ES2289174T3 - Anticuerpos contra el antigeno muc-18. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado que comprende un polipéptido de región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, y un péptido de región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a MUC18.

Description

Anticuerpos contra el antígeno MUC-18.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Las realizaciones de la presente invención se refieren a anticuerpos que se unen al antígeno MUC18, además de procedimientos y medios para preparar y usar tales anticuerpos.

Descripción de la técnica relacionada

MUC18 es una glicoproteína de la superficie celular identificada originalmente como un antígeno de melanoma, molécula de adhesión celular de melanoma (MCAM), cuya expresión está asociada con progresión tumoral y el desarrollo de potencial metastásico. MUC18 es una glicoproteína de membrana integral de la superficie celular de 113 kDA compuesta por un péptido señal, cinco dominios similares a inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta (Lehmann y col., Proc Natl Acad Sci USA, 86(24): 9891-5 (1989)).

MUC18 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y tiene una significativa homología de secuencias con varias moléculas de adhesión celular de la superfamilia de Ig (Lehmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:9891-9895 (1989)), que incluye BEN (Pourquie y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5261-5265 (1992)), molécula de adhesión celular neural (NCAM) (Owens y col., Proc. Natl., Acad Sci. USA, 84:294-298 (1987)), glicoproteína asociada a mielina (GAM) (Lai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4337-4341 (1987)), deleción de cáncer colorrectal (DCC) (Hedrick y col., Genes Devel., 8 (10):1174-83 (1994)) y gicerina (Taira y col., Neuron, 12: 861-872 (1994)). La expresión de MUC18 se ha detectado en el espectro relativamente limitado de tejidos humanos normales y en una variedad de tumores malignos. En tejidos adultos normales, MUC18 se expresa en células endoteliales, células de músculo liso (Shih y col., Lab. Invest., 75:377-388 (1996); Sers y col., Cancer Res., 54(21):5689-94 (1994)), una subpoblación de linfocitos T activados (Pickl y col., J. Inmunol., 158: 2107-2115 (1997)) y trofoblastos intermedios (Shih y col., Lab. Invest., 75:377-388 (1996)). MUC18 también se expresa en una variedad de tumores malignos que incluyen tumores de músculo liso (leiomiomas y leiomiosarcomas), tumores de origen vascular (angiosarcomas y sarcomas de Kaposi), tumores trofoblásticos de sitio placentario, coriocarcinomas y melanomas (Shih y col., Clinical Cancer Res., 2:569-575 (1996); Holzmann y col., Int. J. Cancer, 39:466-471 (1987)). La expresión de MUC18 se correlaciona directamente con el potencial metastásico de células de melanoma humano (Bar-Eli, M., Cancer Metastasis, 18(3):377-85 (1999)).

Varios estudios han identificado MUC18 como un marcador de progresión tumoral y metástasis en melanomas. La expresión de MUC18 está ausente en melanocitos normales y nevos benignos, pero destaca en muchos melanomas primarios y en la mayoría de las lesiones metastásicas (Lehmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9891-9895 (1989); Lehmann y col., Cancer Res., 47:841-845 (1987); Shih y col., Cancer Res., 54:2514-2520 (1994)). Y lo más importante, la expresión de MUC18 se correlaciona bien con el espesor vertical del tumor y la formación de metástasis, y más del 80% de las lesiones metastásicas expresan MUC18 (Lehmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9891-9895 (1989); Xie y col., Cancer Res., 57:2295-2303 (1997); Sers y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8514-8518 (1993); Lehmann y col., Cancer Res., 47:841-845 (1987); Shih y col., Cancer Res., 54:2514-2520 (1994). En la figura 1 se presenta un diagrama que describe la expresión de MUC18 con respecto a otras lesiones moleculares conocidas en melanoma humano.

La expresión de los factores de transcripción ATF-1 y CREB está regulada por incremento en células metastásicas de melanoma. Sin embargo, no está claro cómo contribuye la sobreexpresión de ATF-1/CREB a la adquisición de la metástasis. CREB/ATF-1 puede desempeñar un papel esencial en la invasión regulando la expresión dependiente de CRE de MUC18 y metaloproteinasa MMP-2 de la molécula de adhesión (Jean y col., Mol. Cell Biochem., 212(1-2):19-28 (2000)) que pertenece a la familia de las MMP conocida por contribuir a cánceres y por desempeñar un papel en la invasión, angiogénesis y metástasis tumoral. Se cree que las células tumorales utilizan la capacidad de degradación de la matriz de las MMP para propagarse a sitios remotos y, una vez que las células tumorales se han metastatizado, se cree que las MMP promueven el crecimiento de estas células tumorales. No se entiende completamente el papel de MUC18 en la progresión tumoral de melanoma, pero puede incluir un papel en una o más etapas en el proceso metastásico, posiblemente mediante la afectación de la activación de MMP-2 o la migración celular.

El análisis de líneas celulares de melanoma humano mostró una correlación positiva de la expresión de MUC18 con la capacidad de las células para producir metástasis en ratones atímicos (Johnson y col., Cancer Metastasis Rev., 18:345-357 (1999)). Se informó de que la generación de variantes tumorigénicas de una línea celular de melanoma no tumorigénico va acompañada de inducción de la expresión de MUC18 (Luca y col., Melanoma Res., 3:35-41 (1993)). La expresión de MUC18 en líneas celulares de melanoma humano negativas para MUC18 aumentó su tumorigenicidad y mejoró su capacidad metastásica en modelos de tumores experimentales (Xie y col., Cancer Res., 57:2295-2303 (1997); Bani y col., Cancer Res., 56:3075-3086 (1996)). Finalmente, la inhibición de la expresión de MUC18 en metástasis usando elementos supresores genéticos de ADNc de MUC18 condujo a una disminución del fenotipo tumorigénico en ratones atímicos (Styamoorthy y col., Oncogene, 20:4676 (2001)).

Aunque no se entiende completamente la función de MUC18, varios estudios han demostrado una papel para esta proteína en la mediación de las interacciones célula-célula y célula-matriz mediante unión a un ligando no identificado (Shih y col., Cancer Res., 57: 3835-3840 (1997); Johnson y col., Int. J cancer, 73:769-774 (1997)). La expresión de moléculas de adhesión celular que median las interacciones célula a célula o célula a matriz es una propiedad celular tumoral que es esencial para la metástasis. Por consiguiente, las células de melanoma transfectadas con MUC18 mostraron un aumento en la adhesión homotípica, aumento en la unión a células endoteliales humanas y aumento en la invasión a través de filtros recubiertos con Matrigel, sugiriendo un papel en la invasión tumoral y migración transendotelial (Xie y col., Cancer Res., 57:2295-2303 (1997)). Y lo más importante, los anticuerpos anti-MUC18 pudieron inhibir estas funciones en las células transfectadas con MUC18 (Xie y col., Cancer Res., 57:2295-2303 (1997)). Por consiguiente, existe una gran necesidad de anticuerpos anti-MUC18 que puedan inhibir la función biológica de MUC18, y lo más importante la proliferación y el crecimiento celular que pueden ser esenciales para la progresión y la metástasis tumoral. Tales anticuerpos interferirían probablemente con la capacidad inherente de MUC18 para mediar las interacciones célula-célula y célula-matriz. La inhibición de tal actividad puede ser posible con un anticuerpo monoclonal que elige como diana MUC18. La capacidad para afectar la progresión de células tumorales que expresan MUC18 en la superficie celular puede demostrar que es un tratamiento para pacientes con tumores o de uso para evitar enfermedades metastásicas en pacientes con tales tumores.

Resumen de la invención

Las realizaciones de la invención se refieren a anticuerpos monoclonales que se encontraron que se unían al antígeno MUC18 y afectaban la función de MUC18. Esta solicitud describe anticuerpos anti-MUC18 humanos y preparaciones de anticuerpos anti-MUC18 con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, que incluye fuerte afinidad de unión por MUC18 in vitro.

En un aspecto, el anticuerpo anti-MUC18 humano tiene un dominio variable de la cadena pesada y ligera.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-MUC18 humano que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de: región variable de la cadena pesada 3.19.1 (SEQ ID Nº:1). Ejemplos de otras regiones variables de la cadena pesada incluyen 6.11.3 (SEQ ID Nº: 5), C3.10 (SEQ ID Nº:9), C3.22 (SEQ ID Nº: 13), C3.27 (SEQ ID Nº: 17), C3.45 (SEQ ID Nº: 21), C3.65 (SEQ ID Nº: 25), C6.1 (SEQ ID Nº: 29), C6.9 (SEQ ID Nº: 33) o C6.2 (SEQ ID Nº: 37).

