cat.#M2279;
ProCHO5,Lonza,Cat.#BE12-766Q;
Select CD1000,Becton Dickinson,Cat.#215204;
VPA钠贮存液100mM。
一次性使用器材
14ml离心管,Greiner,Cat.#187261;
15ml离心管,Corning,Cat.#430052;
24孔板,Nunc,Cat.#142475;
5ml聚苯乙烯园底试管,Becton Dickinson,Falcon,Cat.#352054;
5ml聚苯乙烯园底试管,Becton Dickinson,Falcon,Cat.#352054;
96孔板,Costar,Cat.#3595;
96孔板,Falcon,Cat.#353072;
ABI PRISM TM光照粘合盖100Pkg,Applied Biosystems,Cat.#4311971;
冷冻管小瓶2ml,Grenier,Cat.#126-263;
针头过滤器(Acrodisc filter)0.2μm,Gelman,Cat.#4192;
Amicon超滤试管,15ml10kDa,Cat.UFC901024,Millipore;
Amicon超滤试管,3kDa,Cat.UFC900324,Millipore;
Amicon超离心过滤单元,Millipore,Cat.#UFC801024;
1℃冰冻容器,Nalgene,Cat.#5100-0001;
PBS或水除菌用一次性0.22μ过滤器,Nalgene,Cat.#1270020;
ACFM除菌(GP表达加膜)用一次性0.2μ过滤器,Millipore,Cat.#SCGPU05RE或SCGPU11RE;
FACS清洗除菌一次性0.45μ过滤器,Nalgene,Cat.#4500045;
一次性40μ细胞粗滤除菌器,Becton Dickinson,Falcon,Cat.#352340;
带有35μ细胞粗滤杯的一次性5ml聚苯乙烯试管,Becton Dickinson,Falcon,Cat.#352235;
一次性70μ(或35μ)除菌过滤杯Filcon,Becton Dickinson,Falcon,Cat.#340634;
一次性10μ过滤杯Filcon,Becton Dickinson,Cat.#340732;
一次性30μ过滤杯Filcon,Becton Dickinson,Cat.#340625;
DynaMag,Dynal,Invitrogen,Cat.#123.01D;
DynaMag,Dynal,Invitrogen,Cat.#123.21D;
ELISA微滴板MaxiSorp F96,Cat:NUNC;
锥形瓶100ml,Triforest,Cat.#TF FPC1000S;
锥形烧瓶125ml,Corning,Cat.#WI-431143;250ml,Corning,Cat.#WI-431144;500ml,Corning,Cat.#WI-431145;2L,Corning,Cat.#WI-4312-55;
FACS试管,Falcon,Cat.#352235,带蓝色过滤帽;
FACS试管,BD Falcon,Cat.#352235;
过滤试管10”0.1μm,Durapore,Millipore,Cat.#Mllipak20050;
过滤试管50,TPP,Cat.#87050;
iCE280毛细管芯柱,Cat:FC包被(PN:101700),Convergent Biosciences;
iCE280显微注射转移毛细管,Cat.PN:102019,Convergent Biosciences;
I磁铁,Becton Dickinson,Cat.#552311;
带有网格的Kova玻璃计数板(Glasstic Slide)10,Hycor,Cat.87144;
微离心管(1.7ml),Costa,Cat.#3207;
Octet QK系统,微孔板,黑色96孔,Cat.655209,Greiner,bio-one,德国;
96孔光学快热循环条形码板20/Pkg,Applied Biosystems,Cat.#4346906吸管头,Sorenson,Cat.#14200和14220;
吸管头0-200μl,Costa,Cat.#4864;
载玻片-A溶解透析盒G22kDa:Cat.#87718,恒温;
SnakeSkin透析管10kDa,Cat.#68100,批号:JJ127549,恒温,HiTrap MabSelectXtra1ml,Cat.#28-4082-58,GE;
一次性过滤装置1升过滤单元0.1μm,Millipore,Cat.#SCGPU05RE;
一次性过滤装置1升过滤单元0.2μm,Millipore,Cat.#SCGPU11RE;
无菌过滤器50ml过滤单元,0.22μm,Millipore,Cat.#SCGP00525;
灭菌24孔板,Nunc,Cat.#143982;
灭菌6孔板,Costar,Cat.#3506;
灭菌离心管:15ml,Becton Dickinson,Falcon,Cat.#2097和Corning,Cat.#430055;50ml,Corning,Cat.#430290;250ml,Corning,Cat.#430776;500ml,Corning,Cat.#431123;
灭菌FACS试管,Becton Dickinson,Falcon,Cat.#352054;
灭菌移液管:10ml,Sterillin Cat.#47110;1ml,Sterillin Cat.#40105;2ml,Sterillin Cat.#40102;5ml,Corning,Cat.#4011;50ml,Corning,Cat.#W4501;25ml,Falcon,Cat.#35-7525;
灭菌组织培养瓶:25cm2(T-25),Nunc,Cat.#163371;
链霉亲和素生物传感器头,Cat.18-5019,Fortebio Inc,USA;
灭菌注射器,2.5ml,Medi-Plus,Cat.;
TCF175cm2,Nunc,Cat.#156502;
TCF25cm2,Nunc,Cat.#136196;
TCF80cm2,Nunc,Cat.#153732。
仪器
AKTA探测器100,Cat.18-1112-41,GE(德国);
Cellavista-Innovatis,Roche;
离心机-Cat.#5417R-Eppendorf;
离心机-型号RC3C Plus–Sorvall(USA);
循环水浴箱,F3/K型,Haake(芬兰);
电导仪ORION,150型,ORION Research Inc.
库尔特计数器,ZI型,Coulter Electronics(英格兰);
1℃冰冻容器,Nalgene,Cat#No.5100-0001;
ELISA平板读数仪,Sunrise basic,Cat.#16039400,TECAN;
ELISA平板洗涤器,Cat.#6040834,TECAN;
ELISA机器人,Geresis RSP150/8,Cat.#5112200,恒温;
Eppendorf离心管,5417R系列,Eppendorf(德国);
FACSAria流式细胞仪,Becton Dickinson,;
微量移液管,Cat.#4540000,Labsystems(芬兰);
GE Fanuc系列90-70程序控制仪-General Electric Ltd.(USA);
PCR系统9700,PE Applied Biosystems(USA);
水平凝胶电泳系统,GIBCO-BRL Horizon58,Cat.#41060;
iCE280成像毛细管电泳分析仪,Cat.#1241,Convergent Biosciences;
iCE280PrinCE微量注射器,Cat.#5418074067,Convergent Biosciences;
iCE280软件iCE280CFR软件,v.2.3.6版,Convergent Biosciences;
成像控制器(Imagine master)VDS,Cat.#80-6254-80,Pharmacia(瑞典);
摇动培养盒,BS-T,B.Braun Biotech International(德国);
培养箱,37℃5%CO2,温度和CO2可控,Tuttnauer(以色列);
培养摇床“n”堆叠,Hybaid,Cat.#HBMOVC5T220(杂交炉);
层流净化罩(LFH)100型,Israflow(以色列);
光学显微镜,TMS型No.301070,Nikon(日本);
微量板培养箱/摇床,iEMS,ThermoLabsystem(芬兰);
微量板清洗机,Cat.#WW015,Applied Quality Services LTD(UK);
微波炉—Crystal,17升;
Octet QK系统,数据获得软件6.3版,Fortebio Inc,USA;
Octet QK系统,数据分析软件6.3版,Fortebio Inc,USA;
Octet QK系统,Fortebio Inc,CA,USA;
定轨平台摇床,具有25mm摇动振幅(轨道),New Brunswick Scientific(USA);
蠕动泵-Watson Marlow503S或505U(英国);
pH计,PHM210系列,Radiometer(丹麦);
平板洗涤器(SLT96PW)TECAN;
平台振动摇床-Hoefer“Red-Rocker”PR50-250V(Pharmacia Biotech);
电源,Cat.#PS500XT,Hoefer Scientific Instruments(USA);
冷冻离心管,Multifuge3S-R,Heraeus;
冷冻摇动培养箱,Innova4230,New Brunswick Scientific(USA);
机器人样品处理器,RSP150/8型,Genesis,TEACN(瑞士);
摇床,Rotamax,#120系列Heidolph(德国);
