JP2023548767A - 抗体製造方法における相対不対グリカン - Google Patents

Abstract

本明細書では、抗体組成物を製造する方法であって、抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することと、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／若しくは相対不対高マンノースグリカン含量並びに／又はＡＤＣＣレベルに基づいて、下流処理のために抗体組成物を選択することとを含む方法が提供される。本明細書では、抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定する関連方法及び抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
２０２０年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０９２，２８１号明細書及び２０２１年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１６３，１３１号明細書の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益が本明細書によって主張され、各々の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された材料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下のとおり特定されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０２１年１０月１２日に作成された「Ａ－２６２６－ＷＯ－ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名の３０，２８４バイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル。

グリコシル化は、例えば、タンパク質折り畳み、クオリティー対照、分子輸送及び局在化及び細胞表面受容体相互作用を含む複数の細胞機能に関与するため、最も一般的であるが、依然として顕著な翻訳後修飾の１つである。グリコシル化は、治療用糖タンパク質の生理活性、薬物動態、免疫原性、溶解度及びインビボクリアランスに影響を与えるため、組換えタンパク質薬の治療効果に影響を及ぼす。Ｆｃグリコフォームプロファイルは、特に抗体の臨床効果及び薬物動態に直接影響を及ぼすため、組換え抗体に対する製品品質特性である。

Ｆｃ－ＣＨ２ドメイン中の保存された二分枝型グリカンに関連する特定のグリカン構造は、抗体エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を介在するＦｃドメインとＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用に強く影響し得る（Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ，Ｔｅｊａｄａ ＭＬ．Ｆｃ ｇｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；２５：１３２５－３４を参照されたい）。例えば、コアフコースは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性に対して大きい影響を有し、ＡＤＣＣ活性に実質的な変化をもたらすことが示されている（Ｏｋａｚａｋｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｃｏｓｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｔｈａｌｐｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４；３３６：１２３９－４９、Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１１；１０８：１２６６９－７４を参照されたい）。高マンノースも、コアフコースよりはるかに小さく、且つ予測しにくい程度ではあるが、ＡＤＣＣ活性を調節する役割を果たすことが示されている（Ｔｈｏｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｆｃ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；７３：６９－７５）。コアフコースは、ＦｃドメインがＦｃγＲと相互作用することを立体的に妨げることが報告されているため、多くの研究は、非フコシル化グリカン及び高マンノースグリカンを含む、コアフコースを欠くグリカン基に焦点を当ててきた。

Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ，Ｔｅｊａｄａ ＭＬ．Ｆｃ ｇｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；２５：１３２５－３４ Ｏｋａｚａｋｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｃｏｓｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｔｈａｌｐｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４；３３６：１２３９－４９ Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１１；１０８：１２６６９－７４ Ｔｈｏｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｆｃ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；７３：６９－７５

Ｆｃ－ＦｃγＲＩＩＩａ相互作用に関する既存の知識は、単一のＦｃ鎖に結合するＦｃγＲＩＩＩａに焦点を当てている。しかしながら、ＩｇＧ及びＩｇＧ Ｆｃ領域との融合タンパク質を含むタンパク質治療分子には、典型的には、２つのグリコシル化Ｆｃ鎖が含まれるため、ＦｃγＲＩＩＩａ結合相互作用及びその結果として生じるＡＤＣＣ活性に対するグリカンペアリングの影響は、知られていない。様々な要因がグリカン構造に影響し、従ってタンパク質（糖タンパク質）の最終的なグリコシル化形態（グリコフォーム）に影響する。例えば、抗体を発現する細胞株、細胞培養培地、フィード培地組成及び細胞培養中の供給のタイミングは、タンパク質のグリコフォームの産生に影響し得る。研究グループは、抗体の特定のグリコフォームのレベルに影響を及ぼす多くの方法を示唆しているが、バイオ医薬産業において、その抗体組成物の所与のグリコフォームプロファイルに基づく特定の抗体組成物のエフェクター機能を予測する、簡単であり、効率的であり且つ信頼できる方法が依然として必要とされている。

本明細書では、抗体組成物の不対グリカン含量が抗体組成物についてのＡＤＣＣ活性レベルに関係していることを裏付けるデータが提示される。このデータは、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルが抗体組成物の不対グリカン含量を変化させることによって変更され得ることも裏付けている。特定の理論に拘束されるものではないが、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量は、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルに関係しており、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量を変化させると、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルの変更がもたらされる。

従って、本開示は、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを変更する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の相対不対高マンノースグリカン含量を変更することを含む。例示的な態様では、方法は、相対不対非フコシル化グリカン含量を増加させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを増加させることを含む。例示的な事例では、方法は、相対不対高マンノースグリカン含量を増加させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを増加させることを含む。様々な態様では、方法は、相対不対非フコシル化グリカン含量を低減させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを低減させることを含む。様々な事例では、方法は、相対不対高マンノースグリカン含量を低減させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを低減させることを含む。例示的な態様では、相対不対非フコシル化グリカン含量又は相対不対高マンノースグリカン含量が約１％変更されると、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％変更される。相対不対非フコシル化グリカン含量又は相対不対高マンノースグリカンの１％の増加ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％増加する。相対不対非フコシル化グリカン含量又は相対不対高マンノースグリカンの１％の低減ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％低減する。いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、相対不対非フコシル化グリカン含量の約１０％～約１５％倍と、相対不対高マンノースグリカン含量の約１０％～約１５％倍との合計によって変更される。任意選択的に、ＡＤＣＣ活性のレベルは、相対不対非フコシル化グリカン含量の約１２％～約１３％倍と、相対不対高マンノースグリカン含量の約１２．５％～約１３．５％倍との合計によって変更される。様々な態様では、抗体組成物の抗体は、抗ＴＮＦ抗体、任意選択的にインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ又はセルトリズマブペゴルである。代替的な態様では、相対不対非フコシル化グリカン含量が約１％変更され、及び抗体組成物の抗体が抗ＨＥＲ２抗体、任意選択的にトラスツズマブ又はペルツズマブである場合、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％変更される。相対不対非フコシル化グリカン含量の１％の増加ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％増加する。相対不対非フコシル化グリカン含量の１％の低減ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％低減する。様々な事例では、ＡＤＣＣのレベルは、相対不対高マンノースグリカン含量が変化しても変更されない。

本開示は、抗体組成物を製造する方法も提供する。例示的な実施形態では、方法は、（ｉ）抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉ）（ｉ）で決定された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、下流処理のために抗体組成物を選択することとを含む。様々な態様では、試料は、細胞、例えば抗体組成物の抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を含む細胞培養物から採取される。任意選択的に、方法は、細胞培養物の１つ以上の条件を変更して、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を変更することと、変更された細胞培養物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することとを更に含む。例示的な態様では、方法は、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量が標的範囲内になるまで変更を繰り返すことを含む。例示的な態様では、標的範囲は、参照抗体並びに抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを抗体組成物の非フコシル化グリカン含量及び／又は高マンノースグリカン含量と相関させるモデル、任意選択的に抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量と相関させるモデルについてのＡＤＣＣ活性レベルの標的範囲に基づく。例示的な事例では、参照抗体は、インフリキシマブである。例示的な態様では、参照抗体は、トラスツズマブである。抗体がインフリキシマブなどの抗ＴＮＦ抗体である場合、任意選択的に、相対不対非フコシル化グリカン含量の標的範囲は、約８０％～約９０％であり、及び／又は相対不対高マンノースグリカンの標的範囲は、約７５％～約８５％である。抗体がトラスツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体である場合、任意選択的に、相対不対非フコシル化グリカン含量の標的範囲は、約９５％～約９９％であり、及び／又は相対不対高マンノースグリカンの標的範囲は、約２５％未満～約３５％である。様々な態様では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量は、抗体組成物の製造に関してリアルタイムで決定される。様々な事例では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量が標的範囲にある場合、方法は、下流処理のために抗体組成物を選択することを含む。様々な態様では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量は、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルと相関している。任意選択的に、方法は、（ｉ）で決定された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを決定することを更に含む。任意選択的に、ＡＤＣＣ活性レベルが標的範囲にある場合、方法は、下流処理のために抗体組成物を選択することを含む。いくつかの実施形態では、下流処理のために抗体組成物を選択することは、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量の特定のレベルを有する抗体組成物を産生するクローンを選択することを含む。

例示的な実施形態では、抗体組成物を製造する方法は、（ｉ）抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の相対不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉ）（ｉ）で決定された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを決定することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）で決定された抗体組成物のＡＤＣＣレベルが標的ＡＤＣＣ範囲内にある場合、下流処理のために抗体組成物を選択することとを含む。

例示的な実施形態では、抗体組成物を製造する方法は、（ｉ）抗体組成物の抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を含む細胞培養物から採取される抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉ）任意選択的に、細胞培養物を変更して、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を調節し、且つ変更された細胞培養物から採取される抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉｉ）相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、下流処理のために抗体組成物を選択することとを含む。

抗体組成物を製造する本明細書で開示される方法の様々な態様では、方法は、本開示の方法に従って抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更することを含む。様々な事例では、方法は、ヒンジ領域のジスルフィド結合のＮ末端側の部位で抗体重鎖を切断して抗体断片を形成する酵素で抗体組成物を処理することと、（ｉｉ）クロマトグラフィーによって抗体断片を分離することと、（ｉｉｉ）抗体断片を定量化することとによって抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定することを含む。任意選択的に、部位は、ＩｇＧ１抗体重鎖の配列ＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）のＴｈｒとＨｉｓとの間又はＬｙｓとＴｈｒとの間にある。様々な態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を含む。様々な事例では、抗体断片は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を通して分離される。いくつかの態様では、各抗体断片を定量化することは、質量分析を含む。任意選択的に、グリコシル化Ｆｃ断片は、様々なグリカン部分の１つに結合されたＦｃ断片を含み、及び方法は、結合されたグリカン部分に従ってグリコシル化Ｆｃ断片を分離及び定量化することを含む。例示的な態様では、方法は、選択された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を有する抗体組成物を産生するクローンを選択することを含む、下流処理のために抗体組成物を選択することを含む。

本開示は、抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定する方法であって、（ｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合のＮ末端側の部位で抗体重鎖を切断して抗体断片を形成する酵素で抗体組成物を処理することと、（ｉｉ）クロマトグラフィーによって抗体断片を分離することと、（ｉｉｉ）各抗体断片を定量化することとを含む方法を更に提供する。様々な態様では、酵素は、システインプロテアーゼである。様々な事例では、酵素は、ＩｇｄＥプロテアーゼファミリーのメンバー、任意選択的にストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）によって発現されるＩｇｄＥである。様々な事例では、酵素は、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）によって発現されるＩｇｄＥプロテアーゼと構造的に同一であるか又は非常に類似している。様々な態様では、酵素は、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）嫌気性菌によって発現される酵素と構造的に同一であるか又は非常に類似している。様々な事例では、酵素は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）によって発現される酵素と構造的に同一であるか又は非常に類似している。例示的な態様では、酵素は、ジンジパインＫ（これは、「Ｋｇｐ」とも呼ばれ得る）である。様々な事例では、部位は、ＩｇＧ１抗体重鎖の配列ＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）のＴｈｒとＨｉｓとの間又はＬｙｓとＴｈｒとの間にある。様々な態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を含む。例示的な態様では、（ｉｉ）の分離することは、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を含む。例示的な態様では、（ｉｉｉ）の定量化することは、質量分析を含む。様々な事例では、グリコシル化Ｆｃ断片は、様々なグリカン部分の１つに結合されたＦｃ断片を含み、及び方法は、結合されたグリカン部分に従ってグリコシル化Ｆｃ断片を分離及び定量化することを含む。様々な態様では、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン及び／又は相対不対高マンノースグリカンは、定量化される。

例示的なグリカン構造の図解である。 例示的なグリカン群の図解である。 代表的なグリカンマップクロマトグラム（フルスケールビュー；ｙ軸最大約４４０．００ＥＵ）である。 代表的なグリカンマップクロマトグラム（拡大スケールビュー；ｙ軸最大約４４．００ＥＵ）である。 フコース代謝のサルベージ経路及びデノボ経路の図である。サルベージ経路において、遊離Ｌ－フコースは、ＧＤＰ－フコースに変換されるが、デノボ経路では、ＧＤＰ－フコースは、ＧＭＤ及びＦＸにより触媒される３つの反応を介して合成される。次に、ＧＤＰ－フコースは、ＧＤＰ－Ｆｕｃトランスフェラーゼによって細胞質基質からゴルジ内腔に輸送され、受容体オリゴ糖及びタンパク質に移される。他の反応産物であるＧＤＰは、内腔のヌクレオチドジホスファターゼによってグアノシン５－一リン酸（ＧＭＰ）及び無機リン酸（Ｐｉ）に変換される。前者は、（ＧＤＰ－フコースの輸送と共役される対向輸送系を介して）細胞質基質に排出されるが、後者は、ゴルジアニオンチャネルであるＧＯＬＡＣを介してゴルジ内腔を離れると想定される。例えば、Ｎｏｒｄｅｅｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００１を参照されたい。 不対又は対になったグリカンを有する例示的な抗体の図面である。図４Ａは、不対非フコシル化グリカンＡ２Ｇ１の図面である。図４Ｂは、対になったＡ２Ｇ１グリカンの図面である。図４Ｃは、不対高マンノース５（ＨＭ５）グリカンの図面である。図４Ｄは、対になったＨＭ５グリカンの図面である。 不対又は対になったグリカンを有する例示的な抗体の図面である。図４Ａは、不対非フコシル化グリカンＡ２Ｇ１の図面である。図４Ｂは、対になったＡ２Ｇ１グリカンの図面である。図４Ｃは、不対高マンノース５（ＨＭ５）グリカンの図面である。図４Ｄは、対になったＨＭ５グリカンの図面である。 不対又は対になったグリカンを有する例示的な抗体の図面である。図４Ａは、不対非フコシル化グリカンＡ２Ｇ１の図面である。図４Ｂは、対になったＡ２Ｇ１グリカンの図面である。図４Ｃは、不対高マンノース５（ＨＭ５）グリカンの図面である。図４Ｄは、対になったＨＭ５グリカンの図面である。 不対又は対になったグリカンを有する例示的な抗体の図面である。図４Ａは、不対非フコシル化グリカンＡ２Ｇ１の図面である。図４Ｂは、対になったＡ２Ｇ１グリカンの図面である。図４Ｃは、不対高マンノース５（ＨＭ５）グリカンの図面である。図４Ｄは、対になったＨＭ５グリカンの図面である。 ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡによる３７℃で一晩の処理前後の抗体の図解である。ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡで消化された材料に対してＭＳ検出を伴うクロマトグラフィー分離を実行して、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を分離した。 抗体Ａのペリンググリカンマップクロマトグラムである。 抗体Ｂのペリンググリカンマップクロマトグラムである。 抗体Ａ及び抗体Ｂについての不対非フコシル化グリカンの相対存在量（％）及び不対高マンノースグリカンの相対存在量（％）のグラフである。不対非フコシル化グリカンの相対存在量（％）は、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージを、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージ及び対になった非フコシル化グリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けることによって計算した。不対高マンノースグリカンの相対存在量は、不対高マンノースグリカンのパーセンテージを、不対高マンノースグリカンのパーセンテージ及び対になった高マンノースグリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けることによって計算した。 細胞系ＡＤＣＣアッセイの概略図である。 抗体ＡについてのＮＫ９２ＡＤＣＣアッセイの代表的な用量反応曲線である。各用量点は、３回の反復の平均値±標準偏差である。アッセイシグナル＝蛍光。 細胞系ＡＤＣＣアッセイによって測定された抗体Ａの相対ＡＤＣＣ活性レベル（％）のレバレッジプロットであり、測定された抗体Ａの非フコシル化グリカン含量（％）の関数としてプロットされている。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＜０．０００１。 細胞系ＡＤＣＣアッセイによって測定された抗体Ａの相対ＡＤＣＣ活性レベル（％）のレバレッジプロットであり、測定された抗体Ａの高マンノースグリカン含量（％）の関数としてプロットされている。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＝０．０００９。 式１を使用して計算された抗体Ａの予測ＡＤＣＣ活性レベル（％）に対してプロットされた、細胞系ＡＤＣＣアッセイによって測定された抗体Ａの実際のＡＤＣＣ活性レベル（％）のグラフである。 細胞系ＡＤＣＣアッセイによって測定された抗体Ｂの相対ＡＤＣＣ活性レベル（％）のレバレッジプロットであり、測定された抗体Ｂの非フコシル化グリカン含量（％）の関数としてプロットされている。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＜０．０００１。 細胞系ＡＤＣＣアッセイによって測定された抗体Ｂの相対ＡＤＣＣ活性レベル（％）のレバレッジプロットであり、測定された抗体Ｂの高マンノースグリカン含量（％）の関数としてプロットされている。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＝０．３２６３。 式２を使用して計算された抗体Ｂの予測ＡＤＣＣ活性レベル（％）に対してプロットされた、細胞系ＡＤＣＣアッセイによって測定された抗体Ｂの実際のＡＤＣＣ活性レベル（％）のグラフである。 抗体Ｂについての測定されたＦｃγＲＩＩＩａ結合の関数としてプロットされた、測定されたＡＤＣＣ活性レベル（％）のグラフである。 抗体Ｂのインタクトな質量分析からのデコンボリューションされた質量スペクトルであり、指定のグリカンペアのピークが示されている。 ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによる３７℃で６０分の処理前後の抗体の図解である。ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮで消化された材料に対してＭＳ検出を伴うクロマトグラフィー分離を実行して、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を分離した。 図１３に記載の分離及び検出からの例示的な結果を示すグラフである。 標識されたグリカンペアを有するＦｃ断片のピークの拡大図である。 個々のＦｃグリカンペア種の溶出を示す抽出イオンクロマトグラムの例である。 個々のＦｃグリカンペア種の溶出を示す抽出イオンクロマトグラムの例である。 抗体Ｃの測定された非フコシル化グリカン含量の総存在量（％）の関数としてプロットされた、測定された抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）のレバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＝０．１８３８。 抗体Ｃの測定された高マンノースグリカン含量の総存在量（％）の関数としてプロットされた、測定された抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）のレバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＝０．１０８６。 式３を使用して非フコシル化グリカン含量の総存在量及び高マンノースグリカン含量の総存在量に基づいて計算された予測された抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）に対してプロットされた実際の（測定された）抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）のグラフである。ＲＭＳＥ＝１６．７９７；ｒ^２＝０．４５；ｐ＝０．０６７９。 抗体Ｃの不対非フコシル化グリカンの相対存在量（％）の関数としてプロットされた、測定された抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）のレバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＝０．００２２。 抗体Ｃの不対高マンノースグリカンの相対存在量（％）の関数としてプロットされた、測定された抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）のレバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ｐ＝０．００９９。 式４を使用して不対非フコシル化及び不対高マンノースグリカンに基づいて計算された予測された抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）に対してプロットされた実際の（測定された）抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合（％）のグラフである。ＲＭＳＥ＝１３．０７１；ｒ^２＝０．６７；ｐ＝０．００７１。

