KR20230087539A - 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸 - Google Patents

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알라 폴로조바
첸디 니우
램지 에이. 살림
스리칸트 수라바잘라
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암젠 인크
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Abstract

항체 조성물 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계 및 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량 및/또는 ADCC 수준에 기반하여 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함하는 항체 조성물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 관련 방법, 및 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다.

Description

항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
관련 출원에 대한 상호 참조
2020년 10월 15일자로 출원된 미국 가특허출원 제63/092,281호, 및 2021년 3월 19일자로 출원된 미국 가특허출원 제63/163,131호의 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익이 본 명세서에 의해 주장되며, 각각의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
본 명세서와 동시에 제출되어 다음과 같이 확인되는 컴퓨터 판독 가능 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전체가 참조로 포함된다: 30,284 바이트 ASCII(텍스트) 파일명 "A-2626-WO-PCT_Seq_Listing_ST25.txt"; 2021년 10월 12일자로 생성.
글리코실화는 예를 들어 단백질 폴딩, 품질 관리, 분자 이동 및 분류, 및 세포 표면 수용체 상호작용을 포함하는 다수의 세포 기능에서 역할을 하므로 가장 흔하지만 영향력 있는 번역 후 변경 중 하나이다. 글리코실화는 치료학적 당단백질의 생물활성, 약동학, 면역원성, 용해도 및 생체내 청소율에 영향을 미치므로 재조합 단백질 약물의 치료학적 효율에 영향을 미친다. Fc 당형태 프로파일은 특히 항체의 임상 효율 및 약동학에 직접 영향을 미치므로 재조합 항체에 대한 제품 품질 속성이다.
Fc-CH2 도메인에서 보존된 이중-안테나 글리칸과 관련된 특정 글리칸 구조는 항체 효과기 기능들, 예를 들어, 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 매개하는 Fc-감마 수용체(FcγR)와 Fc 도메인의 상호작용에 강력하게 영향을 미칠 수 있다(문헌[Reusch D, Tejada ML. Fc glycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes. Glycobiology 2015; 25:1325-34] 참조). 예를 들어, 코어 푸코스는 FcγRIIIa 결합 친화도에 상당한 영향을 미쳐 ADCC 활성에 실질적인 변화를 일으키는 것으로 입증되었다(문헌[Okazaki A, et al. Fucose depletion from human IgG1 oligosaccharide enhances binding enthalpy and association rate between IgG1 and FcgammaRIIIa. Journal of molecular biology 2004; 336:1239-49]; [Ferrara C, et al. Unique carbohydrate-carbohydrate interactions are required for high affinity binding between FcgammaRIII and antibodies lacking core fucose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011; 108:12669-74] 참조). 또한 고 만노스 수준은 ADCC 활성을 조절하는 역할을 하지만, 코어 푸코스보다 훨씬 더 완만하고, 덜 예측 가능한 정도인 것으로 나타났다(문헌[Thomann M, et al. Fc-galactosylation modulates antibody-dependent cellular cytotoxicity of therapeutic antibodies. Molecular immunology 2016; 73:69-75]). 코어 푸코스는 Fc 도메인이 FcγR과 상호작용하는 것을 입체적으로 방해하는 것으로 보고되었기 때문에, 어푸코실화된 글리칸 및 고 만노스 글리칸을 포함하여 코어 푸코스가 결여된 글리칸 그룹에 많은 연구가 집중되었다.
Fc-FcγRIIIa 상호작용의 기존 지식은 단일 Fc 사슬에 대한 FcγRIIIa 결합에 초점을 맞추고 있다. 그러나, IgG 및 IgG Fc 영역을 갖는 융합 단백질을 포함하는 단백질 치료 분자는 전형적으로 2개의 글리코실화된 Fc 사슬을 함유하기 때문에, FcγRIIIa 결합 상호작용 및 결과적인 ADCC 활성에 대한 글리칸 쌍의 효과는 알려져 있지 않다. 다양한 인자들이 글리칸 구조에 영향을 미치고, 이에 따라 단백질(당단백질)의 최종 글리코실화 형태(당형태)에 영향을 미친다. 예를 들어, 항체를 발현하는 세포주, 세포 배양 배지, 공급 배지 조성물 및 세포 배양 동안의 공급 시기는 단백질의 당형태의 제조에 영향을 미칠 수 있다. 연구 그룹이 항체의 특정 당형태의 수준에 영향을 미치는 많은 방식을 제안하였지만, 특정 항체 조성물에 대해 주어진 당형태 프로파일에 기반한 해당 항체 조성물의 효과기 기능을 예측하는 단순하고 효율적이고, 신뢰할 수 있는 방법에 대한 생물약제 산업에 대한 필요가 여전히 있다.
항체 조성물의 비결합 글리칸 함량이 항체 조성물에 대한 ADCC 활성 수준과 관련된다는 것을 뒷받침하는 데이터가 본원에 제시된다. 데이터는 또한 항체 조성물의 비결합 글리칸 함량을 변화시킴으로써 항체 조성물의 ADCC 활성 수준이 변경될 수 있음을 뒷받침한다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 ADCC 활성 수준과 관련되며, 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경시키면 항체 조성물의 ADCC 활성 수준의 변경이 초래된다.
따라서, 본 개시내용은 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 변경시키는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량을 증가시켜, ADCC 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 예시적인 예에서, 방법은 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 증가시켜, ADCC 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량을 감소시켜, ADCC 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 다양한 예에서, 방법은 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 감소시켜, ADCC 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 또는 상대적 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 약 1% 변경될 때 ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 15% 변경된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸이 1% 증가할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 15% 증가된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸이 1% 감소할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 15% 감소된다. 일부 양태에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 약 10% 내지 약 15%와 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 약 10% 내지 약 15%의 합으로 변경된다. 선택적으로, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 약 12% 내지 약 13%와 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 약 12.5% 내지 약 13.5%의 합으로 변경된다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 항체는 항-TNF 항체, 선택적으로, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 또는 세르톨리주맙 페골이다. 대안적인 양태에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량이 약 1% 변경되고, 항체 조성물의 항체가 항-HER2 항체, 선택적으로, 트라스투주맙 또는 퍼투주맙인 경우, 약 10% 내지 약 15% 변경된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량이 1% 증가할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 15% 증가된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량이 1% 감소할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 15% 감소된다. 다양한 예에서, ADCC의 수준은 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 변화에 따라 변경되지 않는다.
본 개시내용은 또한 항체 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (i) 항체 조성물 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; 및 (ii) (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 샘플은 항체 조성물의 항체를 발현시키는 세포, 예를 들어 글리코실화-적격 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 취한다. 선택적으로, 방법은 세포 배양물의 하나 이상의 조건을 변경하여, 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경하는 단계 및 변경된 세포 배양물 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 표적 범위 내에 있을 때까지 상기 변경을 반복하는 것을 포함한다. 예시적인 양태에서, 표적 범위는 기준 항체에 대한 ADCC 활성 수준의 표적 범위 및 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 항체 조성물의 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 고 만노스 글리칸 함량과 상관시키는 모델, 선택적으로, 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량과 상관시키는 모델에 기반한다. 예시적인 예에서, 기준 항체는 인플릭시맙(infliximab)이다. 예시적인 양태에서, 기준 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)이다. 선택적으로, 항체가 항-TNF 항체, 예컨대, 인플릭시맙인 경우, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 표적 범위는 약 80% 내지 약 90%이고/이거나 상대적 비결합 고 만노스 글리칸의 표적 범위는 약 75% 내지 약 85%이다. 선택적으로, 항체가 항-HER2 항체, 예컨대, 트라스투주맙인 경우, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 표적 범위는 약 95% 내지 약 99%이고/이거나, 상대적 비결합 고 만노스 글리칸의 표적 범위는 약 25% 내지 약 35% 미만이다. 다양한 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 생산과 관련하여 실시간으로 결정된다. 다양한 예에서, 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 표적 범위 내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위해 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 ADCC 활성 수준과 상관관계가 있다. 선택적으로, 방법은 (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 선택적으로, 방법은 ADCC 활성 수준이 표적 범위 내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위해 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 다운스트림 처리를 위해 항체 조성물을 선택하는 단계는 특정 수준의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 갖는 항체 조성물을 생산하는 클론을 선택하는 것을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 항체 조성물을 제조하는 방법은 (i) 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; (ii) (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 항체 조성물의 ADCC 수준을 결정하는 단계; 및 (iii) (ii)에서 결정된 항체 조성물의 ADCC 수준이 표적 ADCC 범위내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 항체 조성물을 제조하는 방법은 (i) 항체 조성물의 항체를 발현하는 글리코실화-적격 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 채취한 항체 조성물 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; (ii) 선택적으로, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 조정하기 위해 세포 배양물을 변경시키고 변경된 세포 배양물로부터 채취한 항체 조성물 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; 및 (iii) 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다.
항체 조성물을 생산하는 본원에 개시된 방법의 다양한 양태에서, 방법은 본 개시내용의 방법에 따라 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 단계를 포함한다. 다양한 예에서, 방법은 힌지 영역 디설파이드 결합에 대한 N-말단 부위에서 항체 중쇄를 절단하여 항체 단편을 형성하는 효소로 항체 조성물을 처리함으로써 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 단계, (ii) 크로마토그래피로 항체 단편을 분리하는 단계, 및 (iii) 각 항체 단편을 정량하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 부위는 IgG1 항체 중쇄의 서열 KTHTCPP(서열번호 1)의 Thr과 His 사이 또는 Lys와 Thr 사이에 있다. 다양한 양태에서, 항체 단편은 Fab 단편 및 글리코실화 Fc 단편을 포함한다. 다양한 예에서, 항체 단편은 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 통해 분리된다. 일부 양태에서, 각 항체 단편의 정량화는 질량 분석법을 포함한다. 선택적으로, 글리코실화 Fc 단편은 다양한 글리칸 모이어티 중 하나에 부착된 Fc 단편을 포함하고, 상기 방법은 부착된 글리칸 모이어티에 따라 글리코실화 Fc 단편을 분리하고 정량화하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하고, 이는 선택된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 갖는 항체 조성물을 생산하는 클론을 선택하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 (i) 힌지 영역 디설파이드 결합에 대한 N-말단 부위에서 항체 중쇄를 절단하여 항체 단편을 형성하는 효소로 항체 조성물을 처리하는 단계, (ii) 크로마토그래피로 항체 단편을 분리하는 단계, 및 (iii) 각 항체 단편을 정량화하는 단계를 포함하는, 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 방법을 추가로 제공한다. 다앙?h 양태에서, 효소는 시스테인 프로테아제이다. 다양한 예에서, 효소는 IgdE 프로테아제 계열의 구성원이며, 선택적으로, 스트렙토코커스(Streptococcus)로 발현되는 IgdE이다. 다양한 예에서, 효소는 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)에 의해 발현되는 IgdE 프로테아제와 구조적으로 동일하거나 매우 유사하다. 다양한 양태에서, 효소는 포르피로모나스(Porphyromonas) 혐기성 미생물에 의해 발현되는 효소와 구조적으로 동일하거나 매우 유사하다. 다양한 예에서, 효소는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 의해 발현되는 효소와 구조적으로 동일하거나 매우 유사하다. 예시적인 양태에서, 효소는 진기페인 K("Kgp"로도 지칭될 수 있음)이다. 다양한 예에서, 부위는 IgG1 항체 중쇄의 서열 KTHTCPP(서열번호 1)의 Thr과 His 사이 또는 Lys와 Thr 사이에 있다. 다양한 양태에서, 항체 단편은 Fab 단편 및 글리코실화 Fc 단편을 포함한다. 예시적인 양태에서, (ii)의 분리는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 포함한다. 예시적인 양태에서, (iii)의 정량화는 질량 분석법을 포함한다. 다양한 예에서, 글리코실화 Fc 단편은 다양한 글리칸 모이어티 중 하나에 부착된 Fc 단편을 포함하고, 상기 방법은 부착된 글리칸 모이어티에 따라 글리코실화 Fc 단편을 분리하고 정량화하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸이 정량화된다.
도 1a는 예시적인 글리칸 구조의 예시이다. 도 1b는 예시적인 글리칸 기의 예시이다.
도 2a는 대표적인 글리칸 맵 크로마토그램(전면도; y축 최대 약 440.00 EU))이다. 도 2b는 대표적인 글리칸 맵 크로마토그램(확대도; y축 최대 약 44.00 EU)이다.
도 3는 푸코스 대사의 회수 경로 및 신생 경로의 다이어그램이다. 회수 경로에서, 유리 L-푸코스는 GDP-푸코스로 전환되는 한편, 신생 경로에서, GDP-푸코스는 GMD 및 Fx에 의해 촉매된 3개의 반응을 통해 합성된다. GDP-푸코스는 이후 GDP-Fuc 트랜스퍼라제에 의해 세포기질로부터 골지 루멘으로 수송되고, 수용체 올리고사카라이드 및 단백질로 옮겨진다. 다른 반응 생성물인 GDP는 루멘 뉴클레오타이드 디포스파타제에 의해 구아노신 5-모노포스페이트(GMP) 및 무기 포스페이트(Pi)로 전환된다. 전자는 (GDP-푸코스의 수송과 커플링된 역수송 시스템을 통해) 세포기질로 배출되는 한편, 후자는 골지 음이온 채널인 GOLAC를 통해 골지 루멘을 떠나는 것으로 상정된다. 예를 들어, Nordeen et al. 2000; Hirschberg et al. 2001을 참고한다.
도 4a 내지 4d는 비결합 또는 쌍 글리칸을 갖는 예시적인 항체의 도면이다. 도 4a는 비결합 아푸코실화 글리칸 A2G1의 도면이다. 도 4b는 쌍 A2G1 글리칸의 도면이다. 도 4c는 비결합 고 만노스 5(HM5) 글리칸의 도면이다. 도 4d는 쌍 HM5 글리칸의 도면이다.
도 5는 37℃에서 하룻밤동안 FabALACTICA로 처리하기 전과 후 항체의 예시이다. FabALACTICA-분해 물질에 대해 MS 검출을 통한 크로마토그래피 분리를 수행하여 Fab 단편과 글리코실화 Fc 단편을 분리했다.
도 6a는 항체 A의 쌍 글리칸 맵 크로마토그램이고, 도 6b는 항체 B의 쌍 글리칸 맵 크로마토그램이다.
도 7은 항체 A 및 항체 B에 대한 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도(%) 및 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도(%)의 그래프이다. 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도(%)는 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율을 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율과 쌍 아푸코실화 글리칸의 백분율의 합으로 나누고, 100%를 곱하여 계산되었다. 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도는 비결합 고 만노스 글리칸의 백분율을 비결합 고 만노스 글리칸의 백분율과 쌍 고 만노스 글리칸의 백분율의 합으로 나누고, 100%를 곱하여 계산되었다.
도 8a는 세포-기반 ADCC 분석의 개략도이다. 도 8b는 항체 A에 대한 NK92 ADCC 분석의 대표적인 용량-반응 곡선이다. 각 용량 지점은 3회 반복의 평균 ± 표준 편차이다. 분석 신호 = 형광
도 9a는 항체 A의 측정된 아푸코실화 글리칸 함량(%)의 함수로서 플롯된 세포-기반 ADCC 분석에 의해 측정된 항체 A의 상대적 ADCC 활성 수준(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p<0.0001.
도 9b는 항체 A의 측정된 고 만노스 글리칸 함량(%)의 함수로서 플롯된 세포-기반 ADCC 분석에 의해 측정된 항체 A의 상대적 ADCC 활성 수준(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p=0.0009.
도 9c는 수학식 1을 사용하여 계산된 항체 A의 예측된 ADCC 활성 수준(%)에 대해 플롯된 세포-기반 ADCC 분석에 의해 측정된 항체 A의 실제 ADCC 활성 수준(%)의 그래프이다.
도 10a는 항체 B의 측정된 아푸코실화 글리칸 함량(%)의 함수로서 플롯된 세포-기반 ADCC 분석에 의해 측정된 항체 B의 상대적 ADCC 활성 수준(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p<0.0001.
도 10b는 항체 B의 측정된 고 만노스 글리칸 함량(%)의 함수로서 플롯된 세포-기반 ADCC 분석에 의해 측정된 항체 B의 상대적 ADCC 활성 수준(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p=0.3263.
도 10c는 식 2를 사용하여 계산된 항체 B의 예측된 ADCC 활성 수준(%)에 대해 플롯된 세포-기반 ADCC 분석에 의해 측정된 항체 B의 실제 ADCC 활성 수준(%)의 그래프이다.
도 11은 항체 B에 대한 측정된 FcγRIIIa 결합의 함수로서 플롯된 측정된 ADCC 활성 수준(%)의 그래프이다.
도 12는 항체 B의 온전한 질량 분석으로부터의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼이며, 여기서 표시된 글리칸 쌍에 대한 피크가 나타나 있다.
도 13은 37℃에서 60분 동안 GingisKHAN로 처리하기 전과 후 항체의 예시이다. GingisKHAN-분해 물질에 대해 MS 검출을 통한 크로마토그래피 분리를 수행하여 Fab 단편과 글리코실화 Fc 단편을 분리하였다.
도 14a는 도 13에 기술된 분리 및 검출로부터의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다. 도 14b는 표지된 글리칸 쌍을 갖는 Fc 단편의 피크의 확대도이다.
도 15는 개별 Fc 글리칸 쌍 종의 용출을 나타내는 추출된 이온 크로마토그램의 예이다.
도 16a는 항체 C의 아푸코실화 글리칸 함량(%)의 측정된 총 풍부도의 함수로서 플롯된 항체 C의 측정된 FcγRIIIa 결합(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p=0.1838. 도 16b는 항체 C의 고 만노스 글리칸 함량(%)의 측정된 총 풍부도의 함수로서 플롯된 항체 C의 측정된 FcγRIIIa 결합(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p=0.1086. 도 16c는 식 3을 사용하여 아푸코실화 글리칸 함량의 총 풍부도 및 고 만노스 글리칸 함량의 총 풍부도를 기반으로 계산된 항체 C의 예측된 FcγRIIIa 결합(%)에 대해 플롯된 항체 C의 실제(측정된) FcγRIIIa 결합(%)의 그래프이다. RMSE=16.797; r2=0.45; p=0.0679.
도 17a는 항체 C의 비결합 아푸코실화 글리칸(%)의 상대적 풍부도의 함수로서 플롯된 항체 C의 측정된 FcγRIIIa 결합(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p=0.0022. 도 17b는 항체 C의 비결합 고 만노스 글리칸(%)의 상대적 풍부도의 함수로서 플롯된 항체 C의 측정된 FcγRIIIa 결합(%)의 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. p=0.0099. 도 17c는 식 4를 사용하여 비결합 아푸코실화 및 비결합 고 만노스 글리칸을 기반으로 계산된 항체 C의 예측된 FcγRIIIa 결합(%)에 대해 플롯된 항체 C의 실제(측정된) FcγRIIIa 결합(%)의 그래프이다. RMSE=13.071; r2=0.67; p=0.0071.