软件-WIZCON-PC Soft International Ltd.(以色列);
StepOnePlusTM实时-PCR系统,Applied Biosystems,Cat.#4376600;
UV表,BTS20.MS,Uvitec,Cat.#M023641;
水浴箱,恒温控制,Polyscience,9106型。
通用方法
缩写
AAL- 橙黄网孢盘菌凝集素
ACF- 无动物成分
ACFM 无动物成分培养液
ADCC- 抗体依赖性细胞介导的细胞毒
Anti EGFR mAb 抗EGFR mAb
CHO- 中国仓鼠卵巢细胞
DHFR 二氢叶酸还原酶
DMEM- Dulbecco’s改良Eagle’s培养液
DMSO 二甲基亚枫
DTT- 二硫苏糖醇
EDTA 乙二胺四乙酸
EGFR 表皮生长因子受体
ELISA 酶联免疫吸附试验
EMCV- 脑心肌炎病毒
Fab- IgG1重链和轻链的CH1和VH部分
FACS- 荧光激活细胞分拣仪
Fc- IgG1重链的CH3和CH2部分
F-SA- 荧光链霉亲和素
Fut8- 岩藻糖转移酶8
FX GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖3,5-差向异构酶,4-还原酶
GFT- GDP-岩藻糖转运蛋白
GMD- GDP-甘露糖4,6-脱水酶
GOI- 感兴趣的基因
HC- 重链
hCMV-IE- 人巨细胞病毒立即早期启动子
HRP 辣根过氧化物酶
ICE 成像毛细管电泳
IgG1 免疫球蛋白G1类
IRES 内部核糖体进入位点
LC- 轻链
MAA- 怀槐(Maackia amurensis)凝集素
MCB- 主细胞库
mMCV- 小鼠巨细胞病毒启动子
MF1- 平均荧光强度
MS- 质谱
MTX- 甲氨喋呤
NK- 自然杀伤细胞
PA- 聚腺苷酸化
PAC- 嘌呤霉素N-乙酰转移酶
PBS 磷酸缓冲盐水
PCD- 每个细胞每天微微克
PCR- 聚合酶链反应
PDL- 群体倍增水平
PDT- 群体倍增时间
POI- 感兴趣的蛋白质
PreMCB- 前主细胞库
RE- 限制性酶
RT- 室温
SA- 链霉亲和素
SA-PE R-藻红蛋白偶联的链霉亲和素
SP- 单个肽
SV40- 猿猴病毒40
TM- 跨膜肽
TMB 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺
VPA- 丙戊酸
在存在MTX时培育CHO-S细胞:取C6614培养的CHO-S细胞以0.2x106细胞/ml接种在含100nM MTX的培养液中,增殖10天直到活力超过90%。然后将细胞转移至200nM MTX中增殖27天,随后在200nM MTX中冻存细胞。为分离得到岩藻糖零表达的细胞,用不含MTX的培养液融化细胞。
用链霉亲和素磁珠选择低岩藻糖细胞:将经MTX处理的CHO细胞用生物素化AAL或AOL标记并与连接有链霉亲和素的磁珠混合。用磁铁分离细胞,使悬液中不附着于磁铁的细胞(即其表面岩藻糖水平低的细胞)进一步增殖。执行此步骤两次,然后用FACS分拣细胞。
收集经MTX处理的50x106个CHO-S细胞,用PBS+0.1%泊洛沙姆酸(Pluronic F-68,Sigma Cat.#p5556)液洗涤。然后于室温下将细胞在含浓度20μg/ml生物素化AAL(Vector,Cat.B-1395,Lot#U0922)或浓度5μg/ml生物素化AOL(Cat.L0169,EY)的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液5ml中,重悬30分钟。用PBS+0.1%泊洛沙姆酸洗涤染色后的细胞,加入250μl BD IMagSA颗粒和DM(BD,Cat#557812),再室温培育30分钟。然后加入2.25ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸+0.5%BSA。将磁珠分装在三个5ml试管中,放在BD IMagmet(BD,Cat#552311)上留置8分钟。吸取上清液移到一个新15ml试管中,进行此步骤两次,合并吸取的上清液。再将上清液分装入5ml试管置于BD IMagmet(BD,Cat#552311)上8分钟。收集上清液、离心,接种C6614培养液(CHO DHFR-培养基粉末,SAFC Bioscinces Cat#C6614)(ITL制品R0461V01)。增殖细胞,然后执行另一轮磁珠分离。
与凝集素一起培育后,与AAL培育的细胞活力为83%,与AOL培育的为89%。与PBS培育细胞的典型活力为85-95%。
用FACS分拣低岩藻糖细胞
A.磁珠分离后的分拣:对经二轮磁珠分离的细胞用FACS分拣细胞表面岩藻糖水平低的细胞。用冷PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗涤40x106细胞,离心,重悬于10ml含20μg/ml生物素化AAL或AOL+SA-PE的混合液中,转移至T80瓶中于37℃、45rpm振摇培育30分钟。将细胞离心,用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗涤,离心两次,重悬于PBS+0.1%泊洛沙姆酸液至终浓度10x106细胞/ml。用FACS将荧光最低的细胞悬液部分(1.5%)分拣入每管2ml的SigmaC6614SFM+HT(Biological Industries Cat#03-085-1C)液中,离心,重悬于每管1.5ml的Sigma C6614SFM+HT液中,接种6孔板孔,并增殖细胞。
B.低岩藻糖细胞的分拣-4轮:用冷PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗涤100x106细胞,离心,重悬于10ml含生物素化AAL(20μg/ml)+SA-PE(1:100)的PBS+0.1%泊洛沙姆酸混合液中,转移至T80瓶中37℃、45rpm振摇培育30分钟。将细胞离心,用冷的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗涤,离心两次,重悬于PBS+0.1%泊洛沙姆酸液,得到细胞浓度10x106/ml,滤入FACS试管中。用AAL培育后,细胞的活力为81%。用PBS培育后的典型细胞活力为85-95%。用FACS将细胞群中最低荧光部分(第一次分拣0.2%,第二次0.07%,第三次1%,第四次2%)分拣入每管2ml的Sigma ProCH5SFM+HT液中,离心,重悬于每管1ml(第一和第二次分拣)或3ml(第三和第四次分拣)的ProCH5SFM+HT液中,接种24孔板孔(第一和第二次分拣)或T25瓶(第三和第四次分拣),并增殖细胞。
用FACS分析细胞膜岩藻糖水平:用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗涤2x106细胞,离心,重悬于含500μl生物素化AAL(Cat.B1395,Vector)(稀释至20μg/ml)或AOL(Cat.L0169,EY)(稀释至5μg/ml)+SA-PE(Cat.40250,Biolegend)(稀释至2μg/ml)的PBS+0.1%泊洛沙姆酸混合液中,转移至24孔板37℃振摇培育30分钟。将细胞充分重悬并转移至15ml试管。加入10mlPBS+0.1%泊洛沙姆酸液混合细胞,离心,再洗涤。将沉淀细胞重悬于每管0.5ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液中,滤入FACS试管作细胞荧光分析。
用FACS分析细胞膜的唾液酸含量:用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液洗涤20x106细胞两次,离心,重悬于500μl含MAA-FITC(稀释至50μg/ml)的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液中,转移至24孔板,25℃振摇培育30分钟。将细胞彻底重悬并转移至15ml试管。加入10ml PBS+0.1%泊洛沙姆酸液,将细胞混合、离心再洗涤。沉淀细胞重悬于每管0.5ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液中,滤入FACS试管作细胞荧光分析。
将外源性岩藻糖加入培养的ITL-LF2细胞:取用抗EGFR mAb转染前或后的ITL-LF2细胞,以0.2x106细胞/ml浓度接种含不同浓度L-岩藻糖(Sigma,Cat.#F2252)的ProCHO5培养液,37℃和CO2下、320rpm振摇培育。4天后取样作细胞荧光FACS分析(如下文所述)。此外,用FACS对收获的抗EGFRmAb转染细胞的粗制样品进行分析。
前-主细胞库(前-MCB)的制备:在锥形瓶中扩增培养细胞用于细胞冻存。离心收集所需量的细胞,重悬于冻存培养液中。所述冻存培养液的组成为:92.5%的新鲜ProCH5培养液+HT和条件培养液(由指数生长的ITL-LF2宿主细胞产生)的1:1混合液;和7.5%DMSO。每个前-主细胞库(pre-MCB)中的每个克隆细胞冻存60个小瓶,每个1.5ml小瓶有10x106个细胞,在-80℃的Cryo冰冻1℃容器(NALGENE,Cat.#No.5100-0001)中冻结,24小时后移入液氮贮藏罐中。
细胞库测试:在制备前-MCB11天后,测试冻存安瓶中的ITL-LF2前-MCB细胞的活力。融化一个安瓶的细胞,立即测定活力。使细胞增殖三个生长周期,第三周期后测定活力。
用直接转移或沉浸技术进行无菌试验。同时检测细胞有无支原体。
用FACS ACDU进行克隆:用FACSAria细胞分拣仪的自动化细胞沉积单元(ACDU)装置进行克隆,用ACDU将ProCH5+HT培养的细胞以精确的“单个细胞”模式接种96孔板,每孔含200μl的80%C6366+20%ProCH5ACFM混合液,细胞浓度为0.4x106细胞/ml。克隆日(0天)和其后第8天用Cellavista给培养板拍照。挑选几个克隆,增殖后转移到装有4ml50%SigmaC6366和50%ProCH5混合液的T25培养瓶中。在细胞增殖期间逐步加入ProCH5液。分析这些细胞的mRNA特征。