本明細書では、抗体などのタンパク質の相対不対グリカン含量を決定する方法及び抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法が記載される。本明細書で記載されるデータは、抗体組成物の相対不対グリカン含量が抗体組成物についてのＡＤＣＣ活性レベルと相関性があることと、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルが抗体組成物の相対不対グリカン含量を変更することによって変更され得ることを示唆している。更に、相対不対グリカン含量の変化率は、対になったグリカンの相対含量の同じ変化率よりもＡＤＣＣ活性レベルにより大きい影響を与えるため、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノース含量がより大きいと、対になったグリカンの相対含量よりもＡＤＣＣ活性レベルに大きい影響を及ぼすと考えられる。従って、本明細書では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法が提供される。方法は、選択されたＡＤＣＣレベルを達成するために、選択された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は選択された相対不対高マンノースグリカン含量を有する抗体組成物を製造することを含み得る。例えば、本明細書に記載される方法に従い、選択された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は選択された相対不対高マンノースグリカン含量を有する抗体組成物を産生するクローンを選ぶか又は選択することができる。抗体組成物は、クローンから産生することができる。

グリコシル化、グリカン及びグリカン測定方法
多くの分泌タンパク質は、翻訳後グリコシル化され、このプロセスで、糖部分（例えば、グリカン、糖類）がタンパク質の特定のアミノ酸に共有結合される。真核細胞では、以下の２種類のグリコシル化反応が起こる：（１）グリカンが認識配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（ここで、「Ｘ」は、プロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギンに連結されるＮ結合型グリコシル化、及び（２）グリカンがセリン又はスレオニンに連結されるＯ結合型グリコシル化。グリコシル化のタイプ（Ｎ結合型又はＯ結合型）にかかわらず、各部位（Ｏ又はＮ）と結合されるグリカン構造は広範囲にわたるため、タンパク質グリコフォームには微小不均一性がある。

全てのＮ－グリカンは、共通のコア糖配列：Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ａｓｎ）を有し、以下の３つのタイプの１つに分類される：（Ａ）２個のＮ－アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分及び少なくとも５個（例えば、５、６、７、８又は９個）のマンノース（Ｍａｎ）残基からなる高マンノース（ＨＭ）若しくはオリゴマンノース（ＯＭ）型、（Ｂ）３個以上のＧｌｃＮＡｃ部分及び任意の数の他の糖タイプを含む複合型、又は（Ｃ）分枝の一方にＭａｎ残基を、複合枝の基部にＧｌｃＮＡｃを含むハイブリッド型。図１Ａ（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ８：Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２^ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９から適応された）は、Ｎ－グリカンの３つのタイプを示す。

ＩｇＧ分子中で見出されるＮ結合型グリカンは、典型的には、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－グルコース（ＧＬｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＣｌｃＮＡｃ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）の１つ以上の単糖を含む。例示的なグリカン、その正体及び群分類を図１Ｂに示す。

Ｎ結合型グリコシル化は小胞体（ＥＲ）において開始され、複雑な一連の反応の結果、基本的に２個のＧｌｃＮＡｃ残基及び３個のＭａｎ残基から作られるコアグリカン構造の連結が起こる。ＥＲにおいて形成されたグリカン複合体は、ゴルジ装置において酵素の作用により修飾される。糖類が酵素に比較的接近しにくい場合、これは、一般的には元来のＨＭ形態にとどまる。酵素が糖類に接近し得る場合、Ｍａｎ残基の多くが切り離され、糖類が更に修飾され、その結果、複合型のＮ－グリカン構造が生じる。例えば、ｃｉｓ－ゴルジに位置するマンノシダーゼ－１は、ＨＭグリカンを切断又は加水分解し得、一方でメディアル－ゴルジに位置するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ－８はグリカンをフコシル化する（Ｈａｎｒｕｅ Ｉｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ（２００７），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：８４）。

従って、グリカン構造の糖組成及び構造立体配置は、とりわけ、ＥＲ及びゴルジ装置におけるグリコシル化機序、その機序の酵素のグリカン構造への到達性、各酵素の作用の順序及びタンパク質がグリコシル化機序から放出される段階に依存して変動する。

糖タンパク質含有組成物中に存在するグリカンを評価するか、又は糖タンパク質を含む特定の試料のグリコフォームプロファイル（例えば、グリコプロファイル）を決定、検出若しくは測定するために様々な方法を使用し得る。好適な方法としては、陽イオンＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析、陰イオンＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー（ＮＰ－ＨＰＬＣ）、エキソグリコシダーゼ消化、Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－４クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び一次元ｎ．ｍ．ｒ．分光法並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｍａｔｔｕ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７３：２２６０－２２７２（１９９８）；Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９９（Ｐｔ １）：２６１－２７５（１９９４）；Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２（３）：３２０－３３４（２０１０）Ｗｕｈｒｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００５，Ｖｏｌ．８２５，Ｉｓｓｕｅ ２，１２４－１３３頁；Ｒｕｈａａｋ Ｌ．Ｒ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，Ｖｏｌ．３９７：３４５７－３４８１及びＧｅｏｆｆｒｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，Ｖｏｌ．２４０，ｐａｇｅｓ ２１０－２２６を参照されたい。本明細書中に示す実施例１には、糖タンパク質含有組成物、例えば抗体組成物中に存在するグリカンを評価（例えば、決定、同定、定量化）するのに好適な方法も記載する。この方法は、グリカンが対になっているか又は不対であるかを検出するために使用できない場合がある。実施例１の方法は、組成物のグリコシル化タンパク質、例えば抗体組成物の抗体に結合されたグリカンをタンパク質（例えば、抗体）から酵素により切断するアッセイを記載する。グリカンは続いて親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって分離され、いくつかのピークを有するクロマトグラムが作成される。クロマトグラムの各ピークは、異なるグリカンの平均分布（量又は存在量）を示す。異なるグリカンのピークを含む代表的なＨＩＬＩＣクロマトグラムの２つの図を図２Ａ及び２Ｂに提供する。これらの目的のため、ピーク面積％＝ピーク面積／総ピーク面積×１００％である。従って、特定のグリカン（又はグリカンの群）のレベルを％として報告する。例えば、抗体組成物が３０％のＭａｎ６レベルを有すると特徴付けられる場合、組成物の抗体から切断された全てのグリカンの３０％がＭａｎ６であることを意味する。本明細書で更に詳述されるように、タンパク質からグリカンを除去し、その後、グリカンの組成を分析する従来の方法は、タンパク質のグリカン含量の分布を特定することができることに留意されたい。しかしながら、このような方法では、対になったグリカン及び／又は不対グリカンに関する情報は提供されない。

本開示は、抗体組成物の高マンノースグリカン及び非フコシル化グリカンに関する（例えば、図１Ｂを参照されたい）。本明細書で使用される場合、「高マンノースグリカン」又は「ＨＭグリカン」という用語は、それぞれＭａｎ５又はＭ５、Ｍａｎ６又はＭ６、Ｍａｎ７又はＭ７、Ｍａｎ８又はＭ８及びＭａｎ９又はＭ９と略称される、５、６、７、８又は９個のマンノース残基を含むグリカンを包含する。様々な態様では、ＨＭグリカンのレベルは、Ｍａｎ５％、Ｍａｎ６％、Ｍａｎ７％、Ｍａｎ８％及びＭａｎ９％を合計することによって得られる。本明細書で使用される場合、「非フコシル化グリカン」又は「ＡＦグリカン」という用語は、コアフコース、例えばＮ－グリコシル化部位のＡｓｎとのアミド結合において含まれるＧｌｃＮＡｃ残基上のα１，６－結合型フコースを欠くグリカンを指す。非フコシル化グリカンとしては、Ａ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１（ａ及びｂ）、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。高マンノースグリカンは、コアフコースも欠いている（従って非フコシル化グリカンのサブセットに相当する）が、高マンノースグリカンには、特定の特徴があり、別のグリカン基と呼ばれる場合があることに留意されたい。従って、特に明記しない限り、高マンノースは別の特徴を表すものと理解され、非フコシル化グリカンとは別に又は非フコシル化グリカンの追加の特性として分類することができる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５（１２）：１３２５－１３３４（２０１５）を参照されたい。様々な態様では、非フコシル化グリカンのレベルは、Ａ１Ｇ０％、Ａ２Ｇ０％、Ａ２Ｇ１ａ％、Ａ２Ｇ１ｂ％、Ａ２Ｇ２％、Ａ１Ｇ１Ｍ５％、Ａ１Ｇ１ａ％を合計することによって得られる。

例示的な態様では、グリカンのレベル（例えば、量、存在量）（例えば、ＨＭグリカン％、ＡＦグリカン％）は、糖タンパク質含有組成物中に存在するグリカンを評価するか、又は糖タンパク質を含む特定の試料のグリコフォームプロファイル（例えば、グリコプロファイル）を決定、検出又は測定するための、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって決定（例えば、測定）される。例示的な事例では、抗体組成物のグリカンのレベル（例えば、量、存在量）（例えば、ＨＭグリカン％、ＡＦグリカン％）は、クロマトグラフィーに基づく方法、例えばＨＩＬＩＣにより、抗体組成物の試料中のそのようなグリカンのレベル（例えば、量、存在量）を測定することによって決定され、そのグリカンのレベル（例えば、量、存在量）は、本明細書に記載されるように％で表される。例えば、実施例１を参照されたい。例示的な事例では、抗体組成物のグリカンレベルは、組成物の抗体から切断された全てのグリカンの％として表される。様々な態様では、グリカンのレベル（例えば、量、存在量）（例えば、ＨＭグリカン％、ＡＦグリカン％）は、抗体組成物の試料中のそのようなグリカンのレベルを測定することによって決定（例えば、測定）される。例示的な事例では、抗体組成物の試料を採取して、各試料についてのグリカンのレベル（例えば、量、存在量）（例えば、ＨＭグリカン％、ＡＦグリカン％）を決定する（例えば、測定する）。様々な態様では、ＨＭグリカン％及び／又はＡＦグリカン％が決定される。

グリカンペアリング及び抗体組成物の不対グリカンを測定する方法
様々な事例では、糖タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、様々な態様では、各ポリペプチド鎖は、グリコシル化されている。例えば、糖タンパク質は、抗体の２つのＦｃ鎖を含み得、各Ｆｃ鎖は、グリカンに共有結合している。例えば、糖タンパク質は、その各々がグリコシル化Ｆｃ領域を含む２つの重鎖を含む抗体であり得る。様々な態様では、一方のＦｃ鎖に結合されたグリカンは、他のＦｃ鎖に結合されたグリカンと異なるカテゴリーに属する。代替的な事例では、一方のＦｃ鎖に結合されたグリカンは、他のＦｃ鎖に結合されたグリカンと同じであるか又は同じグリカンカテゴリーに属する。一方のＦｃ鎖に結合されたグリカンが、他のＦｃ鎖に結合されたグリカンと同じであるか又は同じグリカンカテゴリーに属する場合、グリカンは、「対になった」と考えられる。様々な事例では、「対になった」グリカンは、各Ｆｃ鎖上のグリカンが、（ａ）同一のグリカン（例えば、各Ｆｃ鎖に結合した構造的に同一のグリカン）又は（ｂ）同じグリカンカテゴリーに分類される同一でないグリカン（例えば、各Ｆｃ鎖に結合した構造的に同一でないグリカンであって、グリカンが同じグリカンカテゴリーに分類されるもの、例えば２つの非フコシル化グリカン又は別の例として２つのフコシル化グリカン）であることを指す。Ｆｃ鎖に結合されたグリカンが、異なるグリカンカテゴリーに分類される場合、グリカンは、「不対」と考えられる（例えば、非フコシル化グリカン及びフコシル化グリカン）。様々な態様では、「不対」は、Ｆｃ鎖に結合した糖鎖が対になっていないことを意味する。

「グリカンカテゴリー」は、本明細書で使用する場合、それぞれ「フコシル化」及び「非フコシル化」と呼ばれ得るコアフコースの有無によって決定される。一方のＦｃ鎖に結合されたグリカンが非フコシル化であり（即ちコアフコースを欠き）、且つ他のＦｃ鎖に結合されたグリカンがコアフコースを含む場合、グリカンは、「不対非フコシル化グリカン」と考えられる。不対非フコシル化糖タンパク質の場合、グリカン基はＦｃ鎖間で異なるフコシル化状態を持ち、その１つのＦｃ鎖のみがコアフコースを欠くグリカンに共有結合する（例えば、第１のＦｃ鎖上に非フコシル化グリカンと第２のＦｃ鎖上にフコシル化グリカン）。「不対非フコシル化」状態は、一方のＦｃ鎖のみがコアフコース（Ｆ）を有するペアに割り当てられ得、「対になった非フコシル化」状態は、いずれのＦｃ鎖もコアフコースを有さないペアに割り当てられ得る。不対非フコシル化グリカンとしては、例えば、一方のＦｃ鎖上にＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ又はＡ２Ｇ２及び他のＦｃ鎖上にコアフコースを含むグリカンが挙げられる。「対になった非フコシル化グリカン」は、（ａ）各Ｆｃ鎖上に同一の非フコシル化グリカン（例えば、同一の構造の非フコシル化グリカン）、又は（ｂ）各Ｆｃ鎖上に同一でない非フコシル化グリカン（例えば、異なる構造を有する非フコシル化グリカン）を有することを指す。対になった非フコシル化グリカンとしては、例えば、各Ｆｃ鎖上にＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ又はＡ２Ｇ２のいずれかが挙げられる。対になった非フコシル化グリカンとしては、例えば、（ｉ）一方のＦｃ鎖上にＡ１Ｇ０及び他方のＦｃ鎖上にＡ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ若しくはＡ２Ｇ２、又は（ｉｉ）一方の鎖上にＡ２Ｇ０及び他方のＦｃ鎖上にＡ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ若しくはＡ２Ｇ２、又は（ｉｉｉ）一方のＦｃ鎖上にＡ２Ｇ１ａ及び他方のＦｃ鎖上にＡ２Ｇ１ｂ若しくはＡ２Ｇ２、又は（ｉｖ）一方のＦｃ鎖上にＡ２Ｇ１ｂ及び他方のＦｃ鎖上にＡ２Ｇ２が挙げられる。対になった非フコシル化グリカンとしては、例えば、各々がコアフコースを欠く、各Ｆｃ鎖上の同一の非高マンノースグリカン（例えば、各Ｆｃ鎖上のＭａｎ３）又は一方のＦｃ鎖上にコアマンノースを欠く非高マンノースグリカン及び他のＦｃ鎖上に非高マンノースを欠く別の非フコシル化グリカン（例えば、Ａ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ又はＡ２Ｇ２）も挙げられる。「対になったフコシル化」状態は、各Ｆｃ鎖がコアフコースを有するペアに割り当てられ得る。

例示的な事例では、グリカン（例えば、対になった非フコシル化グリカン、不対非フコシル化グリカン）は、高マンノースの有無により更に特徴付けられる。例えば、「対になった非フコシル化グリカン」の一方又は両方のグリカンが高マンノースを含む場合、グリカンは、「対になった高マンノースグリカン」と特徴付けられる。例えば、「不対非フコシル化グリカン」の一方又は両方のグリカンが高マンノースを含む場合、グリカンは、「不対高マンノースグリカン」としても特徴付けられる。例示的な対になった高マンノースグリカンは、（ａ）各Ｆｃ鎖上に同一の高マンノースグリカン（例えば、同一の構造の高マンノース）、例えば各鎖上にＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８若しくはＭａｎ９など、又は（ｂ）同一でない高マンノースグリカン（例えば、異なる構造を有する高マンノースグリカン）であるが、各高マンノースグリカンが、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８若しくはＭａｎ９（例えば、一方のＦｃ鎖上にＭａｎ５且つ他のＦｃ鎖上にＭａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８若しくはＭａｎ９又は一方のＦｃ鎖上にＭａｎ６且つ他のＦｃ鎖上にＭａｎ７、Ｍａｎ８若しくはＭａｎ９又は一方のＦｃ鎖上にＭａｎ７且つ他のＦｃ鎖上にＭａｎ８若しくはＭａｎ９又は一方のＦｃ鎖上にＭａｎ８且つ他のＦｃ鎖上にＭａｎ９）を含む同一でない高マンノースグリカンを有するグリカンを含む。例示的な不対高マンノースグリカンは、一方の鎖上にＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８又はＭａｎ９を有するグリカン及び他方の鎖上にフコシル化グリカンを含む。

