JP2022512124A - マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能なおよびセリンまたはシステインプロテアーゼ切断可能な基質ならびにそれらの使用方法 - Google Patents

マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能なおよびセリンまたはシステインプロテアーゼ切断可能な基質ならびにそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2022512124000001
本発明は一般に、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である少なくとも第１の切断可能部分（ＣＭ１）および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）または少なくとも１種のシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）を含むポリペプチド、少なくとも１種のＭＭＰプロテアーゼに対する基質である少なくとも１種のＣＭ１および少なくとも１種のＳＰプロテアーゼまたは少なくとも１種のシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも１種のＣＭ２を含むこれらのポリペプチドを含む活性化可能抗体および他のさらに大きな分子、ならびに少なくとも１種のＭＭＰプロテアーゼに対する基質である少なくとも１種のＣＭ１および少なくとも１種のＳＰプロテアーゼまたは少なくとも１種のシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも１種のＣＭ２を含むこれらのポリペプチドを製造する方法および種々の治療的、診断的および予防的適用においてそれらを使用する方法に関する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月６日に出願された米国特許仮出願第６２／７７６，４０９号および２０１８年１２月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／７７８，０６２号の利益を主張する。これらの仮出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は一般に、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である少なくとも第１の切断可能部分（ＣＭ１）および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）および／または少なくとも１種のシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）を含むポリペプチド、少なくとも１種のＭＭＰプロテアーゼに対する基質であるＣＭ１および少なくとも１種のＳＰプロテアーゼおよび／または少なくとも１種のＣＰプロテアーゼに対する基質であるＣＭ２を少なくとも含むこれらのポリペプチドを含む活性化可能抗体および他のより大きな分子、ならびに少なくとも１種のＭＭＰプロテアーゼに対する基質であるＣＭ１および少なくとも１種のＳＰプロテアーゼおよび／または少なくとも１種のＣＰプロテアーゼに対する基質であるＣＭ２を少なくとも含むこれらのポリペプチドの製造方法および種々の治療、診断および予防適用におけるこれらの使用方法に関する。
配列リストの参照
米国特許法施行規則３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に基づいて本明細書と同時にコンピューター可読形式（ＣＦＲ）で、ファイル名「ＣＹＴＸ－０５８－ＰＣＴ＿ＳＴ２５」としてＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子申請された「配列表」は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは、２０１９年１１月２６日に作成され、ディスクサイズは１５９キロバイトである。
プロテアーゼは、アミノ酸残基間のペプチド結合を切断することによりタンパク質を分解する酵素である。プロテアーゼは天然において、すべての生物に存在し、単純な分解から高度に制御された経路まで種々の生理的反応に関与している。いくつかのプロテアーゼは、タンパク質内の特定のアミノ酸配列の存在に基づいて、特定のペプチド結合を切断することが知られている。
従って、プロテアーゼに対する新規基質を特定する、および種々の治療、診断および予防適用のためにこれらの基質を使用する必要性が存在する。
本発明の態様では、本明細書で提供されるのは、タンデム基質を含む単離ポリペプチドであり、タンデム基質は少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である少なくとも第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）またはシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）を含み、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＨＧＬまたはＰＲＱＶを含み、タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置は、ＣＭ１－ＣＭ２またはＣＭ２－ＣＭ１である。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドのＣＭ１は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＡＬＡＨＧＬ（配列番号５２）、ＬＡＨＧＬＦ（配列番号５０）、ＬＡＨＧＬ（配列番号５３）、およびＡＨＧＬＦ（配列番号５１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドのＣＭ１は、ＨＶＰＲＱＶ（配列番号８）およびＶＰＲＱＶ（配列番号６０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、連合ペプチドを介して連結されるＣＭ１およびＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドのＣＭ１とＣＭ２は、相互に直接連結される。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＰ酵素に対する基質を含むＣＭ２を含み、ＣＰ酵素はレグマインである。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ウロキナーゼ、マトリプターゼ、および好中球エラスターゼからなる群より選択されるＳＰ酵素に対する基質を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ウロキナーゼ、マトリプターゼ、および好中球エラスターゼからなる群より選択されるＳＰ酵素に対する基質、ならびにＣＰ酵素に対する基質を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、またはＭＭＰ１４からなる群より選択されるＭＭＰ酵素に対する基質を含むＣＭ１を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＡＲＧ、ＰＲＳ、ＴＦＶＨ（配列番号１４１）、ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＬＳＧＲＳ（配列番号７２）、ＬＳＧＲＳＤ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＡ（配列番号１１０）、ＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号７０）、ＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号１０９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８４）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１０８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１４）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８６）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９２）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９６）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１００）、およびＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＡＲＧＰ（配列番号１２８）、ＴＡＲＧ（配列番号１２５）、およびＴＡＲＧＰ（配列番号１２４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＡＰＲＳ（配列番号１３１）、ＡＰＲＳＦ（配列番号１３０）、およびＰＲＳＦ（配列番号１３２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３５）、ＧＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３６）、ＧＬＰＴＦＶ（配列番号１３７）、ＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３８）、ＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３９）、およびＬＰＴＦＶ（配列番号１４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５２）からなる群より選択されるアミノ酸配列；およびＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＬＳＧＲＳ（配列番号７２）、ＬＳＧＲＳＤ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＡ（配列番号１１０）、ＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号７０）、ＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号１０９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８４）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１０８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１４）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８６）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９２）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９６）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１００）、およびＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、タンデム基質ＣＭ１－ＣＭ２のＮ末端からＣ末端への配置を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、タンデム基質ＣＭ２－ＣＭ１のＮ末端からＣ末端への配置を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ１の第１の切断可能部分のＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも８０％である切断性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ１の第１の切断可能部分のＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも８５％である切断性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ１の第１の切断可能部分のＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも９０％である切断性を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、３０％未満の活性化であるＣＭ１の第１の切断可能部分のインビボ安定性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、２５％未満の活性化であるＣＭ１の第１の切断可能部分のインビボ安定性を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも３０％であるタンデム基質の切断性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも５０％であるタンデム基質の切断性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも７０％であるタンデム基質の切断性を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも１５％である、およびマトリプターゼによる少なくとも３０％であるタンデム基質の切断性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも３０％である、およびマトリプターゼによる少なくとも３０％であるタンデム基質の切断性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも５０％である、およびマトリプターゼによる少なくとも５０％であるタンデム基質の切断性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４によるそれぞれ少なくとも７０％である、およびマトリプターゼによる少なくとも７０％であるタンデム基質の切断性を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、４０％未満の活性化のインビボ安定性を有するタンデム基質を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、３０％未満の活性化のインビボ安定性を有するタンデム基質を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、２５％未満の活性化のインビボ安定性を有するタンデム基質を有する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、２０％未満の活性化のインビボ安定性を有するタンデム基質を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、配列番号２５、２６、２９、３１、３２、３４、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、配列番号２７、２８、３０、３３、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、配列番号２５、２９、３１、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、配列番号２６、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、配列番号２７、２８、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、配列番号３０、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である少なくとも第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）またはシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）を含む本開示の単離ポリペプチドであり、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＨＧＬまたはＰＲＱＶを含み、タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置は、ＣＭ１－ＣＭ２またはＣＭ２－ＣＭ１である。いくつかの実施形態では、ＭＭＰ、ＣＰ、およびＳＰの少なくとも１種は、組織中で標的と共存する。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択されるその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ１に連結されるＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ１に直接連結されるＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、連結ペプチドを介してＣＭ１に連結されるＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ２に連結されるＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ２に直接連結されるＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、連結ペプチドを介してＣＭ２に連結されるＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＣＭ１またはＣＭ２はＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＣＭ１またはＣＭ２はＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、マスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＡＢの標的への結合の解離定数よりも高いＡＢへの結合の解離定数を有するＭＭを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、４０アミノ酸長以下のポリペプチドであるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、未切断状態での単離ポリペプチドがＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭを含むように、ＣＭ１に連結されるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド、およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、未切断状態での単離ポリペプチドがＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭを含むように、ＣＭ１に連結されるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭとＣＭ２の間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＣＭ１とＡＢの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、ＭＭとＣＭ２の間に連結ペプチド、およびＣＭ１とＡＢの間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、単離ポリペプチドは、未切断状態でＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、またはＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ、を有する。いくつかの実施形態では、２個の連結ペプチドは、相互に同一ではない。いくつかの実施形態では、ＬＰ１とＬＰ２のそれぞれは、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、ＣＭ１とＣＭ２の間に第３の連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＬＰ２はＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＬＰ２は、ＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、アミノ酸配列が標的の配列と異なり、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列に対し１０％以下同一であるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、切断状態において標的への結合についてＡＢと干渉も競合もしないＭＭを含む。
いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号４５０～４６２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号４５０～４６２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列、および配列番号４００を含む重鎖アミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様では、本明細書で提供されるのは、活性化状態で、標的に特異的に結合する活性化可能抗体であり、これは、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）と、ＡＢに結合したマスキング部分（ＭＭ）であって、活性化可能抗体が未切断状態にある場合に標的へのＡＢの結合を阻害する、ＭＭと、本明細書で提供されるタンデム基質のいずれか１つによるタンデム基質を含む切断可能部分（ＣＭ）とを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢの標的への結合の解離定数よりも高いＡＢへの結合の解離定数を有する、ＭＭを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、４０アミノ酸長以下のポリペプチドであるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択されるその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢの標的への結合の解離定数よりも高いＡＢへの結合の解離定数を有する、ＭＭを含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、未切断状態での活性化可能抗体がＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭを含むように、ＣＭ１に連結されるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド、およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、未切断状態での活性化可能抗体がＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭを含むように、ＣＭ１に連結されるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ２の間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＡＢの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ２の間に連結ペプチド、およびＣＭ１とＡＢの間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＣＭ１またはＣＭ２はＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＣＭ１またはＣＭ２はＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、活性化可能抗体は、未切断状態でＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、またはＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ、を有する。いくつかの実施形態では、２個の連結ペプチドは、相互に同一ではない。いくつかの実施形態では、ＬＰ１とＬＰ２のそれぞれは、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に第３の連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＬＰ２はＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含むＡＢを含み、ＬＰ２はＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、配列番号４５０～４６２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、配列番号４５０～４６２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列、および配列番号４００を含む重鎖アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、標的のアミノ酸配列と異なり、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列に対し１０％以下同一であるＭＭを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、切断状態において標的への結合についてＡＢと干渉も競合もしないＭＭを含む。
本発明の別の態様では、本明細書で提供されるのは、薬剤に接合された活性化可能抗体を含む接合型活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断可能なリンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断不能なリンカーを介してＡＢに接合される。
いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、毒素またはそのフラグメントである薬剤を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、微小管阻害剤である薬剤を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、核酸損傷剤である薬剤を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ドラスタチンまたはその誘導体、オーリスタチンまたはその誘導体、マイタンシノイドまたはその誘導体、デュオカルマイシンまたはその誘導体、およびカリケアマイシンまたはその誘導体、オーリスタチンＥまたはこれらの誘導体、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、またはＤＭ１およびＤＭ４からなる群より選択されるマイタンシノイドである、薬剤を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、検出可能部分または診断薬である薬剤を含む。
本発明の別の態様では、本明細書で提供されるのは、本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体または本開示の接合型活性化可能抗体および担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、追加の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療薬である追加の薬剤を含む。
本発明の別の態様では、本明細書で提供されるのは、本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体をコードする単離核酸分子である。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示の単離核酸分子を含む。
本発明の別の態様では、本明細書で提供されるのは、本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で細胞を培養することにより、抗体または活性化可能抗体を産生する方法である。本発明の別の態様では、本明細書で提供されるのは、活性化状態で標的を結合する活性化可能抗体を製造する方法であって、本開示の活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養すること、および活性化可能抗体を回収することを含む方法である。
本発明の別の態様では、本明細書で提供されるのは、治療有効量の本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体または本開示の接合型活性化可能抗体、または本開示の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、障害または疾患を治療する、その症状を緩和するまたはその進行を遅らせる方法である。いくつかの実施形態では、障害または疾患は、癌である。いくつかの実施形態では、方法は、追加の薬剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、追加の治療薬を対象に投与することを含む。
ｎｕ／ｎｕマウスへのそれらの投与後にインビボで切断が観察された、示された本開示の活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体のパーセントの例示的結果を示すグラフである。これらの例示的結果は、試験した活性化可能抗体のいくつかが、複数の酵素により切断可能である他の基質よりも高い安定性を示すことを示した。 図２Ａおよび図２Ｂは、示された本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のＥＧＦＲへのインビトロ結合の例示的結果を示すグラフである。これらの例示的結果は、ＭＭＰ基質が活性化可能抗体のプロドメインのマスキング効率に影響を与えることを示した。 図３Ａおよび図３Ｂは、マウスＨ２９２異種移植モデルを用いる、示された本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビボ有効性の例示的結果を示すグラフである。これらの例示的結果は、本開示の特定のＭＭＰ基質を有する活性化可能抗体が、この異種移植モデルで、マスクされていない抗ＥＧＦＲセツキシマブと同等であった有効性を示したことを示した。 マウスＨ２９２異種移植モデルへの投与後に腫瘍内組織中で活性化された、示された本開示の活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体のパーセントの例示的結果を示すグラフである。 ｎｕ／ｎｕマウスへのそれらの投与後にインビボで切断が観察された、本開示の単一ＭＭＰまたはタンデム基質を有する、示された本開示の活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体のパーセントの例示的結果を示すグラフである。これらの例示的結果は、試験したタンデム基質を有する活性化可能抗体のいくつかが、複数の酵素により切断可能である他の基質よりも高いインビボ安定性を示すことを示した。 マウスＨ２９２異種移植モデルを用いる、示された本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビボ有効性の例示的結果を示すグラフである。これらの例示的結果は、本開示の特定のＭＭＰ基質を有する活性化可能抗体が、この異種移植モデルで、マスクされていない抗ＥＧＦＲセツキシマブ抗体と同等であった有効性を示したことを示した。 マウスＨ２９２異種移植モデルへの投与後に腫瘍内組織中で活性化された、示された本開示の活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体のパーセントの例示的結果を示すグラフである。 示された本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のＥＧＦＲへのインビトロ結合から計算した計算マスキング効率の例示的結果を示すグラフである。これらの例示的結果は、タンデム基質が活性化可能抗体のプロドメインのマスキング効率に影響を与えたことを示した。 ヒト腫瘍組織とのインキュベーション後に活性化された、示された本開示の活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体のパーセントの例示的結果を示すグラフである。
本開示は、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である少なくとも第１の切断可能部分（ＣＭ１）および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）および／または少なくとも１種のシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）を包含するアミノ酸配列を提供する。これらのアミノ酸配列は、本明細書中では、ひとまとめにして、「タンデム基質」と呼ばれる。この用語は、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である第１の切断可能部分（ＣＭ１）および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）および／または少なくとも１種のシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）の配向または他の構造配置に関する何らかの要件を示唆することを意図するものではない。したがって、「タンデム基質」という用語は、ＣＭ１－ＣＭ２またはＣＭ２－ＣＭ１のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有するＣＭ１－ＣＭ２基質を包含する。「タンデム基質」という用語はまた、ＣＭ１配列の少なくとも一部がＣＭ２配列の少なくとも一部に重なる基質も包含する。
いくつかの実施形態では、ＣＭ２は少なくとも２つの基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２は、第１のセリンプロテアーゼに対する基質および第２のセリンプロテアーゼに対する基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２は、セリンプロテアーゼに対する基質およびシステインプロテアーゼに対する基質を含む。
本明細書で記載のＣＭ１－ＣＭ２基質は、種々の治療、診断および予防適用に有用である。例えば、これらのＣＭ１－ＣＭ２基質は、プロドメインを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体に有用である。プロドメインは、ＭＭの結合が、その標的を結合するＡＢの能力を低減するように、ＡＢの少なくとも１種の抗原またはエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１個のマスキング部分（ＭＭ）を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、少なくとも第１のＣＭ（ＣＭ１）および第２のＣＭ（ＣＭ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列の少なくとも一部は、ＣＭ２配列の少なくとも一部に重なる。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、少なくとも１個のアミノ酸残基を共有する。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、少なくとも２個のアミノ酸残基を共有する。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、少なくとも３個のアミノ酸残基を共有する。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、３個以上のアミノ酸残基を共有する。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１とＣＭ２は、一緒に作動可能に連結される別々のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１とＣＭ２は、一緒に直接連結される別々のポリペプチドである、すなわち、一方の基質のＮ末端が他方の基質ポリペプチドのＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１のＮ末端は、ＣＭ２のＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、ＣＭ２のＮ末端は、ＣＭ１のＣ末端に直接連結される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１とＣＭ２は、少なくとも１個の連結部分を介して一緒に作動可能に連結される別々のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、未切断状態の活性化可能抗体の第１の切断可能部分ＣＭ１と第２の切断可能部分ＣＭ２は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ、ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、またはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）とＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）およびＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ２とマスキング部分（ＭＭ）の間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）およびＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１８）である。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である。ＭＭＰの例としては、ＭＭＰ１；ＭＭＰ２；ＭＭＰ３；ＭＭＰ７；ＭＭＰ８；ＭＭＰ９；ＭＭＰ１０；ＭＭＰ１１；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ１３；ＭＭＰ１４；ＭＭＰ１５；ＭＭＰ１６；ＭＭＰ１７；ＭＭＰ１９；ＭＭＰ２０；ＭＭＰ２３；ＭＭＰ２４；ＭＭＰ２６；およびＭＭＰ２７が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１、および／またはＭＭＰ１９に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、ＭＭＰ２に対する基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、ＭＭＰ９に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、ＭＭＰ１４に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、２種以上のＭＭＰに対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ９とＭＭＰ１４に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ２とＭＭＰ９に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ２とＭＭＰ１４に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、３種以上のＭＭＰに対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ２、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１４に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、同じＭＭＰに対する２種以上の基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくとも２種以上のＭＭＰ２基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくとも２種以上のＭＭＰ９基質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、少なくとも２種以上のＭＭＰ１４基質を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、ＭＭＰに対する基質であり、少なくとも配列ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）、ＡＦＲＨＬＲ（配列番号３）、ＰＨＧＦＦＱ（配列番号４）、ＳＶＨＨＬＩ（配列番号５）、ＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）、ＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）、ＨＶＰＲＱＶ（配列番号８）、ＳＮＰＦＫＹ（配列番号９）、ＲＦＰＬＫＶ（配列番号１０）、ＰＦＨＬＳＲ（配列番号１１）、ＳＴＶＦＨＭ（配列番号１２）、ＭＧＰＷＦＭ（配列番号１３）、ＲＨＬＡＫＬ（配列番号１４）、ＰＬＧＶＲＧＫ（配列番号１５）、およびＱＮＱＡＬＲＩＡ（配列番号１６）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＦＲＨＬＲ（配列番号３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＰＨＧＦＦＱ（配列番号４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＳＶＨＨＬＩ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＨＶＰＲＱＶ（配列番号８）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＳＮＰＦＫＹ（配列番号９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＲＦＰＬＫＶ（配列番号１０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＰＦＨＬＳＲ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＳＴＶＦＨＭ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＭＧＰＷＦＭ（配列番号１３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＲＨＬＡＫＬ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＰＬＧＶＲＧＫ（配列番号１５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＱＮＱＡＬＲＩＡ（配列番号１６）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＬＡＨＧＬＦ（配列番号５０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＨＧＬＦ（配列番号５１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＬＡＨＧＬ（配列番号５２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＬＡＨＧＬ（配列番号５３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＨＧＬ（配列番号５４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＬＡＨＧ（配列番号５５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＬＡＨＧ（配列番号５６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＨＧを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＶＰＲＱＶ（配列番号６０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＰＲＱＶ（配列番号６１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＨＶＰＲＱ（配列番号６２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＶＰＲＱ（配列番号６３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＰＲＱを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ２は、少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＳＰは、ｕ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、ウロキナーゼとも呼ばれる）、マトリプターゼ（本明細書中ではＭＴ－ＳＰ１またはＭＴＳＰ１とも呼ばれる）、好中球エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ）、およびそれらの組合せから選択される。非限定的例であるが、本明細書で記載のＣＭ２を切断する他のＳＰの例としては、活性化プロテインＣ；カテプシンＧ；キマーゼ；凝固因子プロテアーゼ、例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａなど；エラスターゼ；グランザイムＢ；グアニジノベンゾアターゼ；ＨｔｒＡ１；ラクトフェリン；マラプシン；ＮＳ３／４Ａ；ＰＡＣＥ４；プラスミン；ＰＳＡ；ｔＰＡ；トロンビン；トリプターゼ；ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、および／またはＴＭＰＲＳＳ４が挙げられる。
