JP2022500371A

JP2022500371A - 抗体依存性細胞介在性細胞傷害の調節方法

Info

Publication number: JP2022500371A
Application number: JP2021512923A
Authority: JP
Inventors: ポロゾバ，アーラ; ジャン，チンチュン; クーンズ，スコット; シェン，ドン
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2022-01-04
Also published as: AU2019339895A1; MX2021002792A; MA53603A; WO2020055900A1; US20220033511A1; CA3110530A1; EP3850006A1

Abstract

本開示は、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を制御する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（２）コンセンサスグリコシル化部位における非フコシル化グリカン種中の末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程を含む。関連した、参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせる方法、並びにグリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の特定の標的ＡＤＣＣ活性を操作する方法が、本明細書においてさらに提供される。

Description

本発明は、一般に、抗体、例えば、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体を含むＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を調節することに関する。

電子ファイルでの提出物の参照による援用
本明細書と同時に提出されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、その全体が参照によって援用され、当該リストは、以下のとおりである：２０１９年９月９日作成の「Ａ−２２４６−ＷＯ−ＰＣＴ＿Ｆｉｎａｌ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿０９０９２０１９．ｔｘｔ」というファイル名の２８．６ＫＢのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に基づく治療法は、癌及び慢性疾患などの様々な疾患を治療するために有効に使用されてきた。これらの抗体の多くは免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のサブクラスのものであり、知られたエフェクター機能活性を有することからよく選択されている。ＩｇＧはｍＡｂのＣＨ２領域の保存されたＡｓｎ残基にＮ結合型グリカンを有する。この部位でのグリコシル化はｍＡｂの標的結合に直接影響しないが、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を含む抗体エフェクター機能に重大な影響を及ぼす可能性がある（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｓａｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｉｍｐｒｏｖｅａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ，２００９．８（３）：ｐ．２２６−３４；Ｎａｔｓｕｍｅ，Ａ．，ｅｔ．ａｌ，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ＥｎｈａｎｃｉｎｇＡＤＣＣａｎｄＣＤＣ．ＤｒｕｇＤｅｓＤｅｖｅｌＴｈｅｒ，２００９．３：ｐ．７−１６を参照）。これらの機能はいくつかのｍＡｂの作用機序（ＭＯＡ）に重要であり得る。したがって、治療用抗体の効力が、特定の製造ロット中に存在する特定のグリカン種のレベル及び種類によって変動し得る潜在的なリスクが存在する。

バイオリアクター制御及びバイオプロセシングにおける最近の進歩にもかかわらず、標準的なｍＡｂ産生プロセスを使用して、明確なグリカン種を有するｍＡｂを生産することは依然として困難である。多くの因子が組み換え抗体に関連するグリカンプロファイルに影響を及ぼす可能性がある。哺乳動物宿主で産生される場合、ｍＡｂに関連するＦｃグリカン構造に内在する不均一性及び複雑性の高さが主な理由の１つである。Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇｇｌｙｃａｎｆｏｒｍｓｏｆｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓＧ１ａｎｄＧ２．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２０１０．４７（１１−１２）：ｐ．２０７４−８２；Ｒｅａｄ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｉｎｄｕｓｔｒｙａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０１１．５８（４）：２１３−９。さらに、ｍＡｂのグリカンプロファイルのバッチ間変動は、プロセシング酵素の存在及び濃度、細胞培地成分、動態パラメーター、糖ヌクレオチド供与体の利用可能性などを含む細胞変化から生じ得る。固有のタンパク質特性もまた、グリカンプロセシングに影響を及ぼし、異なるグリカン構造を生じ得る。Ｄｉｃｋｅｒ，Ｍ．ａｎｄＲ．Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｕｓｉｎｇｇｌｙｃｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｏｄｕｃｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ，２０１５．１５（１０）：ｐ．１５０１−１６。したがって、治療製造の観点からは、免疫細胞が媒介するエフェクター機能に対する様々なグリコフォームの影響についての詳細な研究から得られるべきことが多い。これらの関連するグリカン種の知識の増加は、重要な属性の制御を確実にし、また重要でない属性の範囲における適切な柔軟性を可能にする、属性に焦点を当てた制御戦略を導くために使用され得る。

いくつかの治療用抗体の臨床的有効性の基礎となる重要なエフェクター機構の１つとして、ＡＤＣＣは、標的細胞死をもたらすサイトカイン及び細胞傷害性顆粒の放出を誘発する、免疫細胞上に発現するＦｃγＩＩＩａ受容体への細胞表面抗原抗体複合体の結合に依存する。インビトロでのＡＤＣＣ活性は、標的細胞表面の抗原の密度、抗原−抗体アフィニティー、及びＦｃγＲレセプターへの複合体の結合などのいくつかのパラメーターに依存する。所望の抗体／抗原結合特性を有する標的細胞について、ＡＤＣＣ活性は、ＦｃγＩＩＩａレセプター結合に対する影響のために、ｍＡｂのＦｃ部分のグリコシル化プロファイルに大きく依存する。Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｕｎｉｑｕｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌａｃｋｉｎｇｃｏｒｅｆｕｃｏｓｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１１．１０８（３１）：ｐ．１２６６９−７４；Ｏｋａｚａｋｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＦｕｃｏｓｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｆｒｏｍｈｕｍａｎＩｇＧ１ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｎｈａｎｃｅｓｂｉｎｄｉｎｇｅｎｔｈａｌｐｙａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｒａｔｅｂｅｔｗｅｅｎＩｇＧ１ａｎｄＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２００４．３３６（５）：ｐ．１２３９−４９；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，ＬａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕｍａｎＩｇＧ１Ｎ−ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００２．２７７（３０）：ｐ．２６７３３−４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｆｕｃｏｓｅｂｕｔｎｏｔｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇａｌａｃｔｏｓｅｏｒｂｉｓｅｃｔｉｎｇＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｏｆｈｕｍａｎＩｇＧ１ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｓｈｏｗｓｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｅｎｈａｎｃｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００３．２７８（５）：ｐ．３４６６−７３。したがって、効力に対する潜在的な影響のために、グリコシル化制御は、抗体ベースの生物学的製剤の製造における重要な戦略であるとされている。Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｓａｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｉｍｐｒｏｖｅａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ，２００９．８（３）：ｐ．２２６−３４。様々なタイプのＦｃグリカン構造のＦｃγＲ結合及びＡＤＣＣ活性に及ぼす影響が調べられており、いくつかの重要な関係が確立されている。複合型グリカン上のコアフコースをなくすと（非フコシル化としても知られている）、ｍＡｂとＦｃγＩＩＩａ受容体との結合親和性が高まる傾向があり、ＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｕｎｉｑｕｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌａｃｋｉｎｇｃｏｒｅｆｕｃｏｓｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１１．１０８（３１）：ｐ．１２６６９−７４；Ｏｋａｚａｋｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＦｕｃｏｓｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｆｒｏｍｈｕｍａｎＩｇＧ１ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｎｈａｎｃｅｓｂｉｎｄｉｎｇｅｎｔｈａｌｐｙａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｒａｔｅｂｅｔｗｅｅｎＩｇＧ１ａｎｄＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２００４．３３６（５）：ｐ．１２３９−４９；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，ＬａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕｍａｎＩｇＧ１Ｎ−ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００２．２７７（３０）：ｐ．２６７３３−４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｆｕｃｏｓｅｂｕｔｎｏｔｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇａｌａｃｔｏｓｅｏｒｂｉｓｅｃｔｉｎｇＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｏｆｈｕｍａｎＩｇＧ１ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｓｈｏｗｓｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｅｎｈａｎｃｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００３．２７８（５）：ｐ．３４６６−７３。コアフコースを本来欠く高マンノースグリカンもまた、ＡＤＣＣ活性を高めることが示されており（Ｋａｎｄａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｍｏｎｇｎｏｎｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＩｇＧ１ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔＮ−ｌｉｎｋｅｄＦｃｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｔｈｅｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ，ｈｙｂｒｉｄ，ａｎｄｃｏｍｐｌｅｘｔｙｐｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７．１７（１）：ｐ．１０４−１８；Ｐａｃｅ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅＦｃｇｌｙｃａｎａｔｔｒｉｂｕｔｅｓｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎＩｇＧ１ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２０１６．３２（５）：ｐ．１１８１−１１９２；Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｉｍｐｌｅａｎｄｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄｏｌｉｇｏｍａｎｎｏｓｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，２００８．９９（３）：ｐ．６５２−６５）、一方、末端のシアル化は、ＦｃγＩＩＩａ受容体への抗体の結合を減少させ、ＡＤＣＣの活性を減少させることが確認されている（Ｋａｎｅｋｏ，Ｙ．，Ｆ．ｅｔａｌ，Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍＦｃｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６．３１３（５７８７）：ｐ．６７０−３；Ｓｃａｌｌｏｎ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＨｉｇｈｅｒｌｅｖｅｌｓｏｆｓｉａｌｙｌａｔｅｄＦｃｇｌｙｃａｎｓｉｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｍｏｌｅｃｕｌｅｓｃａｎａｄｖｅｒｓｅｌｙｉｍｐａｃｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２００７．４４（７）：ｐ．１５２４−３４）。

Ｆｃグリカンの末端ガラクトシル化のＡＤＣＣに対する影響を理解することは、依然として活発に行われている研究の領域である。いくつかの研究は、末端ガラクトースがｍＡｂのＦｃγＩＩＩａへの結合及びＡＤＣＣ活性に影響を及ぼさないことを示唆しており（Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｆｕｃｏｓｅｂｕｔｎｏｔｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇａｌａｃｔｏｓｅｏｒｂｉｓｅｃｔｉｎｇＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｏｆｈｕｍａｎＩｇＧ１ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｓｈｏｗｓｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｅｎｈａｎｃｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００３．２７８（５）：ｐ．３４６６−７３；Ｂｏｙｄ，Ｐ．Ｎ．，ｅｔａｌ，Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒｅｍｏｖａｌｏｆｓｉａｌｉｃａｃｉｄ，ｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，１９９５．３２（１７−１８）：ｐ．１３１１−８；Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ，ＣｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｂｙＦｃＮ−ｇｌｙｃａｎｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２００５．２１（６）：ｐ．１６４４−５２；Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，ＴｅｒｍｉｎａｌｓｕｇａｒｓｏｆＦｃｇｌｙｃａｎｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅａｎｔｉｂｏｄｙｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＩｇＧｓ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２００８．２０（４）：ｐ．４７１−８）、一方、他の研究では、Ｆｃガラクトシル化がそのような活性に正の影響を及ぼし得ることが示されている（Ｋｕｍｐｅｌ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＩｇＧａｎｔｉ−Ｄｉｓｒｅｄｕｃｅｄｂｙｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＨｕｍＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ，１９９５．６（３）：ｐ．８２−８；Ｔｈｏｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｆｃ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｏｄｕｌａｔｅｓａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２０１６．７３：ｐ．６９−７５；Ｔｈｏｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＩｎｖｉｔｒｏｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＩｇＧ１ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎＦｃｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇａｎｄＡＤＣＣａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１５．１０（８）：ｐ．ｅ０１３４９４９；Ｈｏｕｄｅ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙａｆｆｅｃｔＩｇＧ１ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１０．９（８）：ｐ．１７１６−２８）。ガラクトシル化とｍＡｂのＡＤＣＣ活性との関係を深く理解することは、所望の治療特性を有する治療用ｍＡｂを設計し製造する機会、制御戦略を最適化する機会を提供する。

Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｓａｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｉｍｐｒｏｖｅａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ，２００９．８（３）：ｐ．２２６−３４Ｎａｔｓｕｍｅ，Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ＥｎｈａｎｃｉｎｇＡＤＣＣａｎｄＣＤＣ．ＤｒｕｇＤｅｓＤｅｖｅｌＴｈｅｒ，２００９．３：ｐ．７−１６Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇｇｌｙｃａｎｆｏｒｍｓｏｆｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓＧ１ａｎｄＧ２．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２０１０．４７（１１−１２）：ｐ．２０７４−８２Ｒｅａｄ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｉｎｄｕｓｔｒｙａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０１１．５８（４）：ｐ．２１３−９Ｄｉｃｋｅｒ，Ｍ．ａｎｄＲ．Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｕｓｉｎｇｇｌｙｃｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｏｄｕｃｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ，２０１５．１５（１０）：ｐ．１５０１−１６Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｕｎｉｑｕｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌａｃｋｉｎｇｃｏｒｅｆｕｃｏｓｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１１．１０８（３１）：ｐ．１２６６９−７４Ｏｋａｚａｋｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＦｕｃｏｓｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｆｒｏｍｈｕｍａｎＩｇＧ１ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｎｈａｎｃｅｓｂｉｎｄｉｎｇｅｎｔｈａｌｐｙａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｒａｔｅｂｅｔｗｅｅｎＩｇＧ１ａｎｄＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２００４．３３６（５）：ｐ．１２３９−４９Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，ＬａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕｍａｎＩｇＧ１Ｎ−ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００２．２７７（３０）：ｐ．２６７３３−４０Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｆｕｃｏｓｅｂｕｔｎｏｔｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇａｌａｃｔｏｓｅｏｒｂｉｓｅｃｔｉｎｇＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｏｆｈｕｍａｎＩｇＧ１ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｓｈｏｗｓｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｅｎｈａｎｃｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００３．２７８（５）：ｐ．３４６６−７３Ｋａｎｄａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｍｏｎｇｎｏｎｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＩｇＧ１ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔＮ−ｌｉｎｋｅｄＦｃｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｔｈｅｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ，ｈｙｂｒｉｄ，ａｎｄｃｏｍｐｌｅｘｔｙｐｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７．１７（１）：ｐ．１０４−１８Ｐａｃｅ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅＦｃｇｌｙｃａｎａｔｔｒｉｂｕｔｅｓｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎＩｇＧ１ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２０１６．３２（５）：ｐ．１１８１−１１９２Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｉｍｐｌｅａｎｄｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄｏｌｉｇｏｍａｎｎｏｓｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，２００８．９９（３）：ｐ．６５２−６５Ｋａｎｅｋｏ，Ｙ．，Ｆ．ｅｔａｌ．，Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍＦｃｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６．３１３（５７８７）：ｐ．６７０−３Ｓｃａｌｌｏｎ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＨｉｇｈｅｒｌｅｖｅｌｓｏｆｓｉａｌｙｌａｔｅｄＦｃｇｌｙｃａｎｓｉｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｍｏｌｅｃｕｌｅｓｃａｎａｄｖｅｒｓｅｌｙｉｍｐａｃｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２００７．４４（７）：ｐ．１５２４−３４Ｂｏｙｄ，Ｐ．Ｎ．，ｅｔａｌ，Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒｅｍｏｖａｌｏｆｓｉａｌｉｃａｃｉｄ，ｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，１９９５．３２（１７−１８）：ｐ．１３１１−８Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ，ＣｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｂｙＦｃＮ−ｇｌｙｃａｎｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２００５．２１（６）：ｐ．１６４４−５２Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，ＴｅｒｍｉｎａｌｓｕｇａｒｓｏｆＦｃｇｌｙｃａｎｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅａｎｔｉｂｏｄｙｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＩｇＧｓ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２００８．２０（４）：ｐ．４７１−８Ｋｕｍｐｅｌ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＩｇＧａｎｔｉ−Ｄｉｓｒｅｄｕｃｅｄｂｙｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＨｕｍＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ，１９９５．６（３）：ｐ．８２−８Ｔｈｏｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｆｃ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｏｄｕｌａｔｅｓａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２０１６．７３：ｐ．６９−７５Ｔｈｏｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＩｎｖｉｔｒｏｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＩｇＧ１ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎＦｃｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇａｎｄＡＤＣＣａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１５．１０（８）：ｐ．ｅ０１３４９４９Ｈｏｕｄｅ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙａｆｆｅｃｔＩｇＧ１ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１０．９（８）：ｐ．１７１６−２８

本明細書においては、末端β−ガラクトースが、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性に有意な影響を及ぼすことを示す。したがって、本開示は、末端β−ガラクトースを調節する（すなわち、増加又は減少させる）（例えば、ガラクトシル化グリカンを濃縮、増加、除去、及び／又はリモデリングすることを含む）ことによって、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を調節する（すなわち、増加又は減少させる）方法（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（例えば、トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）を含む組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる方法を含む）を提供する。例示的な実施形態では、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）を含む組成物など）のＡＤＣＣ活性を調節する方法は、組成物内の１つ以上のＩｇＧ１抗体上の末端ガラクトースの量を調節する（例えば、組成物内の１つ以上のＩｇＧ１抗体上の末端ガラクトースの量を増加させてＡＤＣＣ活性を増加させる、又は組成物内の１つ以上のＩｇＧ１抗体上の末端ガラクトースの量を減少させてＡＤＣＣ活性を減少させる）ことを含む。

例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性を調節する方法は、抗体組成物の非フコシル化、ガラクトシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）の量又は割合を調節することを含む。例示的な態様では、本明細書で提供される方法は、抗体組成物の非フコシル化、ガラクトシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）の量又は割合を増加させることによって、ＡＤＣＣ活性を増加させる。代替の例示的な態様では、本明細書で提供される方法は、抗体組成物の非フコシル化、ガラクトシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）の量又は割合を減少させることによって、ＡＤＣＣ活性を減少させる。

本開示は、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）を含む抗体組成物のＡＤＣＣ活性を制御、調整又は維持する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）を含む組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（２）組成物内の１つ以上の抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程を含む。

本開示はまた、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）を含む参照組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせる方法を提供する。例示的な実施形態では、この方法は、（１）参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；（２）参照ＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有するＩｇＧ１抗体を含む第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（３）第２の抗体組成物内の１つ以上の抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させることによって、第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を変化させる工程を含み、末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、参照ＩｇＧ１抗体組成物と同じであるか、又は参照ＩｇＧ１抗体組成物の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は参照ＩｇＧ１抗体組成物の約１％〜約５０％以内である。いくつかの実施形態では、工程１（「参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）は、工程２（「参照ＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有するＩｇＧ１抗体を含む第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）及び／又は工程３（「…第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を変化させる」）の前、後又は同時に行われる。