「対になった」及び「不対」グリカンの例は、表３及び４で提供される。「対になった」及び「不対」グリカンの更なる例は、図４Ａ～４Ｄに示されており、ここで、図４Ａは、不対非フコシル化グリカンを有する抗体を示し、図４Ｃは、不対高マンノースグリカン（グリカンが不対であり、グリカンの１つが高マンノースであるため）を有する抗体を示し、図４Ｂは、対になった非フコシル化グリカンを有する抗体を示し、図４Ｄは、対になった高マンノースグリカンを有する抗体を示す。

糖タンパク質を含む組成物、例えば抗体組成物は、その対になったグリカン含量及びその不対グリカン含量に関して特徴付けられ得る。例えば、抗体組成物は、その対になった非フコシル化グリカン含量及び不対非フコシル化グリカン含量並びに／又はその対になった高マンノース含量及び不対高マンノース含量に関して特徴付けられ得る。

本明細書で記載されるグリカンの存在量は、相対又は絶対存在量と呼ばれ得る。例示的な事例では、グリカンの絶対含量は、グリカン自体のレベルを測定する単位、例えば質量、モル、体積単位当たりの質量若しくはモル単位、任意の単位又は曲線下面積（例えば、クロマトグラフから決定され得る）に関して表現され得る。例示的な事例では、糖タンパク質又はこれを含む組成物は、不対グリカンのその相対存在量に関して特徴付けられ、不対グリカンの量は、糖タンパク質又はその組成物の対になったグリカン及び不対グリカンの合計に関する量として表されることを意味する。例示的な態様では、糖タンパク質又はこれを含む組成物は、不対非フコシル化グリカンのその相対存在量に関して特徴付けられ得る。例示的な態様では、糖タンパク質又はこれを含む組成物は、不対高マンノースグリカンのその相対存在量に関して特徴付けられ得る。「相対不対非フコシル化グリカン含量」及び「不対非フコシル化グリカン相対％」と同義である用語「不対非フコシル化グリカンの相対存在量」は、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージを、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージ及び対になった非フコシル化グリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けることによって計算される。「相対不対高マンノースグリカン含量」及び「不対高マンノースグリカン相対％」と同義である用語「不対高マンノースグリカンの相対存在量」は、不対高マンノースグリカンのパーセンテージを、不対高マンノースグリカンのパーセンテージ及び対になった高マンノースグリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けたものとして計算される。

「対になった非フコシル化グリカンの相対含量」及び「対になった非フコシル化グリカンの相対％」と同義である用語「対になった非フコシル化グリカンの相対存在量」は、対になった非フコシル化グリカンのパーセンテージを、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージ及び対になった非フコシル化グリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けることによって計算される。「対になった高マンノースグリカンの相対含量」及び「対になった高マンノースグリカンの相対％」と同義である用語「対になった高マンノースグリカンの相対存在量」は、対になった非フコシル化グリカンのパーセンテージを、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージ及び対になった非フコシル化グリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けることによって計算される。本開示の様々な態様では、グリカンカテゴリーの不対グリカン相対％とグリカンカテゴリーの対になったグリカン相対％の合計は、１００％に等しくなる。本開示の様々な態様では、不対非フコシル化グリカン相対％及び対になった非フコシル化グリカン相対％の合計は、１００％に等しくなる。従って、様々な態様では、対になった非フコシル化グリカン相対％が既知である場合、不対非フコシル化グリカン相対％は、対になった非フコシル化グリカン相対％を１００％から減算することによって決定（例えば、計算）することができる。様々な事例では、不対非フコシル化グリカン相対％が既知である場合、不対非フコシル化グリカン相対％は、不対非フコシル化グリカン相対％を１００％から減算することによって決定（例えば、計算）することもできる。本開示の様々な態様では、不対高マンノースグリカン相対％及び対になった高マンノースグリカン相対％の合計は、１００％に等しくなる。従って、様々な態様では、対になった高マンノースグリカン相対％が既知である場合、不対高マンノースグリカン相対％は、対になった高マンノースグリカン相対％を１００％から減算することによって決定（例えば、計算）することができる。様々な事例では、不対高マンノースグリカン相対％が既知である場合、対になった高マンノースグリカン相対％は、不対高マンノースグリカン相対％を１００％から減算することによって決定（例えば、計算）することもできる。

本開示は、抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（ｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合のＮ末端側の部位で抗体重鎖を切断して抗体断片を形成する酵素で抗体組成物を処理することと、（ｉｉ）クロマトグラフィーによって抗体断片を分離することと、（ｉｉｉ）各抗体断片を定量化することとを含む。様々な態様では、酵素は、システインプロテアーゼである。様々な事例では、酵素は、ＩｇｄＥプロテアーゼファミリーのメンバー、任意選択的にストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）によって発現されるＩｇｄＥである。様々な事例では、酵素は、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）によって発現されるＩｇｄＥプロテアーゼと構造的に同一であるか又は非常に類似している。様々な態様では、酵素は、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）嫌気性菌によって発現される酵素と構造的に同一であるか又は非常に類似している。様々な事例では、酵素は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）によって発現される酵素と構造的に同一であるか又は非常に類似している。様々な事例では、部位は、ＩｇＧ１抗体重鎖の配列ＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）のＴｈｒとＨｉｓとの間又はＬｙｓとＴｈｒとの間にある。様々な態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を含む。例示的な態様では、方法は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）により、抗体断片を分離することを含む。例示的な態様では、方法は、質量分析によって各抗体断片を定量化することを含む。様々な事例では、グリコシル化Ｆｃ断片は、様々なグリカン部分の１つに結合されたＦｃ断片を含み、及び方法は、結合されたグリカン部分に従ってグリコシル化Ｆｃ断片を分離及び定量化することを含む。様々な態様では、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン及び／又は不対高マンノースグリカンは、定量化される。様々な事例では、抗体組成物の対になった非フコシル化グリカン及び／又は対になった高マンノースグリカンは、定量化される。様々な態様では、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン、不対高マンノースグリカン、対になった非フコシル化グリカン及び対になった高マンノースグリカンは、定量化される。抗体組成物の不対グリカン含量を決定する例示的な方法は、本明細書の実施例２に記載される。実施例５も、抗体組成物の不対グリカン含量を決定する例示的な方法を実証している。

ＡＤＣＣ及びＡＤＣＣ活性レベルを変更する方法
本明細書で提示されたデータは、抗体組成物の相対不対グリカン含量が抗体組成物についてのＡＤＣＣ活性レベルと関係があることと、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルが抗体組成物の相対不対グリカン含量を変更することによって変更され得ることを裏付けている。特定の理論に拘束されるものではないが、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量は、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルに関係しており、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を変更すると、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルの変更がもたらされる。更に、相対不対グリカン含量の変化率は、対になったグリカンの相対含量の同じ変化率よりもＡＤＣＣにより大きい影響を与えるため、相対不対グリカン含量（例えば、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量）は、対になったグリカンの相対含量（例えば、対になった非フコシル化グリカンの相対含量及び／又は対になった高マンノースグリカンの相対含量）よりもＡＤＣＣに対するレバレッジが大きくなると考えられる。従って、本明細書では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法が提供される。例示的な実施形態では、方法は、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の相対不対高マンノースグリカン含量を変更することを含む。

「ＡＤＣＣ」、又は「抗体依存性細胞介在性細胞障害」、又は「抗体依存性細胞傷害」という用語は、免疫系のエフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、好中球、好酸球）が、膜表面抗原に特定の抗体が結合している標的細胞を活発に溶解する機序を指す。ＡＤＣＣは適応免疫反応の一部であり、抗原特異的抗体が（１）その抗原結合領域を介して標的細胞の膜表面抗原に結合し、且つ（２）そのＦｃ領域を介してエフェクター細胞表面のＦｃ受容体に結合したときに生じる。抗体のＦｃ領域のＦｃ受容体への結合は、エフェクター細胞に、（例えば、細胞溶解又は細胞脱顆粒を介して）標的細胞の死をもたらす細胞傷害性因子を放出させる。

Ｆｃ受容体は、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、肥満細胞の表面にある受容体で、抗体のＦｃ領域に結合する。Ｆｃ受容体は、それらが結合する抗体のタイプに基づいて異なるクラスに分類される。例えば、Ｆｃγ受容体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する受容体であり、Ｆｃアルファ受容体は、ＩｇＡ抗体のＦｃ領域に対する受容体であり、Ｆｃイプシロン受容体は、ＩｇＥ抗体のＦｃ領域に対する受容体である。

「ＦｃγＲ」又は「Ｆｃ－ガンマ受容体」という用語は、オプソニン化された細胞又は微生物の食作用の誘導に関与するＩｇＧスーパーファミリーに属するタンパク質である。例えば、Ｆｒｉｄｍａｎ ＷＨ． Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．５（１２）：２６８４－９０（１９９１）を参照されたい。Ｆｃガンマ受容体ファミリーのメンバーには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）が含まれる。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢの配列は、多くの配列データベース、例えばＵｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のアクセッション番号Ｐ１２３１４（ＦＣＧＲ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ１２３１８（ＦＣＧ２Ａ＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ３１９９４（ＦＣＧ２Ｂ＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）及びＰ０８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）の下にそれぞれ見出すことができる。

「ＡＤＣＣ活性」又は「ＡＤＣＣレベル」という用語は、ＡＤＣＣが活性化又は刺激される程度を指す。抗体組成物のＡＤＣＣレベルを測定又は決定する方法（ＡＤＣＣレベルを測定又は決定するための市販のアッセイ及びキットを含む）は、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６：ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ １９７７２（２０１６），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１９７７２）；Ｋａｎｔａｋａｍａｌａｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｎｏｖｅｌ ＥＧＦＰ－ＣＥＭ－ＮＫｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ－ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ”，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１５（Ｉｓｓｕｅｓ １－２）：１－１０；（２００６）；Ｇｏｍｅｚ－Ｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０８（Ｉｓｓｕｅｓ １－２）：５３－６７（２００６）；Ｓｃｈｎｕｅｒｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，ｃｅｌｌ－ｌｉｎｅ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ＡＤＣＣ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３８（Ｉｓｓｕｅｓ １２－１３）：１５１２－１５１７（２０１１）；及びＭａｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ^５１Ｃｒ－ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ＣＤ１０７ａ ａｓｓａｙｓ”，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０６：１－９（２０１４）で記載されているように、当技術分野で周知であり；全ての文献は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。「ＡＤＣＣアッセイ」又は「ＦｃγＲレポーター遺伝子アッセイ」という用語は、抗体のＡＤＣＣ活性の決定に有用なアッセイ、キット又は方法を指す。本明細書に記載の方法における抗体組成物のＡＤＣＣ活性を測定又は決定する例示的な方法には、実施例３に記載のＡＤＣＣアッセイ又はＰｒｏｍｅｇａから市販されているＡＤＣＣレポーターアッセイ（カタログ番号Ｇ７０１０及びＧ７０１８）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＤＣＣ活性は、以下の１つ以上を含むカルセイン放出アッセイを使用して測定又は決定される：エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）発現ＮＫ９２（Ｍ１）細胞及びカルセイン－ＡＭで標識した標的細胞としてＨＣＣ２２１８細胞又はＭＴ－３細胞。例示的なカルセイン放出アッセイの図解を図８Ａとして提供する。カルセイン放出アッセイの例示的な態様では、標準曲線は、様々な濃度の参照抗体を使用して作成される（図８Ｂ）。

例示的な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルは、抗体の抗原を発現し、抗体のＦｃドメインを介してエフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に関与する細胞において、用量依存的に細胞障害を媒介する抗体組成物の抗体の能力を測定する、定量的な細胞系アッセイによって決定される。様々な実施形態では、方法は、標的細胞がエフェクター細胞によって溶解されると放出される検出可能な標識を有する標的細胞の使用を含む。標的細胞から放出される検出可能な標識の量は、抗体組成物のＡＤＣＣ活性の尺度である。いくつかの態様では、標的細胞から放出される検出可能な標識の量は、ベースラインと比較される。ＡＤＣＣレベルは、対照ＡＤＣＣ％に対するＡＤＣＣ％としても報告され得る。様々な態様では、ＡＤＣＣ％は相対ＡＤＣＣ％であり、これは、任意選択的に、対照ＡＤＣＣ％に対して相対的である。様々な態様では、対照ＡＤＣＣ％は、参照抗体のＡＤＣＣ％である。様々な態様では、参照抗体は、本明細書に記載されるＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）又は抗ＴＮＦ抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ又はセルトリズマブペゴル）である。例示的な事例では、対照ＡＤＣＣ％は、約６０％～約１３０％の範囲内である。任意選択的に、ＡＤＣＣ％は、実施例３に記載のアッセイによって決定される。

例示的な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルは、抗体とＦｃ受容体、任意選択的にＦｃγＲＩＩＩａとの間の結合を測定することにより決定される。様々な態様では、抗体Ｆｃ鎖のＦｃ受容体への結合はＡＤＣＣ中に必須の事象であるため、結合活性はＡＤＣＣ活性の代用となる。従って、様々な事例では、ＡＤＣＣは、抗体とＦｃγＲＩＩＩａなどのＦｃ受容体との間の結合を指す（又はそれとして測定される）。様々な事例では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルは試験抗体のＦｃ領域の結合が、参照抗体又は対照抗体とＦｃ受容体との結合の減少を表す蛍光の減少によって検出される、競合結合アッセイを使用して抗体のＦｃ受容体結合を測定することにより決定される。様々な態様では、Ｆｃ受容体の結合活性は、基本的に、実施例４に記載のされるように測定される。

例示的な実施形態では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する（増加させる又は低減させる）方法は、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の相対不対高マンノースグリカン含量を変更する（増加させる又は低減させる）ことを含む。例示的な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する本明細書で開示される方法は、相対不対非フコシル化グリカン含量を増加させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを増加させることを含む。例示的な事例では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法は、相対不対高マンノースグリカン含量を増加させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを増加させることを含む。様々な態様では、本開示の方法によりもたらされるＡＤＣＣ活性レベルの増加は、対照に対して、少なくとも又は約１％～約１０％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加）である。好適な対照は、相対不対グリカン含量の増加がない同じタンパク質又は抗体組成物であり得る。例示的な実施形態では、本開示の方法によりもたらされるＡＤＣＣ活性レベルの増加は、約１０％～約１００％、任意選択的に約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％又は約９５％～約１００％である。増加は、対照と比較したものであり得る。例示的な実施形態では、本開示の方法によりもたらされるＡＤＣＣ活性レベルの増加は、対照に対して１００％を超える、例えば２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又は更に１０００％である。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して少なくとも約１．５倍増加する。好適な対照は、相対不対グリカン含量を変化させない同じタンパク質又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルであり得る。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して、少なくとも約２倍増加する。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して、少なくとも約３倍増加する。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して、少なくとも約４倍又は約５倍増加する。様々な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルの増加は、相対不対グリカン含量の増加に関係している。例えば、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルの増加は、相対不対グリカン含量の約１％の増加当たり少なくとも又は約Ｘ％の増加であり、ここで、Ｘ％は、少なくとも又は約１％～約１０％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加）である。例えば、Ｘ％は、約１０％～約１００％、任意選択的に約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％又は約９５％～約１００％でもあり得る。

様々な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法は、相対不対非フコシル化グリカン含量を低減させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを低減させることを含む。様々な事例では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法は、相対不対高マンノースグリカン含量を低減させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを低減させることを含む。様々な態様では、本開示の方法によりもたらされるＡＤＣＣ活性レベルの低減は、対照と比較して、少なくとも又は約１％～約１０％の低減（例えば、少なくとも又は約１％の低減、少なくとも又は約２％の低減、少なくとも又は約３％低減、少なくとも又は約４％の低減、少なくとも又は約５％の低減、少なくとも又は約６％の低減、少なくとも又は約７％の低減、少なくとも又は約８％の低減、少なくとも又は約９％の低減、少なくとも又は約９．５％の低減、少なくとも又は約９．８％の低減、少なくとも又は約１０％の低減）である。好適な対照は、相対不対グリカン及び全体のグリカン組成物含量の変化がない同じタンパク質又は抗体組成物であり得る。例示的な実施形態では、本開示の方法によりもたらされるＡＤＣＣ活性レベルの低減は、約１０％～約１００％、任意選択的に約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％又は約９５％～約１００％である。低減は、対照と比較したものであり得る。例示的な実施形態では、本開示の方法によりもたらされるＡＤＣＣ活性レベルの低減は、対照に対して１００％を超える、例えば２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又は更に１０００％である。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して、少なくとも約１．５倍低減する。好適な対照は、グリカン含量の変化がない同じタンパク質又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルであり得る。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して、少なくとも約２倍低減する。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して、少なくとも約３倍低減する。例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、対照と比較して、少なくとも約４倍又は約５倍低減する。様々な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルの低減は、相対不対グリカン含量の低減に関係している。例えば、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルの低減は、相対不対グリカン含量の約１％の低減当たり少なくとも又は約Ｘ％の低減であり、ここで、Ｘ％は、少なくとも又は約１％～約１０％の低減（例えば、少なくとも又は約１％の低減、少なくとも又は約２％の低減、少なくとも又は約３％の低減、少なくとも又は約４％の低減、少なくとも又は約５％の低減、少なくとも又は約６％の低減、少なくとも又は約７％の低減、少なくとも又は約８％の低減、少なくとも又は約９％の低減、少なくとも又は約９．５％の低減、少なくとも又は約９．８％の低減、少なくとも又は約１０％の低減）である。例えば、Ｘ％は、約１０％～約１００％、任意選択的に約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％又は約９５％～約１００％でもあり得る。