抽提细胞RNA:用Rneasy试剂盒(Qiagen,Cat.#74104)按厂商说明书分离得到细胞的总RNA。
用于检测岩藻糖通路基因的RT-PCR:用Invitrogen的SuperScript III试剂盒(Cat.#18080-051)和盒中提供的寡dT引物,从CHO-S或ITL-LF2细胞抽提的总RNA制备cDNA。然后用基因特异性引物执行PCR。引物由Sigma Aldrich合成。引物的序列详见以下表1。用琼脂糖凝胶电泳分析产生的条带,与DNA大小标记物进行比较。
表1
用Q-PCR(实时PCR)评价岩藻糖通路mRNA的表达水平:用Applied Biosystems的高能cDNA逆转录酶试剂盒(Applied Biosystems Cat.#4368814)和盒中提供的随机引物制备cDNA。
由Applied Biosystems合成基因特异性引物和MGB探针。引物和探针的序列详见以下表2。
表2
按以下方式进行Q-PCR:
每次反应将制备的5μl cDNA加入到含有TaqManTM基因表达主混合液、正向引物和反向引物及TaqManTM MGB探针的混合液中,终体积13μl。
在StepOnePlusTM实时PCR仪上以“快速”模式进行Q-PCR,用StepOnePlusTM和DataAssist v2.0软件分析结果。
cDNA片段和质粒的DNA测序:用全自动化16毛细管ABI Prism3100基因分析仪进行DNA测序。采用Sci-Ed通用软件(克隆管理软件7.01版本和Aligen plus5,5.01版本)进行内部序列分析。
DNA表达载体的构建:所有载体采用标准的分子生物学技术构建。
质粒DNA的制备:用QIAGEN高速质粒Maxi试剂盒按照厂商所述程序分离质粒DNA。为了稳定转染,用特异性限制酶对DNA进行线性化,并用乙醇沉淀DNA进行除菌。用环形DNA进行瞬时转染。
ITL-LF2和CHO-S细胞的稳定转染:ITL-LF2细胞已适应无血清C6614培养液(CHODHFR-粉状培养基,SAFC Bioscinces Cat.#C6614)。将细胞在50ml试管(过滤管50,TPP,Cat.#87050)中的悬液于潮湿氛围中37℃、320rpm振摇培育。转染前2天,取100ml细胞以0.5x106细胞/ml的浓度接种在500ml锥形瓶(Corning,Cat.WJ-431145)中。通过脂质转染胺(GibcoBRL Cat.#18324-020)用含抗EGFRmAb编码序列的PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR串联-872载体转染细胞。转染当日,将一式三份细胞洗涤,重悬,取10x106细胞接种在T25瓶(Nunc,Cat.#163371)(Sigma,Cat.#M2279)中,每瓶含4ml MEM液。对于每次单质粒转染,采用20μg的线性化PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR串联-872载体。用MEM调节最终DNA体积至100μl,随后加入100μl脂质转染胺,室温培育45分钟。将DNA-脂质转染胺混合物加入细胞,在5%CO2氛围下37℃、50rpm振摇培育4小时。培育期结束时离心沉降细胞,更换8ml新鲜培养液(含50%C6614(Sigma)和50%C6366(Sigma),内加13.6mg/L次黄嘌呤/3.9mg/L胸腺嘧啶(HT,Biological Industries Cat.#03-085-1C)和10μg/ml岩藻糖(Sigma,Cat.#F2252))。
在振摇培养箱中,于37℃、50rpm振摇培育细胞瓶72小时。收集细胞,离心,重悬于10ml含50%C6614+50%C6366((内加10mg/ml岩藻糖+5-10μg/ml嘌呤霉素(针对不同的重复样品))的培养液,回置于原来的T25瓶中。在这些选择性条件下,只有表达PAC基因的细胞才能存活。随着重复样品细胞池的回收,逐步加入C6614培养液+10μg/ml岩藻糖。当细胞池回收完成后,取细胞接种无岩藻糖的新鲜C6614培养液。然后将细胞转移到ProCHO5培养液中,如下文所述检测细胞膜的岩藻糖水平。
用添加了13.61mg/L次黄嘌呤和3.88mg/L胸腺嘧啶(HT x1,BiologicalIndustries Cat.#03-085-1B)的无血清ProCHO5培养液(Lonza,Cat.#BE12-766Q)培养CHO-S细胞。将细胞悬浮在50ml生物反应器过滤管(TPP,Cat.#87050)中,于潮湿氛围下37℃、320rpm振摇培养。转染前2天,以0.2x106细胞/ml的浓度将细胞接种在有过滤盖的500ml锥形摇瓶(Corning,Cat.WJ-431145)中。转染当日,将细胞离心,取10x106细胞接种T25瓶(Nunc,Cat.#163371)中,每品含4ml MEM(Sigma,Cat.#M2279)培养液。对于每次单质粒转染,采用20μg的线性化载体(PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR串联-872)。用MEM调节最终DNA体积至100μl。随后加入100μl脂质转染胺(GibcoBRL Cat.#18324-020),室温培育45分钟。然后将DNA-脂质转染胺混合物加入细胞,在振摇培养箱中于5%CO2氛围下37℃、50rpm振摇培育4小时。培育期结束时离心沉降细胞,更换8ml新鲜ProCHO5培养液(Lonza,Cat.#BE12-766Q,内含0.1mg/ml硫酸葡聚糖、27.22mg/L次黄嘌呤和7.76mg/L胸腺嘧啶(HTx2,Biological Industries Cat.#03-085-1B),装入有过滤盖的125ml锥形瓶(Corning,Cat.#431143)中。在振摇培养箱中37℃、125rpm培育细胞瓶72小时。然后收集细胞,离心,重悬于20ml含25μg/ml嘌呤霉素(Invivogen,Cat.#抗-pr-1)的ProCHO5培养液,在这些选择性条件下,只有表达PCA基因的细胞才能存活。
ITL-LF2细胞的瞬时转染:转染前二天,将ProCHO5培养增殖的细胞以0.5x106细胞/ml浓度接种在1000ml锥形瓶(TRIFOREST,Cat.#TF FPC1000S)中的250ml培养液中,2天后达到大约2.5-3.0x106细胞/ml密度。
采用两种转染方案:
1.用含ProCHO5(Lonza)的培养液转染
转染当日,在15ml管(Corning,Cat.WJ-430052)中,将37.5μg DNA(HC+LC质粒各18.75μg)用2.5ml FEME培养液((含DMEM/F-12(1:1)(Invitrogen,Cat.#32500_043)、29mMNaHCO3、10mM HEPES、5g/L D-葡萄糖和7.5mM L-谷氨酰胺))稀释,Er125瓶中装有10ml初始体积的FEME培养液[DMEM/F-12(1:1)(Invitrogen,Cat.#32500_043),添加有8ml/L ITS-X(Invitrogen,Cat.#51500-056)、187.5μg PEI储备液(Polysciences Inc.,Cat.#23966)],将其加入DNA+FEME培养液(DNA:PEI=1:5)中,涡旋混合这些试剂10秒钟后室温培育10秒钟。将60x106个活细胞在50ml离心管中离心。用转染混合液轻轻重悬沉淀细胞,转移到125ml锥形瓶中,然后在含CO2的振摇培养箱中37℃、160rpm振摇培育180分钟。加入12.5ml ProCHO5培养液,使25ml培养物的最终浓度达到2.4x106细胞/ml。
转染后24小时,给转染的CHO细胞添加100μl(终浓度0.5mM)的100nM丙戊酸(VPA)钠盐贮存液(Sigma,Cat.#P4543)和2ml的3.5%细胞增强剂(HyClone,Cat.#SH30866.01)。将ITL-LF2细胞添加100μl(终浓度0.5mM)的100nM丙戊酸(VPA)钠盐贮存液(Sigma,Cat.#P4543),培育温度降低至31℃。
培育6天后,取细胞悬液样品作细胞计数和活力测定。离心后取上清液用ELISA试验评价瞬时表达。
2.用第二种培养液转染
从ITL-LF2和CHO-S细胞产生抗-EGFR mAb:在1升或2升锥形培养瓶中,以0.5-2x106个细胞的浓度将细胞接种在200-600ml含硫酸葡聚糖ProCHO5培养液中,在37℃振摇培养箱中以320rpm振摇培育4天。将收获的细胞离心并通过0.22μm滤膜过滤。然后加入蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,Cat.#P8340)(1升培养液加1ml)。收集的细胞于-80℃冻存直至纯化步骤开始。
用FACS分析粗制收获样品或纯化重组蛋白的岩藻糖水平:将G蛋白磁珠(Cat.S1430S,Biolabs)彻底重悬,室温下取25μl移入2ml试管中。将试管置于磁铁上1分钟,吸弃上清液。加入0.5ml20mM磷酸缓冲液重悬G蛋白珠。再重复此洗涤步骤一次。