En incluso otro aspecto, la presente invención también proporciona una cadena ligera de anticuerpo monoclonal anti-MUC18 humano que tiene una secuencia de aminoácidos de: región variable de la cadena ligera 3.19.1 (SEQ ID Nº: 2). Ejemplos de otras regiones variables de la cadena ligera incluyen 6.11.3 (SEQ ID Nº: 6), C3.10 (SEQ ID Nº: 10), C3.22 (SEQ ID Nº: 14), C3.27 (SEQ ID Nº: 18), C3.45 (SEQ ID Nº: 22), C3.65 (SEQ ID Nº: 26), C6.1 (SEQ ID Nº: 30), C6.9 (SEQ ID Nº: 34) o C6.2 (SEQ ID Nº: 38).

La región variable de la cadena ligera (por ejemplo SEQ ID Nº:2) se combina con la región variable de la cadena pesada anteriormente identificada (por ejemplo SEQ ID Nº:1), siempre que el anticuerpo así producido conserve la capacidad de unirse a MUC18 humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-MUC18 humano que comprende: A) al menos una cadena ligera o un fragmento de la misma y (B) al menos una cadena pesada o un fragmento de la misma.

En otro aspecto, el anticuerpo anti-MUC18 es c3.19.1. Específicamente, c3.19.1 también se denomina en lo sucesivo ABX-MA1.

Ejemplos de otros anticuerpos anti-MUC18 son c6.11.3, c3.10, c3.22, c3.27, c3.45, c3.65, c6.1, c6.12, c6.2 o c6.9.

En este documento se contemplan diversas formas del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-MUC18 puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo que tiene una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo Fab, Fab' o F(ab')_{2}). Además, el anticuerpo puede marcarse con una marca detectable, inmovilizarse sobre una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico). En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de la invención ligado a un radioisotipo. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de la invención ligado a una toxina, preferentemente la toxina ricina o una toxina compuesta por un agente quimioterapéutico. En otro aspecto, tales anticuerpos de la invención pueden usarse para el tratamiento de enfermedades tales como tumores.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-MUC18 humano que se une a y neutraliza una actividad biológica de al menos MUC18 humano o estimula la internalización y regulación por disminución de la proteína. El anticuerpo puede reducir o eliminar significativamente una actividad biológica del MUC18 humano en cuestión. La actividad biológica del MUC18 humano objeto puede ser proliferación celular. Además, la actividad biológica puede incluir angiogénesis y proliferación celular importante para crecimiento tumoral primario y la metástasis, invasión y/o migración celular, y activación de metaloproteinasa MMP-2. Aún más, la actividad biológica puede incluir el crecimiento y la metástasis de células tumorales en pacientes con tumores, por ejemplo
melanoma.

También se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento, un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislado, una célula huésped transformada con la molécula de ácido nucleico y un procedimiento para producir el anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped en condiciones en las que la molécula de ácido nucleico se exprese para producir el anticuerpo y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped. El anticuerpo puede ser de la clase de las IgG. La molécula de ácido nucleico aislado comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que codifican un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal, en el que la secuencia de nucleótidos es la región variable de la cadena pesada de c3.19.1 (SEQ ID Nº:3). Ejemplos de secuencias alternativas incluyen c6.11.3 (SEQ ID Nº: 7), C3.10 (SEQ ID Nº: 11), C3.22 (SEQ ID Nº: 15), C3.27 (SEQ ID Nº: 19), C3.45 (SEQ ID Nº: 23), C3.65 (SEQ ID Nº: 27), C6.1 (SEQ ID Nº: 31), C6.9 (SEQ ID Nº: 35) o C6.2 (SEQ ID Nº: 39). También comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal, en el que dicha secuencia de nucleótidos es la región variable de la cadena ligera de 3.19.1 (SEQ ID Nº: 4). Ejemplos de secuencias alternativas de la cadena ligera incluyen 6.11.3 (SEQ ID Nº: 8), C3.10 (SEQ ID Nº:12), C3.22 (SEQ ID Nº: 16), C3.27 (SEQ ID Nº: 20), C3.45 (SEQ ID Nº: 24), C3.65 (SEQ ID Nº: 28), C6.1 (SEQ ID Nº: 32), C6.9 (SEQ ID Nº: 36) o C6.2 (SEQ ID Nº: 40).

En un aspecto diferente, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o estado asociado con la expresión de MUC18 en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-MUC18. El paciente es un paciente mamífero, preferentemente un paciente humano. La enfermedad es un tumor, tal como melanoma.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 es un diagrama que representa el patrón de expresión de MUC18 y otros oncógenos conocidos y factores de crecimiento que participan en la progresión tumoral de melanoma;

la fig. 2 muestra análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-MUC18 y muestra una correlación positiva entre la expresión de MUC18 con la capacidad metastásica de células de melanoma humano. Se muestra la expresión de MUC18 en líneas celulares de melanoma metastásico humano (A375SM, TXM-13 y WM2664), línea celular no metastásica SB-2 y células endoteliales de ratón normal (NME).

las fig. 3A y 3B son gráficas de línea que ilustran que ni las células A375-SM (figura 3A) ni las WM-2664 (figura 3B) mostraron un desplazamiento fluorescente cuando se incubaron en presencia del Ac IgG2 de control (línea en negrita). Sin embargo, cuando se incubaron en presencia de anti-MUC18 (línea de puntos), se observó un fuerte desplazamiento en la intensidad de fluorescencia indicativo de la expresión del antígeno de la superficie celular;

la fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 1) y la ligera (SEQ ID Nº: 2) y la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 3) y la ligera (SEQ ID Nº: 4) del anticuerpo anti-MUC18, c3.19.1;

la fig. 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 5) y la ligera (SEQ ID Nº: 6) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 7) y la ligera (SEQ ID Nº: 8) del anticuerpo anti-MUC18, c6.11.3;

la fig. 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 9) y la ligera (SEQ ID Nº: 10) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 11) y la ligera (SEQ ID Nº: 12) del anticuerpo anti-MUC18, c3.10;

la fig. 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 13) y la ligera (SEQ ID Nº: 14) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 15) y la ligera (SEQ ID Nº: 16) del anticuerpo anti-MUC18, c3.22;

la fig. 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 17) y la ligera (SEQ ID Nº: 18) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 19) y la ligera (SEQ ID Nº: 20) del anticuerpo anti-MUC18, c3.27;

la fig. 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 21) y la ligera (SEQ ID Nº: 22) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 23) y la ligera (SEQ ID Nº: 24) del anticuerpo anti-MUC18, c3.45;

la fig. 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 25) y la ligera (SEQ ID Nº: 26) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 27) y la ligera (SEQ ID Nº: 28) del anticuerpo anti-MUC18, c3.65;

la fig. 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 29) y la ligera (SEQ ID Nº: 30) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 31) y la ligera (SEQ ID Nº: 32) del anticuerpo anti-MUC18, c6.1;

la fig. 12 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 33) y la ligera (SEQ ID Nº: 34) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 35) y la ligera (SEQ ID Nº: 36) del anticuerpo anti-MUC18, c6.9 (también se clona independientemente como c6.12);

la fig. 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 37) y la ligera (SEQ ID Nº: 38) y la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada (SEQ ID Nº: 39) y la ligera (SEQ ID Nº: 40) del anticuerpo anti-MUC18, c6.2;

la fig. 14 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c3.10 (SEQ ID Nº: 9), y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V4-59 (SEQ ID Nº: 41) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 42) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 15 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c3.10 (SEQ ID Nº: 10) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región 02 (SEQ ID Nº: 43) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 44) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 16 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c3.22 (SEQ ID Nº: 13) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V4-31 (SEQ ID Nº: 45) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 46) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 17 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c3.22 (SEQ ID Nº: 14) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región A30 (SEQ ID Nº: 47) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 48) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 18 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c3.27 (SEQ ID Nº: 17) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V4-59 (SEQ ID Nº: 49) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 50) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 19 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c3.27 (SEQ ID Nº: 18) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región A30 (SEQ ID Nº: 51) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 52) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 20 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c3.45 (SEQ ID Nº: 21) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V 1-18 (SEQ ID Nº: 53) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 54) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 21 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c3.45 (SEQ ID Nº: 22) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región B3 (SEQ ID Nº: 55) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 56) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 22 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c3.65 (SEQ ID Nº: 25) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región 4-31 (SEQ ID Nº: 57) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 58) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 23 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c3.65 (SEQ ID Nº: 26) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región 08 (SEQ ID Nº: 59) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 60) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 24 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c6.1 (SEQ ID Nº: 29) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V3-30 (SEQ ID Nº: 61) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 62) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 25 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c6.1 (SEQ ID Nº: 30) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región A20 (SEQ ID Nº: 63) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 64) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 26 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c6.12, y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V4-31 región (SEQ ID Nº: 65) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 66) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 27 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c6.12, y la secuencia de aminoácidos que codifica la región L2 (SEQ ID Nº: 67) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 68) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 28 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de anticuerpo anti-MUC18, c6.2 (SEQ ID Nº: 37) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V4-59 (SEQ ID Nº: 69) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 70) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 29 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c6.2 (SEQ ID Nº: 38) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región A19 (SEQ ID Nº: 71) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 72) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 30 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c6.9 (SEQ ID Nº: 33) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V4-31 (SEQ ID Nº: 73) del gen V_{H} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 74) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 31 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c6.9 (SEQ ID Nº: 34) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región L2 (SEQ ID Nº: 75) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 76) se muestra debajo del alinea-
miento;

