ES2910407T3 - Anticuerpos anti-CD71 activables y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

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Jason Gary Sagert
Kimberly Ann Tipton
Jonathan Alexander Terrett
Shweta Singh
Annie Yang Weaver
Luc Roland Desnoyers
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Abstract

Un anticuerpo activable conjugado que, en un estado activado, se une a CD71 que comprende: un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus, donde el AB comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9), la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10), la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11), la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12), la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14) y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15); un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, y donde el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud; un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que es un sustrato para una proteasa; un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), donde el anticuerpo activable conjugado en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-LP1-CM-LP2-AB, y donde cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de 1 a 20 aminoácidos de longitud; y un agente conjugado con el AB.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CD71 activables y procedimientos de uso de los mismos
Esta solicitud reivindica el beneficio a las solicitudes provisionales de los EE.UU. con n.° 62/156 838, depositada el 4 de mayo de 2015; 62/257 321, depositada el 19 de noviembre de 2015; 62/257484, depositada el 19 de noviembre de 2015; 62/277 775, depositada el 12 de enero de 2016; 62/310 553, depositada el 18 de marzo de 2016; y 62/315 276, depositada el 30 de marzo de 2016.
Campo de la invención
La invención se refiere en general a anticuerpos que se unen a CD71, anticuerpos activables que se unen específicamente a CD71 y a procedimientos para producir y usar estos anticuerpos anti-CD71 y anticuerpos activables anti-CD71 en una variedad de indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y profilácticas.
Antecedentes de la invención
Las terapias basadas en anticuerpos han demostrado ser tratamientos eficaces para varias enfermedades, pero en algunos casos, las toxicidades debidas a una expresión diana amplia han limitado su eficacia terapéutica. Además, los productos terapéuticos basados en anticuerpos han mostrado otras limitaciones, tal como la depuración rápida de la circulación después de la administración.
En el ámbito de los productos terapéuticos de molécula pequeña, se han desarrollado estrategias para proporcionar profármacos de una entidad química activa. Dichos profármacos se administran en una forma relativamente inactiva (o significativamente menos activa). Una vez administrado, el profármaco se metaboliza in vivo en el compuesto activo. Dichas estrategias de profármaco pueden proporcionar una mayor selectividad del fármaco para su objetivo previsto y para una reducción de los efectos adversos.
En consecuencia, existe una necesidad continua en el campo de los productos terapéuticos basados en anticuerpos de anticuerpos que imitan las características deseables del profármaco de molécula pequeña.
Resumen de la invención
La invención proporciona un anticuerpo activable conjugado según las reivindicaciones 1 a 10, una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo y sus usos como medicamentos según las reivindicaciones 17 y 18, un procedimiento para fabricar un anticuerpo activable según las reivindicaciones 15 y 16, una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 13 y un vector según la reivindicación 14. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen específicamente a CD71, también conocida como proteína receptora de transferrina 1 (TfR1), una vez en un estado activado.
El anticuerpo incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD71 como se define en la reivindicación 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD71 es un anticuerpo monoclonal, de cadena sencilla, fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un scFv o un scAb. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD71 es un anticuerpo monoclonal de ratón, otro roedor, quimérico, humanizado o completamente humano.
Descripción de la descripción
Cualquier referencia a "aspectos" o "la descripción" se refiere a un objeto que no se reivindica explícitamente y no define el alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6­ 8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6­ 8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una combinación de una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en esta invención CDRH1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en esta invención CDRH2), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en esta invención CDRH3), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en esta invención CDRL1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en esta invención CDRL2) y una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en esta invención CDRL3), donde al menos una secuencia de la región determinante de complementariedad (CDR) se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una combinación de una secuencia de Vh CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14; y una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la secuencia de VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la secuencia de VH CDR1 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID nO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
La descripción también proporciona procedimientos para producir un anticuerpo de la descripción cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo, donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico de la descripción o un vector de la descripción.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se incorpora en un anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico 0 fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a CD71. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se incorpora en un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos un brazo del anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a CD71.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una combinación de una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en esta invención CDRH1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en esta invención CDRH2), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en esta invención CDRH3), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en esta invención CDRL1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en esta invención CDRL2) y una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en esta invención CDRL3), donde al menos una secuencia de la región determinante de complementariedad (CDR) se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una combinación de una secuencia de Vh CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14; y una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una combinación de una secuencia de Vh CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la secuencia de VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la secuencia de VH CDR1 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada o una región variable de cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada o una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que se muestra en la Tabla 12. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera o de la región variable de cadena ligera que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada o una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que se muestra en la Tabla 12. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada o de la región variable de cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada o una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que se muestra en la Tabla 12, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera o de la región variable de cadena ligera que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera o una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que se muestra en la Tabla 12.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada o una región variable de cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que se muestra en la Tabla 12. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena ligera o una región variable de cadena ligera que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que se muestra en la Tabla 12. En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende una secuencia de aminoácidos de región que se muestra en la Tabla 12 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que se muestra en la Tabla 12.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una combinación de una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en esta invención CDRH1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en esta invención CDRH2), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en esta invención CDRH3), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en esta invención CDRL1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en esta invención CDRL2) y una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en esta invención CDRL3), donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 mostrada la Tabla 13; una secuencia de VH CDR2 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR3 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR2 mostrada en la Tabla 13; y una secuencia de VL CDR3 mostrada en la Tabla 13.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR2 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR3 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR2 mostrada en la Tabla 13; y una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR3 mostrada en la Tabla 13.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una combinación de una secuencia de VH c DR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena ligera (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2 y una secuencia de VH CDR3, donde la combinación es una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena pesada (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una combinación de una secuencia de VH c DR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde cada secuencia CDR combinada comprende al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica a la secuencia CDR correspondiente en una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de secuencia pesada variable que comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, y una secuencia de Vh CDR3, donde cada secuencia CDR combinada comprende al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica a la secuencia CDR correspondiente en una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de secuencia pesada variable que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2, y una secuencia de Vl CDR3, donde cada secuencia CDR combinada comprende al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica a la secuencia CDR correspondiente en una combinación de las seis secuencias de CDR (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
Los anticuerpos anti-CD71 adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
Los anticuerpos anti-CD71 adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
Los anticuerpos anti-CD71 adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada para unirse a CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus con un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
Los anticuerpos anti-CD71 adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada para unirse a CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus con un anticuerpo antiCD71 que comprende una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 de la descripción comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo aislado que comprende la secuencia de Vh CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia VL CDR1 SASSSVYYMY de (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8. En algunos aspectos, el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de entre el grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio único y un anticuerpo de cadena ligera de dominio único. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al CD71 humano.
En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo compite de forma cruzada con un anticuerpo aislado que comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo compite de forma cruzada con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se define en la reivindicación 1 se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo compite de forma cruzada con un anticuerpo aislado que comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo compite de forma cruzada con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma y una pirrolobenzodiacepina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide seleccionado de entre el grupo que consiste en DM1 y DM4. En algunas realizaciones, el agente es maitansinoide DM4. En algunas realizaciones, el agente es duocarmicina. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador con el que se conjuga el agente al AB comprende un resto SPDB, un resto vc o un resto PEG2-vc. En algunas realizaciones, el enlazador y la toxina conjugada con el AB comprenden un resto SPDB-DM4, un resto vc-MMAD, un resto vc-MMAE, vc-duocarmicina o un resto PEG2-vc-MMAD. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente es un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunos aspectos, el anticuerpo conjugado comprende un anticuerpo conjugado que comprende: (a) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el A b comprende: (i) la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL c Dr 3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15), o (ii) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8; (b) un agente conjugado con el AB, donde el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en auristatina E, monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina D (MMAD), maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una pirrolobenzodiacepina, un dímero de pirrolobenzodiacepina y una duocarmicina.
La descripción también proporciona anticuerpos activables que incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD71 acoplado a un resto de enmascaramiento (MM), de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a CD71. En algunas realizaciones, el MM se acopla a través de una secuencia que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que es activa en el tejido enfermo y/o una proteasa que se colocaliza con CD71 en un sitio de tratamiento en un sujeto. Los anticuerpos anti-CD71 activables proporcionados en esta invención, también denominados en esta invención indistintamente como anticuerpos activables anti-CD71 o anticuerpos activables CD71, son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de la terapia y/o diagnóstico pero no en tejido normal, porejemplo, tejido sano u otro tejido no seleccionado como diana para el tratamiento y/o diagnóstico y, cuando se activan, muestran una unión a c D71 que es al menos comparable con el anticuerpo no modificado correspondiente, también denominado en esta invención como anticuerpo parental.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, prevenir y/o retrasar el inicio o la progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la expresión aberrante y/o actividad de CD71 en un sujeto usando anticuerpos activables que se unen a CD71, particularmente anticuerpos activables que se unen y neutralizan o inhiben de otro modo al menos una actividad biológica de CD71 y/o la señalización mediada por CD71.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, prevenir y/o retrasar el inicio o la progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de células que expresan CD71 o que expresan CD71 de manera aberrante en un sujeto usando anticuerpos activables que se unen a CD71, en particular anticuerpos activables que se unen, seleccionan como diana, neutralizan, destruyen o de otro modo inhiben al menos una actividad biológica de células que expresan o expresan de manera aberrante CD71.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, prevenir y/o retrasar el inicio o la progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de células que expresan CD71 en un sujeto usando anticuerpos activables que se unen a CD71, en particular anticuerpos activables que se unen, seleccionan como diana, neutralizan, destruyen o de otro modo inhiben al menos una actividad biológica de células que expresan CD71.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, prevenir y/o retrasar el inicio o la progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de células que expresan CD71 de manera aberrante en un sujeto usando anticuerpos activables que se unen a CD71, en particular anticuerpos activables que se unen, seleccionan como diana, neutralizan, destruyen o de otro modo inhiben al menos una actividad biológica de células que expresan de manera aberrante CD71.
Los anticuerpos activables en un estado activado se unen a CD71 e incluyen (i) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71; (ii) un resto de enmascaramiento (MM) que, cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, inhibe la unión del AB a CD71; y (c) un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM.
El anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el MM y el CM.
El anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el CM y el AB.
El anticuerpo activable comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), y donde el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM. En algunas realizaciones, los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 339) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 340), donde n es un número entero de al menos uno.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 341), GGSGG (SEQ ID NO: 342), GSGSG (SEQ ID NO: 343), GSGGG (SEQ ID NO: 344), GGGSG (SEQ ID NO: 345) y GSSSG (SEQ ID NO: 346).
En algunas realizaciones, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 347), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 348), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 349), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 350), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 351) o GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 352).
En algunas realizaciones, LP2 comprende la secuencia de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 353), GSSGT (SEQ ID NO: 354) o GSSG (SEQ ID NO: 355).
En algunos aspectos, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 100 nM o menos para la unión a CD71 de mamífero. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 10 nM o menos para la unión a CD71 de mamífero. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 5 nM o menos para la unión a CD71. En algunos aspectos, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 1 nM o menos para la unión a CD71. En algunos aspectos, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 0,5 nM o menos para la unión a CD71. En algunos aspectos, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 0,1 nM o menos para la unión a CD71. En algunos aspectos, el AB tiene una constante de disociación de 0,01 nM a 100 nM, de 0,01 nM a 10 nM, de 0,01 nM a 5 nM, de 0,01 nM a 1 nM, de 0,01 a 0,5 nM, de 0,01 nm a 0,1 nM, de 0,01 nm a 0,05 nM, de 0,05 nM a 100 nM, de 0,05 nM a 10 nM, de 0,05 nM a 5 nM, de 0,05 nM a 1 nM, de 0,05 a 0,5 nM, de 0,05 nm a 0,1 nM, de 0,1 nM a 100 nM, de 0,1 nM a 10 nM, de 0,1 nM a 5 nM, de 0,1 nM a 1 nM, de 0,1 a 0,5 nM, de 0,5 nM a 100 nM, de 0,5 nM a 10 nM, de 0,5 nM a 5 nM, de 0,5 nM a 1 nM, de 1 nM a 100 nM, de 1 nM a 10 nM, de 1 nM a 5 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 10 nM, o de 10 nM a 100 nM, para la unión a CD71 de mamífero.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD71 es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de dominio, de cadena sencilla, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio único o un anticuerpo de cadena ligera de dominio único. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD71 es un anticuerpo monoclonal de ratón, otro roedor, quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable en un estado no escindido se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación inferior o igual a 1 nM, inferior o igual a 5 nM, inferior o igual a 10 nM, inferior o igual a 15 nM, inferior o igual a 20 nM, inferior o igual a 25 nM, inferior o igual a 50 nM, inferior o igual a 100 nM, inferior o igual a 150 nM, inferior o igual a 250 nM, inferior o igual a 500 nM, inferior o igual a 750 nM, inferior o igual a 1000 nM y/o inferior o igual a 2000 nM.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable en un estado no escindido se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación en el intervalo de 1 nM a 2000 nM, de 1 nM a 1000 nM, de 1 nM a 750 nM, de 1 nM a 500 nM, de 1 nM a 250 nM, de 1 nM a 150 nM, de 1 nM a 100 nM, de 1 nM a 50 nM, de 1 nM a 25 nM, de 1 nM a 15 nM, de 1 nM a 10 nM, de 1 nM a 5 nM, de 5 nM a 2000 nM, de 5 nM a 1000 nM, de 5 nM a 750 nM, de 5 nM a 500 nM, de 5 nM a 250 nM, de 5 nM a 150 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 50 nM, de 5 nM a 25 nM, de 5 nM a 15 nM, de 5 nM a 10 nM, de 10 nM a 2000 nM, de 10 nM a 1000 nM, de 10 nM a 750 nM, de 10 nM a 500 nM, de 10 nM a 250 nM, de 10 nM a 150 nM, de 10 nM a 100 nM, de 10 nM a 50 nM, de 10 nM a 25 nM, de 10 nM a 15 nM, de 15 nM a 2000 nM, de 15 nM a 1000 nM, de 15 nM a 750 nM, de 15 nM a 500 nM, de 15 nM a 250 nM, de 15 nM a 150 nM, de 15 nM a 100 nM, de 15 nM a 50 nM, de 15 nM a 25 nM, de 25 nM a 2000 nM, de 25 nM a 1000 nM, de 25 nM a 750 nM, de 25 nM a 500 nM, de 25 nM a 250 nM, de 25 nM a 150 nM, de 25 nM a 100 nM, de 25 nM a 50 nM, de 50 nM a 2000 nM, de 50 nM a 1000 nM, de 50 nM a 750 nM, de 50 nM a 500 nM, de 50 nM a 250 nM, de 50 nM a 150 nM, de 50 nM a 100 nM, de 100 nM a 2000 nM, de 100 nM a 1000 nM, de 100 nM a 750 nM, de 100 nM a 500 nM, de 100 nM a 250 nM, de 100 nM a 150 nM, de 150 nM a 2000 nM, de 150 nM a 1000 nM, de 150 nM a 750 nM, de 150 nM a 500 nM, de 150 nM a 250 nM, de 250 nM a 2000 nM, de 250 nM a 1000 nM, de 250 nM a 750 nM, de 250 nM a 500 nM, de 500 nM a 2000 nM, de 500 nM a 1000 nM, de 500 nM a 750 nM, de 500 nM a 500 nM, de 500 nM a 250 nM, de 500 nM a 150 nM, de 500 nM a 100 nM, de 500 nM a 50 nM, de 750 nM a 2000 nM, de 750 nM a 1000 nM o de 1000 nM a 2000 nM.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable en un estado activado se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación inferior o igual a 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM o 10 nM.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable en un estado activado se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación en el intervalo de 0,01 nM a 100 nM, de 0,01 nM a 10 nM, de 0,01 nM a 5 nM, de 0,01 nM a 1 nM, de 0,01 a 0,5 nM, de 0,01 nm a 0,1 nM, de 0,01 nm a 0,05 nM, de 0,05 nM a 100 nM, de 0,05 nM a 10 nM, de 0,05 nM a 5 nM, de 0,05 nM a 1 nM, de 0,05 a 0,5 nM, de 0,05 nm a 0,1 nM, de 0,1 nM a 100 nM, de 0,1 nM a 10 nM, de 0,1 nM a 5 nM, de 0,1 nM a 1 nM, de 0,1 a 0,5 nM, de 0,5 nM a 100 nM, de 0,5 nM a 10 nM, de 0,5 nM a 5 nM, de 0,5 nM a 1 nM, de 1 nM a 100 nM, de 1 nM a 10 nM, de 1 nM a 5 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 10 nM o de 10 nM a 100 nM.
El CD71 de mamífero se selecciona de entre el grupo que consiste en un CD71 humano, un CD71 murino, un CD71 de rata y un CD71 de mono cynomolgus. En algunas realizaciones, el AB se une específicamente a CD71 humano, CD71 murino o CD71 de mono cynomolgus con una constante de disociación de menos de 1 nM. En algunas realizaciones, el CD71 de mamífero es un CD71 humano.
En algunas realizaciones, el AB tiene una o más de las siguientes características: (a) el AB se une específicamente a CD71 humano; y (b) el AB se une específicamente a CD71 humano y a CD71 de mono cynomolgus.
En algunas realizaciones, el AB tiene una o más de las siguientes características: (a) el AB se une específicamente a CD71 humano y a CD71 de mono cynomolgus; (b) el AB inhibe la unión de transferrina a CD71 de mamífero; (c) el AB inhibe la unión de transferrina humana a CD71 humano; y (d) el AB inhibe la unión de transferrina de mono cynomolgus a CD71 de mono cynomolgus.
En algunos aspectos, el AB bloquea la capacidad de un ligando natural para unirse al CD71 de mamífero con una CE50 inferior o igual a 5 nM, inferior o igual a 10 nM, inferior o igual a 50 nM, inferior o igual a 100 nM, inferior o igual a 500 nM y/o inferior o igual a 1000 nM. En algunos aspectos, el AB bloquea la capacidad de una transferrina para unirse al CD71 de mamífero con una CE50 inferior o igual a 5 nM, inferior o igual a 10 nM, inferior o igual a 50 nM, inferior o igual a 100 nM, inferior o igual a 500 nM y/o inferior o igual a 1000 nM. En En algunos aspectos, el ligando natural de CD71 es transferrina.
En algunos aspectos, el AB bloquea la capacidad de un ligando natural para unirse al CD71 de mamífero con una CE50 de 5 nM a 1000 nM, de 5 nM a 500 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 50 nM, de 5 nM a 10 nM, de 10 nM a 1000 nM, de 10 nM a 500 nM, de 10 nM a 100 nM, de 10 nM a 50 nM, de 50 nM a 1000 nM, de 50 nM a 500 nM, de 50 nM a 100 nM, de 100 nM a 1000 nM, de 100 nM a 500 nM, de 500 nM a 1000 nM. En algunos aspectos, el AB bloquea la capacidad de una transferrina para unirse al CD71 de mamífero con una CE50 de 5 nM a 1000 nM, de 5 nM a 500 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 50 nM, de 5 nM a 10 nM, de 10 nM a 1000 nM, de 10 nM a 500 nM, de 10 nM a 100 nM, de 10 nM a 50 nM, de 50 nM a 1000 nM, de 50 nM a 500 nM, de 50 nM a 100 nM, de 100 nM a 1000 nM, de 100 nM a 500 nM, de 500 nM a 1000 nM. En algunas realizaciones, el ligando natural de CD71 es transferrina.
El AB de la presente descripción inhibe o reduce el crecimiento, proliferación y/o metástasis de células que expresan CD71 de mamífero. Sin pretender limitarse a ninguna teoría, el A b de la presente descripción puede inhibir o reducir el crecimiento, la proliferación y/o la metástasis de las células que expresan CD71 de mamífero al unirse específicamente a CD71 e inhibir, bloquear y/o prevenir la unión de un ligando natural a CD71 de mamífero. En algunas realizaciones, el ligando natural de CD71 de mamífero es transferrina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3­ 5. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3­ 5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el
93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en esta invención CDRH1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en esta invención CDRH2), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en esta invención CDRH3), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en esta invención CDRL1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en esta invención CDRL2) y una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en esta invención CDRL3), donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el
95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el
91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO:
13); una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el
94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
El anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la secuencia de VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de
VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la secuencia de VH CDR1 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el
91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el AB del anticuerpo anti-CD71 activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12. En algunos aspectos, el AB del anticuerpo anti-CD71 activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12. En algunos aspectos, el AB del anticuerpo anti-CD71 activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12.
En algunos aspectos, el AB del anticuerpo anti-CD71 activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12. En algunos aspectos, el AB del anticuerpo anti-CD71 activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12. En algunos aspectos, el AB del anticuerpo anti-CD71 activable comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en esta invención CDRH1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en esta invención CDRH2), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en esta invención CDRH3), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en esta invención CDRL1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en esta invención CDRL2) y una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en esta invención CDRL3), donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR2 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR3 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR2 mostrada en la Tabla 13; y una secuencia de VL CDR3mostrada en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR2 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR3 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR2 mostrada en la Tabla 13; y una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR3 mostrada en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una cadena pesada que comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2 y una secuencia de VH CDR3, donde la combinación es una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena pesada (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2, una secuencia de VL c DR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las tres secuencias de CDR (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una región variable de cadena pesada que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde cada secuencia de CDR en la combinación comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de CDR correspondiente en una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena pesada (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una región variable de cadena pesada que comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2 y una secuencia de VH CDR3, donde cada secuencia de CDR en la combinación comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de CDR correspondiente en una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena pesada (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde cada secuencia de CDR en la combinación comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de CDR correspondiente en una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena ligera (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que es mayor que la constante de disociación del AB a CD71.
En algunos aspectos, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que no es mayor que la constante de disociación del AB a CD71.
En algunos aspectos, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que es menor que la constante de disociación del AB a CD71.
En algunos aspectos, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB no es mayor de 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 veces o más, o entre 1-5, 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100­ 10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000­ 10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000 o 100.000-10.000.000 veces o más que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunos aspectos, el MM no interfiere ni compite con el AB por unirse a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado escindido.
En algunos aspectos, el MM es un polipéptido de aproximadamente 2 a 40 aminoácidos de longitud. El MM es un polipéptido de hasta aproximadamente 40 aminoácidos de longitud.
En algunos aspectos, la secuencia polipeptídica de MM es diferente de la de CD71. En algunos aspectos, la secuencia polipeptídica de MM no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunos aspectos, la secuencia polipeptídica de MM es diferente de la de CD71 y no es más de un 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % o 10 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos dos veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos cinco veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos 10 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos 20 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos 40 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos 100 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos 1000 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos 10.000 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD71.
En algunos aspectos, en presencia de CD71, el MM reduce la capacidad del AB para unirse a CD71 en al menos un 90 % cuando el CM no está escindido, en comparación a cuando el CM se escinde cuando se ensaya in vitro usando un ensayo de desplazamiento de diana tal como, por ejemplo, el ensayo descrito en la publicación PCT n.° WO 2010/081173.
En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 16-295 y 297-314.
En algunas realizaciones, la proteasa que escinde el CM está activa, por ejemplo, regulada positivamente o no regulada de ningún modo, en tejido enfermo, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa.
En algunos aspectos, la proteasa se colocaliza con CD71 en un tejido, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos dos veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos cinco veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 10 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 20 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 40 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 50 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 100 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD71 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 200 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une a CD71.
En algunos aspectos, el CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunos aspectos, el CM es un polipéptido que incluye un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). En algunas realizaciones, cada una de la secuencia de sustrato CM1 y la secuencia de sustrato CM2 del sustrato CM1-CM2 es independientemente un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunos aspectos, el CM es un sustrato para al menos una proteasa que está o se cree que está regulada positivamente o no está regulada de ningún modo en el cáncer.
En algunos aspectos, el CM es un sustrato para al menos una proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en una metaloproteasa de matriz (MMP), trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, legumaína y una serina proteasa, tal como matriptasa (MT-SP1), y urocinasa (uPA). Sin quedar ligado a ninguna teoría, se cree que estas proteasas están reguladas positivamente, o no están reguladas de ningún modo, en al menos uno de cáncer.
Los sustratos ejemplares incluyen, pero sin limitación, sustratos escindibles por una o más de las siguientes enzimas o proteasas enumeradas en la Tabla 4.
En algunos aspectos, el CM se selecciona para su uso con una proteasa específica, por ejemplo, una proteasa que se sabe que se colocaliza con la diana del anticuerpo activable.
En algunos aspectos, el CM es un sustrato para al menos una MMP. Los ejemplos de MMP incluyen las MMP enumeradas en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en MMP 9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11 y MMP19. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para MMP9. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para MMP14.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato que incluye la secuencia TGRGPSWV (SEQ ID NO: 356); SARGPSRW (SEQ ID NO: 357); TARGPSFK (SEQ ID NO: 358); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 359); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 360); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 361); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 362); AARGPAIH (SEQ ID NO: 363); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 364); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 365); RGPATPIM (SEQ ID NO: 366); RGPA (SEQ ID NO: 367); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 368); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 369); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 370); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 371); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 372); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 373); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 374); PLGL (SEQ ID NO: 375); LSGRSGNH (SEQ ID NO: 789); SGRSANPRG (SEQ ID NO: 790); LSGRSDDH (SEQ ID NO: 791); LSGRSDIH (SEQ ID NO: 792); LSGRSDQH (SEQ ID NO: 793); LSGRSDTH (SEQ ID NO: 794); LSGRSDYH (SEQ ID NO: 795); LSGRSDNP (SEQ ID NO: 796); LSGRSANP (SEQ ID NO: 797); LSGRSANI (SEQ ID NO: 798); LSGRSDNI (SEQ ID NO: 799); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 800); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 801); WATPRPMR (SEQ ID NO: 802); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 803); ISSGL (SEQ ID NO: 804); ISSGLLS (SEQ ID NO: 805); y/o ISSGLL (SEQ ID NO: 806).
En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 359). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TGRGPSWV (SEQ ID NO: 356). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PLTGRSGG (SEQ ID NO: 362). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 368). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 369). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 370). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PLGL (SEQ ID NO: 375). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SARGPSRW (SEQ ID NO: 357). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TARGPSFK (SEQ ID NO: 358). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GGWHTGRN (SEQ ID NO: 360). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos HTGRSGAL (SEQ ID NO: 361). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos AARGPAIH (SEQ ID NO: 363). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RGPAFNPM (SEQ ID NO: 364). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SSRGPAYL (SEQ ID NO: 365). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RGPATPIM (SEQ ID NO: 366). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RGPA (SEQ ID NO: 367). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSGNH (SEQ ID NO: 789). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SGRSANPRG (SEQ ID NO: 790). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDDH (SEQ ID NO: 791). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDIH (SEQ ID NO: 792). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDQH (SEQ ID NO: 793). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDTH (SEQ ID NO: 794). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDYH (SEQ ID NO: 795). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNP (SEQ ID NO: 796). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSANP (SEQ ID NO: 797). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSANI (SEQ ID NO: 798). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNI (SEQ ID NO: 799). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos MIAPVAYR (SEQ ID NO: 800). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 801). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 802). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos FRLLDWQW (SEQ ID NO: 803). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGL (SEQ ID NO: 804). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLS (SEQ ID NO: 805). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos y/o ISSGLL (SEQ ID NO: 806).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una MMP e incluye la secuencia ISSGLSS (SEQ ID NO: 376); QNQALRMA (SEQ ID NO: 377); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 378); STFPFGMF (SEQ ID NO: 379); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 380); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 381), ISSGLLSS (SEQ ID NO: 382), LKAAPRWA (SEQ ID NO: 383); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 384); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 385); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 386); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 387); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 388); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 389); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 390); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 391); y/o PAGLWLDP (SEQ ID NO: 392).
En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLSS (SEQ ID NO: 376). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 377). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 378). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 379). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PVGYTSSL (SEQ ID NO: 380). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 381). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 382). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 383). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 384). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LPGGLSPW (SEQ ID NO: 385). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos MGLFSEAG (SEQ ID NO: 386). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SPLPLRVP (SEQ ID NO: 387). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 388). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 389). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 390). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 391). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 392).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para la trombina. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para trombina, e incluye la secuencia GPRSFGL (SeQ ID NO: 393) o GPRSFG (SEQ ID NO: 394). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GPRSFGL (SEQ ID NO: 393). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GPRSFG (SEQ ID NO: 394).
En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 395); NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 396); TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 397); TSGRSANP (SEQ ID NO: 398); VAGRSMRP (SEQ ID NO: 399); VVPEGRRS (SEQ ID NO: 400); ILPRSPAF (SEQ ID NO: 401); MVLGRSLL (SEQ ID NO: 402); QGRAITFI (SEQ ID NO: 403); SPRSIMLA (SEQ ID NO: 404); y SMLRSMPL (SEQ ID NO: 405).
En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 395). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 396). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 397). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TSGRSANP (SEQ ID NO: 398). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos VAGRSMRP (SEQ ID NO: 399). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos VVPEGRRS (SEQ ID NO: 400). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ILPRSPAF (SEQ ID NO: 401). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos MVLGRSLL (SEQ ID NO: 402). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos QGRAITFI (SEQ ID NO: 403). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SPRSIMLA (SEQ ID NO: 404). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SMLRSMPL (SEQ ID NO: 405).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una elastasa de neutrófilos. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una serina proteasa. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para uPA. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para legumaína. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para matriptasa. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una cisteína proteasa. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una cisteína proteasa, tal como una catepsina.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato CM1-CM2 e incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 406); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 407); AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 408); TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 409); VHMPLGFFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 410); TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 411); AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 412); LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 413); VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 414); LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 415); LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 416); LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 417); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 418); LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 419); QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 420); LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 421); QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 422); ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 423); ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 680); AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 681); AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 682); ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 683); ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 684); ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 685); ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 686); ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 687); ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 688); ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 689); ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 690); AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 691); AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 692); AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 693); AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 694); AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 695); AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 696); AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 697); AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 698), ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 713); AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 714); GLSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 807);y/o GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 808).
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 406), que también se denomina en esta invención como sustrato 2001. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 407), que también se denomina en esta invención como sustrato 1001/LP'/0001, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 408), que también se denomina en esta invención como sustrato 2015 y/o sustrato 1004/LP'/0003, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 409), que también se denomina en esta invención como sustrato 0003/LP'/1004, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 410), que también se denomina en esta invención como sustrato 1003/LP'/0003, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 411), que también se denomina en esta invención como sustrato 0003/LP'/1003, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 412), que también se denomina en esta invención como sustrato 3001 y/o sustrato 1004/LP'/0001, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 413), que también se denomina en esta invención como sustrato 0001/LP'/1004, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 414), que también se denomina en esta invención como sustrato 1003/LP'/0001, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 415), que también se denomina en esta invención como sustrato 0001/LP'/1003, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 416), que también se denomina en esta invención como sustrato 0001/LP'/1001, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 417), que también se denomina en esta invención como sustrato 0002/LP'/1001, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 418), que también se denomina en esta invención como sustrato 1001/LP'/0002, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 419), que también se denomina en esta invención como sustrato 0001/LP'/1002, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID No: 420), que también se denomina en esta invención como sustrato 1002/LP'/0001, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ iD NO: 421), que también se denomina en esta invención como sustrato 0002/LP'/1002, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 422), que también se denomina en esta invención como sustrato 1002/LP'/0002, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 1037). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 423), que también se denomina en esta invención como sustrato 2002. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 680), que también se denomina en esta invención como sustrato 2003. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 681), que también se denomina en esta invención como sustrato 2004. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 682), que también se denomina en esta invención como sustrato 2005. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 683), que también se denomina en esta invención como sustrato 2006. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 684), que también se denomina en esta invención como sustrato 2007. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 685), que también se denomina en esta invención como sustrato 2008. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 686), que también se denomina en esta invención como sustrato 2009. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 687), que también se denomina en esta invención como sustrato 2010. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 688), que también se denomina en esta invención como sustrato 2011. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 689), que también se denomina en esta invención como sustrato 2012. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 690), que también se denomina en esta invención como sustrato 2013. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 691), que también se denomina en esta invención como sustrato 3006. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 692), que también se denomina en esta invención como sustrato 3007. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 693), que también se denomina en esta invención como sustrato 3008. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 694), que también se denomina en esta invención como sustrato 3009. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 695), que también se denomina en esta invención como sustrato 3010. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 696), que también se denomina en esta invención como sustrato 3011. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 697), que también se denomina en esta invención como sustrato 3012. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 698), que también se denomina en esta invención como sustrato 3013. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 713), que también se denomina en esta invención como sustrato 2014. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 714), que también se denomina en esta invención como sustrato 3014. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia GLSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 807), que también se denomina en esta invención como sustrato 0001/LP'/1004, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 808), que también se denomina en esta invención como sustrato 0001/LP'/1003, donde LP' tal como se usa en este sustrato CM1-CM2 es la secuencia de aminoácidos GG.