取100μl抗体样品(25-37μg/ml粗制收获样品或纯化蛋白)加入含磁珠的试管中。37℃培育混合物30分钟后放置在磁铁上,除去上清液。用0.5ml20mM磷酸缓冲液洗涤磁珠两次,吸弃磁铁上的缓冲液。将结合抗体样品的磁珠重悬于0.5ml生物素化AAL-SA-PE混合液(20μg/ml生物素化AAL,Vector,Cat.B1395和0.2mg/ml用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液稀释至2μg/ml的SA-PE,BioLegend.Cat.40520),移入24孔板(Nunc,Cat.142475),用铝泊封盖,37℃、80rpm振摇培育30分钟。将混合物彻底重悬并移入装有10ml PBS+0.1%泊洛沙姆酸液的15ml试管(Corning,Cat.430052)中。通过加入10ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液进行二轮洗涤,离心去除上清液。将沉淀细胞重悬于0.5ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液中,通过FACS试管(Falcon,Cat.352235)过滤作FACS分析。
用FACS分析粗制收获样品或纯化重组蛋白的唾液酸水平:将G蛋白磁珠(Cat.S1430S,Biolabs)彻底重悬,于室温下取25μl移入2ml试管中。将试管置于磁铁上1分钟,吸弃上清液。加入0.5ml20mM磷酸缓冲液重悬G蛋白珠。再重复此洗涤步骤一次。
取100μl抗体样品(25μg/ml粗制收获物或纯化蛋白)加入含磁珠的试管中。混合物于室温培育30分钟后放置在磁铁上,除去上清液。用0.5ml20mM磷酸缓冲液洗涤磁珠两次,吸弃磁铁上的缓冲液。将结合样品抗体的磁珠重悬于0.5ml MAA-FITC液(2ml中含2mg EY,Cat.F-7801-1,用PBS+0.1%泊洛沙姆酸液稀释至25μg/ml)中,转移到24孔板(Nunc,Cat.142475)上,用铝泊封盖,室温80rpm振摇培育30分钟。将混合物彻底重悬并移入装有10ml PBS+0.1%泊洛沙姆酸液的15ml试管(Corning,Cat.WJ-430052)中。通过加入10ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液进行二轮洗涤,离心去除上清液。将沉淀细胞重悬于0.5ml的PBS+0.1%泊洛沙姆酸液,通过FACS试管(Falcon,Cat.352235)过滤作FACS分析。
ELISA检测抗-EGFR抗体:采用ELISA试验测定测试样品中的人抗体浓度。按以下所述进行此试验。
用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的2μg/ml山羊抗-人IgG(H+L)包被微量滴定板,4℃培育过夜。用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20的PBS)洗涤微滴板4次。用200μl/孔封闭缓冲液(含1%BSA和0.05%吐温-20的PBS-T)室温封闭1小时。封闭后用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20的PBS)洗涤微滴板4次。该包被板制备后立即使用或-20℃存放直至使用(6周内)。将样品、制标准曲线用的标准品和核查样品加入微滴板(100μl/孔)37℃培育1小时。再用洗涤缓冲液洗涤微滴板4次。与100μl等份的用试验缓冲液(含1%脱脂奶粉的PBS)稀释至8ng/ml的偶联HRP-山羊抗-人IgG Fab一起37℃培育1小时。再用洗涤缓冲液洗涤微滴板4次,加入100μl底物液(TMB),室温培育约10分钟。每孔加入100μl1N HCI终止反应。在ELISA读数仪中检测A450nm吸光值。用试验缓冲液制备参比样品抗-EGFR(MerckSerono公司的ERBITUX)系列稀释液,得出范围为100—1.56ng/ml的标准曲线。用细胞池2390(由ITL细胞产生)产生的粗产品样品作为核查样品。用Magelan5软件计算出光学数据结果。采用四参数逻辑方程,从以ng/ml表示的标准曲线自动插入未知样品的结果。用Robotic样品处理器执行样品的稀释、标准曲线的制备、样品在微滴板上的分配。
完整抗-EGFR和FC单体的纯化:在G蛋白柱上纯化细胞池(2390和2622UN)产生的抗-EGFR产物。纯化的产物以完整IgG或Fc单体形式(如下文描述的)进行分析。纯化过程按图2所概括的采用AKTA Explorer系统进行。
用A蛋白纯化抗-EGFR:用5-6柱体积(CV)的50mM乙酸钠pH6.8液以流速2.0ml/分平衡A蛋白琼脂糖凝胶-MAb Select Xtra预装柱。将含细胞池产物的澄清粗制收获液(约500ml)加载到该柱上,流速2.0ml/分。以二步骤洗涤该柱(7-9CV):先用含1.5M NaCl的50mM乙酸钠pH8.6洗涤,然后用50mM乙酸钠pH8.6第二次洗涤,流速2.0ml/分直至达到基线。用20mM乙酸pH3.2洗脱产物至一个流份中,流速2.0ml/分。室温下进行柱展开,用UV于280和215nm监测。用1M Tris液调整pH至6.0。用0.1M乙酸pH2.9洗柱,然后用8CV的4M盐酸胍清洗。用50mM乙酸钠pH8.6重新平衡该柱后保存于20%乙醇中。
透析和浓缩完整的抗-EGFRmAb:将从A蛋白琼脂糖凝胶-MAb Select Xtra柱洗脱的流份在SnakeSkin透析管(10kDa MW截断孔径)中用“配方缓冲液”(100mM NaCl、100mM甘氨酸、10mM柠檬酸盐,pH5.8)以体积比约1:100透析过夜。透析后在Amicon浓缩器中超滤(10kDa MW截断膜)浓缩样品。于2-8℃进行这些步骤。浓缩产品的浓度用ELISA或O.D.280nm检测。
木瓜酶切割抗体:将从A蛋白柱洗脱的流份在SnakeSkin透析管(10kDa MW截断孔径)中用缓冲液(0.1M Tris-HCl,4mM EDTA,pH5.8)以体积比=约1:100(蛋白:缓冲液)4℃透析过夜。透析后在Amicon浓缩器中超滤(10kDa MW截断膜)浓缩样品至1mg/ml。用木瓜酶将抗-EGFR切割成Fab和Fc部分。通过在0.1M Tris-HCl(pH7.6)、4mM EDTA、5mM半胱氨酸中培育终浓度为1mg/ml的抗体,进行这种切割。通过加入木瓜酶(用水稀释至1mg/ml)使最终的蛋白:酶比例=100:1(w/w)而启动消化。37℃进行消化2小时,加入马来酰亚胺(33mM)并置冰上冷却终止切割。用上述A蛋白亲和层析纯化得到切割混合物中的Fc二聚体部分。在SnakeSkin透析管(10kDa MW截断孔径)中用PBSx1(pH7.2)将纯化的Fc二聚体透析两次,在Amicon浓缩器中超滤(10kDa MW截断膜)浓缩至2mg/ml。
还原和烷基化:在变性条件下用Fc二聚体部分进行还原和烷基化而产生Fc单体,对位于重链CH2区297位N-糖基化位点的岩藻糖水平作特征分析(参见技术背景章节)。用缓冲液(4M盐酸胍,50mM Tris-HCl,pH8.8)将Fc二聚体部分稀释至1mg/ml,然后加入二硫苏糖醇(DTT,5mM),将反应混合液置于75℃,5分钟。使蛋白溶液冷却至室温,加入0.5M碘乙酰胺贮存液达到最终浓度15mM。在黑暗中进行室温烷基化40分钟。然后加入0.5MDTT贮存液达到15mM浓度,以淬灭烷基化反应。
透析和浓缩抗-EGFR单体:在SnakeSkin透析管(10kDa MW截断孔径)中,用“配方缓冲液”(100mM NaCl、100mM甘氨酸、10mM柠檬酸盐,pH5.8)以体积比为约1:100(蛋白:缓冲液),将从A蛋白琼脂糖凝胶-MAb Select Xtra柱洗脱的流份透析过夜。透析后在Amicon浓缩器中超滤(10kDa MW截断膜)浓缩样品。这些步骤于2-8℃进行。浓缩产品的浓度用ELISA或O.D.280nm检测。
用octet分析纯化蛋白质的岩藻糖和唾液酸水平:利用此试验来测定纯化产品(完整IgG1或Fc单体)上的岩藻糖和唾液酸水平,作Octet动力学分析。如下所述进行该试验。
用NHS-PEG4-生物素试剂按厂商说明书将AAL或MAA生物素化。将生物素试剂溶液(1mM,用pH7.2的PBS配制)加到1ml凝集素(1mg/ml)溶液中(凝集素:生物素比例=1:5)。在冰上培育反应混合液2小时。在载玻片-A-裂解盒(Slide–A-Lyzer cassette,10kDa MW截断孔径)中用PBS(pH7.2)透析样品。
开始实验前用动力学分析缓冲液于30℃不摇动下预培育链霉亲和素生物传感器(SA)20分钟。制备所需浓度的缓冲液、生物素化凝集素和纯化的蛋白产物,移入96孔板(250μl/孔)。所有步骤在30℃、1000rpm振摇速度下进行。将生物传感器置于相应的孔中启动试验并检测层厚度随时间的变化(纳米nm),在电脑控制下进行所有操作。先将1μg/ml的生物素化AAL(AAL-B)或10μg/ml生物素化MAA(MAA-B)固定在链霉亲和素传感器顶端的表面40分钟(加载步骤)。然后用稀释的动力学分析缓冲液(KB x1)洗涤传感器头10分钟(基线步骤)。在结合步骤时,使纯化的蛋白质与生物素化凝集素结合40分钟,然后解离步骤用KB x1缓冲液洗涤。图3显示了用Octet作动力学分析的典型概况。用Octet用户软件6.3版自动处理数据。
用ICE280分析纯化抗体的电荷概况:用iCE280分析仪(Convergent Biosciences)进行毛细管等电点聚焦成像。在毛细管芯柱(长50nm,直径100μm的I.D.柱)上实现异型分离,分离用毛细管具有以碳氟化合物预先包被的内表面。
在Amicon超离心过滤管(10kDa MW截断纤维素膜)中超滤浓缩经纯化和透析的抗-EGFR样品至4mg/ml。将20μl4mg/ml抗-EGFR与80μl电泳贮存液混合,制备分析用样品。用100mM NaOH作为阴极电解液、80mMH3PO4作为阳极电解液进行分离。电泳图由280nm处UV吸收加以识别。以下表3给出了最终状态和浓度的小结。
表3
用MS分析Fc单体上的糖基化模式:对如上所述分离的抗-EGFR抗体的Fc单体,用MS聚糖分析作进一步评价。
在ACFM中的细胞增殖和产率
细胞培养的维持和PDT计算
按如下所述在ACFM中维持细胞培养:以0.2x106细胞/ml浓度将细胞接种在50ml试管中,在定轨摇床上37℃、320rpm培育。一周两次测量细胞数和活力。将细胞培养液于4℃、100g离心5分钟,沉淀细胞重悬于预热的新鲜ACFM中传代培养。