la fig. 32 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-MUC18, c6.11.3 (SEQ ID Nº: 5) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región V4-31 (SEQ ID Nº: 77) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 78) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 33 representa un alineamiento entre la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC18, c6.11.3 (SEQ ID Nº: 6) y la secuencia de aminoácidos que codifica la región L2 (SEQ ID Nº: 79) del gen V_{k} de la línea germinal usada. La secuencia consenso (SEQ ID Nº: 80) se muestra debajo del alineamiento;

la fig. 34 representa un resumen de las secuencias que comprenden las regiones de recombinación V, D, J y la N resultante de los clones del anticuerpo de MUC18 identificados en la presente invención.

Descripción detallada de la realización preferida A. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Véase, por ejemplo Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994); Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Para los fines de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.

Como se usa en este documento, el término "MUC 18" se refiere al polipéptido de la superficie celular que es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas con similitud de secuencia con varias moléculas de adhesión celular. MUC18 también se conoce en la técnica como "MCAM", "Mel-CAM" o "CD146". Para los fines de esta invención, a partir de aquí, "MUC18" se usa para representar "MCAM", "Mel-CAM" y "CD 146".

El término "c3.19.1" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo monoclonal IgG_{2} completamente humano dirigido contra el antígeno MUC18. El anticuerpo se generó usando tecnología XenoMouse® (Abgenix, Inc. Fremont, CA) y está constituido por 2 cadenas pesadas gamma y ligeras kappa humanas con un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. C3.19.1 también se denomina en lo sucesivo en este documento ABX-MA1 y se une específicamente a MUC18 humano con alta afinidad (Kd = 6 X 10^{-10} M).

Los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo" con respecto a MUC18 se refieren a la capacidad de una molécula para afectar específicamente la progresión tumoral. Actividades biológicas preferidas incluyen la capacidad para inducir el crecimiento y la metástasis de células tumorales. El efecto de MUC18 en la metástasis de células tumorales puede incluir la capacidad para inducir la activación de MMP-2 y/o la migración celular. Otra actividad biológica preferida es la capacidad para inducir muerte animal debido a la carga tumoral.

Los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo" con respecto a anticuerpos anti-MUC18 se refieren a la capacidad de una molécula para inhibir el crecimiento y la metástasis de células tumorales frecuentemente asociados con expresión de MUC18. Además, otro mecanismo de acción o actividad para anticuerpos anti-MUC18 incluye la capacidad para estimular la internalización de MUC18 y una pérdida consiguiente de la expresión de la superficie celular Específicamente, las células tumorales incluyen células tumorales en pacientes con tumores.

"Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en la que cantidades mínimas de un trozo específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe en la patente de los EE.UU. número 4.683.195 concedida el 28 de julio de 1987. Generalmente necesita estar disponible la información de las secuencias de los extremos de la región de interés o más allá, de forma que puedan diseñarse cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en la secuencia a cadenas opuestas del molde que va a amplificarse. Los nucleótidos terminales en 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. PCR puede usarse para amplificar secuencias de ARN específico, secuencias de ADN específico de ADN genómico total y ADNc transcrito de ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase generalmente Mullis y col., Cold Spring HarborSymp. Quant. Biol. 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Pres, NY, 1989). Como se usa en este documento, PCR se considera un ejemplo, pero no el único, de un procedimiento de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar un muestra de prueba de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como un cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un trozo específico de ácido nucleico.

"Tumor", como se usa en este documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, tanto si es maligno como benigno, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que normalmente se caracteriza por crecimiento celular desordenado. Ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a, melanoma, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cancer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer del hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio o carcinoma uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, además de cáncer de cabeza y cuello.

Los "anticuerpos" (Ac) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión para un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad para antígenos. Los polipéptidos de éste último tipo se producen, por ejemplo, a bajos niveles por el sistema linfático y a altos niveles por mielomas.

"Anticuerpos e inmunoglobulinas nativas" son normalmente glicoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestos por dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene regularmente espaciados puentes disulfuro entre cadenas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothia y col. J. Mol. Biol. 186:651 (1985; Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 (1985); Chothia y col., Nature 342:877-883 (1989)).

El término "anticuerpo" se usa en este documento en el sentido más amplio y engloba específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, mientras que presenten la actividad biológica deseada.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominadas \kappa y \lambda, basadas en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases". Hay cinco clases importantes de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y además varias de éstas pueden dividirse en "subclases" (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se llaman \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Son muy conocidas las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.

El término "anticuerpo" incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también engloba fragmentos de anticuerpos. El término "anticuerpo" engloba específicamente anticuerpos monoclonales, que incluyen clones de fragmentos de anticuerpos.

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El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son sumamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminarse por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que la producción del anticuerpo requiere algún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson y col. Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo como se determina por el procedimiento de Lowry, y la secuencia de aminoácidos terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) para la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará generalmente mediante al menos una etapa de purificación.

"Anticuerpo neutralizante" significa una molécula de anticuerpo que puede eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antígeno diana al que se une. Por consiguiente, un anticuerpo anti-MUC18 "neutralizante" puede eliminar o reducir significativamente una función efectora que puede incluir la regulación dependiente de MUC18 de adhesión celular, migración o activación de MMP. El anticuerpo puede afectar la función de MUC18 estimulando la internalización y la degradación de la molécula, eliminado así eficazmente la expresión de la superficie celular del antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren mucho en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida por los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más sumamente conservadas de los dominios variables se llaman estructura (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprende cuatro regiones FR, que adoptan en gran parte una conformación de hoja \beta, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de hoja \beta. Las CDR en cada cadena se conservan juntas muy próximas por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col. (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión al antígeno. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está constituida por un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una ligera asociada de manera no covalente estrecha. En una especie Fv de cadena sencilla, un dominio variable de una cadena pesada y una ligera puede unirse covalentemente por un ligador de péptido flexible de forma que las cadenas ligeras y pesadas pueden asociarse en una estructura "dímera" análoga a la de en una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Conjuntamente, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno por el anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que sólo comprende tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una menor afinidad que todo el sitio de unión.

El término "región hipervariable" cuando se usa en este documento se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (L1), 50-62 (L2) y 89-97 (L3) en el domino variable de cadena la ligera y 31-55 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el domino variable de la cadena pesada; Kabat y col., Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el domino variable de la cadena ligera y 26-32 ((H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el domino variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol 196:901-917 (1987)). Los residuos de "región estructural" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable como se definen en este documento.

El término "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" cuando se usa en este documento se refiere a partes de receptores inmunológicos que se ponen en contacto con un ligando específico y determinan su especificidad. Las CDR de receptores inmunológicos son la parte más variable de la proteína receptora, dando a los receptores su diversidad, y se mantienen en seis bucles en el extremo distal de los dominios variables del receptor, procediendo tres bucles de cada uno de los dos dominios variables del receptor.

El término "epítopo" se usa para referirse a sitios de unión para anticuerpos (monoclonales o policlonales) en antígenos de proteínas.

El término aminoácido o residuo de aminoácido, como se usa en este documento, se refiere a aminoácidos L o a aminoácidos D que se producen naturalmente como se describe más adelante con respecto a las variantes. En este documento se usan las abreviaturas comúnmente usadas de una y tres letras para aminoácidos (Bruce Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., Nueva York (3ª edición, 1994)).

El término "estado de enfermedad" se refiere a un estado fisiológico de una célula o de todo un mamífero en el que se ha producido una interrupción, cese o trastorno de funciones, sistemas u órganos celulares o corporales.