항체와 같은 단백질의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 방법, 및 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 데이터는 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량이 항체 조성물의 ADCC 활성 수준과 상관관계가 있고, 항체 조성물의 ADCC 활성 수준이 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 변경함으로써 변경될 수 있음을 시사한다. 더 높은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 함량이 상대적 쌍 글리칸 함량보다 ADCC 활성 수준에 더 큰 영향을 미치므로, 상대적 비결합 글리칸 함량의 퍼센트 변화가 상대적 쌍 글리칸 함량의 동일한 퍼센트 변화보다 ADCC 활성 수준에 더 큰 영향을 미칠 것임이 추가로 고려된다. 따라서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 선택된 수준의 ADCC를 달성하기 위해, 선택된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 선택된 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 갖는 항체 조성물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라, 선택된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 선택된 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 갖는 항체 조성물을 생성하는 클론이 선별되거나 선택될 수 있다. 항체 조성물은 클론으로부터 생성될 수 있다.
글리코실화, 글리칸 및 글리칸 측정 방법
많은 분비된 단백질은 당 모이어티(예를 들어, 글리칸, 사카라이드)가 단백질의 특이적 아미노산에 공유 부착되는 과정인 번역 후 글리코실화를 겪는다. 진핵생물 세포에서, 2가지 유형의 글리코실화 반응이 생긴다: (1) 글리칸이 인식 서열 Asn-X-Thr/Ser(여기서, "X"는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)의 아스파라긴에 부착된 N 연결 글리코실화, 및 (2) 글리칸이 세린 또는 트레오닌에 부착된 O 연결 글리코실화. 글리코실화 유형(N 연결 또는 O 연결)과 무관하게, 각각의 부위(O 또는 N)와 연관된 글리칸 구조의 큰 범위로 인해 단백질 당형태의 미세이질성이 존재한다.
모든 N-글리칸은 공통 코어 당 서열: Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr (Man3GlcNAc2Asn)을 갖고, 3개의 유형 중 하나로 분류된다: (A) 2개의 N-아세틸글루코사민(GalNAc) 모이어티 및 적어도 5개(예를 들어, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개)의 만노스(Man) 잔기로 이루어진 고 만노스(HM) 또는 올리고만노스(OM) 유형, (B) 2개 초과의 GlcNAc 모이어티 및 임의의 수의 다른 당 유형을 포함하는 복합 유형 또는 (C) 가지의 일 측에서 Man 잔기를 포함하고 복합 가지의 기부에서 GlcNAc를 포함하는 하이브리드 유형. (문헌[Stanley et al., Chapter 8: N-글리칸, Essentials of Glycobiology, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009로부터 변경됨) 도 1a는 N-글리칸의 3개의 유형을 보여준다.
IgG 분자에서 발견되는 N-결합 글리칸은 전형적으로 갈락토스(Gal), N-글루코스(GLc), N-아세틸글루코사민(ClcNAc), 글루코사민(GlcN), 만노스(Man), 푸코스(Fuc)의 하나 이상의 단당류를 포함하며, 예시적인 글리칸, 이들의 정체성 및 그룹 분류는 도 1b에 도시되어 있다.
N-결합 글리코실화는 소포체(ER)에서 시작하며, 여기서 복잡한 반응 세트가 본질적으로 2개의 GlcNAc 잔기 및 3개의 Man 잔기로 제조된 코어 글리칸 구조의 부착을 일으킨다. ER에서 형성되는 글리칸 복합체는 골지 기구에서 효소의 작용에 의해 개질된다. 당류가 효소에 대해 비교적 접근 불가능한 경우, 이는 전형적으로 원래 HM 형식으로 유지된다. 효소가 당류에 접근할 수 있는 경우, 여러 Man 잔기가 절단 제거되고 당류가 추가 개질되어, 복합 유형 N-글리칸 구조를 생성한다. 예를 들어, 시스-골지에 있는 만노시다제-1은 HM 글리칸을 절단하거나 가수분해할 수 있는 반면, 내측-골지에 있는 푸코실트랜스퍼라제 FUT-8은 글리칸을 푸코실화한다(Hanrue Imai-Nishiya (2007), BMC Biotechnology, 7:84).
따라서, 글리칸 구조의 당 조성 및 구조 구성은 여러 인자들 중에서도 ER 및 골지 기구에서의 글리코실화 기구, 글리칸 구조에 대한 기계 효소의 접근성, 각각의 효소의 작용의 순서 및 단백질이 글리코실화 기계로부터 방출되는 단계에 따라 달라진다.
당단백질 함유 조성물에 존재하는 글리칸을 평가하기 위한 또는 당단백질을 포함하는 특정 샘플의 당형태 프로파일(예를 들어, 당프로파일)을 결정하거나 검출하거나 측정하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은 양이온 MALDI-TOF 분석, 음이온 MALDI-TOF 분석, 약음이온 교환(WAX) 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피(NP-HPLC), 엑소글리코시다아제 분해, Bio-Gel P-4 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피 및 1차원 n.m.r. 분광학, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌[Mattu et al., JBC 273: 2260-2272 (1998); Field et al., Biochem J 299(Pt 1): 261-275 (1994)]; 문헌[Yoo et al., MAbs 2(3): 320-334 (2010) Wuhrer M. et al., Journal of Chromatography B, 2005, Vol.825, Issue 2, pages 124-133]; 문헌[Ruhaak L.R., Anal Bioanal Chem, 2010, Vol. 397:3457-3481] 및 문헌[Geoffrey, R. G. et. al. Analytical Biochemistry 1996, Vol. 240, 페이지 210-226]을 참조한다. 또한, 본 명세서에 제시된 실시예 1은 당단백질-함유 조성물, 예를 들어, 항체 조성물에 존재하는 글리칸을 평가(예를 들어, 결정, 확인, 정량화)하기 위한 적합한 방법을 기재한다. 이 방법은 글리칸이 쌍인지 비결합인지를 검출하는데 사용되지 못할 것이다. 실시예 1의 방법은 조성물의 글리코실화된 단백질, 예를 들어, 항체 조성물의 항체에 부착된 글리칸이 단백질(예를 들어, 항체)로부터 효소적으로 절단되는 분석을 기재한다. 글리칸은 후속적으로 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)에 의해 분리되며 몇몇 피크를 갖는 크로마토그램이 생성된다. 크로마토그램의 각 피크는 상이한 글리칸의 분포(양 또는 풍부도)를 나타낸다. 상이한 글리칸에 대해 피크를 포함하는 대표적인 HILIC 크로마토그램의 2개의 도면이 도 2a 및 도 2b에 제공된다. 이러한 목적을 위해, % 피크 면적 = 피크 면적/총 피크 면적 x 100%이다. 따라서, 특정 글리칸(또는 글리칸 그룹)의 수준은 %로서 보고된다. 예를 들어, 항체 조성물이 30%의 Man6 수준을 갖는 것을 특징으로 한다면, 조성물의 항체로부터 절단된 모든 글리칸의 30%가 Man6이라는 것을 의미한다. 본원에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 단백질로부터 글리칸을 제거한 다음 글리칸의 조성을 분석하는 통상적인 방법이 단백질에 대한 글리칸 함량의 분포를 확인할 수 있음에 주목한다. 그러나, 그러한 방법은 쌍 글리칸 및/또는 비결합 글리칸에 관한 정보를 제공하지 않는다.
본 개시내용은 항체 조성물의 고 만노스 글리칸 및 아푸코실화 글리칸에 관한 것이다(예를 들어, 도 1b 참조). 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "고 만노스 글리칸" 또는 "HM 글리칸"은 5, 6, 7, 8 또는 9개의 만노스 잔기를 포함하는 글리칸을 포함하며, 이들은 각각 Man5 또는 M5, Man6 또는 M6, Man7 또는 M7, Man8 또는 M8, 및 Man9 또는 M9로서 약칭된다. 다양한 양태에서, HM 글리칸의 수준은 %Man5, %Man6, %Man7, %Man8 및 %Man9를 합함으로써 얻어진다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "아푸코실화된 글리칸" 또는 "AF 글리칸"은 코어 푸코스, 예를 들어, N-글리코실화 부위의 Asn과의 아마이드 결합에 수반된 GlcNAc 잔기 상의 α1,6-연결 푸코스가 없는 글리칸을 지칭한다. 아푸코실화 글리칸은 A1G0, A2G0, A2G1 (a 및 b), A2G2 및 A1G1M5를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 고 만노스 글리칸은 또한 코어 푸코스가 부족하지만(따라서 아푸코실화 글리칸의 서브세트를 나타냄), 고 만노스 글리칸은 특정 특성을 가지며 별도의 글리칸 그룹으로 지칭될 수 있음에 주목한다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 고 만노스는 별개의 특성을 나타내는 것으로 이해되며, 어푸코실화 글리칸과 별개로 분류되거나 부가적인 특성으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Reusch and Tejada, Glycobiology 25(12): 1325-1334 (2015)]을 참조. 다양한 양태에서, 어푸코실화 글리칸의 수준은 % A1G0, % A2G0, % A2G1a, % A2G1b, % A2G2, % A1G1M5, % A1G1a를 합함으로써 얻어진다.
예시적인 양태에서, 글리칸(예를 들어, % HM 글리칸, % AF 글리칸)의 수준(예를 들어, 양, 풍부도)은 당단백질-함유 조성물에 존재하는 글리칸을 평가하거나 또는 당단백질을 포함하는 특정 샘플의 당형태 프로파일(예를 들어, 당프로파일)을 결정, 검출 또는 측정하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법 중 어느 것에 의해 결정된다(예를 들어, 측정된다). 예시적인 예에서, 항체 조성물의 글리칸(예를 들어, % HM 글리칸, % AF 글리칸)의 수준(예를 들어, 양, 풍부도)은 크로마토그래피-기반 방법, 예를 들어, HILIC를 통한 항체 조성물의 샘플에서 이러한 글리칸의 수준(예를 들어, 양, 풍부도)을 측정함으로써 결정되고, 글리칸의 수준(예를 들어, 양, 풍부도)은 본 명세서에 기재된 바와 같이 %로서 표현된다. 예를 들어, 실시예 1을 참조한다. 예시적인 예에서, 항체 조성물의 글리칸 수준은 조성물의 항체로부터 절단된 모든 글리칸의 %로서 표현된다. 다양한 양태에서, 글리칸(예를 들어, % HM 글리칸, % AF 글리칸)의 수준(예를 들어, 양, 풍부도)은 항체 조성물의 샘플에서 이러한 글리칸 수준을 측정함으로써 결정된다(예를 들어, 측정된다). 예시적인 예에서, 항체 조성물의 샘플을 취하고 각 샘플에 대한 글리칸(예를 들어, % HM 글리칸, % AF 글리칸)의 수준(예를 들어, 양, 풍부도)이 결정된다(예를 들어, 측정된다). 다양한 양태에서, % HM 글리칸 및/또는 % AF 글리칸이 결정된다.
글리칸 쌍형성 및 항체 조성물의 비결합 글리칸의 측정 방법
다양한 예에서, 당단백질은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 다양한 양태에서, 각각의 폴리펩티드 사슬은 글리코실화된다. 예를 들어, 당단백질은 항체의 2개의 Fc 사슬을 포함할 수 있고, 각각의 Fc 사슬은 글리칸에 공유 결합된다. 예를 들어, 당단백질은 각각 글리코실화 Fc 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 항체일 수 있다. 다양한 양태에서, 하나의 Fc 사슬에 부착된 글리칸은 다른 Fc 사슬에 부착된 글리칸과 다른 범주에 속한다. 다른 예에서, 하나의 Fc 사슬에 부착된 글리칸은 다른 Fc 사슬에 부착된 글리칸과 동일하거나, 동일한 글리칸 범주에 있다. 하나의 Fc 사슬에 부착된 글리칸이 다른 Fc 사슬에 부착된 글리칸과 동일하거나 동일한 글리칸 범주에 있는 경우, 글리칸은 "쌍을 이룬" 것으로 간주된다. 다양한 예에서, "쌍을 이룬" 글리칸은 (a) 동일한 글리칸 (예를 들어, 각 Fc 사슬에 부착된 구조적으로 동일한 글리칸) 또는 (b) 동일한 글리칸 범주에 속하는 비동일 글리칸(예를 들어, 글리칸이 동일한 글리칸 범주에 속하는 각각의 Fc 사슬에 부착된 구조적으로 동일하지 않은 글리칸, 예를 들어 2개의 아푸코실화된 글리칸, 또는 다른 예로서 2개의 푸코실화된 글리칸)인 각 Fc 사슬의 글리칸을 지칭한다. Fc 사슬에 부착된 글리칸이 서로 다른 글리칸 범주에 속하는 경우, 글리칸은 "비결합" (예를 들어 아푸코실화 글리칸 및 푸스코실화 글리칸)으로 간주된다. 다양한 양태에서, "비결합"은 Fc 사슬에 부착된 글리칸이 쌍을 이루지 않았다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "글리칸 범주"는 각각 "푸코실화된" 및 "아푸코실화된"으로 지칭될 수 있는 코어 푸코스의 존재 또는 부재에 의해 결정된다. 하나의 Fc 사슬에 부착된 글리칸이 아푸코실화되고(즉, 코어 푸코스가 결여됨), 다른 Fc 사슬에 부착된 글리칸이 코어 푸코스를 포함하는 경우, 글리칸은 "비결합 아푸코실화 글리칸"으로 간주된다. 비결합 아푸코실화 당단백질의 경우, 글리칸 그룹은 Fc 사슬 사이에서 서로 다른 푸코실화 상태를 가지며, 그중 하나의 Fc 사슬만이 코어 푸코스가 결여된 글리칸에 공유 결합된다 (예를 들어 첫 번째 Fc 사슬의 아푸코실화 글리칸 및 두 번째 Fc 사슬 상의 푸코실화된 글리칸). 하나의 Fc 사슬만이 코어 푸코스(F)를 갖는 쌍에 "비결합 아푸코실화" 상태가 할당될 수 있고, "쌍" 상태는 Fc 사슬 중 어느 것도 코어 푸코스를 갖지 않는 쌍에 할당될 수 있다. 비결합 아푸코실화 글리칸은 예를 들어, 하나의 Fc 사슬 상의 A1G0, A2G0, A2G1a, A2G1b, 또는 A2G2 및 다른 Fc 사슬 상의 코어 푸코스를 포함하는 글리칸을 포함한다. "쌍 아푸코실화 글리칸"은 (a) 각각의 Fc 사슬에 동일한 아푸코실화 글리칸(예를 들어, 동일한 구조의 아푸코실화 글리칸) 또는 (b) 각각의 Fc 사슬에 동일하지 않은 아푸코실화 글리칸(예를 들어, 상이한 구조를 갖는 아푸코실화 글리칸)을 갖는 것을 지칭한다. 쌍 아푸코실화 글리칸은 예를 들어, 각 Fc 사슬에 A1G0, A2G0, A2G1a, A2G1b, 또는 A2G2 중 임의의 것을 포함한다. 쌍 아푸코실화 글리칸은 예를 들어, (i) 하나의 Fc 사슬에 A1G0, 및 다른 Fc 사슬에 A2G0, A2G1a, A2G1b, 또는 A2G2, 또는 (ii) 하나의 사슬에 A2G0, 및 다른 Fc 사슬에 A2G1a, A2G1b, 또는 A2G2, 또는 (iii) 하나의 Fc 사슬에 A2G1a, 및 다른 Fc 사슬에 A2G1b 또는 A2G2, 또는 (iv) 하나의 Fc 사슬에 A2G1b, 및 다른 사슬에 A2G2를 포함한다. 쌍 아푸코실화 글리칸은 또한 예를 들어, 각 Fc 사슬에 코어 푸코스가 결여된 동일한 비-고 만노스 글리칸(예를 들어, 각 Fc 사슬에 Man3), 또는 하나의 Fc 사슬에 코어 만노스가 결여된 비-고 만노스 글리칸, 및 다른 Fc 사슬에 비-고 만노스가 결여된 또 다른 아푸코실화 글리칸(예를 들어, A1G0, A2G0, A2G1a, A2G1b, 또는 A2G2)을 포함한다. "쌍 푸코실화" 상태는 각 Fc 사슬이 코어 푸코스를 갖는 쌍에 할당될 수 있다.
예시적인 예에서, 글리칸 (예를 들어, 쌍 아푸코실화 글리칸, 비결합 아푸코실화 글리칸)은 또한 고 만노스의 존재 또는 부재로 특징지어진다. 예를 들어, "쌍 아푸코실화 글리칸"의 하나 또는 둘 모두의 글리칸이 고 만노스를 포함하는 경우, 글리칸은 "쌍 고 만노스 글리칸"으로 특징지어진다. 또한, 예를 들어, "비결합 아푸코실화 글리칸"의 하나 또는 둘 모두의 글리칸이 고 만노스를 포함하는 경우, 글리칸은 "비결합 고 만노스 글리칸"으로 특징지어진다. 예시적인 쌍 고 만노스 글리칸은 (a) 각 Fc 사슬에 동일한 고 만노스 글리칸(예를 들어, 동일한 구조의 고 만노스), 예컨대 각 사슬에 Man5, Man6, Man7, Man8 또는 Man9, 또는 (b) 동일하지 않은 고 만노스 글리칸 (예를 들어, 상이한 구조를 갖는 고 만노스 글리칸)을 갖는 글리칸을 포함하지만, 각각의 고 만노스 글리칸은 Man5, Man6, Man7, Man8 또는 Man9 (예를 들어, 하나의 Fc 사슬에 Man5, 및 다른 Fc 사슬에 Man6, Man7, Man8, 또는 Man9, 하나의 Fc 사슬에 Man6, 및 다른 Fc 사슬에 Man7, Man8, 또는 Man9, 또는 하나의 사슬에 Man7, 및 다른 Fc 사슬에 Man8 또는 Man9, 또는 하나의 Fc 사슬에 Man8, 및 다른 Fc 사슬에 Man9)를 포함한다. 예시적인 비결합 고 만노스 글리칸은 하나의 사슬에 Man5, Man6, Man7, Man8 또는 Man9, 및 다른 사슬에 푸코실화 글리칸을 갖는 글리칸을 포함한다.
"쌍" 및 "비결합" 글리칸의 예는 표 3 및 4에 제공되어 있다. "쌍" 및 "비결합" 글리칸의 추가 예는 도 4a~4d에 도시되어 있으며, 여기서 도 4a는 비결합 아푸코실화 글리칸을 갖는 항체를 예시하며, 도 4c는 비결합 고 만노스 글리칸을 갖는 항체를 예시하며(글리칸이 비결합이고, 글리칸 중 하나가 고 만노스이기 때문임), 도 4b는 쌍 아푸코실화 글리칸을 갖는 항체를 예시하며, 도 4d는 쌍 고 만노스 글리칸을 갖는 항체를 예시한다.