例示的な態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量の１％の変化当たり約１０％～約３０％変更される。相対不対非フコシル化グリカン含量又は相対不対高マンノースグリカンの１％の増加ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％増加する。相対不対非フコシル化グリカン含量又は相対不対高マンノースグリカンの１％の低減ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約１５％低減する。いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、相対不対非フコシル化グリカン含量の約１０％～約１５％倍と、相対不対高マンノースグリカン含量の約１０％～約１５％倍との合計によって変更される。任意選択的に、ＡＤＣＣ活性のレベルは、相対不対非フコシル化グリカン含量の約１２％～約１３％倍と、相対不対高マンノースグリカン含量の約１２．５％～約１３．５％倍との合計によって変更される。例示的な事例では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び相対不対高マンノースグリカン含量の各々が約１％変更され、及び抗体組成物の抗体が抗ＴＮＦ抗体、任意選択的にインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ又はセルトリズマブペゴルである場合、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約２５％変更される。例示的な事例では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び相対不対高マンノースグリカン含量の各々が約１％増加され、抗体組成物の抗体が、抗ＴＮＦ抗体、任意選択的にインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ又はセルトリズマブペゴルである場合、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約２０％～約３０％増加される。例示的な事例では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び相対不対高マンノースグリカン含量の各々が約１％低減され、抗体組成物の抗体が、抗ＴＮＦ抗体、任意選択的にインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ又はセルトリズマブペゴルである場合、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約２０％～約３０％低減される。

例示的な態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、相対不対非フコシル化グリカン含量の１％の変化当たり約１０％～約２０％変更される。相対不対非フコシル化グリカン含量の１％の増加ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約２０％増加する。相対不対非フコシル化グリカン含量又は相対不対高マンノースグリカンの１％の低減ごとに、いくつかの態様では、ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１０％～約２０％低減する。様々な事例では、ＡＤＣＣ活性は、相対不対高マンノースグリカン含量の１％の変化当たり変化しない。任意選択的に、ＡＤＣＣ活性のレベルは、相対不対非フコシル化グリカン含量の約１％の変化当たり約１０％～約１９％、約１０％～約１８％、約１０％～約１７％、約１０％～約１６％、約１０％～約１５％、約１１％～約２０％、約１２％～約２０％、約１３％～約２０％、約１２％～約１６％、例えば約１３％、約１４％、約１５％変更される。任意選択的に、抗体組成物の抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、任意選択的にトラスツズマブ又はペルツズマブである。

例示的な態様では、本明細書で開示される方法によってもたらされる変更（増加又は低減）は、「対照」と比較したものである。例示的な態様では、対照は、方法の工程が行われない場合のＡＤＣＣ活性のレベルである。例示的な態様では、対照は、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量が変更（増加又は低減）されない場合のＡＤＣＣ活性のレベルである。例えば、好適な対照は、同じタンパク質又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルであり得るが、相対不対グリカン含量（例えば、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量）の増加は含まれないか、又は好適な対照は、同じタンパク質又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルであり得るが、相対不対グリカン含量（例えば、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量）の低減は含まれない。例示的な事例では、対照は、相対不対グリカン含量の変化を引き起こすために変更された条件を除いて、同じ細胞培養条件下で産生される同じタンパク質又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルであり得る。例示的な態様では、対照は、ＡＤＣＣ活性レベルの標的範囲外のＡＤＣＣ活性レベルをもたらす第１セットの細胞培養条件下で産生される同じタンパク質又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルであり得る。様々な態様では、対照は、標的範囲外にある相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量をもたらす第１セットの細胞培養条件下で産生される同じタンパク質又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルであり得る。

不対グリカン含量を変更する方法
例示的な実施形態では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する（増加させる又は低減させる）方法は、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の不対高マンノースグリカン含量を変更する（増加させる又は低減させる）ことを含む。例示的な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する本明細書で開示される方法は、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量を増加させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを増加させることさせることを含む。様々な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを変更する方法は、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量を、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％又はそれを超えて増加させることを含む。様々な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを変更する方法は、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量を、５％超又は１０％超、例えば約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％又は約２０％増加させることを含む。様々な態様では、方法は、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量を、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又はそれを超えて増加させることを含む。

例示的な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する本明細書で開示される方法は、不対非フコシル化グリカン含量を低減させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを低減させることを含む。様々な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを変更する方法は、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量を、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％又はそれを超えて低減させることを含む。様々な態様では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを変更する方法は、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量を、５％超又は１０％超、例えば約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％又は約２０％低減させることを含む。様々な態様では、方法は、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量を、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又はそれを超えて低減させることを含む。

例示的な態様では、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量の増加又は低減は、「対照」と比較したものである。例示的な態様では、対照は、不対グリカン含量の増加又は低減をもたらす条件を除いて、同じ細胞培養条件下で産生される対照タンパク質又は抗体組成物の不対グリカン含量である。例示的な態様では、対照は、ＡＤＣＣ活性レベルの標的範囲外のＡＤＣＣ活性レベルをもたらす第１セットの細胞培養条件下で産生される同じタンパク質又は抗体組成物の不対グリカン含量であり得る。様々な態様では、対照は、標的範囲外にある不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不高マンノースグリカン含量をもたらす第１セットの細胞培養条件下で産生される同じタンパク質又は抗体組成物の不対グリカン含量であり得る。

特定の理論に拘束されるものではないが、非フコシル化グリカン含量及び／又は高マンノース含量の変更（増加又は低減）をもたらす条件は、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量の増加又は低減をもたらし得る。様々な事例では、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量は、国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット、同第２０１３／１１４２４５号パンフレット、同第２０１３／１１４１６７号パンフレット、同第２０１５１２８７９３号パンフレット又は同第２０１６／０８９９１９号パンフレット、同第２０１８／１７００９９号パンフレット、同第２０１９／１９１１５０号パンフレット（その各々が参照により本明細書に組み込まれる）のいずれか１つの教示に従って増加又は低減される。様々な事例では、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量は、特定のレベルの不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノース含量を含む抗体又は抗体タンパク質生成物を産生するクローンを選択することによって増加又は低減される。

抗体組成物を製造する方法
特定の抗体組成物がその抗体組成物の所与のグリコフォームプロファイルに基づいて示すエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）のレベルを予測する簡単且つ効率的な方法が本明細書で記載される。本明細書において、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルが、抗体組成物の相対不対グリカン含量に基づいて予測され得ることを裏付けるデータが提供される。特定の理論に拘束されるものではないが、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量は、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルの予測である。そのような予測されたＡＤＣＣレベルは、抗体が標的範囲内のＡＤＣＣ活性レベルを有する必要がある場合、抗体製造中に有用である。例えば、抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量をモニタリングすることにより、抗体組成物が標的範囲内のＡＤＣＣ活性レベルを示すかどうかを予測することができる。抗体組成物についてのＡＤＣＣ活性レベルの標的範囲が既知である場合、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量の標的範囲が決定され得る。不対非フコシル化グリカン含量及び／若しくは不対高マンノースグリカン又は不対非フコシル化グリカン含量及び／若しくは不対高マンノースグリカン含量に基づいて計算されるＡＤＣＣ活性レベルが標的範囲内にある場合、継続処理、例えば下流処理のための抗体組成物の選択が発生する場合がある。例示的な態様では、標的範囲は、参照抗体並びに抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを抗体組成物の非フコシル化グリカン含量及び／又は高マンノースグリカン含量と相関させるモデル、任意選択的に抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量と相関させるモデルについてのＡＤＣＣ活性レベルの標的範囲に基づく。例示的な事例では、参照抗体は、インフリキシマブである。例示的な態様では、参照抗体は、トラスツズマブである。抗体がインフリキシマブなどの抗ＴＮＦ抗体である場合、任意選択的に、不対非フコシル化グリカン含量の標的範囲は、約８０％～約９０％であり、及び／又は不対高マンノースグリカンの標的範囲は、約７５％～約８５％である。抗体がトラスツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体である場合、任意選択的に、不対非フコシル化グリカン含量の標的範囲は、約９５％～約９９％であり、及び／又は不対高マンノースグリカンの標的範囲は、約２５％未満～約３５％である。

従って、本開示は、抗体組成物を製造する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（ｉ）抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉ）（ｉ）で決定された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、下流処理のために抗体組成物を選択することとを含む。例示的な実施形態では、抗体組成物を製造する方法は、（ｉ）抗体組成物の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉ）（ｉ）で決定された不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量に基づいて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを決定することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）で決定された抗体組成物のＡＤＣＣレベルが標的ＡＤＣＣ範囲内にある場合、下流処理のために抗体組成物を選択することとを含む。例示的な実施形態では、抗体組成物を製造する方法は、（ｉ）抗体組成物の抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を含む細胞培養物から採取される抗体組成物の試料の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉ）任意選択的に、細胞培養物を変更して、不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量を調節し、変更された細胞培養物から採取される抗体組成物の試料の不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量を決定することと、（ｉｉｉ）不対非フコシル化グリカン含量及び／又は不対高マンノースグリカン含量に基づいて、下流処理のために抗体組成物を選択することとを含む。

様々な態様では、試料は、抗体組成物の抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を含む細胞培養物から採取される。任意選択的に、方法は、細胞培養物の１つ以上の条件を変更して、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の相対不対高マンノースグリカン含量を変更することと、変更された細胞培養物から採取される抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することとを更に含む。例示的な態様では、方法は、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量が標的範囲内になるまで変更を繰り返すことを含む。様々な態様では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量は、抗体組成物の製造に関してリアルタイムで決定される。本明細書で使用される場合、「リアルタイム」とは、製造プロセスの進行中に、プロセスを中断することなく行われる決定を指す。治療用タンパク質の製造には、アッセイ及び決定が行われている間、無期限に保留することができない生細胞及び敏感な物質が含まれると理解されるであろう。対象の数値例であれば、「リアルタイム」決定とは、測定が行われてから６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５０分、４０分、３０分、２０分、１０分、５分、１分、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、１秒又は０．１秒以内（製造プロセスが進行中である間）で行われる決定であり得る。様々な事例では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量が標的範囲にある場合、方法は、下流処理のために抗体組成物を選択することを含む。様々な態様では、相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量は、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルと相関している。任意選択的に、方法は、（ｉ）で決定された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルを決定することを更に含む。任意選択的に、ＡＤＣＣ活性レベルが標的範囲にある場合、方法は、下流処理のために抗体組成物を選択することを含む。

様々な態様では、抗体組成物を製造する方法は、本開示のＡＤＣＣレベルを変更する方法に従って抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更すること含む。

様々な事例では、抗体組成物を製造する方法は、抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定する本開示の方法のいずれかに従って抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定することを含む。例えば、決定は、（ｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合のＮ末端側の部位で抗体重鎖を切断して抗体断片を形成する酵素で抗体組成物を処理することと、（ｉｉ）クロマトグラフィーによって抗体断片を分離することと、（ｉｉｉ）各抗体断片を定量化することとを含む。様々な事例では、部位は、ＩｇＧ１抗体重鎖の配列ＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）のＴｈｒとＨｉｓとの間又はＬｙｓとＴｈｒとの間にある。様々な態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を含む。例示的な態様では、（ｉｉ）の分離することは、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を含む。例示的な態様では、（ｉｉｉ）の定量化することは、質量分析を含む。様々な態様では、決定は、本明細書の実施例２で記載される抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定する方法（又はその部分）を含む。

下流処理
不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％を決定（例えば、測定）して、抗体組成物の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）％についてより十分な情報を提供する。決定（例えば、測定）は、製造の任意の段階で行うことができる。特に、測定は、採取前又は採取後、下流処理の任意の段階前又は中に行われ得る。例示的な下流処理としては、キャプチャークロマトグラフィー、中間クロマトグラフィー及び／若しくはポリッシュクロマトグラフィー単位操作を含む任意のクロマトグラフィー単位操作；ウイルスの不活化及び中和；ウイルス濾過；並びに／又は最終製剤化が挙げられる。様々な態様では、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％はリアルタイム、準リアルタイム及び／又は事後に決定（例えば、測定）される。モニタリング及び測定は、既知の手法及び市販の設備を使用してなされ得る。

本開示の様々な態様では、不対高マンノースグリカン％及び／又は不対非フコシル化グリカン％の決定（例えば、測定）は、回収前に行われる。本明細書で使用される場合、用語「回収する」は、目的の組換えタンパク質を含有する細胞培養培地が収集され、細胞培養物の少なくとも細胞から分離されることを指す。回収は連続的に行うことができる。いくつかの態様では、回収は、遠心分離を使用して行われ、沈殿、濾過などを更に含み得る。様々な態様では、決定は回収前に行われる。様々な態様では、決定は、クロマトグラフィー前、任意選択的に、プロテインＡクロマトグラフィー前に行われる。いくつかの態様では、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％の決定（例えば、測定）は、回収の少なくとも３日、少なくとも４日又は少なくとも５日前に行われる。任意選択的に、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％の決定（例えば、測定）は、抗体製造に関してリアルタイムで行われる。

本開示の様々な態様では、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％の決定（例えば、測定）は、回収後に行われる。様々な態様では、決定は、クロマトグラフィー後、任意選択的に、プロテインＡクロマトグラフィー後に行われる。様々な態様では、決定は、回収後及びクロマトグラフィー後、任意選択的に、プロテインＡクロマトグラフィー後に行われる。

本開示の方法に関して、抗体組成物は、様々な態様では、更なる処理、例えば下流処理のために選択され、この選択は特定のパラメータ、例えばＡＤＣＣ％、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％に基づく。様々な事例では、本明細書に開示される方法は、特定のパラメータ、例えばＡＤＣＣ％、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％に基づいて、更なる処理、例えば下流処理において抗体組成物を使用することを含む。様々な事例では、本明細書に開示される方法は、特定のパラメータ、例えばＡＤＣＣ％、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％に基づく抗体組成物を用いて、更なる処理、例えば下流処理を行うことを含む。

例示的な事例では、下流処理は、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％が決定される（例えば、測定される）処理後に（又は決定される下流で）発生する任意の処理を含むか又はそれからなる。例えば、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％が回収時に決定（例えば、測定）された場合、下流処理は、回収後に（又はその下流で）行われる任意の処理であり、様々な態様では、以下を含む：希釈、充填、濾過、製剤化、更なるクロマトグラフィー、ウイルス濾過、ウイルス不活化又はこれらの組み合わせ。例えば、不対高マンノースグリカン相対％及び／又は不対非フコシル化グリカン相対％がクロマトグラフィー、例えばプロテインＡクロマトグラフィー後に決定（例えば、測定）された場合、下流処理は、クロマトグラフィー後に（又はその下流で）行われる任意の処理も含むか又はその処理からなり、下流処理は、様々な態様では、以下を含む：希釈、充填、濾過、製剤化、更なるクロマトグラフィー、ウイルス濾過、ウイルス不活化又はこれらの組み合わせ。例示的な事例では、更なるクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィー）である。

下流処理中に使用されるクロマトグラフィーの段階／タイプには、他のタンパク質、凝集体、ＤＮＡ、ウイルス及び他のそのような不純物から組換え産物を分離するために使用されるキャプチャークロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。例示的な事例では、最初のクロマトグラフィーはプロテインＡ（例えば、樹脂に結合したプロテインＡ）を用いて実施される。様々な態様では、中間及びポリッシュクロマトグラフィーは、組換えタンパク質を更に精製し、バルク汚染物質、外来性ウイルス、微量不純物、凝集体、アイソフォームなどを除去する。クロマトグラフィーは、目的の組換えタンパク質がクロマトグラフィー媒体に結合し、不純物が流れる結合及び溶出モード又は不純物が結合し、組換えタンパク質が流れるフロースルーモードで行うことができる。このようなクロマトグラフィー方法の例としては、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）などのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；混合様式又は多様式クロマトグラフィー（ＭＭ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡ）；逆相クロマトグラフィー及びゲル濾過が挙げられる。

様々な態様では、下流処理は、ウイルス不活化を含む。エンベロープウイルスは、リポタンパク質膜又は「エンベロープ」で囲まれたカプシドを有し、従って不活化を受けやすい。様々な場合において、ウイルス不活化として、熱不活化／低温殺菌、ｐＨ不活化、ＵＶ及びガンマ線照射、高強度広域スペクトル白色光の使用、化学不活化剤の添加、界面活性物質及び溶媒／界面活性剤処理が挙げられる。

様々な態様では、下流処理は、ウイルス濾過を含む。様々な態様では、ウイルス濾過は、ノンエンベロープウイルスを除去することを含む。様々な態様では、ウイルス濾過は、マイクロフィルター又はナノフィルターの使用を含む。