El término "tratar" o "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es evitar o aminorar (atenuar) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o propagación de cáncer. Para los fines de esta invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, disminución del alcance de la enfermedad, estado estabilizado de la enfermedad (es decir, no empeora), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (tanto si es parcial como total), tanto si es detectable como si es indetectable. "Tratamiento" también puede significar prologar la supervivencia cuando se compara con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el estado o trastorno, además de aquellos propensos a tener el estado o trastorno o aquellos en los que va a prevenirse el estado o trastorno.

Un "trastorno" es cualquier estado que se beneficiará del tratamiento de la presente invención. Éste incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedad que incluye aquellos estados patológicos que predisponen el mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de trastornos que van a tratarse en este documento incluyen tumores benignos y malignos, leucemias y tumores malignos linfoides, en particular cáncer de próstata, renal, de ovarios, de estómago, de endometrio, de las glándulas salivares, de riñón, de colon, de tiroides, pancreático, de próstata o vejiga, y tumores malignos tales como carcinomas cervicales y neoplasia intraepitelial cervical escamosa y glandular, carcinoma de células renales (RCC), tumores de esófago y líneas celulares derivadas de carcinoma. Un trastorno preferido que va a tratarse según la presente invención es cáncer renal y de próstata. Un trastorno incluso más preferido que va a tratarse es melanoma.

"Mamífero" para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deportes o mascotas tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

"Lipofección" se refiere a un procedimiento no viral práctico para introducir información genética dentro de tejidos diana. Los procedimientos no virales incluyen procedimientos químicos o físicos. La lipofección usa un complejo electrostáticamente unido de lípidos positivamente cargados y ADN negativamente cargado como un vector que se fusiona con la membrana celular y administra ADN dentro del citoplasma. La lipofección se diferencia de los procedimientos virales en que la eficiencia de la transferencia de información genética por lipofección es menor que por vectores virales y que la expresión del gen es pasajera. Alternativamente, el complejo de lípido y ADN es más estable y fácil de manejar cuando se compara con vectores virales.

B. Procedimientos para llevar a cabo una realización de la invención 1. Generación de anticuerpos anti-MUC18

Sigue una descripción de técnicas a modo de ejemplo para la producción de los anticuerpos usados según la presente invención.

(a) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (patente de los EE.UU. número 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o macaco, se inmuniza como se describe anteriormente en este documento para obtener linfocitos que produzcan o puedan producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente para la inmunización pueden usarse células que expresan el antígeno de interés. Además, los linfocitos pueden inmunizarse alternativamente in vitro. Los animales se inmunizan contra los conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg o 1 \mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freud e inyectando la disolución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/0 de la cantidad original de conjugado en adyuvante completo de Freud mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días después, los animales se sangran y el suero se ensaya para el título de anticuerpos anti-MUC18. Los anticuerpos se refuerzan hasta la meseta del título. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno MUC18, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reticulante diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. Por tanto, para mejorar la respuesta inmune se usan agentes de agregación tales como alúmina.

Entonces, los linfocitos, o más preferentemente los linfocitos enriquecidos para células B aisladas de tales animales inmunizados, se fusionan con células de mieloma mediante un procedimiento de fusión electrocelular o usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar un célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-109, [Academic Press, 1996]).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan la producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células que producen el anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOP-21 y MC-11 disponibles del Centro de distribución de células del Instituto Salk, San Diego, California, EE.UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección americana de cultivos tipo, Rockville, Mariland, EE.UU. Para la producción de anticuerpos monoclonales humanos también se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano (Kozbor, J. Inmunol. 133: 3001 (1984); Brodeur y col., Mono-
clonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, [1987]).

El medio de cultivo en el que las células de hibridoma están creciendo se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem. 107: 220 (1980).

Después de que se ha identificado que las células de hibridoma producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, las células pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante procedimientos habituales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103, Academic Press, 1996). Medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio DMEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, cromatografía en proteína A-Sepharose, en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo uniéndolo covalentemente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia que codifica un polipéptido de no inmunoglobulina. De este modo se preparan los anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen en ellos la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-MUC18.

Normalmente, tales polipéptidos de no inmunoglobulina sustituyen los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o sustituyen los dominios variables de un sitio de combinación al antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación al antígeno que tiene especificidad para un MUC18 y otro sitio de combinación al antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden prepararse in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos en los que participan reticulantes. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

(b) Anticuerpos humanos

Los intentos por usar la misma tecnología para generar AcM humanos se han visto dificultados por la falta de una línea celular de mieloma humano adecuada. Los mejores resultados se obtuvieron usando heteromielomas (mielomas híbridos ratón x humano) como componentes de fusión (Kozbor, J. Inmunol. 133: 3001 (1984); Brodeur, y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987). Alternativamente, las células secretoras de anticuerpos humanos pueden inmortalizarse mediante infección con el virus Epstein-Barr (EBV). Sin embargo, las células infectadas con EBV son difíciles de clonar y normalmente sólo producen rendimientos relativamente bajos de inmunoglobulina (James y Bell, J. Inmunol. Methods 100: 5-40 [1987]). En el futuro, la inmortalización de células B humanas podrá lograrse posiblemente mediante la introducción de una combinación definida de genes transformantes. Una posibilidad tal se pone de relieve por una reciente demostración de que la expresión de la subunidad catalítica de la telomerasa junto con la oncoproteína T grande de SV40 y un alelo oncogénico de H-ras dio como resultado la conversión tumorigénica de células epiteliales y de fibroblastos humanos normales (Hahn y col., Nature 400: 464-468 [1999]).

Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que pueden, con la inmunización, producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena (Jakobovits y col., Nature 362: 255-258 [1993]; Lonberg y Huszar, Int. Rev. Inmunol. 13: 65-93 [1995]; Fishwild y col., Nat. Biotechnol. 14: 845-851 [1996]; Mendez y col., Nat. Genet. 15: 146-156 [1997]; Green, J. Inmunol. Methods 231: 11-23 [1999]; Tomizuka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727 [2000]; revisado en Little y col., Inmunol. Today 21: 364-370 [2000]). Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gel de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos (Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555 [1993]). La transferencia de la matriz del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos con exposición al antígeno (Jakobovits y col., Nature 362: 255-258 [1993]).

Mendez y col. (Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) han generado una línea de ratones transgénicos designados "XenoMouse® II" que, cuando se exponen a un antígeno, genera anticuerpos completamente humanos de alta afinidad. Esto se logró mediante la integración de la línea germinal de loci de la cadena pesada y la cadena ligera humana de megabases en ratones con deleción dentro del segmento J_{H} endógeno como se describe anteriormente. El XenoMouse® II alberga 1,020 kb de locus de la cadena pesada humana que contiene aproximadamente 66 genes V_{H}, D_{H} completo y regiones J_{H} y tres regiones constantes diferentes (\mu, \delta y \gamma), y también alberga 800 kb de locus \kappa humano que contienen 32 genes V_{\kappa}, segmentos J_{\kappa} y genes C_{\kappa}. Los anticuerpos producidos en estos ratones se parecen mucho a los vistos en los seres humanos en todos los sentidos, incluyendo reorganización, reunión y repertorio de genes. Los anticuerpos humanos se expresan preferencialmente en anticuerpos endógenos debido a la deleción en el segmento J_{H} endógeno que evita la reorganización génica en el locus murino.

Las técnicas para generar anticuerpos usando tecnología XenoMouse® de Abgenix incluyen la inyección de un antígeno particular de interés en tales ratones. Los sueros de tales animales inmunizados pueden examinarse para la reactividad del anticuerpo contra el antígeno inicial. Los linfocitos pueden aislarse de nodos linfáticos o células del bazo y además pueden seleccionarse de células B seleccionando células negativas para CD138 y CD19+. Los cultivos de células B (BCC) pueden o fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas como se detalla anteriormente o además examinarse para la reactividad contra el antígeno inicial. Tales exámenes incluyen ELISA.

La transfección se refiere a la captación de un vector de expresión por una célula huésped tanto si en realidad las secuencias codificantes se expresan como si no. El experto habitual conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, precipitación de CaPO_{4} y electroporación. La transfección satisfactoria se reconoce generalmente cuando dentro de la célula huésped se produce cualquier indicación del funcionamiento de este vector.

En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención comprenden una cadena pesada de anticuerpo monoclonal anti-MUC18 humano o un fragmento de la misma, que comprende las siguientes CDR (como se definen por Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del INS 91-3242, Bethesda MD (1991), volúmenes 1-3): (a) CDR1, (b) CDR2 y (c) CDR3.

La cadena pesada de los anticuerpos en una realización de la presente invención comprende SEQ ID Nº: 1. Ejemplos de otras secuencias de la cadena pesada incluyen SEQ ID Nº: 5; SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 17, SEQ ID Nº: 21, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 29, SEQ ID Nº: 33, o SEQ ID Nº: 37.