당단백질을 포함하는 조성물, 예를 들어, 항체 조성물은 그의 쌍 글리칸 함량 및 그의 비결합 글리칸 함량에 관하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 그의 쌍 아푸코실화 글리칸 함량 및 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 그의 쌍 고 만노스 함량 및 비결합 고 만노스 함량에 관하여 특징화될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 글리칸의 풍부도는 상대적 또는 절대적 풍부도로 지칭될 수 있다. 예시적인 예에서, 글리칸의 절대 함량은 글리칸 자체의 수준을 측정하는 단위, 예를 들어 질량, 몰, 부피 단위당 질량 또는 몰 단위, 임의 단위, 또는 곡선하 면적(예를 들어, 크로마토그래프로 측정될 수 있음)에 관하여 표현될 수 있다. 예시적인 예에서, 당단백질, 또는 이를 포함하는 조성물은 비결합 글리칸의 그의 상대적 풍부도에 관하여 특징화되며, 이는 비결합 글리칸의 양이 쌍 글리칸과 당단백질의 비결합 글리칸, 또는 이의 조성물의 합에 대한 양으로 표현됨을 의미한다. 예시적인 양태에서, 당단백질, 또는 이를 포함하는 조성물은 비결합 아푸코실화 글리칸의 그의 상대적 풍부도에 관하여 특징화된다. 예시적인 양태에서, 당단백질, 또는 이를 포함하는 조성물은 비결합 고 만노스 글리칸의 그의 상대적 풍부도에 관하여 특징화된다. "상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량" 및 "상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸"과 동의어인 용어 "비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도"는 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율을 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율과 쌍 아푸코실화 글리칸의 백분율의 합으로 나누고 100%를 곱하여 계산된다. "상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량" 및 "상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸"과 동의어인 용어 "비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도"는 비결합 고 만노스 글리칸의 백분율을 비결합 고 만노스 글리칸의 백분율과 쌍 고 만노스 글리칸의 백분율의 합으로 나누고 100%를 곱하여 계산된다.
"상대적 쌍 아푸코실화 글리칸 함량" 및 "상대적 % 쌍 아푸코실화 글리칸"과 동의어인 용어 "쌍 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도"는 쌍 아푸코실화 글리칸의 백분율을 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율과 쌍 아푸코실화 글리칸의 백분율의 합으로 나누고 100%를 곱하여 계산된다. "상대적 쌍 고 만노스 글리칸 함량" 및 "상대적 % 쌍 고 만노스 글리칸"과 동의어인 용어 "쌍 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도"는 쌍 아푸코실화 글리칸의 백분율을 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율과 쌍 아푸코실화 글리칸의 백분율의 합으로 나누고 100%를 곱하여 계산된다. 본 개시내용의 다양한 양태에서, 글리칸 범주의 상대적 % 비결합 글리칸과 글리칸 범주의 상대적 % 쌍 글리칸의 합은 100%이다. 본 개시내용의 다양한 양태에서, 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸과 상대적 % 쌍 아푸코실화 글리칸의 합은 100%이다. 따라서, 다양한 양태에서, 상대적 % 쌍 아푸코실화 글리칸이 알려져 있는 경우, 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸은 100%에서 상대적 % 쌍 아푸코실화 글리칸을 빼서 결정(예를 들어, 계산)될 수 있다. 또한, 다양한 예에서, 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸이 알려져 있는 경우, 상대적 % 쌍 아푸코실화 글리칸은 100%에서 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸을 빼서 결정(예를 들어, 계산)될 수 있다. 본 개시내용의 다양한 양태에서, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸과 상대적 % 쌍 고 만노스 글리칸의 합은 100%이다. 따라서, 다양한 양태에서, 상대적 % 쌍 고 만노스 글리칸이 알려져 있는 경우, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸은 100%에서 상대적 % 쌍 고 만노스 글리칸을 빼서 결정(예를 들어, 계산)될 수 있다. 또한, 다양한 예에서, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸이 알려져 있는 경우, 상대적 % 쌍 고 만노스 글리칸은 100%에서 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸을 빼서 결정(예를 들어, 계산)될 수 있다.
본 개시내용은 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (i) 힌지 영역 디설파이드 결합에 대한 N-말단 부위에서 항체 중쇄를 절단하여 항체 단편을 형성하는 효소로 항체 조성물을 처리하는 단계, (ii) 크로마토그래피로 항체 단편을 분리하는 단계, 및 (iii) 각 항체 단편을 정량화하는 단계를 포함한다. 다앙?h 양태에서, 효소는 시스테인 프로테아제이다. 다양한 예에서, 효소는 IgdE 프로테아제 계열의 구성원이며, 선택적으로, 스트렙토코커스(Streptococcus)로 발현되는 IgdE이다. 다양한 예에서, 효소는 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)에 의해 발현되는 IgdE 프로테아제와 구조적으로 동일하거나 매우 유사하다. 다양한 양태에서, 효소는 포르피로모나스(Porphyromonas) 혐기성 미생물에 의해 발현되는 효소와 구조적으로 동일하거나 매우 유사하다. 다양한 예에서, 효소는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 의해 발현되는 효소와 구조적으로 동일하거나 매우 유사하다. 다양한 예에서, 부위는 IgG1 항체 중쇄의 서열 KTHTCPP(서열번호 1)의 Thr과 His 사이 또는 Lys와 Thr 사이에 있다. 다양한 양태에서, 항체 단편은 Fab 단편 및 글리코실화 Fc 단편을 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)로 항체 단편을 분리하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 각 항체 단편을 질량 분석법으로 정량화하는 단계를 포함한다. 다양한 예에서, 글리코실화 Fc 단편은 다양한 글리칸 모이어티 중 하나에 부착된 Fc 단편을 포함하고, 상기 방법은 부착된 글리칸 모이어티에 따라 글리코실화 Fc 단편을 분리하고 정량화하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸이 정량화된다. 다양한 예에서, 항체 조성물의 쌍 아푸코실화 글리칸 및/또는 쌍 고 만노스 글리칸이 정량화된다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸, 비결합 고 만노스 글리칸, 쌍 아푸코실화 글리칸 및 쌍 고 만노스 글리칸이 정량화된다. 항체 조성물의 비결합 글리칸 함량을 결정하는 예시적인 방법은 본원에서 실시예 2에 기재된다. 실시예 5는 또한 항체 조성물의 비결합 글리칸 함량을 결정하는 예시적인 방법을 입증한다.
ADCC 및 ADCC 활성 수준을 변경시키는 방법
본원에 제시된 데이터는 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량이 항체 조성물의 ADCC 활성 수준과 관련이 있고, 항체 조성물의 ADCC 활성 수준이 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 변경함으로써 변경될 수 있음을 뒷받침한다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 ADCC 활성 수준과 관련되며, 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경시키면 항체 조성물의 ADCC 활성 수준의 변경이 초래된다. 상대적 비결합 글리칸 함량(예를 들어, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량)은 상대적 쌍 글리칸 함량 (예를 들어, 상대적 쌍 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 쌍 고 만노스 글리칸 함량)보다 ADCC에 더 큰 영향을 미치므로, 상대적 비결합 글리칸 함량의 퍼센트 변화는 상대적 쌍 글리칸 함량의 동일한 퍼센트 변화보다 ADCC에 더 큰 영향을 미치게 될 것임을 추가로 고려한다. 따라서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경시키는 단계를 포함한다.
용어 "ADCC" 또는 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "항체-의존적 세포의 세포독성"은 면역계의 효과기 세포(예를 들어, 자연 살해 세포 (NK 세포), 대식세포, 호중구, 호산구)가 표적 세포를 능동적으로 용해시키고, 이의 막-표면 항원이 특정 항체에 의해 결합되게 하는 메커니즘을 지칭한다. ADCC는 적응 면역 반응의 일부이며, 항원-특이적 항체가 (1) 이의 항원-결합 영역을 통해 표적 세포 상의 막-표면 항원에 결합하고, (2) Fc 영역을 통해 효과기 세포의 표면 상의 Fc 수용체에 결합할 때 일어난다. Fc 수용체에 대한 항체의 Fc 영역의 결합은 효과기 세포가 (예를 들어, 세포 용해 또는 세포의 탈과립화를 통해) 표적 세포의 사멸을 야기하는 세포독성 인자를 방출시키도록 야기한다.
Fc 수용체는 항체의 Fc 영역에 결합하는 B 림프구, 여포 수지상 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 혈소판 및 비만세포 표면 상의 수용체이다. Fc 수용체는 이들이 결합하는 항체 유형에 기반하여 상이한 분류로 그룹화된다. 예를 들어, Fcγ 수용체는 IgG 항체의 Fc 영역에 대한 수용체이며, Fc-알파 수용체는 IgA 항체의 Fc 영역에 대한 수용체이고, Fc-엡실론 수용체는 IgE 항체의 Fc 영역에 대한 수용체이다.
용어 "FcγR" 또는 "Fc-감마 수용체"는 옵소닌화된 세포 또는 미생물의 식세포작용을 유도하는 데 관여하는 IgG 슈퍼패밀리에 속하는 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Fridman WH. Fc receptors and immunoglobulin binding factors. FASEB Journal. 5 (12): 2684-90 (1991)]을 참고한다. Fc-감마 수용체 패밀리의 구성원은 하기를 포함한다: FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), 및 FcγRIIIB (CD16b). FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 및 FcγRIIIB의 서열은 다수의 서열 데이터베이스, 예를 들어, Uniprot 데이터베이스(www.uniprot.org)에서 각각 수탁번호 P12314(FCGR1_HUMAN), P12318(FCG2A_HUMAN), P31994(FCG2B_HUMAN), P08637(FCG3A_HUMAN) 및 P08637(FCG3A_HUMAN) 하에 발견될 수 있다.
용어 "ADCC 활성" 또는 "ADCC 수준"은 ADCC가 활성화되거나 자극되는 정도를 지칭한다. ADCC 수준을 측정 또는 결정하기 위해 상업적으로 입수 가능한 분석 및 키트를 포함하는, 항체 조성물의 ADCC 수준을 측정 또는 결정하는 방법은 문헌[Yamashita et al., Scientific Reports 6: article number 19772 (2016), doi:10.1038/srep19772)]; 문헌[Kantakamalakul et al., "A novel EGFP-CEM-NKr flow cytometric method for measuring antibody dependent cell mediated-cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-1 infected individuals", J Immunol Methods 315 (Issues 1-2): 1-10; (2006)]; 문헌[Gomez-Roman et al., "A simplified method for the rapid fluorometric assessment of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity", J Immunol Methods 308 (Issues 1-2): 53-67 (2006)]; 문헌[Schnueriger et al., :Development of a quantitative, cell-line based assay to measure ADCC activity mediated by therapeutic antibodies", Molec Immunology 38 (Issues 12-13): 1512-1517 (2011)]; 및 문헌[Mata et al., "Effects of cryopreservation on effector cells for antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and natural killer (NK) cell activity in 51Cr-release and CD107a assays", J Immunol Methods 406: 1-9 (2014)]에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 잘 공지되어 있으며; 이들 모두는 본 명세서에 모든 목적을 위해 참조에 의해 원용된다. 용어 "ADCC 분석" 또는 "FcyR 리포터 유전자 분석"은 항체의 ADCC 활성을 결정하는 데 유용한 분석, 키트 또는 방법을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법에서 항체의 ADCC 활성을 측정 또는 결정하는 예시적인 방법은 실시예 3에 기재된 ADCC 분석 또는 Promega로부터 상업적으로 입수 가능한 ADCC 리포터 분석(카탈로그 번호 G7010 및 G7018)을 포함한다. 일부 구현예에서, ADCC 활성은 하기 중 하나 이상을 함유하는 칼세인 방출 분석을 사용하여 측정 또는 결정된다: FcγRIIIa (158V)-발현 NK92(M1) 세포를 효과기 세포로, HCC2218 세포 또는 MT-3 세포를 칼세인-AM로 표지된 표적 세포로. 예시적인 칼세인 방출 분석의 예시가 도 8a로 제공된다. 칼세인 방출 분석의 예시적인 양태에서, 다양한 농도의 기준 항체를 사용하여 표준 곡선이 생성된다(도 8b).
예시적인 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준은 항체의 Fc 도메인을 통해 효과기 세포 상의 FcγRIIIA 수용체와 맞물리고 항체의 항원을 발현하는 세포에서 용량-의존적 방식으로 세포의 세포독성을 매개하는 항체 조성물의 항체의 능력을 측정하는 정량적 세포-기반 분석에 의해 결정된다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 표적 세포가 효과기 세포에 의해 용해될 때 방출되는 검출 가능한 수준을 보유하는 표적 세포의 용도를 포함한다. 표적 세포로부터 방출된 검출 가능한 표지의 양은 항체 조성물의 ADCC 활성의 척도이다. 일부 양태에서, 표적 세포로부터 방출된 검출 가능한 표지의 양은 기준선과 비교된다. 또한, ADCC 수준은 대조군 ADCC%에 대한 ADCC%로서 보고될 수 있다. 다양한 양태에서, ADCC%는 상대 ADCC%이며, 이는 선택적으로, 대조군 ADCC%에 대한 것이다. 다양한 양태에서, 대조군 ADCC%는 기준 항체의 ADCC%이다. 다양한 양태에서, 기준 항체는 본원에 기재된 바와 같은 HER2 항체 (예를 들어, 트라스투주맙) 또는 항-TNF 항체 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 또는 세르톨리주맙 페골)이다. 예시적인 예에서, 대조군 ADCC%는 약 60% 내지 약 130% 범위 이내이다. 선택적으로, ADCC%는 실시예 3에 기재된 분석에 의해 결정된다.
예시적인 양태에서, 항체 조성물의 ADCC의 수준은 항체와 Fc 수용체, 선택적으로, FcγRIIIa 사이의 결합을 측정함으로써 결정된다. 다양한 양태에서, Fc 수용체에 대한 항체 Fc 사슬의 결합이 ADCC 동안 요구되는 이벤트이기 때문에, 결합 활성은 ADCC 활성을 대신한다. 따라서, 다양한 예에서, ADCC는 항체와 Fc 수용체, 예컨대 FcγRIIIa 사이의 결합을 지칭하거나, 이러한 결합으로 측정된다. 다양한 예에서, 항체 조성물의 ADCC 수준은 경쟁적 결합 분석을 사용하여 항체의 Fc 수용체 결합을 측정함으로써 결정되며, 여기서 시험 항체의 Fc 영역의 결합은 기준 또는 대조군 항체 및 Fc 수용체의 감소된 결합을 나타내는 형광 감소에 의해 검출된다. 다양한 양태에서, Fc 수용체 결합 활성은 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정된다.
예시적인 구현예에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경(증가 또는 감소)시키는 방법은 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경(증가 또는 감소)시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 본원에 개시된 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량을 증가시켜 ADCC 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 예시적인 예에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법은 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 증가시켜 ADCC 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 ADCC 활성 수준의 증가는 대조군에 비해 적어도 또는 약 1% 내지 약 10%의 증가(예를 들어, 적어도 또는 약 1%의 증가, 적어도 또는 약 2%의 증가, 적어도 또는 약 3%의 증가, 적어도 또는 약 4%의 증가, 적어도 또는 약 5%의 증가, 적어도 또는 약 6%의 증가, 적어도 또는 약 7%의 증가, 적어도 또는 약 8%의 증가, 적어도 또는 약 9%의 증가, 적어도 또는 약 9.5%의 증가, 적어도 또는 약 9.8%의 증가, 적어도 또는 약 10%의 증가)이다. 적합한 대조군은 상대적 비결합 글리칸 함량이 증가하지 않는 동일한 단백질 또는 항체 조성물일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 ADCC 활성 수준의 증가는 약 10% 내지 약 100%, 선택적으로, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100%이다. 증가는 대조군에 비례할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공된 ADCC 활성 수준 증가는 대조군에 비해 100% 초과, 예를 들어 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 심지어 1000%이다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 1.5배 증가한다. 적합한 대조군은 상대적 비결합 글리칸 함량이 변화하지 않는 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 ADCC 활성 수준일 수 있다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 2배 증가한다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 3배 증가한다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 4배 또는 약 5배 증가한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 활성의 수준 증가는 상대적 비결합 글리칸 함량의 증가와 관련이 있다. 예를 들어, 항체 조성물의 ADCC 활성의 수준 증가는 상대적 비결합 글리칸 함량의 1% 증가마다 적어도 또는 약 X%이며, 여기서 X%는 적어도 또는 약 1% 내지 약 10%의 증가(예를 들어, 적어도 또는 약 1%의 증가, 적어도 또는 약 2%의 증가, 적어도 또는 약 3%의 증가, 적어도 또는 약 4%의 증가, 적어도 또는 약 5%의 증가, 적어도 또는 약 6%의 증가, 적어도 또는 약 7%의 증가, 적어도 또는 약 8%의 증가, 적어도 또는 약 9%의 증가, 적어도 또는 약 9.5%의 증가, 적어도 또는 약 9.8%의 증가, 적어도 또는 약 10%의 증가)이다. 또한, 예를 들어, X%는 약 10% 내지 약 100%, 선택적으로, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100%일 수 있다.
다양한 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량을 감소시켜 ADCC 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 다양한 예에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법은 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 감소시켜 ADCC 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 ADCC 활성 수준의 감소는 대조군에 비해 적어도 또는 약 1% 내지 약 10%의 감소(예를 들어, 적어도 또는 약 1%의 감소, 적어도 또는 약 2%의 감소, 적어도 또는 약 3%의 감소, 적어도 또는 약 4%의 감소, 적어도 또는 약 5%의 감소, 적어도 또는 약 6%의 감소, 적어도 또는 약 7%의 감소, 적어도 또는 약 8%의 감소, 적어도 또는 약 9%의 감소, 적어도 또는 약 9.5%의 감소, 적어도 또는 약 9.8%의 감소, 적어도 또는 약 10%의 감소)이다. 적합한 대조군은 상대적 비결합 글리칸 및 전체 글리칸 조성 함량의 변화가 없는 동일한 단백질 또는 항체 조성물일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 ADCC 활성 수준의 감소는 약 10% 내지 약 100%, 선택적으로, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100%이다. 감소는 대조군에 비례할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 제공된 ADCC 활성 수준 감소는 대조군에 비해 100% 초과, 예를 들어 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 심지어 1000%이다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 1.5배 감소한다. 적합한 대조군은 글리칸 함량이 변화하지 않는 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 ADCC 활성 수준일 수 있다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 2배 감소한다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 3배 감소한다. 예시적인 구현예에서, ADCC 활성의 수준은 대조군에 비해 적어도 약 4배 또는 약 5배 감소한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 활성의 수준 감소는 상대적 비결합 글리칸 함량의 감소와 관련이 있다. 예를 들어, 항체 조성물의 ADCC 활성의 수준 감소는 상대적 비결합 글리칸 함량의 1% 감소마다 적어도 또는 약 X%이며, 여기서 X%는 적어도 또는 약 1% 내지 약 10%의 감소(예를 들어, 적어도 또는 약 1%의 감소, 적어도 또는 약 2%의 감소, 적어도 또는 약 3%의 감소, 적어도 또는 약 4%의 감소, 적어도 또는 약 5%의 감소, 적어도 또는 약 6%의 감소, 적어도 또는 약 7%의 감소, 적어도 또는 약 8%의 감소, 적어도 또는 약 9%의 감소, 적어도 또는 약 9.5%의 감소, 적어도 또는 약 9.8%의 감소, 적어도 또는 약 10%의 감소)이다. 또한, 예를 들어, X%는 약 10% 내지 약 100%, 선택적으로, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100%일 수 있다.