また、本開示によって、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）を含む組成物の特定の目標ＡＤＣＣ活性を操作する方法が提供される。例示的な実施形態では、方法は、（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体を含む組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＣ活性を決定する方法；及び（３）組成物内の１つ以上の抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程を含み、末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、目標ＡＤＣＣ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＣ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は目標ＡＤＣＣ活性の約１％〜約５０％以内である。いくつかの実施形態では、工程２（「目標ＡＤＣＣ活性を決定する」）は、工程１（「グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体を含む組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）及び／又は工程３（「…ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる」）の前、後又は同時に行われる。いくつかの他の実施形態では、工程１（「グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体を含む組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＣ活性を決定する」）及び／又は工程３（「…ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる」）の前、後又は同時に行われる。

図１は、哺乳動物タンパク質に一般に見出される３つの主要な型のＮ−グリカン（オリゴマンノース型、複合型及びハイブリッド型）、及びこのようなグリカンに対し一般に使用されている記号を示す図である。ＣＨＯ産生モノクローナルＩｇＧ抗体では、末端シアル酸のレベルは通常低く、末端ガラクトース、ＧｌｃＮａｃ又はマンノースを有するオリゴ糖がより一般的である。図２は、主要なグリカン群分類の概略図である。各群に示すグリカン構造は完全に包括したものではなく、すなわち、ＣＨＯ発現ＩｇＧに通常見られる、代表的構造に過ぎない。図３Ａは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合部位と複合体化したｌｇＧ１Ｆｃ領域の結晶構造を示す図である（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓｔｏＣｅｌｌｓ（２０１１）１６，１０７１−１０８０から）。図３Ｂは、非フコシル化ガラクトシル化グリカン種のより最適で且つより高い親和性結合を示す構造的仮説の図である。図４Ａ及び４Ｂは、非フコシル化ガラクトシル化種及び非フコシル化非ガラクトシル化種の組み合わせの寄与に基づくグリカン−ＡＤＣＣモデルを示すグラフである。図４Ａはモデル適合の評価であり、図４Ｂは個々の構成要素の寄与（力）を示すグラフである。図４Ｃは、非フコシル化ガラクトシル化グリカン群及び非フコシル化非ガラクトシル化グリカン群の組み合わせの寄与によってサポートされるＡＤＣＣ目標範囲の例を示す。図５は、フコース代謝のサルベージ経路及びデノボ経路の図である。サルベージ経路において、遊離Ｌ−フコースはＧＤＰ−フコースに変換されるが、デノボ経路においては、ＧＤＰ−フコースは、ＧＭＤ及びＦＸにより触媒される３つの反応を介して合成される。次に、ＧＤＰ−フコースは、ＧＤＰ−Ｆｕｃトランスフェラーゼによって細胞質基質からゴルジ内腔に輸送され、アクセプターオリゴ糖及びタンパク質へ移される。他の反応産物であるＧＤＰは、内腔のヌクレオチドジホスファターゼによって、グアノシン５−一リン酸（ＧＭＰ）及び無機リン酸（Ｐｉ）に変換される。前者は、（ＧＤＰ−フコースの輸送と共役される対向輸送系を介して）細胞質基質に排出されるが、後者は、ゴルジアニオンチャネルであるＧＯＬＡＣを介してゴルジ内腔を離れると想定される。例えば、Ｎｏｒｄｅｅｎｅｔａｌ．２０００；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇｅｔａｌ．２００１を参照されたい。図６は、（Ａ）抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ）（「ｍＡｂ１」）、（Ｂ）抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体（リツキシマブ）（「ｍＡｂ２」）及び（Ｃ）抗ＴＮＦαＩｇＧ１抗体（インフリキシマブ）（「ｍＡｂ３」）のＡＤＣＣ活性に対する総ガラクトシル化の影響を示す。３つの抗体全ての原薬のインビトロでの酵素によるリモデリングを行って、広範囲にわたる様々なレベルのガラクトシル化ｍＡｂを有する試料を作製したが、非フコシル化（Ａｆｕｃ％）及び高マンノース（ＨＭ％）などの他のグリカン属性は個々の各ｍＡｂで一定に保った。図６Ａは、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ）組成物のＧａｌ％の関数としてプロットされた相対ＡＤＣＣ活性（％）のグラフであり、グラフの下の表に、トラスツズマブ抗体組成物のグリカンプロファイルを記載する。図６Ｂは、抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体（リツキシマブ）組成物のＧａｌ％の関数としてプロットされた相対ＡＤＣＣ活性（％）のグラフであり、グラフの下の表に、リツキシマブ抗体組成物のグリカンプロファイルを記載する。図６Ｃは、抗ＴＮＦαＩｇＧ１抗体（インフリキシマブ）組成物のＧａｌ％の関数としてプロットされた相対ＡＤＣＣ活性（％）のグラフであり、グラフの下の表に、インフリキシマブ抗体組成物のグリカンプロファイルを記載する。図７は、様々なレベルの末端ガラクトースを有する（Ａ）抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ）（「ｍＡｂ１」）及び（Ｂ）抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体（リツキシマブ）（「ｍＡｂ２」）に対する抗原結合活性を示す。ここで示す相対活性は、各ｍＡｂについて最も低いガラクトースレベルを有する試料の活性に対して正規化された。図７Ａは、１％Ｇａｌ、５２％Ｇａｌ又は９１％Ｇａｌを含むトラスツズマブ抗体組成物についてプロットされた相対標的結合（％）のグラフである。図７Ｂは、０％Ｇａｌ、５３％Ｇａｌ又は８９％Ｇａｌを含むリツキシマブ抗体組成物についてプロットされた相対標的結合（％）のグラフである。図８は、非フコシル化グリカン構造を有するｍＡｂに対するガラクトシル化の影響を研究するための、Ｇ０Ｆ、Ｇ１及びＧ０濃縮種を有する抗体を生成するためのインビトログリカン濃縮ワークフローを示す図である。ＦｃγＩＩＩａ受容体アフィニティークロマトグラフィーを用いて、フコシル化種を非フコシル化及び高マンノース種から分離した。フコシル化画分中のガラクトースを、ガラクトシダーゼを用いて除去して、優勢グリコフォームとしてＧ０Ｆを有するｍＡｂを生成した。非フコシル化種は、最初にＦｃγＩＩＩａ受容体カラムからの溶出画分中の高マンノースをエンド−Ｈ処理で除去し、続いて、ガラクトシダーゼで処理して、非フコシル化Ｇ０及びＧ１試料を生成することによって、さらに濃縮した。ｍＡｂのインタクト質量分析を行い、各ステップを注意深くモニターし、濃縮材料の特性をさらに明らかにした。図９は、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ）のＡＤＣＣ活性に対する非フコシル化グリカンと結合した末端Ｇａｌの効果を示す。図９Ａは、Ｇ０Ｆ濃縮、Ｇ０濃縮及びＧ１濃縮試料中のＧ０及びＧ１種の割合を記載した表、並びに、表下の、Ｇ０Ｆ、Ｇ０及びＧ２グリカンの構造を概略的に描いた図である。図９Ｂは、初期原薬（「ＤＳ」）、Ｇ０Ｆ、Ｇ０系（Ｇ０−１、Ｇ０−２及びＧ０−３）及びＧ１系（Ｇ１−１、Ｇ１−２及びＧ１−３）試料の相対ＡＤＣＣ活性（％）を示すグラフである。灰色のバーはＧ０系試料のＡＤＣＣ活性を表し、一方、パターンのあるバーは、Ｇ１系試料のＡＤＣＣ活性を表す。出発物質ＤＳ及び濃縮Ｇ０Ｆは、２つの対照（黒色のバー）である。図９Ｃは、トラスツズマブについてのＧ０（％）（上）又はＧ１（％）（下）の関数としての相対ＡＤＣＣ活性（％）を示す一対のグラフである。ＡＤＣＣに対するＧ０の影響（図９Ｃの上のパネル）は、Ｇ０が主要な非フコシル化種であるので、Ｇ０系試料から容易に得られた。Ｇ１の影響は、図９Ｃの上のパネルからのＧ０影響係数に基づいて、Ｇ１系からＧ０寄与分を除去することによって算出した。図１０は、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ）のＡＤＣＣ活性に対する全非フコシル化の影響の実験的測定を示す。非フコシル化Ｇ１種及び非フコシル化Ｇ０種の両方を含有するトラスツズマブＤＳロットを、Ｅｎｄｏ−Ｈで処理し、続いて、アフィニティークロマトグラフィーにより非フコシル化ｍＡｂを濃縮した。非フコース濃縮トラスツズマブをＧ０Ｆ濃縮トラスツズマブと種々の比率でブレンドし、続いて、ＡＤＣＣ活性を測定して、ＡＤＣＣ活性に対する両種の全体的な影響を評価した。図１０は、非フコシル化グリカン（％）の関数としての相対ＡＤＣＣ活性（％）を示すグラフである。図１１は、抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体（リツキシマブ）のＡＤＣＣ活性に対する非フコシル化グリカンと結合した末端Ｇａｌの効果を示す。図１１Ａは、初期原薬（「ＤＳ」）、Ｇ０Ｆ、Ｇ０系（Ｇ０−１、Ｇ０−２及びＧ０−３）及びＧ１シリーズ（Ｇ１−１、Ｇ１−２及びＧ１−３）試料の相対ＡＤＣＣ活性（％）を示すグラフである。灰色のバーはＧ０系試料のＡＤＣＣ活性を表し、一方、パターンのあるバーは、Ｇ１系試料のＡＤＣＣ活性を表す。出発物質ＤＳ及び濃縮Ｇ０Ｆは、２つの対照（黒色のバー）である。グラフの下は、各試料又は試料系におけるグリカン種の量を記載した表である。図１１Ｂは、リツキシマブについてのＧ０％（上）及びＧ１％（下）とＡＤＣＣ活性との相関を示す一対のグラフである。ＡＤＣＣに対するＧ０の影響（図１１Ｂの上のパネル）は、Ｇ０が主要な非フコシル化種であるので、Ｇ０系試料から容易に得られた。Ｇ１の影響は、図１１Ｂの上のパネルからのＧ０影響係数に基づいて、Ｇ１系からＧ０寄与分を除去することによって算出した。図１２は、（Ａ）抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ）（「ｍＡｂ１」）及び（Ｂ）抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体（リツキシマブ）（「ｍＡｂ２」）のＡＤＣＣ活性に対するフコシル化グリカンと結合した末端Ｇａｌの効果を示す。フコシル化トラスツズマブ及びフコシル化リツキシマブにおけるＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響の評価は、図８（左）に記載されるように、各ｍＡｂについてＧ０Ｆ濃縮試料を作製し、続いて、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼで酵素によるリモデリングを行うことによってなされた。図１２Ａは、トラスツズマブを含有する試料中のＧａｌ（％）の関数としての相対ＡＤＣＣ活性（％）を示すグラフであり、図１２Ｂは、リツキシマブを含有する試料中のＧａｌ（％）の関数としての相対ＡＤＣＣ活性（％）を示すグラフである。

本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。発明を実施するための形態を通して、さらなる定義を記載する。

「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、並びに類似の指示対象は、本明細書で使用する場合、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に指定がない限り、開放型用語として解釈されるべきである（すなわち、「包含するが、これに限定されない」を意味し、１つ以上の特徴又は構成要素の存在を許容する）。「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）という用語、並びに「１つ以上の（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」及び「少なくとも１つの（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。さらに、「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として（他の特徴又は構成要素の有無にかかわらず）解釈されるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／又はＢ」などの句で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を包含するものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含するものとする：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。

明細書及び特許請求の範囲を通して数値又は範囲に関連して使用される「約」という用語は、当業者によく知られ、且つ受け入れられる精度の間隔を示す。一般に、このような精度の間隔は±１０％である。

他に定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、ＣｏｎｃｉｓｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄｅｄ．，２００２，ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＴｈｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，１９９９，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般辞書を当業者に提供する。一般に、本明細書に記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、タンパク質グリコシル化、抗体産生及び抗体精製に関連して使用される命名法、並びにそれらの技術は、当該技術分野でよく知られ、またよく使用されているものである。組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換、タンパク質精製、抗体生成などに標準的手法を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書にしたがって、又は当該技術分野において一般的に達成されるように若しくは本明細書に記載されるように実施することができる。以下の手順及び手法は、当該技術分野においてよく知られている従来の方法にしたがって、また明細書全体を通して引用され論じられている様々な一般的で且つより具体的な参考文献に記載されるように概ね実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ｃｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。この文献はいかなる目的に対しても参照により本明細書に組み込まれる。

単位、接頭辞及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で示される。数値範囲は、範囲を規定する数値を含む。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシへの向きで書かれている。本明細書で示される見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、それは本明細書全体を参照することによって有することができる。

翻訳後のグリコシル化
多くの分泌タンパク質が翻訳後グリコシル化され、この過程により、糖部分（例えば、グリカン、糖類）がタンパク質の特定のアミノ酸に共有結合される。真核細胞においては、次の２種類のグリコシル化反応が起こる：（１）グリカンが認識配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（ここで、「Ｘ」はプロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギンに連結されるＮ結合型グリコシル化、及び（２）グリカンがセリン又はスレオニンに連結されるＯ結合型グリコシル化。グリコシル化のタイプ（Ｎ結合型又はＯ結合型）にかかわらず、各部位（Ｏ又はＮ）と結合されるグリカン構造は広範囲にわたるため、タンパク質グリコフォームには微小不均一性がある。

全てのＮ−グリカンは、共通のコア糖配列：Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ａｓｎ）を有し、次の３つのタイプのうちの１つに分類される：（Ａ）２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分及び多数（例えば、４、５、６、７、８若しくは９個）のマンノース（Ｍａｎ）残基からなる高マンノース（ＨＭ）若しくはオリゴマンノース（ＯＭ）型、（Ｂ）３個以上のＧｌｃＮＡｃ部分及び任意の数の他の糖タイプを含む複合型、又は（Ｃ）分枝の一方にＭａｎ残基を、複合枝の基部にＧｌｃＮＡｃを含むハイブリッド型。図１Ａ（Ｓｔａｎｌｅｙｅｔａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ８：Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ，ＥｓｓｅｎｔｉａｌｓｏｆＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２^ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；２００９から得た）は、Ｎ−グリカンの３つのタイプを示す。

Ｎ結合型グリカンは、通常、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、フコース（Ｆｕｃ）の１つ以上の単糖を含む。このような糖類に対し一般的に使用されている記号を、図１に示す。

Ｎ結合型グリコシル化は小胞体（ＥＲ）において開始され、複雑な一連の反応の結果、２個のＧｌｃＮＡｃ単位及び３個のＭａｎ単位からなるコアグリカン構造の連結が起こる。さらなるプロセシングの際に、さらなるＭａｎ単位がコアグリカン構造に付加され、高マンノース（ＨＭ）構造が得られる。ＥＲにおいて形成されたグリカン複合体は、ゴルジ装置において酵素の作用により修飾される。オリゴ糖が酵素に比較的接近しにくいか、又は酵素が存在しないか、又は酵素が活性でない場合、オリゴ糖は元のＨＭ形態のままである。活性酵素がオリゴ糖に接近し得る場合、非コアＭａｎ残基は切断され、糖類はさらに修飾され、その結果、複合型のＮ−グリカン構造が生じる。例えば、ｃｉｓ−ゴルジに位置するマンノシダーゼ−１は、ＨＭグリカンを切断又は加水分解し得、一方、メディアル−ゴルジに位置するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ−８はグリカンをフコシル化する（ＨａｒｕｅＩｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ（２００７），ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：８４）。

したがって、グリカン構造の糖組成及び構造立体配置は、とりわけ、ＥＲ及びゴルジ装置におけるグリコシル化機構、その機構の酵素のグリカン構造への到達性、各酵素の作用の順序及びタンパク質がグリコシル化機構から放出される段階に依って変動する。

Ｆｃドメインに結合するグリカン構造はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを媒介するＦｃγＲとの相互作用、並びにＣＤＣに導く最初の結合事象であるＣ１ｑ結合との相互作用に影響を及ぼすので、グリカン構造を制御することは、治療用モノクローナル抗体の組み換え産生において重要である。

ＡＤＣＣは、いくつかの治療的ＩｇＧ１抗体の臨床的有効性の基礎となる潜在的に重要なエフェクター機能の１つであると確認されている。Ｆｃ領域上の高レベルの非フコシル化Ｎ結合型グリカン構造がＦｃγＩＩＩａ受容体に対するＩｇＧ結合親和性を増強し、ＡＤＣＣ活性の増加をもたらすことが十分に確立されている。しかしながら、非フコシル化ＩｇＧ１を含むＩｇＧ１の末端ガラクトシル化がＡＤＣＣ活性に影響するかどうかは明らかではない。

ここでは、グリカン組成物とＡＤＣＣ機能との間の関係を分析するために、様々な範囲のＡＤＣＣを有するＩｇＧ１組成物中の活性種を確認する戦略を用いた。本明細書に提示した結果は、インビトロＡＤＣＣ活性に対する末端β−ガラクトースの影響の程度が、通常Ｎ−結合型グリコシル化コア構造の最初のＮ−アセチルグルコサミン残基に結合しているコアフコースの非存在に依存することを示している。さらに、治療用ＩｇＧ１組成物のＡＤＣＣ活性に対する末端β−ガラクトースの影響を確認するために、グリカンの濃縮及びブレンドの研究を実施し、その結果は、グリカン組成物−ＡＤＣＣモデリング観察と一致した。具体的には、非フコシル化ｍＡｂの末端β−ガラクトースはＡＤＣＣ活性を増強したが、フコシル化グリカン構造の活性には影響しなかった。ここで得られた知見は、有効性のためにエフェクター機能を必要とする生物学的治療用抗体の製品及びプロセスの開発活動を導くために使用することができるだけでなく、抗体のＮ結合型グリコシル化による免疫応答の調節における複雑さのレベルを強調する。

したがって、本開示は、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ又はインフリキシマブを含む、）のＡＤＣＣ活性に対する末端β−ガラクトースの影響を記載し、したがって、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を、組成物内の末端β−ガラクトースを調節する（すなわち、増加又は減少させる）（例えば、ガラクトシル化グリカンを濃縮、増加、除去及び／又はリモデリングすることを含む）ことによって調節する（すなわち、増加又は減少させる）方法（抗ＨＥＲ２抗体組成物、抗ＴＮＦα抗体組成物又は抗ＣＤ２０抗体組成物（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含有するものを含む）のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる方法を含む）を提供する。本開示はまた、ＩｇＧ１抗体組成物（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む））によって誘発又は刺激されるＡＤＣＣ活性を調節する方法であって、抗体組成物内のガラクトシル化グリコフォーム、非フコシル化グリコフォーム又はそれらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化グリコフォーム）の量を調節する（すなわち、増加又は減少させる）ことを含む方法を提供する。例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体組成物（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）内のガラクトシル化グリコフォーム、非フコシル化グリコフォーム又はそれらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化グリコフォーム）の量を増加させることにより、抗体組成物のＡＤＣＣ活性が増加し、一方、ＩｇＧ１抗体組成物（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）内のガラクトシル化グリコフォーム、非フコシル化グリコフォーム又はそれらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化グリコフォーム）の量を減少させることにより、抗体組成物のＡＤＣＣ活性が減少する。