En algunos aspectos, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas. En algunas realizaciones, cada proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 4. En algunos aspectos, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas, donde una de las proteasas se selecciona de entre el grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa, y la otra proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas seleccionadas de entre el grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable incluye al menos un primer CM y un segundo CM. En algunos aspectos, el primer CM y el segundo CM son cada uno polipéptidos de no más de 15 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, el primer CM y el segundo CM en el anticuerpo activable en el estado no escindido tienen la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: MM-CM1-CM2-AB o AB-CM2-CM1-MM. En algunos aspectos, al menos uno del primer CM y el segundo CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa. En algunos aspectos, el primer CM se escinde por un primer agente de escisión seleccionado de entre el grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa en un tejido diana, y el segundo CM se escinde por un segundo agente de escisión en un tejido diana. En algunos aspectos, la otra proteasa se selecciona de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 4. En algunos aspectos, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa, y el primer CM y el segundo CM son sustratos diferentes para la enzima. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada de entre el grupo que consiste en las mostradas en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son proteasas diferentes. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión se localizan conjuntamente en el tejido diana. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM se escinden por al menos un agente de escisión en el tejido diana.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable se expone y se escinde por una proteasa de modo que, en el estado activado o escindido, el anticuerpo activado incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye al menos una porción de LP2 y/o una secuencia de CM después de que la proteasa haya escindido el CM.
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o c D71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o c D71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o c D71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12.
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada para unirse a CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus con un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada para unirse a CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus con un anticuerpo antiCD71 que comprende una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada para unirse a CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12.
Los anticuerpos anti-CD71 activables adecuados de la descripción también incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada para unirse a CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo anti-CD71 que comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable es un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD71 que comprende: un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus; un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; y un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa.
En algunas realizaciones, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que es mayor que la constante de disociación del AB a CD71. En algunas realizaciones, el MM no interfiere ni compite con el a B por unirse a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado escindido. En algunas realizaciones, el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de MM es diferente de la de CD71. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de MM no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-295 y 297-314. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 17 y 297-314.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una proteasa que es activa en el tejido enfermo. En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 356-423, 680-698, 713, 714, y 789-808. En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 406-423, 680-698, 713, 714, y 807-808.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo que se selecciona de entre el grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scAb. El Ab del anticuerpo activable se une específicamente al CD71 humano. El AB comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el AB comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8 y 809-908.
En algunos aspectos, el AB está unido al CM. En algunos aspectos, el AB se une directamente al CM. En algunos aspectos, el a B se une al CM a través de un péptido de unión. En algunos aspectos, el MM se une al CM de tal forma que el anticuerpo activable en un estado no escindido comprende la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: m M-CM-AB o Ab -CM-MM. El anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el MM y el CM. El anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el CM y el AB. El anticuerpo activable comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), y donde el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM. En algunas realizaciones, los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí. Cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 325 o 699; y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 327, 329, 331, 333, 335, 337, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 670-673, 701-712, 721-788, 809-836 y 841-908.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde la combinación de secuencias de aminoácidos se selecciona de entre una fila única en la Tabla D, donde, para una combinación dada, (a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias de VH CDR correspondientes a la combinación dada en la fila ÚNICA enumerada en la Tabla D, (b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias de VL CDR correspondientes a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D, (c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de enmascaramiento (MM) correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D, y (d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde, para una combinación dada de secuencias de aminoácidos, (a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia de VH o las secuencias de VH CDR seleccionadas de entre el grupo que consiste en: la secuencia de VH o las secuencias de VH CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E, (b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia de VL o las secuencias de VL CDR seleccionadas de entre el grupo que consiste en: la secuencia de VL o las secuencias de VL CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E, (c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de enmascaramiento (MM) seleccionada de entre el grupo que consiste en: las secuencias de MM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E, y (d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) seleccionada de entre el grupo que consiste en: las secuencias de CM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD71 activable comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, un MM y un CM, donde el anticuerpo activable comprende: una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 325 o 699; y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 327, 329, 331, 333, 335, 337, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 670-673, 701-712, 721-788, 809-836 y 841-908. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 17, y 297-314, y el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SeQ ID NO: 406-423, 680-698, 713, 714 y 789-808. En algunos aspectos, el AB comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el AB comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8 y 809-908.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, un mM que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-295 y 297-314 y un CM que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 356-423, 680-698, 713, 714 y 789-808. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 17, y 297-314, y el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 406-423, 680-698, 713, 714 y 807­ 808. En algunos aspectos, el AB comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el AB comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8 y 809-908.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente al mismo epítopo en CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus como un anticuerpo aislado de la descripción; un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; y un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable anti-CD71 de la descripción comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el Ab compite específicamente de forma cruzada con un anticuerpo aislado de la descripción para unirse a CD71 humano y/o CD71 de mono cynomolgus; un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; y un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable anti-CD71 de la descripción comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8.
El anticuerpo activable también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente conjugado con el AB o el AB de un anticuerpo activable es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. Como se usa en el presente documento, un fragmento de una toxina es un fragmento que conserva actividad tóxica. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador que incluye al menos una secuencia de sustrato CM1-CM2. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador que es escindible en un entorno intracelular o lisosómico. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN, un agente de escisión de ADN, un reticulador de ADN, un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 5. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiacepina.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable se conjuga con uno o más equivalentes de un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable se conjuga con un equivalente del agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable se conjuga con dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez equivalentes del agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable forma parte de una mezcla de anticuerpos activables que tienen un número homogéneo de equivalentes de agentes conjugados. En algunos aspectos, el anticuerpo activable forma parte de una mezcla de anticuerpos activables que tienen un número heterogéneo de equivalentes de agentes conjugados. En algunos aspectos, la mezcla de anticuerpos activables es tal que el número promedio de agentes conjugados con cada anticuerpo activable está entre cero y uno, entre uno y dos, entre dos y tres, entre tres y cuatro, entre cuatro y cinco, entre cinco y seis, entre seis y siete, entre siete y ocho, entre ocho y nueve, entre nueve y diez y diez y más. En algunas realizaciones, la mezcla de anticuerpos activables es tal que el número promedio de agentes conjugados con cada anticuerpo activable es uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende una o más modificaciones de secuencia de aminoácidos específicas del sitio, de modo que el número de residuos de lisina y/o cisteína aumenta o disminuye con respecto a la secuencia de aminoácidos original del anticuerpo activable, aumentando o disminuyendo correspondientemente así, en algunos aspectos, el número de agentes que pueden conjugarse con el anticuerpo activable, o limitando en algunos aspectos la conjugación de los agentes con el anticuerpo activable de una manera específica del sitio. En algunos aspectos, el anticuerpo activable modificado se modifica con uno o más aminoácidos no naturales de una manera específica del sitio, limitando así, en algunos aspectos, la conjugación de los agentes a solo los sitios de los aminoácidos no naturales.
En algunas realizaciones, el agente es un agente antiinflamatorio.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable también incluye un péptido señal. En algunos aspectos, el péptido señal se conjuga con el anticuerpo activable a través de un espaciador. En algunos aspectos, el espaciador se conjuga con el anticuerpo activable en ausencia de un péptido señal. En algunos aspectos, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable. En algunos aspectos, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable en la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal del espaciador-MM-CM-AB. Un ejemplo de un espaciador unido directamente al extremo N terminal del MM del anticuerpo activable es QGQSGQ (SEQ ID NO: 424). Otros ejemplos de un espaciador unido directamente al extremo N terminal del MM del anticuerpo activable incluyen QGQSGQG (SEQ ID NO: 645), QGQSG (SEQ ID NO: 646), QGQS (SEQ ID NO: 647), QGQ (SEQ ID NO: 648), QG (SEQ ID NO: 649), y Q. Otros ejemplos de un espaciador unido directamente al extremo N terminal del MM del anticuerpo activable incluyen GQSGQG (SEQ ID NO: 666), QSGQG (SEQ ID NO: 667), SGQG (SEQ ID NO: 668), GQG (SEQ ID NO: 669), y G. En algunos aspectos, no hay un espaciador unido al extremo N terminal del MM. En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 424). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQG (SEQ ID NO: 645). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSG (SEQ ID NO: 646). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQS (SEQ ID NO: 647). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQ (SEQ ID NO: 648). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QG (SEQ ID NO: 649). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos el residuo aminoacídico Q. En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQSGQG (SEQ ID NO: 666). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QSGQG (SEQ ID NO: 667). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos SGQG (SEQ ID NO: 668). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQG (SEQ ID NO: 669). En algunos aspectos, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos G. En algunos aspectos, el espaciador está ausente.
En algunos aspectos, el AB del anticuerpo activable contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunos aspectos, el a B se puede diseñar para incluir uno o más enlaces disulfuro.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada con un anticuerpo aislado que comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS(SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite de forma cruzada con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma y una pirrolobenzodiacepina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide seleccionado de entre el grupo que consiste en DM1 y DM4. En algunas realizaciones, el agente es maitansinoide DM4. En algunas realizaciones, el agente es duocarmicina. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador con el que se conjuga el agente al A b comprende un resto SPDB, un resto vc o un resto PEG2-vc. En algunas realizaciones, el enlazador y la toxina conjugada con el AB comprenden un resto SPDB-DM4, un resto vc-MMAD, un resto vc-MMAE, vc-duocarmicina o un resto PEG2-vc-MMAD. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente es un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
El anticuerpo activable conjugado comprende un anticuerpo activable conjugado que, en un estado activado, se une a CD71 que comprende: un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus; un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa; y un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma y una pirrolobenzodiacepina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en auristatina E, monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina D (MMAD), maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una duocarmicina, una pirrolobenzodiacepina y un dímero de pirrolobenzodiacepina. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador con el que se conjuga el agente al AB comprende un resto SPDB, un resto vc o un resto PEG2-vc. En algunas realizaciones, el enlazador y la toxina conjugada con el AB comprenden un resto SPDB-DM4, un resto vc-MMAD, un resto vc-MMAE, vc-duocarmicina o un resto PEG2-vc-MMAD. En algunas realizaciones, el AB del anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el AB del anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8 y 809-908. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-295 y 297-314. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 17 y 297-314. En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 356-423, 680-698, 713, 714, y 789-808. En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 406-423, 680-698, 713, 714, y 807-808. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde la combinación de secuencias de aminoácidos se selecciona de una fila única en la Tabla D, donde para una combinación dada, (a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias de VH CDR correspondientes a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D, (b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias de VL CDR correspondientes a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D, (c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de enmascaramiento (MM) correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D y (d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde para una combinación dada de secuencia de aminoácidos, (a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia de VH o secuencias de VH CDR seleccionadas de entre el grupo que consiste en: la secuencia de VH o secuencias de VH CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E, (b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia de VL o secuencias de VL CDR seleccionadas de entre el grupo que consiste en: la secuencia de VL o secuencias de VL CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E, (c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de enmascaramiento (MM) seleccionada de entre el grupo que consiste en: las secuencias de MM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E y (d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) seleccionada de entre el grupo que consiste en: las secuencias de CM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende: una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 325 o 699; y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 327, 329, 331, 333, 335, 337, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 670-673, 701-712,721-788, 809-836 y 841-908.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado comprende un anticuerpo activable conjugado que, en un estado activado, se une a CD71, que comprende: un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus; un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa; y un agente conjugado con el AB, donde el AB comprende: (i) la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15), o (ii) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende un secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-8, o (iii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 325 o 699, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 327, 329, 331, 333, 335, 337, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 670-673, 701-712, 721-788, 809-836 y 841-908; y donde el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en auristatina E, monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina D (MMAD), maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una pirrolobenzodiacepina, un dímero de pirrolobenzodiacepina y una duocarmicina. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-295 y 297-314. En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 17 y 297-314. En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 356-423, 680-698, 713, 714, y 789-808. En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 406-423, 680-698, 713, 714, y 807-808. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador, y donde el enlazador con el que se conjuga el agente al AB comprende un resto SPDB, un resto vc o un resto PEG2-vc. En algunas realizaciones, el enlazador y la toxina conjugada con el AB comprenden un resto SPDB-DM4, un resto vc-MMAD, un resto vc-MMAE, vc-duocarmicina o un resto PEG2-vc-MMAD.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado comprende un anticuerpo activable conjugado o un anticuerpo conjugado que comprende: un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que, en un estado activado, se une a CD71; y una toxina conjugada con el AB a través de un enlazador, donde el anticuerpo activable conjugado o el anticuerpo conjugado comprende secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina seleccionados de una fila única en la Tabla F, donde, para la combinación dada: (a) el AB comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena pesada o la secuencia de dominio variable de cadena pesada correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla F, (b) el AB comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena ligera o la secuencia de dominio variable de cadena ligera correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla F, y (c) el enlazador y la toxina comprenden el enlazador y la toxina correspondientes a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla F.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que comprende seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8. En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3-5, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6-8.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada que se muestran en la Tabla 12, y una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena ligera que se muestran en la Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una combinación de una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en esta invención CDRH1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en esta invención CDRH2), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en esta invención CDRH3), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en esta invención CDRL1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en esta invención CDRL2) y una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en esta invención CDRL3), donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR2 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR3 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR2 mostrada en la Tabla 13; y una secuencia de VL CDR3 mostrada la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR2 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VH CDR3 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR1 mostrada en la Tabla 13; una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR2 mostrada en la Tabla 13; y una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a una secuencia de VL CDR3 mostrada en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena ligera (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una combinación de una secuencia de VH CDR1, una secuencia de VH CDR2 y una secuencia de VH CDR3, donde la combinación es una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena pesada (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, al menos un brazo del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una combinación de una secuencia de VH c DR1, una secuencia de VH CDR2, una secuencia de VH CDR3, una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde la combinación es una combinación de las seis secuencias de CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde cada secuencia de CDR en la combinación comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de CDR correspondiente en una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena ligera (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de una secuencia de VL CDR1, una secuencia de VL CDR2 y una secuencia de VL CDR3, donde cada secuencia de CDR en la combinación comprende una secuencia que es al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más idéntica a la secuencia de CDR correspondiente en una combinación de las tres secuencias de CDR de cadena ligera (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) que se muestran en una fila única en la Tabla 13.
La descripción también proporciona procedimientos para producir un anticuerpo activable de la descripción cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico de la descripción o un vector de la descripción.
La descripción también proporciona procedimientos para fabricar un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD71, comprendiendo el procedimiento: (a) cultivar una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un anticuerpo activable de la descripción; y (b) recuperar el anticuerpo activable.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable incluye uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de secuencias en una fila dada de la Tabla D o cualquier combinación de una secuencia de enmascaramiento (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla E.
Tabla D: Combinaciones de anticuerpos activables anti-CD71
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Tabla E: Componentes de anticuerpos activables anti-CD71
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En algunos aspectos, un anticuerpo activable de la presente descripción incluye uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de secuencias seleccionadas de entre la Tabla D o la Tabla E, donde el polipéptido incluye una combinación de una secuencia de enmascaramiento seleccionada de la columna titulada "Secuencia de enmascaramiento (MM)" de la Tabla D o la Tabla E, una secuencia de sustrato de la columna titulada "Secuencia de sustrato (CM)" de la Tabla D o la Tabla E, un dominio variable de cadena ligera o CDR de cadena ligera de la columna titulada "VL o VL CDR" o "VL CDR SEQ ID NO" de la Tabla D o la Tabla E, y un dominio variable de cadena pesada o CDR de cadena pesada de la columna titulada "VH o VH CDR" o "VH CDR SEQ ID No" de la Tabla D o la Tabla E. Por ejemplo, un anticuerpo activable de la presente descripción puede incluir las secuencias de aminoácidos de la combinación n.° 54, que incluye la secuencia de enmascaramiento de SEQ ID NO: 17, la secuencia de sustrato de SEQ ID NO: 412, un dominio variable de cadena ligera que incluye las secuencias de VL CDR de SEQ ID NO: 12, 14 y 15, y un dominio variable de cadena pesada que incluye las secuencias de VH CDR de 9, 10 y 11. Por lo tanto, en esta invención se describe un anticuerpo activable que incluye al menos la combinación de secuencias en cualquier fila dada de la Tabla D. De manera similar, se describe en esta invención cualquier combinación de una secuencia de enmascaramiento (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla E. También se describe en esta invención un anticuerpo activable que incluye al menos cualquier combinación de una secuencia de enmascaramiento, una secuencia de sustrato, una cadena pesada variable o CDR de cadena pesada variable, y una cadena ligera variable o CDR de cadena ligera variable seleccionadas de las columnas correspondientes de la Tabla D o la Tabla E. En algunos aspectos ejemplares, un anticuerpo activable que incluye al menos la combinación de secuencias en cualquier fila dada de la Tabla D o cualquier combinación de una secuencia de enmascaramiento (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla E se pueden combinar con una o más toxinas, incluyendo una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma o una pirrolobenzodiacepina o un derivado de la misma. En algunos aspectos ejemplares, un anticuerpo activable que incluye al menos la combinación de secuencias en cualquier fila dada de la Tabla D o cualquier combinación de una secuencia de enmascaramiento (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla E se pueden combinar con una o más toxinas, incluyendo auristatina E, monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina D (MMAD), maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una pirrolobenzodiacepina, un dímero de pirrolobenzodiacepina y/o una duocarmicina.
Cualquiera de las combinaciones en la Tabla D o la Tabla E como se han descrito anteriormente se puede combinar con regiones constantes de inmunoglobulina humana para dar como resultado IgG completamente humanas, incluyendo IgG1, IgG2, IgG4, o regiones constantes mutadas para dar lugar a IgG humanas con funciones alteradas tales como IgG1 N297A, IgG1 N297Q o IgG4 S228P. Las combinaciones descritas en la Tabla D o la Tabla E no están limitadas por las combinaciones particulares que se muestran en cualquier fila dada y, por lo tanto, pueden incluir cualquier secuencia de enmascaramiento de la columna 2 de la Tabla D (o columna 1 de la Tabla E) combinada con cualquier secuencia de sustrato de la columna 3 de la Tabla D (o columna 2 de la Tabla E) combinada con cualquier secuencia de VL o conjunto de secuencias de VL CDR de la columna 4 de la Tabla D (o columna 3 o Tabla E) combinadas con cualquier secuencia de VH o conjunto de secuencias de VH CDR de la columna 5 de la Tabla D (o columna 4 de la Tabla E). Además de las secuencias de enmascaramiento descritas en la columna 2 de la Tabla D o la columna 1 de la Tabla E, cualquier secuencia de enmascaramiento descrita en esta invención puede usarse en una combinación. Además de las secuencias de sustrato descritas en la columna 3 de la Tabla D o la columna 2 de la Tabla E, cualquier CM descrito en esta invención puede usarse en una combinación. Además de la secuencia de región variable de cadena ligera o las secuencias CDR de cadena ligera descritas en la columna 4 de la Tabla D o la columna 3 de la Tabla E, cualquier secuencia de región variable de cadena ligera o secuencias CDR de cadena ligera descritas en esta invención pueden usarse en una combinación. Además de la secuencia de región variable de cadena pesada o las secuencias CDR de cadena pesada descritas en la columna 5 de la Tabla D o la columna 4 de la Tabla E, cualquier secuencia de región variable de cadena pesada o secuencias CDR de cadena pesada descritas en esta invención pueden usarse en una combinación.
En algunos aspectos, los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) y los conjugados de anticuerpo activable-fármaco (AADC) pueden incluir uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de una secuencia de cadena ligera o una secuencia de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de cadena pesada o una secuencia de dominio variable de cadena pesada, un enlazador y una toxina en una fila dada de la Tabla F, o cualquier combinación de una secuencia de cadena ligera o una secuencia de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de cadena pesada o una secuencia de dominio variable de cadena pesada, un enlazador y una toxina de la Tabla F.
T l F: m in i n AD ni- D71 AD iv l ni- D71
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Un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de la presente descripción o conjugado de anticuerpo activable-fármaco (AADC) de la presente descripción puede incluir uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina enumerados en un fila dada de la Tabla F. Por lo tanto,en esta invención se describe un conjugado de anticuerpo activable-fármaco (ADC) de la presente descripción o conjugado de anticuerpo activable-fármaco (AADC) de la presente descripción que incluye la combinación de secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina enumerados en una fila dada o proporcionados como una combinación específica. Por ejemplo, un conjugado de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción puede incluir las secuencias de aminoácidos de la combinación n.° 45, que incluye una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 325, una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 333 y un enlazador-toxina spdb-DM4. En otro ejemplo de los AADC descritos en esta invención, un conjugado de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción puede incluir las secuencias de aminoácidos de la combinación n.° 33, que incluye una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 325, una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 331 y un enlazador-toxina vc-MMAE.
Cualquiera de las combinaciones en la Tabla F que enumera una región variable de cadena pesada o cadena ligera se puede combinar con regiones constantes de inmunoglobulina humana para dar como resultado IgG completamente humanas, incluyendo IgG1, IgG2, IgG4, o regiones constantes mutadas para dar lugar a IgG humanas con funciones alteradas tales como IgG1 N297A, IgG1 N297Q o IgG4 S228P. Las combinaciones descritas en la Tabla F no están limitadas por las combinaciones particulares mostradas en cualquier fila dada, y por lo tanto pueden incluir cualquier secuencia de cadena pesada o secuencia de región variable de cadena pesada de la columna 2 de la Tabla F combinada con cualquier secuencia de cadena ligera o secuencia de región variable de cadena ligera de la columna 3 de la Tabla F combinada con cualquier enlazador de la columna 4 en combinación con cualquier toxina de la columna 5. Además de las secuencias de cadena pesada o secuencias de región variable de cadena pesada enumeradas en la columna 2, cualquier secuencia de cadena pesada o secuencia de región variable de cadena pesada descrita en esta invención puede usarse en una combinación. Además de las secuencias de cadena ligera o las secuencias de región variable de cadena ligera enumeradas en la columna 3, cualquier secuencia de cadena ligera o secuencia de región variable de cadena ligera descrita en esta invención puede usarse en una combinación. Además de los enlazadores enumerados en la columna 4, cualquier enlazador descrito en el presente documento puede usarse en una combinación. Además de las toxinas enumeradas en la columna 5, cualquier toxina descrita en esta invención puede usarse en una combinación.
En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo correspondiente; por ejemplo, el pK del anticuerpo activable es mayor que el del anticuerpo correspondiente. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es similar a la del anticuerpo correspondiente. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 15 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 11 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 9 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 7 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 5 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 2 días cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 24 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 20 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 18 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 16 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 14 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 horas cuando se administra a un organismo. En algunos aspectos la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 horas cuando se administra a un organismo.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado es monoespecífico. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado es multiespecífico, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitativo, biespecífico o trifuncional. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado se formula como parte de una molécula acopladora pro-biespecífica de linfocitos T (BITE). En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado se formula como parte de un linfocito T modificado por el prorreceptor de antígeno quimérico (CAR) u otro receptor diseñado por ingeniería genética.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo se incorpora en un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos un brazo del anticuerpo activable multiespecífico se une específicamente a CD71. En algunos aspectos, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo se incorpora en un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos un brazo del anticuerpo activable biespecífico se une específicamente a CD71.
En algunos aspectos, los anticuerpos anti-CD71, anticuerpos anti-CD71 conjugados, anticuerpos anti-CD71 activables y/o anticuerpos anti-CD71 activables conjugados descritos en esta invención se usan junto con uno o más agentes adicionales o una combinación de agentes adicionales. Los agentes adicionales adecuados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación prevista, tal como, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD71, anticuerpos anti-CD71 conjugados, anticuerpos anti-CD71 activables y/o anticuerpos anti-CD71 activables conjugados pueden usarse junto con un agente quimioterapéutico o antineoplásico adicional.
En algunos aspectos, el uno o más agentes adicionales son un agente quimioterapéutico, tal como un agente quimioterapéutico seleccionado de entre el grupo que consiste en docetaxel, paclitaxel, abraxano (es decir, paclitaxel conjugado con albúmina), doxorrubicina, oxaliplatino, carboplatino, cisplatino, irinotecan y gemcitabina.
En algunos aspectos, el uno o más agentes adicionales son un inhibidor de punto de control, un inhibidor de cinasa, un agente dirigido a inhibidores en el microambiente tumoral y/o un agonista de linfocitos T o células NK. En algunos aspectos, el uno o más agentes adicionales son radioterapia, en solitario o en combinación con otro u otros agentes adicionales tal como un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En algunos aspectos, el uno o más agentes adicionales son una vacuna, un oncovirus y/o un agente activador de DC tal como, a modo de ejemplo no limitativo, un agonista del receptor tipo toll (TLR) y/o a-CD40. En algunos aspectos, el uno o más agentes adicionales son un anticuerpo dirigido a tumor diseñado para destruir el tumor a través de ADCC o a través de conjugación directa con una toxina (por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).
En algunos aspectos, el inhibidor de punto de control es un inhibidor de una diana seleccionado de entre el grupo que consiste en c TlA-4, LAG-3, PD-1, CD71, TIGIT, TIM-3, B7H4 y Vista. En algunas realizaciones, el inhibidor de cinasa se selecciona de entre el grupo que consiste en inhibidores de B-RAFi, MEKi y Btk, tales como ibrutinib. En algunos aspectos, el inhibidor de cinasa es crizotinib. En algunas realizaciones, el inhibidor del microambiente tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en un inhibidor de IDO, un inhibidor de a-CSF1R, un inhibidor de a-CCR4, un TGF-beta, una célula supresora derivada de mieloide o un linfocito de T regulador. En algunas realizaciones, el agonista se selecciona de entre el grupo que consiste en Ox40, GITR, CD137, ICOS, CD27, y HVEM.
En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de CTLA-4. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de LAG-3. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de PD-1. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de CD71. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de TIGIT. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de TIM-3. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de B7H4. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de Vista. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de B-RAFi. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de MEKi. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de Btk. En algunos aspectos, el inhibidor es ibrutinib. En algunos aspectos, el inhibidor es crizotinib. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de IDO. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de a-CSF1R. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de a-CCR4. En algunos aspectos, el inhibidor es un inhibidor de TGF-beta. En algunas realizaciones, el inhibidor es una célula supresora derivada de mieloide. En algunos aspectos, el inhibidor es un linfocito T regulador.
En algunos aspectos, el agonista es Ox40. En algunos aspectos, el agonista es GITR. En algunos aspectos, el agonista es CD137. En algunos aspectos, el agonista es ICOS. En algunos aspectos, el agonista es CD27. En algunos aspectos, el agonista es HVEM.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado se administra durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales tales como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio y/o un agente inmunosupresor. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional se formulan en una única composición terapéutica, y el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional se administran simultáneamente. Como alternativa, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional están separados entre sí, por ejemplo, cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional se administran simultáneamente, o el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado se administra antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado se administra después de la administración del agente adicional, o el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional se administran de forma alterna. Como se describe en esta invención, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional se administran en dosis únicas o en dosis múltiples.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran simultáneamente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales pueden formularse en una composición única o administrarse en forma de dos o más composiciones por separado. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran secuencialmente, o el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado se administra durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales tales como, a modo de ejemplo no limitativo, un agente quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio y/o un agente inmunosupresor, tal como un agente alquilante, un antimetabolito, un agente antimicrotúbulos, un inhibidor de topoisomerasa, un antibiótico citotóxico y/o cualquier otro agente que dañe el ácido nucleico. En algunos aspectos, el agente adicional es un taxano, tal como paclitaxel (por ejemplo, Abraxane®). En algunos aspectos, el agente adicional es un antimetabolito, tal como gemcitabina. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente alquilante, tal como quimioterapia a base de platino, tal como carboplatino o cisplatino. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente dirigido, tal como un inhibidor de cinasa, por ejemplo, sorafenib o erlotinib. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente dirigido, tal como otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, bevacizumab), un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico. En algunos aspectos, el agente adicional es un inhibidor de proteosoma, tal como bortezomib o carfilzomib. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente inmunomodulador, tal como lenalidomida o IL-2. En algunos aspectos, el agente adicional es radiación. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente considerado estándar de cuidado por los expertos en la materia. En algún aspecto, el agente adicional es un agente quimioterapéutico bien conocido por los expertos en la materia.
En algunos aspectos, el agente adicional es otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/u otro anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el agente adicional es otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/u otro anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo contra la misma diana que el primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el primer anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, contra CD71. En algunos aspectos, el agente adicional es otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/u otro anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo contra una diana diferente de la diana del primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el primer anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Como ejemplo no limitativo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y/o el AB de un anticuerpo activable es una pareja de unión para cualquier diana enumerada en la Tabla 1.
Tabla 1: Dianas eemplares
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Como ejemplo no limitativo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y/o el AB de un anticuerpo activable es o se deriva de un anticuerpo enumerado en la Tabla 2.
Tabla 2: Fuentes e emplares para Ab
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En algunos aspectos, el anticuerpo adicional o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo de dominio, de cadena sencilla, fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio único o un anticuerpo de cadena ligera de dominio único. En algunos aspectos, el anticuerpo adicional o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal de ratón, otro roedor, quimérico, humanizado o completamente humano.
La descripción también proporciona procedimientos para producir un anticuerpo anti-CD71 y/o un polipéptido de anticuerpo anti-CD71 activable mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del polipéptido, donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo y/o un anticuerpo activable descrito en esta invención, y/o vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La descripción proporciona procedimientos para producir un anticuerpo y/o un anticuerpo activable mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo y/o anticuerpo activable, donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo y/o un anticuerpo activable descrito en esta invención, y/o vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas.
La invención también proporciona un procedimiento de fabricación de anticuerpos activables que, en un estado activado, se une a CD71, (a) cultivando una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 como se define en la reivindicación 1, (i) donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa; y (ii) donde el CM se posiciona en el anticuerpo activable de tal forma que, cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, el MM interfiere con la unión específica del AB a CD71, y en un estado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a CD71; y (b) recuperando el anticuerpo activable. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM y/o CM definidos en las reivindicaciones.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el MM y el CM. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el CM y el AB. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), y donde el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM. En algunos aspectos, los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí. En algunos aspectos, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: espaciador-MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM-espaciador.
En algunos aspectos, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 339) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 340), donde n es un número entero de al menos uno.
En algunos aspectos, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 341), GGSGG (SEQ ID NO: 342), GSGSG (SEQ ID NO: 343), GSGGG (SEQ ID NO: 344), GGGSG (SEQ ID NO: 345) y GSSSG (SEQ ID NO: 346).
En algunos aspectos, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 347), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 348), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 349), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 350), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 351) o GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 352).
En algunos aspectos, LP2 comprende la secuencia de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 353), GSSGT (SEQ ID NO: 354) o GSSG (SEQ ID NO: 355).
La descripción proporciona procedimientos para prevenir, retrasar la progresión de, tratar, aliviar un síntoma de, o mejorar de otro modo una enfermedad mediada por CD71 en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado descrito en esta invención a un sujeto que lo necesite.
La descripción también proporciona procedimientos para prevenir, retrasar la progresión de, tratar, aliviar un síntoma de, o mejorar de otro modo un cáncer en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado descrito en esta invención a un sujeto que lo necesite. Se sabe que CD71 se expresa en una variedad de cánceres, tales como, a modo de ejemplo no limitativo, adenocarcinoma, cáncer del conducto biliar (biliar), cáncer de vejiga, cáncer de mama, por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, cáncer de mama Her2 negativo; cáncer carcinoide; cáncer de cuello uterino; colangiocarcinoma; cáncer colorrectal; de endometrio; glioma; cáncer de cabeza y cuello, por ejemplo, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón, por ejemplo, NSCLC, SCLC; linfoma; melanoma; cáncer orofaríngeo; cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata, por ejemplo, carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración; cáncer de riñón; cáncer de piel; cáncer de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer de testículo; cáncer de tiroides; y cáncer urotelial.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con un tumor que expresa CD71. En algunas realizaciones, el cáncer se debe a un tumor que expresa CD71.