En todavía otra realización, la invención proporciona una cadena ligera de anticuerpo monoclonal anti-MUC18 humano o un fragmento de la misma, que comprende las siguientes CDR: (a) CDR1, (b) CDR2 y (c) CDR3. La cadena ligera de los anticuerpos en una realización de la presente invención comprende SEQ ID Nº: 2. Ejemplos de otras secuencias incluyen SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 10; SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 18; SEQ ID Nº: 22; SEQ ID Nº: 26; SEQ ID Nº: 30; SEQ ID Nº: 34; o SEQ ID Nº: 38.

En un aspecto, la presente invención incluye anticuerpos anti-MUC18 tales como c3.19.L

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Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena pesada de c3.19.1 están codificadas por SEQ ID Nº: 1 y 3, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena pesada de c6.11.3 están codificadas por 5 y 7, respectivamente. Un ejemplo de otro anticuerpo anti-MUC18 es c6.11.3; las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena ligera de c3.19.1. están codificadas por SEQ ID Nº: 2 y 4, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena ligera de c6.11.3 están codificadas por 6 y 8, respectivamente.

2. Examen de anticuerpos con las propiedades deseadas

Anteriormente se han descrito las técnicas para generar anticuerpos. Además, una puede seleccionar anticuerpos con ciertas características biológicas, como se desee.

Unión al antígeno MUC18

Por ejemplo, para identificar anticuerpos anti-MUC18 con alta afinidad por MUC18 humano, las mediciones cinéticas y la afinidad de unión de los anticuerpos anti-MUC18 se obtuvieron de experimentos Biacore. Los experimentos Biacore midieron la afinidad de los anticuerpos de MUC18 capturados en una superficie de la proteína A para antígeno MUC18 marcado y además se describen en los ejemplos de más adelante. Los anticuerpos anti-MUC18 con una Kd de 6 x 10^{-10} M se consideraron anticuerpos anti-MUC18 de alta afinidad.

En otro ejemplo, para determinar si los anticuerpos anti-MUC18 de la presente invención pudieron reconocer MUC18 desnaturalizado en células de melanoma humano, los anticuerpos se usaron para inmunotransferencias de células metastásicas de melanoma y células no metastásicas de melanoma (control). Los anticuerpos que pudieron detectar MUC18 en células de melanoma metastásico se seleccionaron como anticuerpos anti-MUC 18 de interés.

Además, para identificar anticuerpos anti-MUC18 que reconocen la forma nativa de la proteína de MUC18 en la superficie de células se realizó análisis de citometría de flujo. Según este ensayo, las células que expresan el antígeno de interés se separaron de las placas de cultivo celular, se incubaron con o bien un anticuerpo humano de control compatible con isotipo o el anticuerpo anti-MUC18 durante 20 minutos a 4ºC. Después del lavado, todas las muestras se incubaron con fragmentos F(ab')_{2} conjugados con ficoeritrina de IgG anti-humana de cabra (H+L) (Jackson) durante 20 minutos a 4ºC en la oscuridad. Después de varios lavados, las células se volvieron a suspender en tampón FACS y se analizaron mediante citofluorometría. Los anticuerpos que desplazaron la intensidad de fluorescencia en comparación con los anticuerpos de control se seleccionaron como anticuerpos anti-MUC18 de interés.

3. Composiciones terapéuticas y modo de administración de anticuerpos anti-MUC18

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-MUC18 de la invención se preparan para almacenarse mediante el mezclado de anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co. (Easton, PA: 1995)) en forma de torta liofilizada o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes sacáricos tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

El anticuerpo anti-MUC18 que va a usarse para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o tras la liofilización y reconstitución. El anticuerpo anti-MUC18 se almacenará generalmente en forma liofilizada o en disolución.

Las composiciones terapéuticas de anticuerpo anti-MUC18 se colocan generalmente dentro de un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o vial de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración del anticuerpo anti-MUC18 está de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión mediante vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, subcutánea, intramuscular, intraocular, intraarterial, intracerebrospinal o intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida como se observa más adelante. Preferentemente el anticuerpo se administra de manera sistémica.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (documentos U.S.3.773.919, EP58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato gamma (Sidman y col., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etilen-vinilo (Langer y col., arriba) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP133.988). Las composiciones de anticuerpo anti-MUC18 de liberación sostenida también pueden incluir anticuerpo liposomalmente atrapado. Los liposomas que contienen anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en sí: documento DE3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); documentos EP52.322; EP36.676; EP88.046; EP143.949; EP142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; documentos U.S.4.485.045 y 4.544.545; y EP102.324. Generalmente, los liposomas son del tipo de una sola lamina pequeña (aproximadamente 200-800 Angstroms), en la que el contenido de lípido es mayor de aproximadamente el 30% en mol de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para el tratamiento óptimo con anticuerpos.

El anticuerpo anti-MUC18 también puede administrarse mediante inhalación. Para la administración son útiles nebulizadores comercialmente disponibles para formulaciones líquidas, que incluyen nebulizadores a chorro y nebulizadores ultrasónicos. Las formulaciones líquidas pueden nebulizarse directamente y el polvo liofilizado puede nebulizarse después de la reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo anti-MUC18 puede convertirse en aerosol usando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis dosificada, o inhalarse como un polvo liofilizado y molido.

Una "cantidad eficaz" de anticuerpo anti-MUC18 que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, el tipo de anticuerpo anti-MUC18 empleado y el estado del paciente. Por consiguiente, el terapeuta necesitará titular la dosificación y modificar la vía de administración como se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Normalmente, el médico administrará el anticuerpo anti-MUC18 hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de este tratamiento se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.

Los anticuerpos específicos para antígenos tumorales tales como anti-MUC18 son útiles para elegir como dianas células tumorales para la destrucción. Por ejemplo, la ricina, una toxina celular derivada de plantas, está encontrando aplicaciones únicas, especialmente en la lucha contra tumores y cáncer. Se están descubriendo repercusiones, como el uso de ricina en el tratamiento de tumores. Se ha sugerido que la ricina tiene una mayor afinidad por células cancerosas que por células normales (Montfort y col. 1987) y frecuentemente se ha calificado de una "bala mágica" para elegir como diana tumores malignos. Las toxinas tales como ricina permanecen activas aunque se elimine la cadena B de la toxina. Por consiguiente, si la cadena A solitaria se acopla a un anticuerpo específico para tumor, tal como anticuerpo anti-MUC18, la toxina tiene una afinidad específica por células cancerosas respecto a las células normales (Taylorson 1996). Por ejemplo, se ha desarrollado la inmunotoxina de ricina para elegir como diana el antígeno CD5 de las células T frecuentemente encontrado en tumores malignos de células T y células B (Kreitman y col. 1998). Además, la unión de tales anticuerpos anti-MUC18 a radioisótopos proporciona ventajas a los tratamientos tumorales. A diferencia de la quimioterapia y otras formas de tratamiento del cáncer, la radioinmunoterapia o la administración de una combinación de radioisótopo-anticuerpos elige directamente como diana las células cancerígenas con lesión mínima al tejido sano normal de alrededor. Con esta "bala mágica", el paciente puede tratarse con cantidades mucho más pequeñas de radioisótopos que otras formas de tratamiento actualmente disponibles. Los anticuerpos más comunes están conjugados con potentes agentes quimioterapéuticos tales como maitansina, geldanamicina o caliqueamicina para la administración a tumores (Frankel y col., Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, 15:459-476 (2000); Knoll y col., Cancer Res., 60:6089-6094 (2000); Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8618-8623 (1996); Mandler y col., J. Natl. Cancer Inst., 92:1573-1581 (2000); y Ota y col., Int. J. Clin. Oncol., 4:236-240 (1999). Estos fármacos son demasiado tóxicos para ser administrados solos. Cuando se conjugan a un anticuerpo terapéutico tal como MUC18, su actividad biológica puede dirigirse específicamente a las células tumorales. Por consiguiente, los anticuerpos, tales como anticuerpos de MUC18, pueden modificarse para actuar como inmunotoxinas utilizando técnicas que son muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Vitetta y col., Inmunol. Today, 14:252 (1993) y la patente de los EE.UU. número 5.194.594. En relación con la preparación de anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos modificados pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas que son muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Junghans y col., Cancer Chemotherapy and Biotherapy, páginas 655-686 (segunda edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) y las patentes de los EE.UU. números 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827, 5.102.990, 5.648.471 y 5.697.901. Las inmunotoxinas y las moléculas radiomarcadas serían similares a destruir células que expresan MUC18, y particularmente aquellas células en las que son eficaces los anticuerpos de la invención.