例示的な実施形態では、ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性を調節する方法は、ＩｇＧ１抗体の末端β−ガラクトースの存在又は非存在を調節する、例えば、ＩｇＧ１抗体に末端β−ガラクトースを付加してＡＤＣＣ活性を増加させる、又はＩｇＧ１抗体の末端β−ガラクトースを除去してＡＤＣＣ活性を減少させることを含む。例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は非フコシル化されている。したがって、例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性を調節する方法は、非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）に末端βガラクトースを付加して、そのＡＤＣＣ活性を増加させる、或いは非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）から末端βガラクトースを除去して、そのＡＤＣＣ活性を減少させることを含む。

例示的な実施形態では、ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）を含む組成物のＡＤＣＣ活性を調節する方法は、非フコシル化抗体組成物のガラクトシル化グリコフォームの量を調節する、例えば、組成物中の非フコシル化抗体のガラクトシル化グリコフォームの量を増加させて抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加させる、又は組成物中の非フコシル化抗体のガラクトシル化グリコフォームの量を減少させて抗体組成物のＡＤＣＣ活性を減少させることを含む。

例示的な実施形態では、ＡＤＣＣ活性を調節する方法は、抗体組成物の非フコシル化、ガラクトシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）の量又は割合を調節することを含む。例示的な態様では、方法は、非フコシル化、ガラクトシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）の量又は割合を増加させることによって、ＡＤＣＣ活性を増加させる。代替の例示的な態様では、方法は、抗体組成物の非フコシル化、ガラクトシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）の量又は割合を減少させることによって、ＡＤＣＣ活性を減少させる。

本開示は、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を制御し、調節し又は維持する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（２）組成物内の非フコシル化ＩｇＧ１抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量又は割合を増加又は減少させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程を含む。

本開示はまた、参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせる方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（１）参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；（２）参照ＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有する抗体を含む第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（３）第２の組成物内の非フコシル化ＩｇＧ１抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量又は割合を増加又は減少させることによって、第２の組成物のＡＤＣＣ活性を変化させる工程を含み、末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の第２の組成物のＡＤＣＣ活性は、参照ＩｇＧ１抗体組成物と同じであるか、又は参照ＩｇＧ１抗体組成物の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は参照ＩｇＧ１抗体組成物の約１％〜約５０％以内である。いくつかの実施形態では、工程１（「参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）は、工程２（「参照ＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有する抗体を含む第２の組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）及び／又は工程３（「…第２の組成物のＡＤＣＣ活性を変化させる」）の前、後又は同時に行われる。

また、本開示によって、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の特定の目標ＡＤＣＣ活性を操作する方法が提供される。例示的な実施形態では、方法は、（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（３）組成物内の非フコシル化ＩｇＧ１抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量又は割合を増加又は減少させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程を含み、末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、目標ＡＤＣＣ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＣ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は目標ＡＤＣＣ活性の約１％〜約５０％以内である。いくつかの実施形態では、工程２（「目標ＡＤＣＣ活性を決定する」）は、工程１（「グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）及び／又は工程３（「…ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる」）の前、後又は同時に行われる。いくつかの他の実施形態では、工程１（「グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＣ活性を決定する」）及び／又は工程３（「…ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる」）の前、後又は同時に行われる。

「抗体依存性細胞介在性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」という用語は、免疫系のエフェクター細胞、主としてナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が、膜表面抗原に特定の抗体が結合している標的細胞を活発に溶解する機構を指す。ＡＤＣＣは適応免疫反応の一部であり、抗原特異的抗体が（１）その抗原結合領域を介して標的細胞の膜表面抗原に結合し、且つ（２）そのＦｃ領域を介してエフェクター細胞表面のＦｃ受容体、主にＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に結合したときに生じる。抗体のＦｃ領域のＦｃ受容体への結合は、エフェクター細胞に、（例えば、細胞溶解又は細胞脱顆粒を介して）標的細胞の死をもたらす細胞傷害性因子を放出させる。

Ｆｃ受容体は、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、肥満細胞の表面にあるレセプターで、抗体のＦｃ領域に結合する。Ｆｃ受容体は、それらが結合する抗体のタイプに基づいて異なるクラスに分類される。例えば、Ｆｃガンマ受容体はＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する受容体であり、Ｆｃアルファ受容体はＩｇＡ抗体のＦｃ領域に対する受容体であり、Ｆｃイプシロン受容体はＩｇＥ抗体のＦｃ領域に対する受容体である。

「ＦｃγＲ」又は「Ｆｃガンマ受容体」という用語は、オプソニン化された細胞又は微生物の食作用の誘導に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質である。例えば、ＦｒｉｄｍａｎＷＨ．Ｆｃｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ．ＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌ．５（１２）：２６８４−９０（１９９１）を参照されたい。Ｆｃガンマ受容体ファミリーのメンバーには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）が含まれる。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢの配列は、多くの配列データベース、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のアクセッション番号Ｐ１２３１４（ＦＣＧＲ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ１２３１８（ＦＣＧ２Ａ＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ３１９９４（ＦＣＧ２Ｂ＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）及びＰ０８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）の下にそれぞれ見出すことができる。

「ＡＤＣＣ活性」という用語は、ＡＤＣＣが活性化又は刺激される程度を指す。「抗体のＡＤＣＣ活性」という句は、ＡＤＣＣを誘導する抗体の能力を指す。

市販のアッセイ及びキットを含む、抗体又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性を測定又は決定する方法は、Ｙａｍａｓｈｉｔａｅｔａｌ．，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ６：ａｒｔｉｃｌｅｎｕｍｂｅｒ１９７７２（２０１６）；Ｋａｎｔａｋａｍａｌａｋｕｌｅｔａｌ．，“ＡｎｏｖｅｌＥＧＦＰ−ＣＥＭ−ＮＫｒｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄ−ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＨＩＶ−１ｉｎｆｅｃｔｅｄｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ”，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３１５（Ｉｓｓｕｅｓ１−２）：１−１０；（２００６）；Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎｅｔａｌ．，“Ａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３０８（Ｉｓｓｕｅｓ１−２）：５３−６７（２００６）；Ｓｃｈｎｕｅｒｉｇｅｒｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｂａｓｅｄａｓｓａｙｔｏｍｅａｓｕｒｅＡＤＣＣａｃｔｉｖｉｔｙｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭｏｌｅｃＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３８（Ｉｓｓｕｅｓ１２−１３）：１５１２−１５１７（２０１１）；及びＭａｔａｅｔａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｎｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓｆｏｒａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）ａｎｄｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎ^５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅａｎｄＣＤ１０７ａａｓｓａｙｓ”，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ４０６：１−９（２０１４）で記載されているように、当技術分野で周知であり；全ての文献はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。「ＡＤＣＣアッセイ」又は「ＦｃγＲレポーター遺伝子アッセイ」という用語は、抗体又は抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定するために有用なアッセイ、キット又は方法を指す。

本明細書に記載の方法における抗体組成物のＡＤＣＣ活性を測定又は決定する例示的な方法には、実施例に記載のＡＤＣＣアッセイ、又はＰｒｏｍｅｇａから市販されているＡＤＣＣレポーターアッセイ（カタログ番号Ｇ７０１０及びＧ７０１８）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＤＣＣ活性は、以下の１つ以上を含むカルセイン放出アッセイを使用して測定又は決定される：エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）発現ＮＫ９２（Ｍ１）細胞、及びカルセイン−ＡＭで標識した標的細胞としてＨＣＣ２２１８細胞又はＷＩＬ２−Ｓ細胞。

ＡＤＣＣ活性の調節
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」又は「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、増加又は減少させることによって変化させることを意味する。したがって、本明細書中、「ＡＤＣＣ活性を調節する」などの句で使用される「調節する」という用語は、ＡＤＣＣ活性を増加させること、又はＡＤＣＣ活性を減少させることを含むことが意図される。また、「ガラクトシル化、非フコシル化グリカン、フコシル化グリカン、ガラクトシル化グリカン、非フコシル化グリカン、又はこれらの組み合わせの量を調節する」などの句で使用される「調節する」という用語は、前記グリカンの量を増加させること、又は前記グリカンの量を減少させることを含むことが意図される。

したがって、例示的な実施形態では、本開示の方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性を増加させる方法を表す。例示的な態様では、本開示の方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性を、対照又は参照抗体と比較して、任意の程度又はレベルまで増加させる。例示的な例では、本開示の方法により提供されるＡＤＣＣ活性の増加は、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１％〜約１００％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約１５％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約２５％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約３５％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約４５％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約５５％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約６５％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約７５％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約８５％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加、少なくとも又は約１００％の増加）である。例示的な実施形態では、本開示の方法により提供される増加は、対照又は参照抗体と比較して、１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約５％〜約４００％の範囲内の量だけ増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１．５倍、少なくとも又は約２倍、少なくとも又は約３倍、少なくとも又は約４倍、或いは少なくとも又は約５倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ増加する。

代替の実施形態では、本開示の方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性を減少させる方法を表す。いくつかの態様では、本開示の方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルを、対照又は参照抗体と比較して、任意の程度又はレベルまで減少させる。例えば、本開示の方法により提供されるＡＤＣＣ活性の減少は、対照又は参照抗体のレベルと比較して、少なくとも又は約１％〜約１００％の減少（例えば、少なくとも又は約１％の減少、少なくとも又は約２％の減少、少なくとも又は約３％の減少、少なくとも又は約４％の減少、少なくとも又は約５％の減少、少なくとも又は約６％の減少、少なくとも又は約７％の減少、少なくとも又は約８％の減少、少なくとも又は約９％の減少、少なくとも又は約９．５％の減少、少なくとも又は約９．８％の減少、少なくとも又は約１０％の減少、少なくとも又は約１５％の減少、少なくとも又は約２０％の減少、少なくとも又は約２５％の減少、少なくとも又は約３０％の減少、少なくとも又は約３５％の減少、少なくとも又は約４０％の減少、少なくとも又は約４５％の減少、少なくとも又は約５０％の減少、少なくとも又は約５５％の減少、少なくとも又は約６０％の減少、少なくとも又は約６５％の減少、少なくとも又は約７０％の減少、少なくとも又は約７５％の減少、少なくとも又は約８０％の減少、少なくとも又は約８５％の減少、少なくとも又は約９０％の減少、少なくとも又は約９５％の減少、少なくとも又は約１００％の減少）である。例示的な実施形態では、本開示の方法により提供される減少は、対照又は参照抗体のレベルと比較して、約１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約５％〜約４００％の範囲内の量だけ減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１．５倍、少なくとも又は約２倍、少なくとも又は約３倍、少なくとも又は約４倍、或いは少なくとも又は約５倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ減少する。

グリカン
例示的な実施形態において、本明細書に開示する方法は、抗体のグリカンの量を調節して（例えば、（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン、又は（ｃ）これらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化グリカン）を調節して）、抗体のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させることを含む。例示的な態様では、本明細書に開示する方法は、抗体のＦｃドメインに結合するグリカンの量を調節して（例えば、（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン（例えば、フコースを調節することによって）、又は（ｃ）これらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化グリカン）を調節して）、抗体のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させることを含む。さらなる例示的な態様では、本明細書に開示する方法は、抗体のＦｃドメインのＣ_Ｈ２ドメインにおけるコンセンサスＮ−グリコシル化部位に結合したグリカンの量を調節して（例えば、（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン（例えば、フコースを調節することによって）、又は（ｃ）これらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化グリカン）を調節して）、抗体のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させることを含む。

例示的な態様では、本開示によって提供される方法は、ＩｇＧ１抗体組成物の調節であって、所望の又は所定の又は予め選択されたレベルのＡＤＣＣ活性を達成するために、ＩｇＧ１抗体のグリコフォームの所望の又は所定の又は予め選択されたレベルを達成するための工程が行われる調節に関する。例示的な実施形態では、方法は、抗体組成物によって誘発又は刺激されるＡＤＣＣ活性を調節する（増加又は減少させる）ために、ＩｇＧ１抗体のガラクトシル化グリコフォームの量を調節する（増加又は減少させる）ことを含む。例示的な実施形態では、方法は、抗体組成物によって誘発又は刺激されるＡＤＣＣ活性を調節する（増加又は減少させる）ために、ガラクトシル化され且つ非フコシル化されているグリコフォーム（すなわち、ガラクトシル化、非フコシル化グリコフォーム）の量を調節する（増加又は減少させる）ことを含む。特定の理論に縛られるものではないが、本開示の方法は、特定のレベルのＡＤＣＣ活性を達成するために有用な、特定の量の所与の抗体の特定のグリコフォームを含むテーラーメイドの抗体組成物のための手段を提供すると考えられる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示する方法は、抗体組成物内のガラクトシル化グリカン、非フコシル化グリカン、又はガラクトシル化、非フコシル化グリカンの量又は割合を調節することを含む。

代替の態様では、本明細書に開示する方法は、特定のＩｇＧ１分子に結合した末端β−ガラクトースの量を調節することを含む。例えば、この方法は、ＩｇＧ１抗体上の末端β−ガラクトースの量を（例えば、以下に限定されないが、グリカンをＧ０種からＧ１種若しくはＧ２種に、又はＧ１種からＧ２種に効果的に変化させることにより）増加させて、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を増加させることを含み得る。或いは、この方法は、末端ガラクトースの量を（例えば、以下に限定されないが、グリカンをＧ２種からＧ１種若しくはＧ０種に、又はＧ１種からＧ０種に変化させることにより）減少させて、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を減少させることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）の末端β−ガラクトースの量を調節して、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を調節することを含む。いくつかの態様では、方法は、末端ガラクトースの量を（例えば、グリカンをＧ０種からＧ１種若しくはＧ２種に、又はＧ１種からＧ２種に効果的に変化させることにより）増加させて、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体、又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性を増加させることを含む。或いは、本方法は、末端ガラクトースの量を（例えば、以下に限定されないが、グリカンをＧ２種からＧ１種若しくはＧ０種に、又はＧ１種からＧ０種に変化させることにより）減少させて、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体、又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性を減少させることを含み得る。

用語「グリカン（ｇｌｙｃａｎ）」、「グリカン（ｇｌｙｃａｎｓ）」、「グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」又は「グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ）」は、種々のグリコシド結合によって連結された単糖種のオリゴマーを指す。哺乳動物のＮ結合型グリカンに一般に見られる単糖の例には、ヘキソース（Ｈｅｘ）、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が含まれる。組み換えＩｇＧ１抗体上に見られる主要なＮ−グリカン種には、図１に示すように、フコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸及びＧｌｃＮＡｃが含まれる。グリカンオリゴ糖の構造は、Ｃ_Ｈ２ドメインのコンセンサスＮ−グリコシル化部位に結合しており、一般に、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸（ＳＡ）、及びバイセクト型Ｎ−ＧｌｃＮＡｃの可変付加によって構築されたアウターアームを有する７糖コアから構成されている。代表的なオリゴ糖構造は、以下のように略することができる：Ａ２Ｇ０Ｆ、Ａ２Ｇ１Ｆ、Ａ２Ｇ２Ｆ、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１、Ａ２Ｇ２はそれぞれ、コアフコース（Ｆ）が結合しているか又は結合していない、０、１つ又は２つの末端β−ガラクトース部分を有する、コアＧｌｃＮＡｃ及びマンノースオリゴ糖構造を指す。或いは、図２に示すように、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ０、Ｇ１及びＧ２の略語を使用することができる。Ｇ１には、Ｇ１ａとＧ１ｂと略される２つの付加的な構造が存在し得、Ｇ１ａ又はＧ１ｂは末端ガラクトース基がコア構造の６−アーム又は３−アームのいずれに結合しているかを示す。シアル酸が存在する場合、これらの略語は「Ｓ」を含み、例えば、Ｇ２ＦＳ２が２つのガラクトース、フコース及び２つのシアル酸基を有するグリカンを指す。追加のマンノース基を組み込むことによって形成される高マンノース（ＨＭ）構造、例えば、図１に示すような高マンノース種「Ｍ９」及び「Ａ２Ｇ１Ｓ１Ｍ５」を含む、ＩｇＧ１抗体に連結されたさらなるグリカンも存在し得る。本明細書で使用される場合、「グリカン」又は「グリコフォーム」という用語は、本明細書に記載される単糖種のオリゴマーのいずれか、又は抗体若しくはＩｇＧ１抗体に連結された単糖種の任意の他のオリゴマーを指す。

「末端β−ガラクトース」、「ガラクトシル化グリカン」又は「Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／又はＧ２ガラクトシル化種」という用語は、コアマンノース構造に結合するＮ−アセチルグルコサミン部分を介してＣ_Ｈ２ドメインのコンセンサスＮ−グリコシル化部位でＩｇＧ１抗体に連結された１つ（例えば、Ｇ１ａ及びＧ１ｂを含むＧ１）又は２つのガラクトース（例えば、Ｇ２）分子を含むグリカンを指す。フコース含有グリカンについて「末端β−ガラクトース」を含む例示的なグリカン、「ガラクトシル化グリカン」又はＡ２Ｇ１Ｆ、Ａ２Ｇ２Ｆ、並びに非フコシル化形態Ａ２Ｇ１（Ａ２Ｇ１ａ及びＡ２Ｇ１ｂを含む）及びＡ２Ｇ２（又はＧ１及びＧ２）を図２に示す。いくつかの実施形態では、ガラクトシル化グリカンは、図２中それぞれＡ１Ｇ１Ｍ５及びＡ１Ｇ１によって例示される、高マンノースアーム及びガラクトース含有アームを含むハイブリッド型グリカン、並びにシングルアームグリカンである。

用語「コアフコース」又は「フコシル化種」は、コアマンノース構造に結合するＮ−アセチルグルコサミン部分を介して、Ｃ_Ｈ２ドメインのコンセンサスＮ−グリコシル化部位でＩｇＧ１抗体に連結されたフコース分子（アルファ１−６）を含むグリカンを指す。「コアフコース」又は「フコシル化種」を含む例示的なグリカンを図１及び図２に示す。いくつかの実施形態では、コアフコース及び／又はフコシル化種を含有する抗体は、末端β−ガラクトース及び／又は高マンノースを含む他のグリカンを含んでも含まなくてもよい。

用語「非フコシル化の（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」、「非フコシル化グリカン」又は「非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、抗体におけるコアフコースの除去又は欠如を指す。例示的な非フコシル化抗体種を図２に示す。いくつかの実施形態では、コアフコースを欠く抗体は、末端β−ガラクトース及び／又は高マンノースを含む他のグリカンを含んでも含まなくてもよい。非フコシル化グリコフォームとしては、Ａ１Ｇ０、Ａ１Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＲｅｕｓｃｈａｎｄＴｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２５（１２）：１３２５−１３３４（２０１５）を参照されたい。