様々な態様では、下流処理には製剤が含まれ、これは１つ以上の工程で実施される。様々な態様では、クロマトグラフィーの完了後、精製された組換えタンパク質は、製剤化バッファにバッファ交換される。例示的な態様では、バッファ交換は、限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を使用して行われる。例示的な態様では、組換えタンパク質は、ダイアフィルトレーションを用いて所望の製剤化バッファにバッファ交換され、限外濾過を用いて所望の最終製剤濃度に濃縮される。様々な態様では、ＵＦ／ＤＦ製剤化に続いて、更なる安定性増強賦形剤が添加される。

組換えグリコシル化タンパク質
本開示の方法は、組換えグリコシル化タンパク質を含む組成物に関する。様々な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、式：
Ａｓｎ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２
（式中、Ｘａａ_１はＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、Ｘａａ_２はＳｅｒ又はＴｈｒである）
の１つ以上のＮ－グリコシル化コンセンサス配列を含むアミノ酸配列を含む。

例示的な実施形態では、組換えグリコシル化タンパク質は、結晶性断片（Ｆｃ）ポリペプチドを含む。「Ｆｃポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドのネイティブ及びムテイン形態を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドのトランケート型も含まれる。Ｆｃ部分（及びそれから形成されるオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡ又はプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の長所をもたらす。例示的な実施形態では、組換えグリコシル化タンパク質は、ＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧのＦｃを含む。例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃを含む。例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、抗体、抗体タンパク質生成物、ペプチボディ又はＦｃ－融合タンパク質である。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は抗体である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、本開示を考慮して当業者によって理解されるであろうその通常の慣習的な意味を有する。それは、重及び軽鎖を含み、且つ可変及び定常領域を含む、正規の免疫グロブリン型を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、同一のポリペプチド鎖の対が２つある「Ｙ字型」構造であり、各対が１つの「軽」鎖（通常、分子量が約２５ｋＤａである）及び１つの「重」鎖（通常、分子量が約５０～７０ｋＤａである）を有する、ＩｇＧであり得る。抗体は、１つの可変領域及び１つの定常領域を正規に含む。ＩｇＧ型において、可変領域は、一般に、約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体と実質的に異なる。従って、抗体は、３つのＣＤＲを含む可変領域を含む重鎖及び３つのＣＤＲを含む可変領域を含む重鎖を含み得る。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４^ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９）を参照されたい。

簡潔に説明すると、抗体の骨格において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、そこで抗原結合及び抗原認識に大きい役割を果たす領域を構成する。可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照されたい）、それらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７、前掲も参照されたい）内にある。

ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、以下に限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、以下に限定されないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含む、サブクラスを有する。本開示の実施形態は、抗体の全てのこのようなクラス又はアイソタイプを含む。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域、例えばヒトカッパ型又はヒトラムダ型の軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型の重鎖定常領域、例えばヒトアルファ型、ヒトデルタ型、ヒトイプシロン型、ヒトガンマ型又はヒトミュー型の重鎖定常領域であり得る。従って、例示的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のいずれか１つを含むアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体である。

様々な態様では、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。例示的な事例では、抗体は、哺乳動物抗体、例えばマウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ブタ抗体、ヒト抗体などである。特定の態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、モノクローナルヒト抗体である。

様々な態様では、抗体は、例えば、パパイン、ペプシン及び／又はジンジパインＫなどの酵素によって断片に切断される。パパインは、抗体を切断して、２つのＦａｂ断片及び単一のＦｃ断片を生成する。ペプシンは、抗体を切断して、Ｆ（ａｂ’）_２断片及びｐＦｃ’断片を生じる。例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、少なくとも１個のグリコシル化部位を保持する抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）_２又はｐＦｃ’である。本開示の方法に関して、抗体は、抗体のある種の部分を欠く場合があり、抗体断片であり得る。様々な態様では、抗体断片は、グリコシル化部位を含む。いくつかの態様では、断片は、真核細胞において翻訳後修飾によりグリコシル化される抗体のＦｃ領域の少なくとも一部を含む「グリコシル化Ｆｃ断片」である。様々な事例では、組換えグリコシル化タンパク質はグリコシル化Ｆｃ断片である。

少なくとも又は約１２～１５０ｋＤａの分子量範囲及び単量体（ｎ＝１）、二量体（ｎ＝２）及び三量体（ｎ＝３）から四量体（ｎ＝４）及び場合によってはそれより高い結合価（ｎ）範囲に広がる代替的な型の範囲を増大させるために抗体の構造が利用されており、このような代替的な抗体型は、本明細書中で「抗体タンパク質生成物」又は「結合タンパク質」と呼ばれる。

抗体タンパク質生成物は、完全な抗原結合能を保持する、抗体断片、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ／ＶＨに基づく抗原結合型であり得る。その完全な抗原結合部位を保持する最小の抗原結合断片は、Ｆｖ断片であり、これは、完全に可変（Ｖ）領域からなる。可溶性で柔軟なアミノ酸ペプチドリンカーを使用して、Ｖ領域をｓｃＦｖ（単鎖可変断片）断片に連結させて分子を安定化させるか、又は定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に加えて、Ｆａｂ断片［断片、抗原結合性］を生成する。ｓｃＦｖ及びＦａｂの両方は、原核宿主において容易に作製され得る広く使用される断片である。他の抗体タンパク質生成物としては、オリゴマー化ドメインに連結されるｓｃＦｖからなる異なる型を含むダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ又はミニボディ（ミニＡｂｓ）のようなジスルフィド結合で安定化されるｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）並びに二量体及び多量体抗体型が挙げられる。最小の断片は、ラクダ科動物重鎖Ａｂ及び単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）のＶＨＨ／ＶＨである。新規の抗体型を作製するために最も頻繁に使用される構築ブロックは、約１５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結された重鎖及び軽鎖由来のＶドメイン（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）を含む単鎖可変（Ｖ）－ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）である。ペプチボディ又はペプチド－Ｆｃ融合体は、更に別の抗体タンパク質生成物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメインにグラフトされた生物学的に活性なペプチドからなる。ペプチボディは、当技術分野で十分に説明されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６－５９１（２０１２）を参照されたい。

他の抗体タンパク質生成物としては、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重又は三重特異性抗体などが挙げられる。二重特異性抗体は、５つの主要なクラス：ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲートに分類することができる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照されたい。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、これらの抗体タンパク質生成物（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ ＶＨＨ／ＶＨ、Ｆｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、二量体抗体、多量体抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ミニＡｂ、ラクダ科動物の重鎖抗体のペプチボディＶＨＨ／ＶＨ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性又は三重特異性抗体、ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲート）のいずれか１つを含み、且つ１つ以上のＮ－グリコシル化コンセンサス配列、任意選択的に１つ以上のＦｃポリペプチドを含む。様々な態様では、抗体タンパク質生成物は、グリコシル化部位を含む。例示的な態様では、抗体タンパク質生成物は、抗体結合断片にコンジュゲートされたグリコシル化Ｆｃ断片（「グリコシル化Ｆｃ断片抗体生成物」）であり得る。

組換えグリコシル化タンパク質は、単量体形態又は多量体、オリゴマー若しくは多量体形態の抗体タンパク質生成物であり得る。抗体が２つ以上の個別の抗原結合領域断片を含む特定の実施形態では、抗体は、抗体により認識され、結合される個別のエピトープの数に依って、二重特異性、三重特異性若しくは多重特異性又は二価、三価若しくは多価とみなされる。

様々な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。「キメラ抗体」という用語は、本明細書では、ある１つの種由来の定常ドメイン及び第２の種由来の可変ドメインを含有するか、又はより一般には少なくとも２種由来のアミノ酸配列のストレッチを含有する抗体を指すために使用される。「ヒト化」という用語は、抗体に関して使用される場合、元の起源の抗体よりも真のヒト抗体と類似している構造及び免疫学的機能を有するように操作されている非ヒト起源由来の少なくともＣＤＲ領域を有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体など由来のＣＤＲをヒト抗体に移植することを含み得る。ヒト化は、非ヒト配列をよりヒト配列に見えるようにするためのアミノ酸置換の選択も含み得る。

有利には、本方法は、抗体、グリコシル化Ｆｃ断片、抗体タンパク質生成物、キメラ抗体又はヒト化抗体の抗原特異性に限定されない。従って、抗体、グリコシル化Ｆｃ断片、抗体タンパク質生成物、キメラ抗体又はヒト化抗体は、実質的に任意の抗原に対して任意の結合特異性を有する。例示的な態様では、抗体は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、細胞表面受容体又はその任意のリガンドに結合する。例示的な態様では、抗体は、免疫細胞の細胞表面に発現するタンパク質に結合する。例示的な態様では、抗体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１，ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６及びＣＤ１８２からなる群から選択される分化分子のクラスターに結合する。

例示的な態様では、抗体、グリコシル化Ｆｃ断片、抗体タンパク質生成物、キメラ抗体又はヒト化抗体は、米国特許第７９４７８０９号明細書及び米国特許出願公開第２００９００４１７８４号明細書（グルカゴン受容体）、米国特許第７９３９０７０号明細書、米国特許第７８３３５２７号明細書、米国特許第７７６７２０６号明細書及び米国特許第７７８６２８４号明細書（ＩＬ－１７受容体Ａ）、米国特許第７８７２１０６号明細書及び米国特許第７５９２４２９号明細書（スクレロスチン）、米国特許第７８７１６１１号明細書、米国特許第７８１５９０７号明細書、米国特許第７０３７４９８号明細書、米国特許第７７００７４２号明細書及び米国特許出願公開第２０１００２５５５３８号明細書（ＩＧＦ－１受容体）、米国特許第７８６８１４０号明細書（Ｂ７ＲＰ１）、米国特許第７８０７１５９号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００９１４５５号明細書（ミオスタチン）、米国特許第７７３６６４４号明細書、米国特許第７６２８９８６号明細書、米国特許第７５２４４９６号明細書及び米国特許出願公開第２０１００１１１９７９号明細書（上皮成長因子受容体の欠失変異体）、米国特許第７７２８１１０（ＳＡＲＳコロナウイルス）、米国特許第７７１８７７６号明細書及び米国特許出願公開第２０１００２０９４３５号明細書（ＯＰＧＬ）、米国特許第７６５８９２４号明細書及び米国特許第７５２１０５３号明細書（アンジオポイエチン２）、米国特許第７６０１８１８号明細書、米国特許第７７９５４１３号明細書、米国特許出願公開第２００９０１５５２７４号明細書、米国特許出願公開第２０１１００４００７６号明細書（ＮＧＦ）、米国特許第７５７９１８６号明細書（ＴＧＦ－βＩＩ型受容体）、米国特許第７５４１４３８号明細書（結合組織増殖因子）、米国特許第７４３８９１０号明細書（ＩＬ１－Ｒ１）、米国特許第７４２３１２８号明細書（ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ）、米国特許第７４１１０５７号明細書、米国特許第７８２４６７９号明細書、米国特許第７１０９００３号明細書、米国特許第６６８２７３６号明細書、米国特許第７１３２２８１号明細書及び米国特許第７８０７７９７号明細書（ＣＴＬＡ－４）、米国特許第７０８４２５７号明細書、米国特許第７７９０８５９号明細書、米国特許第７３３５７４３号明細書、米国特許第７０８４２５７号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００４５５３７号明細書（インターフェロン－ガンマ）、米国特許第７９３２３７２（ＭＡｄＣＡＭ）号明細書、米国特許第７９０６６２５号明細書、米国特許出願公開第２００８０２９２６３９号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００４４９８６号明細書（アミロイド）、米国特許第７８１５９０７号明細書及び米国特許第７７００７４２号明細書（インシュリン用成長因子Ｉ）、米国特許第７５６６７７２号明細書及び米国特許第７９６４１９３号明細書（インターロイキン１β）、米国特許第７５６３４４２号明細書、米国特許第７２８８２５１号明細書、米国特許第７３３８６６０号明細書、米国特許第７６２６０１２号明細書、米国特許第７６１８６３３号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００９８６９４号明細書（ＣＤ４０）、米国特許第７４９８４２０号明細書（ｃ－Ｍｅｔ）、米国特許第７３２６４１４号明細書、米国特許第７５９２４３０号明細書及び米国特許第７７２８１１３号明細書（Ｍ－ＣＳＦ）、米国特許第６９２４３６０号明細書、米国特許第７０６７１３１号明細書及び米国特許第７０９０８４４号明細書（ＭＵＣ１８）、米国特許第６２３５８８３号明細書、米国特許第７８０７７９８号明細書及び米国特許出願公開第２０１００３０５３０７号明細書（上皮成長因子受容体）、米国特許第６７１６５８７号明細書、米国特許第７８７２１１３号明細書、米国特許第７４６５４５０号明細書、米国特許第７１８６８０９号明細書、米国特許第７３１７０９０号明細書及び米国特許第７６３８６０６（インターロイキン４受容体）、米国特許出願公開第２０１１０１３５６５７号明細書（ベータ－クロトー）、米国特許第７８８７７９９号明細書及び米国特許第７８７９３２３号明細書（線維芽細胞増殖因子様ポリペプチド）、米国特許第７８６７４９４号明細書（ＩｇＥ）、米国特許出願公開第２０１００２５４９７５号明細書（アルファ－４ベータ－７）、米国特許出願公開第２０１００１９７００５号明細書及び米国特許第７５３７７６２号明細書（アクチビン受容体様キナーゼ１）、米国特許第７５８５５００号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００４７２５３号明細書（ＩＬ－１３）、米国特許出願公開第２００９０２６３３８３号明細書及び米国特許第７４４９５５５号明細書（ＣＤ１４８）、米国特許出願公開第２００９０２３４１０６号明細書（アクチビンＡ）、米国特許出願公開第２００９０２２６４４７号明細書（アンジオポイエチン１及びアンジオポイエチン２）、米国特許出願公開第２００９０１９１２１２号明細書（アンジオポイエチン２）、米国特許出願公開第２００９０１５５１６４号明細書（Ｃ－ＦＭＳ）、米国特許第７５３７７６２号明細書（アクチビン受容体様キナーゼ１）、米国特許第７３７１３８１号明細書（ガラニン）、米国特許出願公開第２００７０１９６３７６号明細書（インシュリン用成長因子）、米国特許第７２６７９６０号明細書及び米国特許第７７４１１１５号明細書（ＬＤＣＡＭ）、ＵＳ７２６５２１２（ＣＤ４５ＲＢ）、米国特許第７７０９６１１号明細書、米国特許出願公開第２００６０１２７３９３号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００４０６１９号明細書（ＤＫＫ１）、米国特許第７８０７７９５号明細書、米国特許出願公開第２００３０１０３９７８号明細書及び米国特許第７９２３００８号明細書（オステオプロテゲリン）、米国特許出願公開第２００９０２０８４８９号明細書（ＯＶ０６４）、米国特許出願公開第２００８０２８６２８４号明細書（ＰＳＭＡ）、米国特許第７８８８４８２、米国特許出願公開第２０１１０１６５１７１号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００５９０６３号明細書（ＰＡＲ２）、米国特許出願公開第２０１１０１５０８８８号明細書（ヘプシジン）、米国特許第７９３９６４０号明細書（Ｂ７Ｌ－１）、米国特許第７９１５３９１号明細書（ｃ－Ｋｉｔ）、米国特許第７８０７７９６号明細書、米国特許第７１９３０５８号明細書及び米国特許第７４２７６６９号明細書（ＵＬＢＰ）、米国特許第７７８６２７１号明細書、米国特許第７３０４１４４号明細書及び米国特許出願公開第２００９０２３８８２３号明細書（ＴＳＬＰ）、米国特許第７７６７７９３号明細書（ＳＩＧＩＲＲ）、米国特許第７７０５１３０号明細書（ＨＥＲ－３）、米国特許第７７０４５０１号明細書（アタキシン１様ポリペプチド）、米国特許第７６９５９４８号明細書及び米国特許第７１９９２２４（ＴＮＦ－α変換酵素）、米国特許出願公開第２００９０２３４１０６号明細書（アクチビンＡ）、米国特許出願公開第２００９０２１４５５９号明細書及び米国特許第７４３８９１０号明細書（ＩＬ１－Ｒ１）、米国特許第７５７９１８６号明細書（ＴＧＦ－βＩＩ型受容体）、米国特許第７５６９３８７号明細書（ＴＮＦ受容体様分子）、米国特許第７５４１４３８号明細書（結合組織増殖因子）、米国特許第７５２１０４８号明細書（ＴＲＡＩＬ受容体２）、米国特許第６３１９４９９号明細書、米国特許第７０８１５２３号明細書及び米国特許出願公開第２００８０１８２９７６号明細書（エリスロポイエチン受容体）、米国特許出願公開第２００８０１６６３５２号明細書及び米国特許第７４３５７９６号明細書（Ｂ７ＲＰ１）、米国特許第７４２３１２８号明細書（プロペルジン）、米国特許第７４２２７４２号明細書及び米国特許第７１４１６５３号明細書（インターロイキン５）、米国特許第６７４０５２２号明細書及び米国特許第７４１１０５０号明細書（ＲＡＮＫＬ）、米国特許第７３７８０９１号明細書（炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ ＩＸ）腫瘍抗原）、米国特許第７３１８９２５号明細書及び米国特許第７２８８２５３号明細書（副甲状腺ホルモン）、米国特許第７２８５２６９号明細書（ＴＮＦ）、米国特許第６６９２７４０号明細書及び米国特許第７２７０８１７号明細書（ＡＣＰＬ）、米国特許第７２０２３４３号明細書（単球走化性タンパク質１）、米国特許第７１４４７３１号明細書（ＳＣＦ）、米国特許第６３５５７７９号明細書及び米国特許第７１３８５００号明細書（４－１ＢＢ）、米国特許第７１３５１７４号明細書（ＰＤＧＦＤ）、米国特許第６６３０１４３号明細書及び米国特許第７０４５１２８号明細書（Ｆｌｔ－３リガンド）、米国特許第６８４９４５０号明細書（メタロプロテアーゼ阻害剤）、米国特許第６５９６８５２号明細書（ＬＥＲＫ－５）、米国特許第６２３２４４７号明細書（ＬＥＲＫ－６）、米国特許第６５００４２９号明細書（脳由来神経栄養因子）、米国特許第６１８４３５９号明細書（上皮由来Ｔ細胞因子）、米国特許第６１４３８７４号明細書（神経栄養因子ＮＮＴ－１）、米国特許出願公開第２０１１００２７２８７号明細書（プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（ＰＣＳＫ９））、米国特許出願公開第２０１１００１４２０１号明細書（ＩＬ－１８ＲＥＣＥＰＴＯＲ）及び米国特許出願公開第２００９０１５５１６４号明細書（Ｃ－ＦＭＳ）に記載されている抗体の１つである。上記の特許及び公開特許出願は、可変ドメインポリペプチド、可変ドメインをコードする核酸、宿主細胞、ベクター、上記の可変ドメインをコードするポリペプチドを作製する方法、医薬組成物及び可変ドメイン含有抗体タンパク質生成物又は抗体のそれぞれの標的に付随する疾患を処置する方法のそれらの開示の目的のために、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。