按以下公式计算细胞群体倍增水平(PDL)和群体倍增时间(PDT):
Ti-接种时活细胞总数
Te-结束时活细胞总数
最大细胞浓度的测定:以0.2x106细胞/ml浓度将细胞接种于50ml试管(TPP,Cat.#87050),在定轨摇床上37℃、320rpm培育,检测不同时间点的细胞数和细胞活力。
在ACFM中的具体产率:为了测定在ACFM中的具体产率(PCD),在50ml试管中,以0.5x106细胞/ml浓度将细胞接种在特定的ACFM中,在振荡培养器中37℃、320rpm培育24小时。取出培养液,用ELISA测定产物浓度。将24小时的滴度除以接种时和24小时实验后的平均浓度进行计算。
PCD-pg/细胞/天
T-滴度(pg/ml)
Ci-接种时的细胞浓度(细胞/ml)
Ce-24小时后的细胞浓度(细胞/ml)
以批次方法培养和产率:在125ml锥形瓶(Corning,Cat.#WI-431143)中,装有40mlProCHO5培养液和12ml CHO CD Efficient FeedTMA(Invitrogen,Cat.#A10234-01)+CHO CDEfficient FeedTM.B(Invitrogen,Cat.#A10240-01)(1:1)混合液,以0.2x106细胞/孔的接种浓度进行批次法悬浮细胞的培养和产率计算:5%CO2气体下37℃、125rpm摇动培养直至活力水平降低至70%以下,从第3天起每隔1-2天取样作产物滴度分析(用ELISA法)、测定代谢物浓度、细胞浓度和活力。
实施例1.含低岩藻糖细胞的分离方法
分离低岩藻糖表达细胞所采用的策略是以产生随机突变和选择具有所需低岩藻糖表型的细胞为基础的。
该方法包括几个步骤(见图4和5所示),起始时将CHO-S细胞与诱变剂MTX一起培育以产生突变细胞。然后去除MTX,按以下步骤之一分离细胞:
1.进行两轮用生物素化岩藻糖特异性凝集素(生物素化AAL或AOL)标记细胞和分离不结合链霉亲和素包被磁珠的细胞。此步后是用生物素化岩藻糖特异性凝集素(生物素化AAL或AOL)和荧光链霉亲和素标记细胞,然后用FACS一次分拣低荧光细胞(图4)。
2.进行四轮生物素化岩藻糖特异性凝集素(生物素化AAL)和荧光链霉亲和素标记细胞,然后用FACS分拣低荧光细胞(图5)。
在MTX中培育CHO-S细胞:取C6614培养的CHO-S细胞以0.2x106细胞/ml浓度接种在100nM MTX液中,增殖10天直到活力超过90%。然后以同样起始浓度将细胞转移到含200nMMTX的C6614培养液中培养直到活力超过90%。冻存细胞供含低岩藻糖细胞的分离用。
实施例2.用链霉亲和素磁珠二轮分离和FACS一轮分拣(ITL-LF1细胞)选择低岩藻糖细胞
在200nM MTX中培养5x107个CHO-S细胞,取用磁珠一次分离的野生型CHO-S和CHODUKX细胞接种96孔板,增殖后转移到T80瓶中。分离的未结合细胞的数量和活力在MTX处理的CHO-S细胞中较高,而在非MTX处理的细胞中低得多。此外,用MTX培养的CHO-S细胞14天即可达到(转移入)T80瓶,而CHO-S和CHO DUKX细胞只是在22天后才达到(转移入)T80瓶。进一步进行低岩藻糖细胞分离只用MTX处理的CHO-S细胞。第二轮链霉亲和素包被磁珠分离用5x107个细胞开始,取选出的不结合细胞接种96孔板。回收和细胞增殖后,用4x107个细胞进行1.5%低岩藻糖细胞群的FACS分拣。
细胞膜岩藻糖水平分析:细胞表面岩藻糖水平分析显示,用生物素化AAL和SA-PE标记细胞后,只有CHO-S MTX分拣的细胞显示为细胞膜低岩藻糖水平细胞亚群。CHO-S(图6)和CHO DUKX(数据未显示)分离的细胞呈现正常的细胞膜岩藻糖水平。对经二轮链霉亲和素包被磁珠选择和一轮FACS分拣选择的MTX处理的CHO-S细胞进行的进一步分析(见图7A),显示分拣细胞的低岩藻糖模式。发现在ProCHO5和C6614培养液培养的细胞中该低岩藻糖模式相似(图8A)。
用生物素化AOL实施类似的方法。经二轮链霉亲和素包被磁珠选择和一轮FACS分拣后,对用生物素化AOL标记的MTX处理CHO-S细胞进行的分析见图8B,显示分拣得到的细胞为低岩藻糖模式。
用米曲霉菌1-岩藻糖特异性凝集素(AOL)选择低岩藻糖细胞:用生物素化AOL标记经MTX培养的CHO-S细胞,并与链霉亲和素包被磁珠混合。在磁铁上分离细胞,使不附着于磁铁的细胞进一步增殖。重复此步骤两次。然后用生物素化AOL和链霉亲和素标记细胞,用FACS分拣低荧光细胞作进一步增殖。用生物素化AOL和链霉亲和素标记细胞进行FACS分析。结果见图7B,显示AOL也可用于选择低荧光表达细胞。
细胞膜唾液酸水平的分析:细胞膜唾液酸水平的分析不仅可指示寡糖上唾液酸的存在,而且确保在低岩藻糖选择期间全部寡糖不会丢失。通过细胞与偶联FITC的唾液酸特异性凝集素(MAA)一起培育然后作FACS分析,进行细胞膜唾液酸水平的分析。该分析显示,细胞用生物素化AOL和SA-PE标记后,在用ProCHO5和C6614培养的CHO-S和ITL-LF1细胞二者的细胞膜上呈现相似的唾液酸水平(图9)。
低岩藻糖表型的稳定性:在选择ITL-LF1细胞作358群体倍增(PDL)后不同时间点测定细胞表面的岩藻糖水平,分析显示用生物素化AOL和SA-PE标记细胞后,低岩藻糖表型保持低水平而且保持稳定(图10)。
生长速率:在岩藻糖稳定性试验期间测定的ITL-LF1细胞生长速率为PDT=15-20小时(图11),与CHO-S细胞类似。
实施例3.用FACS分拣选择零岩藻糖细胞(ITL-LF2细胞)
将在200nM MTX中培养的CHO-S细胞用FACS分拣以选择低岩藻糖细胞群。以下表4说明了分拣采用的初始细胞数,低岩藻糖门控细胞部分及每轮分拣中的分拣细胞数。
表4
FACS分拣轮次 | 初始细胞数 | 门控细胞的% | 分拣细胞数 |
1 | 6.5x10<sup>7</sup> | 0.2 | 1.2x10<sup>4*</sup> |
2 | 6.5x10<sup>7</sup> | 0.07 | 5.8x10<sup>3*</sup> |
3 | 8x10<sup>7</sup> | 1.0 | 8x10<sup>5#</sup> |
4 | 6x10<sup>7</sup> | 2.0 | 1x10<sup>6#</sup> |
*分拣后用Cellavista计数细胞
#按照FACS门控估计的细胞数
细胞膜岩藻糖水平的分析:细胞膜岩藻糖水平的分析显示,用生物素化AAL和SA-PE标记细胞后,分拣的零岩藻糖CHO-S MTX细胞部分随着实施的分拣轮数增加而增加。三轮分拣得到具有低岩藻糖水平的同质细胞群。采用四轮分拣进一步证实选择到低岩藻糖基化水平的同质细胞群(图12)。另一分析显示,ProCHO5和C6614培养液中ITL-LF2细胞的岩藻糖基化水平均为零(图13)。
细胞膜唾液酸水平的分析:唾液酸水平的分析不仅可指示寡糖上唾液酸的存在,而且确保在低岩藻糖选择期间全部寡糖不会丢失。该分析显示,用偶联FITC的唾液酸特异性凝集素MAA标记细胞后,CHO-S和ITL-LF2细胞的细胞膜上呈现相似的唾液酸水平(图14)。
低岩藻糖表型的稳定性:选择ITL-LF2低岩藻糖细胞作370群体倍增(PDL)后在不同时间点测定细胞表面的岩藻糖水平,分析显示用生物素化AAL和SA-PE标记细胞后,低岩藻糖表型保持低水平并且保持稳定(图15)。
生长速率:在岩藻糖稳定性试验期间测定的ITL-LF2细胞生长速率为PDT=15-20小时(图16),与CHO-S细胞类似。
最高细胞浓度:为测定在单纯批次培养条件下(无饲料)可达到的最高细胞浓度。在50ml试管中接种浓度0.2x106细胞/ml的ITL-LF2细胞,培养7天。所达到的最高活细胞浓度为8.4x106细胞/ml,略高于亲代CHO-S细胞所达到的最高7.5x106活细胞/ml(图17)。
外源性岩藻糖对ITL-LF2细胞岩藻糖基化水平的影响:在存在递增浓度L-岩藻糖的ProCHO5培养液中接种ITL-LF2细胞。FACS分析结果显示外源性岩藻糖的浓度与细胞膜岩藻糖基化水平之间存在相关性(图18)。
以批次方法培养ITL-LF2细胞:为了评价批次培养方法时ITL-LF2细胞的表现并与CHO-S细胞作比较,在ProCHO5+CHO CD Efficient FeedTM培养液中接种细胞并增殖,只要其活力保持高于60%。取培养细胞的样品检测细胞浓度、细胞活力、代谢产物浓度和产物滴度。结果显示培养较长时间的ITL-LF2细胞具有较高的活力(图19B和19C),与CHO-S细胞相比,活细胞积分浓度(IVCC)较高(图19D)。ITL-LF2细胞也显示在此期间乳酸盐浓度显著较低(图19D),表明这些细胞利用乳酸盐作为碳源比亲代CHO-S更有效。
用FACS ACDU克隆细胞:利用FACSAria细胞分拣仪的自动化细胞沉积单元(ACDU)装置克隆ITL-LF2细胞。在克隆后8天的两次实验中,接种在80%C6614+20%ProCHO5培养液中的细胞,192孔分别出现了103和124个细胞克隆(反映回收率为54%和65%)。克隆CHO-S细胞后(数据未显示)通常可获得相似范围的回收。将几个克隆细胞在ProCHO5培养液中增殖,用于mRNA特征分析。
ITL-LF2细胞的基因分析:岩藻糖基化通路由分别起始和会聚的两条途径组成,这两条途径包括D-葡萄糖的从头合成途径和L-岩藻糖的拯救途径。为了研究ITL-LF2细胞低岩藻糖表型的原因,对该途径所涉及基因的表达进行了分析。目的是为了观察这些基因中的任一基因的序列或表达水平是否受到破坏。对这些基因进行表达模式(通过RT-PCR和测序)和表达水平(通过Q-PCR)的分析,见图20。
以下表5详示了所用引物的序列。
表5
为了分析ITL-LF2细胞岩藻糖基化通路基因的表达与CHO-S亲代细胞相比较,提取这两种细胞系的总RNA,使其逆转录(RT)后用基因特异性引物作PCR,获得完整的编码区。然后将得到的cDNA进行琼脂糖凝胶电泳,分析其大小是否与获自亲代CHO-S和ITL-LF2细胞的(cDNA)存在差异。通过测序进一步分析所得条带。图21显示所有四种测试基因在RT-PCR后获得的结果。
GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶-还原酶(FX)与α1,6岩藻糖基转移酶(Fut8)基因获得的cDNA大小相似。测序分析证实两种细胞系的这两个基因的cDNA相同。CHO-S细胞中的GDPβL岩藻糖焦磷酸化酶(GFPP)不可测得(经几次RT-PCR分析核实),但ITL-LF2细胞中可检测到一条非常弱的预期大小条带(图21箭头所指)。这种情况未进行测序。
对于GMD基因,测得CHO-S细胞中有预期大小的条带,测序揭示它是预期的全长GMDmRNA。然而,在ITL-LF2细胞中测得两个条带(这两个条带在凝胶上有时看起来像一条“肥胖”带,表明为双体),两条都比全长ORF小。测序揭示存在两种剪接变体,一种(称为剪接变体1—SV1)含外显子8和9缺失(图22A),第二种(剪接变体-2—SV2)缺失了外显子3和4(图22B)。全长GMD和两种剪接变体的蛋白质序列如SEQ ID NO:23-25所示。全长GMD和两种剪接变体的DNA序列如SEQ ID NO:26-28所示。此外,发现CHO-S和ITL-LF2细胞均有一条约250bp的小条带。由于这条小条带在两种类型细胞中均可检测到,似乎此条带不是这两种类型细胞糖基化差异的原因。因此,将此条带称为“小”条带而不再进行进一步分析。
GMD剪接变体(SV)序列的分析揭示各剪接变体存在其独特的限制性酶位点(外显子4上的BgIII和外显子8上的XmnI,见图23A)。为进一步核实CHO-S和ITL-LF2细胞的mRNA模式,对每种类型细胞进行了额外的RT-PCR。将cDNA切成相等的三个部分,一个不处理,另一个用BgIII消化,第三个用XmnI消化。然后将所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳,检测条带并与DNA大小标志物进行比较(图23B)。此实验背后的合理推论是如果ITL-LF2细胞含有两种SV的混合物,则用一种限制酶消化将切出一条不含该特异性限制酶位点的较大SV条带,另一条含有该特异性限制酶位点的SV出现预期大小的新条带。所有消化中都获得了预期大小的条带,表明ITL-LF2细胞中的确存在这两种剪接变体的混合物。限制性酶消化后(不消化该SV)从凝胶上切下最大的条带并测序。结果显示各细胞存在预期的SV:BgIII消化的部分中遗留有较大条带SV2,XmnI消化片段中遗留有SV1(所得片段大小的说明见以下表6)。
表6
*CHO-S细胞的cDNA被BgIII消化不完全
参与岩藻糖合成的基因的表达水平:用Q-PCR和基因特异性引物及探针检测参与岩藻糖合成通路的基因的表达水平。任何一种所检测基因的表达水平均无显著改变(图24)。该结果表明ITL-LF2细胞的岩藻糖基化水平变化不是由于GMD mRNA表达水平所致。
前-MCB的制备(制备,融化,灭菌和支原体测试):将经四轮FACS低岩藻糖细胞选择后产生的ITL-LF2细胞进行增殖和冻存。融化这些细胞使它们增殖从而制备前MCB。制备的前主细胞库(前MCB)包含每瓶装有10x106个细胞的60个安瓿。
前主细胞库的细胞活力,灭菌和支原体测试:冻存后11天取1个ITL-LF2细胞的前MCB安瓿进行融化。融化后立即测得的活力为98.3%。使细胞增殖三个生长周期后,活力为99.0%。
检测了该前MCB的灭菌和支原体污染情况。发现该细胞库无菌也无支原体。
实施例4.用野生型GMD基因转染后ITL-LF2细胞重新获得岩藻糖基化
发现在ITL-LF2细胞中GMD基因(参与岩藻糖从头合成通路的基因)显示有两种剪接变体而无全长mRNA,这与CHO-S野生型细胞所见的模式不同。为了评价缺乏全长GMD蛋白是否是ITL-LF2细胞所见到的低岩藻糖表型的原因,用全长GMD cDNA转染该细胞然后用FACS分析岩藻糖基化水平。
构建质粒MB-129(PCMV-P-GMD):采用表5所示的引物586-26和587-22对从CHO-S野生型细胞提取的总RNA作RT-PCR,产生全长GMDcDNA。为了将此基因克隆到所需载体中,用引物700-45和701-30(详见下表7)再进行一步PCR从而加入克隆步骤所需的限制性酶(RE)位点(5’SwaI和3’XhoI)。
表7
用SwaI和XhoI消化PCR片段后与用相同限制性酶消化的载体pCMV-P连接。
所得载体(MB-129)含有在hCMV启动子调控下的GMD基因和在一分开的弹夹上作为选择标志的嘌呤霉素抗性基因,见图25。
转染细胞的岩藻糖表达:采用脂质转染胺试剂,一式三份用含GMD编码序列的线性质粒(pCMV-P-GMD)转染ITL-LF2和CHO-S细胞。三天后回收ITL-LF2细胞到50%C6614(Sigma)和50%C6366(Sigma)(加有13.6mg/L次黄嘌呤/3.9mg/L胸腺嘧啶(HT)和10μg/ml岩藻糖)的溶液中。然后用50%C6614(Sigma)和50%C6366(Sigma)(加有10mg/ml岩藻糖和10μg/ml嘌呤霉素)的溶液选择转染细胞。将所有回收的ITL-LF2转染细胞转移到含10μg/ml嘌呤霉素而无岩藻糖的ProCHO5培养液中。
用FACS分析GMD转染的ITL-LF2细胞的岩藻糖基化水平,与CHO-S(阳性对照)和ITL-LF2(阴性对照)细胞的岩藻糖基化水平进行比较(图26)。结果证明细胞群大约45%的细胞表达的蛋白质其岩藻糖基化水平与CHO-S细胞表达的相似。细胞群的其余部分(约55%)显示较低的岩藻糖基化水平。然而,低岩藻糖基化水平的细胞群其岩藻糖基化水平高于未转染的ITL-LF2细胞。上述结果表明,用含GMD基因的质粒转染后ITL-LF2细胞重建了岩藻糖基化,并证实缺乏GMD mRNA是ITL-LF2细胞岩藻糖基化水平低的原因。GMD转染的ITL-LF2细胞存在具有不同岩藻糖基化水平的两个亚群的原因可能源自嘌呤霉素选择的严格性。设想低和高岩藻糖基化的两个亚群细胞均表达足够量的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PCA)从而在嘌呤霉素选择下存活,但PAC与GMD表达之间可能没有直接相关性。因此,这两个亚群细胞表达不同水平的GMD蛋白而导致不同的岩藻糖基化水平。
实施例5.稳定和瞬时转染后的ITL-LF2细胞分析
ITL-LF和CHO-S细胞的稳定转染:采用脂质转染胺试剂,一式三份用含抗EGFRmAb编码序列(PGL3抗EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR串联)的线性质粒转染ITL-LF2和CHO-S细胞(图27)。
回收ITL-LF2细胞三天,置于50%C6614(Sigma)和50%C6366(Sigma)(加有13.6mg/L次黄嘌呤/3.9mg/L胸腺嘧啶(HT)和10μg/ml岩藻糖)的溶液中。然后用50%C6614(Sigma)和50%C6366(Sigma)(加有10mg/ml岩藻糖和5-10μg/ml嘌呤霉素)的溶液选择转染细胞。8天后将细胞转移到含10μg/ml岩藻糖和25μg/ml嘌呤霉素的C6614培养液中。完全回收后合并转染的ITL-LF2细胞,从而产生低岩藻糖转染细胞合并池。除去培养液中的岩藻糖,然后将细胞转移到含10μg/ml嘌呤霉素的ProCHO5培养液中。
回收CHO-S细胞三天,置于添加27.2mg/L次黄嘌呤/7.8mg/L胸腺嘧啶(HT)和10μg/ml岩藻糖的ProCHO5培养液(Sigma)中。在添加10μg/ml岩藻糖和25μg/ml嘌呤霉素的ProCHO5培养液中选择转染细胞。12天后全部回收该CHO-S细胞。
用ELISA分析重组抗体的表达,发现ITL-LF2细胞只比转染的CHO-S细胞略低(图28)。
用FACS分析抗EGFR mAb转染细胞膜的岩藻糖水平:对去除岩藻糖前、后C6614培养液中增殖的抗EGFR mAb转染细胞的细胞膜上岩藻糖水平的分析显示,去除岩藻糖导致细胞岩藻糖基化水平下降至先前无岩藻糖时所达到的低水平(图29)。
用FACS分析抗EGFR mAb转染细胞膜的唾液酸水平:分析显示转染后和用偶联FITC的唾液酸特异性凝集素MAA标记细胞后,抗EGFR转染的CHO-S和ITL-LF2细胞二者的细胞膜上均呈现类似的唾液酸水平,这些水平也与未转染CHO-S和ITL-LF2细胞的水平相似(图30)。
构建pTT%-抗EGFRmAb载体用于瞬时转染:为将抗EGFRmAb瞬时转染入ITL-LF2细胞中,以pTT5载体为骨架构建了两个载体。一个载体含EGFRmAb抗体的轻链(LC),另一个含其重链(HC)。
为创建载体MB-127,以载体PGL3抗-EGFRmAb EMCV-PAC1-DHFR串联-872为基础,采用引物690-36和691-38产生了含EGFRmAb HC的1476bp的PCR片段。用HindIII和NotI消化该片段后连接于用相同PE消化的pTT5载体。所得载体见图31A。
为创建载体MB-128,以载体PGL3抗-EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR串联-872为基础,采用引物692-36和693-32产生了含EGFR mAb LC的762bp的PCR片段。用HindIII和NotI消化该片段后连接于用相同PE消化的pTT5载体。所得载体见图31B。
瞬时转染ITL-LF2和CHO-S细胞:采用PEI试剂,一式三份用含EGFRmAb的pTT5载体转染ITL-LF2和CHO-S细胞(图30B)。然后执行两种转染方案:
在ProCHO5中转染:在含ProCHO5的培养液中于37℃转染CHO-S和ITL-LF2细胞,转染后24小时,在CHO-S胞中加入丙戊酸并于31℃培育。在上述条件下ITL-LF2和CHO-S细胞中该蛋白的浓度分别为12.5μg/ml和25μg/ml(图32)。