「高マンノース」、「高マンノースグリカン」又は「ＨＭ」という用語は、Ｃ_Ｈ２ドメインのコンセンサスＮ−グリコシル化部位でＩｇＧ１抗体に連結された３個を超えるマンノース分子を含むグリカンを指す。例示的な高マンノース抗体を図１及び図２に示す。高マンノースグリカンは、それぞれＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８及びＭａｎ９、又はＭ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８及びＭ９と略される、５、６、７、８又は９個のマンノース残基を含むグリカンを包含する。

本明細書で使用される「グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物」又は「非フコシル化組成物」という句は、組成物内の抗体がＣ_Ｈ２ドメイン中のコンセンサスＮ−グリコシル化部位に連結されたグリカンオリゴ糖構造を含有するＩｇＧ１抗体組成物を指す。好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも約０．５％が非フコシル化であるか、又は約０．５％超が非フコシル化であるか、又は約０．５％〜１００％が非フコシル化である（或いは、９９．５％のコアフコース若しくは９９．５％未満のコアフコースを有するか、又は０％〜９９．５％の範囲のコアフコースを有する）７糖コアを含む抗体を含む。

グリカン量の調節
例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＩｇＧ１抗体組成物の、例えば、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／又はＧ２ガラクトシル化種を含むグリカンの量又は割合を調節する（すなわち、増加又は減少させる）ことを含む。

用語「量」は、グリカンの量（例えば、（１）末端β−ガラクトースの量、（２）Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量、（３）コアフコースの量、（４）非フコシル化種の量、又は（５）ガラクトシル化非フコシル化グリカンの量を含む）をいう場合、試料又は糖タンパク質中のグリカンの総量と比較した特定のグリカンの相対的な量又は割合を指す。例えば、（１）末端β−ガラクトース、（２）Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、並びに／又は（３）コアフコース／非フコシル化種の量は、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種又はコアフコース／非フコシル化種を含む末端β−ガラクトースを有する種の量を試料又は糖タンパク質中の全てのグリカン種の総量で除した割合として示される。グリカン（例えば、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、コアフコース、非フコシル化種などを含む）の量又は相対的割合を測定及び決定する方法は当該技術分野でよく知られており、実施例に記載されるような親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）が挙げられる。また、Ｐａｃｅｅｔａｌ．，ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｔｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＭｕｌｔｉｐｌｅＦｃＧｌｙｃａｎＡｔｔｒｉｂｕｔｅｓｏｎｔｈｅＥｆｆｅｃｔｏｒＦｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄＦｃｃＲＩＩＩａＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎＩｇＧ１Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１６，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５ｐａｇｅｓ１１８１−１１９２、及びＳｈａｈ，Ｂ．ｅｔａｌ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳＰｅｐｔｉｄｅＭａｐｐｉｎｇｗｉｔｈＡｕｔｏｍａｔｅｄＤａｔａＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇｆｏｒＲｏｕｔｉｎｅＰｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆＮ−ＧｌｙｃａｎｓｉｎＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓＪ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．（２０１４）２５：９９９を参照されたい。これらの各文献はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、量は取り込みモルパーセントとして決定又は算出することができる。

「調節する」は、本明細書で使用される場合、減少又は増加させることによって変化させることを意味し、したがって、例示的な態様では、この方法は抗体のグリカン量を増加させることを含み、一方、代替の態様では、この方法は組成物中の抗体のグリカン量を減少させることを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、組成物内の抗体のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化種））を、対照又は参照抗体組成物と比較して任意の程度又はレベルまで増加させることを含む。例示的な例では、本方法は、対照又は参照抗体組成物と比較して、グリカン（例えば、組成物（抗ＨＥＲ２抗体組成物、抗ＴＮＦα抗体組成物又は抗ＣＤ２０抗体組成物（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）内のグリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体の末端βガラクトースを含む）を、少なくとも又は約１％〜約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体組成物と比較して、グリカンを１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも増加させることを含む。例示的な実施形態では、抗体組成物中のグリカンレベルの増加は、対照又は参照抗体組成物と比較して約５％〜約４００％の範囲である。例示的な実施形態では、本方法は、グリカンを、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも又は約１．５倍、少なくとも又は約２倍、少なくとも又は約３倍、少なくとも又は約４倍、或いは少なくとも又は約５倍増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、グリカンを、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、グリカンを、対照又は参照抗体組成物と比較して、約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ増加させることを含む。

例示的な態様では、本開示の方法は、抗体組成物のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化及び非フコシル化グリカン））を、対照又は参照抗体組成物と比較して任意の程度又はレベルまで減少させることを含む。例示的な例では、本方法は、対照又は参照抗体組成物と比較して、グリカン（例えば、組成物（抗ＨＥＲ２抗体組成物、抗ＴＮＦα抗体組成物又は抗ＣＤ２０抗体組成物（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）内のグリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体の末端βガラクトースを含む）を、少なくとも又は約１％〜約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体組成物と比較して、グリカンを１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも減少させることを含む。例示的な実施形態では、抗体組成物のグリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約５％〜約４００％の範囲の量だけ減少する。例示的な実施形態では、本方法は、グリカンを、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも又は約１．５倍、少なくとも又は約２倍、少なくとも又は約３倍、少なくとも又は約４倍、或いは少なくとも又は約５倍減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、グリカンを、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、グリカンを、対照又は参照抗体組成物と比較して、約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ減少させることを含む。

例示的な態様では、本開示の方法は、抗体組成物のガラクトシル化グリカン、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を、総量で少なくとも若しくは約０．５％、少なくとも若しくは約１％、少なくとも若しくは約２％、少なくとも若しくは約３％、少なくとも若しくは約５％、少なくとも若しくは約７％、少なくとも若しくは約１０％、少なくとも若しくは約１５％、少なくとも若しくは約２０％、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９６％、少なくとも若しくは約９７％、又は少なくとも若しくは約９８％に調節する（すなわち、増加又は減少させる）、或いは総量で少なくとも又は約０．５％〜９８％の範囲に増加又は減少させる、或いは総量で０％〜１００％の範囲に増加又は減少させることを含む。

例示的な態様では、本開示の方法は、抗体組成物のガラクトシル化グリカン、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、並びに非フコシル化グリカンの量を調節する（すなわち、増加又は減少させる）ことを含み、ガラクトシル化グリカン、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の総量は、少なくとも若しくは約０．５％、少なくとも若しくは約１％、少なくとも若しくは約２％、少なくとも若しくは約３％、少なくとも若しくは約５％、少なくとも若しくは約７％、少なくとも若しくは約１０％、少なくとも若しくは約１５％、少なくとも若しくは約２０％、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９６％、少なくとも若しくは約９７％、又は少なくとも若しくは約９８％である、或いは総量で少なくとも又は約０．５％〜９８％の範囲に増加又は減少する、或いは総量で０％〜１００％の範囲に増加又は減少し；非フコシル化グリカンの総量は、少なくとも約０．５％若しくは約０．５％超、又は少なくとも若しくは約３％、少なくとも若しくは約４％、少なくとも若しくは約５％、少なくとも若しくは約７％、少なくとも若しくは約１０％、少なくとも若しくは約１５％、少なくとも若しくは約２０％、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９６％、少なくとも若しくは約９７％、少なくとも若しくは約９８％、又は少なくとも若しくは約９９％である、或いは総量で約０．５％〜１００％の範囲、総量で約３％〜１００％の範囲、総量で約５％〜１００％の範囲、又は総量で約８％〜１００％の範囲に増加又は減少する。

例示的な実施形態では、本開示の方法は、抗体組成物のガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量を調節して、抗体組成物のＡＤＣＣ活性を調節することを含む。例示的な態様では、本方法は、抗体組成物のガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量を増加させて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加させることを含む。例示的な態様では、本方法は、抗体組成物のガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量を減少させて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性を減少させることを含む。例示的な態様では、本方法は、非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量を増加させて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加させることを含む。例示的な態様では、本方法は、非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量を減少させて、抗体組成物のＡＤＣＣ活性を減少させることを含む。

例示的な実施形態では、本開示の方法は、抗体組成物のガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、及び非フコシル化グリカン又はコアフコースの量を調節して、抗体組成物のＡＤＣＣ活性を調節することを含む。例示的な態様では、本方法は、（１）ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量を増加させること、及び（２）非フコシル化グリカンを増加させるか又はコアフコースの量を減少させることの両方によって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加させることを含む。例示的な態様では、本方法は、（１）ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量を減少させること、及び（２）非フコシル化グリカンの量を減少させるか又はコアフコースの量を増加させることの両方によって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）である。

抗体のＡＤＣＣ活性を操作する方法
本明細書で提供される方法はまた、第２の抗体組成物中のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β−ガラクトース、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化非フコシル化グリカン））の量を調節して、第１の参照ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせることにより、第１の参照ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性と第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性をマッチさせる方法を含む。

例えば、いくつかの例示的な実施形態において、本開示の方法は、（１）参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；（２）抗体が参照抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（３）第２の組成物中の抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量（例えば、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を含む）を増加又は減少させることによって、第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を変化させる工程（ここで、末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、参照ＩｇＧ１抗体組成物と同じであるか、又は参照ＩｇＧ１抗体組成物の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は参照ＩｇＧ１抗体組成物の約１％〜約５０％以内である）によって、参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせることを含む。例示的な態様では、約１％の末端β−ガラクトースの増加は、ＡＤＣＣ活性を約２０％〜約３０％増加させる。例示的な態様では、約１％の末端β−ガラクトースの減少は、ＡＤＣＣ活性を約２０％〜約３０％減少させる。例示的な態様では、本方法は、第２の抗体組成物のガラクトシル化非フコシル化グリカンの量又は割合を調節して、この抗体組成物のＡＤＣＣ活性を、参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチするように調節することを含む。例示的な態様では、本方法は、第２の抗体組成物のガラクトシル化非フコシル化グリカンの量又は割合を増加させることによって、第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加させ、参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせることを含む。例示的な態様では、本方法は、第２の抗体組成物のガラクトシル化非フコシル化グリカンの量又は割合を減少させることによって、第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を減少させ、参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせることを含む。いくつかの実施形態では、本方法の工程１（すなわち、「参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）は、本方法の工程２及び／又は工程３の前、後又は同時に行われる。

参照抗体組成物のＡＤＣＣ活性にマッチさせる方法に加えて、本明細書で提供される方法はまた、目標の、所望の又は予め選択されたＡＤＣＣ活性を達成するために、特定のＡＤＣＣ活性を有する抗体組成物を、この抗体組成物のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β−ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ（例えば、ガラクトシル化、非フコシル化グリカン）の量を調節することによって操作する方法を意図する。

例えば、本開示の方法のいくつかの例示的な実施形態では、方法は、（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び（３）コンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトース（例えば、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）の量又は割合を増加又は減少させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程（ここで、末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、目標ＡＤＣＣ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＣ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は目標ＡＤＣＣ活性の約１％〜約５０％以内である）によって、抗体組成物の特定の目標ＡＤＣＣ活性を操作することを含む。例示的な態様では、約１％の末端β−ガラクトースの増加は、ＡＤＣＣ活性を約２％増加させる。例示的な態様では、約１％の末端β−ガラクトースの減少は、ＡＤＣＣ活性を約２％減少させる。例示的な態様では、本方法は、目標ＡＤＣＣ活性にマッチするように、ＩｇＧ１抗体組成物のガラクトシル化非フコシル化グリカンの量又は割合を調節することを含む。例示的な態様では、本方法は、目標ＡＤＣＣ活性にマッチするように、ＩｇＧ１抗体組成物のガラクトシル化非フコシル化グリカンの量又は割合を増加させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加させることを含む。例示的な態様では、本方法は、目標ＡＤＣＣ活性にマッチするように、ＩｇＧ１抗体組成物のガラクトシル化非フコシル化グリカンの量又は割合を減少させることによって、ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法の工程１（すなわち、「グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する」）は、本方法の工程２及び／又は工程３の前、後又は同時に行われる。

グリカンの調節方法
糖タンパク質、例えば、抗体上のグリカン（ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、及び／又は非フコシル化グリカンなど）を調節する好適な方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙ２１（５）：２０１６を参照されたい。この文献はグリコシル化に対する細胞培養条件の効果を概説している。また実施例に記載の方法も参照されたい。

したがって、いくつかの態様では、グリコシル化コンピテント細胞（これは、糖タンパク質、例えば、抗体を、組み換え技術により産生するために使用することができる）が、細胞を用いて生産される抗体組成物中に所望のレベルのグリカンを達成するための特定の条件下で培養される。例えば、国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４２４５号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４１６７号パンフレット、国際公開第２０１５／１２８７９３号パンフレット、及び国際公開第２０１６／０８９９１９号パンフレットはそれぞれ、グリカン（ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン、又はコアフコースを含有するグリカンなど）を調節するのに有用な組み換え細胞培養技術、例えば、全非フコシル化グリカンを高い割合で有する糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット）、Ｍａｎ５グリカン及び／又は非フコシル化グリカンを高い割合で有する糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１３／１１４２４５号パンフレット）、特定量の高マンノースグリカン、非フコシル化グリカン及びＧ０Ｆグリカンを有する糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１３／１１４１６７号パンフレット）、高マンノースグリカン並びに減少したガラクトシル化及び／又は高ガラクトシル化グリカンを有する糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１５／１２８７９３号パンフレット）；並びに組み換えタンパク質上のフコシル化グリカン含有量を操作する方法（国際公開第２０１６／０８９９１９号パンフレット）を教示している。国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４２４５号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４１６７号パンフレット、国際公開第２０１５／１２８７９３号パンフレット、及び国際公開第２０１６／０８９９１９号パンフレットによって記載されている細胞培養技術には、特異的グリカンを調節するために、温度、ｐＨなどの１つ以上の細胞培養パラメーターを改変すること、細胞をマンガンイオン若しくはその塩（例えば、０．３５μＭ〜約２０μＭのマンガン）と共に培養すること、及び／又は細胞を銅（例えば、１０〜１００ｐｐｂ）及びマンガン（例えば、５０〜１０００ｎＭ）と共に培養することが含まれる。

さらに、国際公開第２０１５／１４０７００号パンフレットは、非フコシル化グリカンを増加させるためにベタインと共に細胞を培養することを教示し、さらに、マンノシル化、ガラクトシル化非フコシル化グリカンの目標値を得るためにマンガン、ガラクトース及びベタインと共に細胞を培養することを教示している。同様に、Ｋｏｎｎｏｅｔａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６４：２４９−３＋６（２０１２）は、抗体のフコース含量が培養培地の浸透圧によって制御され得ることを教示している。国際公開第２０１７／０７９１６５号パンフレットには、タンパク質の非フコシル化形態及びフコシル化形態を産生するために、ＧＭＤもＦＸも有さない遺伝子操作された宿主細胞をフコースと共に培養することが記載されている。国際公開第２０１７／１３４６６７号パンフレットには、細胞を少なくとも１ｍＭの濃度のニコチンアミド及びフコースと共に培養することによってグリカン含量を操作することが記載されている。Ｓｈａｅｔａｌ．，ＴＩＢｓ３４（１０）：８３５−８４６（２０１６）にもまた、グリカンを調節するいくつかの方法、例えば、ウリジン、マンガン及びガラクトースを用いて抗体上のガラクトシル化レベルを増加させること、及びマンノースを炭素源として使用して高マンノースグリコフォームを増加させることを含む方法が概説されている。さらに、ＭｃＣｒａｃｋｅｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３０（３）：５４７−５５３（２０１４）は、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの量に影響を及ぼす特定のアスパラギン濃度、アンモニウムレベル及びｐＨを含む細胞培養培地を含む、細胞培養物中のガラクトシル化グリコフォーム分布を制御する方法を教示している。

したがって、本開示の方法は、例示的な態様において、抗体組成物中のガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、及び／又は非フコシル化グリカン若しくはコアフコースを含有するグリカンの量を調節するために、上記参考文献又は本明細書に記載の他の参考文献のいずれか１つ以上において教示されている手順及び／又は条件の１つ以上を採用することを含む。例示的な態様では、この方法は、ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）及び／又は非フコシル化グリカン若しくはコアフコースを含有するグリカンのレベルを調節する条件下、細胞培養培地中で抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を培養することを含む。

細胞培養物中で細胞を維持又は培養することを含む本明細書に記載の方法において、細胞培養物は、組み換えグリコシル化タンパク質又は抗体産生に好適な任意の一連の条件にしたがって維持され得る。例えば、いくつかの態様では、細胞培養物は、組み換えグリコシル化タンパク質又は抗体産生に好適な、特定のｐＨ、温度、細胞密度、培養体積、溶存酸素レベル、圧力、浸透圧などで維持される。例示的な態様では、ＣＯ_２インキュベーター中、標準的な加湿条件下、５％ＣＯ_２で接種前の細胞培養物を振盪する（例えば、７０ｒｐｍで）。

例示的な態様では、本開示の方法は、当該技術分野でよく知られているように、細胞培養培地中のグリコシル化コンピテント細胞を、組み換えグリコシル化タンパク質又は抗体の産生に好適なｐＨ、温度、浸透圧、及び溶存酸素レベルに維持することを含む。例示的な態様では、細胞培養物は、当該技術分野でよく知られているように、細胞増殖に好適な培地中で維持され、且つ／又は任意の好適な供給スケジュールにしたがって１つ以上のフィード培地が与えられる。

例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は真核細胞であり、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような宿主細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ４：２１７（２０１３）を参照されたい。例示的な態様では、真核細胞は哺乳動物細胞である。例示的な態様では、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯｐｒｏ−３）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０、ＧＳ−ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えば、ＤＵＫＸ−Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又はその誘導体（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト骨の骨肉腫上皮細胞Ｕ２−ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ−Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔｅｔａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，ＡｄｖＰｈａｒｍＢｕｌｌ３（２）：２５７−２６３（２０１３））である。

グリコシル化にコンピテントではない細胞はまた、例えば、グリコシル化に必要な関連酵素をコードする遺伝子をそれらに導入することによって、グリコシル化コンピテント細胞に形質転換され得る。例示的な酵素としては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼＩ、グルコシダーゼＩＩ、カルネキシン／カルレティキュリン、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる又は代替の態様では、抗体を組み換え技術により産生するグリコシル化コンピテント細胞は、細胞により産生される抗体のグリカン（ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β−ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、及び／又は非フコシル化グリカン若しくはコアフコースを含有するグリカンなど）を調節するように遺伝子操作される。例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝子操作される。任意選択により、グリコシル化コンピテント細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝子操作される。フコース代謝のこれらの２つの経路は当該技術分野でよく知られており、図５に示す。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、フコシル−トランスフェラーゼ（ＦＵＴ、例えば、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９）、フコースキナーゼ、ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、及びＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ、４−レダクターゼ（ＦＸ）のいずれか１つ以上の活性を変えるように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、ＦＸをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧＮＴＩＩＩ）又はＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の活性を変えるように遺伝子操作される。例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は、ＧＮＴＩＩＩ又はＲＭＤを過剰発現するように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、改変されたベータ−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するように遺伝子操作される。