Se puede administrar un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado usado en cualquiera de los aspectos de estos procedimientos y usos en cualquier etapa de la enfermedad. Por ejemplo, tal anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-CD71 conjugado, anticuerpo anti-CD71 activable y/o anticuerpo anti-CD71 activable conjugado pueden administrarse a un paciente que padece cáncer de cualquier etapa, desde temprano a metastásico. Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente en esta invención.
En algunos aspectos, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunos aspectos, el sujeto es un ser humano. En algunos aspectos, el sujeto es un animal de compañía. En algunos aspectos, el sujeto es un animal al cuidado de un veterinario.
El anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y las formulaciones terapéuticas de los mismos se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de CD71. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de CD71 se identifica usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican utilizando cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
La administración de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o la actividad aberrante de CD71 se considera exitosa si se logra cualquiera de una variedad de objetivos clínicos o de laboratorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o la actividad aberrante de CD71 se considera exitosa si uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno se alivia, se reduce, se inhibe o no progresa a un estado posterior, es decir, peor. La administración de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o la actividad aberrante de CD71 se considera exitosa si la enfermedad o trastorno entra en remisión o no progresa a un estado posterior, es decir, peor.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y las formulaciones terapéuticas de los mismos se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno, tal como sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica, donde las células enfermas del sujeto expresan CD71. En algunos aspectos, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o la actividad aberrante de CD71. En algunos aspectos, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o la actividad normal de CD71. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno, donde las células enfermas del sujeto expresan CD71, se identifica usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican utilizando cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y las formulaciones terapéuticas de los mismos se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD71 o la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de dichas células, tal como los sujetos que padecen cáncer u otras afecciones neoplásicas. En algunos aspectos, las células están asociadas con la expresión y/o la actividad aberrante de CD71. En algunos aspectos, las células están asociadas con la expresión y/o la actividad normal de CD71. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con las células que expresan CD71 se identifica usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican utilizando cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
La administración de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD71 se considera exitosa si se logra cualquiera de una variedad de objetivos clínicos o de laboratorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD71 se considera exitosa si uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno se alivia, se reduce, se inhibe o no progresa a un estado posterior, es decir, peor. La administración de un anticuerpo anti-CD71, un anticuerpo anti-CD71 conjugado, un anticuerpo anti-CD71 activable y/o un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD71 se considera exitosa si la enfermedad o trastorno entra en remisión o no progresa a un estado posterior, es decir, peor.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado se administra durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales, tales como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio y/o un agente inmunosupresor. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran simultáneamente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales pueden formularse en una composición única o administrarse en forma de dos o más composiciones por separado. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71, el anticuerpo anti-CD71 conjugado, el anticuerpo anti-CD71 activable y/o el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran secuencialmente.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, aliviar un síntoma de, o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad en el que las células enfermas expresan CD71 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la descripción o un anticuerpo conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, el trastorno o la enfermedad es cáncer.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, aliviar un síntoma de, o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad en el que las células enfermas expresan CD71 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la descripción o un anticuerpo conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite.
En una realización, el anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, se utiliza como medicamento para el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociada con células que expresan CD71, donde el trastorno o enfermedad es un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un adenocarcinoma, un cáncer del conducto biliar (biliar), un cáncer de vejiga, un cáncer de hueso, un cáncer de mama, un cáncer de mama triple negativo, un cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer carcinoide, un cáncer cervical, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, una leucemia, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células no pequeñas, un cáncer de pulmón de células pequeñas, un linfoma, un melanoma, un cáncer orofaríngeo, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración, un cáncer de riñón, un sarcoma, un cáncer de piel, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital o un cáncer urotelial. En algunas realizaciones, el ligando natural es transferrina. En algunas realizaciones, la expresión y/o la actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende administrar un agente adicional. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente terapéutico.
La descripción también proporciona procedimientos para inhibir o reducir el crecimiento, proliferación o metástasis de células que expresan CD71 de mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la descripción o un anticuerpo conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, el ligando natural es transferrina. En algunos aspectos, la expresión y/o la actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunos aspectos, el procedimiento comprende administrar un agente adicional. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente terapéutico.
La descripción también proporciona procedimientos para inhibir, bloquear o prevenir la unión de un ligando natural a CD71 de mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la descripción o un anticuerpo conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, aliviar un síntoma de, o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad en el que las células enfermas expresan CD71 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo activable de la descripción o un anticuerpo activable conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, el trastorno o la enfermedad es cáncer.
La descripción también proporciona procedimientos para tratar, aliviar un síntoma de, o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad asociada con células que expresan CD71 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo activable de la descripción o un anticuerpo activable conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, la expresión y/o la actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunos aspectos, el procedimiento comprende administrar un agente adicional. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente terapéutico.
La descripción también proporciona procedimientos para inhibir o reducir el crecimiento, proliferación o metástasis de células que expresan CD71 de mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo activable de la descripción o un anticuerpo activable conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, el ligando natural es transferrina. En algunos aspectos, la expresión y/o la actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunos aspectos, el procedimiento comprende administrar un agente adicional. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente terapéutico.
La descripción también proporciona procedimientos para inhibir, bloquear o prevenir la unión de un ligando natural a CD71 de mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo activable de la descripción o un anticuerpo activable conjugado de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable de la descripción o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de la descripción a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, el ligando natural es transferrina. En algunos aspectos, la expresión y/o la actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunos aspectos, el procedimiento comprende administrar un agente adicional. En algunos aspectos, el agente adicional es un agente terapéutico.
La descripción también proporciona procedimientos y kits para usar los anticuerpos anti-CD71 activables y/o los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados en una variedad de indicaciones de diagnóstico y/o profilácticas. Por ejemplo, la descripción proporciona procedimientos y kits para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y una diana de interés en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto a un sujeto o muestra con un anticuerpo activable anti-CD71, donde el anticuerpo activable anti-CD71 comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable anti-CD71 en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desdel extremo N terminal al extremo C terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a CD71, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, cuando el AB está en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a CD71, y cuando el AB está en un estado escindido y activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a CD71; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable anti-CD71 activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable anti-CD71 activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión y CD71 están presentes en el sujeto o la muestra, y donde ningún nivel detectable de anticuerpo activable anti-CD71 activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión, CD71 o tanto el agente de escisión como CD71 están ausentes en el sujeto o la muestra.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable es un anticuerpo anti-CD71 activable con que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunos aspectos, la medición del nivel de anticuerpo anti-CD71 activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye un marcador detectable. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el marcador detectable incluye un agente de formación de imágenes, un agente de contraste, una enzima, un marcador fluorescente, un cromóforo, un colorante, uno o más iones metálicos o un marcador basado en ligando. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el agente de formación de imágenes comprende un radioisótopo. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el marcador fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), proteína fluorescente roja tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, o un derivado de europio. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el marcador luminiscente comprende un derivado de N-metilacridio. En algunos aspectos de estos procedimientos, el marcador comprende un marcador Alexa Fluor®, tal como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el marcador basado en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el sujeto es un mamífero. En algunos aspectos de estos procedimientos, el sujeto es un ser humano. En algunos aspectos, el sujeto es un mamífero no humano, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunos aspectos, el sujeto es un roedor.
En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el procedimiento es un procedimiento in vivo. En algunos aspectos de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in situ. En algunos aspectos de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento ex vivo. En algunos aspectos de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vitro.
En algunos aspectos de los procedimientos y kits, el procedimiento se usa para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable anti-CD71 de la descripción, seguido del tratamiento administrando ese anticuerpo anti-CD71 activable y/o anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, CD71) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable anti-CD71 que se ensaya en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable anti-CD71 que comprende tal CM, y a continuación se administra al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD71 activable y/o anticuerpo anti-CD71 activable conjugado que se ensayó. Asimismo, los pacientes que den negativo para cualquiera de o tanto la diana (por ejemplo, CD71) como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunos aspectos, dichos pacientes pueden analizarse con otros anticuerpos activables anti-CD71 hasta que se identifique un anticuerpo activable anti-CD71 adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable anti-CD71 que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunos aspectos, a continuación al paciente se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD71 activable y/o conjugado para el que el paciente dio positivo. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en esta invención.
Las composiciones farmacéuticas según la invención incluyen un anticuerpo activable conjugado de la invención y un vehículo. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la descripción, un anticuerpo activable de la descripción, un anticuerpo conjugado de la descripción y/o un anticuerpo activable conjugado de la descripción, y un vehículo. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica según la invención comprende un agente adicional. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente terapéutico.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos anti-CD71 de la descripción para unirse a CD71 humano.
La Figura 2 es un gráfico que representa la capacidad de varios anticuerpos anti-CD71 activables de la descripción para unirse a CD71 humano.
La Figura 3A es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos activables anti-CD71 no conjugados y conjugados de la descripción para unirse a CD71 humano cuando el anticuerpo activable está intacto o se activa proteolíticamente. La Figura 3B es un gráfico que representa la citotoxicidad in vitro de anticuerpos activables anti-CD71 conjugados y anticuerpos activables anti-CD71 conjugados activados de la descripción.
La Figura 4 es un gráfico que representa la eficacia de un anticuerpo anti-CD71 activable de la descripción en tumores de xenoinjerto NCI-H292.
La Figura 5 es un gráfico que representa la eficacia de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de la descripción en tumores de xenoinjerto HCC1806 de cáncer de mama.
La Figura 6A es un gráfico que representa que un anticuerpo anti-CD71 de la descripción se une a las células epiteliales primarias del riñón de mono cynomolgus, la Figura 6B es un gráfico que representa que el anticuerpo anti-CD71 de la descripción se une al CD71 de mono cynomolgus pero no se une al CD71 de ratón, y la Figura 6C es un gráfico que representa que los anticuerpos anti-CD71 murinos y humanizados de la descripción se unen a la línea celular BxPC3 humana.
La Figura 7 es un gráfico que representa que una dosis única de un anticuerpo anti-CD71 activable de la descripción demuestra una semivida prolongada en comparación con el anticuerpo parental CD71 en monos cynomolgus.
La Figura 8 es un gráfico que representa la farmacocinética de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de la descripción cuando se administra a monos cynomolgus.
La Figura 9 es un gráfico que representa la tolerabilidad de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de la descripción cuando se administra a monos cynomolgus.
La Figura 10 es un gráfico que representa un ensayo ejemplar de la unión entre CD71 recombinante y su ligando transferrina.
La Figura 11A es un gráfico que representa un ensayo de unión competitiva a CD71 entre un anticuerpo anti-CD71 de la presente descripción y la transferrina. La Figura 11B es un gráfico que representa un ensayo de unión de la unión de transferrina a CD71 que demuestra la inhibición de la unión por un anticuerpo anti-CD71 de la presente descripción. Las Figuras 12A, 12B y 12C representan ensayos inmunohistoquímicos (IHC) ejemplares para determinar los niveles de expresión de CD71 en varios tipos de tejido de cáncer primario y metastásico.
Las Figuras 13A, 13B y 13C representan estudios de eficacia ejemplares de anticuerpos conjugados anti-CD71 activables (AADC) de la presente descripción utilizando xenoinjertos de tumor de linfoma no Hodgkin en ratones. Las Figuras 14A a 14G representan estudios de tolerabilidad ejemplares de anticuerpos activables conjugados (AADC) anti-CD71 de la presente descripción en monos cynomolgus.
La Figura 15 representa niveles de expresión de CD71 ejemplares en varias líneas celulares usando un anticuerpo anti-CD71, así como estudios de citotoxicidad en las mismas líneas celulares usando un anticuerpo anti-CD71 de la presente descripción con un anticuerpo secundario conjugado con fármaco.
Las Figuras 16A a 16D representan estudios ejemplares de la capacidad de varios anticuerpos activables anti-CD71 de la presente descripción para unirse a CD71 humano en varias líneas celulares derivadas de humanos.
Las Figuras 17A a 17d representan estudios ejemplares de la citotoxicidad de conjugados de anticuerpo anti-CD71-fármaco de la presente descripción en varias líneas celulares.
La Figura 18 representa estudios ejemplares de la citotoxicidad de varios conjugados de anticuerpo anti-CD71 activables-fármaco de la presente descripción en una línea celular Raji derivada del linfoma no Hodgkin.
La Figura 19 representa un estudio ejemplar de la capacidad de varios anticuerpos activables anti-CD71 de la descripción para unirse a CD71 humano.
Las Figuras 20A y 20B representan un estudio ejemplar de la eficacia de conjugados de anticuerpo anti-CD71-fármaco (ADC) y conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco (AADC) de la presente descripción en un modelo de tumor de xenoinjerto derivado de paciente.
Las Figuras 21A - 21H representan estudios ejemplares de la citotoxicidad de varios conjugados de anticuerpo anti-CD71-fármaco de la presente descripción en una variedad de líneas celulares derivadas de cáncer colorrectal. Las Figuras 22A y 22b representan estudios ejemplares de la citotoxicidad de varios conjugados de anticuerpo anti-CD71-fármaco y conjugados de fármaco activables de la presente descripción en una línea celular derivada de cáncer colorrectal HT29.
Las Figuras 23A y 23B representan estudios de eficacia ejemplares de anticuerpos conjugados anti-CD71 activables (AADC) de la presente descripción utilizando xenoinjertos de tumor de linfoma no Hodgkin en ratones.
Las Figuras 24a y 24B representan estudios de eficacia ejemplares de anticuerpos conjugados anti-CD71 activables (AADC) de la presente descripción utilizando xenoinjertos de tumor de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NCI-H292) en ratones.
La Figura 25 representa estudios de eficacia ejemplares de anticuerpos conjugados anti-CD71 activables (AADC) de la presente descripción utilizando xenoinjertos de tumor de cáncer de páncreas (BxPC3) en ratones.
Las Figuras 26A y 26B representan estudios de eficacia ejemplares de anticuerpos conjugados anti-CD71 activables (AADC) de la presente descripción utilizando xenoinjertos de tumor derivados de pacientes (linfoma no Hodgkin) en ratones.
Las Figuras 27A y 27B representan estudios de eficacia ejemplares de anticuerpos conjugados anti-CD71 activables (AADC) de la presente descripción utilizando xenoinjertos de tumor derivados de pacientes en ratones.
La Figura 28 representa un estudio ejemplar de la capacidad de varios anticuerpos anti-CD71 y anticuerpos activables de la descripción para unirse a CD71 humano.
Las Figuras 29A a 29C representan estudios ejemplares de la capacidad de varios anticuerpos activables anti-CD71 y conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción para unirse a CD71 humano en varias líneas celulares derivadas de humanos.
Las Figuras 30A a 30D representan estudios ejemplares de la capacidad de varios anticuerpos activables anti-CD71 de la presente descripción para unirse a CD71 humano in vitro y en varias líneas celulares derivadas de humanos. Las Figuras 31A a 31J representan estudios ejemplares de la citotoxicidad de varios conjugados de anti-CD71 activables-fármacos de la presente descripción en varias líneas celulares derivadas de cáncer.
Las Figuras 32A a 32B representan estudios ejemplares de la capacidad de los anticuerpos antiCD71 y los conjugados de anticuerpo-fármaco de la presente descripción para unirse a CD71 humano en varias líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas derivadas de humanos.
Las Figuras 33A y 33B representan estudios ejemplares del efecto antiproliferativo de los anticuerpos anti-CD71 de la presente descripción contra varias líneas celulares derivadas de cáncer.
La Figura 34 representa estudios ejemplares del nivel de expresión de CD71 en múltiples muestras de cáncer metastásico derivadas de pacientes.
La Figura 35 representa estudios ejemplares de la unión in vivo de anticuerpos anti-CD71 de la presente descripción a tumores en un modelo de cáncer de páncreas de ratón.
La Figura 36 representa estudios ejemplares de la unión in vivo de anticuerpos anti-CD71 de la presente descripción a tumores en un modelo de cáncer de mama metastásico de ratón.
La Figura 37 representa estudios ejemplares de la unión in situ de anticuerpos anti-CD71 de la presente descripción en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón.
Descripción detallada de la invención
La presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales (mAb) y anticuerpos monoclonales activables que se unen específicamente a c D71, también conocida como proteína receptora de transferrina 1 (TfR1). En algunos aspectos, los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos monoclonales activables son internalizados por células que contienen CD71. El uso del término "CD71" pretende cubrir cualquier variación del mismo, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, CD-71 y/o CD 71, y todas las variaciones se usan en esta invención indistintamente.
CD71 es una glicoproteína transmembrana que se une principalmente a la transferrina. CD71 es esencial para la homeostasis celular. CD71 se recicla continuamente a través de endocitosis mediada por ligando, donde el ligando principal es la transferrina. Se sabe que CD71 también se expresa de forma ubicua en células en división.
La expresión y/o actividad aberrante de CD71 y la señalización relacionada con CD71 se han implicado en la patogénesis de muchas enfermedades y trastornos, tales como cáncer. CD71 se sobreexpresa en muchos cánceres, incluidos los cánceres sólidos y hematológicos. CD71 tiene una amplia expresión en la superficie celular. CD71 en células malignas media una mayor absorción de hierro necesaria para la división celular. CD71 también se asocia con mal pronóstico en las leucemias.
CD71 es una diana deseable porque prevalece en múltiples indicaciones de cáncer.
La descripción proporciona anticuerpos anti-CD71, anticuerpos anti-CD71 conjugados, anticuerpos anti-CD71 activables y/o anticuerpos anti-CD71 activables conjugados que son útiles en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de CD71. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD71 activables se usan en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de un cáncer u otra afección neoplásica.
La descripción proporciona anticuerpos anti-CD71, anticuerpos anti-CD71 conjugados, anticuerpos anti-CD71 activables y/o anticuerpos anti-CD71 activables conjugados que son útiles en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD71. En algunos aspectos, las células están asociadas con la expresión y/o la actividad aberrante de CD71. En algunos aspectos, las células están asociadas con la expresión y/o la actividad normal de CD71. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD71 activables se usan en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de un cáncer u otra afección neoplásica.
La descripción proporciona anticuerpos anti-CD71, anticuerpos anti-CD71 conjugados, anticuerpos anti-CD71 activables y/o anticuerpos anti-CD71 activables conjugados que son útiles en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno en el que las células enfermas expresan CD71. En algunos aspectos, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o la actividad aberrante de CD71. En algunos aspectos, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o la actividad normal de CD71. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD71 activables se usan en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de un cáncer u otra afección neoplásica.
Los anticuerpos anti-CD71 activables y/o los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD71 acoplado a un resto de enmascaramiento (MM), de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a CD71. En algunas realizaciones, el Mm se acopla a través de una secuencia que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que se colocaliza con CD71 en un sitio de tratamiento en un sujeto.
Los anticuerpos anti-CD71 activables ejemplares de la descripción incluyen, por ejemplo, anticuerpos activables que incluyen una cadena pesada y una cadena ligera que son, o se derivan de, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera que se muestra a continuación (las secuencias de CDR se muestran en negrita y subrayado):
muM21 VH:
EVQLQESGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSETGYNQNFKGK
AKLTAVTSASTAYMDLSSLTNEDSAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLITVSA (SEQ ID NO: 1)
muM21 VL:
DIVMTQTPAIMSASPGEKVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSG
TSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRRNYPYTFGGGTKLEIKRA (SEQ ID NO: 2)
cadena pesada variable hu2vHa
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGNSETGYAQKFQGR
VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARENWDPGFAFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3)
cadena pesada variable hu2vHb
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKFQGR
ATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4)
cadena pesada variable hu2vHc
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKFQGR
ATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLITVSS (SEQ ID NO: 5) cadena ligera variable hu21vKa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 6)
cadena ligera variable hu21vKb
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSG
TDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 7)
cadena ligera variable hu21vKc
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSG
TDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 8)
Los anticuerpos anti-CD71 activables ejemplares de la descripción incluyen, por ejemplo, anticuerpos activables que incluyen una combinación de una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en esta invención CDRH1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en esta invención CDRH2), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en esta invención CDRH3), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en esta invención CDRL1), una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en esta invención CDRL2) y una secuencia de la región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en esta invención CDRL3), donde al menos una secuencia de CDR se selecciona de entre el grupo que consiste en una secuencia de VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); una secuencia de VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); una secuencia de VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); una secuencia de VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12) o CRAs Ss VYYMY (SEQ ID NO: 13); una secuencia de VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y una secuencia de VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en las publicaciones PCT n.°WO 2014/144060, WO 2014/189973, WO 2014/020140, en las patentes de los EE.UU. n.° 8.663.598; 8.129.503; 7.736.647; 7.572.895; 4.434.156; en las publicaciones de solicitud de patente de los EE. UU. n.° US2014114054, US20140212423, US2013177579, US2013045206, US20130216476, US20120282176 y/o en la Patente China n.° CN101245107B,.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una cadena ligera que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la Tabla 12, y una cadena ligera que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las combinaciones mostradas en el Grupo A en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las combinaciones mostradas en el Grupo B en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las combinaciones mostradas en el Grupo C en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las combinaciones mostradas en el Grupo D en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye la combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera mostradas en el Grupo E en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye la combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera mostradas en el Grupo F en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las combinaciones mostradas en el Grupo G en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las combinaciones mostradas en el Grupo H en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye la combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera mostradas en el Grupo I en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye la secuencia de región variable de cadena pesada mostradas en el Grupo J en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye la secuencia de región variable de cadena pesada mostrada el Grupo J en la Tabla 12, o la combinación de secuencias de resión variable decadena pesada y de región variable de cadena ligera mostradas en el Grupo K en la Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las secuencias mostradas en el Grupo L en la Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo A Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo A Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo A Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo A Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo B Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo B Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo B Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo B Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo C Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo C Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo C Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo C Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo D Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo D Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo D Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo D Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo E Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo E Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo E Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo E Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo F Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo F Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo F Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo F Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo G Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo G Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo G Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo G Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo H Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo H Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo H Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo H Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo I Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo I Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo I Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo I Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo J Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo J Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo J Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo J Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo K Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo K Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo K Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo K Tabla 12.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo L Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo L Tabla 12. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo L Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo L Tabla 12.
Tabla 12. Secuencias de la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) para anticuerpos activables que se unen a CD71
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En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye una secuencia de CDR mostrada en la Tabla 13, una combinación de secuencias de VL CDR (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) seleccionadas de entre el grupo que consiste en las combinaciones mostradas en una fila única en la Tabla 13, una combinación de secuencias de VH CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) seleccionadas de entre el grupo que consiste en las combinaciones mostradas en la Tabla 13 o una combinación de secuencias de VL CDR y VH CDR (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) seleccionadas de entre el grupo que consiste en las combinaciones mostradas en la Tabla 13. T l 1. n i DR r ni r ni r iv l nn D71
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En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 activable comprende o se deriva de un anticuerpo que es fabricado, secretado o producido de otro modo por un hibridoma, tal como, por ejemplo, el uno o más hibridomas denominados BA120 como se describe en la patente de los EE. UU. n.° 7 736 647 y depositados en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (Institut Pasteur, París, Francia, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724, París, Cedex 15) el 14 de junio de 2005, bajo el número CNCM 1-3449; el uno o más hibridoma descritos en la patente de los EE.UU. n.° 7 572 895 y depositados en la ATCC bajo PTA-6055; el uno o más hibridoma(s) descritos en la publicación PCT n.° WO 2014/020140 y WO 2005/111082 y depositados en la CNCM el 10 de mayo de 2001, bajo el número 1-2665; el uno o más hibridomas descritos en la patente de los EE.UU. n.° 4 434 156 y depositados en la ATCC bajo HB-8094; el uno o más hibridomas descrito(s) en la patente de los EE.UU. n.° 5648469 y depositados en la ATCC bajo HB-11011 y HB-11010.
Los anticuerpos anti-CD71 y los AB en los anticuerpos activables de la descripción se unen específicamente a una diana CD71, tal como, por ejemplo, CD71 de mamífero y/o CD71 humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos anti-CD71 y los AB que se unen al mismo epítopo de CD71 que un anticuerpo de la descripción y/o un anticuerpo activable activado descrito en esta invención. También se incluyen en la descripción los anticuerpos anti-CD71 y los AB que compiten con un anticuerpo anti-CD71 y/o un anticuerpo activable anti-CD71 activado descrito en esta invención para la unión a una diana CD71, por ejemplo, CD71 humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos anti-CD71 y los AB que compiten de forma cruzada con un anticuerpo anti-CD71 y/o un anticuerpo activable anti-CD71 activado descrito en esta invención para la unión a una diana CD71, por ejemplo, CD71 humano.
Los anticuerpos anti-CD71 activables proporcionados en esta invención incluyen un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, el resto de enmascaramiento es una secuencia de aminoácidos que está acoplada o unida de otro modo al anticuerpo anti-CD71 y se posiciona dentro de la construcción de anticuerpo anti-CD71 activable de modo que el resto de enmascaramiento reduce la capacidad del anticuerpo anti-CD71 para unirse específicamente a CD71. Los restos de enmascaramiento adecuados se identifican usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los restos de enmascaramiento peptídicos se identifican usando los procedimientos descritos en la publicación PCT n.° WO 2009/025846 de Daugherty y col.
Los anticuerpos anti-CD71 activables proporcionados en esta invención incluyen un resto escindible. En algunas realizaciones, el resto escindible incluye una secuencia de aminoácidos que es un sustrato para una proteasa, generalmente una proteasa extracelular. Los sustratos adecuados se identifican usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los sustratos peptídicos se identifican usando los procedimientos descritos en la patente de los EE.UU. n.° 7666 817 de Daugherty y col.; en la patente de los EE.UU. n.° 8563269 de Stagliano y col.; y en la publicación PCT n.° WO 2014/026136 de La Porte y col.,. (Véase también Boulware y col. "Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics". Biotechnol Bioeng. 106.3 (2010): 339-46).
Los sustratos ejemplares incluyen, pero sin limitación, sustratos escindibles por una o más de las siguientes enzimas o proteasas enumeradas en la Tabla 4.
T l 4: Pr nzim m l r
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Los anticuerpos anti-CD71 activables descritos en esta invención superan una limitación de los productos terapéuticos de anticuerpos, particularmente los productos terapéuticos de anticuerpos que se sabe que son tóxicos al menos en cierto grado in vivo. La toxicidad mediada por la diana constituye una limitación importante para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos anti-CD71 activables proporcionados en esta invención están diseñados para abordar la toxicidad asociada con la inhibición de la diana en tejidos normales por anticuerpos terapéuticos tradicionales. Estos anticuerpos anti-CD71 activables permanecen enmascarados hasta que se activan proteolíticamente en el sitio de la enfermedad. Comenzando con un anticuerpo anti-CD71 como anticuerpo terapéutico parental, los anticuerpos anti-CD71 activables de la invención se diseñaron acoplando el anticuerpo a una máscara inhibidora a través de un enlazador que incorpora un sustrato de proteasa.
Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental a la diana.
La Kd del AB modificado con un MM hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10­ 1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000- 10.000.000, 100.000-1.000.000 o 100.000-10.000.000 veces mayor que la Kd del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificado con un MM hacia la diana es al menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000. 000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10­ 10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000- 1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000 o 100.000- 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana.
La constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es generalmente mayor que la Kd del AB hacia la diana. La Kd del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces mayor que la Kd del AB hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del MM hacia el AB es generalmente menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana. La afinidad de unión del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es aproximadamente igual a la Kd del AB hacia la diana. En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del m M hacia el AB no es mayor que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es menor que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es mayor que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que no es mayor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que no es menor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es aproximadamente igual a la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es menor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es mayor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que no es más de 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, o 1.000 veces mayor que la Kd para la unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es entre 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1.000, 20-100, 20-1000 o 100-1.000 veces mayor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es menor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que no es mayor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es aproximadamente igual a la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que no es menor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es mayor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o 1.000 menor que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es entre 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1.000, 20-100, 20-1000 o 100-1.000 veces menor que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es de 2 a 20 veces menor que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, un MM no unido covalentemente al AB y a una concentración equimolar con respecto al AB no inhibe la unión del AB a la diana.
Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental a la diana. En comparación con la unión del AB no modificado con un MM o la unión del AB parental a la diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM puede reducirse en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso un 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
El MM inhibe la unión del AB a la diana. El MM se une al dominio de unión a antígeno del AB e inhibe la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir estéricamente la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir alostéricamente la unión del AB a su diana. En estas realizaciones, cuando el AB se modifica o se acopla a un MM y en presencia de la diana, no hay unión o no hay sustancialmente ninguna unión del AB a la diana, o no más del 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o del 50 % de unión del AB a la diana, en comparación con la unión del AB no modificado con un MM, el AB parental, o el AB no acoplado a un MM a la diana, durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
Cuando un AB está acoplado o modificado por un MM, el MM "enmascara" o reduce o inhibe de otro modo la unión específica del AB a la diana. Cuando un AB está acoplado a, o modificado por un MM, dicho acoplamiento o modificación puede efectuar un cambio estructural que reduce o inhibe la capacidad del AB para unirse específicamente a su diana.
Un AB acoplado a, o modificado con un MM puede representarse mediante las siguientes fórmulas (en orden desde una región terminal amino (N) a una región terminal carboxilo (C):
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
, donde MM es un resto de enmascaramiento, el AB es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, y L es un enlazador. En muchas realizaciones, puede ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en la composición para proporcionar flexibilidad.
En ciertas realizaciones, el MM no es una pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no contiene o sustancialmente no tiene homología con ninguna pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % similar a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 25 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 50 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 20 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 10 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables incluyen un AB que está modificado por un MM y también incluye uno o más restos escindibles (CM). Dichos anticuerpos activables muestran unión activable/conmutable, a la diana del AB. Los anticuerpos activables generalmente incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB), modificado por o acoplado a un resto de enmascaramiento (MM) y un resto modificable o escindible (CM). En algunas realizaciones, el CM contiene una secuencia de aminoácidos que sirve como sustrato para al menos una proteasa.
Los elementos de los anticuerpos activables están dispuestos de manera que el MM y el CM se posicionan de tal forma que, en un estado escindido (o relativamente activo) y en presencia de una diana, el AB se une a una diana, mientras que el anticuerpo activable está en un estado no disuelto (o relativamente inactivo) en presencia de la diana, la unión específica del A b a su diana se reduce o se inhibe. La unión específica del AB a su diana puede reducirse debido a la inhibición o el enmascaramiento de la capacidad del AB para unirse específicamente su diana por el MM.
La Kd del AB modificado con un MM y un CM hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000- 10.000.000, 100.000-1.000.000 o 100.000-10.000.000 veces mayor que la Kd del AB no modificado con un MM y un CM o del AB parental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificado con un MM y un CM hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000. 000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10­ 1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000- 100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000­ 1.000.000 o 100.000-10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM y un CM o del AB parental hacia la diana.
Cuando el AB se modifica con un MM y un CM y está en presencia de la diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo, al menos una proteasa), la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM y un CM o del AB parental a la diana. En comparación con la unión del AB parental o la unión de un AB no modificado con un MM y un CM a su diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM y un CM puede reducirse en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso un 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
Como se usa en esta invención, el término estado escindido se refiere a la condición de los anticuerpos activables después de la modificación del CM por al menos una proteasa. El término estado no escindido, como se usa en esta invención, se refiere a la condición de los anticuerpos activables en ausencia de escisión del CM por una proteasa. Como se ha analizado anteriormente, el término "anticuerpos activables" se usa en esta invención para referirse a un anticuerpo activable tanto en su estado no escindido (nativo) como en su estado escindido. Será evidente para el experto en la materia que, en algunos aspectos, un anticuerpo activable escindido puede carecer de un MM debido a la escisión del CM por una proteasa, dando como resultado la liberación de al menose/MM(por ejemplo, cuando el MM no está unido a los anticuerpos activables por un enlace covalente (por ejemp/o, un enlace disulfuro entre residuos de cisteína).
Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable muestra un primer nivel de unión a una diana cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana en el estado no inhibido, no enmascarado y/o escindido (es decir, una segunda conformación), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión. En general, el acceso de la diana al AB del anticuerpo activable es mayor en presencia de un agente de escisión capaz de escindir el CM, es decir, una proteasa, que en ausencia de dicho agente de escisión. Por lo tanto, cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, se inhibe la unión del AB a la diana y puede enmascararse de la unión a la diana (es decir, la primera conformación es tal que el AB no puede unirse a la diana), y en el estado escindido, el AB no se inhibe o se desenmascara con respecto a la unión a la diana.