Los pacientes que van a tratarse con el anticuerpo anti-MUC18 de la invención incluyen pacientes con tumores, preferentemente melanoma y/o cáncer de próstata o renal. Otros tumores incluyen tumores de esófago, pancreáticos, colorrectales, carcinomas tales como carcinoma de células renales (RCC), carcinomas cervicales y neoplasia intraepitelial cervical escamosa y glandular, y cánceres tales como cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón y otros tumores malignos. Los pacientes son candidatos para el tratamiento de acuerdo con esta invención hasta el momento en que no quede tejido sano que deba protegerse de la progresión tumoral. Se desea administrar un anticuerpo anti-MUC18 tan pronto como sea posible en el desarrollo del tumor, y continuar el tratamiento durante el tiempo que sea necesario.

En el tratamiento y la prevención del trastorno asociado a tumor por un anticuerpo anti-MUC18, la composición del anticuerpo se formulará, dosificará y administrará de un modo consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que va a tratarse, el mamífero particular que va a tratarse, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el procedimiento de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos por profesionales médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo que va a administrarse estará determinada por tales consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar el trastorno, que incluye el tratamiento de estados autoinmunes crónicos y el mantenimiento inmunodepresor en receptores de trasplantes. Tal cantidad está preferentemente por debajo de la cantidad que es tóxica para el huésped o convierte al huésped significativamente más susceptible a infecciones.

Como propuesta general, la cantidad farmacéuticamente eficaz inicial del anticuerpo administrado por vía parenteral estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg de peso corporal del paciente por día, siendo el intervalo inicial típico de anticuerpo usado de 0,3 a 20 mg/kg/día, más preferentemente de 0,3 a 15 mg/kg/día. La dosificación deseada puede administrarse mediante una única administración en bolo, mediante múltiples administraciones en bolo o mediante administración en infusión continua de anticuerpo, dependiendo del modelo de descomposición farmacocinética que desee lograr el médico.

Sin embargo, como se observa anteriormente, estas cantidades de anticuerpo sugeridas están sometidas a un gran trámite de criterio terapéutico. El factor clave en la selección de una dosis y calendario apropiado es el resultado obtenido, como se indica anteriormente. Por ejemplo, el anticuerpo puede formularse opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar tumores tales como quimioterapia de dosis estándar o alta y trasplante de células madre hematopoyéticas. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo anti-MUC18 presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores tratados anteriormente. Éstas se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se usan anteriormente en este documento o aproximadamente del 1 al 99% de las dosificaciones empleadas hasta este momento.

Pueden encontrarse más detalles de la invención en el siguiente ejemplo, que además define el alcance de la invención, toda la bibliografía citada en la memoria descriptiva y la bibliografía citada en este respecto.

Ejemplo 1 Preparación de antígenos MUC18

En el presente estudio se prepararon proteínas de MUC18 recombinante. El dominio extracelular (ECD) (número de aa 1-559) de MUC18 humano se clonó de células SK-MEL-28 (ATCC HTB-72) mediante PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) con cebadores que incorporan un sitio EcoRI en el cebador directo y un sitio NheI en el cebador inverso basado en la secuencia NCBI publicada (nº de registro NM006500).

Los cebadores usados para la amplificación del ECD de MUC18 fueron del siguiente modo:

Cebador directo:	5'-ATATTACGAATTCACTTGCGTCTCGCCCTCCGG-3'	(SEQ ID Nº: 10)
Cebador inverso:	5'-CAGCTTAGAGCTAGCCGGCTCTCCGGCTCCGGCA-3'	(SEQ ID Nº: 11)

Se amplificó el ADNc de MUC18 (kit de PCR Gene Amp XL, Perkin Elmer) a partir de ARN (RNAzol, prueba de Tel, INC) preparado a partir de células SK-MEL-28 (ATCC HTB-72). Para la construcción de una proteína de fusión de V5-HIS o HulgG2, el producto de PCR de 1700 bp que codifica los aminoácidos 1-559 se digirió con EcoRI y NheI y se ligó al vector CD147HulgG2DHFR (ABGX) digerido con EcoRI y NheI o al vector pADNc3.1V5HISB (Invitrogen) digerido con EcoRI y XbaI. Los plásmidos resultantes se transfectaron en 293 células mediante el procedimiento de CaPO_{4}, y entonces, la proteína de fusión se purificó a partir de medios condicionados recogidos mediante cromatografía ProteinA (MUC18-HulgG2) o cromatografía Ni-NTA (MUC18-V5HIS).

Los ECD de MUC18 contenían 4 diferencias de aminoácidos de los publicados en la secuencia NCBI: número 383 D>G, número 390 P>L, número 424 K>N y número 425 L>V.

Ejemplo 2 Anticuerpos anti-MUC18 A. Generación de anticuerpos Inmunización y selección de animales para recogida por ELISA

Los anticuerpos monoclonales contra MUC18 se desarrollaron inmunizando secuencialmente ratones XenoMouse inmunizantes (XenoMouse G2, Abgenix, Inc. Fremont, CA). La inmunización inicial fue con 5 x 10^{6} células de SK-MEL-28 mezcladas 1:1 v/v con adyuvante completo de Freund (CFA). Los refuerzos posteriores se hicieron primero con 5 x 10^{6} células de SK-MEL-28 mezcladas 1:1 v/v con adyuvante incompleto de Freund (IFA), seguido por cuatro inyecciones con 5 \mug de proteína de fusión Fc IgG2 humana de MUC18 soluble mezclada 1:1 v/v con IFA, y luego un refuerzo final de 10 \mug de proteína de fusión Fc IgG2 humana de MUC18 soluble sin adyuvante. En particular, cada ratón se inmunizó o en la base de la cola mediante inyección intraperitoneal o mediante inyección en la almohadilla de la pata trasera con antígeno recombinante MUC18 seguido por la generación de una gran cantidad de AcM candidatos, y el examen de los anticuerpos para determinar la unión y actividad.

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Los ratones se inyectaron inicialmente con antígeno MUC18 a una concentración de 10º ug/ratón. Además, cada ratón se inmunizó en cada almohadilla de la pata trasera 6 veces adicionales (a intervalos de 3-4 días) con antígeno soluble, específicamente 5 \mug de proteína de fusión Fc IgG2 humana de MUC18 soluble en DPBS mezclado 1:1 v/v con IFA, luego un refuerzo final de 10 \mug de proteína de fusión Fc IgG2 humana de MUC18 soluble en DPBS sin adyuvante. Los animales se inmunizaron en los días 0, 4, 7, 10, 14, 17 y 20 y cuatro días después, en el día 4, se realizaron las fusiones. Para las fusiones, los ratones se sacrificaron y se recuperaron los nodos linfáticos inguinales y popliteales.

Los linfocitos de los ratones XenoMouse inmunizados se liberaron mediante rotura mecánica de los nodos linfáticos usando un molinillo de tejidos y luego se redujeron de células T mediante selección negativa de CD90. La fusión se realizó mezclando células B enriquecidas lavadas y células P2X63Ag8.653 de mieloma no secretor compradas de ATCC (número de catálogo CRL 1580) (Kearney y col., J. Inmunol., 123:1548-1550 (1979)) a una relación de 1:1. La mezcla de células se sometió cuidadosamente a centrifugación a 800 g. Después de completarse la eliminación del sobrenadante, las células se trataron con 2-4 ml de disolución Pronasc (CalBiochem, número de catálogo 53702; 0,5 mg/ml en PBS) durante no más de 2 minutos. Luego se añadieron 3-5 ml de FBS para detener la actividad enzimática, y la suspensión se ajustó a un volumen total de 40 ml usando disolución de fusión electrocelular, ECFS (sacarosa 0,3 M, Sigma, número de catálogo S7903; acetato de magnesio 0,1 mM, Sigma, número de catálogo M2545; acetato de calcio 0,1 mM, Sigma, número de catálogo C4705). El sobrenadante se eliminó después de la centrifugación y las células se volvieron a suspender en 40 ml de ECFS. Se repitió esta etapa de lavado y las células se volvieron a suspender en ECFS hasta una concentración de 2x10^{6} células/ml. La fusión electrocelular se realizó usando un generador de fusión, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA.