예시적인 양태에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 1% 변화 당 약 10% 내지 약 30% 변경된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸이 1% 증가할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 15% 증가된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸이 1% 감소할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 15% 감소된다. 일부 양태에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 약 10% 내지 약 15%와 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 약 10% 내지 약 15%의 합만큼 변경된다. 선택적으로, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 약 12% 내지 약 13%와 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 약 12.5% 내지 약 13.5%의 합만큼 변경된다. 예시적인 예에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량과 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량 각각이 약 1% 변경될 때 약 25% 변경되며, 항체 조성물의 항체는 항-TNF 항체, 선택적으로, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 또는 세르톨리주맙 페골이다. 예시적인 예에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량과 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량 각각이 약 1% 증가될 때 약 20% 내지 약 30% 증가되며, 항체 조성물의 항체는 항-TNF 항체, 선택적으로, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 또는 세르톨리주맙 페골이다. 예시적인 예에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량과 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량 각각이 약 1% 감소될 때 약 20% 내지 약 30% 감소되며, 항체 조성물의 항체는 항-TNF 항체, 선택적으로, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 또는 세르톨리주맙 페골이다.
예시적인 양태에서, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 1% 변화 당 약 10% 내지 약 20% 변경된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량이 1% 증가할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 20% 증가된다. 일부 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸이 1% 감소할 때마다, ADCC 활성의 수준은 약 10% 내지 약 20% 감소된다. 다양한 예에서, ADCC 활성은 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 1% 변화 마다 변화되지 않는다. 선택적으로, ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 약 1% 변화 당 약 10% 내지 약 19%, 약 10% 내지 약 18%, 약 10% 내지 약 17%, 약 10% 내지 약 16%, 약 10% 내지 약 15%, 약 11% 내지 약 20%, 약 12% 내지 약 20%, 약 13% 내지 약 20%, 약 12% 내지 약 16%, 예를 들어, 약 13%, 약 14%, 약 15% 변경된다. 선택적으로, 항체 조성물의 항체는 항-HER2 항체, 선택적으로, 트라스투주맙 또는 퍼투주맙이다.
예시적인 양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 이루어지는 변경(증가 또는 감소)은 "대조군"에 상대적이다. 예시적인 양태에서, 대조군은 본 방법의 단계가 수행되지 않을 때의 ADCC 활성의 수준이다. 예시적인 양태에서, 대조군은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 변경(증가 또는 감소)되지 않을 때의 ADCC 활성의 수준이다. 예를 들어, 적합한 대조군은 상대적 비결합 글리칸 함량 (예를 들어, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량)의 증가가 없는, 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 ADCC 활성 수준일 수 있거나, 또는 적합한 대조군은 상대적 비결합 글리칸 함량 (예를 들어, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량)의 감소가 없는, 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 ADCC 활성 수준일 수 있다. 예시적인 예에서, 대조군은 상대적 비결합 글리칸 함량의 변화를 일으키도록 변경된 조건들을 제외하고 동일한 세포 배양 조건 하에서 생성된 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 ADCC 활성 수준일 수 있다. 예시적인 양태에서, 대조군은 ADCC 활성 수준이 이의 표적 범위를 벗어나게 하는 제1 세트의 세포 배양 조건 하에서 생성된 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 ADCC 활성 수준일 수 있다. 다양한 양태에서, 대조군은 표적 범위를 벗어나는 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 초래하는 제1 세트의 세포 배양 조건 하에서 생성된 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 ADCC 활성 수준일 수 있다.
비결합 글리칸 함량을 변경시키는 방법
예시적인 구현예에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경(증가 또는 감소)시키는 방법은 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경(증가 또는 감소)시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 본원에 개시된 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 증가시켜 ADCC 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 또는 그 이상 증가시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 5% 초과 또는 10% 초과, 예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20% 증가시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 이상 증가시키는 단계를 포함한다.
예시적인 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 본원에 개시된 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량을 감소시켜 ADCC 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 또는 그 이상 감소시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 5% 초과 또는 10% 초과, 예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20% 감소시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 이상 감소시키는 단계를 포함한다.
예시적인 양태에서, 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 증가 또는 감소는 "대조군"에 상대적이다. 예시적인 양태에서, 대조군은 비결합 글리칸 함량을 증가시키거나 감소시키는 조건을 제외하고 동일한 세포 배양 조건 하에서 생성된 대조군 단백질 또는 항체 조성물의 비결합 글리칸 함량이다. 예시적인 양태에서, 대조군은 ADCC 활성 수준이 이의 표적 범위를 벗어나게 하는 제1 세트의 세포 배양 조건 하에서 생성된 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 비결합 글리칸 함량일 수 있다. 다양한 양태에서, 대조군은 표적 범위를 벗어나는 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 초래하는 제1 세트의 세포 배양 조건 하에서 생성된 동일한 단백질 또는 항체 조성물의 비결합 글리칸 함량일 수 있다.
특정 이론에 구애됨 없이, 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 고 만노스 함량을 변경(증가 또는 감소)시키는 조건들은 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 다양한 예에서, 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량은 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013/114164, WO2013/114245, WO2013/114167, WO 2015128793, 또는 WO2016/089919, WO2018/170099, WO2019/191150 중 어느 하나의 교시에 따라 증가 또는 감소되며, 이들 각각은 본원에 참고로 원용된다. 다양한 예에서, 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량은 특정 수준의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 함량을 포함하는 항체 또는 항체 단백질 생성물을 생산하는 클론을 선택함으로써 증가 또는 감소된다.
항체 조성물의 생산 방법
특정 항체 조성물이 나타낼 효과기 기능(예를 들어, ADCC)의 수준을 그 항체 조성물에 대한 주어진 글리코형 프로파일에 기초하여 예측하는 간단하고 효율적인 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에 제공된 데이터는 항체 조성물에 대한 ADCC 활성 수준이 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량에 기반하여 예측될 수 있음을 뒷받침한다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 예측할 수 있게 한다. 이러한 예측된 ADCC 수준은 항체가 표적 범위 내의 ADCC 활성 수준을 갖는 것이 필요한 경우 항체 생산 중에 유용하다. 예를 들어, 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 모니터링함으로써, 항체 조성물이 표적 범위 내의 ADCC 활성 수준을 나타낼지 여부를 예측할 수 있다. 항체 조성물에 대한 ADCC 활성 수준의 표적 범위가 알려진 경우, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량의 표적 범위가 결정될 수 있다. 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸, 또는 ADCC 활성 수준이, 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 계산된 바와 같이, 표적 범위 내에 있을 경우 연속된 처리, 예를 들어, 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물의 선택이 일어날 수 있다. 예시적인 양태에서, 표적 범위는 기준 항체에 대한 ADCC 활성 수준의 표적 범위 및 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 항체 조성물의 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 고 만노스 글리칸 함량과 상관시키는 모델, 선택적으로, 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량과 상관시키는 모델에 기반한다. 예시적인 예에서, 기준 항체는 인플릭시맙(infliximab)이다. 예시적인 양태에서, 기준 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)이다. 선택적으로, 항체가 항-TNF 항체, 예컨대, 인플릭시맙인 경우, 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 표적 범위는 약 80% 내지 약 90%이고/이거나 비결합 고 만노스 글리칸의 표적 범위는 약 75% 내지 약 85%이다. 선택적으로, 항체가 항-HER2 항체, 예컨대, 트라스투주맙인 경우, 비결합 아푸코실화 글리칸 함량의 표적 범위는 약 95% 내지 약 99%이고/이거나, 비결합 고 만노스 글리칸의 표적 범위는 약 25% 내지 약 35% 미만이다.
따라서, 본 개시내용은 항체 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (i) 항체 조성물 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; 및 (ii) (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 항체 조성물을 제조하는 방법은 (i) 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; (ii) (i)에서 결정된 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 항체 조성물의 ADCC 수준을 결정하는 단계; 및 (iii) (ii)에서 결정된 항체 조성물의 ADCC 수준이 표적 ADCC 범위내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 항체 조성물을 제조하는 방법은 (i) 항체 조성물의 항체를 발현하는 글리코실화-적격 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 채취한 항체 조성물 샘플의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; (ii) 선택적으로, 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 조정하기 위해 세포 배양물을 변경시키고 변경된 세포 배양물로부터 채취한 항체 조성물 샘플의 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; 및 (iii) 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, 샘플은 항체 조성물의 항체를 발현시키는 글리코실화-적격 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 취한다. 선택적으로, 방법은 세포 배양물의 하나 이상의 조건을 변경하여, 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경하는 단계 및 변경된 세포 배양물로부터 취한 항체 조성물의 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 표적 범위 내에 있을 때까지 상기 변경을 반복하는 것을 포함한다. 다양한 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 생산과 관련하여 실시간으로 결정된다. 본원에 사용된 바와 같이, "실시간"은 생산 공정이 진행되는 동안 공정 중단 없이 이루어지는 결정을 지칭한다. 치료용 단백질의 생산에는 분석 및 결정이 수행되는 동안 무한정 보류할 수 없는 살아있는 세포 및 민감한 물질이 관여된다는 것을 이해할 것이다. 관심있는 수치적 예라면, "실시간" 결정은 (생산 공정이 진행되는 동안) 측정이 이루어진 시간으로부터 6시간, 5시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 50분, 40분, 30분, 20분, 10분, 5분, 1분, 30초, 20초, 10초, 5초, 1초 또는 0.1초 내의 결정일 수 있다. 다양한 예에서, 방법은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 표적 범위 내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위해 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 ADCC 활성 수준과 상관관계가 있다. 선택적으로, 방법은 (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 선택적으로, 방법은 ADCC 활성 수준이 표적 범위 내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위해 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, 항체 조성물을 생산하는 방법은 본 개시내용의 ADCC 수준을 변경시키는 방법에 따라 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 단계를 포함한다.
다양한 예에서, 항체 조성물의 생산 방법은 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 결정하는 단계는 (i) 힌지 영역 디설파이드 결합에 대한 N-말단 부위에서 항체 중쇄를 절단하여 항체 단편을 형성하는 효소로 항체 조성물을 처리하는 단계, (ii) 크로마토그래피로 항체 단편을 분리하는 단계, 및 (iii) 각 항체 단편을 정량화하는 단계를 포함한다. 다양한 예에서, 부위는 IgG1 항체 중쇄의 서열 KTHTCPP(서열번호 1)의 Thr과 His 사이 또는 Lys와 Thr 사이에 있다. 다양한 양태에서, 항체 단편은 Fab 단편 및 글리코실화 Fc 단편을 포함한다. 예시적인 양태에서, (ii)의 분리는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 포함한다. 예시적인 양태에서, (iii)의 정량화는 질량 분석법을 포함한다. 다양한 양태에서, 결정은 본원 실시예 2에 기술된 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 방법(또는 이의 부분)을 포함한다.
다운스트림 처리
상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸은 항체 조성물의 % 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)에 관해 더 알아내도록 결정된다(예를 들어, 측정된다). 결정하는(예를 들어, 측정하는) 단계는 제조 동안 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 특히, 채취 전 또는 후, 다운스트림 처리의 임의 단계 전 또는 도중에 측정이 이루어질 수 있다. 다운스트림 처리의 예는 포획 크로마토그래피, 중간 크로마토그래피, 및/또는 광택 크로마토그래피 단위 작업을 포함하는 임의의 크로마토그래피 단위 작업; 바이러스 비활성화 및 중화; 바이러스 여과; 및/또는 최종 제형화를 포함한다. 다양한 양태에서 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸, 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸은 실시간으로 거의 실시간으로, 그리고/또는 사후에 결정된다(예를 들어, 측정된다). 모니터링 및 측정은 알려진 기법 및 상업적으로 이용 가능한 장비를 사용하여 수행될 수 있다.
본 개시내용의 다양한 양태에서, % 비결합 고 만노스 글리칸 및/또는 % 비결합 아푸코실화 글리칸을 결정하는(예를 들어, 측정하는) 단계는 채취 단계 전에 수행된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "채취"는 관심 대상의 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양 배지가 수집되고 적어도 세포 배양물의 세포로부터 분리되는 것을 지칭한다. 채취는 지속적으로 수행될 수 있다. 일부 양태에서 채취는 원심분리를 이용하여 수행되고, 침전, 여과 등을 추가로 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 결정은 채취 전에 수행된다. 다양한 양태에서, 결정은 크로마토그래피, 선택적으로, 단백질 A 크로마토그래피 전에 수행된다. 일부 양태에서, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸을 결정(예를 들어, 측정)하는 단계는 채취 전 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 적어도 5일 전에 수행된다. 선택적으로, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸을 결정(예를 들어, 측정)하는 단계는 항체 생산과 관련하여 실시간으로 수행된다.
본 개시내용의 다양한 양태에서, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸, 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸을 결정하는(예를 들어, 측정하는) 단계는 채취 단계 후에 수행된다. 다양한 양태에서, 결정은 크로마토그래피, 선택적으로, 단백질 A 크로마토그래피 후에 수행된다. 다양한 양태에서, 결정은 채취 후 및 크로마토그래피, 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피 후에 수행된다.
본원에 개시된 방법과 관련하여, 다양한 양태에서 항체 조성물은 추가적인 처리를 위해, 예를 들어, 다운스트림 처리를 위해 선택되며, 선택은 특정 파라미터, 예를 들어, %ADCC, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸을 기준으로 한다. 다양한 예에서, 본원에 개시된 방법은 특정 파라미터에 기반하여, 예를 들어, %ADCC, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸, 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸에 기반하여, 추가 처리에서, 예를 들어, 다운스트림 처리에서 항체 조성물을 이용하는 것을 포함한다. 다양한 예에서, 본원에 개시된 방법은 특정 파라미터에 기반하여, 예를 들어, %ADCC, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸, 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸에 기반하여, 항체 조성물로 추가 처리, 예를 들어, 다운스트림 처리를 수행하는 것을 포함한다.
예시적인 예에서, 다운스트림 처리는 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸, 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸이 결정(예를 들어, 측정)되는 처리 후 (또는 다운스트림에서) 발생하는 임의의 처리를 포함하거나, 이들로 이루어진다. 예를 들어, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸, 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸이 채취시 결정(예를 들어, 측정)되는 경우, 다운스트림 처리는 채취 후 (또는 다운스트림에서) 일어나는 임의의 처리이며, 이는 다양한 양태에서, 희석, 충전, 여과, 제형화, 크로마토그래피, 바이러스 여과, 바이러스 비활성화, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또한, 예를 들어, 상대적 % 비결합 고 만노스 글리칸, 및/또는 상대적 % 비결합 아푸코실화 글리칸이 크로마토그래피, 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피 후 결정(예를 들어, 측정)된 경우, 다운스트림 처리는 크로마토그래피 후(또는 다운스트림에서) 일어나는 임의의 처리를 포함하거나 이들로 이루어지며, 다운스트림 처리는 다양한 양태에서, 희석, 충전, 여과, 제형화, 추가적인 크로마토그래피, 바이러스 여과, 바이러스 비활성화, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 예에서, 추가적인 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피)이다.
하류의 가공 동안에 사용되는 크로마토그래피의 단계/유형은 다른 단백질, 응집물, DNA, 바이러스 및 기타 이러한 불순물로부터의 재조합 생성물을 분리시키는 데 사용되는 포획 또는 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 예시적인 예에서, 초기 크로마토그래피는 단백질 A(예를 들어, 수지에 부착된 단백질 A)에 의해 수행된다. 다양한 양태에서 중간 및 광택 크로마토그래피는 재조합 단백질을 추가로 정제하여, 벌크 오염물질, 우발성 바이러스, 미량 불순물, 응집체, 이소형 등을 제거한다. 크로마토그래피는 관심 있는 재조합 단백질이 크로마토그래피 매질 및 불순물이 흐르는 결합 및 용출 모드, 또는 불순물이 결합되고 재조합 단백질이 흐르는 흐름-통과 모드로 수행될 수 있다. 이러한 크로마토그래피 방법의 예는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 및 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)와 같은 이온 교환 크로마토그래피(IEX); 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 혼합모드 또는 다중모드 크로마토그래피(MM), 히드록시아파타이트 크로마토그래피(HA); 역상 크로마토그래피 및 겔 여과를 포함한다.
다양한 양태에서, 다운스트림 처리는 바이러스 비활성화를 포함한다. 외피 보유 바이러스는 지단백질 막 또는 "외피"로 둘러싸인 캡시드를 갖고, 따라서 비활성화되기 쉽다. 다양한 예에서, 바이러스 비활성화는 열 비활성화/저온살균, pH 비활성화, UV 및 감마선 조사, 고강도 광범위 스펙트럼 백색광 사용, 화학적 비활성화제 첨가, 계면활성제 및 용매/세제 처리를 포함한다.
다양한 양태에서, 다운스트림 처리는 바이러스 여과를 포함한다. 다양한 양태에서, 바이러스 여과는 비-외피 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 다양한 양태에서, 바이러스 여과는 마이크로- 또는 나노-필터의 사용을 포함한다.
다양한 양태에서, 다운스트림 처리는 하나 이상의 단계에서 수행될 수 있는 제형화를 포함한다. 다양한 양태에서, 크로마토그래피의 완료 후에, 정제된 재조합 단백질은 제형 완충제로 완충제 교환된다. 예시적인 양태에서, 완충제 교환은 한외여과 및 정용여과(UF/DF)를 이용하여 수행된다. 예시적인 양태에서, 재조합 단백질은 정용여과를 이용하여 목적하는 제형 완충제로 완충제 교환되고, 한외여과를 이용하여 목적하는 최종 제형 농도로 농축된다. 다양한 양태에서, 추가적인 안정성-향상 부형제가 UF/DF 제형화 단계 후에 첨가된다.
재조합 글리코실화 단백질
본 명세서에 개시된 방법은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 다양한 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 하기 식의 하나 이상의 N-글리코실화 공통 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Asn-Xaa1-Xaa2
상기 식에서, Xaa1은 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고, Xaa2는 Ser 또는 Thr이다.