例えば、好適なＣＭ２は、少なくとも１種のセリンプロテアーゼにより切断され、次のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの配列を含み得る：ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号７０）、ＬＳＧＲＳＤ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳ（配列番号７２）、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＳＧＲＳＤＮ（配列番号７４）、ＳＧＲＳＤ（配列番号７５）、ＳＧＲＳ（配列番号７６）、ＳＧＲ、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８）、ＬＳＧＲＳＧＮ（配列番号７９）、ＬＳＧＲＳＧ（配列番号８０）、ＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号８１）、ＳＧＲＳＧＮ（配列番号８２）、ＳＧＲＳＧ（配列番号８３）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８４）、ＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８５）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８６）、ＬＳＧＲＳＤＹ（配列番号８７）、ＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８８）、ＳＧＲＳＤＹ（配列番号８９）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９０）、ＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９１）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９２）、ＬＳＧＲＳＤＴ（配列番号９３）、ＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９４）、ＳＧＲＳＤＴ（配列番号９５）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９６）、ＬＳＧＲＳＤＱ（配列番号９７）、ＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９８）、ＳＧＲＳＤＱ（配列番号９９）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１００）、ＬＳＧＲＳＤＩ（配列番号１０１）、ＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１０２）、ＳＧＲＳＤＩ（配列番号１０３）、ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０４）、ＬＳＧＲＳＤＤ（配列番号１０５）、ＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０６）、ＳＧＲＳＤＤ（配列番号１０７）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１０８）、ＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号１０９）、ＬＳＧＲＳＡ（配列番号１１０）、ＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１１１）、ＳＧＲＳＡＮ（配列番号１１２）、ＳＧＲＳＡ（配列番号１１３）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１４）、およびＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１５）。
いくつかの実施形態では、好適なＣＭ２は、少なくとも１種のセリンプロテアーゼにより切断され、次のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの配列を含み得る：ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号１２０）、ＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号１２１）、ＴＡＲＧＰＳＦ（配列番号１２２）、ＴＡＲＧＰＳ（配列番号１２３）、ＴＡＲＧＰ（配列番号１２４）、ＴＡＲＧ（配列番号１２５）、ＡＲＧＰＳＦ（配列番号１２６）、ＡＲＧＰＳ（配列番号１２７）、ＡＲＧＰ（配列番号１２８）、およびＡＲＧ。
いくつかの実施形態では、好適なＣＭ２は、少なくとも１種のセリンプロテアーゼにより切断され、次のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの配列を含み得る：ＡＰＲＳＦ（配列番号１３０）、ＡＰＲＳ（配列番号１３１）、およびＰＲＳＦ（配列番号１３２）。
いくつかの実施形態では、好適なＣＭ２は、少なくとも１種のセリンプロテアーゼにより切断され、次のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの配列を含み得る：ＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３５）、ＧＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３６）、ＧＬＰＴＦＶ（配列番号１３７）、ＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３８）、ＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３９）、およびＬＰＴＦＶ（配列番号１４０）。
いくつかの実施形態では、ＣＭ２は、少なくとも１種のシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である。いくつかの実施形態では、ＣＰはレグマインである。いくつかの実施形態では、好適なＣＭ２は、少なくとも１種のシステインプロテアーゼにより切断され、次のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つの配列を含み得る：ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５２）。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳ（配列番号２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号２８）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＴＡＲＧＰＶＰＲＱＶ（配列番号３０）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＨＶＰＲＱＶＡＰＲＳＦ（配列番号３３）、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号３４）、ＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶ（配列番号３５）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、ＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＮＩ（配列番号３８）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＮＩ（配列番号３９）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＮＩＧＳ（配列番号４０）、ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＮＩＧＳ（配列番号４１）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＮＩＧ（配列番号４２）、およびＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＮＩＧ（配列番号４３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、未切断状態での活性化可能抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ、ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、またはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は第１の連結ペプチド（ＬＰ１）と第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、未切断状態での抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、またはＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ。いくつかの実施形態では、ＬＰ１とＬＰ２のそれぞれは、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態では、２個の連結ペプチドは、相互に同一である必要はない。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）とＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に結合ペプチド（ＬＰ１）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ２とマスキング部分（ＭＭ）の間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１８）である。
いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも一方は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２００）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０１）（ｎは少なくとも１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも一方は、ＧＧＳＧ（配列番号２０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２０６）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号２０７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２０８）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２０９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２１２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１４）、およびＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２１５）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２１６）、ＧＳＳＧＴ（配列番号２１７）またはＧＳＳＧ（配列番号２１８）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＧＧＳ（配列番号２１６）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１は、ＭＭＰに対する基質であり、少なくとも配列ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）、ＡＦＲＨＬＲ（配列番号３）、ＰＨＧＦＦＱ（配列番号４）、ＳＶＨＨＬＩ（配列番号５）、ＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）、ＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）、ＨＶＰＲＱＶ（配列番号８）、ＳＮＰＦＫＹ（配列番号９）、ＲＦＰＬＫＶ（配列番号１０）、ＰＦＨＬＳＲ（配列番号１１）、ＳＴＶＦＨＭ（配列番号１２）、ＭＧＰＷＦＭ（配列番号１３）、ＲＨＬＡＫＬ（配列番号１４）、ＰＬＧＶＲＧＫ（配列番号１５）、およびＱＮＱＡＬＲＩＡ（配列番号１６）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質およびＬＰ２リンカーを含み、ＣＭ１－ＣＭ２は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳ（配列番号２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号２８）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＴＡＲＧＰＶＰＲＱＶ（配列番号３０）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＨＶＰＲＱＶＡＰＲＳＦ（配列番号３３）、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号３４）、ＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶ（配列番号３５）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、ＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＮＩ（配列番号３８）、およびＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＮＩ（配列番号３９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＰ２リンカーはＧＧＧＳ（配列番号２１６）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質およびＬＰ２リンカーを含み、ＣＭ１－ＣＭ２は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳ（配列番号２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号２８）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＴＡＲＧＰＶＰＲＱＶ（配列番号３０）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＨＶＰＲＱＶＡＰＲＳＦ（配列番号３３）、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号３４）、ＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶ（配列番号３５）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、ＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＮＩ（配列番号３８）、およびＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＮＩ（配列番号３９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＰ２リンカーはＧＧＳを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質およびＬＰ２リンカーを含み、ＣＭ１－ＣＭ２およびＬＰ２は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳ（配列番号２２６）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮＧＧＧＳ（配列番号２２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＧＧＧＳ（配列番号２２８）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮＧＧＧＳ（配列番号２２９）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳ（配列番号２３０）、ＴＡＲＧＰＶＰＲＱＶＧＧＧＳ（配列番号２３１）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳ（配列番号２３２）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦＧＧＧＳ（配列番号２３３）、ＨＶＰＲＱＶＡＰＲＳＦＧＧＧＳ（配列番号２３４）、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬＧＧＧＳ（配列番号２３５）、ＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶＧＧＧＳ（配列番号２３６）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳ（配列番号２３７）、ＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳ（配列番号２３８）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＮＩＧＧＧＳ（配列番号２３９）、およびＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＮＩＧＧＧＳ（配列番号２４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドまたは本開示の活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質およびＬＰ２リンカーを含み、ＣＭ１－ＣＭ２およびＬＰ２は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦＧＧＳ（配列番号２４１）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮＧＧＳ（配列番号２４２）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＧＧＳ（配列番号２４３）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮＧＧＳ（配列番号２４４）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦＧＧＳ（配列番号２４５）、ＴＡＲＧＰＶＰＲＱＶＧＧＳ（配列番号２４６）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦＧＧＳ（配列番号２４７）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦＧＧＳ（配列番号２４８）、ＨＶＰＲＱＶＡＰＲＳＦＧＧＳ（配列番号２４９）、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬＧＧＳ（配列番号２５０）、ＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶＧＧＳ（配列番号２５１）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦＧＧＳ（配列番号２５２）、ＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦＧＧＳ（配列番号２５３）、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＮＩＧＧＳ（配列番号２５４）、およびＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＮＩＧＧＳ（配列番号２５５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢは、標的への結合について、約１００ｎＭ以下の解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢは完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、ＡＢは免疫学的活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、ＡＢは抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、ＡＢは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、このようなＡＢは、マウスの、他のげっ歯類の、キメラの、ヒト化されたまたは完全にヒトの、モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体中のＣＭ１を切断する。いくつかの実施形態では、ＳＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＳＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体中のＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態では、ＣＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＣＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体中のＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＳＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＳＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼおよびＳＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよびＳＰプロテアーゼの少なくとも一方は、抗体がプロテアーゼに曝露されるとき、抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＣＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＣＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに曝露されるとき、抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼおよびＣＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよびＣＰプロテアーゼの少なくとも一方は、抗体がプロテアーゼに曝露されるとき、抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＣＰプロテアーゼおよび／またはＳＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＣＰプロテアーゼおよび／またはＳＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに曝露されるとき、抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼおよびＣＰプロテアーゼおよびＳＰプロテアーゼは、組織中で標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよびＳＰプロテアーゼおよびＣＰプロテアーゼの少なくとも１種は、抗体がプロテアーゼに曝露されるとき、抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列およびＣＭ２基質配列のそれぞれは、独立に、最大１５個のアミノ酸長のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のヒトポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のヒトポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰおよび／または少なくとも１種のＣＰに対する基質であり、同じＳＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰおよび／または少なくとも１種のＣＰに対する基質であり、同じＳＰおよび／またはＣＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰおよび／または少なくとも１種のＣＰに対する基質であり、同じＳＰおよび／またはＣＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のヒトポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰおよび／または少なくとも１種のＣＰに対する基質であり、同じＳＰおよび／またはＣＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰおよび／または少なくとも１種のＣＰに対する基質であり、同じＳＰおよび／またはＣＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰおよび／または少なくとも１種のＣＰに対する基質であり、同じＳＰおよび／またはＣＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のヒトポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号２５、２６、２９、３１、３２、３４、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号２７、２８、３０、３３、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号２５、２９、３１、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号２６、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号２７、２８、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号３０および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号２５、２６、２９、３１、３２、３４、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号２７、２８、３０、３３、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号２５、２９、３１、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号２６、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号２７、２８、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号３０および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、および本明細書で開示の抗ＥＧＦＲ抗体のアミノ酸配列を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、および配列番号４０１のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号配列番号４００のアミノ酸配列を含む重鎖とを有する抗体を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２は、配列番号４５０～４６２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列と、配列番号４００の重鎖アミノ酸配列を有する活性化可能抗体に含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、少なくとも１種のＭＭＰに対するＣＭ１基質を含み、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば、任意の動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のヒトポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば、任意の動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ１基質配列は、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であり、同じＭＭＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のヒトポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＭＭＰに対する基質であるＣＭ１基質配列は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）、ＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）、ＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）、およびＱＮＱＡＬＲＩＡ（配列番号１６）からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）、ＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）、ＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）、およびＱＮＱＡＬＲＩＡ（配列番号１６）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離ポリペプチドは、少なくとも１種のＳＰプロテアーゼに対する基質であるＣＭ２基質を含み、同じＳＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば、任意の動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰに対する基質であり、同じＳＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰに対する基質であり、同じＳＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のヒトポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰに対する基質であり、同じＳＰプロテアーゼによって天然で切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰに対する基質であり、同じＳＰプロテアーゼによって天然で切断される任意の哺乳動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭ２基質配列は、少なくとも１種のＳＰに対する基質であり、同じＳＰプロテアーゼによって天然で切断される任意ヒトポリペプチド配列とせいぜい９０％またはそれを越えて同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＳＰに対する基質であるＣＭ２基質配列は、ＡＰＲＳＦ（配列番号１３０）およびＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３５）からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、ＡＰＲＳＦ（配列番号１３０）およびＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ２基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、配列番号１～１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む基質、ならびに標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、およびその標的を結合するＡＢの抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減させるマスキング部分（ＭＭ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２、ＣＭ１、またはＣＭ２基質はまた、少なくとも１種の追加のプロテアーゼに対する基質である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の追加のプロテアーゼは、ＣＭ１を切断するＭＭＰプロテアーゼとは異なるＭＭＰプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の追加プロテアーゼは、ＭＭＰ１；ＭＭＰ２；ＭＭＰ３；ＭＭＰ７；ＭＭＰ８；ＭＭＰ９；ＭＭＰ１０；ＭＭＰ１１；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ１３；ＭＭＰ１４；ＭＭＰ１５；ＭＭＰ１６；ＭＭＰ１７；ＭＭＰ１９；ＭＭＰ２０；ＭＭＰ２３；ＭＭＰ２４；ＭＭＰ２６；およびＭＭＰ２７からなる群から選択されるＭＭＰプロテアーゼである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の追加のプロテアーゼは、ＣＭ２を切断するＳＰプロテアーゼとは異なるＳＰプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の追加ＳＰプロテアーゼは、ｕＰＡ；マトリプターゼ；活性化プロテインＣ；カテプシンＡ；カテプシンＧ；キマーゼ；凝固因子プロテアーゼ、例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａなど；エラスターゼ；グランザイムＢ；グアニジノベンゾアターゼ；ＨｔｒＡ１；ヒト好中球エラスターゼ；ラクトフェリン；マラプシン；ＮＳ３／４Ａ；ＰＡＣＥ４；プラスミン；ＰＳＡ；ｔＰＡ；トロンビン；トリプターゼ；ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、およびＴＭＰＲＳＳ４からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の追加のプロテアーゼは、表６に示されるものからなる群より選択される。
Figure 2022512124000002