Después de la fusión, las células se volvieron a suspender en DMEM (JRH Biosciences), 15% de SBF (Hyclone), que contenía HAT, y se complementaron con L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) y IL-6 (Boehringer Mannheim) para cultivar a 37ºC y 10% de CO_{2} en el aire. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos de fondo plano a 4x10^{4} células por pocillo. Los cultivos se mantuvieron en medio complementado con HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) durante 2 semanas antes de transferirse a medio complementado con HT (hipoxantina y timidina). Los hibridomas se seleccionaron para supervivencia en medio HAT y los sobrenadantes de esos pocillos que contenían hibridomas se examinaron para determinar la reactividad de antígeno mediante ELISA. El formato de ELISA se supuso incubando sobrenadantes sobre placas recubiertas con antígeno y detectando la unión de anti-MUC18 humano usando IgG2 anti-humana de ratón marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP).

La clonación se realizó en pocillos positivos para antígenos seleccionados usando sembrado en placa de dilución limitada. Las placas se inspeccionaron visualmente para determinar la presencia de crecimiento de colonias únicas y los sobrenadantes de pocillos de colonias únicas se examinaron luego mediante ELISA específico para antígeno como se describe anteriormente. Los clones sumamente reactivos se ensayaron para verificar la pureza de la cadena gamma y kappa humana mediante ELISA múltiplex usando un instrumento de Luminex.

Basado en los resultados de los ensayos, los siguientes clones se identificaron como anticuerpos anti-MUC18: c3.19.1, c6.11.3, c3.10, c3.22, c3.27, c3.45, c3.65, c6.1, c6.9, c6.2 y c6.12. c6.9 y c6.12 fueron clones identificados individualmente de manera idéntica. Los anticuerpos de la presente invención se analizaron para determinar la similitud de secuencia a los genes V_{H} y V_{K} de línea germinal. Tal análisis se resume en la tabla 1 y la figura 34. Además, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos MUC18 de la presente invención se alinearon con secuencias V_{H} y V_{K} de línea germinal, respectivamente. Estos alineamientos se muestran en las figuras 14-15 (c3.10), figuras 16-17 (C3.22), figuras 18-19 (C3.27), figuras 20-21 (c3.45), figuras 22-23 (c3.65), figuras 24-25 (c6.1), figuras 26-27 (c6.12), figuras 28-29 (c6.2), figuras 30-31 (c6.9) y figuras 32-33 (c6.11). c3.19.1 se seleccionó para caracterización adicional.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Comparación de las regiones CDR en clones del anticuerpo de MUC18 con regiones CDR en genes V_{H} y V_{K} de la línea germinal

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B. Caracterización de anticuerpos de MUC18 1. Unión de anticuerpos anti-MUC18 a antígeno MUC18 (a) Análisis de inmunotransferencia de unión del anticuerpo anti-MUC18 a MUC18

Para determinar si el anticuerpo anti-MUC18 reconoció MUC18 expresada en líneas celulares de melanoma, las líneas celulares de melanoma A375SM, SB2, TXM-13, WM-2664 y células endoteliales de ratón atímico (NME) se sembraron (1 x 10^{6}) en placas de cultivo de tejidos de 100 mm (Falcon) en 10 ml de medio de crecimiento completo. Después de incubación durante la noche, las placas se lavaron dos veces en PBS, y se rasparon en 400 \mul de tampón de lisis Triton que contenía una mezcla de inhibidores de la proteasa más DTT. Tras la centrifugación, la concentración de proteína se determinó usando un kit de BioRad. Se cargaron 40 \mug de proteína sobre una SDS-PAGE al 10% y se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros (Millipore). La membrana se incubó en tampón que contenía anticuerpo anti-MUC18 durante la noche, reaccionó con un anticuerpo secundario conjugado (IgG anti-humana) durante una hora y las proteínas se detectaron posteriormente mediante el procedimiento de ECL (Amersham Corp) según el protocolo de fabricación.

Los anticuerpos anti-MUC18 detectaron altos niveles de MUC18 en las células A375SM, TXM-13 y WM-2664 metastásicas y no se detectó señal de MUC18 en la línea celular no metastásica SB-2 y las células endoteliales de ratón normal (NME2) (figura 2). La razón para la falta de una señal en NME2 en este experimento fue debido lo más probablemente al fallo del anticuerpo anti-MUC18 a reaccionar de manera cruzada con proteína MUC18 de ratón.

Además, estos resultados corroboran los hallazgos de otros con respecto a una correlación positiva entre la expresión de MUC18 y la capacidad metastásica de células de melanoma (Shih y col., Clinical Cancer Res., 2:569-575 (1996); Johnson y col., Cancer Metastasis Rev., 18:345-357 (1999); Xie y col., Oncogene, 15(17):2069-75 (1997); Xie y col., Cancer Res., 57(11):2295-303 (1997); Schlagbauer-Wadl y col., Int J Cancer, 81(6):951-5 (1999)).

(b) Análisis de citometría de flujo de unión de anticuerpo anti-MUC18 a MUC18

Se realizó un análisis de citometría de flujo para determinar si el anticuerpo anti-MUC18 reconoció la forma nativa de la proteína MUC18 en la superficie de las células.

Se separaron células A375-SM y WM-2664 (4 X 10^{5}) con PBS-EDTA y se incubaron en tampón FACS (PBS, 2% de FBS y 0,02% de azida sódica) con o un anticuerpo IgG2 humana de control apareado con isotipo o anticuerpo anti-MUC18 durante 20 minutos a 4ºC. Después de lavar con tampón FACS, todas muestras se incubaron con fragmentos F(ab')_{2} conjugados con ficoeritrina de IgG anti-humana de cabra (H+L) (Jackson) durante 20 minutos a 4ºC en la oscuridad. Después de varios lavados, las células se volvieron a suspender en tampón FACS y se analizaron mediante citofluorometría.

Como se muestra en la figura 3, ni las células A375-SM ni las WM-2664 mostraron un desplazamiento fluorescente cuando se incubaron en presencia del Ac IgG2 de control (línea en negrita). Sin embargo, cuando se incubaron en presencia de anti-MUC18 (línea de puntos), se observó un fuerte desplazamiento en la intensidad de fluorescencia indicativa de la expresión de la superficie celular del antígeno. Estos resultados muestran que el anticuerpo anti-MUC18 puede reconocer el antígeno MUC18 nativo expresado en la superficie de células de melanoma humano.

(c) Cinética y afinidad de unión de MUC18 a anticuerpo anti-MUC18

Se usó un instrumento Biacore 3000 para todas las mediciones cinéticas con tampón HBS-P (solución salina tamponada con Hepes, 0,005% de polisorbato 20). Las mediciones se hicieron utilizando tres chips sensores B1 (matriz de carboximetildextrano con una baja cantidad de carboxilación). Los experimentos se realizaron inmovilizando covalentemente la proteína A mediante acoplamiento con amina estándar a un nivel de 1500-3000 UR (unidades de resonancia) en la superficie de las cuatro células de flujo de un AcM de chip B1. 3.19.1 se capturó haciendo circular una disolución de 1 \mug/ml de 3.19.1 a una velocidad de flujo de 60 \muL/min durante 20-30 s a través de la superficie de la proteína A, dando un nivel capturado de 110-250 UR. La superficie de la proteína A control no tuvo ningún AcM capturado sobre ella. Se hicieron circular diversas concentraciones de antígeno MUC18-V5-His, que oscilan 0,5 nM-100 nM, a través de la superficie por triplicado durante 2,5 minutos a 100 \mul/min, y la fase de disociación siguió durante 10 min. Los datos se procesaron mediante "Scrubber", versión 1.10, y los sensorgramas procesados se ajustaron no linealmente por "Clamp", versión 3.40, empleando un modelo cinético bimolecular 1:1 (tabla 2).

TABLA 2 Cinética y afinidad de unión del anticuerpo anti-MUC18 (c3.19.1) por el antígeno MUC18

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No se entiende completamente el papel de MUC18 en la progresión tumoral de melanoma y el mecanismo de acción del anticuerpo anti-MUC18 (c3.19.1) en esta diana. La evidencia acumulada indica que MUC18 desempeña un papel en una o más etapas en el proceso metastásico afectando posiblemente la activación o migración celular de MMP-2. Si se consideran juntos estos datos proporcionan evidencia de que el anticuerpo anti-MUC18 es un anticuerpo terapéutico prometedor para inhibir el crecimiento y la metástasis de células de melanoma humano en pacientes con esta enfermedad.

Ejemplo 3 Conjugados de anticuerpos

Los anticuerpos específicos para antígenos tales como anti-MUC18 son útiles en elegir como dianas células tumorales que expresan tales antígenos para la eliminación.