예시적인 구현예에서, 재조합 글리코실화 단백질은 단편 결정화 가능한 (Fc) 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 "Fc 폴리펩타이드"는 본원에 사용된 바대로 항체의 Fc 영역으로부터 유래된 폴리펩타이드의 자연적 형식 및 돌연변이단백질 형식을 포함한다. 이합체화를 촉진하는 힌지 영역을 함유하는 이러한 폴리펩타이드의 절두된 형식이 또한 포함된다. Fc 모이어티(및 이로부터 형성된 올리고머)를 포함하는 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼에 비해 친화도 크로마토그래피에 의한 손쉬운 정제 이익을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 재조합 글리코실화 단백질은 IgG, 예를 들어 인간 IgG의 Fc를 포함한다. 예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 IgG1 또는 IgG2의 Fc를 포함한다. 예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 항체, 항체 단백질 생성물, 펩티바디 또는 Fc-융합 단백질이다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 항체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 본 개시내용을 고려하여 당업자가 이해하는 바와 같이 관례적이고 통상적인 의미를 갖는다. 이는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는, 표준 면역글로불린 형식을 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍의 "Y형" 구조인 IgG일 수 있으며, 각 쌍은 (일반적으로 약 25 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 "경쇄" 및 (일반적으로 약 50~70 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 "중쇄"를 갖는다. 항체는 표준적으로 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. IgG 형식에서, 가변 영역은 일반적으로 약 100~110개 이상의 아미노산이며, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 항원 인식을 주로 담당하고, 상이한 항원에 결합하는 다른 항체들 사이에서 실질적으로 다르다. 따라서, 항체는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄, 및 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999) 참조.
간단히 말하면, 항체 스캐폴드에서, CDR은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 내에 임베딩되고, 여기서 이들은 항원 결합 및 인식을 주로 담당하는 영역을 구성한다. 가변 영역은 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR(문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.]; 또한 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917]; 문헌[Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883] 참고)을 프레임워크 영역(문헌[Kabat et al., 1991]에 의하면, 프레임워크 영역 1~4, FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 표기됨; 또한 상기 문헌[Chothia and Lesk, 1987] 참고) 내에 포함한다.
인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는(이에 한정되지 않음) 여러 서브클래스가 있다. IgM에는 IgM1 및 IgM2를 포함하는(이에 한정되지 않음) 서브클래스가 있다. 본 개시내용의 구현예는 항체의 모든 이러한 클래스 또는 이소형을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역, 예컨대, 인간 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어 알파형, 델타형, 엡실론형, 감마형, 또는 뮤형 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 알파형, 델타형, 엡실론형, 감마형, 또는 뮤형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 따라서, 예시적인 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 어느 하나를 포함하는 이소형 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM의 항체이다.
다양한 양태에서, 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 예시적인 예에서, 항체는 포유류 항체, 예를 들어, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 말 항체, 닭 항체, 햄스터 항체, 돼지 항체, 인간 항체 등이다. 소정의 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 단일클론 인간 항체이다.
다양한 양태에서, 항체는 효소, 예컨대, 예를 들어 파파인, 펩신 및/또는 진지파인 K에 의해 단편으로 절단된다. 파파인은 항체를 절단하여 2개의 Fab 단편 및 단일 Fc 단편을 생성한다. 펩신은 항체를 절단하여 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편을 생성한다. 예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 적어도 하나의 글리코실화 부위를 보유하는 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fc, F(ab')2 또는 pFc'를 포함한다. 본 발명의 방법과 관련하여, 항체는 항체의 소정의 부분이 결여될 수 있고, 항체 단편일 수 있다. 다양한 양태에서, 항체 단편은 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 단편은 진핵생물 세포에서 번역 후 글리코실화된 항체의 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하는 "글리코실화된 Fc 단편"이다. 다양한 예에서, 재조합 글리코실화 단백질은 글리코실화된 Fc 단편이다.
적어도 또는 약 12 내지 150 kDa의 분자량 범위에 걸치며 단량체(n = 1), 이량체(n = 2) 및 삼량체(n = 3) 내지 사량체(n = 4) 및 가능하게는 이를 초과하는 결합가(n) 범위를 갖는 보다 더 많은 범위의 대안적인 형식을 생성하기 위해 항체의 구조가 탐색되었고; 이러한 대안적인 항체 형식은 본 명세서에서 "항체 단백질 생성물" 또는 "결합 단백질"로 지칭된다.
항체 단백질 생성물은 완전한 항원-결합 능력을 보유하는 항체 단편, 예컨대, scFv, Fab 및 VHH/VH를 기초로 한 항원 결합 형식일 수 있다. 완전한 항원 결합 부위를 보유하는 최소 항원-결합 단편은 Fv 단편으로, 이는 전적으로 가변(V) 영역들로 구성된다. 분자의 안정성을 위하여 가용성, 가요성 아미노산 펩티드 링커가 사용되어 V 영역들을 scFv(단일쇄 단편 가변) 단편을 연결하거나, 불변(C) 도메인이 V 영역들에 첨가되어 Fab 단편[단편, 항원-결합]을 생성한다. scFv 및 Fab 둘 다는 원핵생물 숙주에서 용이하게 생산될 수 있는 널리 사용되는 단편이다. 다른 항체 단백질 생성물은 이황화 결합 안정화 scFv(ds-scFv), 단일쇄 Fab(scFab), 뿐만 아니라 올리고머화 도메인에 연결된 scFv로 구성된 다양한 형식을 포함하는 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디 또는 미니바디(miniAb)와 같은 이량체 및 다량체 항체 형식을 포함한다. 가장 작은 단편은 낙타 중쇄 Ab 및 단일 도메인 Ab(sdAb)의 VHH/VH이다. 새로운 항체 형식을 생성하는 데 가장 흔히 사용되는 빌딩 블록은 약 15개 아미노산 잔기의 펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄로부터의 V 도메인(VH 및 VL 도메인)을 포함하는 단일쇄 가변(V) 도메인 항체 단편(scFv)이다. 펩티바디 또는 펩티드-Fc 융합체는 또 다른 항체 단백질 생성물이다. 펩티바디의 구조는 Fc 도메인에 이식된 생물학적으로 활성인 펩티드로 구성된다. 펩티바디는 당해 분야에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012)] 참조.
기타 항체 단백질 생성물은 단일쇄 항체(SCA), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 또는 삼중특이적 항체 등을 포함한다. 이중특이적 항체는 다섯 가지 주요한 부류로 나눌 수 있다: BsIgG, 부가형 IgG(appended IgG), BsAb 단편, 이중특이적 융합 단백질 및 BsAb 접합체. 예컨대, Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Part A: 97-106 (2015) 참고.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 이들 항체 단백질 생성물(예를 들어, scFv, Fab VHH/VH, Fv 단편, ds-scFv, scFab, 이합체 항체, 다합체 항체(예를 들어, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디), 미니Ab, 낙타 중쇄 항체의 펩티바디 VHH/VH, sdAb, 디아바디; 트리아바디; 테트라바디; 이중특이적 또는 삼중특이적 항체, BsIgG, 부착된 IgG, BsAb 단편, 이중특이적 융합 단백질 및 BsAb 접합체) 중 어느 하나를 포함하고, 하나 이상의 N-글리코실화 공통 서열, 선택적으로 하나 이상의 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 단백질 생성물은 글리코실화 부위를 포함한다. 예시적인 양태에서, 항체 단백질 생성물은 항체 결합 단편에 접합된 글리코실화된 Fc 단편("글리코실화된 Fc 단편 항체 생성물")일 수 있다.
재조합 글리코실화 단백질은 단량체성 형식 또는 중합체성, 올리고머성 또는 다합체성 형식의 항체 단백질 생성물일 수 있다. 항체가 2개 이상의 별개의 항원 결합 영역 단편을 포함하는 특정 구현예에서, 항체는 항체에 의해 인식되고 결합되는 별개의 에피토프의 수에 따라 이중특이적, 삼중특이적, 또는 다중특이적, 또는 2가, 3가, 또는 다가로 간주된다.
다양한 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터의 불변 도메인 및 제2의 종으로부터의 가변 도메인을 함유하거나, 더욱 일반적으로는 적어도 2종의 종으로부터의 아미노산 서열의 스트레치를 함유하는 항체를 지칭하고자 본 명세서에서 사용된다. 용어 "인간화"가 항체와 관련하여 사용될 때 본래의 원천 항체보다 진정한 인간 항체와 더욱 유사한 구조 및 면역학적 기능을 갖도록 유전자 조작된 비인간 원천으로부터의 적어도 CDR 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 인간화는 마우스 항체와 같은 비인간 항체로부터의 CDR을 인간 항체 내로 이식하는 것을 수반할 수 있다. 또한, 인간화는 비인간 서열을 인간 서열과 더 많이 닮게 만드는 선별된 아미노산 치환을 수반할 수 있다.
유리하게는, 상기 방법은 항체, 글리코실화된 Fc 단편, 항체 단백질 생성물, 키메라 항체 또는 인간화된 항체의 항원 특이성으로 제한되지는 않는다. 따라서, 항체, 글리코실화된 Fc 단편, 항체 단백질 생성물, 키메라 항체 또는 인간화된 항체는 사실상 임의의 항원에 대한 임의의 결합 특이성을 갖는다. 예시적인 양태에서, 항체는 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 세포-표면 수용체, 또는 임의의 이의 리간드에 결합한다. 예시적인 양태에서, 항체는 면역 세포의 세포 표면 상에 발현된 단백질에 결합한다. 예시적인 양태에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 분화 분자의 클러스터에 결합한다: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11A, CD11B, CD11C, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD45RA, CD45RB, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD76, CD79α, CD79β, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CDw128, CD129, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CD145, CD146, CD147, CD148, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166 및 CD182.
예시적인 양태에서, 항체, 글리코실화된 Fc 단편, 항체 단백질 생성물, 키메라 항체 또는 인간화된 항체는 미국 특허 제7947809호 및 미국 특허 출원 공개 제20090041784호(글루카곤 수용체), 미국 특허 제7939070호, 미국 특허 제7833527호, 미국 특허 제7767206호, 및 미국 특허 제7786284호(IL-17 수용체 A), 미국 특허 제7872106호 및 미국 특허 제7592429호(스클레로스틴), 미국 특허 제7871611호, 미국 특허 제7815907호, 미국 특허 제7037498호, 미국 특허 제7700742호, 및 미국 특허 출원 공개 제20100255538호(IGF-1 수용체), 미국 특허 제7868140호(B7RP1), 미국 특허 제7807159호 및 미국 특허 출원 공개 제20110091455호(마이오스타틴), 미국 특허 제7736644호, 미국 특허 제7628986호, 미국 특허 제7524496호 및 미국 특허 출원 공개 제20100111979호(표피성장인자 수용체의 결실 돌연변이체), 미국 특허 제7728110호(SARS 코로나바이러스), 미국 특허 제7718776호 및 미국 특허 출원 공개 제20100209435호(OPGL), 미국 특허 제7658924 및 미국 특허 제7521053호(안지오포이에틴-2), 미국 특허 제7601818호, 미국 특허 제7795413호, 미국 특허 출원 공개 제20090155274호, 미국 특허 출원 공개 제20110040076호(NGF), 미국 특허 제7579186호(TGF-β II형 수용체), 미국 특허 제7541438호(결합 조직 성장 인자), 미국 특허 제7438910호(IL1-R1), 미국 특허 제7423128호(프로퍼딘), 미국 특허 제7411057호, 미국 특허 제7824679호, 미국 특허 제7109003호, 미국 특허 제6682736호, 미국 특허 제7132281호, 및 미국 특허 제7807797호(CTLA-4), 미국 특허 제7084257호, 미국 특허 제7790859호, 미국 특허 제7335743호, 미국 특허 제7084257호 및 미국 특허 출원 공개 제20110045537호(인터페론-감마), 미국 특허 제7932372호(MAdCAM), 미국 특허 제7906625호, 미국 특허 출원 공개 제20080292639호 및 미국 특허 출원 공개 제20110044986호(아밀로이드), 미국 특허 제7815907호 및 미국 특허 제7700742호(인슐린-유사 성장 인자 I), 미국 특허 제7566772호 및 미국 특허 제7964193호(인터류킨-1β), 미국 특허 제7563442호, 미국 특허 제7288251호, 미국 특허 제7338660호, 미국 특허 제7626012호, 미국 특허 제7618633,호 및 미국 특허 출원 공개 제20100098694호(CD40), 미국 특허 제7498420호(c-Met), 미국 특허 제7326414호, 미국 특허 제7592430호, 및 미국 특허 제7728113호(M-CSF), 미국 특허 제6924360호, 미국 특허 제7067131호, 및 미국 특허 제7090844호(MUC18), 미국 특허 제6235883호, 미국 특허 제7807798호, 및 미국 특허 출원 공개 제20100305307호(표피성장인자 수용체), 미국 특허 제6716587호, 미국 특허 제7872113호, 미국 특허 제7465450호, 미국 특허 제7186809호, 미국 특허 제7317090호, 및 미국 특허 제7638606호(인터류킨-4 수용체), 미국 특허 출원 공개 제20110135657호(베타-클로토), 미국 특허 제7887799호 및 미국 특허 제7879323호(섬유아세포 성장 인자-유사 폴리펩타이드), 미국 특허 제7867494호(IgE), 미국 특허 출원 공개 제20100254975호(알파-4 BETA-7), 미국 특허 출원 공개 제20100197005호 및 미국 특허 제7537762호(액티빈 수용체-유사 키나제-1), 미국 특허 제7585500호 및 미국 특허 출원 공개 제20100047253호(IL-13), 미국 특허 출원 공개 제20090263383호 및 미국 특허 제7449555호(CD148), 미국 특허 출원 공개 제20090234106호(액티빈 A), 미국 특허 출원 공개 제20090226447호(안지오포이에틴-1 및 안지오포이에틴-2), 미국 특허 출원 공개 제20090191212호(안지오포이에틴-2), 미국 특허 출원 공개 제20090155164호(C-FMS), 미국 특허 제7537762호(액티빈 수용체-유사 키나제-1), 미국 특허 제7371381호(갈라닌), 미국 특허 출원 공개 제20070196376호(인슐린 유사 성장 인자), 미국 특허 제7267960 및 미국 특허 제7741115호(LDCAM), 미국 특허 제7265212호(CD45RB), 미국 특허 제7709611호, 미국 특허 출원 공개 제20060127393호 및 미국 특허 출원 공개 제20100040619호(DKK1), 미국 특허 제7807795호, 미국 특허 출원 공개 제20030103978호 및 미국 특허 제7923008호(오스테오프로테게린), 미국 특허 출원 공개 제20090208489호(OV064), 미국 특허 출원 공개 제20080286284호(PSMA), 미국 특허 제7888482호, 미국 특허 출원 공개 제20110165171호 및 미국 특허 출원 공개 제20110059063호(PAR2), 미국 특허 출원 공개 제20110150888호(헵시딘), 미국 특허 제7939640호(B7L-1), 미국 특허 제7915391호(c-Kit), 미국 특허 제7807796호, 미국 특허 제7193058호, 및 미국 특허 제7427669호(ULBP), 미국 특허 제7786271호, 미국 특허 제7304144호 및 미국 특허 출원 공개 제20090238823호(TSLP), 미국 특허 제7767793호(SIGIRR), 미국 특허 제7705130호(HER-3), 미국 특허 제7704501호(어택신-1-유사 폴리펩타이드), 미국 특허 제7695948호 및 미국 특허 제7199224호(TNF-α 전환 효소), 미국 특허 출원 공개 제20090234106호(액티빈 A), 미국 특허 출원 공개 제20090214559호 및 미국 특허 제7438910호(IL1-R1), 미국 특허 제7579186호 (TGF-β II형 수용체), 미국 특허 제7569387호(TNF 수용체-유사 분자), 미국 특허 제7541438호(결합 조직 성장 인자), 미국 특허 제7521048호(TRAIL 수용체-2), 미국 특허 제6319499호, 미국 특허 제7081523호 및 미국 특허 출원 공개 제20080182976호(에리트로포이에틴 수용체), 미국 특허 출원 공개 제20080166352호 및 미국 특허 제7435796호(B7RP1), 미국 특허 제7423128호(프로퍼딘), 미국 특허 제7422742호 및 미국 특허 제7141653호(인터류킨-5), 미국 특허 제6740522호 및 미국 특허 제7411050호(RANKL), 미국 특허 제7378091호(탄산무수화 효소 IX (CA IX) 종양 항원), 미국 특허 제7318925호 및 미국 특허 제7288253호(부갑상선 호르몬), 미국 특허 제7285269호(TNF), 미국 특허 제6692740호 및 미국 특허 제7270817호 (ACPL), 미국 특허 제7202343호(단핵구 화학적 유인 단백질-1), 미국 특허 제7144731호 (SCF), 미국 특허 제6355779호 및 미국 특허 제7138500호(4-1BB), 미국 특허 제7135174호(PDGFD), 미국 특허 제6630143호 및 미국 특허 제7045128호(Flt-3 리간드), 미국 특허 제6849450호(메탈로프로테이나제 저해제), 미국 특허 제6596852호(LERK-5), 미국 특허 제6232447호(LERK-6), 미국 특허 제6500429호(뇌-유래 신경영양인자), 미국 특허 제6184359호(상피-유래 T-세포 인자), 미국 특허 제6143874호(신경영양인자 NNT-1), 미국 특허 출원 공개 제20110027287호(프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 9형(PCSK9)), 미국 특허 출원 공개 제20110014201호(IL-18 수용체) 및 미국 특허 출원 공개 제20090155164호(C-FMS)에 기재된 것 중 하나이다. 상기 특허 및 공개 특허 출원은 가변 도메인 폴리펩티드, 가변 도메인 암호화 핵산, 숙주 세포, 벡터, 상기 가변 도메인을 암호화하는 폴리펩티드를 제조하는 방법, 약제학적 조성물, 및 가변 도메인-함유 항체 단백질 생성물 또는 항체의 각각의 표적과 연관된 질환을 치료하는 방법의 이의 개시의 목적을 위해 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
예시적인 구현예에서, 항체, 글리코실화된 Fc 단편, 항체 단백질 생성물, 키메라 항체 또는 인간화된 항체는 무로모납(Muromonab)-CD3(상표명 Orthoclone Okt3®으로 판매되는 제품), 압식시맙(상표명 Reopro®로 판매되는 제품),　리툭시맙(상표명 MabThera®, Rituxan®로 판매되는 제품), 바실릭시맙(상표명 Simulect®로 판매되는 제품), 다클리주맙(상표명 Zenapax®로 판매되는 제품), 팔리비주맙(상표명 Synagis®로 판매되는 제품), 인플릭시맙(상표명 Remicade®로 판매되는 제품),　트라스투주맙(상표명 Herceptin®로 판매되는 제품), 알렘투주맙(상표명 MabCampath®, Campath-1H®로 판매되는 제품),　아달리무맙(상표명 Humira®로 판매되는 제품), 토시투모맙-I131(상표명 Bexxar®로 판매되는 제품), 에팔리주맙(상표명 Raptiva®로 판매되는 제품), Cetuximab(상표명 Erbitux®로 판매되는 제품), 이브리투모맙 튜세탄(상표명 Zevalin®로 판매되는 제품), 이오말리주맙(상표명 Xolair®로 판매되는 제품), 베바시주맙(상표명 Avastin®로 판매되는 제품), 나탈리주맙(상표명 Tysabri®로 판매되는 제품), 라니비주맙(상표명 Lucentis®로 판매되는 제품), 파니투무맙(상표명 Vectibix®로 판매되는 제품), 에쿨리주맙(상표명 Soliris®로 판매되는 제품), 세르톨리주맙 페골(상표명 Cimzia®로 판매되는 제품), 골리무맙(상표명 Simponi®로 판매되는 제품), 카나키누맙(상표명 Ilaris®로 판매되는 제품), 카투막소맙(상표명 Removab®로 판매되는 제품), 우스테키누맙(상표명 Stelara®로 판매되는 제품), 토실리주맙(상표명 RoActemra®, Actemra®로 판매되는 제품), 오파투무맙(상표명 Arzerra®로 판매되는 제품), 데노수맙(상표명 Prolia®로 판매되는 제품), 벨리무맙(상표명 Benlysta®로 판매되는 제품), 락시바쿠맙, 이필리무맙(상표명 Yervoy®로 판매되는 제품) 및 퍼투주맙(상표명 Perjeta®로 판매되는 제품) 중 하나이다. 예시적인 구현예에서, 항체, 글리코실화 Fc 단편, 항체 단백질 생성물, 키메라 항체, 또는 인간화 항체는 항-TNF 알파 단백질, 예컨대 아달리무맙, 인플릭시맙, 에타너셉트, 골리무맙, 및 세르톨리주맙 페골; 항-TNF 알파 항체, 예컨대 아달리무맙, 인플릭시맙, 골리무맙, 및 세르톨리주맙 페골; 항-IL1베타 항체, 예컨대 카나키누맙; 항-IL12/23 (p40) 항체, 예컨대 우스테키누맙 및 브리아키누맙; 및 항-IL2R 항체, 예컨대 다클리주맙 중 하나이다. 본원에 기술된 분자의 비독점 명칭은 그 비독점 명칭의 분자를 포함하는 임의의 혁신자 또는 바이오시밀러 제품을 포함할 것임을 이해할 것이다. 예시적인 구현예에서, 항체, 글리코실화 Fc 단편, 항체 단백질 생성물, 키메라 항체, 또는 인간화 항체는 전술한 항체 중 하나의 바이오시밀러이다.