当該技術分野においては、Ｆｃ含有分子、例えば、抗体の、フコシル化を減少又はなくすためのいくつかの方法が知られている。これらには、ＦＵＴ８ノックアウト細胞株、変異型ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０、ＦＵＴ８遺伝子に対し特異的な低分子干渉ＲＮＡを含む細胞株、及びβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα−マンノシダーゼＩＩを共発現する細胞株を含む特定の哺乳動物細胞株における組み換え発現が含まれる。或いは、Ｆｃ含有分子を、植物細胞、酵母、又は原核細胞（例えば、Ｅ，コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの非哺乳動物細胞において発現し得る。

例示的な態様では、目標グリカン量は、抗体組成物の産生後の化学的処理又は酵素による処理によって達成される。例示的な態様では、本開示の方法は、抗体が組み換え技術により産生された後に、抗体組成物を化学的に又は酵素により処理することを含む。例示的な態様では、化学薬品又は酵素は、Ｅｎｄｏ−Ｓ、Ｅｎｄｏ−Ｓ２、Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−ＬＬ、α−フコシダーゼ、β−（１−４）−ガラクトシダーゼ、Ｅｎｄｏ−Ｈ、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、Ｅｎｄｏ−Ｆ２、Ｅｎｄｏ−Ｆ３、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、キフネンシン、及びＰＮＧアーゼ−Ｆからなる群から選択される。例示的な態様では、化学薬品又は酵素を抗体組成物と様々な時間インキュベートして、種々の量のグリカンを有する抗体を生成する。いくつかの態様では、抗体組成物を、実施例に記載するように、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴアーゼ）とインキュベートする。いくつかのさらなる態様では、種々のレベルのガラクトースを有する抗体は、抗体組成物をβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと一定時間、例えば、以下に限定されないが、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約９時間、又は約１０分〜約９時間の範囲内の時間、インキュベートすることによって生成され得る。

グリカンの測定方法
糖タンパク質含有組成物（抗体組成物を含む）中に存在するグリコフォームを評価するため、又は糖タンパク質を含む特定の試料のグリコフォームプロファイルを決定、検出若しくは測定するための様々な方法が、当該技術分野で知られている。好適な方法としては、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、陽イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析、陰イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析、ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣ）、エキソグリコシダーゼ消化、Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−４クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び一次元ＮＭＲ分光法、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｐａｃｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１６，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５ｐａｇｅｓ１１８１−１１９２、Ｓｈａｈ，Ｂ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．（２０１４）２５：９９９、Ｍａｔｔｕｅｔａｌ．，ＪＢＣ２７３：２２６０−２２７２（１９９８）、Ｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ２９９（Ｐｔ１）：２６１−２７５（１９９４）、Ｙｏｏｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２（３）：３２０−３３４（２０１０）、ＷｕｈｒｅｒＭ．ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，２００５，Ｖｏｌ．８２５，Ｉｓｓｕｅ２，ｐａｇｅｓ１２４−１３３、ＲｕｈａａｋＬ．Ｒ．，ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌＣｈｅｍ，２０１０，Ｖｏｌ．３９７：３４５７−３４８１、Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉｅｔａｌ．，ＰＬＯＳＯｎｅ１０（７）：ｅ０１３２８４８（２０１５）、Ｔｈｏｍａｎｎｅｔａｌ．，ＰＬＯＳＯｎｅ１０（８）：ｅ０１３４９４９．（２０１５）、Ｐａｃｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３２（５）：１１８１−１１９２（２０１６）、及びＧｅｏｆｆｒｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９６，Ｖｏｌ．２４０，ｐａｇｅｓ２１０−２２６を参照されたい。また、本明細書中に示す実施例に、抗体組成物などの糖タンパク質含有組成物中に存在するグリコフォームを評価するのに好適な方法を記載する。

対照
本明細書に記載するように、本開示の方法のいくつかは、「対照」又は「参照」抗体組成物と比較して、そのような方法によってもたらされる調節（例えば、増加又は減少）を挙げる。例示的な態様では、ＡＤＣＣ活性又はグリカンの量に関して、「対照」は、最初に測定又は決定されたときの抗体組成物（例えば、参照抗体組成物）のＡＤＣＣ活性レベル及び／又はグリカン量などの、ＡＤＣＣ活性の調節及び／又はグリカンプロファイルの調節に向けた実験的介入の前の、抗体組成物（例えば、参照抗体組成物）のＡＤＣＣ活性レベル及び／又はグリカン量である。特定の態様では、「対照」又は「参照」抗体組成物は、ＡＤＣＣ活性の調節及び／又はグリカンプロファイルの調節に向けた有意な実験的介入を受けたが、ＡＤＣＣ活性及び／又はグリカンプロファイルのさらなる調節が所望される抗体組成物であり得る。これらの例では、「対照」は、ＡＤＣＣ活性のさらなる調節及び／又はグリカンプロファイルのさらなる調節に向けたさらなる実験的介入の前の抗体組成物（例えば、参照抗体組成物）のＡＤＣＣ活性のレベル及び／又はグリカン量である。

抗体、断片及びタンパク質産物
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン構成を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、同一のポリペプチド鎖の対が２つある「Ｙ字型」構造であり、各対が１つの「軽」鎖（通常、分子量が約２５ｋＤａである）及び１つの「重」鎖（通常、分子量が約５０〜７０ｋＤａである）を有する、ＩｇＧであり得る。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ型において、可変領域は、一般に、約１００〜１１０又はそれを超えるアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体と実質的に異なる。例えば、Ｊａｎｅｗａｙｅｔａｌ．，“ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＡｎｔｉｂｏｄｙＭｏｌｅｃｕｌｅａｎｄｔｈｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：ＴｈｅＩｍｍｕｎｅＳｙｓｔｅｍｉｎＨｅａｌｔｈａｎｄＤｉｓｅａｓｅ，４^ｔｈｅｄ．ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＬｔｄ．／ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９）を参照されたい。

「抗体断片」又は「その抗体断片」という用語は、完全な抗体の一部を指す。「抗原結合断片」又は「その抗原結合断片」は、抗原に結合する完全な抗体の一部を指す。抗原結合断片は、完全な抗体の抗原決定可変領域を含み得る。抗体断片の抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、線形抗体、ｓｃＦｖ、並びに一本鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「ＩｇＧ」は、認識される免疫グロブリンγ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを指す。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３を含む。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖の配列は、多くの配列データベースにおいて見出すことができ、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）において、アクセッション番号Ｐ０１８５７（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８５９（ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８６０（ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ）及びＰ０１８６１（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）でそれぞれ見出すことができる。好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法及び抗体は、ＩｇＧ１抗体に関する。いくつかの他の好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法及び抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体に関する。

用語「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。ＣＤＲは、抗原特異性の主要な決定基である。

ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種の分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分においてある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍを参照されたい（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，前掲、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７、及びＭａｃＣａｌｌｕｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）。抗原結合部位の特性決定のためのさらに別の基準は、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられるＡｂＭ定義である。例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＶａｒｉａｂｌｅＤｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂＭａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技法が、重複するが、同一ではない領域を定義する限り、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式による付番が好ましい。例えば、ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７、ＭａｒｔｉｎａｎｄＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，１９８８を参照されたい。各文献は参照により本明細書に組み込まれる。

用語「可変」は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）が対合し、共に単一の抗原結合部位を形成する。

可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して一体に保持されており、他の鎖の超可変領域と共に抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔｅｔａｌ．を参照されたい）。

本明細書で使用される用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ領域」及び「ＩｇＧＦｃドメイン」は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって得られる結晶性断片と相関するＩｇＧ分子の一部分を指す。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結されたＩｇＧ分子の２本の重鎖のＣ末端側半分を含む。それは抗原結合活性を有さないが、炭水化物部分と、補体受容体及びＦｃ受容体、例えばＦｃＲｎ受容体、に結合する部位とを含む。例えば、Ｆｃドメインは、第２の定常ドメインＣＨ２全体（ヒトＩｇＧ１のＥＵ位置２３１〜３４０の残基）及び第３の定常ドメインＣＨ３（ヒトＩｇＧ１のＥＵ位置３４１〜４４７の残基）を含む。

Ｆｃは、単離されたこの領域、又は抗体若しくは抗体断片と関連したこの領域を指し得る。多型は、Ｆｃドメイン中の多くの位置で、例えば、以下に限定されないが、ＥＵ位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、及び３５８で、観察されている。したがって、「野生型ＩｇＧＦｃドメイン」又は「ＷＴＩｇＧＦｃドメイン」は、天然に存在するＩｇＧＦｃ領域（すなわち、いずれかのアレル）を指す。ＭｙｒｉａｄＦｃ変異体、Ｆｃ断片、Ｆｃバリアント、及びＦｃ誘導体は、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書、同第５，８８５，５７３号明細書、同第５，６７７，４２５号明細書、同第６，１６５，７４５号明細書、同第６，２７７，３７５号明細書、同第５，８６９，０４６号明細書、同第６，１２１，０２２号明細書、同第５，６２４，８２１号明細書、同第５，６４８，２６０号明細書、同第６，５２８，６２４号明細書、同第６，１９４，５５１号明細書、同第６，７３７，０５６号明細書、同第７，１２２，６３７号明細書、同第７，１８３，３８７号明細書、同第７，３３２，５８１号明細書、同第７，３３５，７４２号明細書、同第７，３７１，８２６号明細書、同第６，８２１，５０５号明細書、同第６，１８０，３７７号明細書、同第７，３１７，０９１号明細書、同第７，３５５，００８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０００２５８７号明細書、並びに国際公開第９９／０５８５７２号パンフレット、国際公開第２０１１／０６９１６４号パンフレット、及び国際公開第２０１２／００６６３５号パンフレットに記載されている。

Ｆｃ領域は一般に、抗原結合後に生じる抗体エフェクター機能を決定する。Ｃ１ｑなどの自然免疫系のほか、Ｆｃγ受容体との結合相互作用を介して細胞傷害性細胞や抗原提示細胞の分子を動員することができる。ＩｇＧＦｃ領域は、Ａｓｎ２９７に２つの保存されたＮ−グリコシル化部位（各重鎖に１つ）を含む（Ｐ．Ｍ．Ｒｕｄｄ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１（２００１），ｐｐ．２３７０−２３７６を参照）。コンセンサスグリコシル化部位における構造グリカンの変動は、ＩｇＧと免疫系との相互作用に影響する構造の微妙な変化をもたらす。例えば、Ｆｃ領域グリカンは、Ｆｃ領域の構造を変化させることによって（Ｓ．Ｋｒａｐｐ，ｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｕｍａｎＩｇＧ−ＦｃｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓｒｅｖｅａｌｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２５（２００３）；９７９−９８９３１、Ｙ．Ｍｉｍｕｒａ，ｅｔａｌ．ＲｏｌｅｏｆｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆＩｇＧ１−ＦｃｉｎＦｃＲＩＩｂｂｉｎｄｉｎｇＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（２００１），４５５３９−４５５４７を参照）、又はグリカン−グリカンの相互作用によって（Ｃ．Ｆｅｒｒａｒａ，ｅｔａｌ．Ｕｎｉｑｕｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎＦｃ（ＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌａｃｋｉｎｇｃｏｒｅｆｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０８（２０１１），１２６６９−１２６７４を参照）、Ｆｃγ受容体に対するＩｇＧの親和性に直接影響を及ぼし、その結果として、それらの免疫エフェクター細胞を動員する能力に強く影響し得る。また、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ：ａｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄａｐｐｒｏａｃｈｔｏｐｒｏｄｕｃｉｎｇｏｐｔｉｍａｌａｎｄｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｄｒｕｇｓ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙ，（２１）５（２０１６）７４０−７６５を参照されたい。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち少量存在する可能性がある、考えられる天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、特異性が高く、異なる決定基（又はエピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位又は決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。

モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養物によって作製される抗体を提供する任意の技法を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作られ得、又は組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）によって作られ得る。ヒトモノクローナル抗体を作製するさらなる技法の例としては、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。

次に、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングして、特定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。例えば、組み換え抗原、天然に存在する形態、その任意のバリアント又は断片、並びにその抗原性ペプチドなど、任意の形態の関連抗原が免疫原として使用され得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用して、標的抗原のエピトープにファージ抗体が結合する効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ７（１９９６），９７−１０５、Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８３（１９９５），７−１３）。

モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイライブラリ又はリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイについては、例えば、Ｌａｄｎｅｒｅｔａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５−１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている。

ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して、非ヒト動物、例えば齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギ又はラットなど）を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きい断片を用いて操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択し得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．（１９９４）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ７：１３−２１、米国特許出願公開第２００３／００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。

モノクローナル抗体はまた、非ヒト動物から得た後、当該技術分野で知られる組み換えＤＮＡ技術を用いて、例えばヒト化、脱免疫、キメラ化などの改変を行うことができる。改変抗体コンストラクトの例としては、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０，１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照）及びエフェクター機能が改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎａｎｄＤｕｅｂｅｌ（２０１０）及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照）が挙げられる。

免疫学において、親和性成熟とは、免疫反応の過程で抗原に対する親和性の増大した抗体をＢ細胞が産生するプロセスである。同一抗原への反復暴露により、宿主は、親和性が連続的に増大する抗体を産生することになる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、変異と選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟を問題なく使用して、抗体、抗体コンストラクト及び抗体フラグメントを最適化している。ＣＤＲ内のランダム変異は、放射線、化学的変異原又はエラープローンＰＣＲを用いて導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェイン・シャッフリング法によって増大させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を用いた２又は３ラウンドの変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントが得られる。

本発明に記載のモノクローナル抗体としては、重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残部は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体の断片中の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））が挙げられる。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬＵ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５、Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙｅｔａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓｅｔａｌ．、米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．、欧州特許第０１７１４９６号明細書、欧州特許第０１７３４９４号明細書、及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。

ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどのトランスジェニック動物を用いて作製され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全ては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換されるか、又はＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置換され得る。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置換することのみが必要である。

ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／又は復帰変異の導入によって最適化することができる。このような改変免疫グロブリン分子は、当該技術分野で知られる複数の技術のいずれかによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３、Ｋｏｚｂｏｒｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３、Ｏｌｓｓｏｎｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２、及び欧州特許第２３９４００号明細書）。

「ヒト抗体」という用語には、例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．（１９９１）（前掲）によって記載されているものを含む、当該技術分野で知られるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する、可変及び定常領域又はドメインなどの抗体領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発により、又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える数の位置を有し得る。本明細書で使用されるヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術又はシステムを使用することによって得ることができる、非人為的且つ／又は遺伝子操作により改変された抗体のヒト配列のみを含む完全ヒト抗体も意図している。

有利には、本明細書に記載する方法は、特異的抗体又は特定の型の抗体に限定されない。しかしながら、例示的態様では、抗体はＦｃドメインを含み、例示的な例においては、抗体はＩｇＧ１抗体である。例示的な実施形態では、抗体は、特定の抗体配列を有するＩｇＧ１抗体である。「抗体配列」という用語は、抗体のアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される句「参照抗体と同じ配列を有する」は、参照抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましい実施形態では、本明細書で使用される「参照抗体と同じ配列を有する」抗体は、参照抗体のＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬ配列と同じＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する抗体を指す。

例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は、トラスツズマブ、又はそのバイオシミラーである。トラスツズマブという用語は、表１に列挙される、すなわち配列番号１〜８、２１又は２２に記載されるＶＨ及びＶＬ、又はＶＨ−ＩｇＧ１及びＶＬ−ＩｇＧカッパ配列を含む、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に結合するＩｇＧ１カッパヒト化モノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１８０２８８−６９−１、ＤｒｕｇＢａｎｋ−ＤＢ０００７２、ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ｅｎｔｒｙＤ０３２５７を参照）。

代替の態様では、ＩｇＧ１抗体は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。代替の態様では、ＩｇＧ１抗体は、リツキシマブ、又はそのバイオシミラーである。リツキシマブという用語は、表２に列挙される、すなわち配列番号１１〜１８、２３又は２４に記載されるＶＨ及びＶＬ、又はＶＨ−ＩｇＧ１及びＶＬ−ＩｇＧカッパ配列を含む、ＣＤ２０抗原に結合するＩｇＧ１カッパキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１７４７２２−３１−７、ＤｒｕｇＢａｎｋ−ＤＢ０００７３、ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ｅｎｔｒｙＤ０２９９４を参照）。

例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は、抗ＴＮＦα抗体である。例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は、インフリキシマブ、又はそのバイオシミラーである。インフリキシマブという用語は、表３に列挙される、すなわち配列番号２５〜３４に記載されるＶＨ及びＶＬ、又はＶＨ−ＩｇＧ１及びＶＬ−ＩｇＧカッパ配列を含む、ＴＮＦα抗原に結合するＩｇＧ１カッパキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１７０２７７−３１−３；ＤｒｕｇＢａｎｋ−ＤＢ０００６５、ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ｅｎｔｒｙＤ０２５９８を参照）。

追加の工程
本明細書に開示する方法は、様々な態様において、追加の工程を含む。例えば、いくつかの態様では、本方法は、組み換えタンパク質（例えば、抗体）を産生し、精製し、製剤化することに関与する１つ以上の上流工程又は下流工程を含む。例示的な実施形態では、本方法は、組み換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体）を発現する宿主細胞を作製するための工程を含む。宿主細胞は、いくつかの態様では、原核宿主細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）であるか、又は宿主細胞は、いくつかの態様では、真核宿主細胞、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、若しくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）である。このような宿主細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ４：２１７（２０１３）及び本明細書の「細胞」の節を参照されたい。例えば、本方法は、いくつかの例では、組み換えタンパク質又はそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む。

例示的な実施形態では、本明細書で開示する方法は、培養物から組み換えタンパク質（例えば、組み換え抗体）を単離及び／又は精製するための工程を含む。例示的な態様では、本方法は、以下に限定されないが、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１つ以上のクロマトグラフィー工程を含む。例示的な態様では、本方法は、組み換えタンパク質を含む溶液から結晶性生体分子を生成するための工程を含む。

本開示の方法は、様々な態様において、組成物、例えば、いくつかの態様では、精製組み換えタンパク質を含む医薬組成物、を調製するための１つ以上の工程を含む。このような組成物について、以下で説明する。