A. Unión del anticuerpo anti-MUC18 a ricina

La ricina, una toxina celular, está encontrando aplicaciones únicas, especialmente en la lucha contra tumores y cáncer. Se están descubriendo repercusiones, como el uso de ricina en el tratamiento de tumores. Se ha sugerido que la ricina tiene una mayor afinidad por células cancerosas que por células normales (Montfort y col. 1987) y frecuentemente se ha calificado de una "bala mágica" para elegir como diana tumores malignos. Las toxinas tales como ricina permanecen activas aunque se elimine la cadena B de la toxina, que es responsable de por qué la actividad de lecitina no específica por toxina conduce a efectos secundarios tóxicos. Por consiguiente, si la cadena A solitaria se acopla a un anticuerpo específico para tumor, la toxina tiene una afinidad específica por células cancerosas respecto a las células normales (Taylorson 1996). Por ejemplo, se ha desarrollado la inmunotoxina de ricina para elegir como diana el antígeno CD5 de las células T frecuentemente encontrado en tumores malignos de células T y células B (Kreitman y col. 1998).

Un procedimiento novedoso para acoplar ricina intacta completa a anticuerpo monoclonal se describe en Pietersz y col. (Cancer Res 48(16):4469-76 (1998)) e incluye el bloqueo de la unión no específica de la cadena B de ricina. El acoplamiento de la ricina a los anticuerpos anti-MUC18 de la presente invención puede realizarse usando los reactivos bifuncionales anhídrido S-acetilmercaptosuccínico para el anticuerpo y 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo para ricina. El acoplamiento debe dar como resultado la pérdida de la actividad de unión de la cadena B, a la vez que no afecta ni el potencial tóxico de la cadena A ni la actividad del anticuerpo. Los conjugados ricina-anticuerpos completos producidos de este modo no deberían unirse no específicamente a células diana, siendo la consecuencia más importante que tales inmunotoxinas deben ser más potentes que los conjugados de la cadena A de ricina y deben poder usarse in vivo.

B. Unión a radioisótopo

La unión de tales anticuerpos anti-MUC18 a radioisótopos proporciona ventajas a los tratamientos tumorales. A diferencia de la quimioterapia y otras formas de tratamiento del cáncer, la radioinmunoterapia o la administración de una combinación de radioisótopo-anticuerpos elige directamente como diana las células cancerígenas con lesión mínima al tejido sano normal de alrededor. Con esta "bala mágica", el paciente puede tratarse con cantidades mucho más pequeñas de radioisótopos que otras formas de tratamiento actualmente disponibles. Radioisótopos preferidos incluyen itrio^{90} (90Y), indio^{111} (111In), ^{131}I, ^{99}mTc, radioplata-111, radioplata-199 y bismuto^{213}.

La unión de radioisótopos a anticuerpos puede realizarse con quelatos bifuncionales convencionales. Debido a que la plata es monovalente, para el enlace de radioplata-111 y radioplata-199 pueden usarse ligadores basados en azufre (Hazra y col., Cell Biophys, 24-25:1-7 (1994)). La unión de radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. En otro aspecto, tiuxetan es un quelante ligador de MX-DTPA unido a ibritumomab para formar ibritumomab tiuxetan (Zevalin) (Witzig, T.E, Cancer Chemother Pharmacol, 48, suplemento 1: páginas 91-5 (2001). Ibritumomab tiuxetan puede reaccionar con radioisotipos tales como indio^{111} (111In) o 90Y para formar 111In-ibritumomab tiuxetan y 90Y-ibritumomab tiuxetan, respectivamente.

C. Unión de anticuerpo anti-MUC18 a agentes quimioterapéuticos tóxicos

Los anticuerpos más comunes para tratar cáncer se conjugan con fármacos quimioterapéuticos tóxicos tales como maitansina, geldanamicina o caliqueamicina. Con esta tecnología se emplearon diferentes ligadores que liberan los fármacos en condiciones ácidas o reductoras o con exposición a proteasas específicas.

Ejemplo 4 Usos de anticuerpos anti-MUC18 y conjugado de anticuerpo A. Tratamiento de seres humanos con anticuerpos anti-MUC18

Para determinar los efectos in vivo del tratamiento de anticuerpos anti-MUC18 en pacientes humanos con tumores, tales pacientes humanos se inyectan durante una cierta cantidad de tiempo con una cantidad eficaz de anticuerpo anti-MUC18. A tiempos periódicos durante el tratamiento, los pacientes humanos se monitorizan para determinar si sus tumores progresan, en particular, si los tumores crecen y se metastatizan.

Un paciente con tumor tratado con anticuerpos anti-MUC18 tiene un menor nivel de crecimiento y metástasis tumoral en comparación con el nivel de crecimiento y metástasis tumoral de tumores en pacientes con tumores tratados con anticuerpos de control. Los anticuerpos de control que pueden usarse incluyen anticuerpos del mismo isotipo que los anticuerpos anti-MUC18 probados y además no deben tener la capacidad de unirse al antígeno MUC18 del tumor.

B. Tratamiento con conjugados de anticuerpos anti-MUC18

Para determinar los efectos in vivo de conjugados de anticuerpos anti-MUC18, los pacientes humanos o animales que presentan tumores se inyectan durante una cierta cantidad de tiempo con una cantidad eficaz de conjugado de anticuerpo anti-MUC18. En una realización, el conjugado de anticuerpo anti-MUC18 administrado es conjugado de maitansina-anticuerpos anti-MUC18 o conjugado de radioisótopo-anticuerpos anti-MUC18. A tiempos periódicos durante el tratamiento, los pacientes humanos o animales se monitorizan para determinar si sus tumores progresan, en particular, si los tumores crecen y se metastatizan.

Un paciente humano o animal que presenta tumores y se somete a un tratamiento con conjugados o maitansina-anticuerpos anti-MUC18 o radioisótopo-anticuerpos anti-MUC18 tiene un menor nivel de crecimiento y metástasis tumoral cuando se compara con un paciente o animal de control que presenta tumores y se somete a tratamiento con conjugados de anticuerpos de control, tales como maitansina-anticuerpos de control o radioisótopo-anticuerpos de control. Maitansina-anticuerpos de control que pueden usarse incluyen conjugados que comprenden maitansina ligada a anticuerpos del mismo isotipo de los anticuerpos anti-MUC18, pero más específicamente, que no tienen la capacidad para unirse a antígeno MUC18 de tumor. Radioisótopo-anticuerpos de control que pueden usarse incluyen conjugados que comprenden radioisótopo ligado a anticuerpos del mismo isotipo de los anticuerpos anti-MUC18, pero más específicamente, que no tienen la capacidad para unirse a antígeno MUC18 de tumor.

La memoria descriptiva anteriormente escrita se considera suficiente para permitir a un experto en la materia practicar la invención. La presente invención no va a limitarse en alcance por el constructo depositado ya que la realización depositada pretende ser una simple ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier constructo que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. El depósito de material en este documento no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en este documento es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, tampoco va a interpretarse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa.

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Bibliografía citada en la descripción Esta lista de bibliografía citada por el solicitante sólo es para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aún cuando se ha puesto mucho cuidado en recabar la bibliografía, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP niega cualquier responsabilidad en este aspecto.

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Documentos de patente citados en la descripción

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<110> GREEN, Larry

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<120> ANTICUERPOS CONTRA EL ANTÍGENO MUC18

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<130> ABG-006-EP

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<150> US 60/346299

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<151> 2001-12-28

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<160> 40

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 121

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

5

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<210> 2

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

6

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<210> 3

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<211> 364

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

7

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<210> 4

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<211> 337

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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10

100

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<210> 7

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<211> 352

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 322

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

13

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<210> 9

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<211> 121

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

14

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<210> 10

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

15

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<210> 11

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<211> 364

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

16

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<210> 12

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<211> 328

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

17

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<210> 13

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

18

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<210> 14

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 352

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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<210> 16

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

21

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<210> 17

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<211> 121

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

22

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<210> 18

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

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<210> 19

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<211> 364

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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24

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<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 370

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 367

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 364

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

46

Claims (12)

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que comprende un polipéptido de región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, y un péptido de región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a MUC18.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.

3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 ó 2, asociado con un vehículo terapéuticamente aceptable.

4. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo está conjugado a un agente terapéutico y/o citotóxico.

5. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 4, en el que el agente citotóxico es ricina.

6. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 4 ó 5, en el que el agente terapéutico es un radioisótopo.

7. Un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de la cadena pesada codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 3 y un dominio variable de la cadena ligera codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 4.

8. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.

9. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 7 u 8, asociado con un vehículo terapéuticamente aceptable.

10. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho anticuerpo está conjugado a un agente terapéutico y/o citotóxico.

11. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 10, en el que el agente citotóxico es ricina.

12. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 10 u 11, en el que el agente terapéutico es un radioisótopo.