本開示はまた、少なくとも第１のＣＭ１と第２のＣＭ２を含み、薬剤に接結される抗体を提供する。いくつかの実施形態では、第１のＣＭ１と第２のＣＭ２は、それぞれ１５アミノ酸長以下のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、接合型活性化可能抗体であり、未切断状態では、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ－薬剤、薬剤－ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ、ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ－薬剤、または薬剤－ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、接合型活性化可能抗体であり、未切断状態では、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：薬剤－ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ－薬剤、薬剤－ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、またはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ－薬剤。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、接合型活性化可能抗体であり、未切断状態では、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：薬剤－ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ－薬剤、薬剤－ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ－薬剤、薬剤－ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ－薬剤、または薬剤－ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ－薬剤。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）、および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含む接合型活性化可能抗体であり、未切断状態にある抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ－薬剤、薬剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ－薬剤、または薬剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ。いくつかの実施形態では、ＬＰ１とＬＰ２のそれぞれは、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態では、２個の連結ペプチドは、相互に同一である必要はない。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、第１の連合ペプチド（ＬＰ１）、および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含む接合型活性化可能抗体であり、未切断状態にある抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：薬剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ－薬剤、薬剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、またはＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ－薬剤。いくつかの実施形態では、ＬＰ１とＬＰ２のそれぞれは、約１～２０アミノ酸長のペプチドである。いくつかの実施形態では、２個の連結ペプチドは、相互に同一である必要はない。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）、および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含む接合型活性化可能抗体であり、未切断状態にある抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：薬剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ－薬剤、薬剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ－薬剤、薬剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ－薬剤、または薬剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ－薬剤。いくつかの実施形態では、ＬＰ１とＬＰ２のそれぞれは、約１～２０アミノ酸長のペプチドである。いくつかの実施形態では、２個の連結ペプチドは、相互に同一である必要はない。
いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）とＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、およびＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。
いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＣＭ２とマスキング部分（ＭＭ）の間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）およびＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。いくつかの実施形態では、接合型活性化可能抗体は、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ１）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、およびＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１８）である。
いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも一方は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）（ｎは少なくとも１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも一方は、ＧＧＳＧ（配列番号２０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２０６）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号２０７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２０８）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２０９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２１２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号２１３）、およびＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１４）を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２１５）、ＧＳＳＧＴ（配列番号２１６）またはＧＳＳＧ（配列番号２１７）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、抗体に連結されるかまたは別の方法で取り付けられる。例えば、ＣＭ１－ＣＭ２は、ＭＭＰおよび／またはＳＰおよび／またはＣＰに晒されたときにＣＭ１－ＣＭ２が切断され、薬剤がＡＢから放出されるように、所定の標的を結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）に１種または複数の薬剤を連結するのに使用される。例示的標的としては、限定されないが、表１に示された標的を包含する。例示的ＡＢは、限定されないが、表２に示された抗体を包含する。
いくつかの実施形態では、ＡＢは、標的への結合について、約１００ｎＭ以下の解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、抗体は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを包含する。いくつかの実施形態では、標的を結合する抗体またはその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するそのような抗体またはその免疫学的活性フラグメントは、マウスの、他のげっ歯類の、キメラの、ヒト化されたまたは完全にヒトの、モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの解離定数以下であるＡＢへの結合についての解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、ＭＭは、切断状態で標的への結合に関してＡＢと干渉も競合もしない。
いくつかの実施形態では、ＭＭは、２～４０アミノ酸長のポリペプチドである。例えば、ＭＭは、最大で約４０アミノ酸長のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢのいずれの天然の結合パートナーの配列とも異なる。いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢのいずれかの天然の結合パートナーと５０％以下同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢのいずれの天然の結合パートナーに対しても、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、または１０％以下同一である。
いくつかの実施形態では、ＡＢまたは活性化可能抗体のＡＢに接合される薬剤は、治療薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は抗腫瘍薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、毒素またはそのフラグメントである。本明細書において使用される場合、毒素フラグメントは、毒性活性を保持するフラグメントである。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断可能リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも１種のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含むリンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断不能リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡインターカレーターなどの核酸損傷剤、または他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、表３に列挙される群から選択される薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、抗炎症剤である。
いくつかの実施形態では、抗体および／または活性化可能抗体はまた、検出可能な部分も含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、診断薬である。
いくつかの実施形態では、接合型抗体および／または接合型活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１種または複数の金属イオン、またはリガンドベース標識を含む。いくつかの実施形態では、イメージング剤は、放射性同位体を含む。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、インジウムまたはテクネチウムである。いくつかの実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウムまたは酸化鉄を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ－ガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、またはユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態では、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。いくつかの実施形態では、標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識、例えばＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０を含む。いくつかの実施形態では、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは１種または複数のハプテンを含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の抗体および／またはＡＢは天然では、１個または複数のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢは、１個または複数のジスルフィド結合を含むよう改変され得る。
いくつかの実施形態では、抗体および／または接合型抗体は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体および／または接合型抗体は、多重特異性であり、本明細書においては、多重特異性抗体および／または接合型多重特異性抗体とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体および／または接合型多重特異性抗体は、二重特異性または三重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体および／または接合型抗体は、プロ－二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（プロ－ＢＩＴＥ）分子の一部として処方される。いくつかの実施形態では、抗体および／または接合型抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（プロ－ＣＡＲ）改変Ｔ細胞または他の遺伝子改変受容体もしくは他の免疫エフェクター細胞、例えばＣＡＲ改変ＮＫ細胞などの一部として処方される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細の一部として処方される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変ＮＫ細胞の一部として処方される。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、多重特異性であり、本明細書においては、多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体とも呼ばれる。本明細書において使用される場合、用語、「活性化可能抗体（ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」およびそのすべての文法的変形は、特に断らない限り、活性化可能抗体が、本開示の多重特異性活性化可能抗体である実施形態を包含することが意図されるが、これに限定されるものではない。本明細書において使用される場合、用語、「接合型活性化可能抗体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」およびそのすべての文法的変形は、特に断らない限り、接合型活性化可能抗体は、本開示の接合型多重特異性活性化可能抗体である実施形態を包含することが意図されるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体は、二重特異性または三重特異性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、プロ－二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（プロ－ＢＩＴＥ）分子の一部として処方される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（プロ－ＣＡＲ）改変Ｔ細胞または他の遺伝子改変受容体の一部として処方される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体、抗体接合体、活性化可能抗体、接合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体は、１種または複数の追加の薬剤または追加の薬剤の組合せと共に使用される。好適な追加の薬剤は、例えば、癌などの目的の用途のための現在の医薬品および／または外科療法を含む。例えば、活性化可能抗体、接合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体は、追加の化学療法剤または抗悪性腫瘍薬と共に使用できる。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体である。本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体は、複数の抗原またはエピトープを認識し、かつＭＭの結合が、その標的を結合する抗原またはエピトープ結合ドメインの能力を低減するように多重特異性抗体の少なくとも１種の抗原またはエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１個のマスキング部分（ＭＭ）を含む、多重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、少なくとも１種のＭＭＰプロテアーゼおよび少なくとも１種のＳＰに対する基質として機能する切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２基質）を介して、多重特異性抗体の抗原またはエピトープ結合ドメインに結合される。本明細書で提供される活性化可能な多重特異性抗体は、循環中に安定であり、意図された治療部位および／または診断部位で活性化されるが、正常な、すなわち健康な組織では活性化されず、活性化された場合には、対応する非修飾の多重特異性抗体に少なくとも匹敵する標的への結合を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合し、かつＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列およびＶＨ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列およびＶＨ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号２２０）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号２２１）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号２２２）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；およびそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、かつＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号２２３）を少なくとも含むＶＬ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２２４）を少なくとも含むＶＬ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号２２５）を含むＶＬ ＣＤＲ３配列；およびそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、かつＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列およびＶＨ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列およびＶＨ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号２２０）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号２２１）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号２２２）に対し、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；およびそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、かつＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号２２３）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含むＶＬ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２２４）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含むＶＬ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号２２５）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含むＶＬ ＣＤＲ３配列；およびそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、かつＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ＶＨ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号２２０）を少なくとも含み；ＶＨ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号２２１）を少なくとも含み；ＶＨ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号２２２）を含み；ＶＬ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号２２３）を少なくとも含み；ＶＬ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２２４）を少なくとも含み；ＶＬ ＣＤＲ３配列はアミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号２２５）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、かつＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ＶＨ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号２２０）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号２２１）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号２２２）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号２２３）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２２４）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号２２５）に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、配列番号２５～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、および本明細書で開示される抗ジャグド抗体のアミノ酸配列を含む抗ジャグド抗体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、配列番号２５～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、および配列番号４０１のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号４００のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性活性化可能抗体および／または接合型多重特異性活性化可能抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、少なくとも配列番号４００の重鎖アミノ酸配列および配列番号４０３～４２３および４５０～４６２からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体はまた、ＡＢに接合された薬剤も含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、治療薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗腫瘍薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、毒素またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、薬剤は、リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、薬剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡインターカレーターなどの核酸損傷剤、または他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも１種のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含むリンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、表３に列挙される群から選択される薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、抗炎症剤である。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体はまた、検出可能な部分も含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、診断薬である。
いくつかの実施形態では、接合型抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１種または複数の金属イオン、またはリガンドベース標識を含む。いくつかの実施形態では、イメージング剤は、放射性同位体を含む。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、インジウムまたはテクネチウムである。いくつかの実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウムまたは酸化鉄を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ－ガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、またはユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態では、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。いくつかの実施形態では、標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識、例えば、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０を含む。いくつかの実施形態では、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは１種または複数のハプテンを含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に接合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、シグナルペプチドの非存在下で活性化可能抗体に接合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接的に接続される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、スペーサー－ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢのＮ末端からＣ末端への構造的配置で活性化可能抗体のＭＭに直接的に接続される。活性化可能抗体のＭＭのＮ末端に直接接続されるスペーサーの例は、ＱＧＱＳＧＱ（配列番号１５３）、ＧＱＳＧＱ（配列番号１５４）、ＱＳＧＱ（配列番号１５５）、ＳＧＱ、ＧＱ、およびＱからなる群から選択されるアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱ（配列番号１５３）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱＳＧＱ（配列番号１５４）を包含する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＳＧＱ（配列番号１５５）を包含する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＳＧＱを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱを包含する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列Ｑを包含する。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体中のＡＢは天然では、１個または複数のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢは、１個または複数のジスルフィド結合を含むよう改変され得る。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、対応する抗体の血清半減期より長い；例えば、活性化可能抗体のｐＫは、対応する抗体のｐＫより長い。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する多抗体の半減期に類似する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
本開示はまた、所定の標的を特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体を含む組成物および方法も提供し、ＡＢは、ＡＢのその標的を結合する能力を低減するマスキング部分（ＭＭ）に結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体はさらに、少なくとも１種のＭＭＰおよび少なくとも１種のＳＰに対する基質であるＣＭ１－ＣＭ２基質も含む。本明細書に提供される組成物および方法は、活性化可能抗体の活性（例えば、マスキング、活性化または結合活性）を損なうことなく、ＡＢ中の１個または複数のシステイン残基への１種または複数の薬剤の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法では、ＭＭ内の１個または複数のジスルフィド結合を減少させる、あるいは妨げることなく、ＡＢ中の１個または複数のシステイン残基への１種または複数の薬剤の付着を可能にする。本明細書で提供される組成物および方法は、１種または複数の薬剤、例えば種々の治療、診断および／または予防薬のいずれかに接合される活性化可能抗体を生成し、例えば、いくつかの実施形態では、いずれの薬剤も活性化可能抗体のどのＭＭにも接合されていない。本明細書で提供される組成物および方法は、ＭＭが、未切断状態で活性化可能抗体のＡＢを効果的にかつ効率的にマスクする能力を保持する、接合型活性化可能抗体を生成する。本明細書で提供される組成物および方法は、活性可能抗体が、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できるＭＭＰの存在下で、まだ活性化されている、すなわち切断されている、接合型活性化可能抗体を生成する。
活性化可能抗体は、薬剤に対する少なくとも１つの接合点を有するが、本明細書に提供される方法および組成物においては、すべての可能な接合点が薬剤への接合のために利用できる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の接合点は、ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の接合点は、鎖間ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の接合点は、鎖間スルフィド結合に関与する硫黄原子であるが、鎖内ジスルフィド結合に関与する硫黄原子ではない。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の接合点は、システインの硫黄原子または硫黄原子を含む他のアミノ酸残基である。このような残基は、抗体構造中に天然で存在し得るか、または部位特異的変異誘発、化学変換、もしくは非天然アミノ酸の誤取り込みにより抗体に取り込まれ得る。
ＡＢ中に１個または複数の鎖間ジスルフィド結合およびＭＭ中に１個または複数の鎖内ジスルフィド結合を有する活性化可能抗体の接合体を調製する方法も提供され、遊離チオールと反応する薬剤が提供される。この方法は一般に、例えばＴＣＥＰなどの、還元剤でＡＡ中の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元すること、および遊離チオールと反応する薬物を、部分的に還元された活性化可能抗体に接合することを含む。本明細書において使用される場合、用語「部分的還元」は、多重特異性活性化可能抗体が、還元剤と接触され、すべてのジスルフィド結合より少ない、例えば、すべての可能な結合部位より少ない部位が還元される状況を指す。いくつかの実施形態では、すべての可能な接合部位の９９％未満、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満が還元される。
いくつかの実施形態では、薬剤、例えば、薬物を還元し、活性化可能抗体に接合し、薬剤の配置における選択性を与える方法が提供される。方法は一般に、活性化可能抗体のマスキング部分または他の非ＡＢ部分中のいずれかの接合部位が還元されないように、還元剤により活性化可能抗体を部分的に還元すること、およびＡＢ中の鎖間チオールに薬剤を接合することを含む。接合部位は、薬剤の所望の配置を可能にして接合が所望の部位で生じ得るように選択される。還元剤は、例えば、ＴＣＥＰである。還元反応条件、例えば、還元剤の活性化可能抗体に対する比、インキュベーションの長さ、インキュベーションの間の温度、還元反応溶液のｐＨ、等は、ＭＭが、未切断状態で活性化可能抗体のＡＢを効果的にかつ効率的にマスクする能力を保持する、接合型活性化可能抗体を生成する条件を特定することにより、決定される。還元剤の活性化可能抗体に対する比は、活性化可能抗体に依存して変化するであろう。いくつかの実施形態では、還元剤の活性化可能抗体に対する比は、約２０：１～１：１、約１０：１～１：１、約９：１～１：１、約８：１～１：１、約７：１～１：１、約６：１～１：１、約５：１～１：１、約４：１～１：１、約３：１～１：１、約２：１～１：１、約２０：１～１：１．５、約１０：１～１：１．５、約９：１～１：１．５、約８：１～１：１．５、約７：１～１：１．５、約６：１～１：１．５、約５：１～１：１．５、約４：１～１：１．５、約３：１～１：１．５、約２：１～１：１．５、約１．５：１～１：１．５、または約１：１～１：１．５の範囲であろう。いくつかの実施形態では、比は、約５：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約８：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約２．５：１～１：１の範囲である。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体のＡＢ中の鎖間ジスルフィド結合を還元し、得られる鎖間チオールに、薬剤、例えば、薬物などのチオール含有薬剤を接合して、ＡＢ上に薬剤を選択的に配置する方法が提供される。この方法は一般に、ＡＢを還元剤により部分的に還元して、活性化可能抗体においてすべての可能な鎖間チオールを形成することなく、少なくとも２つの鎖間チオールを形成すること、および部分的に還元されたＡＢの鎖間チオールに薬剤を接合することを含む。例えば、活性化可能抗体のＡＢは、還元剤：活性化可能抗体の所望の比率にて、約３７℃で約１時間にわたり部分的に還元される。いくつかの実施形態では、還元剤対活性化可能抗体の比は、約２０：１～１：１、約１０：１～１：１、約９：１～１：１、約８：１～１：１、約７：１～１：１、約６：１～１：１、約５：１～１：１、約４：１～１：１、約３：１～１：１、約２：１～１：１、約２０：１～１：１．５、約１０：１～１：１．５、約９：１～１：１．５、約８：１～１：１．５、約７：１～１：１．５、約６：１～１：１．５、約５：１～１：１．５、約４：１～１：１．５、約３：１～１：１．５、約２：１～１：１．５、約１．５：１～１：１．５、または約１：１～１：１．５の範囲であろう。いくつかの実施形態では、比は、約５：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１～１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約８：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約２．５：１～１：１の範囲である。
チオール含有試薬は、例えば、システインまたはＮ－アセチルシステインであり得る。還元剤は、例えば、ＴＣＥＰであり得る。いくつかの実施形態では、還元された活性化可能抗体は、結合の前に、例えばカラムクロマトグラフィー、透析または透析濾過を用いて精製されてよい。いくつかの実施形態では、還元された抗体は、部分的還元後および結合前に、精製されない。
本開示はまた、活性化可能抗体中の少なくとも１個の鎖間ジスルフィド結合が、活性化可能抗体中のいずれかの鎖内ジスルフィド結合を乱すことなく、還元剤により還元されている、部分的に還元された活性化可能抗体を提供し、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、末切断状態で活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、およびＡＢに結合したＣＭ１－ＣＭ２基質（少なくとも１種のＭＭＰおよび１種のＳＰに対する基質として機能するポリペプチドである）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の１個または複数の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤により乱されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体内のＭＭの１個または複数の鎖内ジスルフド結合は、還元剤により乱されない。いくつかの実施形態では、末切断状態での活性化可能抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ。いくつかの実施形態では、還元剤は、ＴＣＥＰである。
本開示はまた、活性化可能抗体中の少なくとも１個の鎖内ジスルフィド結合が、活性化可能抗体の活性および／または効力を妨害しないで、あるいは損なわないで、還元剤により還元されている、本開示の多重特異性活性化可能抗体を包含するがこれに限定されない、部分的に還元された活性化可能抗体も提供し、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、末切断状態で活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、およびＡＢに結合されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含み、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、プロテアーゼに対する基質として機能するポリペプチドである。活性化可能抗体の活性および／または有効性は、非制限的例によれば、マスキング活性、活性化可能抗体の活性化、および／または活性化された活性化可能抗体の結合活性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の１個または複数の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤により乱されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体内のＭＭの１個または複数の鎖内ジスルフド結合は、還元剤により乱されない。いくつかの実施形態では、末切断状態での活性化可能抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ。いくつかの実施形態では、還元剤は、ＴＣＥＰである。
本開示はまた、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）ペイロードに連結される活性化可能抗体を含む接合型活性化可能抗体も提供し、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、標的への未切断状態での活性化可能抗体のＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、およびＡＢに結合されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含み、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、少なくとも１種のＭＭＰプロテアーゼおよび少なくとも１種のＳＰプロテアーゼに対する基質として機能するポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤ－接合型活性化可能抗体は、次のような、ＡＢに薬剤を付着するためのいくつかの方法のいずれかを用いて接合され得る：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への付着、または（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への付着、または（ｃ）ＡＢのアミノ基への付着、または（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への付着。
いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢ中のシステインに接合される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢ中のリシンに接合される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介して、本明細書で開示の残基などの、ＡＢの別の残基に接合される。いくつかの実施形態では、リンカーはチオール含有リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断不能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、表５および６に示されるリンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、本明細書で開示の部分的還元および接合技術を用いてＡＢに接合される。
本開示はまた、本明細書で提供される１種または複数のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含む、ポリペプチドおよび他のより大きな分子も提供する。非限定的例であるが、本明細書で提供されるＣＭ１－ＣＭ２基質配列は、プロドラッグ組成物およびその使用方法において有用である。本明細書で提供されるこれらのＣＭ１－ＣＭ２基質配列はまた、プローブおよび他の検出薬、およびその使用方法において有用である。例えば、本明細書で提供されるＣＭ１－ＣＭ２基質配列は、検出薬、例えば、イメージング剤および／または他の診断薬を生成するために、蛍光クエンチャーおよびその他のクエンチャーと組み合わせて使用され得る。当業者は、本明細書に提供されるＣＭ１－ＣＭ２基質配列が、少なくとも１種のＭＭＰおよび少なくとも１種のＳＰにより切断可能な基質を用いる可能性のある、当該技術分野における任意の組成物および／または方法で有用であることを理解するであろう。
本開示はまた、本明細書に記載される抗体および／または活性化可能抗体をコードする単離核酸分子、およびこれらの単離核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、抗体および／または活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で、このようなベクターを含む細胞を培養することにより、抗体および／または活性化可能抗体を製造する方法を提供する。
本開示は、（ａ）抗体の発現をもたらす条件下で、抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養することであって、（ｉ）抗体はＣＭ１－ＣＭ２基質を含み、（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、マトリックスメタロプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼに対する基質として機能するポリペプチドである、培養すること；（ｂ）抗体を回収すること；および（ｃ）１種または複数の追加の薬剤に回収した抗体を接合すること、により、所定の標的を結合する本開示の接合型抗体を製造する方法を提供する。
本開示はまた、（ａ）活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で、活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養することであって、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、ＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、（ｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＭＭＰおよびＳＰに対する基質として機能するポリペプチドであり；（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、かつ切断された状態で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害しないか、またはそれと競合しないように、活性化可能抗体中に配置される、培養すること；および（ｂ）活性化可能抗体を回収すること、により、活性化された状態で所定の標的を結合する本開示の活性化可能抗体を製造する方法も提供する。
本開示はまた、（ａ）活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で、活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養することであって、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、ＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、（ｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＭＭＰおよびＳＰおよび／またはＣＰに対する基質として機能するポリペプチドであり；（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、かつ切断された状態で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害しない、またはそれと競合しないように、活性化可能抗体中に配置される、培養すること；（ｂ）活性化可能抗体を回収すること；および（ｃ）１種または複数の追加の薬剤に回収した抗体を接合すること、により、所定の標的を活性化された状態で結合する本開示の接合型活性化可能抗体を製造する方法も提供する。
本開示は、それを必要としている対象に治療的有効量の本明細書に記載される接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を投与することにより、対象において標的関連疾患を予防する、その進行を遅延させる、それを治療する、その症状を軽減する、あるいは改善する方法を提供する。
本開示は、それを必要としている対象に治療的有効量の本明細書に記載される接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を投与することにより、対象において炎症および／または炎症性疾患を予防する、その進行を遅延させる、それを治療する、その症状を軽減する、あるいは改善する方法を提供する。本開示は、それを必要としている対象に治療的有効量の本明細書に記載される接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を投与することにより、対象において癌を予防する、その進行を遅延させる、それを治療する、その症状を軽減する、あるいは改善する方法を提供する。本開示は、それを必要としている対象に治療的有効量の本明細書に記載される接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を投与することにより、対象において自己免疫疾患を予防する、その進行を遅延させる、それを治療する、その症状を軽減する、あるいは改善する方法を提供する。
これらの方法および使用の実施形態のいずれかで使用される接合型活性化抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、いずれの病期であっても投与できる。例えば、そのような接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、早期～転移性のいずれの段階の癌を有する患者にも投与できる。用語の「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は同義的に使用される。
いくつかの実施形態では、対象はヒト、非ヒト霊長類、伴侶動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業用動物、または動物園の動物などの、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は伴侶動物である。いくつかの実施形態では、対象は獣医師がケアしている動物である。
接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、およびそれらの治療製剤は、異常な標的発現および／または活性に関連する疾患または障害を有するか、またはそれらに罹患しやすい対象に投与される。異常な標的発現および／または活性に関連する疾患または障害を有するか、またはそれらに罹患しやすい対象は、当業界において知られている種々の方法のいずれかを用いて、特定される。例えば、癌または他の腫瘍状態に罹患している対象は、種々の臨床検査および／または実験室試験、例えば、健康状態を評価するための身体検査および血液、尿および／または便分析などのいずれかを用いて特定される。例えば、炎症および／または炎症性障害に罹患している対象を、健康状態を評価するための身体検査および／または体液分析、例えば、血液、尿、および／または便の分析など、様々な臨床検査および／または実験室試験のいずれかを使用して特定する。
異常標的発現および／または活性に関連する疾患または障害を有する患者への接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体の投与は、種々の実験室または臨床目的のいずれかが達成されると、成功したと見なされる。例えば、異常標的発現および／または活性に関連する疾患または障害を有する患者への接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体の投与は、疾患または障害に関連する１つまたは複数の症状が軽減されるか、低減されるか、抑制されるか、またはさらに悪化状態に進行しない場合、成功したと見なされる。異常標的発現および／または活性に関連する疾患または障害を有する患者への接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体の投与は、疾患または障害が寛解するか、またはさらに悪化状態に進行しない場合、成功したと見なされる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、１種または複数の追加の薬剤と併せてまたは追加の薬剤と組み合わせて使用される。好適な追加の薬剤は、例えば、癌などの目的の用途のための現在の医薬品および／または外科療法を含む。例えば、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、追加の化学療法剤または抗悪性腫瘍薬と併せて使用できる。
いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、アブラキサン（すなわち、アルブミン結合パクリタキセル）、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、イリノテカン、およびゲムシタビンからなる群から選択される化学療法剤などの、化学療法剤である。
いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、チェックポイント阻害剤、キナーゼ阻害剤、腫瘍微小環境中の阻害剤を標的とする薬剤、および／またはＴ細胞またはＮＫアゴニストである。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、単独の、または化学療法剤もしくは抗新生物剤などの別の追加の薬剤と組み合わせた放射線療法である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ワクチン、オンコウィルス、および／またはＤＣ活性化剤、例えば、非限定的な例として、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび／またはα－ＣＤ４０である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ＡＤＣＣを介してまたは毒素への直接の接合を介して、腫瘍を死滅させるようにデザインされた腫瘍標的化抗体（例えば、抗体薬物接合体（ＡＤＣ））である。
いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、およびＶｉｓｔａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、Ｂ－ＲＡＦｉ、ＭＥＫｉ、およびイブルチニブなどのＢｔｋ阻害剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、クリゾチニブである。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境阻害剤は、ＩＤＯ阻害剤、α－ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、α－ＣＣＲ４阻害剤、ＴＧＦ－β、骨髄由来サプレッサー細胞、またはＴ－調節細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アゴニストは、Ｏｘ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、およびＨＶＥＭからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＬＡＧ－３阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＩＧＩＴ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＩＭ－３である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、Ｂ７Ｈ４阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、Ｖｉｓｔａ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、Ｂ－ＲＡＦｉ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＭＥＫｉ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、Ｂｔｋ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、イブルチニブである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、クリゾチニブである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＩＤＯ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、α－ＣＳＦ１Ｒ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、α－ＣＣＲ４阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＧＦ－βである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、骨髄由来サプレッサー細胞である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、Ｔ調節細胞である。
いくつかの実施形態では、アゴニストは、Ｏｘ４０である。いくつかの実施形態では、アゴニストは、ＧＩＴＲである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、ＣＤ１３７である。いくつかの実施形態では、アゴニストは、ＩＣＯＳである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、ＣＤ２７である。いくつかの実施形態では、アゴニストは、ＨＶＥＭである。
いくつかの実施形態では、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、１種または複数の追加の薬剤、例えば化学療法剤、抗炎症剤、および／または免疫抑制剤と組み合わせて、治療の間および／または治療の後に投与される。いくつかの実施形態では、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、単一の治療組成物に製剤化され、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、同時に投与される。あるいは、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、お互い別々であり、例えばそれぞれは、別の治療組成物に製剤化され、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は同時に投与されるか、または抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、治療レジメンの間に異なった時点で投与される。例えば、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、追加の薬剤の投与の前に投与される、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、追加の薬剤の投与に続いて投与される、または抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、交互に投与される。本明細書に記載されるように、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、単回投与される、または複数回投与される。
いくつかの実施形態では、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、同時投与される。例えば、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、単一の組成物に処方され、または複数の別々の組成物として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、順次に投与され、あるいは、抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、治療レジメンの間の異なる時点で投与される。
いくつかの実施形態では、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、１種または複数の追加の薬剤、例えば、非限定例として抗炎症剤、免疫抑制剤、化学療法剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞毒性抗生物質および／またはいずれか他の核酸損傷剤と組合せて、治療の間および／または治療の後に投与される。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、パクリタキセル（例えば、アブラキサン（登録商標））などの、タキサンである。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ゲムシタビンなどの、抗代謝剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、カルボプラチンまたはシスプラチンなどの、白金ベースの化学療法剤などの、アルキル化剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブまたはエルロチニブなどの、標的薬である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、別の抗体、例えばモノクローナル抗体（例えばベバシズマブ）、二重特異性抗体、または多重特異性抗体などの、標的薬である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブなどの、プロテアソーム阻害剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、レナリドマイド（ｌｅｎｏｌｉｄｏｍｉｎｄｅ）またはＩＬ－２などの、免疫調節薬である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、放射線である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、当業者により標準治療と考えられる薬剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、当業者に公知の化学療法剤である。
いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、抗体、別の複合化抗体、別の活性化可能抗体および／または別の接合型活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、第１の接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体と同じ標的に対する抗体、別の接合型抗体、別の活性化可能抗体および／または別の接合型活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、第１の接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体の標的と異なる標的に対する抗体、別の接合型抗体、別の活性化可能抗体および／または別の接合型活性化可能抗体である。
いくつかの実施形態では、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、同時に投与される。例えば、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、単一組成物に配合され、または複数の別々の組成物として投与され得る。いくつかの実施形態では、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および追加の薬剤は、逐次に投与されるか、または抗体および／または接合型抗体および追加の薬剤は、治療レジメンの間の異なる時点で、投与される。例えば、抗体および／または接合型抗体は、追加の薬剤の投与の前に投与され、抗体および／または接合型抗体は、追加の薬剤の投与に続いて投与されるか、または抗体および／または接合型抗体および追加の薬剤は、交互に投与される。本明細書に記載されるように、抗体および／または接合型抗体および追加の薬剤は、単回投与されるまたは複数回投与される。
本開示はまた、種々の診断および／または予防適用での接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体の使用のための方法およびキットも提供する。
本開示による医薬組成物は、本開示の抗体、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および担体を含み得る。これらの医薬組成物は、例えば診断キットなどの、キットに含まれ得る。
接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む。ＡＢの標的の例示的種類は、細胞表面受容体および分泌結合タンパク質（例えば、成長因子）、可溶性酵素、構造タンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）などを包含するが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、接合型抗体および／または活性化可能抗体は、細胞外標的、通常は細胞外タンパク質標的、を結合するＡＢを有する。いくつかの実施形態では、接合型抗体および／または活性化可能抗体は、細胞取り込みのためにデザインされ、細胞内で切替え可能である。
非制限的な例として、ＡＢは、表１に列挙される任意の標的のための結合パートナーである。
Figure 2022512124000003
Figure 2022512124000004
非制限的な例として、ＡＢは、表２に列挙される抗体であるか、またはその抗体に由来する。
Figure 2022512124000005
Figure 2022512124000006
本明細書に提供される活性化可能抗体および活性化可能抗体組成物は、標的、例えばヒト標的を特異的に結合する抗体またはその抗体フラグメント（ひとまとめにして、本開示を通してＡＢと呼ばれる）を少なくとも含み、ＡＢはマスキング部分（ＭＭ）により修飾される。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、特定の抗体または抗体フラグメントと共に使用するために選択される。例えば、ＥＧＦＲを結合する抗体と共に使用するための適切なマスキング部分は、配列ＣＩＳＰＲＧ（配列番号１６５）を含むＭＭを包含する。非制限的例として、ＭＭは、ＣＩＳＰＲＧＣ（配列番号１６６）；ＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１６７）；ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号１６８）；ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭ（配列番号１６９）、ＣＩＳＰＲＧＣＥＰＧＴＹＶＰＴ（配列番号１７０）およびＣＩＳＰＲＧＣＰＧＱＩＷＨＰＰ（配列番号１７１）などの配列を含み得る。他の好適なマスキング部分は、非限定例であるが、ＧＳＨＣＬＩＰＩＮＭＧＡＰＳＣ（配列番号１７２）；ＣＩＳＰＲＧＣＧＧＳＳＡＳＱＳＧＱＧＳＨＣＬＩＰＩＮＭＧＡＰＳＣ（配列番号１７３）；ＣＮＨＨＹＦＹＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７４）；ＡＤＨＶＦＷＧＳＹＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７５）；ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７６）；ＣＰＨＦＴＴＴＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７７）；ＣＮＨＨＹＨＹＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７８）；ＣＰＨＶＳＦＧＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７９）；ＣＰＹＹＴＬＳＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８０）；ＣＮＨＶＹＦＧＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８１）；ＣＮＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８２）；ＣＨＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８３）；ＹＮＰＣＡＴＰＭＣＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８４）；ＣＮＨＨＹＦＹＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８５）；ＣＮＨＨＹＨＹＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８６）；ＣＮＨＶＹＦＧＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８７）；ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８８）；ＣＰＨＦＴＴＴＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８９）；ＣＮＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９０）；ＣＨＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９１）；ＣＰＹＹＴＬＳＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９２）；ＣＰＨＶＳＦＧＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９３）；ＡＤＨＶＦＷＧＳＹＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９４）；ＹＮＰＣＡＴＰＭＣＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９５）；ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９６）；Ｃ（Ｎ／Ｐ）Ｈ（Ｈ／Ｖ／Ｆ）（Ｙ／Ｔ）（Ｆ／Ｗ／Ｔ／Ｌ）（Ｙ／Ｇ／Ｔ／Ｓ）（Ｔ／Ｓ／Ｙ／Ｈ）ＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９７）；ＣＩＳＰＲＧＣＧＱＰＩＰＳＶＫ（配列番号１９８）；ＣＩＳＰＲＧＣＴＱＰＹＨＶＳＲ（配列番号１９９）；および／またはＣＩＳＰＲＧＣＮＡＶＳＧＬＧＳ（配列番号１６４）などの、国際公開第ＷＯ２０１０／０８１１７３号で開示のＥＧＦＲ特異的マスクのいずれかを含む。
ＡＢがＭＭにより修飾され、標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの標的への特異的結合、または親ＡＢの標的への特異的結合に比較して、低減されるか、または抑制される。
標的に対する、ＭＭにより修飾されたＡＢのＫｄは、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、または標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍またはそれを超えて、または５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００、または１００，０００～１０，０００，０００倍大きい。逆に、ＭＭにより修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭにより修飾されていないＡＢまたは親ＡＢの標的に対する結合親和性よりも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍またはそれを超えて、または５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００または１００，０００～１０，０００，０００倍小さい。
ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は一般に、標的に対するＡＢのＫｄよりも大きい。ＡＢに対するＭＭのＫｄは、標的に対するＡＢのＫｄより少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、またはさらには１０，０００，０００倍大きくなり得る。逆に、ＡＢに対するＭＭの結合親和性は一般に、標的に対するＡＢの結合親和性よりも小さい。ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、標的に対するＡＢの結合親和性より少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、またはさらには１０，０００，０００倍小さくなり得る。
ＡＢがＭＭで修飾され、標的の存在下にある場合、ＡＢの標的への特異的結合は、ＭＭで修飾されていないＡＢの特異的結合または親ＡＢの標的への特異的結合と比較して、低減または抑制される。ＭＭで修飾されていないＡＢの標的への結合または親ＡＢの標的への結合と比較すると、ＭＭで修飾された場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボまたはインビトロアッセイで測定した場合、少なくとも２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、もしくは９６時間、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、もしくは１８０日、または、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月、またはそれより長い期間にわたり、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％低減され得る。
ＭＭは、ＡＢのその標的への結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢの抗原結合ドメインを結合し、ＡＢの標的への結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢのその標的への結合を立体的に阻害できる。ＭＭは、ＡＢの標的への結合をアロステリックに抑制できる。これらの実施形態においてＡＢがＭＭに修飾されるかまたはＭＭに結合され、かつ標的の存在下にある場合、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、親ＡＢ、またはＭＭに結合されていないＡＢの標的に対する結合に比べて、インビボまたはインビトロアッセイで測定される場合に少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４または９６時間、または５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０または１８０日、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月またはそれより長い期間にわたり、標的へのＡＢの結合は存在しないか、または実質的に存在しないか、またはわずか０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または５０％しか、標的へのＡＢの結合は存在しない。
ＡＢがＭＭに結合されるか、またはＭＭにより修飾される場合、ＭＭはＡＢのその標的への特異的結合を「マスクする」または低減する、あるいは抑制する。ＡＢがＭＭに結合されるか、またはＭＭにより修飾される場合、このような結合または修飾は、ＡＢがその標的に特異的に結合する能力を低下させるか、または抑制する構造変化を引き起こし得る。
ＭＭに結合された、またはＭＭに修飾されたＡＢは、次の式により表すことができる（アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域へ順に）：
（ＭＭ）－（ＡＢ）
（ＡＢ）－（ＭＭ）
（ＭＭ）－Ｌ－（ＡＢ）
（ＡＢ）－Ｌ－（ＭＭ）
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは抗体またはその抗体フラグメントであり、Ｌはリンカーである。多くの実施形態では、柔軟性を与えるように、１個または複数のリンカー、例えば、可撓性リンカーを組成物中に挿入することが望ましい場合がある。
特定の実施形態において、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーを含まないかまたはそのパートナーに対する相同性を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しせいぜい５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％しか、類似していない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対し、わずか２５％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか５０％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか２０％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか１０％しか同一でない。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭにより修飾され、かつまた、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である少なくとも１個の切断可能部分（ＣＭ１）および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）を含む、ＡＢを含む。そのような活性化可能抗体は、ＡＢの標的への活性化可能な／切替可能な結合を示す。活性化可能抗体は一般に、マスキング部分（ＭＭ）およびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されるかまたはそれに結合される、抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含む。
活性化可能抗体中の要素は、切断された（または比較的活性な）状態でおよび標的の存在下でＡＢは標的を結合し、一方で切断されていない（または相対的に不活性な）状態で標的の存在下では、ＡＢのその標的への特異的結合が低減されるまたは抑制されるように、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質が適切な位置に置かれるように整列される。ＡＢの標的への特異的結合は、ＭＭによるその標的を特異的に結合するＡＢの能力の抑制またはマスキング
により低減され得る。
標的に対する、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されたＡＢのＫｄは、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢ、または標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍またはそれを超えて、または５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００または１００，０００～１０，０００，０００倍大きい。逆に、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢまたは標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍またはそれを超えて、または５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００または１００，０００～１０，０００，０００倍小さい。
ＡＢがＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾され、かつその標的の存在下にあるが修飾剤（例えば、ＭＭＰおよびＳＰ）の存在下にない場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢの特異的結合または親ＡＢの標的への特異的結合に比べて、低減されるかまたは抑制される。親ＡＢの結合、またはＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢの標的への結合に比較される場合、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾される場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボまたはインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４または９６時間、または５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０または１８０日、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月またはそれを超える期間にわたり、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびさらに１００％低減され得る。
本明細書において使用される場合、用語の切断された状態は、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼによるＣＭ１－ＣＭ２基質の修飾、すなわち、切断の後の活性化可能抗体の状態を指す。用語、未切断状態または完全に未切断状態は、本明細書において使用される場合、ＭＭＰおよび／またはＳＰによるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断の非存在下での活性化可能抗体の状態を指す。上で考察されたように、用語「活性化可能抗体（ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、その切断されていない（天然の）状態およびその切断された状態の両方での活性化可能抗体を指すために本明細書で使用される。その切断状態にある活性化可能抗体はまた、本明細書中で活性化された抗体および／または活性化された活性化可能抗体とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、切断された活性化可能抗体は、プロテアーゼによるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断のために、ＭＭを欠いており、少なくともＭＭの放出をもたらすことは、当業者に明らかであろう。