組成物
本明細書に記載される方法によって生成される組み換えグリコシル化タンパク質及び抗体を含む組成物もまた、本明細書において提供される。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β−ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ）の量を調節する方法によって調製される。例示的な態様では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。したがって、増加又は減少したＡＤＣＣ活性を有するグリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）を含む抗体組成物（ここで、グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）は、ＩｇＧ１抗体組成物上のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β−ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ）の量を調節する（例えば、増加又は減少させる）ことによって、対照又は参照抗体組成物と比較して、特定のＡＤＣＣ活性、又は増加若しくは減少したＡＤＣＣ活性を有するように操作されている）が本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される方法によって産生されるグリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体（抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体、又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）を含み、このＩｇＧ１抗体組成物は、参照ＩｇＧ１抗体組成物と比較してＡＤＣＣ活性が増加又は減少しており、参照ＩｇＧ１抗体組成物は、増加又は減少したＡＤＣＣ活性を有するＩｇＧ１抗体組成物内のＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有する抗体を含有する。

したがって、例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照抗体と比較して任意の程度又はレベルにまでＡＤＣＣ活性が増加している。例示的な例では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性の増加は、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも又は約１％〜約１００％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約１５％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約２５％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約３５％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約４５％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約５５％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約６５％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約７５％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約８５％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加、少なくとも又は約１００％の増加）である。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性の増加は、対照又は参照抗体組成物と比較して、１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約５％〜約４００％の範囲内の量だけ増加する。例示的な実施形態では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、或いは約５倍増加する。例示的な実施形態では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ増加する。

代替の実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照抗体組成物と比較して任意の程度又はレベルにまでＡＤＣＣ活性が減少している。例えば、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性の減少は、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも又は約１％〜約１００％の減少（例えば、少なくとも又は約１％の減少、少なくとも又は約２％の減少、少なくとも又は約３％の減少、少なくとも又は約４％の減少、少なくとも又は約５％の減少、少なくとも又は約６％の減少、少なくとも又は約７％の減少、少なくとも又は約８％の減少、少なくとも又は約９％の減少、少なくとも又は約９．５％の減少、少なくとも又は約９．８％の減少、少なくとも又は約１０％の減少、少なくとも又は約１５％の減少、少なくとも又は約２０％の減少、少なくとも又は約２５％の減少、少なくとも又は約３０％の減少、少なくとも又は約３５％の減少、少なくとも又は約４０％の減少、少なくとも又は約４５％の減少、少なくとも又は約５０％の減少、少なくとも又は約５５％の減少、少なくとも又は約６０％の減少、少なくとも又は約６５％の減少、少なくとも又は約７０％の減少、少なくとも又は約７５％の減少、少なくとも又は約８０％の減少、少なくとも又は約８５％の減少、少なくとも又は約９０％の減少、少なくとも又は約９５％の減少、少なくとも又は約１００％の減少）である。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物のＡＤＣＣ活性の減少は、対照又は参照抗体組成物のレベルと比較して、約１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約５％〜約４００％の範囲内の量だけ減少する。例示的な実施形態では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、又は約５倍減少する。例示的な実施形態では、抗体組成物のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少する。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のＡＤＣＣ活性のレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ減少する。

例示的な態様では、本開示の抗体組成物は、グリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ）の量が、対照又は参照抗体組成物と比較して任意の程度又はレベルにまで増加した抗体を含む。例示的な例では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも又は約１％〜約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも増加している。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のグリカンのレベルは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約５％〜約４００％の範囲内の量だけ増加する。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、又は約５倍増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加している。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ増加している。

例示的な態様では、本開示の抗体組成物は、グリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、又はこれらの組み合わせ）の量が、対照又は参照抗体組成物と比較して任意の程度又はレベルにまで減少した抗体を含む。例示的な例では、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、少なくとも又は約１％〜約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも減少している。例示的な実施形態では、本開示の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）のグリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約５％〜約４００％の範囲内の量だけ減少する。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、又は約５倍減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体組成物と比較して、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少している。例示的な実施形態では、本明細書に開示する抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）は、対照又は参照抗体組成物と比較して、グリカンが約０．５倍〜約８倍の範囲内の量だけ減少している。

例示的な態様では、本開示の抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）は、ガラクトシル化グリカン、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を、総量で少なくとも若しくは約０．５％、少なくとも若しくは約１％、少なくとも若しくは約２％、少なくとも若しくは約３％、少なくとも若しくは約５％、少なくとも若しくは約７％、少なくとも若しくは約１０％、少なくとも若しくは約１５％、少なくとも若しくは約２０％、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９６％、少なくとも若しくは約９７％、又は少なくとも若しくは約９８％、或いは総量で少なくとも又は約０．５％〜９８％の範囲で、或いは総量で０％〜１００％の範囲で含む。

例示的な態様では、本開示の抗体組成物（グリコシル化非フコシル化の抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体（トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む）など）は、ガラクトシル化グリカン、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、並びに非フコシル化グリカンを含み、ガラクトシル化グリカン、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種は、総量で少なくとも若しくは約０．５％、少なくとも若しくは約１％、少なくとも若しくは約２％、少なくとも若しくは約３％、少なくとも若しくは約５％、少なくとも若しくは約７％、少なくとも若しくは約１０％、少なくとも若しくは約１５％、少なくとも若しくは約２０％、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９６％、少なくとも若しくは約９７％、又は少なくとも若しくは約９８％、或いは総量で少なくとも又は約０．５％〜９８％の範囲で、或いは総量で０％〜１００％の範囲であり、非フコシル化グリカンは、総量で少なくとも約５％又は約５％超、或いは総量で約５％〜１００％である。

例示的な実施形態では、本明細書で提供される抗体組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わされる。したがって、本明細書では、本明細書に記載される組み換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物）及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油エマルションなどのエマルション、及び様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいくつかを含む。

以下の実施例は、単に本開示を説明するために与えられ、決してその範囲を限定するものではない。

以下の実施例は、非フコシル化ガラクトシル化グリカンを含む特定のグリカンの増加又は減少によって、ＩｇＧ１抗体及び抗体組成物のＡＤＣＣエフェクター機能を調節することを記載する。これらの実施例は、種々のグリカン濃縮及びリモデリングツールを適用し、次いで、細胞をベースとしたエフェクター機能アッセイでグリカン操作されたｍＡｂの影響を試験することによって、ＡＤＣＣ活性に対する治療用ＩｇＧ１ｍＡｂのガラクトシル化の影響を示す。フコシル化ｍＡｂ種及び非フコシル化ｍＡｂ種の両方についてＡＤＣＣに対する末端ガラクトースの詳細な影響を説明することができるように、所望のグリカン組成を有する材料を生成する努力がなされた。

以下の実施例では、以下の材料方法を用いた。

材料及び方法
治療用モノクローナル抗体のトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）及びインフリキシマブ（抗ＴＮＦα）をＣＨＯ細胞中に発現させ、標準的な製造プロセスにより高濃度溶液として製造した。この研究で用いたｍＡｂは、ＣＤ２０、ＥＧＦＲファミリーメンバーであるＨＥＲ２、及びＴＮＦαなどの受容体を標的としている。

トラスツズマブ、リツキシマブ及びインフリキシマブ上の末端ガラクトース残基の酵素によるリモデリング
β−（１−４）−ガラクトシダーゼ（ＱＡ−Ｂｉｏ）及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）のインビトロでの脱ガラクトシル化及びガラクトシル化能を利用して、トラスツズマブ、リツキシマブ及びインフリキシマブ用のガラクトースリモデリングシリーズの試料を作製した。ガラクトースを除去するために、トラスツズマブ、リツキシマブ及びインフリキシマブを、最初に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を含有する反応緩衝液の存在下、１／５０の比のβ−（１−４）−ガラクトシダーゼ（ＱＡ−Ｂｉｏ）と、３７℃で１〜２時間インキュベートした。次いで、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製（ガラクトシダーゼ及び他の成分を除去するために使用される）を、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステムで、予め充填したプロテインＡカラム（ＰｏｒｏｓＰｒＡ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて、３ｍＬ／分の流量で実施した。適切な量の各試料をカラムに注入した後、１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ／１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）をカラムに１．４分間通し、続いて１００％緩衝液Ｂ（０．１％酢酸）を２．９分間通し、その間に画分を集めた。溶出したｍＡｂを含有する画分を、３ｋＤａカットオフ膜を有するＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心フィルターを使用して所望の緩衝液系中に透析濾過した。

次いで、ガラクトースを所定のレベルに戻すために、試料を、１０ｍＭＵＤＰ−ガラクトース、１００ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭＭｎＣｌ_２及び０．０２％アジ化ナトリウムを含有する反応緩衝液中、３７℃で、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共にインキュベートした。酵素とｍＡｂの最終的な比は６／１（μＬ／ｍｇ）であり、ｍＡｂ濃度は２ｍｇ／ｍＬである。異なる時点で反応混合物から試料を取り出し、続いて瞬間冷凍して反応を停止させることにより、異なるレベルのガラクトースを有するｍＡｂを得た。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを、上記のようにプロテインＡクロマトグラフィーによって除去した。ＡＤＣＣアッセイのための最終ｍＡｂ濃度は、通常、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて１ｍｇ／ｍＬである。一般的には、ガラクトースリモデリング試料をアリコートし、ＡＤＣＣアッセイの前に約８０℃で保存した。

末端ガラクトースを有する場合と有さない場合の非フコシル化トラスツズマブ及びリツキシマブの調製
最初に、トラスツズマブ及びリツキシマブ原薬（「ＤＳ」）を、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣで、カスタマイズしたｇｌｙｃａｐ−３Ａカラム（低密度ＦｃγＩＩＩａ受容体、３×１５０ｍｍ、Ｚｅｐｔｅｏｎ）を使用して、２つの画分（フロースルー及び溶出液）に分離した。移動相Ａは、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌを含み、移動相Ｂは５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．２）であった。０．５ｍＬ／分の流量で勾配（０％Ｂで８分間保持、０％Ｂから１８％Ｂへ２２分間）を使用して、フコース濃縮（フロースルー）ｍＡｂ及び非フコース／ＨＭ濃縮（溶出）ｍＡｂの両方を得た。非フコシル化種及びＨＭ濃縮種の両方を含む溶出液画分を、Ｅｎｄｏ−Ｈ（ＱＡ−Ｂｉｏ、ＰＮＥ−ＥＨ０２）でさらに酵素処理して、高マンノース種を除去した。具体的には、５０ｍＭリン酸ナトリウムの反応緩衝液（ｐＨ５．５）中、３７℃で、２４時間、ｍＡｂをＥｎｄｏ−Ｈと共にインキュベートした。最終ｍＡｂ濃度は４ｍｇ／ｍＬである。

ＥｎｄｏＨ処理した非フコシル化画分をβ−（１−４）−ガラクトシダーゼと共に異なる条件でインキュベートすることによって、末端ガラクトースを有する非フコシル化ｍＡｂと末端ガラクトースを有さない非フコシル化ｍＡｂとを調製した。具体的には、５８８μｇの非フコシル化ｍＡｂ１を６０μＬの容量で、１２μＬのβ−（１−４）−ガラクトシダーゼ（ＱＡ−Ｂｉｏ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中に３Ｕ／ｍＬ）、２０μＬの５×反応緩衝液（２５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）及び５μＬの水と３７℃で２時間インキュベートした。最終ｍＡｂ濃度は６．１ｍｇ／ｍＬであり、総容量は９７μＬであった。４０μＬの反応混合物を取り出し、上記のようにプロテインＡクロマトグラフィーを用いてさらに精製した。この物質を非フコース濃縮Ｇ１物質として使用した。残りの５７μＬの反応混合物に、さらなるβ−（１−４）−ガラクトシダーゼ酵素（１７０μＬ）及び５×反応緩衝液を新たに添加し、続いて３７℃で４時間インキュベートして、非フコシル化トラスツズマブ種からの末端ガラクトースの完全な除去を確実にした。反応混合物中の最終トラスツズマブ濃度は１．２ｍｇ／μＬであった。生成した非フコシル化Ｇ０試料を、上記のようにプロテインＡクロマトグラフィーを用いてさらに精製した。

主にフコシル化Ｇ０Ｆ種を含有する、トラスツズマブに使用した対照試料もまた、フロースルー画分をβ−（１−４）−ガラクトシダーゼと共に、非フコシル化Ｇ０試料と同様の条件下（詳細は上記の段落に見出すことができる）でインキュベートすることによって生成した。このようなタイプの試料は、ＨＭ、非フコシル化及びガラクトシル化種が存在しないためにＡＤＣＣ活性がないと予想され、ＡＤＣＣアッセイで所望の活性範囲が確保されるように、非フコース濃縮Ｇ１及びＧ０と種々の比率でブレンドするために用いた。ｍＡｂ２Ｇ０Ｆ、Ｇ１及びＧ０濃縮試料を、トラスツズマブと同様の方法で生成した。

末端ガラクトースを種々のレベルで含むフコシル化トラスツズマブ及びリツキシマブの調製
ｇｌｙｃａｐ−３Ａカラムからフロースルー画分を集め、β（１，４）ガラクトシダーゼで処理して末端ガラクトースを除去することにより、様々なレベルのガラクトースを含むフコシル化トラスツズマブ及びリツキシマブを生成した。次いで、Ｇ０Ｆ濃縮ｍＡｂを、１０ｍＭのＵＤＰ−ガラクトース、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＭｎＣｌ_２、及び０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する反応緩衝液中で、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共に３７℃でインキュベートした。酵素とｍＡｂの最終的な比は６／１（μＬ／ｍｇ）であり、ｍＡｂ濃度は２ｍｇ／ｍＬであった。異なる時点で反応混合物からアリコートを取り出し、続いて瞬間冷凍して反応を停止させることにより、異なるレベルのガラクトースを有するｍＡｂを得た。プロテインＡクロマトグラフィーを実施し、溶出液を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心フィルターを使用して所望の緩衝液系に透析濾過した。

濃縮及びリモデリングしたグリカン種の特性評価
所望のグリカン特性及び最小レベルの高分子量種を確実にするために、濃縮及びリモデリングした全ての試料を、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で特性評価した。

ｍＡｂからグリカンを酵素／基質（Ｅ／Ｓ）比１／２５（μＬ／μｇ）のＰＮＧアーゼＦ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）を用いて放出させ、１２ｍｇ／ｍＬの２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、反応混合物を８０℃で７５分間インキュベートすることにより標識した。２−ＡＡ標識グリカンを、蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓＡｃｕｉｔｙ又はＨ−ＣｌａｓｓＵＰＬＣシステムで、ＢＥＨグリカンカラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分離した。カラム温度は５５℃に維持した。移動相Ａは１００ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を含み、移動相Ｂは１００％アセトニトリルであった。グリカンを高有機溶媒でカラムに結合させ、次いで、水性ギ酸アンモニウム緩衝液の勾配を増加させて溶出した（７６％Ｂを５分間保持し、続いて１４分間にわたって７６％Ｂ〜６５．５％Ｂへの勾配により溶出した）。

Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステムで、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）ＴＳＫ−ＧｅｌＧ３０００ＳＷＬＸＬ（７．８×３００ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、流量０．５ｍＬ／分で、高分子量種の分析を行った。通常、２０〜４０μｇの試料をロードし、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）及び２５０ｍＭのＮａＣｌを含有する移動相を用いて、μｇのサンプルをロードし、均一濃度で分離した。

トラスツズマブのＡＤＣＣ活性に対する全非フコシル化トラスツズマブ（Ｇ０及びＧ１）の影響の実験的測定
ＡＤＣＣに対する非フコシル化トラスツズマブの計算による全体的影響（これは、Ｇ０及びＧ１からの個々の影響、並びにＤＳロットに対するそれらの相対比に基づく）を確認するために、実験は全体的な非フコースの影響を直接測定するように設計された。

非フコシル化Ｇ１及びＧ０を４：３の比で有するトラスツズマブＤＳロットを、Ｅｎｄｏ−Ｈ（ＱＡ−Ｂｉｏ）で処理し、続いてＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣで、カスタマイズされたｇｌｙｃａｐ−３Ａカラム（低密度ＦｃγＩＩＩａ受容体、３×１５０ｍｍ、Ｚｅｐｔｅｏｎ）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーを実施した。Ｅｎｄｏ−Ｈ処理及びＦｃγＩＩＩａアフィニティークロマトグラフィー手順の詳細は、上述した手順と基本的に同じであった。ガラクトシル化種及び非ガラクトシル化種の両方を含む非フコシル化トラスツズマブを、さらに分離せずに、種々の比率でＧ０Ｆ濃縮ｍＡｂ１とブレンドし、続いてＡＤＣＣアッセイを行い、ＡＤＣＣ活性に対する両種の全体的な影響を測定した。

インビトロＡＤＣＣアッセイ
ＡＤＣＣアッセイを、エフェクター細胞としてＦｃγＩＩＩａ（１５８Ｖ）発現ＮＫ９２（Ｍ１）細胞を使用し、標的細胞としてトラスツズマブにＨＣＣ２２１８細胞、リツキシマブにＷＩＬ２−Ｓ細胞、インフリキシマブにＣＨＯＭＴ−３細胞を用いて行った。標的細胞を最初にカルセイン−ＡＭで標識した後、トラスツズマブについては３．３〜２０００ｎｇ／ｍＬ、リツキシマブについては０．０１５５〜１００ｎｇ／ｍＬ、インフリキシマブについては０．０１０２４ｎｇ／ｍＬ〜１０００００ｎｇ／ｍＬの漸増濃度でインキュベートした。次いで、エフェクター細胞を、約１〜２時間の間、２５：１のＥ：Ｔ比で、オプソニン化標的細胞に添加した。溶解した標的細胞から放出されたカルセインを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）蛍光プレートリーダーで反応上清の蛍光を測定することによって決定した。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用する拘束４パラメーターフィットを使用してデータを平均蛍光値にフィットさせ、ＥＣ５０標準／ＥＣ５０試料比によって計算し、参照標準に対するＡＤＣＣ活性の割合として報告した。各アッセイを３回行い、平均及び標準偏差を報告した。

抗原結合アッセイ
リツキシマブに対するＣＤ２０抗原結合アッセイを、蛍光阻害を報告する競合的アッセイフォーマットを利用して、ヒトβ−リンパ芽球様細胞株であるＷＩＬ２−Ｓ細胞を用いて行った。試験試料は、ＷＩＬ２−Ｓ細胞の細胞表面発現ＣＤ２０への結合について、参照標準の固定濃度のＡｌｅｘａ−４８８標識形態と競合する。０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＰＢＳ中で、４．９２〜３０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度範囲まで８つの濃度にわたって段階希釈することによって、参照標準、アッセイ対照及び試験試料の用量応答曲線を作成した。Ａｌｅｘａ−４８８標識競合体を最終的なウェル内濃度１００ｎｇ／ｍＬに希釈する。３０，０００細胞／ウェルに希釈した試料、競合体及びＷＩＬ２−Ｓ細胞を９６ウェルプレートに２連で加え、プレートシーラーで密封する。次いで、プレートを室温で４．５〜６時間インキュベートした後、Ａｃｕｍｅｎ（登録商標）ｅＸ３イメージングサイトメーター（ＴＴＰＬａｂｔｅｃｈ）で蛍光シグナルを測定する。蛍光シグナルの用量依存的減少が、試験試料の濃度の上昇に伴い検出される。参照標準試料に対する試験試料の相対ＣＤ２０結合を報告する。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏによる４パラメーター曲線フィットを使用してデータを平均発光値にフィットさせ、ＩＣ５０標準／ＩＣ５０試料を計算し、相対結合活性パーセントとして報告した。各試料を３つの独立したアッセイで試験し、最終結果を３回の測定の平均として報告する。トラスツズマブ結合アッセイを、ＳＫＢＲ−３を標的細胞として使用し、用量応答曲線を（０．０１６〜１０μｇ／ｍＬ）の範囲としたことを除いて、同様の方法で実施した。