El CM y el AB de los anticuerpos activables se seleccionan de manera que el AB represente un resto de unión para una diana dada, y el CM representa un sustrato para una proteasa. En algunos aspectos, la proteasa se colocaliza con la diana en un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico en un sujeto. Como se usa en esta invención, colocalizado se refiere a estar en el mismo sitio o relativamente cerca. En algunos aspectos, una proteasa escinde un CM que produce un anticuerpo activado que se une a una diana situada cerca del sitio de escisión. Los anticuerpos activables descritos en esta invención encuentran un uso particular donde, por ejemplo, una proteasa capaz de escindir un sitio en el CM, es decir, una proteasa, está presente a niveles relativamente más altos en el tejido que contiene la diana de un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico que en el tejido de sitios sin tratamiento (por ejemplo, en tejido sano). En algunos aspectos, un CM de la descripción también se escinde por una o más proteasas. En algunos aspectos, una o más proteasas son las que se localizan conjuntamente con la diana y las que son responsables de la escisión del CM in vivo.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables proporcionan una toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otro modo podrían ser resultado de la unión del AB en sitios sin tratamiento si el AB no se enmascara o se inhibe de otro modo su unión a la diana.
En general, un anticuerpo activable puede diseñarse seleccionando un AB de interés y construyendo el resto del anticuerpo activable de manera que, cuando esté conformacionalmente limitado, el m M proporcione el enmascaramiento del AB o la reducción de la unión del AB a su diana. Se deben tener en cuenta los criterios de diseño estructural para proporcionar esta característica funcional.
Se proporcionan anticuerpos activables que exhiben un fenotipo conmutable de un rango dinámico deseado para la unión a la diana en una conformación inhibida frente a una no inhibida. El rango dinámico generalmente se refiere a una relación de (a) un nivel máximo detectado de un parámetro en un primer conjunto de condiciones con respecto a (b) un valor mínimo detectado de ese parámetro en un segundo conjunto de condiciones. Por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo activable, el rango dinámico se refiere a la relación de (a) un nivel máximo detectado de unión de la proteína diana a un anticuerpo activable en presencia de al menos una proteasa capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables con respecto a (b) un nivel mínimo detectado de unión de la proteína diana a un anticuerpo activable en ausencia de la proteasa. El rango dinámico de un anticuerpo activable puede calcularse como la relación de la constante de disociación de un tratamiento con agente de escisión del anticuerpo activable (porejemplo, enzima) con respecto a la constante de disociación del tratamiento con agente de escisión de anticuerpos activables. Cuanto mayor sea el rango dinámico de un anticuerpo activable, mejor será el fenotipo conmutable del anticuerpo activable. Los anticuerpos activables que tienen valores de rango dinámico relativamente más altos (por ejemplo, mayor de 1) muestran fenotipos conmutables más deseables de tal manera que la unión de la proteína diana por los anticuerpos activablesseproduceenmayor medida (por ejemplo, predominantemente) en presencia de un agente de escisión (por ejemplo, una enzima) capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables que en ausencia de un agente de escisión.
Los anticuerpos activables se pueden proporcionar en una diversidad de configuraciones estructurales. A continuación se proporcionan fórmulas ejemplares para anticuerpos activables. Se contempla específicamente que el orden N a C-terminal del AB, MM y CM puede invertirse dentro de un anticuerpo activable. También se contempla específicamente que el CM y el MM pueden solaparse en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo , de modo que el CM esté contenido dentro del MM.
Por ejemplo, los anticuerpos activables pueden representarse mediante la siguiente fórmula (en orden desde una región terminal amino (N) a una región terminal carboxilo (C):
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
, donde MM es un resto de enmascaramiento, CM es un resto escindible, y AB es un anticuerpo o fragmento del mismo. Cabe señalar que aunque MM y CM están indicados como componentes distintos en las fórmulas anteriores, en todos los aspectos ejemplares (incluidas las fórmulas) descritas en esta invención se contempla que las secuencias de aminoácidos del MM y el CM podrían solaparse, por ejemplo, de modo que el CM esté total o parcialmente contenido dentro del MM. Además, las fórmulas anteriores proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales que pueden posicionarse en el extremo N-terminal o C-terminal con respecto a los elementos de anticuerpos activables.
En ciertas realizaciones, el MM no es una pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no contiene o sustancialmente no tiene homología con ninguna pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % similar a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 50 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 25 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 20 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 10 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB.
En muchos aspectos puede ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en la construcción de anticuerpo activable para proporcionar flexibilidad en una o más de la unión MM-CM, la unión CM-AB, o ambas. Por ejemplo, el AB, MM y/o CM pueden no contener un número suficiente de residuos (por ejemplo, Gly, Ser, Asp, Asn, especialmente Gly y Ser, particularmente Gly) para proporcionar la flexibilidad deseada. Como tal, el fenotipo conmutable de dichas construcciones de anticuerpo activable puede beneficiarse de la introducción de uno o más aminoácidos para proporcionar un enlazador flexible. Además, como se describe a continuación, cuando el anticuerpo activable se proporciona como una construcción conformacionalmente limitada, se puede insertar operativamente un enlazador flexible para facilitar la formación y el mantenimiento de una estructura cíclica en el anticuerpo activable no escindido.
Por ejemplo, en ciertos aspectos, un anticuerpo activable comprende una de las siguientes fórmulas (donde la fórmula a continuación representa una secuencia de aminoácidos en la dirección N a C-terminal o C a N-terminal):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
, donde MM, CM y AB son como se han definido anteriormente; donde L1 y L2 están cada uno independiente y opcionalmente presentes o ausentes, son los mismos o diferentes enlazadores flexibles que incluyen al menos 1 aminoácido flexible (por ejemplo, Gly). Además, las fórmulas anteriores proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales que pueden posicionarse en el extremo N-terminal o C-terminal con respecto a los elementos de anticuerpos activables. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, restos de direccionamiento (por ejemplo, un ligando para un receptor de una célula presente en un tejido diana) y restos que extienden la semivida en suero (porejemplo, polipéptidos que se unen a proteínas séricas, tal como inmunoglobulina (por ejemplo, IgG) o albúmina sérica (porejemplo,albúmina sérica humana (HAS)).
El CM se escinde específicamente por al menos una proteasa a una velocidad de aproximadamente 0,001-1500 x 104 M'1S'1 o al menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 o 1500 x 104 M'1S'1. En algunas realizaciones, el CM se escinde específicamente a una velocidad de aproximadamente 100.000 M'1S'1. En algunas realizaciones, el CM se escinde específicamente a una velocidad de aproximadamente 1x10E2 a aproximadamente 1x10E6 M'1S'1 (es decir, de aproximadamente 1x102 a aproximadamente 1x106 M'1S'1).
Para la escisión específica por una enzima, se establece el contacto entre la enzima y el CM. Cuando el anticuerpo activable que comprende un AB acoplado a un MM y un CM está en presencia de una diana y actividad enzimática suficiente, el CM puede escindirse. Una actividad enzimática suficiente puede referirse a la capacidad de la enzima para entrar en contacto con el CM y realizar la escisión. Se puede prever fácilmente que una enzima puede estar en las proximidades del CM pero no puede escindirse debido a otros factores celulares o modificación de proteínas de la enzima.
Los enlazadores adecuados para su uso en las composiciones descritas en el presente documento generalmente son los que proporcionan flexibilidad del AB modificado o los anticuerpos activables para facilitar la inhibición de la unión del AB a la diana. Dichos enlazadores generalmente se denominan enlazadores flexibles. Los enlazadores adecuados se pueden seleccionar fácilmente y pueden ser de cualquiera de las longitudes adecuadas, tales como de 1 aminoácido (por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluyendo de 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, de 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, de 6 aminoácidos a 8 aminoácidos o de 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, y pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud.
Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 339) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 340), donde n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un enlace neutro entre los componentes. La glicina accede significativamente a más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (véase Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen, pero sin limitación, Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 341), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 342), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 343), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 344), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 345), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 346), y similares. El experto en la materia reconocerá que el diseño de los anticuerpos activables puede incluir enlazadores que sean total o parcialmente flexibles, de modo que el enlazador puede incluir un enlazador flexible, así como una o más porciones que confieran una estructura menos flexible para proporcionar una estructura de los anticuerpos activables deseada.
La descripción también proporciona composiciones y procedimientos que incluyen un anticuerpo anti-CD71 activable que incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a c D71, donde el AB está acoplado a un resto de enmascaramiento (MM) que disminuye la capacidad del AB para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD71 activable incluye además un resto escindible (CM) que es un sustrato para una proteasa. Las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención permiten la unión de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en el AB sin comprometer la actividad (por ejemplo, el enmascaramiento, la activación o la actividad de unión) del anticuerpo anti-CD71 activable. En algunas realizaciones, las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención permiten la unión de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en el AB sin reducir o alterar de otro modo uno o más enlaces disulfuro dentro del MM. Las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención producen un anticuerpo anti-CD71 activable que se conjuga con uno o más agentes, por ejemplo, cualquiera de una variedad de agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o profilácticos, por ejemplo, en algunas realizaciones, sin ninguno de los agentes que se conjugan con el MM del anticuerpo anti-CD71 activable. Las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención producen anticuerpos anti-CD71 activables conjugados en los que el MM conserva la capacidad de enmascarar eficaz y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. Las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención producen anticuerpos anti-CD71 activables conjugados en los que el anticuerpo activable todavía esfáactivado,es decir, escindido, en presencia de una proteasa que puede escindir el CM.
Los anticuerpos anti-CD71 activables tienen al menos un punto de conjugación para un agente, pero en los procedimientos y composiciones que se proporcionan en esta invención están disponibles menos de todos los posibles puntos de conjugación para la conjugación con un agente. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en los enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro intercatenarios. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre involucrados en enlaces de sulfuro intercatenarios, pero no átomos de azufre involucrados en enlaces disulfuro intracatenarios. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre de cisteína u otros residuos de aminoácidos que contienen un átomo de azufre. Dichos residuos pueden aparecer de forma natural en la estructura del anticuerpo o pueden incorporarse al anticuerpo mediante mutagénesis de sitio dirigido, conversión química, o mala incorporación de aminoácidos no naturales.
También se proporcionan procedimientos para preparar un conjugado de un anticuerpo anti-CD71 activable que tiene uno o más enlaces disulfuro intercatenarios en el AB y uno o más enlaces disulfuro intracatenarios en el Mm , y se proporciona un reactivo farmacológico con tioles libres. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial de enlaces disulfuro intercatenarios en el anticuerpo activable con un agente reductor, tal como, por ejemplo, TCEP; y conjugar el reactivo farmacológico con tioles libres con el anticuerpo activable parcialmente reducido. Como se usa en esta invención, el término reducción parcial se refiere a situaciones donde un anticuerpo anti-CD71 activable se pone en contacto con un agente reductor y se reducen menos de todos los enlaces disulfuro, por ejemplo, menos de todos los sitios posibles de conjugación. En algunas realizaciones, se reducen menos del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o menos del 5 % de todos los posibles sitios de conjugación.
En otros aspectos más, se proporciona un procedimiento para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo anti-CD71 activable que da como resultado selectividad en la colocación del agente. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial del anticuerpo anti-CD71 activable con un agente reductor de manera que cualquiera de los sitios de conjugación en el resto de enmascaramiento u otra porción no AB del anticuerpo activable no se reduzca, y la conjugación del agente con tioles intercatenarios en el AB. El uno o más sitios de conjugación se seleccionan para permitir el posicionamiento deseado de un agente para permitir que tenga lugar la conjugación en un sitio deseado. El agente reductor es, por ejemplo, TCEP. Las condiciones de reacción de reducción, tales como, por ejemplo, la relación del agente reductor con respecto al anticuerpo activable, la duración de la incubación, la temperatura durante la incubación, el pH de la solución de reacción de reducción, etc., se determinan identificando las condiciones que producen un anticuerpo activable conjugado en el que el MM conserva la capacidad de enmascarar eficaz y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. La relación del agente reductor con respecto al anticuerpo anti-CD71 activable variará dependiendo del anticuerpo activable. En algunos aspectos, la relación del agente reductor con respecto al anticuerpo anti-CD71 activable estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5 o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
En algunos aspectos, se proporciona un procedimiento para reducir los enlaces disulfuro intercatenarios en el AB de un anticuerpo anti-CD71 activable y conjugar un agente, por ejemplo, un agente que contiene tiol tal como un fármaco, con los tioles intercatenarios resultantes para localizar selectivamente uno o más agentes en el AB. El procedimiento generalmente incluye reducir parcialmente el AB con un agente reductor para formar al menos dos tioles intercatenarios sin formar todos los tioles intercatenarios posibles en el anticuerpo activable; y conjugar el agente con los tioles intercatenarios del AB parcialmente reducido. Por ejemplo, el AB del anticuerpo activable se reduce parcialmente durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 37 °C en una relación deseada de agente reductor:anticuerpo activable. En algunos aspectos, la relación del agente reductor con respecto al anticuerpo activable estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5 o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:1. En algunos aspectos, la relación está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
El reactivo que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína o N-acetilcisteína. El agente reductor puede ser, por ejemplo, TCEP. En algunos aspectos, el anticuerpo activable reducido puede purificarse antes de la conjugación, usando, por ejemplo, cromatografía en columna, diálisis o diafiltración. Como alternativa, el anticuerpo reducido no se purifica después de la reducción parcial y antes de la conjugación.
La invención también proporciona anticuerpos anti-CD71 activables conjugados parcialmente reducidos según la reivindicación 1, en los que al menos un enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo activable se ha reducido con un agente reductor sin alterar ningún enlace disulfuro intracatenario en el anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana CD71 y un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa. El MM se acopla al a B a través del enlazador LP1, el CM y el enlazador LP2. En algunos aspectos, el agente reductor no altera uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del anticuerpo activable. En algunos aspectos, el agente reductor no altera uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del MM en el anticuerpo activable. En algunos aspectos, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM. En algunos aspectos, el agente reductor es TCEP.
En otros aspectos más, un procedimiento para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo anti-CD71 activable que da como resultado selectividad en la colocación del agente al proporcionar un anticuerpo anti-CD71 activable con un número definido y posiciones de residuos de lisina y/o cisteína. En algunos aspectos, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína es mayor o menor que el número de residuos correspondientes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo parental o anticuerpo activable. En algunos aspectos, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína puede dar como resultado un número definido de equivalentes de agente que pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD71 o el anticuerpo anti-CD71 activable. En algunos aspectos, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína puede dar como resultado un número definido de equivalentes de agente que pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD71 o el anticuerpo anti-CD71 activable de una manera específica del sitio. En algunos aspectos, el anticuerpo activable modificado se modifica con uno o más aminoácidos no naturales de una manera específica del sitio, limitando así, en algunos aspectos, la conjugación de los agentes a solo los sitios de los aminoácidos no naturales. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-CD71 o el anticuerpo anti-CD71 activable con un número definido y posiciones de residuos de lisina y/o cisteína pueden reducirse parcialmente con un agente reductor como se analiza en esta invención, de modo que cualquier sitio de conjugación en el resto de enmascaramiento u otra porción no AB del anticuerpo activable no se reduce, y conjugando el agente con los tioles intercatenarios en el AB.
La descripción también proporciona anticuerpos activables parcialmente reducidos en los que al menos un enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo activable se ha reducido con un agente reductor sin alterar ningún enlace disulfuro intracatenario en el anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, por ejemplo, CD71, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana y un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para al menos una proteasa. En algunos aspectos, el MM se acopla al AB a través del CM. En algunos aspectos, el agente reductor no altera uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del anticuerpo activable. En algunos aspectos, el agente reductor no altera uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del MM en el anticuerpo activable. En algunos aspectos, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM. En algunos aspectos, el agente reductor es TCEP.
Los anticuerpos activables descritos en esta invención incluyen un agente conjugado con el anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el agente conjugado es un agente terapéutico, tal como un agente antiinflamatorio y/o antineoplásico. En dichas realizaciones, el agente se conjuga con un resto de carbohidrato del anticuerpo activable, por ejemplo, en algunas realizaciones, donde el resto de carbohidrato se encuentra fuera de la región de unión a antígeno del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con un grupo sulfhidrilo del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, el agente es un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (esdecir, un radioconjugado).
En algunas realizaciones, el agente es un resto detectable tal como, por ejemplo, una etiqueta u otro marcador. Por ejemplo, el agente es o incluye un aminoácido radiomarcado, uno o más restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (ponejemplo,estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante procedimientos ópticos o calorimétricos), uno o más radioisótopos o radionúclidos, uno o más marcadores fluorescentes, uno o más marcadores enzimáticos y/o uno o más agentes quimioluminiscentes. En algunas realizaciones, los restos detectables están unidos por moléculas espaciadoras.
La descripción también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (porejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (esdecir, un radioconjugado). Los agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas y derivados de las mismas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, Dm a F, DMAe). Por ejemplo, el agente es monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 5. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiacepina.
En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina o un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD) unido al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en el presente documento "vc-MMAD". En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE) unida al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-paraaminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en el presente documento "vc-MMAE". En algunas realizaciones, el agente está unido al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD) unido al AB usando un enlazador de maleimida bis-PEG-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en el presente documento "PEG2-vc-MMAD". Las estructuras de vc-MMAD, vc-MMAE y PEG2-vc-MMAD se muestran a continuación:
vc-MMAD:
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vc-MMAE:
PEG2-vc-MMAD:
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La descripción también proporciona anticuerpos activables conjugados que incluyen un anticuerpo activable unido a la carga útil de monometil auristatina D (Mm A d), donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana, y un resto escindible (CM) acoplado al AB, y el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para al menos una MMP proteasa.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado con MMAD puede conjugarse usando cualquiera de varios procedimientos para unir agentes a los AB: (a) unión a los restos de carbohidrato del AB, o (b) unión a grupos sulfhidrilo del AB, o (c) unión a grupos amino del AB, o (d) unión a grupos carboxilato del AB.
En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con una cisteína en el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con una lisina en el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con otro residuo del AB a través de un enlazador, tal como los residuos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador que contiene tiol. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el enlazador se selecciona del grupo que consiste en los enlazadores mostrados en las Tablas 6 y 7. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida caproil-valinacitrulina-para-aminobenciloxicarbonilo. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con el AB usando la tecnología de reducción parcial y de conjugación descrita en esta invención.
En algunas realizaciones, el componente de polietilenglicol (PEG) de un enlazador de la presente descripción se forma a partir de 2 monómeros de etilenglicol, 3 monómeros de etilenglicol, 4 monómeros de etilenglicol, 5 monómeros de etilenglicol, 6 monómeros de etilenglicol, 7 monómeros de etilenglicol 8 monómeros de etilenglicol, 9 monómeros de etilenglicol o al menos 10 monómeros de etilenglicol. En algunas realizaciones de la presente descripción, el componente PEG es un polímero ramificado. En algunas realizaciones de la presente descripción, el componente PEG es un polímero no ramificado. En algunas realizaciones, el componente de polímero PEG se funcionaliza con un grupo amino o derivado del mismo, un grupo carboxilo o derivado del mismo o tanto un grupo amino o derivado del mismo como grupo carboxilo o derivado del mismo.
En algunas realizaciones, el componente PEG de un enlazador de la presente descripción es un grupo amino-tetraetilenglicol-carboxilo o derivado del mismo. En algunas realizaciones, el componente PEG de un enlazador de la presente descripción es un grupo amino-trietilenglicol-carboxilo o derivado del mismo. En algunas realizaciones, el componente PEG de un enlazador de la presente descripción es un grupo amino-di-etilenglicol-carboxilo o derivado del mismo. En algunas realizaciones, un derivado amino es la formación de un enlace amida entre el grupo amino y un grupo carboxilo con el que está conjugado. En algunas realizaciones, un derivado de carboxilo es la formación de un enlace amida entre el grupo carboxilo y un grupo amino con el que está conjugado. En algunas realizaciones, un derivado de carboxilo es la formación de un enlace éster entre el grupo carboxilo y un grupo hidroxilo con el que está conjugado.
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de difteria, los fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricino, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionucleidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 9°Y y 186Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de bis-flúor activo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo (véase el documento WO94/11026).
La Tabla 5 enumera algunos de los agentes farmacéuticos ejemplares que pueden emplearse en la descripción descrita en esta invención, pero de ninguna manera pretende ser una lista exhaustiva.
T l : A n f rm i m l r r n i n A ENTE IT T XI
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Los expertos en la materia reconocerán que se puede acoplar una gran variedad de restos posibles a los anticuerpos resultantes de la descripción. (Véase, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, JM Cruse y RE Lewis, Jr (eds), Carger Press, Nueva York, (1989),).
El acoplamiento se puede lograr mediante cualquier reacción química que se unirá a las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el resto conserven sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. En algunas realizaciones, la unión es, sin embargo, una unión covalente. La unión covalente se puede lograr mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas.
Muchos agentes de unión bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente descripción, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidas en la técnica, sino que es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes. (Véase Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen y col., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta y col., Science 238:1098 (1987).
En algunas realizaciones, además de las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención, el anticuerpo activable conjugado también puede modificarse para la conjugación específica del sitio a través de secuencias de aminoácidos modificadas insertadas o incluidas de otro modo en la secuencia de anticuerpo activable. Estas secuencias de aminoácidos modificadas están diseñadas para permitir la colocación controlada y/o la dosificación del agente conjugado dentro de un anticuerpo activable conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir sustituciones de cisteína en posiciones en las cadenas ligeras y pesadas que proporcionan grupos tiol reactivos y no afectan negativamente al plegamiento y ensamblaje de proteínas, ni alteran la unión al antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se puede diseñar para incluir o de otro modo introducir uno o más residuos de aminoácidos no naturales dentro del anticuerpo activable para proporcionar sitios adecuados para la conjugación. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir o introducir de otro modo secuencias peptídicas enzimáticamente activables dentro de la secuencia de anticuerpo activable.
Los enlazadores adecuados se describen en la bibliografía. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. y col., Cancer Res.
44:201-208 (1984), que describen el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también, la patente de los EE.UU. n.° 5030719, que describe el uso de un derivado de acetilhidrazida halogenada acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico. En algunas realizaciones, los enlazadores adecuados incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfametil-alfa-(2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat n.° 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamido]hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. n.° 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. n.° 24510) conjugado con EDC. Los enlazadores adicionales incluyen, pero sin limitación, SMCC ((succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), SPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio) butanoato) o sulfo-SPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo butanoato).
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen atributos diferentes, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen éster de NHS son menos solubles que los ésteres de sulfo-NHS. Además, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, en general, son menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se escinde in vitro, lo que da como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodimida (tal como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida en solitario.
En algunas realizaciones, los enlazadores son escindibles. En algunas realizaciones, los enlazadores no son escindibles. En algunas realizaciones, están presentes dos o más enlazadores. Los dos o más enlazadores son todos iguales, es decir, escindibles o no escindibles, o los dos o más enlazadores son diferentes, es decir, al menos uno escindible y al menos uno no escindible.
La presente descripción utiliza varios procedimientos para unir agentes a los AB: (a) unión a los restos de carbohidrato del AB, o (b) unión a grupos sulfhidrilo del AB, o (c) unión a grupos amino del AB, o (d) unión a grupos carboxilato del AB. Según la descripción, los AB pueden estar unidos covalentemente a un agente a través de un enlazador intermedio que tiene al menos dos grupos reactivos, uno para reaccionar con el AB y otro para reaccionar con el agente. El enlazador, que puede incluir cualquier compuesto orgánico compatible, se puede elegir de modo que la reacción con el AB (o agente) no afecte negativamente a la reactividad y la selectividad del AB. Además, la unión del enlazador al agente podría no destruir la actividad del agente. Los enlazadores adecuados para la reacción con anticuerpos oxidados o fragmentos de anticuerpos oxidados incluyen aquellos que contienen una amina seleccionada de entre el grupo que consiste en grupos de amina primaria, amina secundaria, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida y tiosemicarbazida. Dichos grupos funcionales reactivos pueden existir como parte de la estructura del enlazador, o pueden introducirse mediante la modificación química adecuada de enlazadores que no contienen dichos grupos.
Según la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a AB reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos reactivos capaces de reaccionar con un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo reducido o fragmento. Dichos grupos reactivos incluyen, pero sin limitación: grupos haloalquilo reactivos (incluyendo, por ejemplo, grupos haloacetilo), grupos p-mercuribenzoato y grupos aptos para reacciones de adición de tipo Michael (incluyendo, por ejemplo, maleimidas y grupos del tipo descrito por Mitra y Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Biol. 101: 3097-3110).
Según la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a Ab ni oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos amino primarios presentes en residuos de lisina no modificados en el Ab. Dichos grupos reactivos incluyen, pero sin limitación, ésteres NHS carboxílicos o carbónicos, ésteres sulfo-NHS carboxílicos o carbónicos, ésteres 4-nitrofenilcarboxílicos o carbónicos, ésteres pentafluorofenilcarboxílicos o carbónicos, acil imidazoles, isocianatos e isotiocianatos.
De acuerdo con la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a Ab ni oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos de ácido carboxílico presentes en los residuos de aspartato o glutamato en el Ab, que se han activado con reactivos adecuados. Los reactivos activadores adecuados incluyen EDC, con o sin NHS o sulfo-NHS añadido, y otros agentes deshidratantes utilizados para la formación de carboxamida. En estos casos, los grupos funcionales presentes en los enlazadores adecuados incluirán aminas primarias y secundarias, hidrazinas, hidroxilaminas e hidrazidas.
El agente puede unirse al enlazador antes o después de que el enlazador se una al AB. En ciertas aplicaciones, puede ser deseable producir primero un intermedio AB-enlazador en el que el enlazador esté libre de un agente asociado. Dependiendo de la aplicación particular, un agente específico puede unirse entonces covalentemente en el enlazador. En algunas realizaciones, el AB se une primero al MM, CM y enlazadores asociados y a continuación se une al enlazador para fines de conjugación.
Enlazadores ramificados: En realizaciones específicas, se utilizan enlazadores ramificados que tienen múltiples sitios para la unión de agentes. Para los enlazadores de sitios múltiples, una unión covalente única a un AB dará como resultado un intermediario AB-enlazador capaz de unirse a un agente en varios sitios. Los sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo o cualquier sitio químico al que se puedan unir agentes.
En algunas realizaciones, se puede lograr una actividad específica más alta (o una relación más alta de agentes con respecto a AB) mediante la unión de un enlazador de sitio único en una pluralidad de sitios en el AB. Esta pluralidad de sitios puede introducirse en el AB por cualquiera de los dos procedimientos. Primero, se pueden generar múltiples grupos aldehído y/o grupos sulfhidrilo en el mismo AB. En segundo lugar, se puede unir a un aldehído o sulfhidrilo del AB un "enlazador ramificado" que tiene múltiples sitios funcionales para su posterior unión a los enlazadores. Los sitios funcionales del enlazador ramificado o del enlazador de múltiples sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo, o puede ser cualquier sitio químico al que se puedan unir los enlazadores. Se pueden obtener actividades específicas aún más altas combinando estas dos estrategias, es decir, uniendo enlazadores de múltiples sitios en varios sitios en el AB.
Enlazadores escindióles: Los enlazadores peptídicos que son susceptibles a la escisión por enzimas del sistema del complemento, tales como, pero sin limitación, activador de plasminógeno tipo u, activador de plasminógeno tisular, tripsina, plasmina u otra enzima que tenga actividad proteolítica pueden usarse en una realización de la presente descripción. Según un procedimiento de la presente descripción, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por complemento. El anticuerpo se selecciona de una clase que puede activar el complemento. Por lo tanto, el conjugado anticuerpo-agente activa la cascada del complemento y libera el agente en el sitio diana. Según otro procedimiento de la presente descripción, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por enzimas que tienen una actividad proteolítica, tal como un activador de plasminógeno tipo u, un activador de plasminógeno tisular, plasmina o tripsina. Estos enlazadores escindibles son útiles en anticuerpos activables conjugados que incluyen una toxina extracelular, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, cualquiera de las toxinas extracelulares mostradas en la Tabla 5.
En la Tabla 6 se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de enlazadores escindibles.
T l : n i nl z r m l r r n i n
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Además, los agentes pueden unirse mediante enlaces disulfuro (por ejemplo, los enlaces disulfuro en una molécula de cisteína) al AB. Dado que muchos tumores liberan naturalmente altos niveles de glutatión (un agente reductor), esto puede reducir los enlaces disulfuro con la posterior liberación del agente en el sitio de administración. En algunos aspectos, el agente reductor que modificaría un CM también modificaría el enlazador del anticuerpo activable conjugado.
Espaciadores y elementos escindióles'. En algunas realizaciones, puede ser necesario construir el enlazador de tal manera que se optimice el espacio entre el agente y el AB del anticuerpo activable. Esto se puede lograr mediante el uso de un enlazador de la estructura general:
W -(CH2)n - Q
donde
W es --NH--CH2-- o --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un número entero de 0 a 20.
En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender un elemento espaciador y un elemento escindible. El elemento espaciador sirve para posicionar el elemento escindible lejos del núcleo del AB de manera que el elemento escindible sea más accesible para la enzima responsable de la escisión. Algunos de los enlazadores ramificados descritos anteriormente pueden servir como elementos espaciadores.
A lo largo de este análisis, debe entenderse que la unión del enlazador al agente (o del elemento espaciador al elemento escindible, o elemento escindible al agente) no necesita ser un modo particular de unión o reacción. Cualquier reacción que proporcione un producto de estabilidad y compatibilidad biológica adecuadas es aceptable. Complemento de suero y selección de enlazadores: Según un procedimiento de la presente descripción, cuando se desea la liberación de un agente, se usa un AB que es un anticuerpo de una clase que puede activar el complemento.
El conjugado resultante conserva tanto la capacidad de unirse al antígeno como la activación de la cascada del complemento. Por lo tanto, según esta realización de la presente descripción, un agente se une a un extremo del enlazador escindible o el elemento escindible y el otro extremo del grupo enlazador se une a un sitio específico en el AB. Por ejemplo, si el agente tiene un grupo hidroxilo o un grupo amino, se puede unir al extremo carboxi de un péptido, aminoácido u otro enlazador adecuadamente elegido a través de un enlace éster o amida, respectivamente. Por ejemplo, dichos agentes pueden unirse al péptido enlazador mediante una reacción de carbodimida. Si el agente contiene grupos funcionales que interferirán con la unión al enlazador, estos grupos funcionales de interferencia pueden bloquearse antes de la unión y desbloquearse una vez que se realiza el producto conjugado o intermedio. A continuación, el extremo opuesto o amino del enlazador se usa directamente o después de una modificación adicional para la unión a un AB que es capaz de activar el complemento.
Los enlazadores (o elementos espaciadores de los enlazadores) pueden tener cualquier longitud deseada, un extremo de los cuales puede unirse covalentemente a sitios específicos en el AB del anticuerpo activable. El otro extremo del enlazador o elemento espaciador puede unirse a un enlazador aminoacídico o peptídico.
Por lo tanto, cuando estos conjugados se unen al antígeno en presencia del complemento, el enlace amida o éster que une el agente al enlazador se escindirá, dando como resultado la liberación del agente en su forma activa. Estos conjugados, cuando se administran a un sujeto, lograrán la administración y liberación del agente en el sitio diana, y son particularmente eficaces para la administración in vivo de agentes farmacéuticos, antibióticos, antimetabolitos, agentes antiproliferativos y similares, como se presentan, pero sin limitación, los de la Tabla 5.
Enlazadores para la liberación sin activación del complemento: En otra aplicación más de administración dirigida, se desea la liberación del agente sin activación del complemento ya que la activación de la cascada del complemento finalmente lisará la célula diana. Por lo tanto, esta estrategia es útil cuando la administración y liberación del agente debe realizarse sin destruir la célula diana. Este es el objetivo cuando se desea la administración de mediadores celulares tales como hormonas, enzimas, corticosteroides, neurotransmisores, genes o enzimas a las células diana. Estos conjugados pueden prepararse uniendo el agente a un AB que no es capaz de activar el complemento a través de un enlazador que es ligeramente susceptible a la escisión por las proteasas séricas. Cuando este conjugado se administra a un individuo, los complejos antígeno-anticuerpo se formarán rápidamente, mientras que la escisión del agente se producirá lentamente, lo que dará como resultado la liberación del compuesto en el sitio diana.