예시적인 양태에서, 항체는 종양 연관된 항원에 결합하고, 항암 항체이다. 적합한 항암 항체의 예는 항-BAFF 항체, 예컨대 벨리무맙; 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙; 항-CD22 항체, 예컨대 에프라투주맙; 항-CD25 항체, 예컨대 다클리주맙; 항-CD30 항체, 예컨대 이라투무맙, 항-CD33 항체, 예컨대 겜투주맙, 항-CD52 항체, 예컨대 알렘투주맙; 항-CD152 항체, 예컨대 이필리무맙; 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시맙; 항-HER2 항체, 예컨대 트라스투주맙 및 퍼투주맙; 항-IL6 항체, 예컨대 실툭시맙; 및 항-VEGF 항체, 예컨대 베바시주맙; 항-IL6 수용체 항체, 예컨대 토실리주맙을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 양태에서, 항체의 항원은 TNFα이고, 항체는 항-TNFα 항체(또한 간결함을 위해 단순히 "항-TNF" 항체로도 지칭될 수 있음), 예를 들어, 항-TNFα 단클론성 항체이다. 예시적인 양태에서, 항체의 항원은 서열번호 2를 포함한다. 다양한 양태에서, 항체는 인플릭시맙이다. 용어 인플릭시맙은 인간 불변 및 뮤린 가변 영역으로 구성된 단클론성 IgG1 카파 항체인 키메라를 지칭하며, TNFα 항원에 결합한다(CAS 번호: 170277-31-3, DrugBank 수탁번호 DB00065). 키메라 항체 cA2로도 알려진 인플릭시맙은 A2로 불리는 뮤린 단클론성 항체로부터 유래된다(Knight et al., Molec Immunol 30(16): 1443-1453 (1993)). cA2 경쇄 및 cA2 경쇄의 가변 영역은 국제 특허 출원 공개 WO 2006/065975에 공개되어 있다. 예시적인 양태에서, 항체는 표 A에 제시된 바와 같은 인플릭시맙 경쇄의 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 예시적인 양태에서, 항체는 표 A에 제시된 바와 같은 인플릭시맙 중쇄의 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다양한 예에서, 항체는 인플릭시맙의 VH-IgG1 및 VL-IgG 카파 서열을 포함하는 VH 또는 VL을 포함한다.
Figure pct00001
다양한 양태에서, 항체는 하기를 포함한다:
i. 서열번호 3의 경쇄(LC) 가변 영역의 CDR1; 또는 LC CDR1 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열; 또는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 LC CDR1 아미노산 서열의 변이체 아미노산 서열,
ii. 서열번호 3의 LC 가변 영역의 CDR2; 또는 LC CDR2 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열; 또는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 LC CDR2 아미노산 서열의 변이체 아미노산 서열,
iii. 서열번호 3의 LC 가변 영역의 CDR3; 또는 LC CDR3 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열; 또는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 LC CDR3 아미노산 서열의 변이체 아미노산 서열,
iv. 서열번호 4의 중쇄(HC) 가변 영역의 CDR1; 또는 HC CDR1 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열; 또는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 HC CDR1 아미노산 서열의 변이체 아미노산 서열,
v. 서열번호 4의 중쇄(HC) 가변 영역의 CDR2; 또는 HC CDR2 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열; 또는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 HC CDR2 아미노산 서열의 변이체 아미노산 서열; 및
vi. 서열번호 4의 중쇄(HC) 가변 영역의 CDR3; 또는 HC CDR3 아미노산 서열과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열; 또는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 HC CDR3 아미노산 서열의 변이체 아미노산 서열.
다양한 예에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 3에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 3의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 LC 가변 영역.
예시적인 양태에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 4의 아미노산 서열, 서열번호 4에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 4의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 HC 가변 영역을 포함하는 HC 가변 영역.
예시적인 예에서, 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 5에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 5의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다양한 양태에서, 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 6에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 6의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
예시적인 양태에서, 종양 연관된 항원은 HER2이고, 항체는 항-HER2 항체, 예를 들어, 항-HER2 단클론성 항체이다. 예시적인 양태에서, 종양 연관된 항원은 서열 번호 7을 포함한다. 다양한 양태에서, IgG1 항체는 트라스투주맙이다. 용어 트라스투주맙은 HER2 항원에 결합하는 IgG1 카파, 인간화된, 단클론 항체를 지칭한다(CAS 번호: 180288-69-1, DrugBank 수탁 번호 DB00072 참조). 예시적인 양태에서, 항체는 표 B에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 예시적인 양태에서, 항체는 표 B에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다양한 예에서, 항체는 표 B에 인용된 VH-IgG1 및 VL-IgG 카파 서열을 포함하는 VH 또는 VL을 포함한다.
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다양한 양태에서, 항체는 하기를 포함한다:
i. 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 8의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) CDR1,
ii. 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 9의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2,
iii. 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 10의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3,
iv. 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 11의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) CDR1,
v. 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 12의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2,
vi. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열 또는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 13의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3,
다양한 예에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 14의 아미노산 서열, 서열번호 14에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 14의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 LC 가변 영역.
예시적인 양태에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 15에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 15의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 HC 가변 영역을 포함하는 HC 가변 영역.
예시적인 예에서, 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열, 서열번호 16에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 16의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다양한 양태에서, 항체는 서열번호 17의 아미노산 서열, 서열번호 17에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열, 또는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 또는 2)개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 17의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
조성물
본 명세서에 개시된 방법은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 다양한 양태에서, 조성물은 재조합 글리코실화 단백질의 1가지 유형만을 포함한다. 다양한 예에서, 조성물은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하되, 조성물의 각 재조합 글리코실화 단백질은 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 양태에서, 조성물은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하되, 조성물의 각 재조합 글리코실화 단백질은 조성물의 모든 다른 재조합 글리코실화 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 양태에서, 조성물은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하되, 조성물의 각 재조합 글리코실화 단백질은 조성물의 모든 다른 재조합 글리코실화 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 양태에서, 조성물은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하되, 조성물의 각 재조합 글리코실화 단백질은 동일하거나 또는 본질적으로 동일한(예를 들어, 조성물의 모든 다른 재조합 글리코실화 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함하지만, 조성물의 조합 글리코실화 단백질의 당프로파일은 서로 다를 수 있다. 다양한 양태에서, 조성물은 글리코실화 단백질의 적어도 80%가 특정 수준 (예를 들어, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30% 이하의 비결합 함량) 미만의 비결합 글리칸 함량 (고 만노스 및/또는 아푸코실화)을 갖는 재조합 글리코실화 단백질을 포함한다. 다양한 양태에서, 조성물은 글리코실화 단백질의 적어도 80%가 특정 수준 (예를 들어, 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30%의 비결합 함량) 초과의 비결합 글리칸 함량 (고 만노스 및/또는 아푸코실화)을 갖는 재조합 글리코실화 단백질을 포함한다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 항체 단편이며, 따라서, 조성물은 항체 단편 조성물일 수 있다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 항체 단백질 생성물이며, 따라서, 조성물은 항체 단백질 생성물 조성물일 수 있다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 글리코실화된 Fc 단편이고, 따라서, 조성물은 글리코실화된 Fc 단편 조성물일 수 있다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 글리코실화된 Fc 단편 항체 생성물이고, 따라서, 조성물은 글리코실화된 Fc 단편 항체 생성물 조성물일 수 있다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 키메라 항체이고, 따라서, 조성물은 키메라 항체 조성물일 수 있다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 인간화된 항체이고, 따라서, 조성물은 인간화된 항체 조성물일 수 있다.
예시적인 양태에서, 재조합 글리코실화 단백질은 항체이고, 조성물은 항체 조성물이다. 다양한 양태에서, 조성물은 1가지 유형의 항체만을 포함한다. 다양한 예에서, 조성물은 항체를 포함하되, 항체 조성물의 각 항체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물은 항체를 포함하되, 항체 조성물의 각 항체는 항체 조성물의 모든 다른 항체의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물은 항체를 포함하되, 항체 조성물의 각 항체는 항체 조성물의 모든 다른 항체의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 양태에서, 항체 조성물은 항체를 포함하되, 항체 조성물의 각 항체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한(예를 들어, 항체 조성물의 모든 다른 항체의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한) 아미노산 서열을 포함하지만, 항체 조성물의 항체의 당프로파일은 서로 다를 수 있다. 예시적인 양태에서, 항체 조성물은 항체의 상이한 당형태의 불균질 혼합물을 포함한다. 다양한 예에서, 항체 조성물은 이의 관련 비결합 글리칸 함량, 예를 들어 관련 비결합 HM 글리칸 함량 및/또는 이의 관련 비결합 AF 글리칸 함량에 관해 특징화될 수 있다. 선택적으로, 항체 조성물은 다른 유형의 글리칸, 예를 들어, 갈락토실화된 당형태, 푸코실화된 당형태 등의 함량에 관해 특징화될 수 있다.
다양한 양태에서, 항체 조성물의 각 항체는 인플릭시맙이다. 다양한 양태에서, 항체 조성물의 각 항체는 트라스투주맙이다.
예시적인 양태에서, 항체 조성물은 항체의 상이한 당형태의 불균질 혼합물을 포함한다. 다양한 예에서, 항체 조성물은 이의 관련 비결합 HM 글리칸 함량 및/또는 이의 관련 비결합 AF 글리칸 함량에 관해 특징화될 수 있다. 다양한 양태에서, 항체 조성물은 % 비결합 HM 글리칸 및/또는 % 비결합 아푸코실화 글리칸에 관해 기재된다. 선택적으로, 항체 조성물은 다른 유형의 글리칸, 예를 들어, 갈락토실화된 당형태, 푸코실화된 당형태 등의 함량에 관해 특징화될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 글리코실화 단백질 조성물(예를 들어, 항체 조성물 또는 항체 단백질 생성물 조성물) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수, 물, 에멀젼, 예컨대 수중유 또는 유중수 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 항체 조성물의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 세포 배양물에서 글리코실화 적격 세포에 의해 발현된다.
추가의 생산 방법들
본원에 개시된 항체 조성물을 생산하는 방법은, 다양한 양태에서, 추가 공정을 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 상기 방법은 재조합 글리코실화 단백질, 예를 들어, 항체의 제조, 정제 및 제형화에 수반되는 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 공정을 포함한다. 선택적으로, 다운스트림 공정은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 다운스트림 가공 단계를 포함한다. 예를 들어, 본원의 다운스트림 처리를 참조한다. 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 재조합 글리코실화 단백질(예를 들어, 항체)을 발현하는 숙주 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 숙주 세포는 일부 양태에서 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어 E. 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이거나, 숙주 세포는 일부 양태에서 진핵생물 숙주 세포, 예를 들어 효모 세포, 사상성 진균 세포, 원생동물 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 BHK 세포)이다. 이러한 숙주 세포는 당해 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013)] 및 본원에서 "세포" 아래를 참조한다. 예를 들어, 상기 방법은 일부 경우에 숙주 세포로 재조합 글리코실화 단백질, 또는 이의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함한다.
예시적인 양태에서, 상기 방법은 세포 배양물에서 세포, 예를 들어, 글리코실화-적격 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 따라서, 상기 방법은 본 명세서에서 세포 배양물에서의 세포 유지에 기재되는 임의의 하나 이상의 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 배양물로부터 재조합 글리코실화 단백질(예를 들어, 재조합 항체)을 단리하고/하거나 정제하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 비제한적인 예로서 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 친화도 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하는 용액으로부터 결정질 생물분자를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 다양한 양태에서, 일부 양태에서, 정제된 재조합 글리코실화 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 조성물은 본 명세서에서 논의된다.
세포 배양물에서의 세포 유지
본 개시내용의 단백질 또는 항체 조성물을 생산하는 방법에 관해, 항체 조성물은 세포 배양물에서 세포를 유지(예를 들어, 세포 배양물을 유지)함으로써 생산될 수 있다. 세포 배양물은 재조합 글리코실화 단백질의 생산에 적합한 임의의 세트의 조건에 따라 유지될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 세포 배양물은 특정 pH, 온도, 세포 밀도, 배양 부피, 용존 산소 수준, 압력, 삼투압몰농도 등에서 유지된다. 예시적인 양태에서, 접종 전에 세포 배양물은 CO2 항온처리기에서 표준 습윤 조건 하에 5% CO2에서 (예를 들어, 70 rpm에서) 진탕된다. 예시적인 양태에서, 세포 배양물은 1.5 L의 배지에서 약 106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종된다. 본원에 기술된 바와 같이, 클론은 선택된 상대적 비결합 및 쌍 글리칸 함량 (예를 들어, 대조군보다 낮거나 높은 비결합 글리칸 함량)을 생성하도록 선택될 수 있다. 클론으로부터 유래된 세포는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 또는 항체 조성물의 생산을 위해 배양될 수 있음을 이해할 것이다.
예시적인 양태에서, 본 발명의 방법은 약 6.85 내지 약 7.05, 예를 들어 다양한 양태에서, 약 6.85, 약 6.86, 약 6.87, 약 6.88, 약 6.89, 약 6.90, 약 6.91, 약 6.92, 약 6.93, 약 6.94, 약 6.95, 약 6.96, 약 6.97, 약 6.98, 약 6.99, 약 7.00, 약 7.01, 약 7.02, 약 7.03, 약 7.04, 또는 약 7.05의 pH에서 세포 배양 배지에서 글리코실화-적격 세포를 유지시키는 단계를 포함한다.
예시적인 양태에서, 상기 방법은 30℃ 내지 40℃의 온도에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 온도는 약 32℃ 내지 약 38℃ 또는 약 35℃ 내지 약 38℃이다.
예시적인 양태에서, 상기 방법은 약 200 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg의 삼투압몰농도를 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 약 225 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 또는 약 225 mOsm/kg 내지 약 375 mOsm/kg의 삼투압몰농도를 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 약 225 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg의 삼투압몰농도를 유지시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 삼투압몰농도(mOsm/kg)는 약 200, 약 225, 약 250, 약 275, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 또는 약 500에서 유지된다.
예시적인 양태에서, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 20% 내지 약 60%의 산소 포화에서 세포 배양물의 용존 산소(DO) 수준을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 30% 내지 약 50%(예를 들어, 약 35% 내지 약 45%)의 산소 포화에서 세포 배양물의 DO 수준을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55% 또는 약 60%의 산소 포화에서 세포 배양물의 DO 수준을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, DO 수준은 약 35 mm Hg 내지 약 85 mmHg, 또는 약 40 mm Hg 내지 약 80 mmHg, 또는 약 45 mm Hg 내지 약 75 mm Hg이다.
세포 배양물은 임의의 하나 이상의 배양 배지에서 유지된다. 예시적인 양태에서, 세포 배양물은 세포 성장에 적합한 배지에서 유지되고/되거나, 임의의 적합한 공급 스케줄에 따라 하나 이상의 공급 배지가 제공된다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 글루코스, 푸코스, 락테이트, 암모니아, 글루타민, 및/또는 글루타메이트를 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 1 μM 이하의 농도의 망간을 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 약 0.25 μM 내지 약 1 μM의 망간을 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 무시할만한 양의 망간을 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 50 ppb 이하의 농도의 구리를 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 40 ppb 이하의 농도의 구리를 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 30 ppb 이하의 농도의 구리를 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 상기 방법은 초기 세포 배양 기간 동안 약 20 ppb 이하의 농도의 구리를 포함하는 배지에서 세포 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 배지는 약 5 ppb 이상 또는 약 10 ppb 이상의 농도의 구리를 포함한다. 예시적인 양태에서, 세포 배양 배지는 만노스를 포함한다. 예시적인 양태에서, 세포 배양 배지는 만노스를 포함하지 않는다.
예시적인 구현예에서, 세포 배양의 유형은 유가 배양 또는 연속 관류 배양이다. 그러나, 본 발명의 방법은 유리하게는 임의의 특정 유형의 세포 배양에 제한되지는 않는다.