実施例１
ＩｇＧ分子におけるＡＤＣＣ機能の高精度制御のための非フコシル化−ガラクトシル化及び非フコシル化−非ガラクトシル化グリカン基の組合せの使用
抗体のＡＤＣＣ活性を大きく増強する際のグリカン非フコシル化の役割は、この略２０年にわたって知られている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａｅｔａｌ．，２０１１）が、ガラクトシル化又は高マンノースなどの他のグリカン構造の成分の寄与は、十分には理解されていなかった。例えば、ガラクトシル化のＡＤＣＣへの影響に関する公表されたデータには議論の余地があった。グリカン構造の全体的な複雑さ及び不均一性には意味があり、一般的なモノクローナル抗体は多くは、２０を超える個々のグリカン種を示す。グリカン−ＡＤＣＣ関係及びグリカン組成物の全体的な複雑さに関する理解が限られているため、治療用抗体に対するＡＤＣＣ機能の正確な制御は依然として困難であった。種々のグリカン群におけるグリカン構造の例を図２に示す。

非フコシル化グリカン種のガラクトシル化は、非ガラクトシル化非フコシル化グリカン種と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体へのＩｇＧＦｃ領域の結合を直接的又はアロステリックな相互作用により増強させるという仮説が立てられた（図３Ｂ）。次に、モデリング法を用いて、ＡＤＣＣ活性に対して影響の最も大きいグリカン種を、トラスツズマブ抗体についてのＡＤＣＣ及びグリカンの試験結果からなる既存のデータセットによりスクリーニングし、同定した。グリカン−ＡＤＣＣモデリングにより、図４Ｂに示すように、非フコシル化種のガラクトシル化がＡＤＣＣを約２倍増強させることが確認された。

モデリングの結果は、トラスツズマブ材料を用いた実験的な糖鎖工学研究により確認された。これらの糖鎖工学研究は、ガラクトシル化を伴う精製非フコシル化種（Ａ２Ｇ１）のＡＤＣＣ活性が、ガラクトシル化を伴わない非フコシル化種（Ａ２Ｇ０）と比較して、勾配の比較でそれぞれ２０及び１３と、約２倍高いことを示した（実施例２〜４を参照）。さらなる糖鎖工学研究により、フコシル化種のガラクトシル化はＡＤＣＣに有意な影響を及ぼさないことが確認された（データは示さず）。

確立されたモデルを用いて、所望の目標ＡＤＣＣ範囲に基づくトラスツズマブグリカン種の設計空間を定義した（図４Ｃ）。増強されたグリカン−ＡＤＣＣの理解及びモデル設計空間を用いて、非フコシル化、非フコシル化ガラクトシル化、及び高マンノースのための限界を組み合わせた対照戦略を開発し、全非フコシル化及び高マンノースの対照と比較してＡＤＣＣ活性に対するより強力な対照を確実にした。

これらの実験は、非フコシル化ガラクトシル化が、個々のグリカン基の組成に対するＡＤＣＣ活性依存性の仮説主導のコンピュータ分析によって発見された、ＡＤＣＣの調節を担うＩｇＧ分子における重要なグリカン基であることを示した。非フコシル化ガラクトシル化がＡＤＣＣに最も強い影響を及ぼし、非フコシル化非ガラクトシル化がそれに続くことがわかった（グリカン群の定義については図２を参照）。フコシル化グリカンのガラクトシル化は、ＡＤＣＣ活性に対する寄与が最小であった。高マンノース群はＡＤＣＣへの寄与が中程度〜低程度であり、高マンノース群のレベルの変動が＜５％であれば実質的に有意ではなかった。この発見は、（実施例２〜４に記載するように）標的糖鎖工学実験によって後に確認された。非フコシル化ガラクトシル化群は、非フコシル化非ガラクトシル化グリカン種と比較して、ＡＤＣＣの影響力は約２倍大きかった。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、観察された差異は、ＦｃγＲｌｌｌａにより高い親和性で結合するためのＦｃ領域の構造変化を引き起こすか、又はＦｃグリカンとＦｃγＲｌｌｌａ受容体とのより高い親和性相互作用を指示する非フコシル化ガラクトシル化の能力によって引き起こされるようであった。この構造の仮説は、ＦｃγＲｌｌｌａ結合アッセイにおいて観察された同様の傾向によってさらに支持された。この知見は、イノベーター分子及びバイオシミラー分子の両方の所望の機能的ＡＤＣＣ標的を達成する治療用タンパク質のためのグリカン組成物の最適な選択、並びにＡＤＣＣの制御戦略に適用可能である。

実施例２
ＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響
ＦｃγＩＩＩａ受容体結合及びその後のＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの効果を調べるための有効な方法は、脱ガラクトシル化及び／又は完全ガラクトシル化タンパク質を生成し、次いで、ＡＤＣＣ活性に対するガラクトースの影響を試験することであった。しかしながら、大部分の治療用ＩｇＧ１は不均一なグリカン種の集団を含み、製剤内にはガラクトシル化されていない種、一部ガラクトシル化されている種、及び完全にガラクトシル化されている種の全てが存在する。さらに、完全にガラクトシル化された種（Ｇ２Ｆなど）は、一般的に他の２つのタイプの種と比較してわずかな割合でしか存在しない。例えば、Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｎｖｉｔｒｏｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｔｅｒｍｉｎａｌＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｅｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１．４０（３０）：ｐ．８８６８−７６を参照されたい。したがって、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性に対するガラクトシル化の影響を評価するために、関連する全てのグリカン形態の役割を解読する機会が存在する。ＦｃＮ結合型グリカン種の一般的な形態（０、１又は２個のガラクトース残基を有するものを含む）を図２に示す。

ガラクトシル化レベルの異なる試料を作製するために、まず、単一ロットのトラスツズマブ、リツキシマブ及びインフリキシマブ原薬（「ＤＳ」）をガラクトシダーゼで処理することにより、末端ガラクトースを除去した。次いで、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴアーゼ）を用いて、制御された選択的な方法で末端ガラクトースを付着させた。試料の調製及びグリカン分析のための詳細な手順は、上述した実施例の材料及び方法のセクションに記載される。Ｇａｌ付着実験において異なる時点で集めた試料は、異なるレベルのガラクトースを示しただけでなく、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆなどの関連する全てのガラクトシル化種も含有していた。各ｍＡｂ上の非フコシル化及び高マンノース種などの他の重要なグリカン種のレベルは、これらの操作において影響を受けず、これらの試料では、元のＤＳから一定に保たれた。ガラクトシル化レベルは意図的に変化し、数パーセント〜約９０％の広い範囲にわたった。末端シアリル化は、３種のｍＡｂ全てで、その低レベルのために示されなかった。

異なるレベルのガラクトースを有するこれらのＧａｌＴアーゼの経時的試料、トラスツズマブ、リツキシマブ及びインフリキシマブを、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、又は質量分析に基づくグリカン分析及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法を用いて試験し、所望のグリカン組成が達成され、高分子量（ＨＭＷ）種が存在しないことを確認した。対応するＡＤＣＣ機能アッセイで試験した全ての試料が予想されたグリカン種を含み、ＨＭＷ種は測定不能であるか又は最小であることがわかった。トラスツズマブ（「ｍＡｂ１」）、リツキシマブ（「ｍＡｂ２」）及びインフリキシマブ（「ｍＡｂ３」）について、末端ガラクトース、非フコース及び高マンノースを含むグリカン種のレベルを、それぞれ図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃの表に要約した。

次いで、ガラクトース再操作ｍＡｂを、細胞ベースの機能アッセイにおいて試験して、ＡＤＣＣ活性に対するガラクトシル化の影響を決定した。図６に、トラスツズマブ（「ｍＡｂ１」）、リツキシマブ（「ｍＡｂ２」）、及びインフリキシマブ（「ｍＡｂ３」）試料の相対ＡＤＣＣ活性を、末端ガラクトースの割合の関数として示す（Ｇ１Ｆ及びＧ１の両方が寄与したＧａｌ％を、Ｇ２Ｆなどの完全ガラクトシル化種に対して正規化した。Ｇａｌ％の計算については上記の方法のセクションを参照されたい）。トラスツズマブ及びインフリキシマブのいずれについても、ＡＤＣＣとＧａｌ％との間に正の相関が認められた。傾きによって表される影響係数（ＡＤＣＣ％／Ｇａｌ％）は図６Ａ及び６Ｃにそれぞれ示すように、トラスツズマブで２．８、インフリキシマブで０．３であった。対照的に、図６Ｂに示すように、末端ガラクトースはリツキシマブのＡＤＣＣ活性には影響を及ぼさないようであった。特に、トラスツズマブ及びインフリキシマブ抗体は非フコシル化が５％以上であり、リツキシマブ抗体は非フコシル化がわずか３％であった（図６Ａ〜６Ｃ参照）。

これらの結果は、ＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響がｍＡｂ特異的であり得ることを示した。言い換えれば、末端ガラクトシル化は、特定のＩｇＧ１に対して正の影響を有するか影響を有さないかのいずれかであり得る。しかしながら、この結論は、フコシル化及び非フコシル化の両タイプの種が試験試料中に存在したので、フコシル化及び非フコシル化ｍＡｂ上の末端ガラクトースが、それらのＡＤＣＣ活性に同様の影響を及ぼすという仮定によってのみ引き出すことができた。ＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの潜在的機能のより深い理解を持ち、ＡＤＣＣ活性のフコシル化／非フコシル化の潜在的影響を除外するために、非フコシル化ｍＡｂ及びフコシル化ｍＡｂに対するガラクトシル化の影響を別々に調べるためにさらなる試験を行った。実施例３を参照されたい。

グリカンの再操作／操作に関するもう一つの一般的な懸念は、標的細胞結合及びエフェクター機能活性の低下につながりうる抗原結合に意図せずに又は間接的に影響を及ぼす潜在的リスクである。トラスツズマブ及びリツキシマブの両方に対する競合的抗原結合アッセイを行い、末端ガラクトースを再操作したｍＡｂの対応する抗原に対する相対結合活性を試験した。図７Ａ及び７Ｂにそれぞれ示すように、トラスツズマブ及びリツキシマブの両方について、低、中及び高レベルのガラクトシル化を有する代表的な試料で変化はほとんど認められなかった。

実施例３
非フコシル化ｍＡｂのＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響
非フコシル化ｍＡｂ種に対するガラクトースの影響を評価するために、末端ガラクトースを有する非フコシル化種及び末端ガラクトースを有さない非フコシル化種の両方を生成した。実験計画では２つの因子を考慮した。第１に、代表的なｍＡｂ産生プロセスからのロットを出発物質と使用することによって、関連するグリカン種の影響に焦点を当てた。ここでは、非フコシル化Ｇ０及びＧ１グリカンが優勢な非フコシル化種であった。ガラクトースを含まない非フコシル化トラスツズマブ（Ｇ０）及びガラクトースを含む非フコシル化トラスツズマブ（Ｇ１）の両方は濃縮したが、他のグリカン属性（マンノースなど）は一定に保った。第２に、濃縮非フコシル化Ｇ０ｍＡｂ及びＧ１ｍＡｂは、ＡＤＣＣ応答が非フコシル化種（ＡＤＣＣ活性に大きな影響を有することが知られている）の高含量のためにアッセイの作業範囲外であるため、直接測定することができなかった。したがって、最小のＡＤＣＣ活性を有すると予想されるＧ０Ｆグリカンを濃縮したｍＡｂを、次に、非フコシル化Ｇ０及びＧ１種を濃縮した試料と種々の比でブレンドして、ブレンドした物質のＡＤＣＣ活性を各ｍＡｂのＡＤＣＣアッセイの作業範囲に収まるようにした。

非フコシル化ｍＡｂ及びフコシル化ｍＡｂの濃縮手順を、図８のワークフローに示す。まず、ＦｃγＩＩＩａ受容体ベースのアフィニティークロマトグラフィーを用いて、フコシル化種を非フコシル化及び高マンノース種から分離した。例えば、Ｂｏｌｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｎｏｎｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２０１３．２９（３）ｐ．８２５−８２８を参照されたい。次いで、フコシル化画分中のガラクトースを、ガラクトシダーゼを用いて除去して、優勢グリコフォームとしてＧ０Ｆを有するｍＡｂを生成した。次に、ＦｃγＩＩＩａ受容体カラムから溶出した画分において、ｅｎｄｏ−Ｈ処理によりｍＡｂから高マンノースグリカンを最初に除去することによって、非フコシル化種をさらに濃縮した。次に、続いて、エンドＨ処理した試料を、わずかに異なる酵素条件下でガラクトシダーゼにより処理して（実験の詳細は方法のセクションに記載されている）、非フコシル化Ｇ０及びＧ１濃縮ｍＡｂ試料を生成し、次いで、これらを３つの異なる比率でＧ０Ｆを濃縮したｍＡｂとブレンドした後、ＡＤＣＣ活性を測定した。ｍＡｂについてインタクト質量分析を行い、各工程を注意深く観察し、濃縮材料をＨＩＬＩＣ／質量分析に基づくグリカン分析によりさらに特性評価した。

トラスツズマブのＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響を決定するために、Ｇ０Ｆ、Ｇ０及びＧ１濃縮サンプルを、上記の方法セクションに記載のように作製した。関連するグリカン情報を図９Ａに示す。全非フコシル化レベルはＧ０及びＧ１濃縮試料で同等であった（３７〜３８％）が、Ｇ１グリコフォームのレベルはＧ１濃縮試料で１５％、Ｇ０濃縮試料で１％であった。Ｇ０濃縮試料をＧ０Ｆ濃縮試料と３つの異なる比率でブレンドして、Ｇ０−１で５％、Ｇ０−２で１１％、Ｇ０−３で１６％の非フコシル化トラスツズマブを含むＧ０系の試料を作製した。同様に、Ｇ１濃縮試料をＧ０Ｆとブレンドすることによって、Ｇ１系の試料を作製し、その非フコシル化レベルは、Ｇ１−１、Ｇ１−２及びＧ１−３でそれぞれ５％、１１％及び１６％であった。

Ｇ０系試料（Ｇ０−１、Ｇ０−２、Ｇ０−３）とＧ１系試料（Ｇ１−１、Ｇ１−２、Ｇ１−３）のＡＤＣＣ活性を並行して分析した。トラスツズマブの参照標準（通常、他のＤＳロット及びＤＰロットの一次参照として機能する十分に特性評価されたＤＳロット）と比較して、トラスツズマブＤＳロットの出発物質は平均で１１１％のＡＤＣＣ活性を示し、一方、Ｇ０Ｆ濃縮試料は１％の平均活性を有した（図９Ｂ、黒色のバー）。これは、最初のＤＳ物質がトラスツズマブ参照標準と同様の活性を有し、Ｇ０Ｆ濃縮ｍＡｂが高マンノース、非フコシル化及びガラクトシル化グリカン構造を有するトラスツズマブ種を除去したことによりＡＤＣＣ活性が最小になるという我々の予想と一致する。さらに、Ｇ１濃縮トラスツズマブ試料（Ｇ１−１、Ｇ１−２及びＧ１−３を含む）は、対応するＧ０試料のＧ０−１、Ｇ０−２及びＧ０−３のＡＤＣＣ活性（図９Ｂ、灰色のバー）よりも一貫して相対的に高いＡＤＣＣ活性を示した（図９Ｂ、パターンのあるバー）。さらに、図９Ｃに示すように、Ｇ０含量（上のパネル）及びＧ１含量（下のパネル）によるＡＤＣＣ活性については、定量的な線形相関が観察された。ＡＤＣＣ％／グリカン％として定義される影響係数は、Ｇ０では約１３であり（図９Ｃの上、勾配）、Ｇ１では約２１である（図９Ｃの下、勾配）。まとめると、ここで得られた結果は、末端ガラクトースを有する非フコシル化グリカンが末端ガラクトースを有さない非フコシル化グリカンよりも大きい影響を有することを示している。Ｇ１：Ｇ０の活性係数の比は、トラスツズマブについて約１．６である。

これらの結果は、非フコシル化Ｇ０及びＧ１グリカン種がいずれもＡＤＣＣ活性を刺激することができ、非フコシル化複合型グリカンへのガラクトースの添加がより活性が高いことを示した。したがって、ＡＤＣＣ活性に対する特定のｍＡｂの非フコシル化の全体的な影響は、非フコシル化Ｇ１種及び非フコシル化Ｇ０種の両グリコフォームが通常そのＤＳロット中に存在しているので、それらの相対レベルによって影響されるであろう。この研究で用いたＤＳロットは、Ｇ０種とＧ１種の相対比はトラスツズマブで４：３である。したがって、図９Ｃの個々の影響勾配とＧ１対Ｇ０の相対比に基づき、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性に対する非フコシル化の全体的な影響係数（ＡＤＣＣ％／Ａｆｕｃ％）は、次のように計算することができる：１３×４／７＋２１×３／７＝１６。

このトラスツズマブＡＤＣＣに対する非フコシル化の影響係数も実験的に測定した。簡単に記載すると、Ｇ０型及びＧ１型の両方を含む非フコシル化トラスツズマブを濃縮し、次いで、Ｇ０Ｆ濃縮トラスツズマブとブレンドして、種々のレベルの非フコシル化を有する一連の試料を作製し、次いで、ＡＤＣＣアッセイを用いて分析した。結果は、図１０に示すように、非フコシル化について測定された影響係数が１８であることを示し、全体として計算された影響係数と一致した。実験の詳細は、上記の方法セクションに記載した。