Reticuladores bioquímicos: En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede conjugarse con uno o más agentes terapéuticos usando ciertos reticuladores bioquímicos. Los reactivos de reticulación forman puentes moleculares que unen grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para unir dos proteínas diferentes de forma escalonada, se pueden usar reticuladores heterobifuncionales que eliminen la formación de homopolímeros no deseados.
Los enlazadores de peptidilo escindibles por proteasas lisosómicas también son útiles, por ejemplo, Val-Cit, Val-Ala u otros dipéptidos. Además, pueden usarse enlazadores lábiles a los ácidos escindibles en el entorno de bajo pH del lisosoma, por ejemplo: bis-sialil éter. Otros enlazadores adecuados incluyen sustratos lábiles a catepsina, particularmente aquellos que muestran una función óptima a un pH ácido.
Se hace referencia a reticuladores heterobifuncionales ejemplares en la Tabla 7.
Tabla 7: Reticuladores heterobifuncionales eemplares
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Enlazadores no escindibles o unión directa: En algunas realizaciones de la descripción, el conjugado puede diseñarse de modo que el agente se administre a la diana pero no se libere. Esto puede lograrse uniendo un agente a un AB directamente o mediante un enlazador no escindible.
Estos enlazadores no escindibles pueden incluir aminoácidos, péptidos, D-aminoácidos u otros compuestos orgánicos que pueden modificarse para incluir grupos funcionales que posteriormente pueden utilizarse en la unión a los AB por los procedimientos descritos en esta invención. Una fórmula general para un enlazador orgánico de este tipo podría ser
W -(CH2)n - Q
donde
W es --NH--CH2-- o --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un número entero de 0 a 20.
Conjugados no escindióles'. En algunas realizaciones, un compuesto puede estar unido a los AB que no activan el complemento. Cuando se usan AB que son incapaces de activar el complemento, esta unión se puede lograr usando enlazadores que sean susceptibles de escisión por complemento activado o usando enlazadores que no sean susceptibles de escisión por complemento activado.
Los anticuerpos descritos en esta invención también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y las patentes de los EE.UU. n.° 4485045 y 4544 545. Se describen liposomas con tiempo de circulación potenciado en la patente de los EE. UU. n.° 5013556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente descripción pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro.
Definiciones:
A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente descripción tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la materia. El término "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad. Por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más compuestos. Como tal, los términos "un", "una", "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar indistintamente. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligo- o polinucleótidos descritas en el presente documento se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal descritas en esta invención son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se usan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración y tratamiento de pacientes.
Como se utiliza según la presente descripción, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
Como se usa en esta invención, "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) a un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" o "se une inmunoespecíficamente" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (Kd > 10'6). Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, anticuerpo de dominio, de cadena sencilla, Fab y fragmentos F(ab')2, scFv, y una biblioteca de expresión de Fab.
Se sabe que la unidad estructural de anticuerpo básica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, tales como, IgG1, IgG2, y otras. Además, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en esta invención, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada.
En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los mAb contienen un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única por él.
El término "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión a antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas relativas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de las Secuencias de Kabat de proteínas de interés inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia y col. Nature 342:878-883 (1989).
Como se usa en esta invención, el término "epítopo" incluye cualquier proteína determinante capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de linfocitos T. El término "epítopo" incluye cualquier proteína determinante capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos contra péptidos N-terminales o C-terminales de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 pM; en algunas realizaciones, <10o nM y en algunas realizaciones, <10 nM.
Como se usa en esta invención, los términos "unión específica", "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza, o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se pueden expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, donde una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Uno de estos procedimientos implica medir las velocidades de formación de complejos de sitio de unión a antígeno/antígeno y la disociación, donde esas velocidades dependen de las concentraciones de las parejas de complejos, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Así, tanto la "constante de asociación" (Kas) como la "constante disociación" (Kdis) pueden determinarse mediante el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. (Véase, Nature, 361:186-87 (1993)). La relación de Kdis /Kas permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. Véase, por ejemplo, Davies y col. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.). Se dice que un anticuerpo de la presente descripción se une específicamente a la diana, cuando la constante de unión (Kd) es <1 pM, en algunas realizaciones <100 nM, en algunas realizaciones <10 nM, y en algunas realizaciones <100 pM a aproximadamente 1 pM, según se mide por ensayos tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la materia.
El término "polinucleótido aislado", como se usa en esta invención, significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Los polinucleótidos según la descripción incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en esta invención, y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en esta invención.
El término "proteína aislada" a la que se hace referencia en esta invención significa una proteína de ADNc, ARN recombinante u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de obtención, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza.
El término "polipéptido" se usa en esta invención como un término genérico para referirse a proteínas nativas, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas nativas y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos según la descripción comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en esta invención, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en esta invención, así como las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tal como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.
El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otro modo es de origen natural.
El término "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a las posiciones de los componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión. El término "polinucleótido" al que se hace referencia en el presente documento significa nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenarias y bicatenarias.
El término oligonucleótido al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos entre sí por enlaces oligonucleotídicos de origen natural y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprende una longitud de 200 bases o menos. En algunos aspectos, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y en algunos aspectos, de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son generalmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la descripción son oligonucleótidos de sentido o antisentido.
El término "nucleótidos de origen natural" al que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en esta invención incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" al que se hace referencia en esta invención incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonmidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche, y col., Nucleic Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y col., J. Am. Chem. Soc.
106:6077 (1984), Stein y col., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon, y col., Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon, y col., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec, y col., la patente de los EE.UU. n.° 5 151 510; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si se desea.
Como se usa en esta invención, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a edición, E.S. Golub y D.R. Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales, tales como los aminoácidos a, a-disustituidos, los N-alquil aminoácidos, el ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente descripción. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (porejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptido utilizada en esta invención, la dirección de la izquierda es la dirección del terminal amino y la dirección de la derecha es la dirección del terminal carboxi, según el uso y la convención estándar.
De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5'; la dirección de la izquierda de las secuencias de polinucleótidos bicatenarias se conoce como la dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes se denomina dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que se encuentran 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas arriba", las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en el extremo 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas abajo".
Según se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de hueco predeterminados, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, en algunos aspectos, al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, en algunos aspectos, al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia, y en algunos aspectos, al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia.
En algunos aspectos, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Como se analiza en esta invención, las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o las moléculas de inmunoglobulina se contemplan incluidas por la presente descripción, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos se mantengan al menos al 75 %, en algunos aspectos, al menos al 80 %, 90 %, 95 %, y en algunos aspectos, al 99 %. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados respecto a sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) los aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi alifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante sobre la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional ensayando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en el presente documento. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Los extremos amino y carboxi adecuados de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. En algunos aspectos, se usan procedimientos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas pronosticados que tienen lugar en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen procedimientos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie y col. Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según la descripción.
Las sustituciones de aminoácidos adecuadas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadoras) pueden hacerse en la secuencia natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución conservadora de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que se produce en la secuencia parental, ni alterar otros tipos de la estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton y col. Nature 354:105 (1991).
El término "fragmento de polipéptido", como se usa en esta invención, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi-terminal y/o una o más deleciones internas, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, en algunos aspectos, al menos 14 aminoácidos de longitud, en algunos aspectos, al menos 20 aminoácidos de longitud, generalmente al menos 50 aminoácidos de longitud, y en algunos aspectos, al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo", como se usa en esta invención, se refiere a polipéptidos que están compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene una unión específica a la diana, en condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución conservadora de aminoácidos (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos típicamente tienen al menos 20 aminoácidos de longitud, en algunos aspectos, al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud completa.
El término "agente" se usa en esta invención para representar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos.
Como se usa en esta invención, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (porejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por procedimientos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutica. Se conocen en la técnica y se pueden usar varios procedimientos para marcar polipéptidos y glucoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 9°Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p -galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunos aspectos, los marcadores están unidos por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en esta invención, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Otros términos químicos en esta invención se usan según el uso convencional en la técnica, como se ilustra en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Como se usa en esta invención, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y en algunos aspectos, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, en algunos aspectos, más de aproximadamente el 85 %, el 90 %, el 95 % y el 99 %. En algunos aspectos, la especie objeto se purifica a una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante procedimientos de detección convencionales), donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Los anticuerpos y/o anticuerpos activables de la descripción se unen específicamente a una diana dada, por ejemplo, una proteína diana humana tal como CD71 humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos y/o anticuerpos activables que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos y/o anticuerpos activables descritos en esta invención. También se incluyen en la descripción los anticuerpos y/o anticuerpos activables por anticuerpos que compiten con un anticuerpo anti-CD71 y/o un anticuerpo activable anti-CD71 descrito en el esta invención para unirse a c D71, por ejemplo, CD7l humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos y/o anticuerpos activables por anticuerpos que compiten de forma cruzada con un anticuerpo anti-CD71 y/o un anticuerpo activable anti-CD71 descrito en esta invención para unirse a CD71, por ejemplo, CD71 humano.
Los expertos en la materia reconocerán que es posible determinar, sin demasiada experimentación, si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o humanizado murino) tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal utilizado en los procedimientos descritos en esta invención determinando si el primero evita que el segundo se una a la diana. Si el anticuerpo monoclonal que se está ensayando compite con el anticuerpo monoclonal de la descripción, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal de la descripción, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítopo, o uno estrechamente relacionado. Un procedimiento alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la descripción es preincubar el anticuerpo monoclonal de la descripción con la diana y a continuación añadir el anticuerpo monoclonal que se está ensayando para determinar si el anticuerpo monoclonal que se está ensayando se inhibe en su capacidad de unirse a la diana. Si el anticuerpo monoclonal que se ensaya se inhibe, entonces, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica, o funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal de la descripción.
Anticuerpos activables multiespecíficos
La descripción también proporciona anticuerpos activables anti-CD71 multiespecíficos. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención son anticuerpos multiespecíficos que reconocen CD71 y al menos uno o más antígenos o epítopos diferentes, y que incluyen al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido a al menos un dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico de tal forma que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del dominio de unión a antígeno o epítopo para unirse a su diana. En algunos aspectos, el MM se acopla al dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico a través de un resto escindible (CM) que funciona como un sustrato para al menos una proteasa. Los anticuerpos multiespecíficos activables proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, muestran unión a una diana que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado.
En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo carboxilo de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG o al extremo carboxilo de tanto la cadena pesada como ligera de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo amino de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo amino de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG o al extremo amino de tanto la cadena pesada como ligera de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse a cualquier combinación de uno o más extremos carboxilo y uno o más extremos amino de un anticuerpo activable de IgG. En algunos aspectos, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) se une y enmascara un dominio de unión a antígeno de la IgG. En algunos aspectos, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) se une y enmascara un dominio de unión a antígeno de al menos un scFv. En algunos aspectos, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) se une y enmascara un dominio de unión a antígeno de una IgG, y un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) se une y enmascara un dominio de unión a antígeno de al menos un scFv.
La descripción proporciona ejemplos de estructuras de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen, pero sin limitación, las siguientes: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH * -L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL *-L3-VH * )2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL *-L3-VH *-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH * -L3-VL * -L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL * -L3-VH * -L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH *-L3-VL *-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH *-L3-VL *-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL *-L3-VH *-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL *-L3-VH *-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH *-L3-VL *-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL *-L3-VH * )2: (MM-L1-CM-L2-VH *-L3-VL *-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH *-L3-VL *-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH *-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; o (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, donde: VL y VH representan los dominios variables de cadena ligera y pesada de la primera especificidad, contenidos en la IgG; VL* y VH* representan los dominios variables de la segunda especificidad, contenidos en el scFv; L1 es un péptido enlazador que conecta el resto de enmascaramiento (MM) y el resto escindible (CM); L2 es un péptido enlazador que conecta el resto escindible (CM), y el anticuerpo; L3 es un péptido enlazador que conecta los dominios variables del scFv; L4 es un péptido enlazador que conecta el anticuerpo de la primera especificidad con el anticuerpo de la segunda especificidad; CL es el dominio constante de cadena ligera; y CH1, c H2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada. Las primera y segunda especificidades pueden ser hacia cualquier antígeno o epítopo.
En algunos aspectos de un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a linfocitos T, un antígeno es CD71, y otro antígeno es típicamente un receptor estimulador (también denominado en esta invención como activador) o inhibidor presente en la superficie de un linfocito T, una célula asesina natural (NK), una célula mononuclear mieloide, un macrófago y/u otra célula efectora inmune, tales como, pero sin limitación, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137 (también denominado TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 o VISTA. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de linfocitos T también puede sustituirse por un ligando o dominio de ligando que se une a un receptor de linfocitos T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunes.
En algunos aspectos, el anticuerpo activable multiespecífico contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunos aspectos, el anticuerpo activable multiespecífico puede diseñarse para incluir uno o más enlaces disulfuro.
La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo activable multiespecífico descrito en esta invención, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La descripción proporciona procedimientos para producir un anticuerpo activable multiespecífico cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula comprende tal molécula de ácido nucleico. En algunos aspectos, la célula comprende tal vector.
La descripción también proporciona un procedimiento para fabricar anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción (a) cultivando una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable multiespecífico en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable multiespecífico, y (b) recuperando el anticuerpo activable multiespecífico. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en esta invención.
La descripción también proporciona anticuerpos activables multiespecíficos y/o composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana o un segundo epítopo, donde al menos el AB 1 está acoplado o unido de otro modo a un resto de enmascaramiento (MM1), de modo que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a su diana. En algunos aspectos, el MM1 se acopla a AB1 a través de una primera secuencia de resto escindible (CM1) que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que se colocaliza con la diana de AB1 en un sitio de tratamiento o un sitio de diagnóstico en un sujeto. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, muestran unión a la diana de AB1 que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en esta invención.
La descripción también proporciona composiciones y procedimientos que incluyen un anticuerpo activable multiespecífico que incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una diana y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB2), donde al menos el primer AB en el anticuerpo activable multiespecífico está acoplado a un resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana.
Anticuerpos activables que tienen restos estéricos no ligantes o parejas de unión para restos estéricos no ligantes
La descripción también proporciona anticuerpos activables que incluyen restos estéricos no ligantes (NB) o parejas de unión (BP) para restos estéricos no ligantes, donde el BP recluta o atrae de otro modo el NB al anticuerpo activable. Los anticuerpos activables proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, un anticuerpo activable que incluye un resto estérico no ligante (NB), un enlazador escindible (CL) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (Ab ) que se une a una diana; un anticuerpo activable que incluye una pareja de unión para un resto estérico no ligante (BP), un CL y un AB; y un anticuerpo activable que incluye un BP para el que se ha reclutado un NB, un CL y un AB que se une a la diana. Los anticuerpos activables en los que el NB está unido covalentemente al CL y al AB del anticuerpo activable o está asociado por interacción con un BP que está unido covalentemente al CL y al AB del anticuerpo activable se denominan en esta invención "anticuerpos activables que contienen NB". Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable muestra un primer nivel de unión a una diana cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana cuando el anticuerpo activable está en un estado no inhibido, no enmascarado y/o escindido (es decir, una segunda conformación, es decir, un anticuerpo activado), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión a la diana. Las composiciones de anticuerpos activables pueden mostrar una biodisponibilidad aumentada y una biodistribución más favorable en comparación con los productos terapéuticos de anticuerpos convencionales.
Los anticuerpos activables proporcionan una toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otro modo podrían ser resultado de la unión en sitios sin tratamiento y/o sitios sin diagnóstico si el AB no se enmascara o se inhibe de otro modo de la unión a tal sitio.
Los anticuerpos activables anti-CD71 que incluyen un resto estérico no ligante (NB) pueden prepararse usando los procedimientos expuestos en la publicación PCT n.° WO 2013/192546.
Uso de anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y anticuerpos activables conjugados
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas según la descripción se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan a las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Se pueden encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tal como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente descripción, siempre que el principio activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts". J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell y col. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en los mismos para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Se usan formulaciones terapéuticas de la descripción, que incluyen un anticuerpo anti-CD71 y/o un anticuerpo anti-CD71 activable, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para prevenir, tratar o mejorar de otro modo una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad diana aberrante. Por ejemplo, se usan formulaciones terapéuticas de la descripción, que incluyen un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado, para tratar o mejorar de otro modo un cáncer u otra afección neoplásica, inflamación, un trastorno inflamatorio y/o una enfermedad autoinmune. En algunos aspectos, el cáncer es un tumor sólido o una neoplasia hematológica donde se expresa la diana. En algunas realizaciones, el agente con el que se conjuga el anticuerpo activable es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente con el que se conjuga el anticuerpo activable es un agente que daña el ácido nucleico.
La eficacia de la prevención, mejora o tratamiento se determina en asociación con cualquier procedimiento conocido para diagnosticar o tratar la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad diana, tal como, por ejemplo, la expresión y/o actividad diana aberrante. Prolongar la supervivencia de un sujeto o retrasar de otro modo la progresión de la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad diana, por ejemplo, la expresión y/o actividad diana aberrante, en un sujeto indica que el anticuerpo, anticuerpo conjugado, anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado confiere un beneficio clínico.
Un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado se pueden administrar en forma de composiciones farmacéuticas. Los principios y consideraciones que intervienen en la preparación de dichas composiciones, así como la orientación en la elección de los componentes, se proporcionan, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, y col., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, vol. 4), 1991, M. Dekker, Nueva York.
En algunos aspectos donde se usan fragmentos de anticuerpos, se selecciona el fragmento más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que conserven la capacidad de unirse a la secuencia de proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. (Véase,por ejemplo, Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 90: 7889-7893 (1993)). La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, por ejemplo, en algunos aspectos, aquellas con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. En algunos aspectos, o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el fin deseado.
Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (pat. de los EE.UU. n.° 3773919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
En algunos aspectos, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado contiene un marcador detectable. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmentodel mismo (por ejemplo, Fab, scFv, o F(ab)2). El término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende incluir el marcado directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o el anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcado final de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Por lo tanto, se incluye dentro del uso del término "muestra biológica" la sangre y una fracción o componente de la sangre, incluyendo suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el procedimiento de detección de la descripción se puede usar para detectar un ARNm de analito, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro, así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de un ARNm de analito incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de una proteína de analito incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), Western blots, inmunoprecipitaciones, tinción inmunoquímica e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de un ADN genómico de analito incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos para realizar inmunoensayos se describen, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las técnicas in vivo para la detección de una proteína de analito incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-proteína de analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden detectarse mediante técnicas de imagen estándar.
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción también son útiles en una variedad de formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En un aspecto, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a pacientes que corren el riesgo de desarrollar uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente se puede determinar utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunos aspectos de la descripción, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. Tras el diagnóstico, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado de la descripción también es útil en la detección de una diana en muestras de pacientes y, en consecuencia, son útiles como productos de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos y/o anticuerpos activables, y las versiones conjugadas de los mismos, de la descripción se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA , para detectar niveles de diana en una muestra de paciente.
En una aspecto, un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado de la descripción se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el pocillo o pocillos de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado sirven como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable, y/o las versiones conjugadas de los mismos, con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de leche o albúmina para impedir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que se marca de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel de marcador detectable, y la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba se determina en comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos y anticuerpos activables de la descripción, y las versiones conjugadas de los mismos, en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible determinar la etapa de una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados en varias etapas de la progresión de la enfermedad, y/o en diversos puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada etapa de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada etapa.
Un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado también se pueden usar en procedimientos de diagnóstico y/o de formación de imágenes. En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos in vitro. En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos in vivo.
En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos in situ. En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos activables que tienen un CM escindible enzimáticamente pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunos aspectos, un entorno de potencial de reducción aumentado tal como el que puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una célula o tejido dado de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción aumentado dependiendo de la naturaleza del CM) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede seleccionarse como sustrato para al menos una proteasa encontrada en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, tal como en un absceso, en un órgano y similares), y similares. El AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Usando los procedimientos como se describen en esta invención, o cuando sea apropiado, procedimientos familiares para un experto en la materia, un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente o marcador radiactivo o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo y/o anticuerpo activable. Los marcadores detectables adecuados se analizan en el contexto de los procedimientos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales a continuación. Usando un AB específico para una proteína o péptido de la patología, junto con al menos una proteasa cuya actividad es elevada en el tejido de la enfermedad de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido de la enfermedad en relación con los tejidos donde la enzima específica del CM no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel más bajo que en el tejido de la enfermedad o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las proteínas pequeñas y los péptidos se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y dado que la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles inferiores en tejidos que no son de la enfermedad o está presente en conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido de la enfermedad aumenta en relación con los tejidos que no son de la enfermedad.
En otro ejemplo, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por una enzima, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, donde los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por agente reductor, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos procedimientos, los anticuerpos activables pueden marcarse de manera detectable y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido, tal como un portaobjetos o una perla). El marcador detectable puede posicionarse en una porción del anticuerpo activable que no se libera después de la escisión, por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente inactivado u otro marcador que no sea detectable hasta que se haya producido la escisión. El ensayo se puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos activables inmovilizados, marcados de forma detectable con una muestra que se sospecha que contiene una enzima y/o agente reductor durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la escisión, que se lava a continuación para eliminar el exceso de muestra y contaminantes. La presencia o ausencia del agente de escisión (por ejemplo, enzima o agente reductor) en la muestra se evalúa a continuación mediante un cambio en la señal detectable de los anticuerpos activables antes de entrar en contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia y/o un aumento en la señal detectable debido a la escisión del anticuerpo activable por el agente de escisión en la muestra.
Dichos procedimientos de detección pueden adaptarse para proporcionar también la detección de la presencia o ausencia de una diana que sea capaz de unir el AB de los anticuerpos activables cuando se escinde. Por lo tanto, los ensayos se pueden adaptar para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de una diana de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede detectarse por la presencia y/o un aumento en el marcador detectable de los anticuerpos activables como se ha descrito anteriormente, y la presencia o ausencia de la diana puede detectarse mediante la detección de un complejo diana-AB, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-diana marcado de forma detectable.
Los anticuerpos activables también son útiles en la formación de imágenes in situ para la validación de la activación de anticuerpos activables, porejemplo, por escisión de proteasa, y la unión a una diana particular. La formación de imágenes in situ es una técnica que permite la localización de la actividad proteolítica y la diana en muestras biológicas tales como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar tanto la unión a una diana dada como la actividad proteolítica basándose en la presencia de un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula congelada o tejido derivado de un sitio de enfermedad (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos sanos. Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo activable se marca con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un colorante fluorescente (por ejemplo, un fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), un marcador Alexa Fluor®), un colorante de infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, nanocristales Qdot®), un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación tal como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección del marcador en una muestra que se ha incubado con el anticuerpo activable marcado indica que la muestra contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable. En algunos aspectos, la presencia de la proteasa puede confirmarse usando inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo tal como A11, que es específico para la proteasa matriptasa e inhibe la actividad proteolítica de la matriptasa; véase, por ejemplo, la publicación internacional número WO 2010/129609, publicada el 11 de noviembre de 2010. La misma estrategia del uso de inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente inhibidor más selectivo puede usarse para identificar una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable. En algunos aspectos, la presencia de la diana puede confirmarse usando un agente que es específico para la diana, por ejemplo, otro anticuerpo, o el marcador detectable puede competir con la diana no marcada. En algunos aspectos, podría usarse un anticuerpo activable no marcado, con detección mediante un anticuerpo secundario marcado o un sistema de detección más complejo.
Técnicas similares también son útiles para la formación de imágenes in vivo donde la detección de la señal fluorescente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable.
Estas técnicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de la actividad de proteasa en una variedad de células, tejidos y organismos basados en el CM específico de proteasa en el anticuerpo activable.
La descripción proporciona procedimientos para usar los anticuerpos y/o anticuerpos activables en una variedad de indicaciones de diagnóstico y/o profilácticas. Por ejemplo, la descripción proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y una diana de interés en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado activado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunos aspectos, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra con un anticuerpo activable en presencia de una diana de interés, por ejemplo, la diana, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado activado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del Ab a la diana; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunos aspectos, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable, comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado activado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el marcador detectable se posiciona en el a B. En algunos aspectos, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, un dominio de unión a antígeno (AB) que se une específicamente a la diana y un marcador detectable, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM; donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del Ab a la diana, y en un estado escindido y activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y donde el marcador detectable se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM; y (ii) midiendo un nivel de marcador detectable en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable del marcador detectable en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra, y donde el nivel no detectable del marcador detectable en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunos aspectos, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado (por ejemplo, un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico) descrito en esta invención para su uso en el contacto con un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o la muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se pueden detectar en el sujeto o la muestra biológica.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable en presencia de la diana, y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra biológica a un nivel detectable, de modo que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o la muestra biológica. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activableen un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el marcador detectable está unido al resto de enmascaramiento. En algunos aspectos, el marcador detectable se une al resto N-terminal escindible con respecto al sitio de escisión de la proteasa. En algunos aspectos, se enmascara un único sitio de unión a antígeno del AB. En algunos aspectos donde un anticuerpo de la descripción tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos un sitio de unión a antígeno está enmascarado y al menos un sitio de unión a antígeno no está enmascarado. En algunos aspectos, todos los sitios de unión a antígeno están enmascarados. En algunos aspectos, la etapa de medición incluye el uso de un reactivo secundario que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención para su uso en el contacto de sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable en presencia de la diana, y la medición de un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra biológica a un nivel detectable, de modo que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o la muestra biológica. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activableen un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el marcador detectable está unido al resto de enmascaramiento. En algunos aspectos, el marcador detectable se une al resto N-terminal escindible con respecto al sitio de escisión de la proteasa. En algunos aspectos, se enmascara un único sitio de unión a antígeno del AB. En algunos aspectos donde un anticuerpo de la descripción tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos un sitio de unión a antígeno está enmascarado y al menos un sitio de unión a antígeno no está enmascarado. En algunos aspectos, todos los sitios de unión a antígeno están enmascarados. En algunos aspectos, la etapa de medición incluye el uso de un reactivo secundario que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención para su uso en el contacto con un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o la muestra biológica, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra biológica, de tal forma que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se puede detectar en el sujeto o la muestra biológica, y donde el nivel no detectable del anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra biológica a un nivel detectable.
La descripción proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM, y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no pueden detectarse en el sujeto o la muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: m M-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activableen un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el marcador detectable se posiciona en el a B. En algunos aspectos, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención para su uso en el contacto de un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o la muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no pueden detectarse en el sujeto o la muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM; y (ii) midiendo un nivel de marcador detectable en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable, de tal forma que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: m M-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activableen un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunos aspectos, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunos aspectos, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunos aspectos, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el marcador detectable se posiciona en el a B. En algunos aspectos, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunos aspectos, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión de interés en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención para su uso en el contacto de un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o la muestra biológica, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM, donde un nivel detectable del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana, o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se pueden detectar en el sujeto o la muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %.
En algunos aspectos, la formación de imágenes in situ y/o la formación de imágenes in vivo son útiles en procedimientos para identificar qué pacientes tratar. Por ejemplo, en la formación de imágenes in situ, los anticuerpos activables se usan para cribar muestras de pacientes para identificar a aquellos pacientes que tienen la proteasa o proteasas y la diana o dianas adecuadas en la ubicación apropiada, por ejemplo, en un sitio de tumor.
En algunos aspectos, se usa la formación de imágenes in situ para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que den negativo para cualquiera de o tanto la diana (por ejemplo, la diana) como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunos aspectos, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunos aspectos, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable para el que el paciente dio positivo.
En algunos aspectos, se usa la formación de imágenes in vivo para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asímismo, los pacientes que den negativo podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunos aspectos, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunos aspectos, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable para el que el paciente dio positivo.
En algunos aspectos, se usa un procedimiento o kit para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable anti-diana y/o un anticuerpo activable conjugado (por ejemplo, un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico) de la descripción, seguido de tratamiento mediante la administración de ese anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para las dianas (por ejemplo, la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado que se ensaya en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con dicho anticuerpo y/o tal anticuerpo activable conjugado que comprende tal CM, y a continuación se administra al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado que se ensayó. Asimismo, los pacientes que den negativo para cualquiera de o tanto la diana (por ejemplo, la diana) como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunos aspectos, dichos pacientes pueden analizarse con otro anticuerpo y/o anticuerpo activable conjugado hasta que se identifique un anticuerpo y/o un anticuerpo activable conjugado adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunos aspectos, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado para el que el paciente dio positivo.
En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el AB comprende una secuencia de anticuerpo o de fragmento de anticuerpo que se selecciona de entre las secuencias de anticuerpos de reacción cruzada presentadas en esta invención. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el AB comprende un fragmento Fab, un scFv o un anticuerpo de cadena sencilla (scAb).
En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el agente de escisión es una proteasa que se colocaliza en el sujeto o muestra con la diana y el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para la proteasa, donde la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el CM está acoplado al extremo N-terminal del AB. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el CM está acoplado al extremo C-terminal del AB. En algunos aspectos de estos procedimientos y kits, el CM está acoplado al extremo N-terminal de una cadena VL del AB.
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción se usan en formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En un aspecto, se administra un anticuerpo activable a pacientes que están en riesgo de desarrollar una o más de la inflamación, trastornos inflamatorios, cáncer u otros trastornos mencionados anteriormente.
La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente se puede determinar utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunos aspectos de la descripción, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. Tras el diagnóstico, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción también son útiles en la detección de la diana en muestras de pacientes y, en consecuencia, son útiles como productos de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos, anticuerpos conjugados, los anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar niveles diana en una muestra de paciente.
En un aspecto, un anticuerpo y/o un anticuerpo activable de la descripción se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el pocillo o pocillos de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable sirven como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de leche o albúmina para impedir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que se marca de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel de marcador detectable, y la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba se determina en comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos y/o anticuerpos activables de la descripción en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible determinar la etapa de una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados en varias etapas de la progresión de la enfermedad, y/o en diversos puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada etapa de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada etapa.
También pueden usarse anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados en procedimientos de diagnóstico y/o de formación de imágenes. En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos in vitro. En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos in vivo. En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos in situ. En algunos aspectos, dichos procedimientos son procedimientos ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos activables que tienen un CM escindible enzimáticamente pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunos aspectos, un entorno de potencial de reducción aumentado tal como el que puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una célula o tejido dado de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción aumentado dependiendo de la naturaleza del CM) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede seleccionarse como sustrato de proteasa para una proteasa encontrada en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, tal como en un absceso, en un órgano y similares), y similares. El AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Usando procedimientos familiares para un experto en la materia, un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente o marcador radiactivo o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo activable. Los marcadores detectables adecuados se analizan en el contexto de los procedimientos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales a continuación. Usando un AB específico para una proteína o péptido de la patología, junto con una proteasa cuya actividad es elevada en el tejido de la enfermedad de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido de la enfermedad en relación con los tejidos donde la enzima específica del CM no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel más bajo que en el tejido de la enfermedad o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las proteínas pequeñas y los péptidos se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y dado que la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles inferiores en tejidos que no son de la enfermedad o está presente en conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido de la enfermedad aumenta en relación con los tejidos que no son de la enfermedad.
En otro ejemplo, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por una enzima, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, donde los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por agente reductor, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos procedimientos, los anticuerpos activables pueden marcarse de manera detectable y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido, tal como un portaobjetos o una perla). El marcador detectable puede posicionarse en una porción del anticuerpo activable que no se libera después de la escisión, por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente inactivado u otro marcador que no sea detectable hasta que se haya producido la escisión. El ensayo se puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos activables inmovilizados, marcados de forma detectable con una muestra que se sospecha que contiene una enzima y/o agente reductor durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la escisión, que se lava a continuación para eliminar el exceso de muestra y contaminantes. La presencia o ausencia del agente de escisión (por ejemplo, enzima o agente reductor) en la muestra se evalúa a continuación mediante un cambio en la señal detectable de los anticuerpos activables antes de entrar en contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia y/o un aumento en la señal detectable debido a la escisión del anticuerpo activable por el agente de escisión en la muestra.