例示的な実施形態では、グリコシル化Ｆｃ断片、抗体タンパク質生成物、キメラ抗体又はヒト化抗体は、ムロモナブ－ＣＤ３（商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ Ｏｋｔ３（登録商標）で市販の製品）、アブシキシマブ（商品名Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）で市販の製品）、リツキシマブ（商品名ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）で市販の製品）、バシリキシマブ（商品名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）で市販の製品）、ダクリズマブ（商品名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）で市販の製品）、パリビズマブ（商品名Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）で市販の製品）、インフリキシマブ（商品名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で市販の製品）、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、アレムツズマブ（商品名ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（登録商標）で市販の製品）、アダリムマブ（商品名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシツモマブ－Ｉ１３１（商品名Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）で市販の製品）、エファリズマブ（商品名Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）で市販の製品）、セツキシマブ（商品名Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）で市販の製品）、イブリツモマブチウキセタン（商品名Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）で市販の製品）、オマリズマブ（商品名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）で市販の製品）、ベバシズマブ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、ナタリズマブ（商品名Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）で市販の製品）、ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で市販の製品）、パニツムマブ（商品名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）で市販の製品）、エクリズマブ（商品名Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、セルトリズマブペゴル（商品名Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）で市販の製品）、ゴリムマブ（商品名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）で市販の製品）、カナキヌマブ（商品名Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、カツマキソマブ（商品名Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標）で市販の製品）、ウステキヌマブ（商品名Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシリズマブ（商品名ＲｏＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）で市販の製品）、オファツムマブ（商品名Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）で市販の製品）、デノスマブ（商品名Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）で市販の製品）、ベリムマブ（商品名Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）で市販の製品）、ラキシバクマブ、イピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）で市販の製品）及びペルツズマブ（商品名Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標）で市販の製品）の１つである。例示的な実施形態では、抗体、グリコシル化Ｆｃ断片、抗体タンパク質生成物、キメラ抗体又はヒト化抗体は、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ及びセルトリズマブペゴルなどの抗ＴＮＦαタンパク質；アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ及びセルトリズマブペゴルなどの抗ＴＮＦα抗体；カナキヌマブなどの抗ＩＬ１β抗体；ウステキヌマブ及びブリアキヌマブなどの抗ＩＬ１２／２３（ｐ４０）抗体；並びにダクリズマブなどの抗ＩＬ２Ｒ抗体の１つである。本明細書に記載される分子の一般的名称には、その一般的名称の分子を含む任意の先発品又はバイオシミラー製品が含まれると理解されるであろう。例示的な実施形態では、抗体、グリコシル化Ｆｃ断片、抗体タンパク質生成物、キメラ抗体又はヒト化抗体は、前述の抗体の１つのバイオシミラーである。

例示的な態様では、抗体は、腫瘍関連抗原に結合し、且つ抗癌抗体である。好適な抗癌抗体の例としては、ベリムマブなどの抗ＢＡＦＦ抗体；リツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体；エプラツズマブなどの抗ＣＤ２２抗体；ダクリズマブなどの抗ＣＤ２５抗体；イラツムマブなどの抗ＣＤ３０抗体、ゲムツズマブなどの抗ＣＤ３３抗体、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体；イピリムマブなどの抗ＣＤ１５２抗体；セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体；トラスツズマブ及びペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体；シルツキシマブなどの抗ＩＬ６抗体；並びにベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体；トシリズマブなどの抗ＩＬ６受容体抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な態様では、抗体の抗原はＴＮＦαであり、抗体は抗ＴＮＦα抗体（簡潔さのために、単に「抗ＴＮＦ」抗体とも呼ばれ得る）、例えば抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である。例示的な態様では、抗体の抗原は、配列番号２を含む。様々な態様では、抗体はインフリキシマブである。インフリキシマブという用語は、ヒト定常領域及びマウス可変領域から構成され、ＴＮＦα抗原に結合するキメラモノクローナルＩｇＧ１カッパ抗体を指す（ＣＡＳ番号：１７０２７７－３１－３、ＤｒｕｇＢａｎｋアクセッション番号ＤＢ０００６５を参照されたい）。キメラ抗体ｃＡ２としても知られるインフリキシマブは、Ａ２と呼ばれるマウスモノクローナル抗体に由来した（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０（１６）：１４４３－１４５３（１９９３））。ｃＡ２軽鎖の可変領域は、国際公開第２００６／０６５９７５号パンフレットに公開されている。例示的な態様では、抗体は、表Ａに記載されるインフリキシマブの軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。例示的な態様では、抗体は、表Ａに記載されるインフリキシマブの重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む。様々な事例では、抗体は、インフリキシマブのＶＨ及びＶＬを含むか又はＶＨ－ＩｇＧ１及びＶＬ－ＩｇＧカッパ配列を含む。

様々な態様では、抗体は以下を含む：
ｉ．配列番号３の軽鎖（ＬＣ）可変領域のＣＤＲ１又はＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有するＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列のバリアントアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号３のＬＣ可変領域のＣＤＲ２又はＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有するＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列のバリアントアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号３のＬＣ可変領域のＣＤＲ３又はＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有するＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列のバリアントアミノ酸配列、
ｉｖ．配列番号４の重鎖（ＨＣ）可変領域のＣＤＲ１又はＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有するＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列のバリアントアミノ酸配列、
ｖ．配列番号４の重鎖（ＨＣ）可変領域のＣＤＲ２又はＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有するＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列のバリアントアミノ酸配列、
ｖｉ．配列番号４の重鎖（ＨＣ）可変領域のＣＤＲ３又はＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有するＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列のバリアントアミノ酸配列。

様々な事例では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号３のバリアントアミノ酸配列を含むＬＣ可変領域を含む。

例示的な態様では、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号４のバリアントアミノ酸配列を含むＨＣ可変領域を含む。

例示的な事例では、抗体は、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号５のバリアントアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

様々な態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号６のバリアントアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

例示的な態様では、腫瘍関連抗原はＨＥＲ２であり、抗体は抗ＨＥＲ２抗体、例えば抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。例示的な態様では、腫瘍関連抗原は、配列番号７を含む。様々な態様では、ＩｇＧ１抗体はトラスツズマブである。トラスツズマブという用語は、ＨＥＲ２抗原に結合するＩｇＧ１カッパヒト化モノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１８０２８８－６９－１，ＤｒｕｇＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＢ０００７２を参照されたい）。例示的な態様では、抗体は、表Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。例示的な態様では、抗体は、表Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む。様々な例において、抗体は、表Ｂに列挙されるＶＨ及びＶＬを含むか又はＶＨ－ＩｇＧ１及びＶＬ－ＩｇＧカッパ配列を含む。

様々な態様では、抗体は、以下を含む：
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有する配列番号８のバリアントアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列又は配列番号９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有する配列番号９のバリアントアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有する配列番号１０のバリアントアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ３、
ｉｖ．配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有する配列番号１１のバリアントアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列又は配列番号１２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有する配列番号１２のバリアントアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ２、
ｖｉ．配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１個若しくは２個のアミノ酸置換を有する配列番号１３のバリアントアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ３。

様々な事例では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号１４のバリアントアミノ酸配列を含むＬＣ可変領域を含む。

例示的な態様では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号１５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号１５のバリアントアミノ酸配列を含むＨＣ可変領域を含む。

例示的な事例では、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列、配列番号１６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号１６のバリアントアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

様々な態様では、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列、配列番号１７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列又は１～１０（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１又は２）個のアミノ酸置換を有する配列番号１７のバリアントアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

組成物
本開示の方法は、組換えグリコシル化タンパク質を含む組成物に関する。様々な態様では、組成物は、１つの型の組換えグリコシル化タンパク質のみを含む。様々な事例では、組成物は、組成物の各組換えグリコシル化タンパク質が同じであるか又は実質的に同じアミノ酸配列を含む組換えグリコシル化タンパク質を含む。様々な態様では、組成物は組換えグリコシル化タンパク質を含み、組成物の各組換えグリコシル化タンパク質は、組成物の他の全ての組換えグリコシル化タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な態様では、組成物は組換えグリコシル化タンパク質を含み、組成物の各組換えグリコシル化タンパク質が組成物の他の全ての組換えグリコシル化タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な態様では、組成物は組換えグリコシル化タンパク質を含み、組成物の各組換えグリコシル化タンパク質は、同じ又は実質的に同じ（例えば、組成物の他の全ての組換えグリコシル化タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一の）アミノ酸配列を含むが、組成物の組換えグリコシル化タンパク質のグリコプロファイルは、互いに相異し得る。様々な態様では、組成物は、グリコシル化タンパク質の少なくとも８０％が、特定のレベル未満の不対グリカン含量（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％又は３０％以下の不対含量）（高マンノース及び／又は非フコシル化）を有する組換えグリコシル化タンパク質を含む。様々な態様では、組成物は、グリコシル化タンパク質の少なくとも８０％が、特定のレベル超の不対グリカン含量（例えば、少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％又は３０％の不対含量）（高マンノース及び／又は非フコシル化）を有する組換えグリコシル化タンパク質を含む。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、抗体断片であり、従って、組成物は、抗体断片組成物であり得る。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、抗体タンパク質生成物であり、従って、組成物は、抗体タンパク質生成物組成物であり得る。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、グリコシル化Ｆｃ断片であり、従って、組成物は、グリコシル化Ｆｃ断片組成物であり得る。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、グリコシル化Ｆｃ断片抗体生成物であり、従って、組成物は、グリコシル化Ｆｃ断片抗体生成物組成物であり得る。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、キメラ抗体であり、従って、組成物は、キメラ抗体組成物であり得る。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、ヒト化抗体であり、従って、組成物は、ヒト化抗体組成物であり得る。

例示的な態様では、組換えグリコシル化タンパク質は、抗体であり、組成物は、抗体組成物である。様々な態様では、組成物は、１つの型の抗体のみを含む。様々な事例では、組成物は、抗体を含み、抗体組成物の各抗体は、同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗体組成物は、抗体を含み、抗体組成物の各抗体は、抗体組成物の他の全ての抗体のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗体組成物は、抗体を含み、抗体組成物の各抗体は、抗体組成物の他の全ての抗体のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗体組成物は、抗体を含み、組成物の各組換えグリコシル化タンパク質は、同じ又は実質的に同じ（例えば、抗体組成物の他の全ての抗体のタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一の）アミノ酸配列を含むが、抗体組成物の抗体のグリコプロファイルは互いに相異し得る。例示的な態様では、抗体組成物は、抗体の異なるグリコフォームの不均一な混合物を含む。様々な事例では、抗体組成物は、その相対不対グリカン含量、例えば相対不対ＨＭグリカン含量及び／又はその相対不対ＡＦグリカン含量に関して特徴付けられ得る。任意選択的に、抗体組成物は、他の型のグリカン、例えばガラクトシル化グリコフォーム、フコシル化グリコフォームなどのその含量に関して特徴付けられ得る。

様々な態様では、抗体組成物の各抗体はインフリキシマブである。様々な態様では、抗体組成物の各抗体はトラスツズマブである。

例示的な態様では、抗体組成物は、抗体の異なるグリコフォームの不均一な混合物を含む。様々な事例では、抗体組成物は、その相対不対ＨＭグリカン含量及び／又はその相対不対ＡＦグリカン含量に関して特徴付けられ得る。様々な態様では、抗体組成物は、不対ＨＭグリカン％及び／又は不対非フコシル化グリカン％に関して記載される。任意選択的に、抗体組成物は、他の型のグリカン、例えばガラクトシル化グリコフォーム、フコシル化グリコフォームなどのその含量に関して特徴付けられ得る。

例示的な実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わされる。従って、本明細書では、本明細書に記載される組換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物又は抗体タンパク質生成物組成物）及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語には、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水又は水／油エマルションなどのエマルション及び様々なタイプの湿潤剤のいずれかが含まれる。

例示的な実施形態では、抗体組成物の抗体は、本明細書に記載されるように、細胞培養物中のグリコシル化コンピテント細胞によって発現される。

更なる製造プロセス
本明細書で開示される抗体組成物を製造する方法は、様々な態様では、更なるプロセスを含む。例えば、いくつかの態様では、方法は、組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体）の産生、精製及び製剤化に関与する上流又は下流処理を含む。任意選択的に、下流処理は、本明細書に記載されるか又は当技術分野で公知の任意の下流処理を含む。例えば、本明細書の下流処理を参照されたい。例示的な実施形態では、方法は、組換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体）を発現する宿主細胞を作製することを含む。宿主細胞は、いくつかの態様では、原核宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であるか、又は宿主細胞は、いくつかの態様では、真核宿主細胞、例えば酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＢＨＫ細胞）である。このような宿主細胞は、当技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）及び本明細書の「細胞」を参照されたい。例えば、方法は、いくつかの例では、組換えグリコシル化タンパク質又はそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む。

例示的な態様では、方法は、細胞、例えばグリコシル化コンピテント細胞を細胞培養物中に維持する工程を含む。従って、方法は、本明細書の細胞培養物中における細胞の維持に記載される任意の１つ以上の工程を実施する工程を含み得る。

例示的な実施形態では、本明細書で開示される方法は、培養物から組換えグリコシル化タンパク質（例えば、組換え抗体）を単離及び／又は精製することを含む。例示的な態様では、方法は、以下に限定されないが、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを含む。例示的な態様では、方法は、組換えグリコシル化タンパク質を含む溶液から結晶性生体分子を生成することを含む。

様々な態様では、本開示の方法は、いくつかの態様において、精製組換えグリコシル化タンパク質を含む、医薬組成物を含む組成物を調製することを含む。このような組成物は、本明細書中で説明されている。

細胞培養物中における細胞の維持
本開示のタンパク質又は抗体組成物を製造する方法に関して、抗体組成物は、細胞培養物中で細胞を維持すること（例えば、細胞培養物を維持すること）によって製造され得る。細胞培養物は、組換えグリコシル化タンパク質の産生に好適な任意の一連の条件に従って維持され得る。例えば、いくつかの態様では、細胞培養物は、特定のｐＨ、温度、細胞密度、培養体積、溶存酸素レベル、圧力、浸透圧などで維持される。例示的な態様では、ＣＯ_２インキュベーター中、標準的な加湿条件下において５％ＣＯ_２で接種前の細胞培養物を振盪する（例えば、７０ｒｐｍ）。例示的な態様では、１．５Ｌ培地中約１０^６個細胞／ｍＬの播種密度で細胞培養物が播種される。本明細書で記載されるとおり、クローンは、選択された不対及び対になったグリカンの相対含量（例えば、対照よりも低い又は高い不対グリカン含量）を製造するように選択され得る。クローンに由来する細胞は、本明細書で記載されるタンパク質又は抗体組成物の製造のために培養され得ると理解されるであろう。

例示的な態様では、本開示の方法は、約６．８５～約７．０５、例えば様々な態様において約６．８５、約６．８６、約６．８７、約６．８８、約６．８９、約６．９０、約６．９１、約６．９２、約６．９３、約６．９４、約６．９５、約６．９６、約６．９７、約６．９８、約６．９９、約７．００、約７．０１、約７．０２、約７．０３、約７．０４又は約７．０５のｐＨで細胞培養培地中においてグリコシル化適格細胞を維持することを含む。

例示的な態様では、方法は、３０℃～４０℃の温度で細胞培養物を維持することを含む。例示的な実施形態では、温度は、約３２℃～約３８℃又は約３５℃～約３８℃である。

例示的な態様では、方法は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。例示的な態様では、方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ又は約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。例示的な態様では、本方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。様々な態様では、浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５又は約５００で維持される。

例示的な態様では、方法は、初期細胞培養期間中、約２０％～約６０％酸素飽和度で細胞培養物の溶解酸素（ＤＯ）レベルを維持することを含む。例示的な事例では、方法は、初期細胞培養期間中、約３０％～約５０％（例えば、約３５％～約４５％）の酸素飽和度に細胞培養物のＤＯレベルを維持することを含む。例示的な事例では、方法は、初期細胞培養期間中、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％又は約６０％酸素飽和度で細胞培養のＤＯレベルを維持することを含む。例示的な態様では、ＤＯレベルは、約３５ｍｍＨｇ～約８５ｍｍＨｇ又は約４０ｍｍＨｇ～約８０ｍｍＨｇ又は約４５ｍｍＨｇ～約７５ｍｍＨｇである。