活性化可能なまたは切替可能な、とは、活性化可能抗体が、阻害された、マスクされた、または未切断の状態で、標的への結合の第１のレベル（第１のコンホメーション）、および阻害されていない、マスクされていない、および／または切断された状態で、標的への結合の第２のレベル（すなわち、第２のコンホメーション）を示し、標的結合の第２のレベルは、結合の第１のレベルよりも大きいことを意味する。一般的に、活性化可能抗体のＡＢへの標的のアクセスは、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる切断剤の存在下で、そのような切断剤の非存在下の場合よりも高い。従って、活性化可能抗体が未切断の状態にある場合、ＡＢは標的結合から阻害され、標的結合からマスクされ得（すなわち、第１のコンホメーションは、ＡＢが標的を結合できないようなものである）、切断された状態で、ＡＢは抑制されないか、または標的結合に対しマスクされない。
活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質およびＡＢは、ＡＢが所定の標的に対する結合部分であり、ＣＭ１－ＣＭ２基質がＭＭＰおよびＳＰに対する基質であるように選択され、ＭＭＰおよび／またはＳＰは、対象の治療部位または診断部位で標的と共局在する。本明細書に開示される活性化可能抗体は、例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質中の部位をそれぞれ切断できるＭＭＰおよびＳＰが、非治療部位の組織中（例えば、健康な組織中）よりも、治療部位または診断部位の標的含有組織中で、比較的高いレベルで存在する場合、特に有用である。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、別の方法では、ＡＢがマスクされないかさもなければその標的への結合から阻害される場合に非治療部位でのＡＢの結合から生じる可能性のある、毒性および／または有害な副作用の低減をもたらす。
一般的に、活性化可能抗体は、目的のＡＢを選択することおよび活性化可能抗体の残りを構築することによりデザインでき、その結果、コンホメーション上の制約がある場合、ＭＭはＡＢのマスキング、またはＡＢのその標的への結合の低減を提供する。構造設計基準は、この機能的特徴を与えるように考慮され得る。
阻害されていないコンホメーションに対する阻害されたコンホメーションでの標的結合のための所望のダイナミックレンジの切替可能な表現型を示す活性化可能抗体が、提供される。ダイナミックレンジは通常、（ａ）第１セットの条件下でのパラメーターの最大検出レベル対（ｂ）第２セットの条件下のそのパラメーターの最小検出値の比、を指す。例えば、活性化可能抗体の場合、ダイナミックレンジは、（ａ）活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できるＭＭＰおよびＳＰの存在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最大検出レベル対（ｂ）プロテアーゼの非存在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最小検出レベル、の比率を指す。活性化可能抗体のダイナミックレンジは、活性化可能抗体切断剤（例えば、酵素）処理の解離定数対複数の活性化可能抗体切断剤処理の解離定数、の比率として計算され得る。活性化可能抗体のダイナミックレンジが大きいほど、活性化可能抗体の切り替え可能な表現型はより良好である。比較的高いダイナミックレンジ値（例えば、１よりも高い値）を有する活性化可能抗体は、活性化可能抗体による標的タンパク質結合が、切断剤（例えば、酵素）の非存在下でよりも活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる切断剤の存在下でより高い程度に発生する（例えば、主に発生する）ような、より望ましいスイッチング表現型を示す。
活性化可能抗体は、種々の構造配置で提供され得る。活性化可能抗体についての例示的式が、下記に提供される。ＡＢ、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質のＮ－からＣ－末端への順が活性化可能抗体内で逆にされ得ることが、特に意図される。ＣＭおよびＭＭが、例えばＣＭ１－ＣＭ２基質がＭＭ内に少なくとも部分的に含まれるように、アミノ酸配列においてオーバーラップしてよいことも、特に意図される。
例えば、活性化可能抗体は、次の式（アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域へ順に）：
（ＭＭ）－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－（ＡＢ）
（ＡＢ）－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－（ＭＭ）
により表すことができ、式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＣＭ１－ＣＭ２基質は切断可能部分であり、ＡＢは抗体またはそのフラグメントである。先に述べたように、「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語は、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である第１の切断可能部分（ＣＭ１）および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）の配向または他の構造配置に関するどのような要件を示唆することも意図しない。したがって、「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有するＣＭ１－ＣＭ２基質を包含する：ＣＭ１－ＣＭ２またはＣＭ２－ＣＭ１。「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語はまた、ＣＭ１配列の少なくとも一部がＣＭ２配列の少なくとも一部に重なる基質も包含する。ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質は上記式において別々の成分として示されるが、本明細書において開示されるすべての例示的実施形態（式を含む）では、ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質のアミノ酸配列は、ＣＭ１－ＣＭ２基質がＭＭ内に完全にまたは部分的に含まれるように重なり合い得ることが意図されることにも留意されたい。加えて、上記式は、活性化可能抗体要素に対しＮ末端またはＣ末端に配置され得る追加のアミノ酸配列を提供する。
特定の実施形態において、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーを含まないかまたはそのパートナーに対する相同性を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しせいぜい５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％しか、類似しない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか５０％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか２５％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか２０％しか同一でない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対しわずか１０％しか同一でない。
多くの実施形態では、１種または複数のＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質結合、ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ結合、または両方での柔軟性を提供するために、活性化可能抗体構築物中に、１個または複数のリンカー、例えば可撓性リンカーを挿入することが望ましい場合がある。例えば、ＡＢ、ＭＭおよび／またはＣＭ１－ＣＭ２基質は、所望する柔軟性を提供するための十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙおよびＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含まない。したがって、このような活性化可能抗体構築物の切替可能な表現型は、可撓性リンカーを提供するために、１個または複数のアミノ酸の導入から利益を得ることができる。さらに、下記のように、活性化可能抗体がコンホメーション上制約された構築物として提供される場合、可撓性リンカーが、切断されていない活性化可能抗体中の環状構造の形成および維持を促進するために、操作可能に導入され得る。
例えば、特定の実施形態において、活性化可能抗体は、次の式（下記式は、Ｎ末端からＣ末端方向に、またはＣ末端からＮ末端方向に、アミノ酸配列を表す）：
（ＭＭ）－ＬＰ１－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－（ＡＢ）
（ＭＭ）－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－ＬＰ２－（ＡＢ）
（ＭＭ）－ＬＰ１－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－ＬＰ２－（ＡＢ）
の１つを含み、式中、ＭＭ、ＣＭ１－ＣＭ２基質、およびＡＢは、上で定義した通りであり；ＬＰ１およびＬＰ２はそれぞれ独立に、また、任意選択で存在しまたは非存在であり、少なくとも１個の可撓性アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含む、同じまたは異なる可撓性リンカーである。加えて、上記式は、活性化可能抗体要素に対しＮ末端またはＣ末端に配置され得る追加のアミノ酸配列を提供する。例としては、限定されないが、標的化部分（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体に対するリガンド）および血清半減期を延長する部分（例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）または血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などの、血清タンパク質を結合するポリペプチド）が挙げられる。
ＣＭ１－ＣＭ２基質は、約０．００１～１５００ｘ１０４Ｍ－１Ｓ－１または少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７.５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０または１５００ｘ１０４Ｍ－１Ｓ－１の速度で少なくとも１種のＭＭＰにより特異的に切断され、約０．００１～１５００ｘ１０４Ｍ－１Ｓ－１または少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０または１５００ｘ１０４Ｍ－１Ｓ－１の速度で少なくとも１種のＳＰにより特異的に切断される。
酵素による特異的切断のために、酵素とＣＭ１－ＣＭ２基質の間の接触が行われる。ＭＭおよびＣＭ１－ＣＭ２基質に結合されたＡＢを含む活性化可能抗体が、標的および十分な酵素活性の存在下にある場合、ＣＭ１－ＣＭ２基質は切断され得る。十分な酵素活性は、ＣＭ１－ＣＭ２基質と接触し、切断をもたらす酵素の能力を指してよい。酵素はＣＭ１－ＣＭ２基質の近くにあってよいが他の細胞因子または酵素のタンパク質修飾のために切断できないことが、容易に想定される。
本明細書に記載される組成物での使用のために適切なリンカーは一般的に、標的へのＡＢの結合の阻害を促進するために、修飾されたＡＢまたは活性化可能抗体の柔軟性を提供するリンカーである。このようなリンカーは通常、可撓性リンカーと呼ばれる。好適なリンカーは容易に選択でき、好適な異なる長さのいずれか、例えば、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸長を含む、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸長であってよく、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長であり得る。
例示的可撓性リンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）を含み、式中、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当業界において知られている他の可撓性リンカーを包含する。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは比較的構造化されていないため、成分間の中性テザーとして機能し得る。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのΦ－Ψ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２年）を参照されたい）。例示的な可撓性リンカーとしては、限定されないが、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２０２）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２０３）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２０４）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２０５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２０６）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２０７）などが挙げられる。当業者は、活性化可能抗体のデザインがすべてまたは部分的に柔軟であるリンカーを含んでよく、結果的に、そのリンカーは可撓性リンカーおよび所望の多重特異性活性化可能抗体構造を提供するために低い柔軟性の構造を付与する１個または複数の部分を含み得ることを、認識するであろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体に接合される薬剤も包含する。いくつかの実施形態では、接合型薬剤は、抗炎症剤および／または抗悪性腫瘍薬などの、治療薬である。このような実施形態では、薬剤は、活性化可能抗体の炭水化物部分に接合され、例えば、いくつかの実施形態では、炭水化物部分は、活性化可能抗体内の抗体または抗原結合フラグメントの抗原結合領域の外側に配置される。いくつかの実施形態では、薬剤は、活性化可能抗体内の抗体または抗原結合フラグメントのスルフヒドリル基に接合される。
いくつかの実施形態では、薬剤は、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などの細胞傷害薬である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、標識または他のマーカーなどの検出可能な部分である。例えば、薬剤は、放射標識アミノ酸、マークされたアビジンによって検出可能な１つまたは複数のビオチニル部分（例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジンまたは光学的方法もしくは熱量測定法によって検出可能な酵素活性）、１種または複数の放射性同位体もしくは放射性核種、１種または複数の蛍光標識、１種または複数の酵素標識、および／または１種または複数の化学発光剤であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、スペーサー分子により付着される。
本開示はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などの細胞傷害薬に接合された抗体を含む免疫接合体にも関する。好適な細胞毒性剤としては、例えば、ドラスタチンおよびその誘導体（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ、ＤＭＡＦ、ＤＭＡＥ）が挙げられる。例えば、薬剤はモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、表３に列挙される群から選択される薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリンリンカーまたはマレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリンリンカーを使用してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリンリンカーを使用してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリンリンカーを使用してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してＡＢに連結されたモノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書では「ｖｃ－ＭＭＡＤ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してＡＢに連結されたモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、このリンカーペイロード構築物は本明細書では「ｖｃ－ＭＭＡＥ」と呼ばれる。ｖｃ－ＭＭＡＤおよびｖｃ－ＭＭＡＥの構造は、下に示される：
ｖｃ－ＭＭＡＤ：
Figure 2022512124000007
ｖｃ－ＭＭＡＥ：
Figure 2022512124000008
使用可能な酵素活性毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテシン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。様々な放射性核種が、放射性複合化抗体の産生のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
抗体と細胞毒性剤の接合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピン酸ジメチル・塩酸塩など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トリエン２，６－ジイソシアナートなど）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７年）に記載のとおり作製され得る。１４Ｃ－標識１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の接合のための例示的キレート化剤である。（国際公開第ＷＯ９４／１１０２６号を参照されたい）。
表３は、本明細書に記載の開示で使用され得る例示的な医薬品のいくつかを列挙するが、決して網羅的なリストであることを意味するものではない。
Figure 2022512124000009
Figure 2022512124000010
当業者であれば、多岐にわたる適切な部分が、本開示により得られる抗体に結合されてよいことを理解するであろう（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）（この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
結合は、抗体と他の部分がそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合するいずれかの化学反応により達成され得る。この連結としては、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、錯体形成など、多くの化学的機序を挙げ得る。しかし、いくつかの実施形態では、結合は、共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合、または外部架橋分子の取り込みのいずれかにより達成され得る。多くの二価または多価の連結剤は、本開示の抗体などのタンパク質分子を他の分子に結合するのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤としては、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を挙げることができる。このリストは、当該技術分野において既知の種々のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、よりよく使われる代表的カップリング剤の例示である。（Ｋｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５－２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５－２１６（１９８２）；ａｎｄ Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法に加えて、接合型活性化可能抗体は、活性化可能抗体配列に挿入されるか、他の方法により包含される改変アミノ酸配列を介した部位特異的接合のために改変され得る。これらの改変アミノ酸配列は、接合型活性化可能抗体内の接合型薬剤の制御された配置および／または投薬量を可能にするようにデザインされる。例えば、活性化可能抗体は、反応性チオール基を提供しかつタンパク質の折りたたみおよびアセンブリーに悪影響を与えず、または抗原結合を変えない、軽鎖および重鎖上の位置でのシステイン置換を含むように改変され得る。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、接合のための適切な部位を提供するために、活性化可能抗体内に１個または複数の非天然のアミノ酸残基を含むか、あるいは、導入するように改変され得る。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、その活性化可能抗体配列内に酵素的に活性化可能なペプチド配列を含むか、あるいは、導入するよう改変され得る。
好適なリンカーは、文献に記載されている。（例えば、（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について記載）を参照されたい）。また、オリゴペプチドリンカーを介して抗体に結合されたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用について記載している米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。いくつかの実施形態では、好適なリンカーとしては、（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ番号２１６５－Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣに接合されるスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２４５１０）が挙げられる。追加のリンカーは、ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢまたはスルホ－ＳＰＤＢを包含するが、これらに限定されない。
上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含み、そのため異なる物理化学的特性を有する接合体をもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳエステル含有リンカーは、スルホＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは立体障害のあるジスルフィド結合を含み、安定性が向上した接合体を形成できる。ジスルフィド結合は一般に、ジスルフィド結合がインビトロで切断されるため、他の結合よりも安定性が低く、その結果利用可能な接合体が少ない。スルホ－ＮＨＳは、特に、カルボジイミド結合の安定性を強化できる。カルボジイミドカップリング（ＥＤＣなど）は、スルホＮＨＳと組み合わせて使用される場合、カルボジイミドカップリング反応単独の場合よりも加水分解に対して耐性の高いエステルを形成する。
いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断不能である。いくつかの実施形態では、２つ以上のリンカーが存在する。２つ以上のリンカーは、すべて同じである、すなわち切断可能もしくは切断不能である、または２つ以上のリンカーは、異なる、すなわち少なくとも１つが切断可能であり少なくとも１つが切断不能である。
本開示は、薬剤をＡＢに付着させるための次記のいくつかの方法を利用する：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への付着、または（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への付着、または（ｃ）ＡＢのアミノ基への付着、または（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への付着。本開示では、ＡＢは、少なくとも２つの反応基を有する中間リンカーを介して薬剤に共有的に付着されてよく、１つはＡＢと反応し、もう１つは薬剤と反応する。任意の適合性有機化合物を含み得るリンカーは、ＡＢ（または薬剤）との反応がＡＢの反応性および選択性に悪影響を与えないように選択できる。さらに、薬剤へのリンカーの付着は、薬剤の活性を破壊しない。酸化抗体または酸化抗体フラグメントとの反応に好適であるリンカーとしては、一級アミン基、二級アミン基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、ヒドロキシルアミン基、フェニルヒドラジン基、セミカルバジド基およびチオセミカルバジド基からなる群から選択されるアミンを含むものが挙げられる。このような反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在するか、またはこのような基を含まないリンカーの適切な化学的修飾により導入され得る。
本開示では、還元されたＡＢへの結合に好適であるリンカーとしては、還元抗体またはフラグメントのスルフヒドリル基と反応できる特定の反応基を有するものが挙げられる。このような反応基としては、限定されないが、反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基など）、ｐ－メルクリベンゾエート基、およびマイケル型付加反応が可能な基（例えば、マレイミドおよびＭｉｔｒａ ａｎｄ Ｌａｗｔｏｎ、１９７９年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０１：３０９７－３１１０によって記載された型の基）が挙げられる。
本開示では、酸化Ａｂまたは還元Ａｂのいずれにも付着しない好適なリンカーとしては、Ａｂ中の非改変リシン残基に存在する一級アミノ基と反応できる特定の官能基を有するものが挙げられる。このような反応基としては、限定されないが、ＮＨＳカルボン酸または炭酸エステル、スルホＮＨＳカルボン酸または炭酸エステル、４－ニトロフェニルカルボン酸または炭酸エステル、ペンタフルオロフェニルカルボン酸または炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
本開示では、酸化Ａｂまたは還元Ａｂのいずれにも付着しない好適なリンカーとしては、好適な試薬により活性化されている、Ａｂ中のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応できる特定の官能基を有するリンカーが挙げられる。好適な活性化試薬としては、追加されたＮＨＳまたはスルホ－ＮＨＳの有無にかかわらず、ＥＤＣ、およびカルボキサミド形成に利用される他の脱水剤が挙げられる。これらの場合、好適なリンカーに存在する官能基としては、一級および二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、およびヒドラジドが挙げられる。
薬剤は、リンカーがＡＢに付着される前または後で、リンカーに付着され得る。特定の用途では、リンカーが関連する薬剤を含まない、ＡＢ－リンカー中間体を、最初に生成することが望ましい場合がある。特定の用途に応じて、特定の薬剤がリンカーに共有的に付着され得る。いくつかの実施形態では、ＡＢが、ＭＭ、ＣＭ１－ＣＭ２基質および関連するリンカーに、最初に付着され、次に、接合の目的のためにリンカーに付着される。
分枝リンカー：特定の実施形態では、薬剤の付着のための複数の部位を有する分岐リンカーが利用される。複数部位リンカーの場合、ＡＢへの単一の共有結合が、いくつかの部位で薬剤を結合できるＡＢリンカー中間体をもたらす。これらの部位は、アルデヒド基またはスルフヒドリル基、または薬剤が付着できるいずれかの化学部位であり得る。
いくつかの実施形態では、ＡＢの複数の部位での単一部位リンカーの付着により、より高い比活性（またはＡＢに対する薬剤のより高い比率）を達成できる。この複数の部位は、２つの方法のいずれかによってＡＢに導入され得る。第１の方法では、同じＡＢ中に複数のアルデヒド基および／またはスルフヒドリル基を生成させ得る。第２の方法では、ＡＢのアルデヒドまたはスルフヒドリルに、その後のリンカーへの付着のための複数の官能部位を有する「分岐リンカー」を付着させ得る。分岐リンカーまたは複数部位リンカーの官能部位は、アルデヒド基もしくはスルフヒドリル基であってよく、またはリンカーが付着され得るいずれかの化学部位であってよい。さらに高い比活性が、これらの２つの手法を組み合わせること、すなわちＡＢの複数の部位で複数の部位リンカーを結合させることにより、得られる。
切断可能なリンカー：補体系の酵素、例えば、限定されないが、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、またはタンパク質分解活性を有する別の酵素、による切断を受けやすいペプチドリンカーが、本開示の１つの実施形態で使用され得る。本開示の一方法では、薬剤は、補体による切断を受けやすいリンカーを介して付着される。抗体は、補体を活性化できるクラスから選択される。抗体－薬剤接合体はしたがって、補体カスケードを活性化し、標的部位で薬剤を放出する。本開示の別の方法では、薬剤は、タンパク質分解活性を有する酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン、活性化因子、プラスミンまたはトリプシンによる切断を受けやすいリンカーを介して付着される。これらの切断可能リンカーは、細胞外毒素、例えば、非限定的例によれば、表３に示される細胞外毒性のいずれかを含む、接合型活性化可能抗体において有用である。
切断可能なリンカー配列の非制限的剤が、表４で提供される。
Figure 2022512124000011
加えて、薬剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上でのジスルフィド結合）を介してＡＢに付着され得る。多くの腫瘍は、天然では高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するため、これはジスルフィド結合を還元でき、その後送達部位での薬剤の放出をもたらす。特定の実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質を修飾する還元剤はまた、接合型活性化可能抗体のリンカーを修飾するであろう。
スペーサーおよび切断可能なエレメント：いくつかの実施形態では、薬剤と活性化可能抗体のＡＢとの間隔を最適化するような方法でリンカーを構築することが必要な場合がある。これは、下記の一般的構造：
Ｗ－（ＣＨ２）ｎ－Ｑ
のリンカーの使用により達成され得、式中、
Ｗは、－ＮＨ－ＣＨ２－または－ＣＨ２－のいずれかであり、
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり、および
ｎは、０～２０の整数である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーエレメントおよび切断可能なエレメントを含み得る。スペーサーエレメントは、切断可能エレメントが切断を担う酵素により接近しやすいように、切断可能エレメントをＡＢのコアから離して位置付けるのに役立つ。上記の特定の分岐リンカーは、スペーサーエレメントとして機能し得る。
この考察の全体を通して、リンカーの薬剤への（またはスペーサーエレメントの切断可能エレメントへの、または切断可能エレメントの薬剤への）付着は、特定の付着様式または反応様式である必要はないことを理解されたい。好適な安定性および生物学的適合性の生成物をもたらすいずれの反応も許容される。
血清補体およびリンカーの選択：本開示の一方法では、薬剤の放出が望まれる場合、補体を活性化できるクラスの抗体であるＡＢが使用される。得られる接合体は、抗原を結合する能力および補体カスケードを活性化する能力の両方を保持する。したがって、本開示のこの実施形態では、薬剤は、切断可能リンカーまたは切断可能エレメントの一端に接続され、リンカー基の他端は、ＡＢの特定の部位に付着される。例えば、薬剤がヒドロキシ基またはアミノ基を有する場合、それは、ペプチド、アミノ酸または他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に、それぞれ、エステルまたはアミド結合を介して付着され得る。例えば、このような薬剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに付着され得る。薬剤がリンカーへの付着に干渉する官能基を含む場合、これらの干渉官能基は、付着の前に封鎖でき、生成物接合体または中間体が作製されると封鎖解除されてよい。リンカーの反対側またはアミノ末端が次いで、直接使用されるか、または補体を活性化できるＡＢへの結合のためのさらなる修飾の後に使用される。
リンカー（またはリンカーのスペーサーエレメント）は、任意の所望の長さであり得、その一端は、活性化可能抗体のＡＢの特定部位に共有的に付着され得る。リンカーまたはスペーサーエレメントの他端は、アミノ酸またはペプチドリンカーに付着され得る。
従って、これらの接合体が補体の存在下で抗原に結合する場合、薬剤をリンカーに付着するアミドまたはエステル結合が切断され、その活性型での薬剤の放出をもたらす。これらの接合体は、対象に投与されると、標的部位での薬剤の送達または放出を達成し、限定されないが、表３に提示されるように、医薬品、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤などのインビボ送達のために特に効果的である。
補体活性化を伴わない放出用リンカー：標的化送達のさらに別の用途では、補体カスケードの活性化が最終的に標的細胞を溶解するため、補体活性化のない薬剤の放出が望ましい。したがって、この手法は、薬剤の送達および放出が、標的細胞を死滅させることなく達成される必要がある場合に有用である。これは、標的細胞へのホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物質、遺伝子または酵素などの細胞メディエーターの送達が望まれる場合のゴールである。これらの接合体は、血清プロテアーゼによる切断を多少受けやすいリンカーを介して補体を活性化できないＡＢに薬剤を付着させることにより、調製され得る。この接合体が個体に投与されると、抗原抗体複合体が急速に形成されるのに対し、薬剤の切断はゆっくりと起こり、その結果、標的部位で化合物が放出される。
生化学的架橋剤：いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、特定の生化学的架橋剤を用いて、１種または複数の治療薬に接合され得る。架橋剤は、２つの異なる分子の官能基を結び付ける分子架橋を形成する。２つの異なるタンパク質を段階的様式で連結するために、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して、望ましくないホモポリマー形成を排除できる。
リソソームプロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカー、例えばＶａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａまたは他のジペプチドも有用である。さらに、リソソームの低ｐＨ環境において切断可能な、酸に不安定なリンカー、例えば、ビス－シアリルエーテルが使用され得る。他の好適なリンカーとしては、カテプシンに不安定な基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示す基質が挙げられる。
例示的ヘテロ－二官能性架橋剤が表５で示される。
Figure 2022512124000012
切断不能なリンカーまたは直接付着：本開示のいくつかの実施形態では、接合体は、薬剤が標的に送達されるが放出されないようにデザインされ得る。これは、薬剤を直接、または切断不能なリンカーを介してＡＢに付着させることにより達成され得る。
これらの切断不能リンカーとしては、アミノ酸、ペプチド、Ｄ－アミノ酸、または本明細書に記載の方法により、後でＡＢへの付着に利用できる官能基を含むように修飾され得る他の有機化合物を挙げ得る。このような有機リンカーのための一般式は式：
Ｗ－（ＣＨ２）ｎ－Ｑ
であり得、式中、
Ｗは、－ＮＨ－ＣＨ２－または－ＣＨ２－のいずれかであり、
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり、および
ｎは、０～２０の整数である。
切断不能な接合体：いくつかの実施形態では、化合物は、補体を活性化しないＡＢに付着され得る。補体を活性化できないＡＢを使用する場合、この付着は、活性化された補体による切断を受けやすいリンカーを用いて、または活性化された補体による切断を受けにくいリンカーを使用して達成され得る。
本明細書に開示される抗体は、免疫リポソームとしても配合できる。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載のものなどの当該分野で既知の方法により調製される。循環時間が延長されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所定の孔径のフィルターを通して押し出されて、所望の直径のリポソームを与える。本開示の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応によりＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されるようにリポソームに接合され得る。
定義：
別に定めのない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者により通常、理解される意味を有するものとする。「ａ」実体または「ａｎ」実体という用語は、その実体の１つまたは複数を指す。例えば、化合物は、１種または複数の化合物を指す。したがって、「ａ」、「ａｎ」、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」という用語は同義的に使用され得る。さらに、文脈により別義が要求されない限り、単数用語は複数を含むものとし、複数用語は単数を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴ－またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連しておよびそれらの技術に関連して使用される命名法は、当業界においてよく知られており、通常使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクションなど）には標準的な手法が用いられる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当核技術分野において通常に達成されるようにして、または本明細書に記載されるようにして、実施される。前述の技術および手順は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書全体を通して引用され、考察されている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている通りに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬品化学（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連して利用される命名法、ならびにこれらの実験室の手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、製剤化および送達、および患者の治療のための標準的な技術が用いられる。
本開示により使用される場合、下記の用語は、特にことわらない限り、下記の意味を有することが理解されよう。
本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」または「免疫反応する」または「免疫特異的に結合する」は、抗体が所望の抗原の１個または複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、またははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０－６）で結合することを意味する。抗体としては、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが既知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０のまたはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、エフェクター機能に主に関与する不変領域を定義する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関し、それらは分子に存在する重鎖の性質により相互に異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などの、サブクラスも同様に有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において使用される場合、ユニーク軽鎖遺伝子生成物およびユニーク重鎖遺伝子生成物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子で同一である。ＭＡｂは、それに対する固有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位を含む。