Dichos procedimientos de detección pueden adaptarse para proporcionar también la detección de la presencia o ausencia de una diana que sea capaz de unir el AB de los anticuerpos activables cuando se escinde. Por lo tanto, los ensayos se pueden adaptar para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de una diana de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede detectarse por la presencia y/o un aumento en el marcador detectable de los anticuerpos activables como se ha descrito anteriormente, y la presencia o ausencia de la diana puede detectarse mediante la detección de un complejo diana-AB, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-diana marcado de forma detectable.
Los anticuerpos activables también son útiles en la formación de imágenes in situ para la validación de la activación de anticuerpos activables, porejemplo, por escisión de proteasa, y la unión a una diana particular. La formación de imágenes in situ es una técnica que permite la localización de la actividad proteolítica y la diana en muestras biológicas tales como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar tanto la unión a una diana dada como la actividad proteolítica basándose en la presencia de un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula congelada o tejido derivado de un sitio de enfermedad (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos sanos. Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo activable se marca con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un colorante fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), un colorante de infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, nanocristales Qdot®), un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación tal como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección del marcador en una muestra que se ha incubado con el anticuerpo activable marcado indica que la muestra contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable. En algunos aspectos, la presencia de la proteasa puede confirmarse usando inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo tal como A11, que es específico para la proteasa matriptasa e inhibe la actividad proteolítica de la matriptasa; véase, por ejemplo, la publicación internacional número WO 2010/129609, publicada el 11 de noviembre de 2010. La misma estrategia del uso de inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente inhibidor más selectivo puede usarse para identificar una proteasa o clase de proteasas específicas para el CM del anticuerpo activable. En algunos aspectos, la presencia de la diana puede confirmarse usando un agente que es específico para la diana, por ejemplo, otro anticuerpo, o el marcador detectable puede competir con la diana no marcada. En algunos aspectos, podría usarse un anticuerpo activable no marcado, con detección mediante un anticuerpo secundario marcado o un sistema de detección más complejo.
Técnicas similares también son útiles para la formación de imágenes in vivo donde la detección de la señal fluorescente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable.
Estas técnicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de la actividad de proteasa en una variedad de células, tejidos y organismos basados en el CM específico de proteasa en el anticuerpo activable.
En algunos aspectos, la formación de imágenes in situ y/o la formación de imágenes in vivo son útiles en procedimientos para identificar qué pacientes tratar. Por ejemplo, en la formación de imágenes in situ, los anticuerpos activables se usan para cribar muestras de pacientes para identificar a aquellos pacientes que tienen la proteasa o proteasas y la diana o dianas adecuadas en la ubicación apropiada, por ejemplo, en un sitio de tumor.
En algunos aspectos, se usa la formación de imágenes in situ para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que dan negativo para cualquiera o tanto la diana como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se ensaya). En algunos aspectos, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad).
En algunos aspectos, se usa la formación de imágenes in vivo para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que dan negativo se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se está ensayando). En algunos aspectos, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad).
Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción (también denominados en el presente documento "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Dichas composiciones comprenden típicamente el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo.
Los ejemplos adecuados de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5 %. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de las mismas en las composiciones. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.
Una composición farmacéutica de la descripción se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral , por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, una solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En algunos aspectos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se agita y se expectora o se traga. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos, y similares, pueden incluir cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saporífero tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En un aspecto, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etilén vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de los EE.UU. n.° 4522811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en esta invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la descripción se dicta por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de compuestos de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
EJEMPLO 1. Caracterización de los anticuerpos anti-CD71
Los estudios proporcionados en esta invención se diseñaron para evaluar la unión de los anticuerpos anti-CD71 de la descripción.
El anticuerpo monoclonal anti-CD71 M21 de la presente descripción se obtuvo usando tecnología de hibridoma de ratón según técnicas conocidas en la técnica. Los ratones se inmunizaron con el dominio extracelular (ECD) de CD71 humano y los hibridomas subsiguientes se seleccionaron mediante un ensayo piggyback de citotoxicidad, y ELISA confirmó que los clones positivos para citotoxicidad de este ensayo se unían al polipéptido ECD de CD71 humano y se confirmó que se unían a las superficies celulares mediante FACS. El anticuerpo monoclonal anti-CD71 M21 de la presente descripción incluye una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 2, y se usó donde se describe en esta invención como un control positivo.
Se ensayaron los siguientes anticuerpos anti-CD71 humanizados, que se basaron en el anticuerpo monoclonal de ratón M21 anti-CD71: Ab21.10 LcB:HcA (VH de SEQ ID NO: 3 y VL de SEQ ID NO: 7), Ab21.11 LcB:HcB (VH de SEQ ID NO: 4 y VL de SEQ ID NO: 7), Ab21.12 LcB:HcC (VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7), y M21 (VH de SEQ ID NO: 1 y VL de SEQ ID NO: 2). La unión de varios anticuerpos anti-CD71 de la descripción se confirmó mediante FACS (Figura 1).
Como se muestra en la Figura 1, todos los anticuerpos anti-CD71 humanizados mostraron una unión a CD71 humana comparable a la unión demostrada por el anticuerpo de ratón CD71 M21. La unión de los anticuerpos anti-CD71 humanizados se confirmó en la línea celular BxPC3 mediante FACS. Brevemente, las células BxPC3 se marcaron con anticuerpo monoclonal de ratón Mab21 o huCD71 (Ab21.10, Ab21.11 y Ab21.12) en las concentraciones indicadas y, posteriormente, se detectaron con un Alexa Fluor 647 de cabra anti IgG humano o de ratón marcado con Alexa Fluor 647, respectivamente.
EJEMPLO 2. Descubrimiento de máscaras
Los estudios proporcionados en esta invención se diseñaron para identificar y caracterizar restos de enmascaramiento para su uso en anticuerpos anti-CD71 activables de la descripción.
El anticuerpo anti-CD71 21.12, que comprende una VH de SEQ ID NO: 5 y una VL de SEQ ID NO: 7, se usó para cribar una biblioteca de péptidos X15 aleatoria con una diversidad total de 6x10r , donde X es cualquier aminoácido, usando un procedimiento similar al descrito en la publicación internacional PCT número WO 2010/081173, publicada el 15 de julio de 2010. El cribado consistió en una ronda de MACS y cinco rondas de clasificación FACS. La clasificación MACS inicial se realizó con Dynabeads de proteína A (Invitrogen) y el anticuerpo anti-CD71 21.12 a una concentración de 200 nM. Para MACS, aproximadamente 1 x 1012 células se seleccionaron para la unión y se recogieron 1x107 células. Se conjugó anti-CD71 21.12 con DyLight-488 (ThermoFisher), se confirmó la actividad de unión a CD71 y se usó anti-CD71 21.12-488 como sonda fluorescente para todas las rondas de FACS. Las células bacterianas se tiñeron y los clones positivos se recolectaron de la siguiente manera: anti-CD71 21.12-48820 nM con 1^10® células recolectadas en la ronda 1 de FACS, anti-CD71 21.12-488 5nM con 6,2*104 células recolectadas en la ronda 2 de FACS y anti-CD71 21.12-488 5nM con 5*103 células y anti-CD71 21.12-488 1nM con 5*102 células recolectadas en la ronda 3 de FACS, anti-CD71 21.12-488 1nM con > 2*102 células recolectadas en las rondas 4 y 5 de FACS rondas. Se verificó que la población positiva de la segunda ronda de FACS inhibía la unión del anticuerpo anti-CD71 21.12-488 a la proteína CD71 recombinante. Los clones de péptidos individuales se identificaron mediante análisis de secuencia de los aglutinantes 5 nM de la ronda 3 de FACS y los aglutinantes 1 nM de las rondas 3, 4 y 5 de FACS.
Las secuencias de los restos de enmascaramiento anti-CD71 se enumeran en la Tabla A.
Tabla A. Restos de enmascaramiento anti-CD71 MM
Figure imgf000112_0001
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
Figure imgf000118_0002
Las máscaras TF01 y TF02 se truncaron y se llevó a cabo un barrido de alanina para generar familias de anticuerpos activables con diferentes eficacias de enmascaramiento:
Tabla B. Truncamiento barrido de alanina de é tidos de enmascaramiento
Figure imgf000118_0001
Figure imgf000119_0001
Estos péptidos de enmascaramiento se usaron para generar los anticuerpos activables anti-CD71 de la descripción. Las secuencias para algunos de estos anticuerpos activables anti-CD71 se muestran a continuación en la Tabla C. En algunos aspectos, estos anticuerpos activables anti-CD71 incluyen el resto escindible 2001 (ISSGLLSGRSDNH; SEQ ID NO: 406), el resto escindible 3001 (AVGLLAPPGGLSGRSDNH; SEQ ID NO: 412), el resto escindible 2007 (ISSGLLSGRSDIH; SEQ ID NO: 684), el resto escindible 2008 (ISSGLLSGRSDQH; SEQ ID NO: 685), el resto escindible 2011 (ISSGLLSGRSDNP; SEQ ID NO: 688), el resto escindible 2012 (ISSGLLSGRSANP; SEQ ID NO: 689), el resto escindible 2013 (ISSGLLSGRSANI; SEQ ID NO: 690), el resto escindible 3007 (AVGLLAPPGGLSGRSDIH; SEQ ID NO: 692), el resto escindible 3008 (AVGLLAPPGGLSGRSDQH; SEQ ID NO: 693), el resto escindible 3011 (AVGLLAPPGGLSGRSDNP; SEQ ID NO: 696), el resto escindible 3012 (AVGLLAPPGGLSGRSANP; SEQ ID NO: 697) o el resto escindible 3013 (AVGLLAPPGGLSGRSANI; SEQ ID NO: 698), como se indica.
Si bien ciertas secuencias que se muestran a continuación incluyen la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 645, los expertos en la materia aprecian que los anticuerpos anti-CD71 activables de la descripción pueden incluir cualquier secuencia espaciadora adecuada, tal como, por ejemplo, una secuencia espaciadora seleccionada de entre el grupo que consiste en QGQSGQG (SEQ ID NO: 645), QGQSGQ (SEQ ID NO: 424), QGQSG (SEQ ID NO: 646), QGQS (SEQ ID NO: 647), QGQ (SEQ ID NO: 648), QG (SEQ ID NO: 649), GQSGQG (SEQ ID NO: 666), QSGQG (SEQ ID NO: 667), SGQG (SEQ ID NO: 668), GQG (SeQ ID NO: 669), G o Q. En algunos aspectos, los anticuerpos anti-CD71 activables de la descripción no pueden tener una secuencia espaciadora unida a su extremo N-terminal.
Tabla C. Secuencias de anticuerpos activables anti-CD71
HuCD71_HcC-des
Secuencia de aminoácidos
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKFQGR
ATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLITVSSASTKGPSVFPLAPSSK
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYIC
NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 699)
HuCD71_HcC-des
Secuencia de nucleótidos
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCA
AGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCCAGGGCCT
CGAATGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACTCCGAGACAGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGA
GCCACCCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGGAGCGAGG
ACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGAGAGAACTGGGACCCCGGCTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCAC
CCTGATCACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAG
TCCACCTCTGGCGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCG
TGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGG
CCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGC
AACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGA
CCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCC
AAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCC
CACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCA
AGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGA
CTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAG
ACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCACCTAGCCGGGAAG
AGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGT
GGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCTGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCT
CCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGG
C (SEQ ID NO: 700)
HuCD71_HcC
Secuencia de aminoácidos
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKFQGR
ATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLITVSSASTKGPSVFPLAPSSK
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYIC
NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 325)
HuCD71_HcC
Secuencia de nucleótidos
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCA
AGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCCAGGGCCT
CGAATGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACTCCGAGACAGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGA
GCCACCCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGGAGCGAGG
ACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGAGAGAACTGGGACCCCGGCTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCAC
CCTGATCACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAG
TCCACCTCTGGCGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCG
TGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGG
CCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGC
AACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGA
CCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCC
AAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCC
CACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCA
AGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGA
CTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAG
ACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCACCTAGCCGGGAAG
AGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGT
GGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCTGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCT
CCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGG
CAAG (SEQ ID NO: 326)
HuCD71_LcB
Secuencia de aminoácidos
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSG
TDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL
LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 323)
HuCD71_LcB
Secuencia de nucleótidos
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCT
GTTCCGCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCT
GTGGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGC
ACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGC
GGCGGAACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCC
CAGCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTCGTGTGCCTG
CTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCA
ACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGAC
CCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCC
AGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCGGCGAGTGC (SEQ ID NO: 324)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_2001 (SEQ ID NO: 650)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 327)
[espaciador (SEQ ID NO: 662)] [huCD71Lc_TF01_2001 (SEQ ID NO: 651)]
Secuencia de nucleótidos
[CAGGGCCAGTCCGGCCAGGGA][CAGTTCTGCCCTTGGTCCTACTACCTGATCGGCGACTGCGACA
TCGGCGGAGGCTCCTCCGGCGGCTCCATCTCCTCTGGCCTGCTGTCCGGCAGATCCGACAACCACGG
CGGTGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTG
ACAATCACCTGTTCCGCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGG
CCCCCAAGCTGTGGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTC
TGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTAC
TGCCAGCAGCGGCGGAACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCG
TGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGT
CGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG
CAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCT
CCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCA
GGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCGGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 328)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_3001 (SEQ ID NO: 652)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 329)
[espaciador (SEQ ID NO: 662)] [huCD71Lc_TF01_3001 (SEQ ID NO: 653)]
Secuencia de nucleótidos
[CAGGGCCAGTCCGGCCAGGGA][CAGTTCTGCCCTTGGTCCTACTACCTGATCGGCGACTGCGACA
TCGGCGGAGGCTCCTCTGGCGGCTCTGCTGTGGGCCTGCTGGCTCCACCTGGCGGCCTGTCCGGCAG
ATCTGACAACCACGGCGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTG
GGCGACAGAGTGACAATCACCTGTTCCGCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGGTTCCAGCAGA
AGCCCGGAAAGGCCCCCAAGCTGTGGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAG
ATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTC
GCCACCTACTACTGCCAGCAGCGGCGGAACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAA
TCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGAGCGG
CACCGCCAGCGTGGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG
GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCT
ACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGA
AGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC] (SEQ ID
NO: 330)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_2001 (SEQ ID NO: 654)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 331)
[espaciador (SEQ ID NO: 663)] [huCD71Lc_TF02.13_2001 (SEQ ID NO: 655)]
Secuencia de nucleótidos
[CAGGGACAGTCTGGCCAGGGC][AACCTGTGCACCGAGCACTCTGCCGCTCTGGACTGCAGATCCT
ACGGCGGAGGCTCCTCCGGCGGCTCCATCTCCTCTGGCCTGCTGTCCGGCAGATCCGACAACCATGG
CGGCGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTG
ACAATCACCTGTTCCGCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGG
CCCCCAAGCTGTGGATCTACTCCACCAGCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTC
TGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTAC
TGCCAGCAGCGGCGGAACTACCCCTACACCTTCGGACAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCG
TGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGT
GGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG
CAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCT
CCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCA
GGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 332)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_3001 (SEQ ID NO: 656)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 333)
[espaciador (SEQ ID NO: 664)] [huCD71Lc_TF02.13_3001 (SEQ ID NO: 657)]
Secuencia de nucleótidos
[CAGGGCCAGTCTGGACAGGGC][AACCTGTGCACCGAGCACTCTGCCGCTCTGGACTGCAGATCCT
ACGGCGGAGGCTCCTCTGGCGGCTCTGCTGTGGGCCTGCTGGCTCCACCTGGCGGCCTGTCCGGCAG
ATCTGACAACCACGGCGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCTGCCTCCGTG
GGCGACAGAGTGACAATCACCTGTTCCGCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGGTTCCAGCAGA
AGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGTGGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAG
ATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTC
Figure imgf000124_0001
TCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGG
CACCGCCAGCGTGGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG
GACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCT
ACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGA
AGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC] (SEQ ID
NO: 334)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_2001 (SEQ ID NO: 658)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID
NO: 335)
[espaciador (SEQ ID NO: 665)] [huCD71Lc_TF02.18_2001 (SEQ ID NO: 659)]
Secuencia de nucleótidos
[CAGGGCCAGTCTGGCCAGGGC][TGCACCGAGCACAGCTTCGCCCTGGACTGTGGCGGCGGATCCT
CCGGCGGCTCCATCTCCTCTGGCCTGCTGTCCGGCAGATCCGACAACCACGGCGGAGGCTCCGACAT
CCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTTCC
GCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGTGGA
TCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGA
CTACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCGGCGG
AACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCG
TGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAA
CAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCC
CAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGT
CCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCC
CGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 336)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_3001 (SEQ ID NO: 660)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ
ID NO: 337)
[e sp a c ia d o r (S E Q ID NO: 665 )] [hu C D 71 L c_ T F 02.18 _ 3001 (S E Q ID NO: 661)]
S ecu e n c ia de n u c le ó tido s
[CAGGGCCAGTCTGGCCAGGGC][TGCACCGAGCACAGCTTCGCCCTGGACTGTGGCGGCGGATCTT
CTGGCGGCTCTGCTGTGGGCCTGCTGGCTCCTCCTGGCGGCCTGTCCGGCAGATCTGACAACCACGG
CGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACA
ATCACCTGTTCCGCCAGCTCCTCCGTGTACTACATGTACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCC
CCAAGCTGTGGATCTACTCCACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGG
CTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGC
CAGCAGCGGCGGAACTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGG
CCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTGGT
GTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG
TCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCA
CCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGG
CCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 338)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_2012 (SEQ ID NO: 670)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 671)
[espaciador (SEQ ID NO: 674)] [huCD71Lc_TF02.13_2012 (SEQ ID NO: 675)]
Secuencia de nucleótidos
[CAGGGACAGTCAGGCCAGGGC][AATCTCTGCACGGAGCATAGCGCCGCACTTGACTGTCGATCTT
ACGGCGGCGGTTCCTCTGGAGGCTCTATATCATCCGGACTCCTCTCAGGCAGAAGCGCTAATCCTGG
CGGCGGATCTGATATACAAATGACTCAGTCACCAAGCTCCCTGAGTGCGTCAGTTGGTGATAGGGTG
ACGATCACTTGTAGTGCGAGCTCATCTGTTTATTATATGTACTGGTTTCAACAGAAACCCGGAAAAG
CACCTAAGTTGTGGATCTACAGTACCTCCAATCTGGCTTCCGGCGTCCCCAGCCGGTTTTCCGGCTC
TGGAAGCGGAACGGATTACACGCTCACCATATCCTCTATGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTAC
TGTCAGCAACGCAGGAATTATCCATATACATTTGGTCAAGGGACTAAGCTCGAAATCAAGCGTACGG
TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGT
TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC
CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCA
GCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA
GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT] (SEQ ID NO: 676)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_3011 (SEQ ID NO: 672)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 673)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 677 )] [hu C D 71 L c_ T F 02.13 _ 3011 (S E Q ID NO: 678)]
S e cu e n c ia de nu c le ó tido s
[CAAGGGCAGTCCGGTCAAGGG][AACTTGTGTACAGAGCATTCTGCCGCCCTTGACTGCAGGTCTT
ACGGCGGAGGGAGTAGTGGCGGGAGCGCGGTGGGACTTCTGGCACCACCTGGTGGGTTGTCAGGCAG
GAGCGACAATCCAGGGGGGTCAGACATCCAGATGACACAAAGTCCGAGTAGTCTCTCAGCTAGTGTG
GGCGATAGAGTCACAATTACATGTAGTGCGTCCAGTAGCGTGTACTACATGTACTGGTTTCAGCAGA
AGCCGGGCAAAGCACCGAAACTGTGGATTTACAGTACCAGCAACCTCGCCAGCGGTGTTCCCTCTCG
ATTTTCAGGGAGTGGGAGTGGGACCGACTACACGCTCACCATCTCAAGTATGCAGCCAGAAGATTTC
GCTACCTACTATTGCCAGCAGCGGCGGAATTATCCCTACACGTTCGGTCAAGGCACAAAACTGGAAA
TCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGG
AACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTG
GATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT
ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA
AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT] (SEQ ID
NO: 679)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_2011 (SEQ ID NO: 701)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 702)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_3012 (SEQ ID NO: 703)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 704)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_2011 (SEQ ID NO: 705)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID
NO: 706)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [h u C D 71 L c_ T F 02.18 _ 3012 (S E Q ID NO: 707)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ
ID NO: 708)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_2012 (SEQ ID NO: 709)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLE IKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID
NO: 710)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_3011 (SEQ ID NO: 711)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLE IKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ
ID NO: 712)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_NSUB (SEQ ID NO: 715)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 716)
[espaciador (SEQ ID NO: 717)] [huCD71Lc_TF02.13_NSUB (SEQ ID NO: 718)]
Secuencia de nucleótidos
[CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGT][AATTTGTGCACGGAGCATAGTGCAGCTCTGGATTGCCGGAGTT
ATGGAGGTGGCTCGAGCGGAGGCAGCGGAGGTTCAGGCGGGAGCGGTGGGGGGTCAGGAGGTGGCTC
TGGAGGCTCAGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCCCTCTCTGCCAGCGTGGGTGATCGAGTG
ACAATTACATGTTCCGCCTCTTCTAGCGTATACTATATGTACTGGTTTCAGCAGAAACCTGGAAAAG
CCCCCAAACTGTGGATCTATTCTACTAGCAACCTGGCCTCCGGAGTCCCATCCCGGTTCTCTGGCAG
CGGTTCTGGAACCGACTACACTCTGACCATCTCTTCTATGCAACCAGAGGACTTTGCTACTTACTAC
TGTCAACAGAGAAGGAACTATCCTTATACTTTCGGTCAGGGAACTAAGCTGGAAATCAAGCGTACGG
TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGT
TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC
CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCA
GCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA
GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT] (SEQ ID NO: 719) [e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [h u C D 71 L c_ T F 02.18 _ N S U B (S E Q ID NO: 720)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID
NO: 315)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_2007 (SEQ ID NO: 721)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDIHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYST SNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 722)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_2008 (SEQ ID NO: 723)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 724)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_2013 (SEQ ID NO: 725)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 726)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_3007 (SEQ ID NO: 727)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDIHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 728)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.13_3008 (SEQ ID NO: 729)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 730)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [h u C D 71 L c_ T F 02.13 _ 3013 (S E Q ID NO: 731)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 732)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_2007 (SEQ ID NO: 733)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID
NO: 734)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_2008 (SEQ ID NO: 735)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID
NO: 736)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_2013 (SEQ ID NO: 737)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ ID
NO: 738)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_3007 (SEQ ID NO: 739)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ
ID NO: 740)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [h u C D 71 L c_ T F 02.18 _ 3008 (S E Q ID NO: 741)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ
ID NO: 742)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02.18_3013 (SEQ ID NO: 743)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC] (SEQ
ID NO: 744)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_2007 (SEQ ID NO: 745)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 746)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_3007 (SEQ ID NO: 747)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDIHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 748)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_2008 (SEQ ID NO: 749)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 750)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_3008 (SEQ ID NO: 751)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 752)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [hu C D 71 L c_ T F 01 _ 2011 (S E Q ID NO: 753)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG] [QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 754)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_3011 (SEQ ID NO: 755)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 756)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_2012 (SEQ ID NO: 757)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 758)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_3012 (SEQ ID NO: 759)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 760)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_2013 (SEQ ID NO: 761)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 762)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF01_3013 (SEQ ID NO: 763)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 764)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [hu C D 71 L c_ T F 02 _ 2001 (S E Q ID NO: 765)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 766)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_3001 (SEQ ID NO: 767)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 768)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_2007 (SEQ ID NO: 769)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDIHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 770)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_3007 (SEQ ID NO: 771)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDIHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 772)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_2008 (SEQ ID NO: 773)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 774)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [h u C D 71 L c_ T F 02 _ 3008 (S E Q ID NO: 775)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 776)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_2011 (SEQ ID NO: 777)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 778)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_3011 (SEQ ID NO: 779)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 780)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_2012 (SEQ ID NO: 781)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 782)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_3012 (SEQ ID NO: 783)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 784)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [huCD71Lc_TF02_2013 (SEQ ID NO: 785)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 786)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [h u C D 71 L c_ T F 02 _ 3013 (S E Q ID NO: 787)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
(SEQ ID NO: 788)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_2001 (SEQ ID NO: 809)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLS
ASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLT
ISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 810)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_3001 (SEQ ID NO: 811)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 812)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_2001 (SEQ ID NO: 813)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYST SNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 814)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_3001 (SEQ ID NO: 815)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 816)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_2001 (SEQ ID NO: 817)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 818)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_3001 (SEQ ID NO: 819)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 820)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_2012 (SEQ ID NO: 821)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 822)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_3011 (SEQ ID NO: 823)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 824)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_2011 (SEQ ID NO: 825)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYST SNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 826)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_3012 (SEQ ID NO: 827)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 828)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_2011 (SEQ ID NO: 829)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
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[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_3012 (SEQ ID NO: 831)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 832)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_2012 (SEQ ID NO: 833)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 834)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_3011 (SEQ ID NO: 835)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
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[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_NSUB (SEQ ID NO: 837)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 838)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_NSUB (SEQ ID NO: 839)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 840)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_2007 (SEQ ID NO: 841)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDIHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 842)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_2008 (SEQ ID NO: 843)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 844)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_2013 (SEQ ID NO: 845)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
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YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 846)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_3007 (SEQ ID NO: 847)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGSDIQMTQSPSSLSA
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DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 848)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_3008 (SEQ ID NO: 849)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIQMTQSPSSLSA
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DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 850)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.13_3013 (SEQ ID NO: 851)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 852)
[e s p a c ia d o r (S E Q ID NO: 645 )] [do m in io V L h u C D 71 L c_ T F 02.18 _ 2007 (S E Q ID NO: 853)]
S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 854)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_2008 (SEQ ID NO: 855)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 856)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_2013 (SEQ ID NO: 857)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQ
RRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 858)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_3007 (SEQ ID NO: 859)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 860)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_3008 (SEQ ID NO: 861)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 862)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02.18_3013 (SEQ ID NO: 863)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][CTEHSFALDCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATY
YCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 864)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_2007 (SEQ ID NO: 865)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDIHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYST SNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 866)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_3007 (SEQ ID NO: 867)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDIHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 868)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_2008 (SEQ ID NO: 869)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 870)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_3008 (SEQ ID NO: 871)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 872)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_2011 (SEQ ID NO: 873)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 874)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_3011 (SEQ ID NO: 875)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 876)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_2012 (SEQ ID NO: 877)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 878)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_3012 (SEQ ID NO: 879)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 880)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_2013 (SEQ ID NO: 881)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 882)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF01_3013 (SEQ ID NO: 883)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 884)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02_2001 (SEQ ID NO: 885)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG] [NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFAT
YYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 886)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02_3001 (SEQ ID NO: 887)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSFALDCRSYGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPE
DFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 888)
[espaciador (SEQ ID NO: 645)] [dominio VL huCD71Lc_TF02_2007 (SEQ ID NO: 889)]
Secuencia de aminoácidos
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EJEMPLO 3. Generación y caracterización de anticuerpos anti-CD71 activables
Los estudios proporcionados en esta invención se diseñaron para generar anticuerpos anti-CD71 activables de la descripción.
Se generaron anticuerpos activables anti-CD71 con diferentes eficacias de enmascaramiento (es decir, una medición de la capacidad del MM del anticuerpo activable para bloquear la unión del AB del anticuerpo activable a su diana). Los péptidos TF01 y TF02 se mutaron por truncamiento y barrido de alanina como se describe en el Ejemplo 2, y estas variantes de péptidos de enmascaramiento se usaron para generar familias de anticuerpos activables anti-CD71 con un intervalo de eficacias de enmascaramiento.
La unión de los anticuerpos activables anti-CD71 de la presente descripción a la línea celular NC1H292 (también denominada en esta invención como H292) se evaluó usando FACS. Brevemente, las células se marcaron con anticuerpo huCD71 o anticuerpo activable a las concentraciones indicadas y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario anti IgG humano de cabra marcado con Alexa Fluor 647. Como se muestra en la Figura 2, los anticuerpos activables anti-CD71 de la presente descripción muestran un intervalo de eficacias de enmascaramiento en comparación con el anticuerpo anti-CD71 parental (Ab huCD71 21.12).
Como se muestra en la Figura 3A, los conjugados de anticuerpo activable huCD71-fármaco- de la presente descripción se comportan de manera similar a los anticuerpos activables no conjugados y recuperan la actividad de unión del anticuerpo huCD71 tras la activación proteolítica. Este estudio se realizó utilizando el anticuerpo anti-CD71 activable denominado en esta invención huCD71 TF01-2001 conjugado con MMAD a través de un enlazador val-cit (la toxina enlazadora se denomina en esta invención vc-MMAD), y esta construcción de anticuerpo activable incluye la VH de SEQ ID NO: 5, la VL de SEQ ID NO: 7, el MM de SEQ ID NO: 16 y el CM que comprende la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 406). La unión del anticuerpo activable huCD71 TF01-2001 tratado con uPA o intacto conjugado con MMAD a células H292 se evaluó mediante FACS usando un protocolo de marcaje FACS estándar. Un conjugado de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco, también denominado en esta invención "AADC", se activó mediante una incubación durante la noche con uPA. La Figura 3B muestra la capacidad del anticuerpo activable anti-CD71 activado huCD71 TF01-2001 conjugado con MMAD a través de un enlazador val-cit (la toxina enlazadora se denomina en esta invención v-MMAD o vc-MMAD), para matar células in vitro de una manera similar al anticuerpo anti-CD71 21.12-MMAD. Se observaron resultados similares cuando se ensayó un anticuerpo activable conjugado con un agente que daña el ácido nucleico en dichos ensayos de destrucción celular.
Tumores de xenoinjerto H292 fueron tratados con control de isotipo-DM4, ADC huCD71-DM4 y el AADC anticuerpo activable anti-CD71 conjugado huCD71 TF02.13_2001-DM4, que tiene la VH de SEQ ID NO: 5, la VL de SEQ ID NO: 7, el MM de SEQ ID NO: 309 (NLCTEHSAALDCRSY) y el CM que comprende la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 406). Los tumores crecieron hasta un promedio de 150 mm3; a continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis los días 0 y 7 con los artículos de prueba indicados. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 4. Se representa gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada grupo. Tanto el ADC como el AADC inducen regresiones tumorales. Todos los anticuerpos activables conjugados con DM4 descritos en esta invención se produjeron por TCRS (The Chemistry Research Solution).
La Figura 5 es un gráfico que representa los resultados de tumores de xenoinjerto HCC1806 de cáncer de mama tratados con PBS como control y con dos dosis diferentes, 1 mg/kg y 3 mg/kg, del AADC anticuerpo anti-CD71 activable conjugado huCD71 TF02.13-2001-DM4, que tiene la VH de SEQ ID NO: 5, la VL de SEQ ID NO: 7, el MM de SEQ ID NO: 309 (NLCTEHSAALDCRSY) y el CM1 que comprende la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 406). Se representa gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada grupo. La Figura 5 demuestra que los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados de la descripción inducen regresiones tumorales completas en tumores de xenoinjerto HCC1806 de mama a dosis más bajas que las clínicamente relevantes.
La Figura 6A es un gráfico que representa la capacidad del anticuerpo anti-CD71 de la presente descripción (VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7) para unirse a células epiteliales primarias de riñón de mono cynomolgus, con una Kd observada de aproximadamente 3 nM en este estudio ejemplar. En este estudio, la unión del anticuerpo de la presente descripción a las células se realizó utilizando un procedimiento de marcaje FACS estándar. Brevemente, las células se marcaron con el anticuerpo anti-CD71 o control de isotipo (palivizumab) de la presente descripción a las concentraciones indicadas y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario anti IgG humano de cabra marcado con Alexa Fluor 647.