세포 배양물에서 유지된 세포는 글리코실화-적격 세포일 수 있다. 예시적인 양태에서, 글리코실화-적격 세포는 비제한적인 예로서 효모 세포, 사상성 진균 세포, 원생동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 포함하는 진핵생물 세포이다. 이러한 숙주 세포는 당해 분야에 기술되어 있다. 예를 들어 문헌[Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013)]을 참조한다. 예시적인 양태에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다. 예시적인 양태에서, 포유류 세포는 비인간 포유류 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 및 이의 유도체(예를 들어, CHO-K1, CHO pro-3), 마우스 골수종 세포(예를 들어, NS0, GS-NS0, Sp2/0), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 활성이 결핍되도록 조작된 세포(예를 들어, DUKX-X11, DG44), 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포 또는 이의 유도체(예를 들어, HEK293T, HEK293-EBNA), 녹색 아프리카 원숭이 신장 세포(예를 들어, COS 세포, VERO 세포), 인간 자궁경부암 세포(예를 들어, HeLa), 인간 뼈 골육종 상피 세포 U2-OS, 선암종 인간 폐포 기저 상피 세포 A549, 인간 섬유육종 세포 HT1080, 마우스 뇌 종양 세포 CAD, 배아 암종 세포 P19, 마우스 배아 섬유아세포 NIH 3T3, 마우스 섬유아세포 L929, 마우스 신경모세포종 세포 N2a, 인간 유방암 세포 MCF-7, 망막모세포종 세포 Y79, 인간 망막모세포종 세포 SO-Rb50, 인간 간암 세포 Hep G2, 마우스 B 골수종 세포 J558L, 또는 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포(Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-263 (2013))이다.
글리코실화-적격이 아닌 세포는 또한 예를 들어 글리코실화에 필요한 관련 효소를 암호화하는 유전자로 글리코실화-적격 세포를 형질주입함으로써 이 세포로 형질전환될 수 있다. 예시적인 효소는 올리고사카릴트랜스퍼라제, 글리코시다아제, 글루코시다아제 I, 글루코시다아제 II, 칼넥신/칼레티쿨린, 글리코실트랜스퍼라제, 만노시다아제, GlcNAc 트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 구현예에서, 글리코실화-적격 세포는 신생 경로 또는 회수 경로의 효소의 활성을 변경하도록 유전자 변경되지 않는다. 푸코스 대사의 이 2가지의 경로는 도 3에 도시되어 있다. 예시적인 구현예에서, 글리코실화-적격 세포는: 푸코실-트랜스퍼라제(FUT, 예를 들어, FUT1, FUT2, FUT3, FUT4, FUT5, FUT6, FUT7, FUT8, FUT9), 푸코스 키나아제, GDP-푸코스 파이로포스포릴라아제, GDP-D-만노스-4,6-데하이드라타아제(GMD), 및 GDP-케토-6-데옥시만노스-3,5-에피머라아제, 4-리덕타아제(FX) 중 임의의 하나 이상의 활성을 변경하도록 유전적으로 변경되지 않는다. 예시적인 구현예에서, 글리코실화-적격 세포는 FX를 암호화하는 유전자를 넉아웃시키도록 유전자 변경되지 않는다.
예시적인 구현예에서, 글리코실화-적격 세포는 활성 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GNTIII) 또는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 환원효소(RMD)를 변경하도록 유전자 변경되지 않는다. 예시적인 양태에서, 글리코실화-적격 세포는 GNTIII 또는 RMD를 과발현하도록 유전자 변경되지 않는다.
예시적인 구현예에서, 글리코실화-적격 세포는 신생 경로 또는 회수 경로의 효소의 활성을 변경하도록 유전자 변경된다.
하기 실시예는 단순히 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로든 그 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 단클론성 항체에 대해 N-연결된 글리코실화 프로파일(글리칸 프로파일)을 결정하는 예시적인 방법을 기재한다.
이 분석 방법의 목적은 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 글리칸 맵 분석에 의해 항체를 포함하는 샘플에서 항체의 N-연결된 글리코실화 프로파일을 결정하는 것이다. 이 글리칸 맵 방법은 항체의 N연결된 글리칸 분포의 정량적 분석이며, 3개의 단계를 포함한다: (1) PNGase　F, 및 유리 글리칸을 특이적으로 유도체화할 수 있는 형광단을 이용하여 기준 및 시험 샘플로부터 N-연결된 글리칸을 방출 및 표지하는 단계, (2) HILIC 칼럼 상의 유효 선형 범위 이내의 샘플을 장입하고, 감소된 유기 용매의 구배를 이용하여 표지된 N연결된 글리칸을 분리시키는 단계, 및 (3) 형광 검출기를 이용하여 글리칸 종 용리를 모니터링하는 단계.
다음의 단계들을 수행함으로써 표준 및 시험 샘플을 제조한다: (1) 샘플 및 대조군을 물로 희석시키는 단계, (2) PNGase　F를 첨가하고, 샘플 및 대조군을 인큐베이션시켜 N연결된 글리칸을 방출시키는 단계, (3) 2-아미노벤조산과 같은 형광단을 이용하여 형광단 표지 용액과 혼합하는 단계. 샘플 및 대조군을 교반 및 인큐베이션시키는 단계, (4) 원심분리시켜 단백질을 펠릿화하고, 상청액을 제거하는 단계, 및 (5) 표지한 글리칸을 주입 용액에서 건조 및 재구성하는 단계.
본 분석에서 사용되는 용액은 이동상 A(100 mM 포름산암모늄, 표적 pH 3.0) 및 이동상 B(아세토나이트릴)이다. 상기 방법의 단계를 수행하기 위해 사용하는 장비는 다음의 사양을 갖는다:
Figure pct00003
친수성 상호작용 분석 BEH 글리칸 1.7 μm 칼럼 (2.1　mm ID X 150　mm) 및 2-아미노벤조산 형광단 표지 방법을 이용하는 HPLC에 대한 기기 설정을 이하에 제공한다:
Figure pct00004
이동상 구배 예가 아래에 제공된다:
Figure pct00005
결과 보고서는 다음 형식을 포함한다:
Figure pct00006
대표적인 글리칸 맵 크로마토그램의 예는 도 2a(전면도) 및 도 2b(확장 축적 도면)에 나타낸다.
실시예 2
본 실시예는 두 항체의 글리칸 쌍 분석을 설명한다.
Fc 영역을 갖는 IgG 분자의 ADCC 활성은 컨센서스 글리코실화 부위에서 올리고당류의 구조 및 조성의 영향을 받는다. Fc 사슬에 코어 푸코스가 없으면 코어 푸코스를 포함하는 해당 Fc 사슬에 비해 ADCC 활성이 10배 이상 증가한다는 것은 잘 알려져 있다. ADCC 활성에 대한 아푸코실화의 이러한 효과는 푸코스의 부족으로 인한 것이며, 푸코스는 존재하는 경우에 예를 들어 효과기 세포의 표면에서 발현되는 Fc 수용체, 예를 들어 FcγRIIIa에 대한 Fc 사슬 사이의 결합 상호작용을 입체적으로 방해한다. 따라서, 아푸코실화 및 고 만노스 글리칸 그룹은 ADCC에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 보고되었다. Fc-FcγRIIIa 상호작용에 대한 기존 지식은 단일 Fc 사슬의 수용체에 대한 결합에 초점을 맞추고 있다. 그러나, IgG 및 IgG Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 단백질 치료 분자는 2개의 Fc 사슬을 함유하며, 각각은 글리코실화된다.
이 연구에서, 쌍 글리칸 함량 및 비결합 글리칸 함량을 2개의 상이한 항체 조성물에 대해 결정하였다: (1) 및 TNFα에 결합하는 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 단클론성 IgG1 항체인 항체 A를 포함하는 조성물 및 (2) 인간 표피 성장 인자 수용체 단백질(HER2)에 결합하는 재조합 IgG1 카파, 인간화 단클론성 항체인 항체 B를 포함하는 조성물. FcγRIIIa 상호작용 및 ADCC 활성에 대한 선택 글리칸의 영향을 분석하였다. 본 실시예에서, 각 항체에 대한 쌍 글리칸 및 비결합 글리칸을 정량화하였다. 실시예 3은 ADCC에 대한 선택된 글리칸의 영향을 기술하고, 실시예 4는 ADCC와 FcγRIIIa 결합 활성 사이의 상관관계를 기술한다.
비결합 또는 쌍 글리칸의 수준을 측정하는 데 사용되는 방법은 3개의 단계를 포함하였다: 항체 절단 단계, 크로마토그래피 분리 단계, 및 질량 분석법-기반 검출 단계. 간략하게, 항체 A 또는 항체 B를 포함하는 항체 조성물의 샘플을 FabALACTICA® (FL) 효소(Genovis Inc., Cambridge, MA)로 처리하고, 이는 힌지 위의 IgG1 항체의 중쇄를 절단하여 Fab 및 Fc 항체 단편을 생성한다(도 5). FL 효소는 IgG1 중쇄 서열 K TH TCPP(서열번호 1)의 제2 아미노산과 제3 아미노산 사이를 절단한다. 생성된 Fab 단편 및 글리코실화 Fc 단편은 이어서 분리되고, 이온쌍 시약을 용매로 하는 물/유기물을 사용하는 순상 모드의 HILIC 및 질량 분석법-기반 검출에 의해 특징화된다. 액체 크로마토그래피(LC) 분리는 Waters Acquity UPLC 당단백질 아미드 컬럼에서 95분 동안 물과 아세토니트릴(0.1% TFA 포함)의 조성 20:80인 이동상으로 수행되었다. 1분에, 정지 상과의 상호작용을 기반으로 글리칸 쌍을 분리하기 위해 다음 74분 동안 0.44 ml/분의 선형 구배를 적용했다. 질량 분석법(MS) 검출은 다음 설정으로 Agilent Jet Stream (AJS) 이온 소스와 함께 Agilent 6545XT QToF MS를 사용하여 수행되었다: 모세관 전압 - 4500 V; 건조 기체 - 11 mL/분; 분무기 압력 - 25 psi 및 가스 온도 - 340℃ 내지 3000 m/z의 질량 범위 사용. 디콘볼루션은 30의 S/N을 사용하는 Bioconfirm B.09.00 (Agilent) 및 40~60 kDa로 설정된 출력 질량 범위를 사용하여 수행되었다.
항체 A의 쌍 글리칸 및 비결합 글리칸을 나타내는 N-연결된 글리코실화 프로파일(글리칸 프로파일) 또는 글리칸 맵이 도 6a에 도시되어 있고, 항체 B의 쌍 글리칸 및 비결합 글리칸을 나타내는 글리칸 프로파일 또는 글리칸 맵은 도 6b에 도시되어 있다. 개별 글리칸 쌍의 풍부도는 다음과 같이 크로마토그램의 해당 피크 아래 상대 면적의 %로 결정되었다:
% 피크 면적 = 피크 면적/총 피크 면적 x 100.
항체 A에 대한 존재비 순으로 글리칸 쌍의 목록이 표 1에 제공되고, 항체 B에 대한 존재비 순으로 글리칸 쌍 목록이 표 2에 제공된다. 각 표에서, 굵은 기울임꼴 텍스트로 나타낸 종은 구조 이성질체이다.
[표 1]
Figure pct00007
[표 2]
Figure pct00008
항체 A 및 항체 B에 대한 고 만노스-함유 글리칸 쌍의 상대적 풍부도는 표 3에 나열되어 있는 반면, 항체 A 및 항체 B에 대한 아푸코실화 글리칸 쌍의 상대적 풍부도는 표 4에 나열되어 있다. 하나의 Fc 사슬만이 코어 푸코스(F)를 갖는 쌍에 "비결합" 상태가 할당되었으며, "쌍 아푸코실화" 상태는 Fc 사슬 중 어느 것도 코어 푸코스를 갖지 않는 쌍에 할당되었다. 일반적으로, 고 만노스-함유 쌍은 M3 및 A2G0을 포함하는 글리칸 쌍을 제외하고 1 또는 2개의 고 만노스 그룹을 포함하며, 여기서 코어 푸코스는 이들 글리칸(M3F 또는 A2G0F) 중 하나에 존재하였다. 아푸코실화 글리칸 쌍은 적어도 하나의 Fc 사슬에 아푸코실화 글리칸을 포함하였다. 어떤 경우에, 아푸코실화 글리칸 쌍은 1개의 고 만노스 그룹을 포함했다.
[표 3]
Figure pct00009
[표 4]
Figure pct00010
항체 A 및 항체 B에 대한 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도(%) 및 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도(%)의 그래프는 도 7에 도시되어 있다. 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도(%)는 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율을 비결합 아푸코실화 글리칸의 백분율과 쌍 아푸코실화 글리칸의 백분율의 합으로 나누고, 100%를 곱하여 계산되었다. 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도는 비결합 고 만노스 글리칸의 백분율을 비결합 고 만노스 글리칸의 백분율과 쌍 고 만노스 글리칸의 백분율의 합으로 나누고, 100%를 곱하여 계산되었다. 이 도면에 도시된 바와 같이, 두 항체(항체 A 및 항체 B)는 다량의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸을 포함하였다. 항체 A가 다량의 상대적 비결합 고 만노스 글리칸을 가진 반면, 상대적 비결합 고 만노스 글리칸은 항체 B에 대해 더 작은 백분율을 나타냈다.
실시예 3
본 실시예는 두 항체의 ADCC 분석을 설명한다.
항체 A 또는 항체 B를 포함하는 샘플에 대한 ADCC 활성 수준(% 상대적 값으로 표현됨)은 항체가 항체 Fc 도메인을 통해 NK92-M1 효과기 세포에 대한 FcγRIIIA(158V) 수용체와 결합하면서 항체 A 또는 항체 B에 대한 표적 항원을 안정적으로 발현하는 표적 세포의 용량-의존적 방식으로 세포 세포독성을 매개하는 능력을 측정하는 정량적 세포-기반 분석을 사용하여 결정되었다. 이러한 사건은 세포용해 과립 복합체 퍼포린/그랜자임의 엑소시토시스를 통한 효과기 세포의 활성화 및 표적 세포의 파괴를 야기한다. 항체 A에 대한 ADCC 분석의 개략도를 도 8a에 제공하고, ADCC 분석에 대한 대표적인 용량-반응 곡선을 도 8b에 도시한다. 도 8b에서, 각 용량 지점은 3개 복제물의 평균 ± 표준 편차이고, 분석 신호 = 형광이다.
증가하는 항체 농도를 갖는 2개의 항체 샘플 시리즈(하나의 항체 A 시리즈 및 또 다른 항체 B 시리즈)를 제조하였다. 각 시리즈의 각 샘플에 대한 고 만노스 글리칸 및 아푸코실화 글리칸의 풍부도를 측정하고 기록하였다. 각 시리즈의 각 샘플에 대한 ADCC 활성 수준(%로 표시함)은 상기 정량적 세포-기반 분석을 통해 결정하였다. 간략하게, 표적 세포는 칼세인-아세톡시메틸(칼세인-AM)로 표지되었고, 이는 세포에 쉽게 들어가고 이어서 세포간 에스테라제에 의해 절단되어 세포 내에 가두어진다. 표적 세포가 용해되면, 형광 칼세인이 배지로 방출된다. 용해된 표적 세포로부터 방출된 칼세인의 수준은 Envision(Perkin Elmer) 형광 플레이트 판독기에서 반응 상청액의 형광을 측정함으로써 결정되었다. 각 분석은 보고된 평균 및 표준 편차와 함께 3중으로 수행되었다. 데이터는 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용하여 제한된 4개 매개변수 맞춤을 사용하여 평균 형광 값에 맞추었고, EC50 표준/EC50 샘플 비율로 계산된 참조 표준에 대한 백분율 ADCC 활성으로 보고되었다.
측정된 ADCC 활성 수준, 고 만노스 글리칸 함량, 및 아푸코실화 글리칸 함량에 대한 데이터를 통계 분석용 컴퓨터 프로그램의 JMP 슈트(SAS Institute, Cary, NC)를 사용하여 분석했다. 분석 결과는 항체 A의 경우 도 9a 내지 도 9c에, 항체 B의 경우 도 10a 내지 도 10c에 도시되어 있다.
항체 A에 대한 글리칸-ADCC 통계 모델은 도 9a 및 9b에 제공되며, 여기서 도 9a는 아푸코실화 글리칸에 대한 ADCC 레버리지 플롯이고, 도 9b는 고 만노스 글리칸에 대한 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. 항체 A에 대한 % ADCC와 측정된 글리칸 사이의 관계는 식 1로 설명될 수 있다:
[식 1]
예측된 % ADCC = 8.7 + (12.4* % 아푸코실화 글리칸) + (12.9 * % 고 만노스 글리칸)
% 고 만노스 및 % 아푸코실화 글리칸에 대한 측정값을 식 1에 대입하여, 예측된 % ADCC 값을 각 샘플에 대해 계산하였다. 실제 % ADCC (세포-기반 분석에서 측정됨)를 예측된 % ADCC(식 1에 의해 계산됨)에 대해 플롯팅하였으며, 플롯은 도 9c로 제공된다. 평균 제곱근 편차(RMSE), r2, 및 p-값을 포함한 통계 매개변수는 도 9c에 도시되어 있다. 이러한 결과는 식 1이 실제(측정된) ADCC를 정확하게 예측하고 아푸코실화 글리칸, 고 만노스 및 ADCC 사이의 통계적으로 유의미한 직접적인 상관관계(p<0.0001)를 강조한다는 것을 시사하였다. 더 높은 수준의 아푸코실화 글리칸 및 고 만노스는 더 높은 ADCC 활성을 초래한다. ADCC 활성에 대한 아푸코실화 글리칸의 레버리지와 고 만노스의 레버리지는 매우 유사했다(각각 12.4 및 12.9).
동일한 분석을 항체 B 샘플에 대한 데이터에 적용했다. 항체 B에 대한 데이터의 글리칸-ADCC 통계 모델이 도 10a 및 10b에 제공되며, 여기서 도 10a는 아푸코실화 글리칸에 대한 ADCC 레버리지 플롯이고, 도 10b는 고 만노스 글리칸에 대한 ADCC 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 아푸코실화 글리칸 함량과 실제 ADCC 수준 사이의 연관성은 통계적으로 유의한 반면(p < 0.0001), 고 만노스 글리칸 함량과 실제 ADCC 수준 사이의 연관성은 유의하지 않았다(p >0.01). 따라서, 항체 B에 대한 % ADCC와 측정된 글리칸 사이의 관계는 아푸코실화 글리칸 함량에 의존했지만 고 만노스 함량에는 의존하지 않았다. 항체 B에 대한 % ADCC와 측정된 아푸코실화 글리칸 사이의 관계는 식 2로 설명할 수 있다:
[식 2]
예측된 % ADCC = -81 + (21.8 * % 아푸코실화 글리칸) + (2.2 고 만노스 글리칸)
% 아푸코실화 글리칸에 대한 측정값을 식 2에 대입하여, 예측된 % ADCC 값을 각 샘플에 대해 계산하였다. 실제 % ADCC (세포-기반 분석에서 측정됨)를 예측된 % ADCC(식 2에 의해 계산됨)에 대해 플롯팅하였으며, 플롯은 도 10c로 제공된다. 평균 제곱근 편차(RMSE), r2, 및 p-값을 포함한 통계 매개변수는 도 10c에 도시되어 있다. 이러한 결과는 식 2가 실제(측정된) ADCC를 정확하게 예측하고 아푸코실화 글리칸과 ADCC 사이의 통계적으로 유의미한 상관관계(p<0.0001)를 강조한다는 것을 시사하였다. 더 높은 수준의 아푸코실화 글리칸은 더 높은 ADCC 활성을 초래한다. ADCC에 대한 고 만노스의 효과는 약했고 통계적으로 유의하지 않았다.