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に異なるストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる、より保存された隣接ストレッチ間に挿入される。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域間で、およびそれに隣接して、天然で認められるアミノ酸配列を指す。抗体分子においては、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、立体空間でお互いに対して配置されて抗原－結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合される抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および1991年））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９年）の定義に従う。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖまたはＴ細胞受容体に特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面基から成り、通常、特異的立体構造特性、および特異的電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端ペプチドまたはＣ末端ペプチドに対して産生され得る。抗体は、解離定数が１μｍ以下、いくつかの実施形態では、１００ｎＭ以下、いくつかの実施形態では、１０ｎＭ以下の場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「免疫学的結合（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）」および「免疫学的結合性質（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」は、免疫グロブリン分子と、それに対し免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有結合相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、より小さいＫｄはより高い親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量化できる。このような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度、および会合および解離の実際の速度の計算により決定され得る。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６－８７（１９９３）を参照されたい）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率は、親和性に関係のないすべてのパラメーターを解除でき、かつ解離定数Ｋｄと等しい（概説としては、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０年）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３を参照されたい）。本開示の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に既知の類似のアッセイなどのアッセイによって測定した場合、結合定数（Ｋｄ）が１μＭ以下、いくつかの実施形態では１００ｎＭ以下、いくつかの実施形態では１０ｎＭ以下、いくつかの実施形態では１００ｐＭ以下～約１ｐＭである場合、標的に特異的に結合すると言われる。
用語の「単離ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源、またはそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源により、「単離ポリヌクレオチド」は、（１）その「単離ポリヌクレオチド」が天然で見出される、ポリヌクレオチドのすべてまたは一部と結合していない、（２）それが天然において連結されないポリヌクレオチドに操作可能的に連結されている、または（３）大きな配列の一部として天然に存在しない。本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に示される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、および本明細書に示される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
本明細書で言及される「単離タンパク質」という用語は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、または合成起源またはそれらのいくつかの組み合わせのタンパク質を意味し、その起源または誘導源により、「単離されたタンパク質」は、（１）天然で認められるタンパク質と結合していない、（２）同じ供給源の他のタンパク質を含まない、例えばマウスタンパク質を含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、または（４）天然で生じない。
「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、ポリペプチド配列の天然のタンパク質、フラグメント、または類似体を指す総称として使用される。従って、天然タンパク質フラグメントおよび類似体は、ポリペプチド属の種である。本開示のポリペプチドは、本明細書に示される重鎖免疫グロブリン分子、および本明細書に示される軽鎖免疫グロブリン分子、並びに、軽鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパ軽鎖免疫グロブリンと共に、重鎖免疫グロブリン分子を含む組合せにより形成される抗体分子を含み、逆もまた同様であり、それらのフラグメントおよび類似体も含む。
本明細書において目的物に適用される「天然に生じる」という用語は、目的物を天然で見つけることができることを指す。例えば、天然の供給源から単離できおよび実験室その他において人によって意図的に改変されていない生物（ウィルスなど）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、そのように記述された構成要素の位置を指し、それらを意図された様式で機能させることができる関係にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるように連結される。
用語「制御配列」は、本明細書において使用される場合、それらが連結されるコード配列の発現およびプロセッシングに影響を及ぼすのに必要とされる、ポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存し、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および真核生物内の転写終結配列を含み、一般的に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現およびプロセッシングに必須であるすべての成分を含むことを意図しており、その存在が有益である追加の成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含んでよい。本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された形態を意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを含む。
本明細書で言及されるオリゴヌクレオチドという用語は、天然に生じるヌクレオチド、および天然に生じるオリゴヌクレオチドの連結および天然に生じないオリゴヌクレオチドの連結によって共に連結される修飾ヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドは、２００個またはそれよりも少ない長さの塩基を通常含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１０～６０塩基であり、いくつかの実施形態では、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０～４０塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、例えば、プローブ用に、一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築での使用のために、二本鎖であり得る。本開示のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのいずれかのオリゴヌクレオチドである。
本明細書で言及される「天然に生じるヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及される「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及される用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７－１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１５１，５１０；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、所望により、検出のための標識を含んでよい。
本明細書において使用される場合、２０種の従来のアミノ酸およびそれらの略語は、慣用的用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ、編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ Ｍａｓｓ．（１９９１年））を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸、α－、α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来のものではないアミノ酸などの非天然アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）も、本開示のポリペプチドの好適な成分であり得る。従来のものではないアミノ酸の例として、以下が挙げられる：４ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、ε－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、σ－Ｎ－メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）。本明細書において使用されるポリペプチド表記では、標準の使用法および規則に準拠して、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、特に明記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’方向から３’方向への付加は、転写方向配列と称され、ＲＮＡと同じ配列を有しかつＲＮＡ転写産物の５’末端に対し５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有しかつＲＮＡ転写産物の３’末端に対し３’であるＤＮＡ鎖の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的に同一である」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ加重を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に整列された場合、少なくとも８０％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９０％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９５％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
いくつかの実施形態では、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
本明細書で考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子におけるアミノ酸配列のわずかな変化は、本開示に包含されるものと考えられ、アミノ酸配列における変化が、少なくとも７５％、いくつかの実施形態では少なくとも８０％、９０％、９５％、およびいくつかの実施形態では９９％を維持することを条件とする。特に、保存的アミノ酸置換が意図される。保存性置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で生じるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、通常次のファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸である、（２）塩基性アミノ酸はリシン、アルギニン、ヒスチジンである、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである、および（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リシン、セリン、およびトレオニンを含む。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを包含する。アミノ酸の他のファミリーは、次のものを包含する：（ｉ）脂肪族－ヒドロキシファミリーである、セリンおよびトレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーである、アスパラギンおよびグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；および（ｉｖ）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシン、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩、セリンによるトレオニンの単独置換、または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の同様の置換は、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合または特性に大きな影響を有しないと予測することが合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより、容易に決定され得る。アッセイは、本明細書において詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたは類似体は、当業者により容易に調製され得る。フラグメントまたは類似体の適切なアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くで発生する。構造および機能ドメインは、公的または独自の配列データベースと、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列とを比較することにより、特定できる。いくつかの実施形態では、コンピューター化された比較方法が、既知構造および／または機能の他のタンパク質で発生する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを特定するために使用される。既知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を特定する方法は、既知である。Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。したがって、前述の例は、当業者が、本開示に従って構造的ドメインおよび機能的ドメインを決定するために使用できる配列モチーフおよび構造コンホメーションを認識できることを示す。
好適なアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および（５）このような類似体の他の物理化学的特性または機能的特性を付与するか変更する、置換である。類似体としては、天然に生じるペプチド配列以外の配列の様々なムテインを挙げることができる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然に生じる配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分）において行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるらせんを破壊する傾向があってはならず、または親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破損させる傾向があってはならない）。当該分野で認められているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
本明細書で使用される用語「ポリペプチドフラグメント」は、例えば、完全長のｃＤＮＡ配列から導き出される天然に生じる配列において、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失、および／または１つまたは複数の内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。フラグメントは典型的には、少なくとも５、６、８または１０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１４個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態では、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、通常、少なくとも５０個の長さのアミノ酸、およびいくつかの実施形態では、７０個の長さのアミノ酸である。本明細書で使用される用語「類似体」は、推定されるアミノ酸配列の一部分に対し実質的な同一性を有し、かつ好適な結合条件下で標的に対する特異的結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを指す。通常、ポリペプチド類似体は、天然に生じる配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は通常、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも５０個またはそれ以上の長さのアミノ酸であり、しばしば、完全な長さの天然に生じるポリペプチドと同じ長さであり得る。
用語の「薬剤」は、本明細書では、化学化合物、化学化合物の混合物、生体巨大分子、または生体材料からの抽出物を示すために使用される。
本明細書で使用する「標識」または「標識された」という用語は、例えば、マークされたアビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法により検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの放射標識されたアミノ酸の組み込みまたは付着による、検出可能なマーカーの組み込みを指す。特定の状況では、標識またはマーカーも治療薬であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当技術分野において既知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例としては、これらに限定されないが、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームにより付着される。本明細書において使用される用語「医薬品または薬物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ ｏｒ ｄｒｕｇ）」は、患者に正しく投与される場合に所望の治療効果を誘導できる化合物または組成物を指す。
本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））に例示される当技術分野における従来の用法に従って使用される。
本明細書で使用される「実質的に純粋な」は、対象種が、存在する優勢な種であることを意味し（すなわち、モル基準で、それは組成物中の他の個々のいかなる種よりも豊富である）、いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、対象種が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）を構成する組成物である。
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物の存在するすべての高分子種の約８０％より多く、いくつかの実施形態では、約８５％、９０％、９５％および９９％より多くを構成するであろう。いくつかの実施形態では、目的種は、本質的に均質に精製され（組成物中の汚染種は、従来の検出法によっては検出され得ない）、組成物は単一の高分子種から本質的に成る。
用語「患者」は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
本開示の活性化可能抗体は、所定の標的、例えば、ヒト標的タンパク質を、特異的に結合する。本明細書に記載される活性化可能抗体と同じエピトープに結合する活性化可能抗体もまた、本開示に包含される。
当業者は、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナルまたはヒト化抗体）が、本明細書に記載される方法で使用されるモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、前者が後者の標的への結合を妨げるかどうかを確かめることにより、過度の実験を行わないで、決定することが可能であることを理解するであろう。試験されるモノクローナル抗体が、本開示のモノクローナル抗体による結合の低下により示されるように、本開示のモノクローナル抗体と競合する場合、これらの２種のモノクローナル抗体は、同じかまたは密接に関連するエピトープに結合する。モノクローナル抗体が本開示のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するための方法は、標的と共に本開示のモノクローナル抗体をプレインキュベートし、次に、試験されるモノクローナル抗体を添加して、試験されるモノクローナル抗体が標的に結合するその能力を阻害されるかどうかを決定することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、ほぼ確実に、それは本開示のモノクローナル抗体と同じか、または機能的に同等のエピトープ特異性を有する。
多重特異性活性化可能抗体
本開示はまた、多重特異性活性化可能抗体を提供する。本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体は、複数の抗原またはエピトープを認識し、かつＭＭの結合が抗原またはエピトープ結合ドメインのその標的に結合する能力を低減するように多重特異性抗体の少なくとも１種の抗原またはエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１個のマスキング部分（ＭＭ）を含む、多重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、少なくとも１種のＭＭＰプロテアーゼおよび少なくとも１種のＳＰに対する基質として機能する切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２基質）を介して、多重特異性抗体の抗原またはエピトープ結合ドメインに結合される。本明細書で提供される活性化可能な多重特異性抗体は、循環中で安定であり、意図された治療部位および／または診断部位で活性化されるが、正常な、すなわち健康な組織では活性化されず、活性化された場合には、対応する非修飾の多重特異性抗体に少なくとも匹敵する標的への結合を示す。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、免疫エフェクター細胞をエンゲージするようにデザインされ、また本明細書において免疫エフェクターエンゲージング多重特異性活性化可能抗体と呼ばれる。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、白血球をエンゲージするようデザインされ、また白血病エンゲージング多重特異性活性化可能抗体として本明細書において言及される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、Ｔ細胞をエンゲージするようデザインされ、またＴ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体として本明細書において言及される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、白血球上の、例えばＴ細胞上の、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上の、骨髄単核細胞上の、マクロファージ上の、および／または別の免疫エフェクター細胞上の表面抗原をエンゲージする。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は白血球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、骨髄単核細胞などの単核細胞である。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、複数の標的および／または複数のエピトープに結合するか、あるいは、それと反応するようにデザインされ、また多抗原標的化活性化可能抗体として本明細書において言及される。本明細書で使用される場合、用語「標的」および「抗原」は、同義的に使用される。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫エフェクター細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、標的化抗体またはその抗原結合フラグメント、および免疫エフェクター細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合部分を含み、標的化抗体またはその抗原結合フラグメント、および／または免疫エフェクター細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合部分の少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の免疫エフェクター細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低下させるようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の免疫エフェクター細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、非免疫エフェクター細胞エンゲージング抗体は、癌標的化抗体である。いくつかの実施形態では、非免疫細胞エフェクター抗体は、ＩｇＧである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞エンゲージング抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、標的化抗体（例えば、非免疫細胞エフェクター抗体）は、ＩｇＧであり、免疫エフェクター細胞エンゲージング抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、白血球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、骨髄単核細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、標的化抗体またはその抗原結合フラグメント、およびＴ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合部分を含み、標的化抗体またはその抗原結合フラグメント、および／またはＴ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合部分の少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１のＴ細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低減させるようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１のＴ細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体または抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的に結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング成分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメント、およびＴ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合部分を含み、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメント、および／またはＴ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合部分の少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１のＴ細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低減させるようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１のＴ細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体または抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング成分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメント、およびＴ細胞エンゲージングｓｃＦｖを含み、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメント、および／またはＴ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合部分の少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１のＴ細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低減させるようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１のＴ細胞エンゲージング標的を結合する第１の抗体またはその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合が第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体または抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング成分（ＭＭ２）に付着される。
免疫エフェクターエンゲージング多重特異性活性化可能抗体のいくつかの実施形態では、１種の抗原は典型的には、腫瘍細胞、または疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば、表１に列挙されるに任意の標的、例えば、限定されないが、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ジャグド、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ３またはＣＤ７１（トランスフェリン受容体）であり、別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、および／または他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激または抑制性受容体、例えば、限定されないが、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはＶＩＳＴＡである。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面に存在する刺激性受容体である。このような刺激性受容体の例としては、限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢとも称される）、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、およびＯＸ４０が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｔ細胞の表面に存在する抑制性受容体である。このような抑制性受容体の例としては、限定されないが、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびＮＫ発現ＫＩＲが挙げられる。Ｔ細胞表面抗原に対して特異性を提供する抗体ドメインはまた、Ｔ細胞受容体、ＮＫ細胞受容体、マクロファージ受容体および／または他の免疫エフェクター細胞受容体、例えば、限定されないが、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＴＮＦＳＦ９に結合するリガンドまたはリガンドドメインにより置換され得る。
本開示の一実施形態は、癌微小環境において活性化できる、かつ抗体、例えば腫瘍標的およびアゴニスト抗体に対するＩｇＧまたはｓｃＦｖ、例えば、活性化されたＴ細胞またはＮＫ細胞の表面上で発現される共刺激受容体に対するＩｇＧまたはｓｃＦｖを含む、多重特異性活性化可能抗体であり、癌標的抗体および／またはアゴニスト抗体の少なくとも１つはマスクされる。共刺激受容体の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＮＫＧ２ＤおよびＯＸ４０が挙げられるが、これらに限定されない。この実施形態において、多重特異性活性化可能抗体は、腫瘍関連プロテーゼにより活性化されると、腫瘍依存様式でＴ細胞またはＮＫ細胞発現共刺激受容体を効果的に架橋し活性化して、任意の腫瘍抗原に応答するＴ細胞の活性を、それらの内因性Ｔ細胞抗原またはＮＫ－活性化受容体を介して増強するであろう。これらのＴ細胞またはＮＫ細胞共刺激受容体の活性化依存的性質は、それらの抗原特異性に無関係に全てのＴ細胞を活性化することなく、活性化された多重特異性活性化可能抗体の活性を腫瘍特異性Ｔ細胞に向けて集中させる。一実施形態では、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも共刺激受容体抗体はマスクされて、多重特異性活性化可能抗体中の腫瘍標的特異的抗体により認識される抗原も発現する組織中に存在し得る、自己反応性Ｔ細胞の活性化を防止するが、しかしその活性は、共受容体エンゲージメントの欠如により制限される。
本開示の一実施形態は、Ｔ細胞過剰刺激により特徴づけられる疾患、例えば、限定されないが、自己免疫疾患または炎症性疾患の微小環境において活性化できる多重特異性活性化可能抗体である。このような多重特異性活性化可能抗体は、抗体、例えば自己免疫または炎症性疾患においてＴ細胞により標的化される組織中で発現される表面抗原を含む標的に対するＩｇＧまたはｓｃＦｖ、および抗体、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞の表面上で発現される抑制性受容体に対するＩｇＧまたはｓｃＦｖを含み、疾患組織標的抗体および／またはＴ細胞抑制性受容体抗体の少なくとも１つはマスクされる。抑制性受容体の例は、限定されないが、次のものを包含する：ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３およびＮＫ発現ＫＩＲ。自己免疫疾患においてＴ細胞により標的化される組織抗原の例としては、限定されないが、次のものが挙げられる：多発生硬化症におけるミエリンまたは神経細胞上に発現される表面抗原、または１型糖尿病において膵島細胞上に発現される表面抗原。この実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、自己免疫攻撃または炎症下で組織に局在化すると、活性化されＴ細胞またはＮＫ細胞抑制性受容体を共エンゲージして、それらの内因性ＴＣＲまたは活性化受容体を介し任意の疾患組織標的化抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制する。一実施形態では、少なくとも１種または複数の抗体がマスクされて、標的抗原がまた発現され得る非疾患組織における所望のＴ細胞応答の抑制を防ぐ。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、抗ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε、またＣＤ３ｅおよびＣＤ３としても本明細書において言及される）ｓｃＦｖおよび標的化抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖおよび／または標的化抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖおよび癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、抗－ＣＤ３ε ｓｃＦｖおよび／または癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、抗抗抗抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖおよび癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖおよび／または癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態においてＴ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、ＯＫＴ３由来の抗ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）ｓｃＦｖを含み、標的抗体またはその抗原結合フラグメントおよび／またはＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖの少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εに結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εに結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖおよび癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖおよび／または癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、癌標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖおよび癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖおよび／または癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖまたはＯＫＴ３由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、癌標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖを含み、標的抗体またはその抗原結合フラグメントおよび／または抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖの少なくとも１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体は、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、および標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖおよび／または標的ＩｇＧ抗体またはその抗原結合部分の少なく１つはマスクされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４に結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着される。いくつかの実施形態では、標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的に結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４を結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、ＭＭ１の結合がＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に付着され、標的化ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはそのフラグメントを含み、ＡＢ２は、ＭＭ２の結合が第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ２）に付着される。