非フコシル化リツキシマブに関連するガラクトシル化の影響を理解するために、トラスツズマブと同様に、リツキシマブについても、非フコース及びガラクトースのリモデリング実験（図８に概要を示す）を実施した。これらの濃縮材料の非フコシル化グリカンレベルを図１１Ａ（下）に示す。Ｇ１濃縮リツキシマブ材料は、合計２９％の非フコシル化種のうち１２％のＧ１を有し、一方、Ｇ０濃縮材料は、わずか１％のＧ１と２９％のＧ０とを有した。これは、出発物質が含有する非フコシル化種が低レベル（２％）であっても、所望の種の濃縮に成功したことを示した。トラスツズマブについて行ったのと同様に、次に、Ｇ０及びＧ１濃縮サンプルを３つの異なる比率でＧ０Ｆとブレンドした。これらのブレンド試料は、最終的に、Ｇ０−１及びＧ１−１で５％、Ｇ０−２及びＧ１−２で１０％、Ｇ０−３とＧ１−３で１５％の非フコシル化レベルを含んでいた。リツキシマブに特異的なＡＤＣＣアッセイを用いて、Ｇ０系の試料（Ｇ０−１、Ｇ０−２、Ｇ０−３）、Ｇ１系の試料（Ｇ１−１、Ｇ１−２、Ｇ１−３）、出発ＤＳ材料、及びＧ０Ｆ濃縮材料についてＡＤＣＣ活性を測定した。

トラスツズマブと同様に、リツキシマブのＧ１系は、対応するＧ０系よりも全体的に高いＡＤＣＣ活性を示した（図１１Ａ）。リツキシマブＡＤＣＣ活性とグリカンレベルとの間の活性係数（図１１Ｂ、勾配）は、Ｇ０（上）で１９であり、Ｇ１（下）で２９であった。Ｇ１対Ｇ０の影響比は、リツキシマブで１．５であり、トラスツズマブ（１．６）と類似している。まとめると、トラスツズマブとリツキシマブの結果は、末端ガラクトースが非フコシル化ｍＡｂのＡＤＣＣ活性に有意な影響を及ぼすことを示した。

実施例４
フコシル化ｍＡｂのＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響
フコシル化トラスツズマブ及びリツキシマブのＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響の評価も実施した。まず、ＦｃγＩＩＩａアフィニティークロマトグラフィーからフロースルーを回収し、ガラクトシダーゼにより処理し、ＰｒｏＡクロマトグラフィーで浄化することにより、対応するＤＳロットからＧ０Ｆ濃縮トラスツズマブ及びＧ０Ｆ濃縮リツキシマブを作製した（図８、左）。次に、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼによるｍＡｂの酵素的リモデリングにより、末端ガラクトースをＧ０Ｆ種に加えた。このような酵素反応のインキュベーション時間を制御することにより、種々のレベルの末端ガラクトースを有する試料を得た。最後に、フコシル化トラスツズマブ及びフコシル化リツキシマブに対する末端ガラクトースの影響を、これらの異なるＧａｌ％を有する試料のＡＤＣＣ活性を、それらの対応する機能アッセイを用いて測定することにより評価した。トラスツズマブ（「ｍＡｂ１」）及びリツキシマブ（「ｍＡｂ２」）について得られた結果を、それぞれ図１２Ａ及び１２Ｂに示す。参照標準と比較したこれらのフコシル化試料の相対ＡＤＣＣ活性は、トラスツズマブ及びリツキシマブともに低かった。最高レベルの末端ガラクトース（約９０％）を有する最大ＡＤＣＣ活性は、トラスツズマブで１５％未満、リツキシマブで４０％未満である。さらに、影響係数（ＡＤＣＣ％／Ｇａｌ％）が２０を超える非フコシル化トラスツズマブ及び非フコシル化リツキシマブに対する末端Ｇａｌの影響（図９及び図１１）とは異なり、フコシル化トラスツズマブ及びフコシル化リツキシマブに対する末端Ｇａｌの影響は非常に小さく、影響係数はｍＡｂ１で約０．１であり、ｍＡｂ２で約０．２であった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。０〜９０％の範囲のガラクトシル化はＡＤＣＣ活性に、それがフコシル化ｍＡｂと関連している場合、有意な影響を及ぼす可能性が低いことを、この結果は示した。換言すれば、ＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響は、コアフコースの非存在によって有意に影響され、フコシル化ｍＡｂに対するその影響は無視できるものであった。

以下は、実施例２〜４の結果の考察である。

製品の品質属性の構造−機能関係を完全に理解することは、クオリティ・バイ・デザイン（ＱｂＤ）パラダイムの下でのタンパク質製剤開発にとって極めて重要である。ＩｇＧのＦｃ領域におけるＮ結合型グリコシル化はＡＤＣＣなどの抗体エフェクター機能の調節に重要な役割を果たすことはよく知られているが、個々のグリカン種の寄与は完全にはわかっていない。これは、一つには、治療用抗体で一般に観察されるグリカン構造の複雑さ及び不均一性による。生物学的機能に対する個々のグリカン種の影響を包括的に理解することは、所望の範囲のエフェクター機能の達成に最も関連する属性に焦点を当てることによって、制御戦略を最適化するのに役立ち得るであろう。

本研究では、ＡＤＣＣに対するガラクトシル化と非フコシル化の相互に関連する効果がトラスツズマブとリツキシマブの両方で明らかになった。末端ガラクトースは、主に非フコシル化ｍＡｂに存在するとＡＤＣＣ活性を増加させたが、フコシル化種では増加させなかった。重要な品質属性としての非フコシル化ＩｇＧ１に関連するガラクトシル化の確認は、ＦｃグリカンがどのようにＡＤＣＣを調節するかを理解するための有意な進歩である。このような徹底した理解は、生物学的製剤のための属性に焦点を当てた開発戦略の確立の促進に役立ち、非フコシル化末端ガラクトシル化などの重要な属性を制御することによって目標とする製品プロファイルの獲得を確実にする。一方、それはまた、フコシル化種に関連するガラクトシル化のような重要でないグリカン属性のための適切な柔軟性又は設計空間を可能にする。これらの結果は、ＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響をｍＡｂについて評価する場合、非フコシル化種に対する末端ガラクトースとフコシル化種に対する末端ガラクトースを区別する必要性を強調している。さらに、末端ガラクトースを含む非フコシル化グリカンと末端ガラクトースを含まない非フコシル化グリカンの、特定のｍＡｂのＡＤＣＣに対する影響係数が得られれば、それらを用いて非フコシル化の全体的な影響係数を計算することができる。これは、例えば、トラスツズマブを使用することによって確認され、非フコシル化の計算による影響係数は実験で測定された値と良好に一致する。これは、非フコシル化Ｇ０対非フコシル化Ｇ１の比がロットごとに異なる場合に特に有用であり、その理由は、非フコシル化の過度の影響を、時間のかかる実験を行う必要なしに予測され得るからである。

トラスツズマブとリツキシマブの両方で観察されるグリカンの相互に関連する作用は、トラスツズマブとリツキシマブが異なる抗原を標的とし、末端ガラクトシル化の影響を評価するために異なる標的細胞を用いた異なる分子に特異的なＡＤＣＣアッセイを有することを考えると、他のＩｇＧ１分子にも適用できる可能性がある。

ＡＤＣＣ活性の重要なグリカン属性としての非フコシル化末端ガラクトースの確認が、非フコシル化末端ガラクトースとフコシル化末端ガラクトースが分離されなかった図６に示すように、トラスツズマブ（「ｍＡｂ１」）、リツキシマブ（「ｍＡｂ２」）、及びインフリキシマブ（「ｍＡｂ３」）についての末端ガラクトースの総合的な影響評価の結果と一致することもまた注目に値する。具体的には、末端ガラクトースのＡＤＣＣ活性への影響の程度は、それらの対応する傾きによって示されるように、トラスツズマブ（「ｍＡｂ１」）＞インフリキシマブ（「ｍＡｂ３」）＞リツキシマブ（「ｍＡｂ２」）の順であり、これは、トラスツズマブ（「ｍＡｂ１」）（８％）、インフリキシマブ（「ｍＡｂ３」）（５％）及びリツキシマブ（「ｍＡｂ２」）（３％）における非フコシル化種の割合と同じ傾向である。フコシル化ガラクトシル化の寄与は無視できるものであった。図６Ｂに示すように、リツキシマブＡＤＣＣに対するガラクトースの影響係数が全体的に低かった（約０）ことは注目すべきことである。理論に束縛されるものではないが、この観察は、分子に特異的なＡＤＣＣアッセイの変動とバックグラウンドノイズが混合された、この試料中の非フコシル化グリコフォームの低い含量によるものであろう。これらの知見は、ＡＤＣＣ機能に対する末端ガラクトースの影響を研究するための任意の努力がコアフコースを説明する必要があることをさらに強調する。本研究で得られた知見はまた、末端ガラクトースのＡＤＣＣ活性に及ぼす影響の報告に一貫性がない（影響がない、又は正の影響がある）理由を説明することができよう。β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ処理は、フコシル化種及び非フコシル化種の両方に末端ガラクトースを加えることができる（Ｗａｒｎｏｃｋ，ｅｔａｌ．，ＩｎｖｉｔｒｏｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＩｇＧａｔ１ｋｇｓｃａｌｅｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，２００５．９２（７）：ｐ．８３１−４２）ので、特定のｍＡｂのＡＤＣＣに対するガラクトシル化全体の影響は、非フコシル化グリカン種及びフコシル化グリカン種の相対レベルに依存し、ｍＡｂが最小レベルの非フコシル化グリカン種を有する場合、検出されるガラクトースの影響は無視できる程度であり得、ｍＡｂがより高いレベルの非フコシル化種（例えば、５％以上の非フコシル化）を有する場合、有意な影響が予想され得る。

ガラクトースが非フコシル化ｍＡｂ及びフコシル化ｍＡｂのＡＤＣＣ活性に対しいかにして影響を及ぼすかについての構造的基礎は明らかではない。ＩｇＧ１上の末端ガラクトースはＦｃγＩＩＩａ受容体に直接結合することができ、且つ／又は抗体の構造変化を引き起こすことにより、ＩｇＧ１の受容体への結合に間接的に影響することができる。いくつかの異なるグリカン形態を有するＩｇＧ１Ｆｃ断片の結晶構造に基づき、ガラクトシル化（主にフコシル化されている）がＦｃ構築物中のＣＨ２ドメイン間の空間距離を増加させ、これによりＦｃγＩＩＩａ受容体に結合するより多くのアミノ酸残基が露出され得ると示唆された。例えば、Ｋｒａｐｐ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｕｍａｎＩｇＧ−Ｆｃｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓｒｅｖｅａｌｓａｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．２００３，３２５，９７９−９８９を参照されたい。一方、水素／重水素交換（Ｈ／ＤＸ）の使用による、異なるレベルの末端ガラクトース（Ｇ０、Ｇ１及びＧ２）を有する非フコシル化ＩｇＧでは、構造の差は観察されなかった。例えば、Ｈｏｕｄｅ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙａｆｆｅｃｔＩｇＧ１ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１０．９（８）：ｐ．１７１６−２８を参照されたい。受容体とｍＡｂ間の特有の炭水化物−炭水化物相互作用の発見は、Ｆｃγ受容体に対する非フコシル化ＩｇＧ１対フコシル化ＩｇＧ１の結合親和性が１００倍にも達する理由を明らかにした。Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｕｎｉｑｕｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎＦｃγＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｌａｃｋｉｎｇｃｏｒｅｆｕｃｏｓｅ．ＰＮＡＳ，２０１１（１０８），ｐ．１２６６９−１２６７４。

グリコシル化は主要な翻訳後修飾の１つであり、タンパク質フォールディング、構造、分布、安定性及び活性に有意な潜在的効果を有する。Ｇ０及びＧ１の両グリカン形態を有するＩｇＧ１がヒト血清中に少なくとも低レベルで存在することを考えると（例えば、Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇｇｌｙｃａｎｆｏｒｍｓｏｆｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓＧ１ａｎｄＧ２．２０１０，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０（４７），２０７４−２０８２を参照）、天然に存在する抗体のエフェクター機能に対するガラクトシル化及び非フコシル化についての相互に関連するグリカンの影響の関連性を考慮することが有益であり得る。このような相互作用によって、免疫系がこの種の重要な細胞活性に対してより微妙な調節及び制御を行うことが可能になり得る。このような制御がＡＤＣＣを含む適応免疫応答に存在するかどうかを明らかにするために、さらなる抗体及び関連する実験系を使用する実験が今後行われる必要がある。

要約すると、ＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの生物学的影響の包括的評価が複数のＩｇＧ１で行われた。出願人らの結果は、ＡＤＣＣ活性に対する末端ガラクトースの影響の程度がコアフコース構造の有無に依存することを示している。非フコシル化ｍＡｂに対する末端ガラクトースはＡＤＣＣ活性に有意な影響を示したが、フコシル化グリカン構造に関連した末端ガラクトースでは観察された影響は極めて小さかった。このようなグリカン構造が生物活性にどのように影響するかについての深い知識は、ＱｂＤパラダイムにおける目標の製品品質プロファイルの確立及び属性に焦点を当てた製品開発の確保に重要な役割を果たす。

選択的参照文献
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本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれるとあたかも示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。上記の発明は、理解を明確にする目的で、説明や例によってある程度詳細に記載されているが、本開示の教示に照らして、開示された実施形態の精神又は範囲から逸脱することなく、それに対して特定の変更及び修正がなされ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で使用される項目の見出しは、単に構成を目的とするものに過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、その範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役目をするものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をさらに明らかにするものであり、別段の主張がない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。

本開示を実行するために、本発明者らには既知の最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上述の記載を読めば、当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、また、本発明者らは、本明細書で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用される法により認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の全ての可能な変形形態におけるそれらの要素の任意の組合せが、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、本開示に包含される。

Claims

グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を制御する方法であって、
（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び
（２）前記組成物内のＩｇＧ１抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させることによって、前記グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程
を含む方法。
参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性にマッチさせる方法であって、
（１）参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；
（２）前記参照ＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有するＩｇＧ１抗体を含む第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；及び
（３）前記第２の抗体組成物内の１つ以上の抗体のコンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させることによって、前記第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性を変化させる工程
を含み、
末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の前記第２の抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、前記参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物と同じであるか、又は前記参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は前記参照グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の約１％〜約５０％以内である、方法。
グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物の特定の目標抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を操作する方法であって、
（１）グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を決定する工程；
（２）目標ＡＤＣＣ活性を決定する方法；及び
（３）コンセンサスグリコシル化部位におけるグリカン種中の末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させることによって、前記グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性を増加又は減少させる工程
を含み、
末端β−ガラクトースの量を増加又は減少させた後の前記グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、前記目標ＡＤＣＣ活性と同じであるか、又は前記目標ＡＤＣＣ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％若しくは約５０％以内であるか、又は前記目標ＡＤＣＣ活性の約１％〜約５０％以内である、方法。
工程１は、工程２及び／又は工程３の前、後又は同時に行われる、或いは工程２は、工程１及び／又は工程３の前、後又は同時に行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
非フコシル化グリカン中のβ−ガラクトースの約１％の増加は、ＡＤＣＣ活性を約２０％〜約３０％増加させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
非フコシル化グリカン中のβ−ガラクトースの約１％の減少は、ＡＤＣＣ活性を約２０％〜約３０％減少させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記グリカン種中の前記末端β−ガラクトースは、前記ＩｇＧ１抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ２又はハイブリッド型ガラクトシル化種である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＩｇＧ１抗体及び／又は参照抗体は、真核宿主細胞で産生される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＩｇＧ１抗体及び／又は参照抗体は、ＣＨＯ細胞で産生される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記グリコシル化非フコシル化ＩｇＧ１抗体組成物又は第２の抗体組成物は、非フコシル化グリカンを総量で約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約７％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％若しくは約９９％、又は総量で約０．５％〜１００％の範囲、総量で約３％〜１００％の範囲、総量で約５％〜１００％の範囲、又は総量で約８％〜１００％の範囲を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＩｇＧ１抗体組成物又は参照抗体組成物は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＣＤ２０抗体を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記ＩｇＧ１抗体組成物又は参照抗体組成物は、トラスツズマブ、インフリキシマブ又はリツキシマブを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体組成物のＡＤＣＣ活性は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約１倍、約２倍、約３倍若しくは約４倍増加若しくは減少するか、又は約５％〜約４００％増加若しくは減少する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体組成物の末端β−ガラクトースの量は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％若しくは約２００％増加若しくは減少するか、又は総量で約０．５％、約１％、約２％、約３％、約５％、約７％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％若しくは約９８％まで増加若しくは減少するか、又は総量で約０％〜１００％まで増加若しくは減少する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＤＣＣ活性は、細胞ベースのアッセイ又は結合アッセイを用いて測定又は決定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞ベースのアッセイは、ＮＫ９２細胞又はＰＭＢＣ細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
前記結合アッセイは、ＦｃγＲＩＩＩａを含む、請求項１５に記載の方法。
前記抗体組成物中の末端β−ガラクトースの量は、抗体を発現する細胞を、前記抗体の前記グリカン種中の末端β−ガラクトースの量を調節する細胞培養培地中で培養することによって増加又は減少させる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
前記末端β−ガラクトースの量は、化学薬品又は酵素を用いて増加又は減少させる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記酵素は、Ｅｎｄｏ−Ｓ２、β−（１−４）−ガラクトシダーゼ、Ｅｎｄｏ−Ｈ、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＰＮＧアーゼ−Ｆからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって生成されるＩｇＧ１抗体組成物であって、前記抗体組成物は、参照ＩｇＧ１抗体組成物と比較して、増加又は減少したＡＤＣＣ活性を有し、前記参照ＩｇＧ１抗体組成物は、前記増加又は減少したＡＤＣＣ活性を有するＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有するＩｇＧ１抗体を含む、ＩｇＧ１抗体組成物。
前記抗体組成物は、前記参照抗体組成物と比較して、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％若しくは約２００％、又は約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍増加したＡＤＣＣ活性、或いは前記参照抗体組成物と比較して、約０．５倍〜約８倍増加したＡＤＣＣ活性を有する、請求項２１に記載のＩｇＧ１抗体組成物。
前記抗体組成物は、前記参照抗体組成物と比較して、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％若しくは約２００％、又は約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍減少したＡＤＣＣ活性、又は前記参照抗体組成物と比較して、約０．５倍〜約８倍減少したＡＤＣＣ活性を有する、請求項２１に記載のＩｇＧ１抗体組成物。
前記ＩｇＧ１抗体組成物は、トラスツズマブ、リツキシマブ又はインフリキシマブを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の抗体組成物。
前記トラスツズマブ抗体は、
ａ．（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び
ｂ．（ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン
を含むか、若しくは
ｃ．配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン、及び
ｄ．配列番号８を含む重鎖可変ドメイン
を含む；
又は、前記リツキシマブ抗体は、
ａ．（ｉ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び
ｂ．（ｉ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン
を含むか、若しくは
ｃ．配列番号１７を含む軽鎖可変ドメイン、及び
ｄ．配列番号１８を含む重鎖可変ドメイン
を含む；
又は、前記インフリキシマブ抗体は、
ａ．（ｉ）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び
ｂ．（ｉ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン
を含むか、若しくは
ｃ．配列番号３１を含む軽鎖可変ドメイン、及び
ｄ．配列番号３２を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２４に記載の抗体組成物。
請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の抗体組成物と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。