細胞培養は、任意の１つ以上の培養培地中で維持される。例示的な態様では、細胞培養物は、細胞増殖に適切な培地中で維持され、且つ／又は任意の適切な供給スケジュールに従って１つ以上のフィード培地とともにもたらされる。例示的な態様では、方法は、グルコース、フコース、乳酸塩、アンモニア、グルタミン及び／又はグルタメートを含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、方法は、初期細胞培養期間中、約１μＭ以下の濃度のマンガンを含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、本方法は、約０．２５μＭ～約１μＭマンガンを含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、本方法は、無視できる量のマンガンを含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、本方法は、初期細胞培養期間中、約５０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、本方法は、初期細胞培養期間中、約４０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、本方法は、初期細胞培養期間中、約３０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様では、培地は、約５ｐｐｂ以上又は約１０ｐｐｂ以上の濃度の銅を含む。例示的な態様では、細胞培養培地は、マンノースを含む。例示的な態様では、細胞培養培地は、マンノースを含まない。

例示的な実施形態では、細胞培養のタイプは、流加培養法又は連続灌流培養法である。しかし、本開示の方法は、有利には、いずれの特定のタイプの細胞培養にも限定されない。

細胞培養物で維持される細胞は、グリコシル化コンピテント細胞であり得る。例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は真核細胞であり、例えば酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、藻類細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような宿主細胞は、当技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照されたい。例示的な態様では、真核細胞は哺乳動物細胞である。例示的な態様では、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えば、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又はその誘導体（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト骨の骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３））である。

グリコシル化にコンピテントではない細胞は、例えば、グリコシル化に必要な関連酵素をコードする遺伝子をそれらに導入することにより、グリコシル化コンピテント細胞にも形質転換され得る。例示的な酵素としては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼＩ、グルコシダーゼＩＩ、カルネキシン／カルレティキュリン、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。フコース代謝のこれらの３つの経路は、図２において示される。例示的な実施形態では、グリコシル化適格細胞は、フコシル－トランスフェラーゼ（ＦＵＴ、例えばＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９）、フコースキナーゼ、ＧＤＰ－フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ、４－レダクターゼ（ＦＸ）のいずれか１つ以上の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例示的な実施形態では、グリコシル化適格細胞は、ＦＸをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。

例示的な実施形態では、グリコシル化適格細胞は、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧＮＴＩＩＩ）又はＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例示的な態様では、グリコシル化適格細胞は、ＧＮＴＩＩＩ又はＲＭＤを過剰発現するように遺伝的に改変されない。

例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝子操作される。

以下の実施例は本発明を単に説明するために示され、その範囲を決して限定するものではない。

実施例１
本実施例では、モノクローナル抗体のＮ結合型グリコシル化プロファイル（グリカンプロファイル）を決定する例示的な方法を記載する。

本分析法の目的は、疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）グリカンマップ分析により、抗体を含む試料中の抗体のＮ結合型グリコシル化プロファイルを決定することである。このグリカンマップ法は、抗体のＮ結合型グリカン分布の定量的分析であり、以下の３つの工程を含む：（１）ＰＮＧアーゼＦ及び遊離グリカンを特異的に誘導体化することができるフルオロフォアを使用して、参照及び試験試料からＮ結合型グリカンを放出させ標識化する工程、（２）ＨＩＬＩＣカラムに有効な線形範囲内の試料をロードし、徐々に減少する有機溶媒の勾配を使用して、標識されたＮ連結グリカンを分離する工程、及び（３）蛍光検出器を用いてグリカン種の溶出をモニターする工程。

標準及び試験試料を、以下の工程を実行することによって製造する：（１）試料及び対照を水で希釈する工程、（２）試料及び対照にＰＮＧアーゼＦを添加し、インキュベートして、Ｎ結合型グリカンを放出させる工程、（３）２－アミノ安息香酸などのフルオロフォアを用いてフルオロフォア標識溶液と混合する工程。試料及び対照をボルテックスし、インキュベートする工程、（４）遠心分離してタンパク質を沈殿させ、上清を除去する工程、（５）乾燥させ、注射溶液中で標識グリカンを再構成する工程。

このアッセイで使用される溶液は、移動相Ａ（１００ｍＭギ酸アンモニウム、目標ｐＨ３．０）及び移動相Ｂ（アセトニトリル）である。方法の工程を実行するために使用される装置は、以下の能力を有する。

親水性相互作用分析ＢＥＨグリカン１．７μｍカラム（内径２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）及び２－アミノ安息香酸フルオロフォア標識法を用いるＨＰＬＣの機器設定を以下に提供する。

移動相勾配の例を以下に提供する。

結果の報告は、以下の形式で構成される。

代表的なグリカンマップクロマトグラムの例を図２Ａ（実スケール図）及び図２Ｂ（拡大スケール図）に示す。

実施例２
本実施例は、２つの抗体のグリカンペアリング分析について記載する。

Ｆｃ領域を有するＩｇＧ分子のＡＤＣＣ活性は、共通グリコシル化部位におけるオリゴ糖の構造及び組成に影響される。Ｆｃ鎖上のコアフコースの欠如により、コアフコースを含む対応するＦｃ鎖と比較してＡＤＣＣ活性が１桁以上増加することは、よく知られている。ＡＤＣＣ活性に対する非フコシル化のこの影響は、フコースの欠如によるものであり、フコースが存在する場合、エフェクター細胞の表面に発現するＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩａに対するＦｃ鎖間の結合相互作用を立体的に妨げる。従って、非フコシル化及び高マンノースグリカン基は、ＡＤＣＣに直接影響を与えることが報告されている。Ｆｃ－ＦｃγＲＩＩＩａ相互作用に関する既存の知識は、単一のＦｃ鎖の受容体との結合に焦点を当てている。しかしながら、ＩｇＧ及びＩｇＧ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質を含むタンパク質治療分子には２つのＦｃ鎖が含まれており、その各々がグリコシル化されている。

本研究では、２つの異なる抗体組成物について、対になったグリカン含量及び不対グリカン含量が決定される：（１）抗体Ａ、ＴＮＦαに結合するヒト定常領域及びマウス可変領域を含むキメラモノクローナルＩｇＧ１抗体を含む組成物、及び（２）抗体Ｂ、ヒト上皮成長因子受容体タンパク質（ＨＥＲ２）に結合する組換えＩｇＧ１κ、ヒト化モノクローナル抗体を含む組成物。ＦｃγＲＩＩＩａ相互作用及びＡＤＣＣ活性に対する選択グリカンの影響を分析した。本実施例では、各抗体のための対になったグリカン及び不対グリカンを定量化した。実施例３はＡＤＣＣに対する選択グリカンの影響を記載し、実施例４はＡＤＣＣとＦｃγＲＩＩＩａ結合活性との間の相関関係を記載する。

不対又は対になったグリカンのレベルを測定するために使用される方法は、３つの工程：抗体切断工程、クロマト分離工程及び質量分析に基づく検出工程を含んでいた。まとめると、抗体Ａ又は抗体Ｂを含む抗体組成物の試料は、ＩｇＧ１抗体の重鎖をヒンジの上で切断してＦａｂ及びＦｃ抗体断片を作製するＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ（登録商標）（ＦＬ）酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で処理される（図５）。ＦＬ酵素は、ＩｇＧ１重鎖配列ＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）の２番目と３番目のアミノ酸との間を切断する。続いて、得られたＦａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片が分離され、溶媒としてイオン対試薬を使用した水／有機溶媒を用いた順相モードのＨＩＬＩＣと質量分析ベースの検出によって特徴付けられる。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ糖タンパク質アミドカラムで９５分間、０．１％ＴＦＡを含む水及びアセトニトリルの２０：８０の移動相組成物で実施した。１分の時点で、固定相との相互作用に基づいてグリカンペアを分離するために、０．４４ｍＬ／分の直線勾配を次の７４分間適用した。質量分析（ＭＳ）検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊｅｔ Ｓｔｒｅａｍ（ＡＪＳ）イオン源を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５４５ＸＴ ＱＴｏＦ ＭＳを使用し、以下の設定で実施した：キャピラリー電圧－４５００Ｖ；乾燥ガス－１１ｍＬ／分；ネブライザ圧力－２５ｐｓｉ及びガス温度－３４０℃ １０００～３０００ｍ／ｚの質量範囲使用。デコンボリューションは、ＢｉｏｃｏｎｆｉｒｍＢ．０９．００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、Ｓ／Ｎ３０、出力質量範囲を４０～６０ｋＤａに設定して実施した。

抗体Ａの対になったグリカン及び不対グリカンを示すＮ結合型グリコシル化プロファイル（グリカンプロファイル）又はグリカンマップを図６Ａに示し、抗体Ｂの対になったグリカン及び不対グリカンを示すグリカンプロファイル又はグリカンマップを図６Ｂに示す。個々のグリカンペアの存在量は、以下のようにクロマトグラムの対応するピークの下の相対面積の％として決定された。
％ピーク面積＝ピーク面積／合計ピーク面積×１００

抗体Ａの存在量順のグリカンペアのリストを表１に示し、抗体Ｂの存在量順のグリカンペアのリストを表２に示す。各表において、太字イタリック体で示されている種は構造異性体である。

抗体Ａ及び抗体Ｂについての高マンノース含有グリカンペアの相対存在量を表３に列挙するとともに、抗体Ａ及び抗体Ｂの非フコシル化グリカンペアの相対存在量を表４に列挙する。「不対」状態は、一方のＦｃ鎖のみがコアフコース（Ｆ）を有するペアに割り当てられ、「対になった」状態は、いずれのＦｃ鎖もコアフコースを有さないペアに割り当てられた。一般に、高マンノース含有ペアは、Ｍ３及びＡ２Ｇ０を伴うグリカンペアを除き、１つ又は２つの高マンノース基を含み、コアフコースはこれらのグリカンの１つ（Ｍ３Ｆ又はＡ２Ｇ０Ｆのいずれか）に存在した。非フコシル化グリカンペアは、少なくとも１つのＦｃ鎖上に非フコシル化グリカンを含んでいた。いくつかの事例では、非フコシル化グリカンペアは、１つの高マンノース基を含んでいた。

抗体Ａ及び抗体Ｂについての不対非フコシル化グリカンの相対存在量（％）及び不対高マンノースグリカン相対存在量（％）のグラフを図７に示す。不対非フコシル化グリカンの相対存在量（％）は、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージを、不対非フコシル化グリカンのパーセンテージ及び対になった非フコシル化グリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けることによって計算した。不対高マンノースグリカンの相対存在量は、不対高マンノースグリカンのパーセンテージを、不対高マンノースグリカンのパーセンテージ及び対になった高マンノースグリカンのパーセンテージの合計で割り、１００％を掛けることによって計算した。この図に示されているように、両方の抗体（抗体Ａ及び抗体Ｂ）が、大量の相対不対非フコシル化グリカンを含んでいた。抗体Ａには大量の相対不対高マンノースグリカンが含まれていたが、抗体Ｂでは相対不対高マンノースグリカンの割合が少なくなった。

実施例３
本実施例は、２つの抗体のＡＤＣＣ分析について記載する。

抗体Ａ又は抗体Ｂを含む試料についてのＡＤＣＣ活性レベル（相対値％として表される）は、抗体Ｆｃドメインを介してＮＫ９２－Ｍ１エフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）受容体に結合しながら、抗体Ａ又は抗体Ｂについての標的抗原を安定に発現する標的細胞の用量依存的な様式で細胞毒性を媒介する抗体の能力を測定する定量的細胞系アッセイを使用して決定された。これらの事象により、エフェクター細胞が活性化され、細胞溶解性顆粒複合体パーフォリン／グランザイムのエキソサイトーシスを介して標的細胞が破壊される。抗体ＡについてのＡＤＣＣアッセイの概略を図８Ａに示し、ＡＤＣＣアッセイの代表的な用量反応曲線を図８Ｂに示す。図８Ｂにおいて、各用量点は３回の反復の平均±標準偏差であり、アッセイシグナル＝蛍光である。

抗体濃度が増加している２組の抗体試料（１組は抗体Ａについて、もう１組は抗体Ｂについて）を作製した。各組の各試料についての高マンノースグリカン及び非フコシル化グリカンの存在量を測定して記録した。各組の各試料についてのＡＤＣＣ活性レベル（％として表される）は、上記の定量的細胞系アッセイにより決定した。簡潔に言えば、標的細胞はカルセイン－アセトキシメチル（カルセイン－ＡＭ）で標識されており、カルセイン－ＡＭは細胞に容易に侵入し、その後、細胞間エステラーゼによって切断されて細胞内に捕捉される。標的細胞が溶解されると、蛍光カルセインが培地中に放出される。溶解した標的細胞から放出されたカルセインのレベルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）蛍光プレートリーダーで反応上清の蛍光を測定することによって決定した。各アッセイを３回行い、平均及び標準偏差を報告した。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用する拘束４パラメーターフィットを使用してデータを平均蛍光値にフィットさせ、ＥＣ５０標準／ＥＣ５０試料比によって計算し、参照標準に対するＡＤＣＣ活性の割合として報告した。

測定されたＡＤＣＣ活性レベル、高マンノースグリカン含量及び非フコシル化グリカン含量についてのデータを、統計分析のためのコンピュータープログラムのＪＭＰスイート（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して分析した。アッセイの結果は、抗体Ａについては図９Ａ～９Ｃに示し、抗体Ｂについては図１０Ａ～１０Ｃに示した。

抗体Ａについてのグリカン－ＡＤＣＣ統計モデルを図９Ａ及び９Ｂに示し、ここで、図９Ａは、非フコシル化グリカンのＡＤＣＣレバレッジプロットであり、図９Ｂは、高マンノースグリカンのレバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。ＡＤＣＣ％と抗体Ａについて測定されたグリカンの関係は、式１により記載され得る。
予測ＡＤＣＣ％＝８．７＋（１２．４^＊非フコシル化グリカン％）＋（１２．９^＊高マンノースグリカン％）
［式１］

高マンノース％及び非フコシル化グリカン％の測定値を式１に代入して、各試料についての予測ＡＤＣＣ％値を計算した。実際のＡＤＣＣ％（細胞系アッセイで測定されるとおり）は予測ＡＤＣＣ％（式１によって計算されるとおり）に対してプロットされ、そのプロットは図９Ｃとして提供される。二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、ｒ^２及びｐ－値を含む統計パラメータを図９Ｃに示す。これらの結果は、式１が実際の（測定された）ＡＤＣＣを正確に予測し、非フコシル化グリカン、高マンノースとＡＤＣＣとの間の統計的に有意な直接相関を強調していることを示唆している（ｐ＜０．０００１）。より高いレベルの非フコシル化グリカン及び高マンノースにより、より高いＡＤＣＣ活性がもたらされる。ＡＤＣＣ活性に対する非フコシル化グリカンのレバレッジ及び高マンノースのレバレッジは非常に類似していた（それぞれ１２．４及び１２．９）。

同じ分析を、抗体Ｂ試料についてのデータに適用した。抗体Ｂについてのデータのグリカン－ＡＤＣＣ統計モデルを図１０Ａ及び１０Ｂに示し、ここで、図１０Ａは、非フコシル化グリカンのＡＤＣＣレバレッジプロットであり、図１０Ｂは、高マンノースグリカンのＡＤＣＣレバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。図１０Ａに示すように、非フコシル化グリカン含量と実際のＡＤＣＣレベルとの間のとの関連は統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）が、高マンノースグリカン含量と実際のＡＤＣＣレベルとの間の関連は、有意ではなかった（ｐ＞０．０１）。従って、ＡＤＣＣ％と、抗体Ｂについて測定されたグリカンとの間の関係は、非フコシル化グリカン含量に依存していたが、高マンノース含量に依存していなかった。ＡＤＣＣ％と測定された抗体Ｂの非フコシル化グリカンの関係は、式２により記載され得る。
予測ＡＤＣＣ％＝－８１＋（２１．８^＊非フコシル化グリカン％）＋（２．２^＊高マンノースグリカン％）
［式２］

非フコシル化グリカン％の測定値を式２に代入して、各試料についての予測ＡＤＣＣ％値を計算した。実際のＡＤＣＣ％（細胞系アッセイで測定されてとおり）は予測ＡＤＣＣ％（式２によって計算されるとおり）に対してプロットされ、そのプロットは図１０Ｃとして提供される。二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、ｒ^２及びｐ－値を含む統計パラメータを図１０Ｃに示す。これらの結果は、式２が実際の（測定された）ＡＤＣＣを正確に予測し、非フコシル化グリカンとＡＤＣＣとの間の統計的に有意な相関を強調していることを示唆している（ｐ＜０．０００１）。より高いレベルの非フコシル化グリカンにより、より高いＡＤＣＣ活性がもたらされる。ＡＤＣＣに対する高マンノースの影響は弱く、統計的に有意ではなかった。

式１及び２で詳述したＡＤＣＣレベルに対する非フコシル化グリカン及び高マンノースの影響を、図７で詳述した各抗体の不対非フコシル化グリカンの相対％及び不対高マンノースグリカンの相対％と比較した（表５）。