いくつかの実施形態では、多重抗原標的化抗体および／または多重抗原標的化活性化可能抗体は、第１の標的および／または第１のエピトープを結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント、および第２の標的および／または第２のエピトープを結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。いくつかの実施形態では、多重抗原標的化抗体および／または多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なる標的を結合する。いくつかの実施形態では、多重抗原標的化抗体および／または多重抗原標的化活性化可能抗体は、同じ標的上の複数の異なるエピトープを結合する。いくつかの実施形態では、多重抗原標的化抗体および／または多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なる標的と同じ標的上の複数の異なるエピトープの組合せを結合する。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスクされたＩｇＧ可能ドメインを有する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスクされたｓｃＦｖドメインを有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキング部分に結合される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキング部分に結合され、ｓｃＦｖドメインの少なくとも１つは、マスキング部分に結合される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの個々は、それ自体のマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体の１個の抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、別の抗体ドメインは、Ｔ細胞表面抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体の１個の抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、別の抗体ドメインは、別の標的抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体の１個の抗体ドメインは、標的抗原のエピトープに対する特異性を有し、別の抗体ドメインは、標的抗原の別のエピトープに対する特異性を有する。
多重特異性活性化可能抗体において、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖のカルボキシル末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体の軽鎖のカルボキシル末端に、またはＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖および軽鎖の両方のカルボキシル末端に融合されてよい。多重特異性活性化可能抗体において、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖のアミノ末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体の軽鎖のアミノ末端に、またはＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端に融合されてよい。多重特異性活性化可能抗体において、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体の１つまたは複数のカルボキシル末端および１つまたは複数のアミノ末端の任意の組み合わせに融合されてよい。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクする。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１個のｓｃＦｖの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクする。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクし、ＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１個のｓｃＦｖの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクする。
本開示は、限定されないが、以下のものを含む多重特異性活性化可能抗体構造の例を提供する：（ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２；（ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２；（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊）２；（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊）２；（ＶＬ－ＣＬ）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＬ－ＣＬ）２：（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊）２：（ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；または（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ）２：（ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２。式中、ＶＬおよびＶＨは、ＩｇＧに含まれる第１の特異性の軽鎖および重鎖可変ドメインであり；ＶＬ＊およびＶＨ＊は、ｓｃＦｖに含まれる第２の特異性の可変ドメインであり；ＬＰ１は、マスキング部分（ＭＭ）およびＣＭ１－ＣＭ２基質をつなぐリンカーペプチドであり；ＬＰ２は、ＣＭ１－ＣＭ２基質および抗体をつなぐリンカーペプチドであり；Ｌ３は、ｓｃＦｖの可変ドメインをつなぐリンカーペプチドであり；Ｌ４は、第１の特異性の抗体を、第２の特異性の抗体につなぐリンカーペプチドであり；ＣＬは、軽鎖定常ドメインドメインであり；ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３は、重鎖定常ドメインである。第１および第２の特異性は、いずれかの抗原またはエピトープに対するものであり得る。
Ｔ細胞エンゲージング多重特異性活性化可能抗体のいくつかの実施形態では、１種の抗原は典型的には、腫瘍細胞または疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば表１に列挙されるいずれかの標的（これらに限定されない）、例えば、限定されないが、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ジャグド、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ３またはＣＤ７１（トランスフェリン受容体）であり、別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージおよび／または他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激性（本明細書においては、活性化とも呼ばれる）または抑制性受容体、例えば、限定されないが、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７（または、ＴＮＦＲＳＦ９とも呼ばれる）、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはＶＩＳＴＡである。Ｔ細胞表面抗原に対して特異性を提供する抗体ドメインはまた、Ｔ細胞受容体、ＮＫ細胞受容体、マクロファージ受容体および／または他の免疫エフェクター細胞受容体、例えば、限定されないが、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＴＮＦＳＦ９に結合するリガンドまたはリガンドドメインにより置換され得る。多重抗原標的化活性化可能抗原のいくつかの実施形態では、１種の抗原は、表１に列挙される標的群から選択され、別の抗原は、表１に列挙される標的群から選択される。
いくつかの実施形態では、標的化抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対し特異的である、Ｃ２２５ｖ５である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対し特異的である、Ｃ２２５である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対し特異的である、Ｃ２２５ｖ４である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対し特異的である、Ｃ２２５ｖ６である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、抗ジャグド抗体である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、ヒトおよびマウスジャグド１およびジャグド２への結合に対し特異的である、４Ｄ１１である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、ヒトおよびマウスジャグド１およびジャグド２への結合に対し特異的である、４Ｄ１１ｖ２である。
いくつかの実施形態では、標的化抗体は、活性化可能抗体の形態であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｐｒｏ－ｓｃＦｖの形態であり得る（例えば、ＷＯ２００９／０２５８４６号、ＷＯ２０１０／０８１１７３号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ３εへの結合に特異的であり、ＣＤ３εを結合する抗体またはそのフラグメント、例えば、ＣＨ２５２７、ＦＮ１８、Ｈ２Ｃ、ＯＫＴ３、２Ｃ１１、ＵＣＨＴ１またはＶ９であるか、またはそれ由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４（本明細書ではＣＴＬＡおよびＣＴＬＡ４とも呼ばれる）の結合に特異的である。
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、次のアミノ酸配列を含む：
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＳＧＧＳＴＩＴＳＹＮＶＹＹＴＫＬＳＳＳＧＴＱＶＱＬＶＱＴＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＳＬＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳ（配列番号３４７）
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、配列番号３４７のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、次のアミノ酸配列を含む：
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲ（配列番号３４９）
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、配列番号３４９のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、１個または複数のＴ細胞、１個または複数のＮＫ細胞、および／または１個または複数のマクロファージの結合に特異的である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはＶＩＳＴＡからなる群から選択される標的の結合に特異的である。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体はまた、ＡＢに接合された薬剤も含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、治療薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗腫瘍薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、毒素またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、薬剤は、リンカーを介して多重特異性活性化可能抗体に接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断可能リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも１種のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含むリンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断不能リンカーである。いくつかの実施形態では、薬剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡインターカレーターなどの核酸損傷剤、または他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、薬剤は、表４に列挙される群から選択される薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体はまた、検出可能な部分も含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、診断薬である。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は天然では、１個または複数のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、１個または複数のジスルフィド結合を含むように改変できる。
本開示はまた、本明細書に記載される多重特異性活性化可能抗体をコードする単離核酸分子、およびこれらの単離核酸配列を含むベクターを提供する。本開示は、活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で細胞を培養することにより多重特異性抗体を製造する方法を提供し、細胞は、このような核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、このようなベクターを含む。
本開示はまた、（ａ）多重特異性活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を、多重特異性活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で培養すること、および（ｂ）多重特異性活性化可能抗体を回収すること、により本開示の多重特異性活性化可能抗体を製造する方法も提供する。
本開示はまた、第１の標的または第１のエピトープを特異的に結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、および第２の標的または第２のエピトープを結合する第２の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異性抗体および／または多重特異性活性化可能抗体組成物も提供し、少なくともＡＢ１は、そのＭＭ１の結合がＡＢ１のその標的を結合する能力を低減するようにマスキング部分（ＭＭ１）に結合されるか、またはさもなければ取り付けられる。いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、ＭＭＰおよびＳＰに対するＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＡＢ１に結合され、ＭＭＰおよびＳＰの少なくとも１つは、対象における治療部位または診断部位でＡＢ１の標的と共局在する。本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体は、循環中で安定であり、治療および／または診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常な、すなわち健康な組織中では活性化されず、活性化される場合、その対応する修飾されていない多重特異性抗体に少なくとも匹敵する、ＡＢ１の標的への結合を示す。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＭＭ１とＣＭ１－ＣＭ２基質の間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質とＡＢ１の間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部が、未切断状態で次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＡＢ１またはＡＢ１－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ１。いくつかの実施形態では、２個の連結ペプチドは、相互に同じである必要はない。
いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）（ｎは少なくとも１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも１つは、ＧＧＳＧ（配列番号３８３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３８４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３８５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３８６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３８７）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号３８８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）、第２の連結ペプチド（ＬＰ２）、およびＣＭ１とＣＭ２の間の連結ペプチド（ＬＰ’）を含み、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部が、未切断状態で次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＡＢ１またはＡＢ１－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ１。いくつかの実施形態では、連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。
いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１８）である。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、第１の標的または第１のエピトープを特異的に結合する、第１の抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、および第２の標的または第２のエピトープを特異的に結合する、第２の抗体またはその抗体結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＡＢは、モノクローナル抗体、ドメイン、抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ，ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から独立に選択される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＡＢは、げっ歯類の（例えば、マウスまたはラットの）、キメラの、ヒト化されたまたは完全にヒトの、モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＡＢは、その対応する標的またはエピトープへの結合について、約１００ｎＭまたはそれ未満の解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的またはエピトープへの結合の解離定数よりも高い、その対応するＡＢへの結合についての解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的またはエピトープへの結合の解離定数以下の、その対応するＡＢへの結合の解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、多重特異性活性化可能抗体が切断された状態である場合、その対応する標的またはエピトープに結合に関し、その対応するＡＢを妨害しないか、またはそれと競合しない。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、約２～４０アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、４０アミノ酸長以下のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、その対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対し５０％以下同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対し２５％以下同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対し１０％以下同一であるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１の結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも２０倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１の結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも４０倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１の結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１００倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１の結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０００倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１の結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭ１に結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０，０００倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、本明細書で開示のＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、その多重特異性活性化可能抗体が未切断状態にある場合にＡＢ２のその標的への結合を阻害する第２のマスキング部分（ＭＭ２）、およびＡＢ２に結合される追加の切断可能部分（ＣＭ’）を少なくとも含み、ＣＭ’は、ＣＭ１－ＣＭ２基質または第２のプロテアーゼに対する基質として機能するポリペプチドのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＣＭ’は、１５アミノ酸長以下のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＭ’は、ＣＭ１－ＣＭ２基質であり、ＣＭ１－ＣＭ２基質中のＣＭ１とＣＭ２のそれぞれは独立に、１５アミノ酸長以下のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、および／または第２のプロテアーゼは、組織中で第２の標的またはエピトープと共局在し、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、および／または第２のプロテアーゼは、多重特異性活性化可能抗体がＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、および／または第２のプロテアーゼに暴露されると多重特異性活性化可能抗体中のＣＭ’を切断する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、および／または第２のプロテアーゼは、組織中で第１の標的またはエピトープおよび第２の標的またはエピトープと共局在する。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、および／または第２のプロテアーゼは、同じＭＭＰプロテアーゼおよび同じＳＰプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、および／または第２のプロテアーゼは、同じＭＭＰプロテアーゼではなく、同じＳＰプロテアーゼではない。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質およびＣＭ’は、同じＭＭＰプロテアーゼおよび同じＳＰプロテアーゼに対する異なる基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭ’を切断するプロテアーゼは、表６に示されるものからなる群から選択されるプロテアーゼである。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭ、例えば、ＭＭ１および少なくともＭＭ２は、その対応する標的またはエピトープに対するＡＢの解離定数よりも大きい、その対応するＡＢへの結合の解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、その対応する標的またはエピトープに対するＡＢの解離定数以下である、その対応するＡＢに対する結合の解離定数を有する。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、多重特異性活性化可能抗体が切断された状態にある場合、対応する標的またはエピトープに結合に関し、その対応するＡＢを妨げないか、またはそれと競合しない。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、約２～４０アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、４０アミノ酸長以下のポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対し５０％以下同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対し２５％以下の同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対し１０％以下同一であるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、各ＭＭの結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも２０倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、各ＭＭの結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも４０倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、各ＭＭの結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１００倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、各ＭＭの結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０００倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、各ＭＭの結合は、その対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合される場合にＡＢの解離定数（Ｋｄ）がその対応する標的またはエピトープに対するＭＭに結合されない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０，０００倍大きいように、その対応するＡＢがその標的またはエピトープを結合する能力を低減する。
いくつかの実施形態では、各ＭＭは、本明細書に開示されるＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質配列を切断するプロテアーゼは、組織中で多重特異性活性化可能抗体中のＡＢ１の標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＳＰプロテアーゼ、すなわち、ＭＭＰプロテアーゼおよびＳＰプロテアーゼの少なくとも一つは、多重特異性活性化可能抗体がそのプロテアーゼに暴露されると多重特異性活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、複数のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含み、少なくとも１個のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を切断するＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＳＰプロテアーゼは、組織中で多重特異性活性化可能抗体中のＡＢ領域の少なくとも１個の領域の標的と共局在し、ＭＭＰプロテアーゼおよび／またはＳＰプロテアーゼは、多重特異性活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露されると多重特異性活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも２倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも３倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態で、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも４倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減され、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも５倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも１０倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態で、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも２０倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも４０倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも５０倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも１００倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＡＢ領域の１個の領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が低減されて、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも２００倍大きい解離定数で起こるように、一方で切断された状態では、ＡＢがその標的を結合するように、多重特異性活性化可能抗体中に配置される。
本開示はまた、標的を特異的に結合する第１の抗体または抗体フラグメント（ＡＢ１）、および第２の抗体または抗体フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異性活性化可能抗体を包含する組成物および方法も提供し、少なくとも多重特異性活性化可能抗体中の第１のＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減するマスキング部分（ＭＭ１）に結合される。いくつかの実施形態では、各ＡＢは、各標的に対するその対応するＡＢの能力を低減するＭＭに結合される。例えば、多重特異性活性化可能抗体の実施形態では、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減する第１のマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、ＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低減する第２のマスキング部分（ＭＭ２）に結合される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は複数のＡＢ領域を含み、そのような実施形態では、活性化可能抗体の各ＡＢについて、ＡＢ１は、その標的を結合するＡＢ１の能力を低減する第１のマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、ＡＢ２は、その標的を結合するＡＢ２の能力を低減する第２マスキング部分（ＭＭ２）に結合され、ＡＢ３は、その標的を結合するＡＢ３の能力を低減する第３マスキング部分（ＭＭ３）に結合される、等々である。
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＭＭＰプロテアーゼおよびＳＰプロテアーゼに対する基質である少なくとも１個のＣＭ１－ＣＭ２基質をさらに含み、ＣＭ１－ＣＭ２基質はＭＭをＡＢに連結する。例えば、いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する第１の抗体または抗体フラグメント（ＡＢ１）および第２の抗体または抗体フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含み、多重特異性活性化可能抗体中の少なくとも第１のＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減するマスキング部分（ＭＭ１）に、第１のＣＭ１－ＣＭ２基質を介して結合される。いくつかの多重特異性活性化可能抗体の実施形態では、ＡＢ１は、第１のＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＭＭ１に結合され、ＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低減する第２のマスキング部分（ＭＭ２）に、第２のＣＭ１－ＣＭ２基質を介して結合される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、２個以上のＡＢ領域を含み；これらの実施形態のいくつかでは、ＡＢ１は、第１のＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＭＭ１に結合され、ＡＢ２は、第２のＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＭＭ２に結合され、ＡＢ３は、第３のＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＡＢ３のその標的を結合する能力を低減する第３のマスキング部分（ＭＭ３）に結合される、等々であり、多重特異性活性化可能抗体中の各ＡＢについて同様である。
非結合性立体部分または非結合性立体部分の結合パートナーを有する活性化可能抗体
本開示はまた、非結合性立体部分（ＮＢ）、または非結合性立体部分に対する結合パートナー（ＢＰ）を含む活性化可能抗体を提供し、ＢＰは、活性化可能抗体にＮＢを動員するか、あるいは、引き付ける。本明細書に提供される活性化可能抗体は、例えば、非結合性立体部分（ＮＢ）、ＣＭ１－ＣＭ２基質および標的に結合する抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含む、活性化可能抗体；非結合性立体部分に対する結合パートナー（ＢＰ）、ＣＭ１－ＣＭ２基質およびＡＢを含む、活性化可能抗体；およびそれに対しＮＢが動員されているＢＰ、ＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的を結合するＡＢを含む、活性化可能抗体を包含する。ＮＢが活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質およびＡＢに共有的に連結されるかまたは活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質およびＡＢに共有的に連結されるＢＰとの相互作用により結合される、活性化可能抗体は、「ＮＢ含有活性化可能抗体」として、本明細書で言及される。活性化可能または切替可能は、活性化可能抗体が、阻害された、マスクされた、または未切断の状態にある場合の標的への結合の第１のレベル（第１のコンホメーション）、および阻害されていない、マスクされていない、および／または切断された状態にある場合の標的への結合の第２のレベル（すなわち、第２のコンホメーション、すなわち活性化された抗体）を示すことを意味し、ここで標的結合の第２のレベルは、結合の第１のレベルよりも大きい。活性化可能抗体組成物は、従来の抗体療法に比べて、高められた生物学的利用能およびより良好な生体分布を示すことができる。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢがマスクされていないかさもなければ非治療部位および／または非診断部位への結合を阻害されていないならばこのような部位での結合から生じるはずの毒性および／または有害な副作用の低減をもたらす。
一実施形態では、活性化可能抗体は、非結合性立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；および標的に特異的に結合する少なくとも抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ＮＢは、ＡＢに特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素に対する基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害しないように配置され；ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。本明細書および全体を通して使用される場合、用語、ポリペプチドは、より大きなポリペプチド、完全長タンパク質およびこれらのフラグメントを含む、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む任意のポリペプチドを指し、用語のポリペプチドは、単鎖ポリペプチドに制限されず、複数ユニット、例えば多鎖ポリペプチドを包含してよい。ポリペプチドが、より短い長さのもの、例えば、合計５０アミノ酸長未満のものである場合、用語のペプチドおよびポリペプチドは、本明細書においては、交換可能的に使用され、ポリペプチドが、より長いもの、例えば、５０アミノ酸長またはそれを越えるものである場合、用語、ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書において、交換可能に使用される。
一実施形態では、活性化可能抗体は、非結合性立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；および標的に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、（ｉ）ＮＢは、ＡＢに特異的に結合しないポリペプチドを含み；（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素に対する基質（Ｓ）を含む、最大５０アミノ酸長のポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害しないように配置され；（ｉｖ）ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列およびＣＭ２基質配列のそれぞれは独立に、最大１５アミノ酸長を有する。