实施例6.重组抗体的分析
用FACS分析粗制材料或纯化抗体的岩藻糖和唾液酸水平:使粗制或纯化的含抗体材料结合于G蛋白磁珠,然后用荧光素标记的特异性凝集素染色(见图33说明)。用FACS分析抗体样品以检测糖残基水平。
用FACS分析从瞬时转染细胞收获的粗制品的岩藻糖水平:用旋转离心过滤器(Amicon,ultra cat#UFC801024)浓缩从瞬时转染细胞收获的粗制样品,使达到超过25μg/ml的浓度。按方法一节中所述,以蛋白产物浓度32-37μg/ml进行分析。结果清楚地显示,转染的ITL-LF2细胞表达的抗EGFRmAb蛋白具有低的岩藻糖水平(图33),类似于从稳定转染细胞所得材料中的水平(图37),并与细胞膜上测得的水平相关(图29)。
用FACS分析从稳定细胞池收获的粗制品的岩藻糖水平:收集每批培养细胞制得的粗制收获样品。如方法一节中所述作FACS分析,蛋白浓度25μg/ml。结果清楚地显示转染的ITL-LF2细胞表达的抗EGFRmAb蛋白具有低岩藻糖水平(图35),与从瞬时转染细胞所得材料中的水平(图34)相似,并且与细胞膜上测得的水平相关(图29)。
用FACS分析稳定细胞池收获粗制品的唾液酸水平:收集每批培养细胞制得的粗制收获样品。如方法一节中所述作FACS分析,蛋白浓度25μg/ml。结果清楚地显示转染的ITL-LF2和CHO-S细胞表达的抗EGFRmAb蛋白具有相似的唾液酸水平(图36),与细胞膜上测得的水平相关(图30)。
用FACS分析纯化产物的岩藻糖水平:用FACS分析稳定转染ITL-LF2细胞的抗EGFRmAb纯化产物,显示其岩藻糖水平低,而亲代CHO-S细胞的纯化产物含正常水平的岩藻糖(图37)。该岩藻糖水平与细胞膜上测得的水平(图29)和粗制制品中的水平(图34)相关。
用FACS分析纯化产物的唾液酸水平:用FACS分析稳定转染细胞的抗EGFRmAb纯化物质,显示其唾液酸水平与ITL-LF2和CHO-S两种细胞所得物质的唾液酸水平相似(图38)。该唾液酸水平与细胞膜上测得的水平(图30)和粗制制品中的水平(图36)相关。
用Octet测定完整的抗EGFRmAb上的岩藻糖水平:将从A蛋白柱上洗脱的纯化的完整抗EGFRmAb流份以配方缓冲液透析并浓缩。通过使抗EGFRmAb与生物素化橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)结合,测定野生型CHO-S细胞或ITL-LF2细胞产生的纯化的完整抗-EGFRmAb的岩藻糖水平。在Octet OK系统中采用动力学分析模块进行该试验。首先,使生物素化AAL结合于包被链霉亲和素的生物传感器,然后将抗-EGFR抗体上的岩藻糖结合于AAL凝集素。完整抗-EGFRmAb的分析只能检测Fab的岩藻糖化残基,因为位于Fc区的岩藻糖基化位点(ASN297)不能接近AAL(资料没显示)。为了检测Fc区的岩藻糖基化位点,应制备Fc单体。
结果证明,ITL-LF2细胞产生的完整抗-EGFRmAb的岩藻糖水平低,与转染的CHO-S细胞产生的相当(图39)。
用Octet测定完整抗EGFRmAb的唾液酸水平:评价了野生型CHO-S细胞(WT)或ITL-LF2细胞产生的抗-EGFRmAb的唾液酸化水平。将从A蛋白柱上洗脱的纯化的完整抗EGFRmAb流份以配方缓冲液透析并浓缩。通过使该产物与生物素化怀槐(Maackia amurensis)凝集素(MAA)结合,测定纯化的完整抗-EGFRmAb的唾液酸水平。在Octet OK系统中采用动力学分析模块进行该试验。首先,使生物素化MAA结合包被链霉亲和素的生物传感器,然后使抗-EGFRmAb上的唾液酸结合于MAA凝集素。结果(图40)显示ITL-LF2和CHO-S细胞产生的产物二者唾液酸水平相似。该结果暗示ITL-LF2和CHO-S细胞产物的唯一差别是岩藻糖水平(不同),而整体糖基化模式可能并不改变。
用Octet测定抗EGFR Fc单体的岩藻糖水平:用木瓜酶切割完整抗体制备抗-EGFR的Fc部分,然后进行还原和烷基化,接着是透析和浓缩步骤。从野生型CHO-S、ITL-LF2细胞所产生的产物制备Fc单体部分。使Fc单体与已附着于Octet QK系统中包被链霉亲和素的生物传感器的生物素化AAL相结合而测定其岩藻糖水平。结果证明,ITL-LF2细胞的抗-EGFRFc单体的岩藻糖水平低,与CHO-S细胞产生的产物相当(图41)。
用Octet测定抗EGFR Fc单体的唾液酸水平:用木瓜酶切割完整抗体制备抗-EGFRmAb的Fc部分,然后进行还原和烷基化,接着是透析和浓缩。制备野生型CHO-S、ITL-LF2细胞所产生产物的经透析和浓缩的Fc单体部分。使该单体部分与已附着于Octet QK系统中包被链霉亲和素的生物传感器的生物素化MAA结合而测定该Fc单体的唾液酸水平。结果显示,从CHO-S和ITL-LF2细胞纯化的该Fc部分唾液酸化水平相似。
抗-EGFR抗体池纯化产物的毛细管等电聚焦:在A蛋白柱上对野生型CHO-S和ITL-LF2细胞产生的抗-EGFR mAb产物进行纯化,以配方缓冲液透析并浓缩。用iCE280毛细管电泳法分析该完整产物的带电模式。图43显示从CHO-S细胞与ITL-LF2细胞所得纯化产物的pI值之间的比较。结果证明,CHO-S细胞与ITL-LF2细胞所产生产物的带电模式相似,而参比样品似乎比它们基础值略高,可能是由于细胞系和培养条件的不同所致。
抗-EGFR Fc部分的质谱分析:用木瓜酶切割纯化的完整抗-EGFRmAb,产生Fc和Fab两部分,然后透析和浓缩纯化该Fc部分。在EMD Serono研究中心(Billerica,USA),用质谱分析野生型CHO-S和ITL-LF2细胞的抗-EGFR Fc样品,评价保守Fc区糖基化位点的岩藻糖水平。观察到的聚糖结构主要是分别含0、1和2个半乳糖残基的G0-F、G1-F和G2-F双触角结构,如图44所描述的。如含1个,主要是含2个半乳糖残基的较高部分所表明的那样,CHO-S细胞产生的物质半乳糖水平较高。此结果显示,野生型CHO-S细胞所产生产物的IgG Fc区完全为岩藻糖基化的,而ITL-LF2细胞所产生产物的Fc区为非岩藻糖化的。
实施例7.外源性岩藻糖对抗-EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞岩藻糖基化水平的影响
取抗-EGFRmAb转染的ITL-LF2细胞接种含递增浓度L-岩藻糖的ProCHO5培养液。接种细胞后4天分析细胞和粗产物。FACA分析结果显示,外源性岩藻糖浓度与细胞膜(图45)及重组抗-EGFRmAb(图46)的岩藻糖基化水平之间具有相关性。在岩藻糖浓度为10μg/ml时,细胞和重组抗-EGFRmAb上达到最高岩藻糖基化。在1μg/ml外源性岩藻糖浓度时测得细胞最低岩藻糖基化水平,而2.5μg/ml较高浓度的外源性岩藻糖时测得重组抗-EGFRmAb上最低的岩藻糖基化水平。
根据上述结果产生校准曲线,其中最强荧光解释为100%岩藻糖基化,获得的无岩藻糖样品测得岩藻糖基化为0%。将在各个外源性岩藻糖浓度时获得的荧光水平减去0%外源性岩藻糖时获得的荧光水平,作为各个岩藻糖浓度的荧光水平,除以100%岩藻糖基化时的荧光水平(岩藻糖饱和),计算出岩藻糖基化的百分比。从这些数字绘制曲线(图47)。
基于Octet QK结果的岩藻糖基化和非岩藻糖基化抗-EGFRmAb Fc单体的校准曲线:用木瓜酶切割完整抗体抗-EGFRmAb,然后还原、烷基化、透析和浓缩,制得抗-EGFRmAb的Fc部分。从野生型CHO-S和ITL-LF2细胞产生的产物制备Fc单体部分。混合不同比例的CHO-S细胞产物(100%岩藻糖)与ITL-LF2细胞产物(0%岩藻糖)制备用于作校准曲线的样品。使混合样品结合事先已附着于Octet QK系统中包被链霉亲和素传感器的生物素化-AAL,从而测定各样品的岩藻糖水平。用Octet QK系统执行动力学分析相关的步骤。各曲线对应于样品的具体岩藻糖%水平(图48A)。校准曲线中结合水平与岩藻糖基化物质的%之间呈线性相关(图48B),可用于计算所需样品的岩藻糖基化水平。结果显示该试验灵敏度高,可以高分辨率区分相接近的岩藻糖水平。结合水平与岩藻糖基化物质的%之间呈线性相关性,这提示可通过加入一定浓度的外源性岩藻糖获得所需的岩藻糖基化百分比。
用Octet分析部分岩藻糖基化的抗-EGFR Fc单体部分:FACS分析结果显示外源性岩藻糖浓度与细胞膜岩藻糖基化水平相关,然后用Octet测定纯化抗-EGFR mAb的岩藻糖水平。用含3.5μg/ml岩藻糖的培养液将表达抗-EGFR mAb的ITL-LF2细胞按5批平行培养4天,收集培养液。将抗-EGFRmAb纯化后用木瓜酶切割,然后还原和烷基化,分离得到Fc单体部分。如上所述分析岩藻糖水平。结果证明,培养液中加入3.5μg/ml岩藻糖,在5个不同批次纯化蛋白中产生约15%岩藻糖基化水平,变异系数为±0.5%(图49)。这表明所需的岩藻糖水平是可复制的。
用质谱分析部分岩藻糖基化的抗-EGFR Fc单体部分:用质谱(MS)分析了抗-EGFRFc单体部分的岩藻糖基化水平。如上所述,用含3.5μg/ml岩藻糖的培养液将表达抗-EGFRmAb的ITL-LF2细胞按5批平行培养4天,收集培养液。将抗-EGFRmAb纯化后用木瓜酶切割,然后还原和烷基化,分离得到Fc单体部分。
观察到的聚糖结构主要是如下面表8所示分别含0、1和2个半乳糖残基的G0-F、G1-F和G2-F双触角结构。如含1个、主要含2个半乳糖残基的较高部分所示,CHO-S细胞产生的物质中半乳糖水平较高。结果证明,培养液中加入3.5μg/ml岩藻糖,在5个不同批次蛋白中诱生的岩藻糖基化水平为15.6%,变异系数为±1.7%。这些结果与Octet获得的结果相关(图49)。结果显示,野生型CHO-S细胞所产生产物的IgG Fc区为完全岩藻糖基化的,而ITL-LF2细胞所产生产物的FC区是非岩藻糖基化的。就岩藻糖基化水平而言,Octet结果与质谱结果之间发现极好的相关性。
表8
GluNac-■;甘露糖-●;岩藻糖-▲;半乳糖-○