興味深いことに、表５で裏付けられているように、ＡＤＣＣに対するグリカン含量の影響は、不対グリカンタイプの相対存在量と一致している。抗体Ａの場合、両方の不対グリカンタイプ（不対非フコシル化グリカン及び不対高マンノースグリカン）の相対存在量が比較的高く、両方のグリカンタイプがＡＤＣＣに有意な影響を与えた。抗体Ｂの場合、不対非フコシル化グリカンのみの相対存在量が比較的高く、このタイプのグリカン（非フコシル化グリカン）のみがＡＤＣＣレベルに有意な影響を与えた。これらの結果は、特定の不対グリカン基の相対パーセンテージが高いほど、ＡＤＣＣに対する影響が大きいことと相関していることを示唆している。

これらの結果は、抗体の標的ＡＤＣＣレベルが、抗体の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量によって反映され得ることと、条件を変更して相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノース含量を変更することにより、抗体の標的ＡＤＣＣレベルが変更されることとを示唆している。この不対グリカン組成の調節は、所望の不対非フコシル化及び／又は不対高マンノースグリカン含量を達成するための細胞株の選択及び／又はプロセス条件の選択／調整によって達成することができる。

実施例４
本実施例は、ＡＤＣＣ活性とＦｃγＲＩＩＩａ結合活性を測定する例示的な方法及びそれらの間の相関関係を記載する。

抗体ＢのＦｃγＲＩＩＩａ結合活性は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて定量化した。組換え、精製ＦｃγＲＩＩＩａグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－融合タンパク質を、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）で調製した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイは、ＩｇＧ１ ｍＡｂのＦｃ部分に結合するＦｃγＲＩＩＩａのレベルを測定するために設計された増幅発光近接均一アッセイ（Ａｌｐｈａ）である。アッセイは、２つのビーズ型：アクセプタービーズ及びドナービーズを含んだ。アクセプタービーズは、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ－ＧＳＴに結合するためにグルタチオンでコーティングされていた。ドナービーズは、ビオチン化ヒトＩｇＧ１（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）に結合するためにストレプトアビジンでコーティングされていた。抗体Ｂの非存在下で、ＦｃγＲＩＩＩａはヒトＩｇＧ１に結合する。抗体Ｂが、ビオチン化ヒトＩｇＧ１へのＦｃγＲＩＩＩａの結合を阻害するのに十分な濃度で存在する場合、発光の用量依存性の減少がプレートリーダーを使用して測定される。参照標準と比較したサンプルの結合は、４パラメータのロジスティックモデルフィット（ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して決定された。各試料を３つの独立したアッセイで試験し、所与の試料についての最終の妥当な結果を３回の測定の平均として報告した。結果はパーセント相対結合値として報告された。

抗体Ｂについて実施例３で得られた測定されたＡＤＣＣ活性レベルを、抗体Ｂについて測定されたＦｃγＲＩＩＩａ結合活性に対してプロットし、そのグラフを図１１に示す。この図に示されているように、抗体ＢについてのＡＤＣＣ活性とＦｃγＲＩＩＩａ結合活性との間に良好な相関関係があった。

抗体Ａについて実施例３で得られた測定されたＡＤＣＣ活性レベルを、抗体Ａについて測定されたＦｃγＲＩＩＩａ結合活性に対してもプロットした。しかしながら、抗体ＡについてのＡＤＣＣ活性とＦｃγＲＩＩＩａ結合活性との間に相関関係があるかどうかを結論付けるには、統計的証拠が不十分であった。この統計的所見の欠如は、実行されたアッセイにおける抗体Ａの試料の純度が低いか、又はＦａｂ媒介標的結合活性のばらつきが大きいことが原因である可能性があることが考えられた。いずれの場合にも、ＦｃγＲＩＩＩａ結合活性は、活性のＦｃ媒介部分を代表するＡＤＣＣの代用であると一般に理解されており、更にＦｃγＲＩＩＩａ結合活性自体は生物学的に重要であると理解されるであろう。

これらの結果は、Ｆｃ、従ってグリカンによって媒介される機能活性がＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイによって測定され得ることを裏付けている。

実施例５
本実施例は、インタクト及びミドルダウン質量分析によるＩｇＧ１ Ｆｃグリコシル化ペアリング及びグリコシル化ペアリングのＡＤＣＣ活性との相関関係の研究を実証している。

抗体ＢをＳＥＣ／ＭＳによるインタクト質量分析に供した。簡潔に言えば、試料を塩酸グアニジンの存在下で変性させた後、カラムに注入した。０．１％トリフルオロ酢酸を含む水及びアセトニトリルで構成される移動相システムを使用して、試料を溶出した。次に、溶出ピークを、Ａｇｉｌｅｎｔ ｑＴＯＦ機器を使用して質量分析検出に供した。結果として得られた質量スペクトルをＭａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してデコンボリューションし、結果を図１２に示す。

ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（登録商標）酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を抗体Ｂとともに３７℃で６０分間インキュベートすることによりＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ分析を実施した。この酵素は、ヒンジ上の特定の部位でヒトＩｇＧ１を消化してＦａｂ及びＦｃ抗体断片を作成するシステインプロテアーゼである（図１３）。消化された材料に対してＭＳ検出を伴うクロマト分離を実行して、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を分離した。例示的な結果を図１４Ａに示し、標識されたグリカンペアを有するＦｃ断片のピークの拡大図を図１４Ｂに示す。図１５は、個々のＦｃグリカンペア種の溶出を示す抽出イオンクロマトグラムの例である。

これらの研究から、インタクト質量分析では最も存在量の多いグリカンペアのみを分離できると結論付けられた。ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ分析により、グリカンペアリング情報が得られた。

実施例６
本実施例は、不対非フコシル化グリカンの相対存在量及び不対高マンノースグリカンの相対存在量と関連しているＦｃγＲＩＩＩａ結合活性を実証する。

抗体Ｃは、ＨＥＲ２に結合するモノクローナルＩｇＧ_１抗体である。抗体Ｂ及び抗体Ｃは同じ標的（ＨＥＲ２）に結合するが、その抗体は異なるエピトープに結合する。この研究では、２つの細胞株の異なるクローン（合計５つのクローン）によって産生された抗体Ｃを含む試料を使用した。研究の最初の部分では、基本的に実施例１に記載されるように、各試料についての高マンノースグリカン及び非フコシル化グリカンの総存在量を測定した。抗体Ｃを含む各試料についてのＦｃγＲＩＩＩａ結合活性（％として表される）は、実施例４に記載されるアッセイを使用して決定された。各試料についての不対高マンノースグリカンの相対存在量及び不対非フコシル化グリカンの相対存在量を測定し、基本的に実施例２に記載のように記録した。

結果を表６に示す。各クローンの試料は少なくとも二重に調製され（例えば、試料１Ａ及び１Ｂは両方ともクローン１からのものなど）、４つの試料はクローン２から実行された（試料２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄ）。

抗体Ｃについての第１のグリカン－ＦｃγＲＩＩＩａ結合統計モデルを図１６Ａ及び１６Ｂに示し、ここで、図１６Ａは、非フコシル化グリカンのＦｃγＲＩＩＩａ結合レバレッジプロットであり、図１６Ｂは、高マンノースグリカンのＦｃγＲＩＩＩａ結合レバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線である。各レバレッジプロットの統計的有意性を図１６Ａ及び１６Ｂに示す。各ｐ値が約０．１以上であるため、ＦｃγＲＩＩＩａ結合に対する非フコシル化グリカンの総存在量と高マンノースグリカンの総存在量との間の相関は弱いと考えられた。図１６Ｃとして提供されるプロットに示されるように、相関関係に統計的有意性が欠如しているため、抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩａ結合％と測定された非フコシル化グリカン及び高マンノースグリカンとの間の関係の予測式を導き出すことができなかった。二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、ｒ^２及びｐ－値を含む統計パラメータを図１６Ｃに示す。

抗体Ｃについての第２のグリカン－ＦｃγＲＩＩＩａ結合統計モデルを図１７Ａ及び１７Ｂに示し、ここで、図１７Ａは、不対非フコシル化グリカンの相対存在量のＦｃγＲＩＩＩａ結合レバレッジプロットであり、図１７Ｂは、不対高マンノースグリカンの相対存在量のＦｃγＲＩＩＩａ結合レバレッジプロットである。最良適合線は、網掛け領域の中央にある斜めの実線であり、各レバレッジプロットの統計的有意性を図１７Ａ及び１７Ｂに示す。各ｐ値が０．０５未満であるため、ＦｃγＲＩＩＩａ結合に対する不対非フコシル化グリカンの相対存在量と不対高マンノースグリカンの相対存在量との間の統計的有意性があると考えられた。ＦｃγＲＩＩＩａ結合％と抗体Ｃについての不対非フコシル化の相対存在量及び不対高マンノースグリカンの相対存在量との関係は、式３により記載され得る。
予測ＦｃγＲＩＩＩａ結合％＝－３２．３＋（２８．９^＊不対非フコシル化グリカン％）＋（４０．２^＊不対高マンノースグリカン％）
［式３］

不対非フコシル化％及び不対高マンノースグリカン％についての測定値を式３に適用して、予測ＦｃγＲＩＩＩａ結合％値を各試料について計算した。実際のＦｃγＲＩＩＩａ結合％（アッセイで測定されるとおり）は予測ＦｃγＲＩＩＩａ結合％（式３によって計算されるとおり）に対してプロットされ、そのプロットは図１７Ｃとして提供される。二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、ｒ^２及びｐ－値を含む統計パラメータを図１７Ｃに示す。これらの結果は、式４が実際の（測定された）ＦｃγＲＩＩＩａ結合を統計的に有意に予測していることを裏付けている。より高いレベルの不対非フコシル化グリカン及び不対高マンノースグリカンにより、より高いＦｃγＲＩＩＩａ結合活性がもたらされる。

これらの結果は、抗体の標的ＦｃγＲＩＩＩａ結合レベルが、主に抗体組成物の不対非フコシル化グリカンの相対存在量及び／又は不対高マンノースグリカンの相対存在量によって反映され得ることと、条件を変更して不対非フコシル化グリカンの相対存在量及び／又は不対高マンノースグリカンの相対存在量を変更することにより、抗体の標的ＦｃγＲＩＩＩａ結合レベルが変更されることとを示唆している。

本明細書で引用される刊行物、特許出願及び特許などの全ての参考文献は、それぞれの参考文献が、あたかも個々に及び具体的に参照により本明細書に組み込まれることが示されており、且つ本明細書においてその全体が記載されているかのように同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その」という用語並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」及び「含有する」という用語は、別段の指定がない限り、指定の成分を含むが他の要素を排除しないことを含む、制約のない用語として解釈される（即ち「含むが、限定されない」を意味する）。

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書中で別段の指定がない限り、範囲内にあるそれぞれ別々の値及びそれぞれの終点を個々に言及する速記法としての役割を果たすことが単に意図され、本明細書中であたかも個々に記載されるように、それぞれ別々の値及び終点が本明細書に組み込まれる。

本明細書中で説明されている方法の全ては、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中で提供されるあらゆる例又は代表的な言語（例えば、「など」）の使用は、本開示をより明らかにすることを意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。

本明細書では、本開示の好ましい実施形態が説明されており、例えば本開示を実行するための本発明者らに既知の最良の形態が説明されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読むことで当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、本発明者らは、本明細書中で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図する。従って、本開示は、適用される法により認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。更に、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態で本開示に包含される。

Claims (38)

1. 抗体組成物を製造する方法であって、
   ｉ．前記抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定することと、
   ｉｉ．（ｉ）で決定された前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、下流処理のために前記抗体組成物を選択することと
   を含む方法。
2. 前記試料は、前記抗体組成物の抗体を発現する細胞を含む細胞培養物から採取される、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞培養物の１つ以上の条件を変更して、前記抗体組成物の前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は前記相対不対高マンノースグリカン含量を変更することと、前記変更された細胞培養物の試料の前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は前記相対不対高マンノースグリカン含量を決定することとを更に含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量が標的範囲内になるまで前記変更を繰り返すことを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は前記相対不対高マンノースグリカン含量は、前記抗体組成物の製造に関してリアルタイムで決定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量が標的範囲にある場合、下流処理のために前記抗体組成物を選択することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量は、前記抗体組成物のＡＤＣＣ活性レベルと相関している、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. （ｉ）で決定された前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、前記抗体組成物の前記ＡＤＣＣ活性レベルを決定することを更に含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＡＤＣＣ活性レベルが標的範囲にある場合、下流処理のために前記抗体組成物を選択することを含む、請求項８に記載の方法。
10. 抗体組成物を製造する方法であって、
    ｉ．抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の相対不対高マンノースグリカン含量を決定すること、
    ｉｉ．（ｉ）で決定された前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は前記相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、前記抗体組成物のＡＤＣＣレベルを決定すること、
    ｉｉｉ．（ｉｉ）で決定された前記抗体組成物の前記ＡＤＣＣレベルが標的ＡＤＣＣ範囲内にある場合、下流処理のために前記抗体組成物を選択すること
    を含む方法。
11. 抗体組成物を製造する方法であって、
    ｉ．前記抗体組成物の抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を含む細胞培養物から採取される前記抗体組成物の試料の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を決定すること、
    ｉｉ．任意選択的に、前記細胞培養物を変更して、前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は前記相対不対高マンノースグリカン含量を調節し、且つ前記変更された細胞培養物から採取される前記抗体組成物の試料の前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は前記相対不対高マンノースグリカン含量を決定すること、
    ｉｉｉ．前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量に基づいて、下流処理のために前記抗体組成物を選択すること
    を含む方法。
12. 前記抗体組成物の抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を含む細胞培養物を維持することを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記下流処理は、希釈、濃縮、充填、濾過、製剤化、クロマトグラフィー、ウイルス濾過及び／又はウイルス不活性化の少なくとも１つを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記下流処理は、キャプチャークロマトグラフィー、中間クロマトグラフィー及び／又はポリッシュクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの１つ以上を含む、請求項１４に記載の方法。
16. （ｉ）の前記決定することは、ヒンジ領域のジスルフィド結合のＮ末端側の部位で抗体重鎖を切断して抗体断片を形成する酵素で前記抗体組成物を処理することと、（ｉｉ）クロマトグラフィーによって前記抗体断片を分離することと、（ｉｉｉ）各抗体断片を定量化することとを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記部位は、ＩｇＧ１抗体重鎖の配列ＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）のＴｈｒとＨｉｓとの間又はＬｙｓとＴｈｒとの間にある、請求項１６に記載の方法。
18. 前記抗体断片は、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. （ｉｉ）の前記分離することは、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. （ｉｉｉ）の前記定量化することは、質量分析を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記グリコシル化Ｆｃ断片は、様々なグリカン部分の１つに結合されたＦｃ断片を含み、及び前記方法は、前記結合されたグリカン部分に従ってグリコシル化Ｆｃ断片を分離及び定量化することを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 下流処理のために前記抗体組成物を選択することは、選択された相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は相対不対高マンノースグリカン含量を有する前記抗体組成物を産生するクローンを選択することを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 抗体組成物の相対不対グリカン含量を決定する方法であって、（ｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合のＮ末端側の部位で抗体重鎖を切断して抗体断片を形成する酵素で前記抗体組成物を処理することと、（ｉｉ）クロマトグラフィーによって前記抗体断片を分離することと、（ｉｉｉ）各抗体断片を定量化することとを含む方法。
24. 前記部位は、ＩｇＧ１抗体重鎖の配列ＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）のＴｈｒとＨｉｓとの間又はＬｙｓとＴｈｒとの間にある、請求項２３に記載の方法。
25. 前記抗体断片は、Ｆａｂ断片及びグリコシル化Ｆｃ断片を含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
26. （ｉｉ）の前記分離することは、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. （ｉｉｉ）の前記定量化することは、質量分析を含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記グリコシル化Ｆｃ断片は、様々なグリカン部分の１つに結合されたＦｃ断片を含み、及び前記方法は、前記結合されたグリカン部分に従ってグリコシル化Ｆｃ断片を分離及び定量化することを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン及び／又は相対不対高マンノースグリカンは、定量化される、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更する方法であって、抗体組成物の相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は抗体組成物の相対不対高マンノースグリカン含量を変更することを含む方法。
31. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量を増加させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを増加させることを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記相対不対高マンノースグリカン含量を増加させて、前記ＡＤＣＣ活性のレベルを増加させることを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
33. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量を低減させて、ＡＤＣＣ活性のレベルを低減させることを含む、請求項３０に記載の方法。
34. 前記相対不対高マンノースグリカン含量を低減させて、前記ＡＤＣＣ活性のレベルを低減させることを含む、請求項３０又は３３に記載の方法。
35. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び／又は前記相対不対高マンノースグリカン含量が約１％変更され、及び前記抗体組成物の抗体が抗ＴＮＦ抗体、任意選択的にインフリキシマブである場合、前記ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１１％～約１４％変更される、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記相対不対非フコシル化グリカン含量及び前記相対不対高マンノースグリカン含量の各々が約１％変更され、及び前記抗体組成物の前記抗体が抗ＴＮＦ抗体、任意選択的にインフリキシマブである場合、前記ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１１％～約１４％変更される、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 相対不対非フコシル化グリカン含量の標的範囲が約１％変更され、及び前記抗体が抗ＨＥＲ２抗体、任意選択的にトラスツズマブである場合、前記ＡＤＣＣ活性のレベルは、約１３％～１５％変更される、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法に従って抗体組成物のＡＤＣＣレベルを変更することを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

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