La Figura 6B demuestra que el anticuerpo anti-CD71 huCD71 (VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7) se une a CD71 humano y de mono cynomolgus pero no se une a CD71 de ratón. En este ensayo, el CD71 recombinante del tipo indicado (1 |jg/ml) se absorbió en placas ELISA y posteriormente se incubó con el anticuerpo anti CD71 humano 21.12 a la concentración indicada, seguida y posteriormente detectada con anticuerpo secundario anti-IgG-HRP humano de cabra y detección Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific) utilizando un ensayo y según procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
La Figura 6C es un gráfico que representa la capacidad del anticuerpo anti-CD71 murino muM21 ("Ab CD71 ms") de la presente descripción (VH de SEQ ID NO: 1 y Vl de SEQ ID NO: 2) y el anticuerpo anti-CD71 humanizado Ab21.12 ("Ab CD71 Hu") de la presente descripción (VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7) para unirse a la línea celular BxPC3 derivada de cáncer de páncreas humano, ambas con una Kd observada de aproximadamente 3 nM en este estudio ejemplar. En este estudio, la unión de los anticuerpos de la presente descripción a las células se realizó utilizando un procedimiento de marcaje FACS estándar. Brevemente, las células se marcaron con el anticuerpo anti-CD71 o el anticuerpo de control de isotipo IgGI humano (palivizumab, "Isotipo") de la presente descripción a las concentraciones indicadas y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario anti IgG de ratón o un anticuerpo secundario anti IgG humano de cabra marcado con Alexa Fluor 647.
La Figura 7 es un gráfico que representa que una dosis única de un anticuerpo activable anti-CD71 de la presente descripción demuestra una semivida prolongada en comparación con el anticuerpo parental CD71 cuando se administra en monos cynomolgus. En este estudio, a los monos se les inyectó una dosis única el día 0 a 5 mg/kg del anticuerpo indicado, donde el "anticuerpo CD71" era el anticuerpo anti-CD71 humano 21.12 de la presente descripción, y el "anticuerpo activable CD71" era el anticuerpo activable anti-CD71 humano TF01.2001 de la presente descripción. La cantidad de IgG humana total en el suero de cada mono se ensayó en los días indicados utilizando un ELISA tipo sándwich anti-IgG humana.
Se evaluó la farmacocinética y la tolerabilidad del conjugado de huCD71 TF02.13-2001 y fármaco DM4 en dos monos cynomolgus después de una dosis única de5 mg/kg (Figura 8). Los niveles séricos totales de IgG humana se midieron usando un ELISA de tipo sándwich anti-IgG humana.
Los estudios representados en las Figuras 7, 8 y 9 se realizaron como parte de un estudio de tolerabilidad de 3 semanas (no terminal); dosis única n=2. La FC prolongada del anticuerpo activable intacto que se observó fue consistente con una disminución en la unión al tejido normal. Se detectaron niveles circulantes bajos de anticuerpo activable conjugado activado. El anticuerpo activable conjugado fue bien tolerado a 5 mg/mg. No se observó evidencia de toxicidad dentro o fuera de la diana. No hubo signos clínicos, pérdida de peso, química clínica o hallazgos hematológicos.
La Figura 9 muestra que dos monos cynomolgus que recibieron el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de la descripción (anti-huCD71 TF02.13-2001 DM4) no mostraron evidencia de neutropenia (en base a los recuentos de neutrófilos) o toxicidad hepática (en base a los niveles de alanina transaminasa (ALT) o aspartato transaminasa (AST)).
EJEMPLO 4:Caracterización de la actividad de unión e inhibición del anticuerpo CD71
Este Ejemplo muestra la capacidad de un anticuerpo anti-CD71 de la presente descripción para inhibir la unión de CD71 recombinante a su ligando, la transferrina.
La Figura 10 muestra la unión del ligando de transferrina humana recombinante (Tf) a CD71 humano recombinante en ausencia de anticuerpo anti-CD71 utilizando un ensayo de unión ELISA en fase sólida. En este estudio, se determinó en este ejemplo una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1,6 nM de transferrina para CD71 humano. En este ensayo, CD71 humano recombinante (1 pg/ml) se absorbió en placas ELISA y posteriormente se incubó con la concentración indicada de ligando de transferrina biotinilada, seguido de la detección de la transferrina biotinilada unida usando estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y detección Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific) usando un ensayo y según los procedimientos conocido por los expertos en la materia.
La Figura 11A muestra el efecto sobre la unión entre el ligando de transferrina humana recombinante (Tf) y el CD71 humano recombinante en varias condiciones utilizando un ensayo de unión ELISA en fase sólida, incluida la unión en presencia de un anticuerpo anti-CD71 de la presente descripción. En particular, como se muestra en la Figura 11A, este estudio mostró que un anticuerpo anti-CD71 humanizado de la presente descripción ("CD71Ab21.12") inhibía la unión entre el ligando de transferrina y su receptor CD71 en comparación con un control de isotipo. Los resultados también mostraron que esta inhibición era similar a la inhibición de la unión demostrada por un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD71 humano diferente, comercialmente disponible ("OKT9"). Los resultados también mostraron que ni un anticuerpo policlonal anti-CD71 humano de conejo comercialmente disponible (LS-C334364, LS Bio) ni un control de isotipo inhibieron significativamente la unión de la transferrina a CD71, y que la actividad de unión fue abolida por la adición de una cantidad excesiva de transferrina fría. En este ensayo, la proteína CD71 humana recombinante (1 pg/ml se absorbió en placas ELISA y posteriormente se incubó con 0,6 nM de transferrina biotinilada en presencia de las concentraciones indicadas de anticuerpo o transferrina (donde el anti-CD71 21.12 de la presente descripción tiene VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7) como parte de un ensayo de titulación. La transferrina unida se detectó con HRP conjugada con estreptavidina y detección Ultra TMB usando un ensayo y según los procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
La Figura 11B muestra que el grado de inhibición de la unión de transferrina a CD71 por un anticuerpo monoclonal anti-CD71 conocido (OKT9) es significativamente menor que el grado de inhibición por el anticuerpo anti-CD71 21.12 de la presente descripción. En este ensayo, la proteína CD71 humana recombinante (1 pg/ml) se absorbió en placas ELISA y posteriormente se incubó con 0,6 nM de transferrina biotinilada en presencia de las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-CD71 OKT9 o anticuerpo anti-CD71 21.12 de la presente descripción (teniendo el anti-CD71 21.12 VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7) como parte de un ensayo de titulación. La transferrina unida se detectó con HRP conjugada con estreptavidina y detección Ultra TMB usando un ensayo y según los procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
EJEMPLO 5: Expresión de CD71 en múltiples tumores primarios y metastásicos
Este Ejemplo muestra que CD71 se expresa en una variedad de tipos de tumores primarios y metastásicos mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) usando un anticuerpo anti-CD71.
Las Figuras 12A, 12B y 12C muestran que CD71 se expresa en gran medida en una gran cantidad de muestras de tumores primarios y metastásicos, usando la tinción IHC con un anticuerpo anti-CD71 adquirido comercialmente en múltiples tumores primarios y microarrays de tejido metastásico (TMA). La Figura 12A muestra una tinción IHC de CD71 en cáncer de cuello uterino (1), cáncer de cabeza y cuello (2), un xenoinjerto H292 (3), linfoma no Hodgkin (LNH) en ganglios linfáticos (4), LNH en colon (5) y LNH en el estómago (6). La Figura 12B muestra una tinción IHC de CD71 en un TMA que consiste en núcleos de tumores metastásicos que demostró un nivel de expresión de CD71 de moderado a alto en la mayoría de los núcleos. La Figura 12C muestra un resumen del nivel de tinción IHC de CD71 de un TMA ejemplar que muestra que una gran cantidad de núcleos de metástasis derivados de múltiples fuentes de tejido mostraron una fuerte señal de CD71.
EJEMPLO 6: Eficacia in vivo de anti-CD71-AADC activable en el modelo de xenoinjerto de Raji
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos con toxinas conjugadas (AADC) de la presente descripción son eficaces en un modelo de xenoinjerto de ratón con linfoma no Hodgkin (LNH). Estas eficacias son específicas de los anticuerpos anti-CD71 humanos y son comparables o equivalentes a la eficacia demostrada por un conjugado de anti-CD71 humano-fármaco parental.
La Figura 13A muestra la eficacia de varios conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco en un modelo de xenoinjerto de LNH de ratón, donde los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción (CD71 TF02.18-2001-spdb-DM4, CD71 TF02.13-2001-spdb-DM4 y CD71 TF02.13.3001-spdb-DM4) mostraron una eficacia significativamente mayor que un control de isotipo (palivizumab-spdb-DM4). La figura también muestra que los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción demostraron una eficacia comparable a un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco no enmascarado (CD71 21.12-spdb-DM4). En este estudio, se cultivaron tumores de xenoinjerto Raji de linfoma no Hodgkin (LNH) en ratones hasta un volumen medio de 150 mm3. A continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis los días 1 y 8 de 5 mg/kg de cada artículo de prueba indicado. Se trazó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
La Figura 13B muestra la eficacia de varios conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco en un modelo de xenoinjerto de LNH de ratón, donde los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción (CD71 TF02.18-2001-vc-MMAE y CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE) mostraron una eficacia significativamente mayor que un control de isotipo (palivizumab-vc-MMAE). La figura también muestra que los conjugados de anticuerpo activablefármaco de la presente descripción demostraron una eficacia comparable a un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco no enmascarado (CD71 21.12-vc-MMAE). En este estudio, se cultivaron tumores de xenoinjerto Raji de linfoma no Hodgkin (LNH) en ratones hasta un volumen medio de 150 mm3. A continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis los días 1 y 8 de 3 mg/kg de cada artículo de prueba indicado. Se trazó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
La Figura 13C muestra la eficacia de varios conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco en un modelo de xenoinjerto de LNH de ratón, donde los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción (CD71 TF02.18-2001-vc-MMAD y CD71 TF02.13-3001-vc-MMAD) mostraron una eficacia significativamente mayor que un control de isotipo (palivizumab-vc-MMAD). La figura también muestra que los conjugados de anticuerpo activablefármaco de la presente descripción demostraron una eficacia comparable a un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco no enmascarado (CD71 21.12-vc-MMAD). En este estudio, se cultivaron tumores de xenoinjerto Raji de linfoma no Hodgkin (LNH) en ratones hasta un volumen medio de 150 mm3. A continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis los días 1 y 8 de 0,5 o 1 mg/kg de cada artículo de prueba indicado. Se trazó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
EJEMPLO 7: Tolerabilidad en cynomolgus de anti-CD71-ADC y anti-CD71-AADC activable
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 humanos activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente descripción son bien tolerados en monos cynomolgus en comparación con los ADC anti-CD71 parentales correspondientes en base a una o más lecturas de hematología.
Las Figuras 14A-14G muestran que los conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco (AADC) de la presente descripción demuestran una mayor tolerancia en monos cynomolgus en base a la ausencia de cambios marcados en cada lectura hematológica, en comparación con los monos tratados con dosis altas o bajas del ADC anti-CD71 parental correspondiente. Se observaron los siguientes resultados hematológicos tras el tratamiento de los monos con 5 mg/kg del ADC anti-CD71 parental: una marcada reducción en los glóbulos blancos totales (WBC) con el tratamiento con ADC en dosis altas (Figura 14A), neutropenia grave entre los días 8 y 11 con el tratamiento con ADC en dosis altas y bajas (Figura 14B), una marcada reducción de linfocitos con el tratamiento con ADC en dosis altas (Figura 14C), disminución de los monocitos con el tratamiento con ADC en dosis altas y bajas, con recuperación de monocitos en el animal tratado con dosis bajas el día 11 (Figura 14D), disminución del recuento de glóbulos rojos con ambos tratamientos ADC de dosis alta y baja (RBC) (Figura 14E), una reducción marcada del recuento de hemoglobina (HGB) con el tratamiento con ADC en dosis altas y bajas (Figura 14F) y una reducción marcada de reticulocitos con el tratamiento con ADC en dosis altas y bajas (Figura 14G). Los monos tratados con ADC anti-CD71 mostraron un recuento de plaquetas normal (datos no mostrados). En comparación, los animales tratados con los AADC anti-CD71 activables de la presente descripción no mostraron cambios marcados en todas estas lecturas hematológicas (Figuras 14A-14F). En este estudio, se administró una dosis única de anti-CD71 activable TF02.13-2001-spdb-DM4 ("AADC") de la presente descripción que tiene una relación de fármaco-anticuerpo (DAR) de aproximadamente 3,4 en monos cynomolgus a 5 mg/kg y anti-CD71 21.12-spdb-DM4 ("ADC") de la presente descripción a 5 mg/kg (dosis baja) y 7,5 mg/kg (dosis alta). Los resultados hematológicos se obtuvieron de cada mono en los días indicados del estudio utilizando técnicas y procedimientos conocidos en la técnica.
EJEMPLO 8: Expresión de CD71 y sensibilidad a la citotoxicidad mediada por anti-CD71 en múltiples líneas celulares
Este Ejemplo muestra que CD71 se expresa en altos niveles en muchas líneas celulares derivadas de tumores, y que muchas de estas líneas celulares demostraron sensibilidad a la citotoxicidad dirigida a anti-CD71.
La Figura 15 muestra la máxima unión o expresión relativa de CD71 en las líneas celulares indicadas mediante análisis FACS. La tinción FACS se llevó a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD71 comercialmente disponible, OKT9, seguido de un anticuerpo secundario de cabra anti ratón conjugado con Alexa Fluor 647, con la altura de la barra para una línea celular dada correspondiente a la cantidad relativa de señal derivada de CD71 para esa línea celular. El color de la barra para una línea celular determinada muestra la sensibilidad relativa de la línea celular correspondiente en un ensayo de citotoxicidad in vitro en el que la línea celular se trató con el anticuerpo anti-CD71 21.12 de la presente descripción en presencia de un anticuerpo secundario anti humano conjugado con toxina MMAE. Una línea celular se clasificó como "sensible" si se observaba citotoxicidad con una CE50 inferior a 1 nM. Una línea celular se clasificó como "moderadamente sensible" si la destrucción máxima era inferior al 50 % y la CE50 era superior a 1 nM. Una línea celular se clasificó como "resistente" si se observaba poca o ninguna citotoxicidad.
EJEMPLO 9: Expresión de CD71 en líneas celulares HT29, BxPc3, Fadu y MDA MB 231
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 humanos activables de la presente descripción se unen a CD71 en múltiples líneas celulares con una constante de disociación más alta que la del anticuerpo anti-CD7 humano no enmascarado de la presente descripción, mostrando así el efecto de la máscara en la reducción de la unión antes de la activación.
Las Figuras 16A a 16D muestran la cantidad de unión de los anticuerpos parentales y activables anti-CD71 de la presente descripción a las líneas celulares HT29 (Figura 16A), BxPc3 (Figura 16B), FaDu (Figura 16C) y MDA MB 231 (Figura 16D). En este estudio, la unión de los anticuerpos de la presente descripción a las lineas celulares indicadas se realizó utilizando un procedimiento de marcaje FACS estándar. Brevemente, las células se marcaron con los anticuerpos indicados de la presente descripción: anticuerpo anti-CD71 humano (anticuerpo anti-CD71 Ab21.12 humano, "CD71-Ab") o uno de los dos anticuerpos activables anti-CD71 humano (anti-CD71 TF02.13-3001 humano, "CD71-ActAb 1", o anti-CD71 TF02.18-2001 humano, "CD71-ActAb 2") en las concentraciones indicadas y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario anti IgG humano de cabra marcado con Alexa Fluor 647. La Tabla 14 a continuación muestra las constantes de disociación de equilibrio basadas en las curvas de unión representadas en las Figuras 14A a 14D. Estos resultados muestran que el anticuerpo anti CD71 humano 21.12 (CD71-Ab) se une a todas las líneas celulares con Kd similar (0,39 a 0,81 nM), mientras que la unión de anti-CD71 TF02.13-3001 humano (CD71-ActAb 1) y anti--CD71 TF02.18-2001 humano (CD71-ActAb 2) a las líneas celulares se desplazaron significativamente hacia la derecha (38 a 46 veces), lo que es indicativo de la eficacia de enmascaramiento del resto de enmascaramiento.
Tabla 14: Actividad de unión a CD71 e em lar observada de anti-CD71 activable
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EJEMPLO 10: Citotoxicidad de ADC anti-CD71 en líneas celulares HT29, BxPc3, FaDu y MDA MB 231
Este Ejemplo muestra que los conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco de la presente descripción demuestran una mayor citotoxicidad contra múltiples líneas celulares en comparación con un ADC de control de isotipo.
Las Figuras 17A a 17D muestran que el anticuerpo anti-CD71 humano de la presente descripción conjugado con varias toxinas demuestra una mayor citotoxicidad in vitro contra varias líneas celulares que expresan CD71 en comparación con un ADC de control de isotipo. En este estudio, el anti-CD71 21.12-ADC humano de la presente descripción (conjugado con spdb-DM4, vc-MMAE o vc-MMAD) o un control de isotipo (palivizumab-ADC, conjugado con spdb-DM4, vc-MMAE o vc-MMAD) aplicado a las concentraciones indicadas a Ht 29 (Figura 17A), BxPc3 (Figura 17B), FaDu (Figura 17C) y MDA MB 231 (Figura 17D). La citotoxicidad se determinó como porcentaje de una población de células no tratadas que se usaron como control.
EJEMPLO 11: Citotoxicidad de anti-CD71 activable en células LNH Raji
Este Ejemplo muestra que los conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco (ADC) de la presente descripción demuestran una mayor citotoxicidad contra una línea celular Raji (linfoma no Hodgkin) en comparación con los conjugados de anticuerpo activable anti-CD71 humano-fármaco (AADC) de la presente descripción.
La Figura 18 muestra que los conjugados anti-CD71 21.12-ADC humano-fármaco (ADC) de la presente descripción (conjugados con spdb-DM4, vc-MMAE o vc-MMAD) mostraron una mayor citotoxicidad contra células derivadas de linfoma no Hodgkin de Raji que la de sus correspondientes conjugados anticuerpo activable-fármaco anti-CD71 TF02.18-2001-AADC humano (conjugado con spdb-DM4, vc-MMAE o vc-MMAD) o conjugados anticuerpo activablefármaco anti-CD71 TF02.13-3001-AADC humano (conjugados con spdb-DM4, vc-MMAE o vc-MMAD). Los ADC antiCD71 humanos demostraron una eficacia citotóxica similar entre sí (mostrando una CI50 de ~ 0,1 nM en base a la comparación con una muestra de control) contra la línea celular Raji. En comparación, el conjugado de anticuerpo activable anti-CD71 humano-fármaco (AADC) mostró un efecto citotóxico que es similar o comparable al del control de isotipo-ADC. En este estudio, los diversos conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco y conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción se aplicaron a las concentraciones indicadas a células Raji. La citotoxicidad se determinó como porcentaje de una población de células no tratadas que se usaron como control.
EJEMPLO 12: Ensayo de unión a CD71
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos de la presente descripción demostraron una afinidad de unión cambiada a la proteína CD71 recombinante en comparación con el anticuerpo anti-CD71 parental de la presente descripción.
Como se muestra en los ejemplos representados en la Figura 19, se usó un ensayo de unión en fase sólida para demostrar la unión de los anticuerpos anti-CD71 humanos de la presente descripción. En estos ejemplos, la proteína CD71 humana recombinante (R&D Systems) se recubrió en placas ELISA niqueladas a una concentración de 1 |jg/ml, y a continuación se incubó con la concentración indicada de anticuerpo anti-CD71 ("CD71 21.12") o anticuerpos anti-CD71 activables ("CD71.TF02.13-2001" o "CD71.TF02.18-2001"), donde los anticuerpos activables se ensayaron en su forma no activada proteolíticamente. La cantidad de anticuerpo unido se detectó mediante incubación y detección mediante anticuerpo anti humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante y detección Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific).
Como se muestra en la Figura 19, el ensayo ejemplar demostró que el anticuerpo anti-CD71 21.12 humano se unía con una Kd de ~0,3 nM. Las constantes de unión de los anticuerpos activables anti-CD71 humano TF02.18-2001 y CD71 humano TF02.13-2001 se desplazan hacia la derecha como resultado de sus respectivas eficacias de enmascaramiento (9 y 42 veces respectivamente).
Tabla 15: Actividad de unión a CD71 e em lar observada de anticuer os anti-CD71 activables
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EJEMPLO 13: Eficacia in vivo de anti-CD71-AADC activable en un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de linfoma no Hodgkin
Este Ejemplo muestra que un anticuerpo activable anti-CD71 humano con toxinas conjugadas de la presente descripción (AADC) es eficaz en un modelo de xenoinjerto derivado de un paciente con linfoma no Hodgkin (LNH), y que esta eficacia es comparable o mejor que la observada con un conjugado de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco parental (ADC).
Las Figuras 20A y 20B muestran que usando un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de paciente de tumor primario de linfoma no Hodgkin (LNH), los ratones tratados con un anti-huCD71-AADC activable de la presente descripción mostraron a lo largo del tiempo eficacias que fueron similares o superiores a la de sus respectivos anti-huCD71-ADC de la presente descripción. En este estudio, dos xenoinjertos de LNH derivados de pacientes (marcados como LY2214 y LY0257, Crown Bioscience) se trataron cada uno con un control de isotipo-ADC (palivizumab conjugado con spdb-DM4, "Isotipo-ADC"); anti-huCD71 21.12-ADC activable de la presente descripción conjugado con spdb-DM4 ("CD71-ADC") de la presente descripción; o anti-huCD71 TF02.13.3001 activable de la presente descripción conjugado con spdb-DM4 ("CD71-AADC"). En cada uno de los ejemplos, los xenoinjertos de tumor crecieron hasta un volumen medio de 150 mm3; a continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de 4 y se les administraron dosis los días 1 y 7 de 5 mg/kg de los artículos de prueba indicados. Se representa gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
EJEMPLO 14: Citotoxicidad de anti-CD71-ADC en múltiples líneas celulares derivadas de cáncer colorrectal
Este Ejemplo muestra que los conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco (ADC) de la presente descripción demuestran una mayor citotoxicidad contra múltiples líneas celulares derivadas de cáncer colorrectal (CRC) en comparación con los controles de isotipo-ADC.
Las Figuras 21A - 21H muestran que los conjugados de anticuerpo anti-CD71 21.12 humano-fármaco (ADC) de la presente descripción conjugados con spdb-DM4 o vc-MMAE mostraron una mayor citotoxicidad contra una variedad de líneas celulares derivadas de CRC que la de un isotipo de anticuerpo (chKTI, un anticuerpo quimérico anti-IgG1 humano inhibidor de tripsina de soja) conjugado con spdb-DM4 o vc-MMAE. Las líneas celulares derivadas de CRC que se trataron con los ADC fueron SW1417, SW48, Ls411N, Lovo, HCT116, DLD1, Ls174T y SW480. Los ADC anti-CD71 humanos demostraron una eficacia citotóxica similar entre sí contra las líneas celulares. En este estudio, los diversos conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco de la presente descripción y los conjugados de isotipofármaco se aplicaron a las concentraciones indicadas a las células. La citotoxicidad se determinó como porcentaje de una población de células no tratadas que se usaron como control.
Las Figuras 22A y 22B muestran que los conjugados anti-CD71 21.12-ADC humano-fármaco (ADC) de la presente descripción conjugados con vc-MMAE o vc-MMAD (CD71 21.12-vc-MMAE, CD71 21.12-vc-MMAD) mostraron una mayor citotoxicidad contra células derivadas de CRC HT29 que la de cualquiera de sus correspondientes conjugados anticuerpo activable-fármaco antiCD71 TF02.18-2001-AADC humano conjugados con vc-MMAE o vc-MMAD (CD71 TF02.18-2001-vc-MMAE, CD71 TF02.18-2001-vc-MMAD), un conjugado anticuerpo activable-fármaco anti-CD71 TF02.13-3001-AADC humano conjugado con vc-MMAE o vc-MMAD (CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE, CD71 TF02.13-3001-vc-MMAD), o un control de isotipo (palivizumab-ADC) conjugado con vc-MMAE o vc-MMAD (Isotipo-vc-MMAE, Isotipo-vc-MMAD). En este estudio, los diversos conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco y conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción, así como el isotipo-ADC, se aplicaron a las concentraciones indicadas a células HT29. La citotoxicidad se determinó como porcentaje de una población de células no tratadas que se usaron como control.
EJEMPLO 15: Eficacia in vivo de anti-CD71-AADC activable en el modelo de xenoinjerto de Raji
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos con toxinas conjugadas (AADC) de la presente descripción son eficaces en un modelo de xenoinjerto de ratón con linfoma no Hodgkin (LNH). Estas eficacias son específicas de los anticuerpos anti-CD71 humanos y son comparables o equivalentes a la eficacia demostrada por un conjugado de anti-CD71 humano-fármaco parental.
La Figura 23A muestra la eficacia de varios conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco en un modelo de xenoinjerto de LNH (Raji) de ratón, donde los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción (CD71 TF02.18-2001-spdb-DM4, CD71 TF02.13-2001-spdb-DM4 y CD71 TF02.13.3001-spdb-DM4) mostraron una eficacia significativamente mayor que un control de isotipo (palivizumab-spdb-DM4). La figura también muestra que los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción demostraron una eficacia comparable a un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco no enmascarado (CD71 21.12-spdb-DM4). En este estudio, se cultivaron tumores de xenoinjerto Raji de linfoma no Hodgkin (LNH) en ratones hasta un volumen medio de 150 mm3 A continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis los días 1 y 8 de 5 mg/kg de cada artículo de prueba indicado. Se trazó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
La Figura 23B muestra la eficacia de varios conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco en un modelo de xenoinjerto de LNH (Raji) de ratón, donde los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción (CD71 TF02.18-2001-vc-MMAE y CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE) mostraron una eficacia significativamente mayor que un control de isotipo (palivizumab-vc-MMAE). La figura también muestra que los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción demostraron una eficacia comparable a un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco no enmascarado (CD71 21.12-vc-MMAE). En este estudio, se cultivaron tumores de xenoinjerto Raji de linfoma no Hodgkin (LNH) en ratones hasta un volumen medio de 150 mm3. A continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis los días 1 y 8 de 3 mg/kg de cada artículo de prueba indicado. Se trazó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
EJEMPLO 16: Eficacia in vivo de anti-CD71-AADC activable en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón de células no pequeñas
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos con toxinas conjugadas (AADC) de la presente descripción son eficaces en un modelo de xenoinjerto de ratón de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en un intervalo de dosis. Estas eficacias son específicas de los anticuerpos anti-CD71 humanos y son comparables o equivalentes a la eficacia demostrada por un conjugado de anti-CD71 humano-fármaco parental.
Las Figuras 24A y 24B muestran la eficacia de conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco en un modelo de xenoinjerto de NSCLC de ratón, donde los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción (CD71 TF02.13-3001-spdb-DM4, CD71 TF02.13-2001 -spdb-DM4, CD71 TF01-2001-PEG2-vc-MMAD) a las dosis indicadas (5 mg/kg, 3 mg/kg y 1 mg/kg) mostraron una eficacia significativamente mayor que un control de isotipo (palivizumab-spdb-DM4 o palivizumab-PEG2-vc-MMAD) administrado a una dosis de 5 mg/kg. La figura también muestra que los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción demostraron una eficacia comparable a un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco no enmascarado (CD71 21.12-spdb-DM4 o CD71 21.12-PEG2-vc-MMAD) a una dosis de 5 mg/kg. En este estudio, se cultivaron tumores de xenoinjerto H292 NSCLC en ratones hasta un volumen medio de 150 mm3. A continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis los días 1 y 8 con la cantidad indicada de cada artículo de prueba indicado. Se trazó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
EJEMPLO 17: E ficacia in vivo de anti-CD71-AADC activable en un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma pancreático
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos con toxinas conjugadas (AADC) de la presente descripción son eficaces en un modelo de xenoinjerto de ratón de adenocarcinoma pancreático BxPC3 en un intervalo de dosis. Estas eficacias son específicas de los anticuerpos anti-CD71 humanos y son comparables o equivalentes a la eficacia demostrada por un conjugado de anti-CD71 humano-fármaco parental y/o superior a la eficacia de un ADC de control de isotipo.
La Figura 25 muestra la eficacia de varios conjugados de anticuerpo activable anti-CD71-fármaco en un modelo de xenoinjerto de ratón BxPC3, donde los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción (CD71 TF02.13-2001-spdb-DM4, CD71 TF02.13-3001-spdb-DM4 y CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE) cada uno en las dosis indicadas mostraron una eficacia significativamente mayor que un control de isotipo (palivizumab-spdb-DM4 a 5 mg/kg y palivizumab-vc-MMAE a 3 mg/kg). La figura también muestra que los conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción demostraron una eficacia comparable a un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco no enmascarado (CD71 21.12-spdb-DM4 a 5 mg/kg y CD71 21.12-vc-MMAE a 3 mg/kg). En este estudio, se cultivaron tumores de xenoinjerto BxPC3 en ratones hasta un volumen medio de 150 mm3. A continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se les administraron dosis el día 1 con la cantidad indicada de cada artículo de prueba indicado. Se trazó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
EJEMPLO 18: Eficacia in vivo de anti-CD71-AADC activable en el modelo de xenoinjerto de Raji
Este Ejemplo muestra que un anticuerpo activable anti-CD71 humano con toxinas conjugadas de la presente descripción (AADC) es eficaz en un modelo de xenoinjerto derivado de un paciente con linfoma no Hodgkin (LNH), y que esta eficacia es comparable o mejor que la observada con un conjugado de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco parental (ADC).
Las Figuras 26A y 26B muestran que usando un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de paciente de tumor primario de linfoma no Hodgkin (LNH), los ratones tratados con un anti-huCD71-AADC activable (Cd 71 TF02.13-3001-spdb-DM4 y CD71 TF02.13-3001-vc-MMAD) de la presente descripción mostraron a lo largo del tiempo eficacias que fueron similares o superiores a la de sus respectivos anti-huCD71-ADC de la presente descripción. En este estudio, dos xenoinjertos de LNH derivados de pacientes (marcados como LY2214 y LY0257, Crown Bioscience) se trataron cada uno con un control palivizumab isotipo-ADC conjugado con spdb-DM4 ("Isotipo-spdb-DM4") o vc-MMAD ("Isotipo-vc-MMAD"); conjugados de anticuerpo-fármaco de la presente descripción anti-huCD71 21,12-spdb-DM4 o anti-huCD71 21,12-vc-MMAD; o anticuerpos activables de la presente descripción anti-hu CD71 TF02.13-3001-spdb-DM4 y antihuCD71 TF02.13-3001-vc-MMAD. En cada uno de los ejemplos, los xenoinjertos de tumor crecieron hasta un volumen medio de 150 mm3; a continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de 4 y se les administraron dosis los días 1 y 7 de los artículos de prueba indicados a las dosis indicadas. Se representa gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
EJEMPLO 19: Eficacia in vivo de anti-CD71-AADC activable en un modelo de xenoinjerto derivado del paciente
Este Ejemplo muestra que un anticuerpo activable anti-CD71 humano con toxinas conjugadas de la presente descripción (AADC) es eficaz en varios modelos de xenoinjertos derivados de pacientes, y que esta eficacia es mayor que la de un ADC control de isotipo.
La Figura 27A muestra que usando un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de paciente de un tumor de pulmón (CTG-0166), los ratones tratados con un anti-huCD71-AADC activable (CD71 TF02.13-3001-spdb-DM4) de la presente descripción mostraron a lo largo del tiempo eficacias que fueron superiores a las de su respectivo control de isotipo-ADC (chKTI, un anticuerpo quimérico anti-IgG1 humano inhibidor de tripsina de soja, conjugado con spdb-DM4, "Isotipo-spdb-DM4"). La Figura 27B muestra que usando un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de paciente de un tumor de endometrio (CTG-0774), los ratones tratados con un anti-huCD71-AADC activable (CD71 TF02.13-3001-spdb-DM4) de la presente descripción mostraron a lo largo del tiempo eficacias que fueron superiores a las de su respectivo control de isotipo-ADC (chKTI conjugado con spdb-DM4, "Isotipo-spdb-DM4"). En otro estudio, usando un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de paciente de un tumor de colangiocarcinoma (cáncer de las vías biliares) (CTG-1941), los ratones tratados con un anti-huCD71-AADC activable (CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE-) de la presente descripción mostraron a lo largo del tiempo eficacias que fueron superiores a las de un control de isotipo-ADC (chKTI, un anticuerpo quimérico anti-IgG1 humano inhibidor de tripsina de soja, conjugado con spdb-DM4). En cada uno de los ejemplos, los xenoinjertos de tumor crecieron hasta un volumen medio de 150 mm3; a continuación los ratones se asignaron al azar en grupos de 4 y se les administraron dosis el día 1 con la cantidad indicada para cada uno de los artículos de prueba indicados. Se representa gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
EJEMPLO 20: Ensayo de unión a CD71
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos de la presente descripción demostraron una afinidad de unión cambiada a la proteína CD71 recombinante en comparación con el anticuerpo anti-CD71 parental de la presente descripción.