식 1 및 2에 상술된 바와 같은 ADCC 수준에 대한 아푸코실화 글리칸 및 고 만노스의 레버리지를 도 7에 상술된 바와 같은 각 항체에 대한 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 % 및 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 %와 비교하였다(표 5).
[표 5]
Figure pct00011
흥미롭게도, 표 5에 의해 뒷받침되는 바와 같이, ADCC에 대한 글리칸 함량의 레버리지는 비결합 글리칸 유형의 상대적 풍부도와 일치한다. 항체 A의 경우, 두 비결합 글리칸 유형(비결합 아푸코실화 글리칸 및 비결합 고 만노스 글리칸)의 상대적 풍부도는 상대적으로 높았고, 두 글리칸 유형 모두 ADCC에 상당한 영향을 미쳤다. 항체 B의 경우, 비결합 아푸코실화 글리칸 단독의 상대적 풍부도는 상대적으로 높았고, 이러한 유형의 글리칸(아푸코실화 글리칸)만이 ADCC 수준에 상당한 영향을 미쳤다. 이러한 결과는 특정 비결합 글리칸 그룹의 상대적 백분율이 높을 수록 ADCC에 미치는 영향이 더 크다는 것을 시사한다.
이들 결과는 항체의 표적 ADCC 수준이 항체의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 의해 반영될 수 있고, 항체의 표적 ADCC 수준이 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 함량을 변경시키기 위한 조건을 변경함으로써 변경될 수 있음을 시사한다. 비결합 글리칸 조성의 이러한 조정은 세포주의 선택 및/또는 원하는 비결합 아푸코실화 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 달성하기 위한 공정 조건들의 선택/조정을 통해 달성될 수 있다.
실시예 4
본 실시예는 ADCC 활성과 FcγRIIIa 결합 활성 사이의 상관관계 및 측정의 예시적인 방법을 기술한다.
항체 B의 FcγRIIIa 결합 활성은 AlphaLISA® 분석(Perkin Elmer, Shelton, CT, USA)을 사용하여 정량화하였다. 재조합, 정제된 FcγRIIIa 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)-융합 단백질은 Amgen Inc.(Thousand Oaks, Ca)에서 생성되었다. AlphaLISA® 분석은 IgG1 mAb의 Fc 부분에 대한 FcγRIIIa 결합의 수준을 측정하도록 설계된 증폭 발광 근접성 균질 분석(알파)이다. 분석에는 두가지 비드 유형이 포함되었다: 수용자 비드 및 공여자 비드. 수용자 비드는 재조합 인간 FcγRIIIa-GST에 결합하기 위해 글루타티온으로 코팅하였다. 비오티닐화 인간 IgG1(Amgen Inc. Thousand Oaks, CA)에 결합하기 위해 공여자 비드를 스트렙타비딘으로 코팅하였다. 항체 B가 없으면, FcγRIIIa는 인간 IgG1에 결합한다. 항체 B가 FcγRIIa가 비오티닐화 인간 IgG1에 결합하는 것을 억제하기에 충분한 농도로 존재하는 경우, 플레이트 판독기를 사용하여 용량-의존적 방출 감소를 측정한다. 참조 표준에 대한 샘플 결합은 4-파라미터 로지스틱 모델 피팅(SoftMax® Pro Software, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 결정하였다. 각각의 샘플을 3개의 독립적인 분석으로 시험하고, 주어진 샘플에 대한 최종 유효 결과는 3회 측정의 평균으로 보고하였다. 결과는 퍼센트 상대 결합 값으로 보고하였다.
항체 B에 대해 실시예 3에서 수득된 측정된 ADCC 활성 수준을 항체 B에 대해 측정된 FcγRIIIa 결합 활성에 대해 플롯팅하였고, 그래프를 도 11에 나타낸다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, 항체 B에 대한 ADCC 활성과 FcγRIIIa 결합 활성 사이에 양호한 상관관계가 있었다.
항체 A에 대해 실시예 3에서 얻은 측정된 ADCC 활성 수준을 또한 항체 A에 대해 측정된 FcγRIIIa 결합 활성에 대해 플롯팅하였다. 그러나, 항체 A에 대한 ADCC 활성과 FcγRIIIa 결합 활성 사이에 상관관계가 있는지 여부를 결론짓기에는 통계적 증거가 불충분했다. 이러한 통계적 결과의 결여는 수행된 분석에서 항체 A 샘플의 Fab-매개 표적 결합 활성의 더 낮은 순도 또는 더 큰 가변성에 기인할 수 있다고 생각되었다. 어느 경우에서든, FcγRIIIa 결합 활성은 일반적으로 활성의 Fc-매개 부분을 나타내는 ADCC에 대한 대체물로 이해되며, 또한 FcγRIIIa 결합 활성 자체가 생물학적으로 중요하다는 것을 이해할 것이다.
이들 결과는 Fc에 의해, 그리고 따라서 글리칸에 의해 매개되는 기능적 활성이 FcγRIIIa 결합 분석에 의해 측정될 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 5
본 실시예는 온전한 중앙-다운 질량 분석법에 의한 IgG1 Fc 글리코실화 쌍 형성의 연구 및 ADCC 활성과 글리코실화 쌍 형성의 상관관계를 입증한다.
SEC/MS에 의해 항체 B에 온전한 질량 분석을 수행하였다. 간략하게, 샘플을 구아니딘 하이드로클로라이드의 존재 하에 변성시킨 후 컬럼에 주입하였다. 0.1% 트리플루오아세트산과 함께 물과 아세토니트릴로 구성된 이동상 시스템을 사용하여 샘플을 용출했다. 그런 다음 Agilent qTOF 장비를 사용하여 용출 피크를 질량 분석 검출에 적용했다. 생성된 질량 스펙트럼은 Mass Hunter® 소프트웨어(Agilent)를 사용하여 디콘볼루션되었으며, 그 결과는 도 12에 도시되어 있다.
GingisKHAN® 효소(Genovis, Lund, Sweden)를 항체 B와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션함으로써 GingisKHAN 분석을 수행하였다. 효소는 힌지 위의 특정 부위에서 인간 IgG1을 분해하여 Fab 및 Fc 항체 단편을 생성하는 시스테인 프로테아제이다(도 13). Fab 단편과 글리코실화 Fc 단편을 분리하기 위해 소화된 물질에 대해 MS 검출을 통한 크로마토그래피 분리를 수행했다. 예시적인 결과가 도 14a에 도시되어 있고 표지된 글리칸 쌍을 갖는 Fc 단편의 피크의 확대도가 도 14b에 도시되어 있다. 도 15는 개별 Fc 글리칸 쌍 종의 용출을 나타내는 추출된 이온 크로마토그램의 예이다.
이들 연구로부터, 온전한 질량 분석은 가장 풍부한 글리칸 쌍만을 분해할 수 있다는 결론을 내렸다. GingisKHAN 분석은 글리칸 쌍형성 정보를 제공할 수 있었다.
실시예 6
본 실시예는 FcγRIIIa 결합 활성이 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도 및 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도와 상관관계가 있음을 입증한다.
항체 C는 HER2에 결합하는 단클론성 IgG1 항체이다. 항체 B와 항체 C는 동일한 표적(HER2)에 결합하지만, 항체는 상이한 에피토프에 결합한다. 2개 세포주의 상이한 클론(총 5개의 클론)에 의해 생성된 항체 C를 함유하는 샘플을 본 연구에 사용하였다. 연구의 제1 부분에서, 각각의 샘플에 대한 고 만노스 글리칸 및 아푸코실화 글리칸의 총 풍부도를 실시예 1에 본질적으로 기재된 바와 같이 측정하였다. 항체 C를 포함하는 각각의 샘플에 대한 FcγRIIIa 결합 활성(%로 표현됨)은 실시예 4에 기재된 분석을 사용하여 결정하였다. 각 샘플에 대한 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도 및 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도를 측정하고 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 기록하였다.
결과를 표　6에 제공한다. 각 클론의 샘플은 적어도 이중으로 제조되었고(예를 들어, 샘플 1A 및 1B는 둘 다 클론 1로부터, 등), 4개의 샘플은 클론 2로부터 수행하였다(샘플 2A, 2B, 2C, 및 2D).
[표 6]
Figure pct00012
항체 C에 대한 제1 글리칸-FcγRIIIa 결합 통계 모델은 도 16a 및 16b에 제공되며, 여기서 도 16a는 아푸코실화 글리칸에 대한 FcγRIIIa 결합 레버리지 플롯이고, 도 16b는 고 만노스 글리칸에 대한 FcγRIIIa 결합 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이다. 각 레버리지 플롯의 통계적 유의성은 도 16a 및 16b에 도시되어 있다. 각각의 p-값이 약 0.1 이상이므로, FcγRIIIa 결합에 대한 아푸코실화 글리칸의 전체 풍부도와 고 만노스 글리칸의 전체 풍부도 사이의 상관관계는 약한 것으로 간주되었다. % FcγRIIIa 결합 %와 항체 C에 대한 측정된 아푸코실화 및 고 만노스 글리칸 사이의 관계에 대한 예측 식은 도 16c로 제공된 플롯에 도시된 바와 같이 상관관계에서 통계적 유의성이 결여되어 유도될 수 없었다. 평균 제곱근 편차(RMSE), r2, 및 p-값을 포함한 통계 매개변수는 도 16c에 도시되어 있다.
항체 C에 대한 제2 글리칸-FcγRIIIa 결합 통계 모델은 도 17a 및 17b에 제공되며, 여기서 도 17a는 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도에 대한 FcγRIIIa 결합 레버리지 플롯이고, 도 17b는 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도에 대한 FcγRIIIa 결합 레버리지 플롯이다. 가장 잘 맞는 선은 음영 영역 중앙의 실선 대각선이고, 각 레버리지 플롯의 통계적 유의성은 도 17a 및 17b에 도시되어 있다. 각각의 p-값이 0.05 미만이었으므로, FcγRIIIa 결합에 대한 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도와 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도 사이의 상관관계는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 항체 C에 대한 % FcγRIIIa 결합과 비결합 아푸코실화의 상대적 풍부도와 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도 사이의 관계는 식 3으로 설명될 수 있다:
[식 3]
예측된 % FcγRIIIa 결합 = -32.3 + (28.9* % 비결합 아푸코실화 글리칸) + (40.2 * % 비결합 고 만노스 글리칸)
% 비결합 아푸코실화 및 % 비결합 고 만노스 글리칸에 대한 측정값을 식 3에 적용하여, 예측된 % FcγRIIIa 결합 값을 각 샘플에 대해 계산했다. 실제 % FcγRIIIa 결합 (분석에서 측정됨)을 예측된 % FcγRIIIa 결합(식 3에 의해 계산됨)에 대해 플롯팅하였으며, 플롯은 도 17c로 제공된다. 평균 제곱근 편차(RMSE), r2, 및 p-값을 포함한 통계 매개변수는 도 17c에 도시되어 있다. 이러한 결과는 식 4가 통계적으로 유의미한 실제(측정된) FcγRIIIa 결합을 예측한다는 것을 뒷받침한다. 더 높은 수준의 비결합 아푸코실화 글리칸 및 비결합 고 만노스 글리칸은 더 높은 FcγRIIIa 결합 활성을 초래한다.
이들 결과는 항체의 표적 FcγRIIIa 결합 수준이 항체 조성물의 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도에 의해 우선적으로 반영될 수 있고, 항체의 표적 FcγRIIIa 결합 수준이 비결합 아푸코실화 글리칸의 상대적 풍부도 및/또는 비결합 고 만노스 글리칸의 상대적 풍부도를 변경시키기 위해 조건들을 변경시킴으로써 변경될 수 있음을 시사한다.
본원에 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 비롯한 모든 참고문헌은, 각 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로서 개별적으로 그리고 구체적으로 나타내고 그 전체가 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용을 설명하는 문맥에서(특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수형 용어("a", "an", "the" 및 유사한 언급)의 사용은, 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함되는", 및 "함유하는"은 달리 주지되지 않는 한 표시된 구성 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는 개방형 용어로 간주된다(즉, "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미함).
본원에서 값의 범위의 언급은 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값 및 각각의 종결점을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서 사용하려는 것이며, 각각의 개별 값 및 종결점은 본원에 개별적으로 언급된 것과 마찬가지로 명세서에 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적인 용어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단순히 본 개시내용을 더 잘 예시하고자 하는 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 명세서에서의 어떠한 언어도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 개시내용의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 개시내용을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최적의 방식을 포함하여, 본 개시내용의 바람직한 구현예가 본원에 기재된다. 이러한 바람직한 구현예의 변경은 상기 설명을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변경을 적절히 이용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 개시내용이 본원에 구체적으로 기재된 것과 같이 달리 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 개시내용에는 준거법이 허용하는 한, 본원에 첨부되는 청구범위에서 인용되는 청구 대상의 모든 변경 및 균등물이 포함된다. 또한, 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 상술한 요소들의 모든 가능한 변경에 대한 조합은 본 개시내용에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Inc. POLOZOVA, Alla <120> UNPAIRED GLYCANS IN ANTIBODY PRODUCTION METHODS <130> A-2626-WO-PCT <150> 63/092,281 <151> 2020-10-15 <150> 63/163,131 <151> 2021-03-19 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 1 5 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human TNF alpha <400> 2 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly 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Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg 1010 1015 1020 Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu 1025 1030 1035 Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser 1040 1045 1050 Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu 1055 1060 1065 Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser 1070 1075 1080 Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val 1085 1090 1095 Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro 1100 1105 1110 Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro 1115 1120 1125 Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu 1130 1135 1140 Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly 1145 1150 1155 Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala 1160 1165 1170 Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp 1175 1180 1185 Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro 1190 1195 1200 Pro Ser Thr Phe Lys Gly 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Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length LC <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 17 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length HC <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly 450

Claims (38)

  1. 항체 조성물의 생산 방법으로서,
    i. 항체 조성물의 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계; 및
    ii. (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    샘플은 항체 조성물의 항체를 발현시키는 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 취하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    세포 배양물의 하나 이상의 조건을 변경하여, 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경하는 단계 및 변경된 세포 배양물 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 표적 범위 내에 있을 때까지 상기 변경을 반복하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 생산과 관련하여 실시간으로 결정되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 표적 범위 내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위해 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량은 항체 조성물의 ADCC 활성 수준과 상관관계가 있는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 항체 조성물의 ADCC 활성 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    ADCC 활성 수준이 표적 범위 내에 있을 경우 다운스트림 처리를 위해 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 항체 조성물의 생산 방법으로서,
    i. 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계;
    ii. (i)에서 결정된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 항체 조성물의 ADCC 수준을 결정하는 단계;
    iii. (ii)에서 결정된 항체 조성물의 ADCC 수준이 표적 ADCC 범위 내에 있을 때 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 항체 조성물의 생산 방법으로서,
    i. 항체 조성물의 항체를 발현하는 글리코실화-적격 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 채취한 항체 조성물의 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계;
    ii. 선택적으로,
    세포 배양물을 변경시켜 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 조정하는 단계, 및
    변경된 세포 배양물로부터 채취한 항체 조성물의 샘플의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 결정하는 단계;
    iii. 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량에 기반하여 다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 조성물의 항체를 발현하는 글리코실화-적격 세포를 포함하는 세포 배양물을 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다운스트림 처리는 희석, 농축, 충전, 여과, 제형화, 크로마토그래피, 바이러스 여과, 및/또는 바이러스 비활성화 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다운스트림 처리는 크로마토그래피, 예컨대 포획 크로마토그래피, 중간 크로마토그래피, 및/또는 광택 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 크로마토그래피는 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    결정하는 단계는 (i) 힌지 영역 디설파이드 결합에 대한 N-말단 부위에서 항체 중쇄를 절단하여 항체 단편을 형성하는 효소로 항체 조성물을 처리하는 단계, (ii) 크로마토그래피로 항체 단편을 분리하는 단계, 및 (iii) 각 항체 단편을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    부위는 IgG1 항체 중쇄의 서열 KTHTCPP(서열번호 1)의 Thr과 His 사이 또는 Lys와 Thr 사이에 있는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 항체 단편은 Fab 단편 및 글리코실화 Fc 단편을 포함하는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (ii)의 분리가 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iii)의 정량화는 질량 분석법을 포함하는, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    글리코실화 Fc 단편은 다양한 글리칸 모이어티 중 하나에 부착된 Fc 단편을 포함하고, 상기 방법은 부착된 글리칸 모이어티에 따라 글리코실화 Fc 단편을 분리하고 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    다운스트림 처리를 위한 항체 조성물을 선택하는 단계는 선택된 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 갖는 항체 조성물을 생산하는 클론을 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 항체 조성물의 상대적 비결합 글리칸 함량을 결정하는 방법으로서, (i) 힌지 영역 디설파이드 결합에 대한 N-말단 부위에서 항체 중쇄를 절단하여 항체 단편을 형성하는 효소로 항체 조성물을 처리하는 단계, (ii) 크로마토그래피로 항체 단편을 분리하는 단계, 및 (iii) 각 항체 단편을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    부위는 IgG1 항체 중쇄의 서열 KTHTCPP(서열번호 1)의 Thr과 His 사이 또는 Lys와 Thr 사이에 있는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 항체 단편은 Fab 단편 및 글리코실화 Fc 단편을 포함하는, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (ii)의 분리가 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)를 포함하는, 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iii)의 정량화는 질량 분석법을 포함하는, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    글리코실화 Fc 단편은 다양한 글리칸 모이어티 중 하나에 부착된 Fc 단편을 포함하고, 상기 방법은 부착된 글리칸 모이어티에 따라 글리코실화 Fc 단편을 분리하고 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸이 정량화되는, 방법.
  30. 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 방법으로서, 항체 조성물의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 항체 조성물의 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 변경시키는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량을 증가시켜, ADCC 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 증가시켜, ADCC 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제30항에 있어서,
    상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량을 감소시켜, ADCC 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제30항 또는 제33항에 있어서,
    상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량을 감소시켜, ADCC 활성의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및/또는 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 약 1% 변경되고 항체 조성물의 항체가 항-TNF 항체, 선택적으로, 인플릭시맙인경우, 약 11% 내지 약 14% 변경되는, 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    ADCC 활성의 수준은 각각의 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 및 상대적 비결합 고 만노스 글리칸 함량이 약 1% 변경되고 항체 조성물의 항체가 항-TNF 항체, 선택적으로, 인플릭시맙인 경우, 약 11% 내지 약 14% 변경되는, 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    ADCC 활성의 수준은 상대적 비결합 아푸코실화 글리칸 함량 표적 범위가 약 1% 변경되고, 항체가 항-HER2 항체, 선택적으로, 트라스투주맙인 경우, 약 13% 내지 약 15% 변경되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    제30항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 따라 항체 조성물의 ADCC 수준을 변경시키는 단계를 포함하는, 방법.
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