结论和讨论
为了获得增强的ADCC功能,近年来开发了几种方法以降低重组抗体的岩藻糖基化水平。此项工作通过在氨甲喋呤存在下培养细胞然后有效地选择细胞膜上具有最低岩藻糖水平低即零岩藻糖的细胞,成功地从CHO-S细胞开发了ITL-LF2细胞系。按先前文献(Schimke,1988;Coquelle,Pipiras等,1997;Singer,Mesner等,2000)所述,在氨甲喋呤(MTX)存在下培养细胞而产生突变并进行基因扩增。
MTX处理后去除该诱变剂,进行下面的选择步骤。可通过采用对Fc糖基化位点上存在的Fuc1-6GlcNA残基有高亲和力的岩藻糖特异性橙黄网孢盘菌凝集素(AAL),经磁珠分离(图7)和/或FACS分拣(图12)进行这种选择。虽然可根据细胞膜岩藻糖水平选择零表达岩藻糖的细胞,但用多种分析方法发现这些细胞表达的重组抗体(抗-EGFRmAb)上岩藻糖水平为零(图34-43)。作为模型抗体的该抗-EGFRmAb有两个N-糖基化位点,一个在Fab片段上,对ADCC活性重要的另一个位点在Fc CH2上。不仅对完整的mAb而且对具有ADCC活性相关岩藻糖残基的Fc单体进行了Octet和MS分析。结果显示ITL-LF2细胞所产生物质的ADCC相关岩藻糖残基的岩藻糖水平为零,发现该ITL-LF2细胞的零岩藻糖表型在370PDL测试时稳定(图15)。表达重组抗体蛋白的细胞的生长和在生物反应器中的生产通常可在约200PDL的细胞期间内完成。零岩藻糖稳定性实验的时间长度(370PDL)比之更长,因此预期在整个克隆发育和生产期间ITL-LF2细胞将维持稳定。发现ITL-LF2细胞系的大多数特征与CHO-S细胞相似,这可从本说明书的表8得出结论。这些细胞的生长速率、可达到的最高细胞浓度、细胞蛋白的唾液酸水平和这些细胞所表达的重组抗体的唾液酸水平,以及抗-EGFRmAb的表达水平,都非常相似。此外,在以分批方式测定的细胞活力与活细胞积分浓度(IVCC)上,ITL-LF2细胞均超过CHO-S细胞。这种现象可能是由于细胞经历了细胞膜岩藻糖低含量的多轮分拣的严格选择过程所致。
在存在外源性岩藻糖时对ITL-LF2细胞进行了稳定的高效率转染。然而,尽管在缺乏外源性岩藻糖时转染细胞难以恢复(资料未提供),但是ITL-LF2细胞转染后的恢复快于CHO-S细胞。这种发现暗示,在转染和选择步骤后的恢复上岩藻糖具有重要作用。在CHO-S细胞中用抗-EGFRmAb瞬时转染也获得成功,产率约65-75%。
以下表9提供了ITL-LF2细胞的特征小结。
表9
特征 | 结果 |
缺乏外源性岩藻糖时的岩藻糖水平 | 零 |
存在外源性岩藻糖时的岩藻糖水平 | 可调整 |
转染成功率 | 与CHO-S细胞相似 |
零岩藻糖表型的稳定性 | 至少370PDL |
生长速率(PDT) | 15-20小时,与CHO-S细胞相似 |
可达到的最高细胞浓度 | 8.4x10<sup>6</sup>,与CHO-S细胞相似 |
唾液酸化水平 | 与CHO-S细胞相似 |
瞬时表达 | 为CHO-S细胞表达的约50% |
基因修饰 | GMD的mRNA模式修饰 |
稳定表达 | 与CHO-S细胞相似 |
分批方法的细胞活力 | 较长时间培养活力比CHO-S细胞高 |
分批方法的IVCC | 在细胞池阶段IVCC比CHO-S细胞高 |
除了发现ITL-LF2细胞的岩藻糖水平为零而且稳定外,还发现细胞(图18和45)和重组蛋白(图46-47和49)的岩藻糖基化水平以剂量依赖方式取决于外源性岩藻糖的添加。而且,外加一定浓度的岩藻糖,不同样品中所产生的重组抗体的岩藻糖基化水平是可复制的(图49和表8)。岩藻糖基化通路(图20)显示从头合成和拯救通路两种分枝途径均可导致GDP-岩藻糖的产生。因为按照零岩藻糖表型选择ITL-LF2细胞,所以揭示该特征的基因来源将会是有趣的。外源性岩藻糖的添加导致细胞膜蛋白质岩藻糖基化水平的重新获得(图18)。此发现暗示拯救途径活跃(图20)。从头合成和拯救途径的几种关键酶的RT-PCR和测序分析显示,ITL-LF2和CHO-S细胞中的岩藻糖基转移酶8(Fut8)mRNA的大小(图21)和序列(资料未提供)相同。此发现可用于分化Ktowa Hakko Kogyo有限公司的ITL-LF2细胞,该公司通过序列同源重组破坏了中国仓鼠卵巢CHO DG44细胞系中的两个Fut8等位基因。
与Fut8相似,在ITL-LF2细胞中参与从头合成途径的GDP-酮基-6脱氧甘露糖3,5-差向异构酶,4-还原酶(FX)的mRNA大小和序列(图21)不变。另一方面,在ITL-LF2细胞中GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)的mRNA大小比CHO-S细胞中的短(图20),序列揭示有两种剪接变体。提取缺乏第3和第4外显子或缺乏第8和第9外显子的mRNA分子(图21A-B和图22A-B)。凝胶电泳不能测出这些缺失之间的差异,因为缺失序列的大小相似(图21和图23B)。然而,凝胶电泳只能测出短GMD(不是全长)(图21)。与诱变原一起培育亚群细胞只表达不同的剪接变体而非全长mRNA的机制尚不清楚,但很可能是原先的CHO-S细胞群中不存在这种改变,因为没用MTX选择低岩藻糖细胞。考虑到要做表型选择,这些结果非常有趣。
QRCR分析显示,岩藻糖通路所涉及的所有受试基因表达mRNA的水平相似(图24)。结果提示,ITL-LF2细胞中所获得的零岩藻糖水平源自于不同剪接变体表达的GMD蛋白失活,或GMD蛋白低水平或完全缺失。
另一研究小组采用不同的表型选择方法产生了凝集素抗性CHO细胞突变株(Lec13)(Ripka和Stanley,1986)。在该法中,细胞与毒碗豆岩藻糖特异性凝集素一起培育,发现其抗性细胞表达的人IgG1缺乏附着于Asn(297)-连接糖链中的岩藻糖(Shields,Lai等,2002)。进一步研究揭示,经相当短的时间后这些细胞的岩藻糖水平升高,表明其低岩藻糖表型不稳定,从头合成途径合成了某些活性GDP-岩藻糖蛋白(Kanda,Yamane-Ohnuki等,2006)。在近年另一篇论文中,Kanda及其同事(Kanda,Imai-Nishiya等,2007)用RT-PCR分析证明,Lec13细胞表达的mRNA大小与CHO DG44细胞表达的mRNA的大小相同。如上所述,ITL-LF2细胞呈现稳定的零岩藻糖表型可能是由于完全缺失活性形式的GMD(图21)。通过RT-PCR和DNA印迹法测序对另一种凝集素(兵豆凝集素-LCA)抗性细胞系CHO-SM作基因型分析(Kanda,Imai-Nishiya等,2007),揭示该细胞系表达的突变GMDmRNA缺乏外显子5、6和7编码的重要活性结构域(Somoza,Menon等,2000;Webb,Mulichak等,2004)。如在ITL-LF2细胞中证明的那样,外显子3和4以及外显子8和9对于GMD的活性也很重要。因此,结论是ITL-LF2细胞的GMD模式既不同于Lec13也不同于CHO-SM细胞。
通过连续四轮FACS分拣,每轮分拣选择含最低岩藻糖(或缺乏岩藻糖)的细胞部分,产生了ITL-LF2细胞(表4)。第一轮分拣甚至难以产生低岩藻糖表型细胞。第二轮分拣后大多数细胞表达低水平的细胞膜岩藻糖。再一(第三)轮分拣结束时只提供零岩藻糖水平的同源细胞群。进行第四个轮分拣以确保只提供零岩藻糖表达的细胞(图12)。
ITL-LF2细胞系保存在巴黎,巴斯德研究所的国家培养物和微生物收集中心(Collection Nationale de Cultures de Microoganisms),2011年2月28日,保藏号CNCMI-4449。
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Claims (16)
1.一种分离的CHO细胞,含有表达的突变GDP-甘露糖4,6-脱水酶,即GMD,所述细胞在无外源性岩藻糖条件下的岩藻糖含量为零,经基因修饰而表达氨基酸序列如SEQ ID NO:23和/或24所示的突变GMD,并且,所述细胞表现出高于100群体倍增的稳定岩藻糖表型。
2.如权利要求1所述的分离的CHO细胞,经基因修饰使所表达蛋白质的岩藻糖基化含量呈线性依赖于外部岩藻糖的浓度。
3.如权利要求1所述的分离的CHO细胞,所述分离的CHO细胞的活细胞积分浓度(IVCC)比非突变的CHO细胞高20%。
4.如权利要求1所述的分离的CHO细胞,所述分离的CHO细胞表达野生型岩藻糖基转移酶-8(Fut8)。
5.如权利要求1所述的分离的CHO细胞,所述分离的CHO细胞表达野生型GDP-酮基-6-脱氧甘露糖3,5-差向异构酶,4-还原酶(FX)。
6.如权利要求1所述的分离的CHO细胞,所述分离的CHO细胞具有的群体倍增时间不超过20小时。
7.如权利要求1所述的分离的CHO细胞,所述分离的CHO细胞表达感兴趣的重组抗体或Fc融合蛋白。
8.一种包含权利要求1所述分离的CHO细胞的CHO细胞系。
9.如权利要求8所述的分离的CHO细胞系,所述CHO细胞系以CNCM保藏号I-4449进行了保藏。
10.一种细胞培养物,所述细胞培养物包含权利要求1所述分离的CHO细胞及无动物衍生污染物的细胞培养基。
11.如权利要求10所述的细胞培养物,其中所述细胞培养基含岩藻糖。
12.如权利要求10所述的细胞培养物,其中所述细胞培养基无岩藻糖。
13.一种生产重组蛋白的方法,包括:用包含编码重组蛋白的核酸序列的多核苷酸转染权利要求1所述分离的CHO细胞;在适合于表达重组蛋白的条件下培养转染的CHO细胞;及分离蛋白。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述重组蛋白是抗体或Fc融合蛋白。
15.如权利要求13所述的方法,其中所述转染在外源性岩藻糖存在下进行。
16.如权利要求13所述的方法,进一步包括将所述分离的CHO细胞在所述转染后于含岩藻糖的培养基中进行培养。
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