Como se muestra en los ejemplos representados en la Figura 28, se usó un ensayo de unión en fase sólida para demostrar la unión de los anticuerpos anti-CD71 humanos de la presente descripción. En estos ejemplos, la proteína CD71 humana recombinante (R&D Systems) se recubrió en placas ELISA niqueladas o de cobre a una concentración de 1 |jg/ml y a continuación se incubó con la concentración indicada de anticuerpo anti-CD71 ("CD71 21.12") o anticuerpos anti-CD71 activables ("CD71.TF01--2001", "CD71.TF02-2001", "CD71.TF02.13-2001" o "CD71.TF02.18-2001"), donde los anticuerpos activables se ensayaron en su forma no escindida. La cantidad de anticuerpo unido se detectó mediante incubación y detección mediante anticuerpo anti humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante y detección Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific).
Como se muestra en la Figura 28, el ensayo ejemplar demostró que el anticuerpo anti-CD71 21.12 humano se unía con una Kd de ~0,14 nM. Las constantes de unión de los anticuerpos anti-CD71 activables se desplazan hacia la derecha como resultado de sus respectivas eficacias de enmascaramiento.
T l 1 : A ivi ni n D71 m l r rv n i r n i- D71 iv l
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EJEMPLO 21: Expresión de CD71 en tejidos normales de ser humano y cynomolgus
Este Ejemplo muestra que CD71 se expresa en una gran variedad de tejidos humanos y de cynomolgus normales mediante tinción inmunohistoquímica (iHC) usando un anticuerpo anti-CD71.
La Tabla 17 muestra que CD71 se expresa en ciertas muestras de tejido humano y de cynomolgus normales, usando tinción IHC con un anticuerpo anti-CD71 adquirido comercialmente (mAb IGg anti-CD71 de conejo; D7G9X, Cell Signaling Tech.). La Tabla 17 muestra un resumen del nivel relativo de tinción IHC de CD71 de una variedad de tejidos humanos normales y de cynomolgus incluidos en parafina y fijados en formalina, donde cada signo más ("+") corresponde a un nivel más alto de tinción, y cada signo menos ("-").
T l 17 : En IH l x r i n D71 n i n rm l FFPE
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EJEMPLO 22: Expresión de CD71 en múltiples tumores primarios y metastásicos
Este ejemplo muestra que CD71 se expresa en una gran cantidad y variedad de tumores derivados de pacientes mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) usando un anticuerpo anti-CD71.
La Tabla 18 muestra que CD71 se expresa de forma moderada o alta en una gran cantidad y variedad de muestras tumorales derivadas de pacientes, usando la tinción IHC con un anticuerpo anti-CD71 adquirido comercialmente en múltiples microarrays de tejido tumoral (TMA) derivados de pacientes. La Tabla 18 muestra un resumen del nivel de tinción IHC de CD71 de los TMA que muestra que una gran cantidad de núcleos derivados de múltiples muestras derivadas de pacientes mostraron una fuerte señal de CD71. El número entre paréntesis que sigue a cada tipo de cáncer indica el número de muestras individuales derivadas de pacientes.
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EJEMPLO 23: Ensayo de unión de Fab CD71
Este Ejemplo muestra que un fragmento de unión a antígeno (Fab) anti-CD71 humano de la presente descripción, que se deriva del anticuerpo anti-CD71 humano de la presente descripción, demostró una afinidad de unión a la proteína CD71 recombinante humana y de cynomolgus.
Se generó un fragmento de unión a antígeno Fab mediante la digestión del anticuerpo anti-CD71 21.12 de la presente descripción con la enzima papaína según protocolos conocidos para generar un fragmento Fab anti-CD71. El fragmento Fab anti-CD71 de la presente descripción se ensayó para determinar la unión a la proteína CD71 recombinante humana o de cynomolgus mediante la medición de las velocidades cinéticas de asociación y disociación de una serie de diluciones 1:3 del fragmento Fab a una proteína CD71 recombinante inmovilizada en sustrato (sistema Octet, ForteBio). Las proteínas CD71 recombinantes incluyeron una etiqueta peptídica de hexa-histidina (Hisa), mediante la cual la proteína se inmovilizó en un sustrato que contenía Ni-NTA (ácido nitrilotriacético). Los resultados se muestran en la Tabla 19.
Tabla 19: Cinética de unión de Fab anti-CD71 a CD71 humano c nomol us
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EJEMPLO 24: Histopatología de monos cynomolgus después del tratamiento con ADC
Este Ejemplo describe un estudio en el que un mono cynomolgus tratado con un conjugado de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco (ADC) de la presente descripción demostró anomalías histopatológicas como resultado de la toxicidad del ADC.
A dos monos cynomolgus macho se les administró cada uno una dosis intravenosa única de un ADC de la presente descripción (CD71 21.12-spdb-DM4) a una dosis de 5 mg/kg o 7,5 mg/kg. El espécimen al que se le administró la dosis de 7,5 mg/kg se sacrificó posteriormente el día 11 del estudio a consecuencia de su estado moribundo, y se examinaron sus tejidos. El examen al microscopio óptico de una selección limitada de tejidos reveló lesiones intestinales interrelacionadas prominentes (por ejemplo, ulceración, inflamación, hemorragia, sobrecrecimiento bacteriano y/o exudado fibrinonecrótico en el colon, duodeno y yeyuno). El espécimen también mostró hemorragia pulmonar, necrosis, inflamación y bacterias, sugestivas de bacteriemia secundaria. También se observaron ulceraciones y bacterias en la lengua. También se observó hiperplasia linfoide esplénica marcada.
El estado moribundo del espécimen puede atribuirse, por ejemplo, a las lesiones intestinales fulminantes y extensas, así como a las lesiones sistémicas secundarias (por ejemplo, en el pulmón). El desarrollo de las lesiones intestinales y sistémicas puede atribuirse, por ejemplo, a la marcada depleción mieloide observada en la médula ósea femoral y/o la neutropenia clínicamente observada.
EJEMPLO 25: Expresión de CD71 en líneas celulares H292, HCC1806 y MDA MB 231
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos de la presente descripción y los conjugados de anticuerpo activable anti-CD71 humano-fármaco de la presente descripción se unen a CD71 en múltiples líneas celulares con una constante de disociación más alta que la del anticuerpo anti-CD71 humano no enmascarado de la presente descripción, mostrando así el efecto de la máscara en la reducción de la unión antes de la activación.
Las Figuras 29A, 29B y 29C muestran la cantidad de unión de anticuerpos activables anti-CD71, conjugados de anticuerpo activable-fármaco y anticuerpos parentales de la presente descripción a las líneas celulares MDA MB 231 (Figura 29A), H292 (Figura 29B) y HCC1806 (Figura 29C). En este estudio, la unión de los anticuerpos de la presente descripción a las lineas celulares indicadas se realizó utilizando un procedimiento de marcaje FACS estándar. Brevemente, las células se marcaron con los anticuerpos indicados o anticuerpos activables de la presente descripción: un control de isotipo (palivizumab), anticuerpo CD71 humano (anticuerpo anti-CD71 Ab 21.12 humano), un anticuerpo activable anti-CD71 humano (anti-CD71 TF02.13-2001 humano o anti-CD71 TF02.13-3001 humano). Además, las células también se marcaron con un control ADC de isotipo (palivizumab-vc-MMAE), un conjugado de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco (ADC) de la presente descripción (c D71 Ab21.12-PEG2-vc-MMAD, CD71 Ab 21.12-vc-MMAE o CD71 Ab 21.12-spdb-DM4), o un conjugado de anticuerpo activable-fármaco (AADC) de la presente descripción: CD71 TF02.13-3001-PEG2-vc-MMAD, CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE, CD71 TF02.13-2001-spdb-DM4 o CD71 TF02.13-3001-spdb-DM4) a las concentraciones indicadas y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humano de cabra marcado con Alexa Fluor 647.
La Tabla 20 a continuación muestra las constantes de disociación de equilibrio y los valores de Bmáx en base a las curvas de unión representadas en las Figuras 29A a 29C. Estos resultados muestran que el anticuerpo anti-CD71 humano Ab 21.12 se unió a todas las líneas celulares con Kd similar, mientras que la unión de anticuerpos activables anti-CD71 humano y conjugados de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción a las líneas celulares demostró una Kd significativamente más alta, que es indicativo de la eficacia de enmascaramiento del resto de enmascaramiento en los anticuerpos activables de la presente descripción.
Tabla 20 : Actividad de unión a CD71 e emplar observada de a lutinantes anti-CD71
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EJEMPLO 26:Unión de anticuerpos activables anti-CD71 con sustratos modificados
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 humanos activables de la presente descripción se unen a CD71 en múltiples líneas celulares con una constante de disociación más alta que la del anticuerpo anti-CD7 humano no enmascarado de la presente descripción, mostrando así el efecto de la máscara en la reducción de la unión antes de la activación.
Las Figuras 30A y 30B muestran la cantidad de unión de anticuerpos activables anti-CD71 y anticuerpos parentales de la presente descripción a la línea celular H292. En este estudio, la unión de los anticuerpos de la presente descripción a las lineas celulares indicadas se realizó utilizando un procedimiento de marcaje FACS estándar. Brevemente, las células se marcaron con los anticuerpos indicados o anticuerpos activables de la presente descripción: un control de isotipo (palivizumab), anticuerpo CD71 humano (anti-CD71 Ab 21.12 humano), un anticuerpo activable anti-CD71 humano (anti-CD71 humano TF02. 13-3001, TF02.13-3007, TF02.13-3008, TF02.13-3011, TF02.13-3012, TF02.13-3013, TF02.13-2001, TF02.13-2007, TF02.13-2008, TF02.13-2011, TF02.13-2012, TF02.13-2013), donde los anticuerpos activables se ensayaron en su forma no escindida. Estos anticuerpos activables incluyen la cadena ligera de la secuencia correspondientemente nombrada enumerada anteriormente en la Tabla C. Las células se marcaron con el artículo de prueba indicado en las concentraciones indicadas y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humano de cabra marcado con Alexa Fluor 647.
Las Figuras 30C y 30C muestran la cantidad de unión de anticuerpos activables anti-CD71 y anticuerpos parentales de la presente descripción a CD71 humano en un ensayo de unión ELISA en fase sólida. En estos ejemplos, la proteína CD71 humana recombinante (R & D Systems) se cubrió con placas ELISA de cobre o niqueladas a una concentración de 1 |jg/ml, y a continuación se incubó con la concentración indicada de un anticuerpo anti-CD71 (anti-CD71 Ab 21.12 humano) o un anticuerpo anti-CD71 activable (anti--CD71 humano TF02.13-3001, TF02.13-3007, TF02.13-3008 TF02.13-3011, TF02.13-3013, TF02.13-2001, TF02.13-2007, TF02.13-2008, TF02.13-2011, TF02.13-2012, TF02.13-2013), donde en los anticuerpos activables se ensayaron en su forma no escindida. La cantidad de anticuerpo unido se detectó mediante incubación y detección mediante anticuerpo anti humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante y detección Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific).
La Tabla 21 a continuación muestra las constantes de disociación de equilibrio en base a las curvas de unión representadas en las Figuras 30A a 30D. Estos resultados muestran que los anticuerpos activables anti-CD71 humanos y los conjugados de anticuerpo activable-fármaco se unen a la línea celular y al CD71 unido en fase sólida con una afinidad significativamente menor que la del anticuerpo anti-CD71 parental, lo que es indicativo de la eficacia de enmascaramiento del resto de enmascaramiento.
Tabla 21: Actividad de unión a CD71 e emplar observada de a lutinantes anti-CD71
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EJEMPLO 27: Citotoxicidad de anti-CD71-AADC y ADC en líneas celulares derivadas de cáncer de piel y pulmón
Este Ejemplo muestra que los conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco (ADC) y los conjugados de anticuerpo activable-fármaco (AADC) de la presente descripción demuestran una mayor citotoxicidad contra un adenocarcinoma de pulmón y líneas celulares derivadas de carcinoma de células escamosas de piel en comparación con los controles de isotipo-ADC.
Las Figuras 31A - 31J muestran que los conjugados de anticuerpo activable-fármaco (AADC) de la presente descripción conjugados con PEG2-vc-MMAD o vc-MMAE mostraron una citotoxicidad más baja contra una variedad de líneas celulares derivadas de cáncer que la de un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fárma correspondientemente conjugado. Las líneas celulares derivadas del cáncer que se trataron con ADC o AADC se derivaron de un carcinoma de células escamosas de piel (A431, Figura 31A y 31B), un adenocarcinoma de pulmón (A549, Figura 31C y 31D), un carcinoma de hipofaringe (FaDu, Figura 31E y 31F), un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NCI-H292, Figura 31G y 31H) y un adenocarcinoma pancreático (BxPC3, Figura 31I y 31J).
Los ADC anti-CD71 humanos demostraron una eficacia citotóxica similar entre sí contra las líneas celulares. Los AADC anti-CD71 humanos demostraron una menor eficacia que los ADC anti-CD71 parentales, lo que puede atribuirse al efecto de enmascaramiento del resto de enmascaramiento. En este estudio, los diversos a Dc o AADC anti-CD71 humanos (TF02.13-3001 o TF02.18-2001 conjugados con el fármaco indicado) de la presente descripción y los conjugados de isotipo-fármaco se aplicaron a las células en las concentraciones indicadas. La citotoxicidad se determinó como porcentaje de una población de células no tratadas que se usaron como control.
EJEMPLO 28: Citotoxicidad de ADC anti-CD71 en varias líneas celulares derivadas de cáncer
Este Ejemplo muestra que los conjugados de anticuerpo anti-CD71 humano-fármaco (ADC) de la presente descripción demuestran una citotoxicidad significativa contra una variedad de líneas celulares derivadas de cáncer.
La Tabla 23 muestra las CE50 observadasde un conjugado de anticuerpo anti-CD71-fármaco (ADC) de la presente descripción conjugado con vc-MMAE. En este estudio, el anti-CD71 Ab 21-12-vc-MMAE humano de la presente descripción se aplicó en un intervalo de concentraciones a las células indicadas. La citotoxicidad se determinó como porcentaje de una población de células no tratadas que se usaron como control, y se calculó una CE50 en base a la curva de citotoxicidad observada.
T l 2 : i xi i E n i- D71-v -MMAE
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EJEMPLO 29: Expresión de CD71 en líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas
Este Ejemplo muestra que los conjugados de anticuerpo-fármaco y anticuerpos CD71 de la presente descripción se unen a CD71 en múltiples líneas celulares de cáncer de pulmón pequeño (SCLC) de manera esencialmente equivalente y específica como se muestra por la falta de unión de un control de isotipo o ADC de control de isotipo.
Las Figuras 32A y 32B y la Tabla 24 muestran la cantidad de unión de anticuerpos anti-CD71 y ADC de la presente descripción a las líneas celulares de SCLC DMS 79 y DMS 153. En este estudio, la unión de los anticuerpos y los ADC de la presente descripción a las lineas celulares indicadas se realizó utilizando un procedimiento de marcaje FACS estándar. Brevemente, las células se marcaron a las concentraciones indicadas con los anticuerpos indicados de la presente descripción: anticuerpo anti-CD71 humano (anti-CD71 Ab21.12 humano) o anticuerpo anti-CD71 humano conjugado con duocarmicina (anti-CD71 Ab21.12-Duoc humano) o los controles de isotipo correspondientes (pavilizumab) y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humano de cabra marcado con Alexa Fluor 647. La Tabla 24 a continuación muestra las constantes de disociación de equilibrio en base a las curvas de unión observadas. Estos resultados muestran que el anticuerpo anti-CD71 21.12 humano (CD71-Ab) y su ADC correspondiente se unieron con una afinidad esencialmente equivalente.
Tabla 24: Actividad de unión a CD71 eem lar observada de anti-CD71 activable
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EJEMPLO 30: Efecto antiproliferativo de anticuerpos anti-CD71
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 humanos de la presente descripción que se unen a CD71 en líneas de células cancerosas demuestran un efecto antiproliferativo en comparación con un control de isotipo.
Las Figuras 33A y 33B muestran la inhibición de la proliferación celular mediante la aplicación del anticuerpo anti-CD71 Ab 21.12 de la presente descripción a las líneas celulares H292 y HCC1806, en comparación con un control de isotipo. En este estudio, las células indicadas se colocaron en placas a una densidad de 1000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Se añadió un volumen igual del artículo de prueba al doble de la concentración indicada y se dejó incubar las placas durante 5 días. Posteriormente se midió la viabilidad usando el reactivo Cell Titer Glo (Promega), y se determinó la inhibición de la proliferación como un porcentaje de una población de células no tratadas que se usaron como control. Los resultados indican que los anticuerpos anti-CD71 de la presente descripción mostraron una inhibición significativa de la proliferación (CE50 de ~ 4 nM en células H292, y ~ 10 nM en células HCC1806)
EJEMPLO 31: Expresión de CD71 en múltiples muestras de cáncer metastásico
Este Ejemplo muestra que CD71 se expresa en una gran cantidad y variedad de tumores mestastásicos derivados de pacientes mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) usando un anticuerpo anti-CD71.
La Figura 34 muestra que CD71 se expresa de forma moderada o alta en una gran cantidad y variedad de muestras de tumores metastásicos derivados de pacientes, usando la tinción IHC con un anticuerpo anti-CD71 adquirido comercialmente en múltiples microarrays de tejido tumoral (TMA) derivados de pacientes. La Figura 34 muestra un resumen del nivel de tinción IHC de CD71 de los TMA, muestra que una gran cantidad de núcleos derivados de múltiples muestras metastásicas derivadas de pacientes mostraron una fuerte señal de CD71.
EJEMPLO 32: Imágenes in vivo de anticuerpos anti-CD71 activables en un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas de ratón
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 activables de la presente descripción demuestran una activación in vivo dependiente de proteasa asociada a tumor y la unión a CD71 expresado en un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas de ratón mediante imagen fluorescente in vivo.
La Figura 35 muestra imágenes in vivo de ratones vivos con xenoinjertos de tumor pancreático (células BxPC3) usando anticuerpos anti-CD71 activables y anti-CD71 conjugados por fluorescencia de la presente descripción. En este estudio, a ratones hembra nu/nu de 7-8 semanas de edad se les implantó por vía subcutánea en el costado posterior derecho 5 x 106 células BxPC3, una línea celular derivada de cáncer de páncreas humano. Después del crecimiento de los tumores de 300 a 380 mm3, se administró un anticuerpo anti-CD71 Ab21.12 de la presente descripción ("anti-CD71"), un anticuerpo anti-CD71 activable de la presente descripción ("CD71 TF02.13-2012") o un anticuerpo anti-CD71 enmascarado de la presente descripción que carecía de un dominio CM ("CD71 TF02.13-NSUB") a cada uno de los ratones a una dosis de 1 mg/kg. Los anticuerpos administrados se marcaron por conjugación con el marcador fluorescente AlexFluor 750. Los ratones se sometieron a imágenes fluorescentes in vivo 96 horas después de la administración de los anticuerpos, usando una señal de excitación de 745 nm y detectando una señal de emisión de 800 nm. La escala muestra la magnitud relativa de la señal fluorescente detectada.
Los resultados de este estudio ejemplar mostraron que las señales fluorescentes del anticuerpo anti-CD71 no enmascarado y marcado de la presente descripción y el anticuerpo anti-CD71 activable marcado de la presente descripción se acumularon en el xenoinjerto. Por el contrario, un anticuerpo anti-CD71 correspondientemente enmascarado pero que carecía de un sitio de escisión de proteasa (CM) no se acumuló de forma detectable en su sitio de xenoinjerto tumoral. Sin quedar ligando a ninguna teoría en particular, este estudio ejemplar demostró que los anticuerpos anti-CD71 activables de la presente descripción pueden activarse in vivo mediante la escisión de proteasa asociada a tumor, permitiendo así que el anticuerpo anti-CD71 activable activado se una a CD71 en el tumor de xenoinjerto en un grado comparable al anticuerpo anti-CD71 no enmascarado de la presente descripción. El anticuerpo anti-CD71 enmascarado que carecía de un dominio de escisión de proteasa (CM) de la presente descripción no fue activable de la misma manera y, por lo tanto, no se unió apreciablemente al xenoinjerto tumoral.
EJEMPLO 33: Imágenes in vivo de anticuerpos anti-CD71 activables en un modelo de metástasis de cáncer de mama de ratón
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 activables de la presente descripción demuestran una activación in vivo dependiente de proteasa asociada a tumor y la unión a CD71 expresado en un modelo de metástasis de cáncer de mama de ratón mediante imagen fluorescente in vivo.
La Figura 36 muestra imágenes in vivo de ratones vivos con un modelo de cáncer metastásico de cáncer de mama derivado de humanos, utilizando anticuerpos anti-CD71 activables y anti-CD71 conjugados con fluorescencia de la presente descripción, y en los que las células cancerosas también expresan una señal bioluminiscente. En este estudio, a ratones hembra nu /nu de7-8 semanas de edad se les inyectó en el ventrículo izquierdo 5 * 105 células MDA-MB-231-luc2-D3LN, una línea celular derivada del cáncer de mama humano que expresa la enzima bioluminiscente luciferasa. Los ratones con células cancerosas detectables (según lo determinado mediante la detección de una señal bioluminiscente a través de imágenes in vivo ) recibieron una inyección intravenosa de 5 mg/kg de un anticuerpo de control de isotipo palivizumab ("isotipo"), un anticuerpo anti-CD71 Ab21.12 de la presente descripción ("anti-CD71") o un anticuerpo activable de la presente descripción ("CD71 TF02.13-3001"). Los anticuerpos administrados se marcaron por conjugación con el marcador fluorescente AlexFluor 750. Los ratones se sometieron a imágenes fluorescentes in vivo 48 horas después de la administración de los anticuerpos, usando una señal de excitación de 745 nm y detectando una señal de emisión de 800 nm. Después de la formación de imágenes fluorescentes de los anticuerpos, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal 3 mg de luciferina y a continuación se sometieron a imágenes bioluminiscentes in vivo 10 minutos después de la inyección mediante excitación bloqueada y emisión abierta.
Los resultados de este estudio ejemplar mostraron que las señales fluorescentes del anticuerpo anti-CD71 no enmascarado y marcado de la presente descripción y el anticuerpo anti-CD71 activable marcado de la presente descripción se acumularon en la misma ubicación que la ubicación del tumor, según lo determinado por la superposición de señales de bioluminiscencia y fluorescentes. Por el contrario, un anticuerpo de control de isotipo correspondientemente marcado no se acumuló de manera detectable en o cerca de ningún sitio tumoral. Sin quedar ligando a ninguna teoría en particular, este estudio ejemplar demostró que los anticuerpos anti-CD71 activables de la presente descripción pueden activarse in vivo mediante la escisión de proteasa asociada a tumor, permitiendo así que el anticuerpo anti-CD7l activable activado se una a CD71 en el modelo de tumor metastásico en un grado comparable al anticuerpo anti-CD71 no enmascarado de la presente descripción.
EJEMPLO 34: Imágenes in s itu de anticuerpos anti-CD71 activables
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 activables de la presente descripción demuestran una activación in situ dependiente del tumor y la unión a CD71 expresado en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) de ratón mediante tinción inmunohistoquímica (IHC).
La Figura 37 muestra un ensayo de tinción IHC de secciones de tejidos de tumores de xenoinjerto de NSCLC H292 utilizando anticuerpos anti-CD7l y anti-CD71 activables de la presente descripción. En este estudio, se preincubaron secciones de tejido de tumores de xenoinjerto H292 en presencia de (+BSPI) o ausencia (-BSPI) de un cóctel inhibidor de proteasa de amplio espectro (Protease Inhibitor Cocktail Set III, sin EDTA (Cat. n.° 539134, Merck Millipore) a una dilución 1:15 y EDTa 20 mM en tampón Tris). A continuación, las secciones de tejido se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-CD71 Ab 21.12 de la presente descripción ("anti-CD71") o los anticuerpos anti-CD71 activables de la presente descripción ("CD71 TF02.13-3001", "CD71 TF02.13-2001" o "CD71 TF02.13-2012"). Después de un lavado extenso para eliminar el material no unido, se detectó la presencia de anticuerpos anti-CD71 unidos o anticuerpos anti-CD71 activados de la presente descripción con anticuerpo secundario anti-IgG humano de burro marcado con AlexaFluor 647 (Cat. n.° 709-605-149, Jackson ImmunoResearch). Sin quedar ligado a ninguna teoría en particular, este estudio ejemplar muestra que los anticuerpos anti-CD71 activables de la presente descripción demostraron activación in situ y unión a CD71 en las secciones de tejido de xenoinjerto, que fue inhibida por la preincubación de los tejidos con un amplia espectro de inhibidores de la proteasa. El anticuerpo anti-CD71 no enmascarado de la presente descripción demostró unión in situ a CD71 en las secciones de tejido de xenoinjerto independientemente de la presencia o ausencia de preincubación con inhibidor de proteasa.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo activable conjugado que, en un estado activado, se une a CD71 que comprende:
un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD71 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD71 humano y CD71 de mono cynomolgus, donde el AB comprende la secuencia de VH CDR1 GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9), la secuencia de VH CDR2 AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10), la secuencia de VH CDR3 ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11), la secuencia de VL CDR1 SASSSVYYMY (SEQ ID NO: 12), la secuencia de VL CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 14) y la secuencia de VL CDR3 QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15);
un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, y donde el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud;
un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que es un sustrato para una proteasa; un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2),
donde el anticuerpo activable conjugado en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-LP1-CM-LP2-AB, y donde cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de 1 a 20 aminoácidos de longitud; y
un agente conjugado con el AB.
2. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 1, donde el MM:
(i) tiene una constante de disociación para la unión al AB que es mayor que la constante de disociación del AB al CD71; y/o
(ii) no interfiere ni compite con el AB por unirse al CD71 cuando el anticuerpo activable conjugado está en un estado escindido; y/o
(iii) la secuencia polipeptídica es diferente de la del CD71 humano; y/o
(iv) la secuencia polipeptídica no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB.
3. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde:
(i) el AB se selecciona de entre el grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv y un scAb; y/o
(ii) el AB se une específicamente a CD71 humano; y/o
(iii) el AB comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6 y 7; opcionalmente, una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y/o (iv) los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí.
4. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el AB comprende:
una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 325 o 699; y
una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 327, 329, 331, 333, 335, 337, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 670-673, 701-712, 721-788, 809-836 y 841­ 908.
5. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4;
donde
(i) el agente es una toxina o fragmento de la misma, o
(ii) el agente es un inhibidor de microtúbulos; o
(iii) el agente es un agente que daña el ácido nucleico; o
(iv) el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma y una pirrolobenzodiacepina o un derivado de la misma; o
(v) el agente es auristatina E o un derivado de la misma, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina D (MMAD), un maitansinoide seleccionado de entre el grupo que consiste en DM1 y DM4, maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una duocarmicina, una pirrolobenzodiacepina o un dímero de pirrolobenzodiacepina; o
(vi) el agente es un resto detectable; opcionalmente donde el resto detectable es un agente de diagnóstico.
6. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde
(i) el AB comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 7, 809­ 836 y 841-908; y/o
(ii) el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde la combinación de secuencias de aminoácidos se selecciona de una fila única en la Tabla D,
donde, para una combinación dada,
(a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias de VH CDR correspondientes a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D,
(b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias de VL CDR correspondientes a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D,
(c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de enmascaramiento (MM) correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D, y
(d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla D; y/o
(iii) el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde, para una combinación dada de secuencias de aminoácidos,
(a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia de VH o las secuencias de VH CDR seleccionadas de entre el grupo que consiste en: la secuencia de VH o las secuencias de VH CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E,
(b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia de VL seleccionada de entre el grupo que consiste en las s Eq ID NO: 6 y 7 o las secuencias de VL CDR seleccionadas de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 14 y 15,
(c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de enmascaramiento (MM) seleccionada de entre el grupo que consiste en: las secuencias de MM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E, y (d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) seleccionada de entre el grupo que consiste en: las secuencias de CM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla E; y/o
(iv) el anticuerpo activable comprende:
una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 325 o 699; y
una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 327, 329, 331, 333, 335, 337, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 670-673, 701-712, 721-788, 809-836 y 841­ 908.
7. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde:
el AB comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 325 o 699, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 327, 329, 331, 333, 335, 337, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 670-673, 701-712, 721-788, 809-836 y 841-908; y donde el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en auristatina E, monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina D (MMAD), maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una pirrolobenzodiacepina, un dímero de pirrolobenzodiacepina y una duocarmicina.
8. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde
(i) el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-295 y 297-314; y/o
(ii) el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 17 y 297-314; y/o
(iii) el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 356-423, 680-698, 713, 714 y 789-808; y/o
(iv) el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 406-423, 680-698, 713, 714 y 807-808.
9. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador, y
donde el enlazador con el que se conjuga el agente al AB comprende un resto SPDB, un resto vc o un resto PEG2-vc; y/o
donde el enlazador y el agente conjugado con el AB comprenden un resto SPDB-DM4, un resto vc-MMAD, un resto vc-MMAE, un resto vc-duocarmicina o un resto PEG2-vc-MMAD; y/o
donde el enlazador es un enlazador escindible o un enlazador no escindible.
10. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 1, donde:
el agente es una toxina y la toxina se conjuga con el AB a través de un enlazador; y
donde el anticuerpo activable conjugado comprende secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina seleccionados de una fila única en la Tabla F, donde, para la combinación dada:
(a) el AB comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena pesada o la secuencia de dominio variable de cadena pesada correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla F,
(b) el AB comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena ligera o la secuencia de dominio variable de cadena ligera correspondiente a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla F, y
(c) el enlazador y la toxina comprenden el enlazador y la toxina correspondientes a la combinación dada en la fila única enumerada en la Tabla F.
11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10; y un vehículo.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 que comprende un agente adicional; opcionalmente donde el agente adicional es un agente terapéutico.
13. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
14. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 13.
15. Un procedimiento para producir un anticuerpo activable mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o el vector de la reivindicación 14.
16. Un procedimiento para fabricar un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD71, comprendiendo el procedimiento:
(a) cultivar una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10;
y
(b) recuperar el anticuerpo activable; conjugar opcionalmente un agente de la reivindicación 5 con el anticuerpo activable recuperado.
17. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, para su uso como medicamento para el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociada con células que expresan CD71, donde el trastorno o la enfermedad es un cáncer; opcionalmente donde el cáncer es un adenocarcinoma, un cáncer del conducto biliar (biliar), un cáncer de vejiga, un cáncer de hueso, un cáncer de mama, un cáncer de mama triple negativo, un cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer carcinoide, un cáncer cervical, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, una leucemia, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células no pequeñas, un cáncer de pulmón de células pequeñas, un linfoma, un melanoma, un cáncer orofaríngeo, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración, un cáncer de riñón, un sarcoma, un cáncer de piel, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital o un cáncer urotelial.
18. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, para su uso como medicamento para el tratamiento de un trastorno o enfermedad en la que las células enfermas expresan CD71, y donde el trastorno o la enfermedad es un cáncer, donde:
(i) el cáncer es un adenocarcinoma, un cáncer del conducto biliar (biliar), un cáncer de vejiga, un cáncer de hueso, un cáncer de mama, un cáncer de mama triple negativo, un cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer carcinoide, un cáncer cervical, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, una leucemia, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células no pequeñas, un cáncer de pulmón de células pequeñas, un linfoma, un melanoma, un cáncer orofaríngeo, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración, un cáncer de riñón, un sarcoma, un cáncer de piel, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital o un cáncer urotelial; o
(ii) el uso comprende administrar un agente adicional; opcionalmente donde el agente adicional es un agente terapéutico.
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