一実施形態では、活性化可能抗体は、非結合性立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；および標的に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、（ｉ）ＮＢは、ＡＢに特異的に結合しないポリペプチドであり；（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素に対する基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害しないように配置され；（ｉｖ）ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害せず；（ｖ）多重特異的活性化可能抗体は、未切断状態では、次のようにＮ末端からＣ末端側に構造配置を有する：ＮＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＮＢ。
一実施形態では、活性化可能抗体は、非結合性立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；および標的に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、（ｉ）ＮＢは、ＡＢに特異的に結合しないポリペプチドであり；（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素に対する基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、切断状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害しないように配置され；未切断の活性化可能抗体中のＮＢは、切断されたＡＢのその標的を結合する能力に比べて、ＡＢのその標的を結合する能力を、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％低減し；（ｉｖ）ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。ＡＢのその標的を結合する能力の低減は、例えば、本明細書に記載されるようなアッセイ、またはインビトロ標的置換アッセイ、例えば国際公開第ＷＯ２００９／０２５８４６号および国際公開第ＷＯ２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、決定される。
一実施形態では、活性化可能抗体は、非結合性立体部分（ＮＢ）に対する結合パートナー（ＢＰ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；および標的に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ＢＰは、ＮＢに暴露されると、そのＮＢに結合するポリペプチドであり；ＮＢは、ＡＢに特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素に対する基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＮＢの存在下で未切断の状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、切断された状態では、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害せずかつＢＰがその標的へのＡＢの結合を妨害しないように配置され；ＮＢおよびＢＰは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。この実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体のＢＰは、任意選択で、ＮＢに結合される。一実施形態では、ＮＢは、インビボで活性化可能抗体のＢＰにより動員される。
これらの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体は、組成物として処方される。いくつかのこれらの実施形態では、組成物はまた、ＮＢも含み、ＮＢは、ＢＰ、ＣＭ１－ＣＭ２基質およびＡＢを含む活性化可能抗体と共処方される。この実施形態のいくつかの例では、ＢＰは、アルブミン結合ペプチド、フィブリノーゲン結合ペプチド、フィブロネクチン結合ペプチド、ヘモグロビン結合ペプチド、トランスフェリン結合ペプチド、免疫グロブリンドメイン結合ペプチドおよび他の血清タンパク質結合ペプチドからなる群から選択される。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、ＮＢは、可溶性の球状タンパク質である。これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、ＮＢは、血流中で循環するタンパク質である。これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、ＮＢは、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘモグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリンドメインおよび他の血清タンパク質からなる群から選択される。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、プロテアーゼに対する基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、プロテアーゼは、組織において、その標的と共局在し、プロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露されると活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、５０アミノ酸長のポリペプチドである。これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、最大１５アミノ酸長、例えば３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、または１５アミノ酸長を有する基質（Ｓ）を含む、ポリペプチドである。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体は、未切断状態で次のようにＮ末端からＣ末端側に構造配置を有する：ＮＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＮＢ、ＢＰ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＢＰ。活性化可能抗体がＢＰを含み、かつ活性化可能抗体がその対応するＮＢの存在下にある実施形態において、活性化可能抗体は、未切断状態で次のようにＮ末端からＣ末端側に構造配置を有する；ＮＢ：ＢＰ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＮＢ：ＢＰ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＢＰ：ＮＢまたはＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＢＰ：ＮＢ、「：」は、ＮＢとＢＰの間の相互作用、例えば、結合を表す。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体は、所定の標的を特異的に結合し、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一のドメイン重鎖抗体、および単一のドメイン軽鎖抗体である、抗体またはその抗原結合抗体を包含する。いくつかの実施形態では、その標的を結合する、このような抗体またはその免疫学的活性フラグメントは、マウスの、他のげっ歯類の、キメラの、ヒト化された、または完全にヒトの、モノクローナル抗体である。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体は、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む可変重鎖領域および本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域の組合せを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、本明細書に提供されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖領域および本明細書に提供されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域の組合せを含む。
これらの活性化可能抗体実施形態のいずれかのいくつかの例では、活性化可能抗体はまた、ＡＢに接合される薬剤も含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、治療薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗腫瘍薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、毒素またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、薬剤は、リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断不能なリンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、表３に列挙される群から選択される薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡインターカレーターなどの核酸損傷剤、または他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体はまた、検出可能な部分も含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、診断薬である。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体はまた、スペーサーも含む。これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に接合される。これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接に接続される。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、対応する抗体の血清半減期より長い；例えば、活性化可能抗体のｐＫは、対応する抗体のｐＫより長い。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する多抗体の半減期に類似する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
本開示はまた、これらの活性化可能抗体のいずれかをコードする単離核酸分子、およびこれらの単離核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で細胞を培養することにより活性化可能抗体を製造する方法を提供し、細胞は、このような核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、このようなベクターを含む。
標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離例数（Ｋｄ）は、ＡＢがＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されない場合、標的に対するＡＢのＫｄよりも大きい。標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離定数（Ｋｄ）は、標的に対する親ＡＢのＫｄよりも大きい。例えば、標的に対するＮＢ～含有活性化可能抗体のＫｄは、ＡＢがＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されない場合、ＡＢのＫｄ、または標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍またはそれ超倍、または５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００または１００，０００～１０，０００，０００倍大きい。逆に、標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の結合親和性は、ＡＢがＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されない場合、ＡＢの結合親和性よりも小さく、または標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも小さい。例えば、標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の結合親和性は、ＡＢがＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されない場合、ＡＢの結合親和性、または標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍またはそれを超える倍、または５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００または１００，０００～１０，０００，０００倍小さい。
ＮＢ含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、ＡＢがＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されない場合、ＡＢの特異的結合に比べて、低減されるか、または抑制される。ＮＢ含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、親ＡＢのその標的への特異的結合に比べて、低減されるか、または抑制される。ＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されないＡＢの結合、または親ＡＢのその標的への結合に比較される場合、その標的を結合するＮＢ含有活性化可能抗体の能力は、例えば、インビトロおよび／またはインビボで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４または９６時間、または５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０または１８０日、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月またはそれを超える期間にわたり、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびさらに１００％低減され得る。
ＮＢ含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼまたは他の酵素）の存在下ではない場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、ＡＢがＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されない場合、ＡＢの特異的結合に比べて、低減されるか、または抑制される。ＮＢ含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼ、他の酵素、還元剤または光）の存在下ではない場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、親ＡＢのその標的への特異的結合に比べて、低減されるか、または抑制される。ＮＢまたはＮＢ：ＢＰと結合されないＡＢの結合、または親ＡＢのその標的への結合に比較される場合、その標的を結合するＮＢ含有活性化可能抗体の能力は、例えば、インビトロおよび／またはインビボで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４または ９６時間、または５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０または１８０日、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月またはそれを超える期間にわたり、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびさらには１００％低減され得る。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体接合体を生成するために、ＡＢに接合される薬剤も含む。活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態では、薬剤は、治療薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、診断薬である。いくつかの実施形態では、薬剤は、検出可能マーカーである。活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態では、薬剤は、抗腫瘍剤である。活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態では、薬剤は、毒素またはそのフラグメントである。活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態では、薬剤は、リンカーを介してＡＢに接合される。活性化可能抗体複合体のいくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断不能リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡインターカレーターなどの核酸損傷剤、または他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、表３に列挙される群から選択される薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
これらのいずれかの活性化可能抗体実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体は、二重標的結合活性化可能抗体である。そのような二重標的結合活性化可能抗体は、同じまたは異なる標的を結合できる２個のＡｂを含む。特定の実施形態では、二重標的化活性化可能抗体は、二重特特異的抗体またはそのフラグメントを含む。
二重標的結合活性化可能抗体は、活性化可能抗体のＡＢに結合できる１つまたは両標的と共に標的組織において共存する切断剤により切断できるＣＭ１－ＣＭ２基質を有するようにデザインされる。同じまたは異なる標的に対する複数のＡＢを有する二重標的結合活性化可能抗体は、複数のＣＭ１－ＣＭ２基質を有するようにデザインされ得、第１のＣＭ１－ＣＭ２基質は、第１の標的組織において切断剤により切断でき、第２のＣＭ１－ＣＭ２基質は、第２の標的組織において切断剤により切断でき、活性化可能抗体のＡＢに結合する１個または複数の標的を有する。一実施形態では、第１のおよび第２の標的組織は、例えば、生物における異なる部位で、空間的に分離される。一実施形態では、第１のおよび第２の標的組織は、一時的に分離された同じ組織であり、例えば２つの異なる時点で同じ組織であり、例えば、第１の時点は、組織が初期段階の腫瘍である場合であり、第２の時点は、組織が後期段階の腫瘍である場合である。
本開示はまた、本明細書に記載される活性化可能抗体をコードする核酸分子を提供する。本開示はまた、これらの核酸を含むベクターも提供する。本明細書に記載される活性化可能抗体は、活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で細胞を培養することにより産生され、細胞は、これらの核酸分子またはベクターを含む。
本開示はまた、活性化可能抗体を製造する方法も提供する。一実施形態では、方法は、（ａ）活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養するステップであって、活性化可能抗体は、（ｉ）非結合性立体部分（ＮＢ）；（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質；および（ｉｉｉ）標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、（１）ＮＢは、ＡＢに特異的に結合せず；（２）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素に対する基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（３）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態では、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害し、切断状態では、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害しないように配置され；（４）ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を抑制しない、ステップ、および（ｂ）活性化可能抗体を回収するステップ、を含む。
別の実施形態において、方法は、（ａ）活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養するステップであって、活性化可能抗体は、（ｉ）非結合性立体部分（ＮＢ）に対する結合パートナー（ＢＰ）；（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質；および（ｉｉｉ）標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、（１）ＮＢは、ＡＢに特異的に結合せず；（２）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素に対する基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（３）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態およびＮＢの存在下では、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害し、切断状態では、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害せずかつＢＰがＡＢの標的への結合を妨害しないように配置され；（４）ＮＢおよびＢＰは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない、ステップ；および（ｂ）活性化可能抗体を回収するステップ、を含む。この実施形態のいくつかの例では、活性化可能抗体のＢＰは、ＮＢに結合される。
活性化可能抗体および接合型活性化可能抗体の使用
本開示による治療物質の投与は、好適な担体、賦形剤、および改善された運搬、送達、耐性などをもたらすために製剤に組み込まれる他の薬剤と共に投与されることは理解されよう。多数の適切な配合物を、すべての薬剤師に既知の処方書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特にその中の第８７章（Ｂｌａｕｇ、Ｓｅｙｍｏｕｒ）で見つけることができる。これらの配合物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（リポフェクチン（商標）など）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型乳剤、カーボワックス乳剤（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックス含有半固体混合物が挙げられる。前述の混合物はいずれも、配合物中の有効成分が配合によって不活化されずかつ配合物が投与経路に生理学的に適合しており許容可能であるという条件で、本開示による治療および治療法に適切であり得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ．” Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０－８（２０００），Ｗａｎｇ Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．” Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１－２）：１－６０（２０００），Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ “Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．” Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（８）：９６７－７８（２０００），Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ” ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８－３１１（１９９８）および薬剤師に公知である配合物、賦形剤、および担体に関連する追加情報のためのそれらの中の引用物も参照されたい。
接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を含む、本開示の治療製剤は、異常標的発現および／または活性に関連する疾患または障害を予防し、治療し、あるいは、改善するために使用される。例えば、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を含む、本開示の治療製剤は、炎症、炎症性障害、自己免疫疾患および／または癌または他の腫瘍状態を治療するか、あるいは、改善するために使用される。いくつかの実施形態では、癌は、標的が発現される固形腫瘍または血液系腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、標的が発現される固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、標的が発現される血液系腫瘍である。いくつかの実施形態では、標的は実質（例えば、癌において、多くの場合、器官または組織の機能を実行する器官または組織の一部分）で発現される。いくつかの実施形態では、標的は、細胞、組織、または器官で発現される。いくつかの実施形態では、標的は、間質（すなわち、細胞、組織、または器官の結合支持フレームワーク）で発現される。いくつかの実施形態では、標的は、骨芽細胞で発現される。いくつかの実施形態では、標的は、内皮（血管系）で発現される。いくつかの実施形態では、標的は、癌幹細胞で発現される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体が接合される薬剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体が接合される薬剤は、核酸損傷剤である。
予防、改善または治療の有効性は、例えば、異常な標的発現および／または活性などの、標的発現および／または活性に関連する疾患または障害を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。対象の生存を延長させること、あるいは、対象における標的発現および／または活性、例えば、異常標的発現および／または活性に関連する疾患または障害の進行を遅延させることは、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体が、臨床的有益性を付与することを示す。
接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、医薬組成物の形で投与できる。このような組成物の調製に関わる原則および考慮事項、ならびに成分の選択におけるガイダンスは、例えば、以下により提供される；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９ｔｈ ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
抗体フラグメントが使用されるいくつかの実施形態では、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小のフラグメントが、選択される。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合する能力を保持するようにペプチド分子をデザインできる。このようなペプチドは、化学的に合成され得、および／または組換えＤＮＡ技術により産生され得る。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９－７８９３（１９９３）を参照されたい）。製剤はまた、治療される特定の適応症のために必要な複数の活性化合物、例えば、いくつかの実施形態では、お互いに悪影響を与えない相補的活性を有するそれらの化合物も含んでよい。いくつかの実施形態では、または追加で、組成物は、例えば細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長抑制剤などの、その機能を向上させる薬剤を含んでよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わされて好適に存在する。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中で、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に封入されてよい。
インビボ投与に用いられる製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を介するろ過により容易に実現される。
徐放性調製物が、調製されてよい。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸およびγ－エチルＬ－グルタミメートの共重合体、非分解性エチレンビニル酢酸塩、分解性の乳酸－グリコール酸共重合体、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、およびポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日間を越える長期間にわたる分子の放出が可能であるが、特定のヒドロゲルは、より短い時間でタンパク質を放出する。
いくつかの実施形態では、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。完全な抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ）２）が、使用される。プローブまたは抗体に関する「標識された」という用語は、プローブまたは抗体へ検出可能な物質をカップリングすること（すなわち、物理的結合）によるプローブまたは抗体の直接標識、および直接標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図している。間接標識の例としては、蛍光標識二次抗体を使用した一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようなビオチンを用いたＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および体液を含むことを意図している。「生体試料」という用語の用法に含まれるのは、したがって、血液と、血清、血漿、またはリンパ液などの血液の一画分または成分である。すなわち、本開示の検出方法を使用して、インビトロおよびインビボの生体試料中の検体ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出できる。例えば、分析物ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションが挙げられる。検体タンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫化学染色、および免疫蛍光法が挙げられる。検体ゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを実施するための手順は、例えば、ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．４２，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６；および“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５、に記載されている。さらに、分析物タンパク質を検出するためのインビボ技術としては、標識された抗分析物タンパク質抗体を対象に導入することが挙げられる。例えば、抗体は、放射性マーカーで標識でき、対象中のその放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像処理技術により検出できる。
本開示の接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体はまた、種々の診断および予防製剤においても有用である。一実施形態では、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、１種または複数の前述の障害を発症する危険性がある患者に投与される。前述の障害の１種または複数に対する患者または器官の素因は、遺伝子型、血清学的または生化学的マーカーを使用して決定できる。
いくつかの実施形態では、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、１種または複数の前述の障害に関連する臨床適応症を有するものとして診断されたヒト個人に投与される。診断に基づいて、接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、臨床適応症の影響を軽減するか、または回復するために投与される。
本開示の接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体はまた、患者試料中の標的の検出において有用であり、従って、診断薬としても有用である。例えば、本開示の抗体および／または活性化可能抗体、およびその接合型バージョンは、患者試料中の標的レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡで使用される。
一実施形態では、本開示の接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、試験試料中に存在し得る任意の標的のための捕捉抗体として機能する。固定された抗体と患者試料の接触の前に、固体支持体は、分析物の非特異的吸着を防ぐために、乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤により洗浄および処理される。
その後ウェルを、抗原を含んでいることが疑われる試験試料、または標準量の抗原を含む溶液で処理する。このような試料は、例えば、病状を示すと見なされる循環抗原レベルを有することが疑われる対象からの血清試料である。試験試料または標準物質を洗い流した後、固体支持体は、検出可能に標識された第２の抗体で処理される。標識された第２の抗体は、検出抗体として機能する。検出可能な標識のレベルが、測定され、試験試料中の標的抗原の濃度が、標準試料から作成された検量線との比較により決定される。
インビトロ診断アッセイにおいて、本開示の抗体およびその接合型バージョンを用いて得られる結果を基づき、標的抗原の発現レベルに基づいて患者の疾患を病期分類できることが理解されよう。所定の疾患について、血液試料を、疾患の進行の様々な段階にある、および／または疾患の治療的処置での様々な時点にあると診断された対象から採取する。進行または治療の各段階に対し統計的に有意な結果を与える試料の集団を用いて、各段階の特徴と見なされ得る抗原の濃度範囲が特定される。
接合型抗体、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体はまた、診断および／またはイメージング方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、このような方法は、インビトロ法である。いくつかの実施形態では、このような方法は、インビボ法である。いくつかの実施形態では、このような方法は、インサイツ法である。いくつかの実施形態では、このような方法は、エクスビボ法である。例えば、酵素的に切断できるＣＭ１－ＣＭ２基質を有する活性化可能抗体を、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる酵素の存在または非存在を検出するために使用できる。このような活性化可能抗体は、診断において使用でき、診断は、所定の宿主生物の所定の細胞または組織中の活性化された抗体（すなわち、活性化可能抗体の切断に起因する抗体）の蓄積の測定による酵素活性（または、いくつかの実施形態では、高められた還元電位の環境、例えば、ジスルフィド結合の還元を提供できる環境）のインビボ検出（例えば、定性的または定量的）を含み得る。活性化された抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（またはＣＭ１－ＣＭ２基質の性質に依存して、高められた還元電位）を発現するのみならず、組織が、活性化抗体が結合する標的も発現することを示す。
例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、腫瘍の部位で、ウィルスまたは細菌感染の部位で、生物学的に閉じ込められた部位（例えば、膿瘍、器官、等）などの部位で見出されるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）に対する基質であるよう選択できる。ＡＢは、標的抗原を結合するものであり得る。本明細書に開示の方法、または適切な場合には当業者に周知である方法を使用して、検出可能な標識（例えば、蛍光標識または放射性標識または放射性トレーサー）を、ＡＢまたは抗体および／または活性化可能抗体の他の領域に接合し得る。好適な検出可能な標識は、上記のスクリーニング方法と関連して考察されており、追加の特定の例を以下に示す。その活性が目的の疾患組織において高められているＭＭＰと共に、疾患状態のタンパク質またはペプチドに特異的なＡＢを用いて、活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質特異的酵素が疾患組織中にて検出レベルで存在しないか、またはよりも低いレベルで存在するか、または不活性である（例えば、チモーゲン形で、または阻害剤との複合体形で）組織に比較して、疾患組織への高められた結合速度を示す。小タンパク質およびペプチドは腎濾過システムにより血液から急速に排出されるため、かつＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的な酵素は、検出レベルで存在しない（または非疾患組織においては低レベルで存在するか、または不活性コンホメーションで存在する）ので、疾患組織中の活性化された抗体の蓄積は、非疾患組織と比較して増強される。
別の例では、活性化可能抗体は、試料中の切断剤の存在または非存在を検出するために使用できる。例えば、活性化可能抗体が酵素による切断を受けやすいＣＭ１－ＣＭ２基質を含む場合、活性化可能抗体は、試料中の酵素の存在を検出するために（定性的にまたは定量的に）使用できる。別の例では、活性化可能抗体が還元剤による切断を受けやすいＣＭ１－ＣＭ２基質を含む場合、活性化可能抗体は、試料中の還元状態の存在を検出するために（定性的または定量的に）使用できる。これらの方法での分析を促進するために、活性化可能抗体は、検出可能に標識でき、支持体（例えば、固体支持体、例えばスライドまたはビーズ）に結合されてよい。検出可能な標識は、活性化可能抗体の切断後に放出されない部分上に配置でき、例えば、検出可能な標識は、消光蛍光標識、または切断が生じるまで、検出できない他の標識であり得る。アッセイは例えば、固定された、検出可能に標識された活性化可能抗体を、酵素および／または還元剤を含むことが疑われる試料と、切断が生じるのに十分な時間、接触させた後、過剰の試料および混入物質を除去するために洗浄することにより実施できる。試料における切断（例えば、酵素または還元剤による）の存在または非存在が次に、試料との接触の前に、活性化可能抗体の検出可能シグナルの変化、例えば、試料中の切断剤による活性化可能抗体の切断による検出可能シグナルの存在および／または増大により評価される。
このような検出方法はまた、切断されると活性化可能抗体の少なくとも１種のＡＢに結合できる標的の存在または非存在の検出を提供するよう適合させ得る。したがって、アッセイは、切断剤の存在または非存在、および目的の標的の存在または非存在を評価するように適合させることができる。切断剤の存在または非存在は、上記のような活性化可能抗体の検出可能レベルの存在および／または増大により検出でき、標的の存在または非存在は、標的－ＡＢ複合体の検出により、例えば、検出可能に標識された抗標的抗体の使用により検出できる。
活性化可能抗体はまた、例えば、プロテアーゼ切断による活性化可能抗体の活性化の検証のためのインサイツイメージング、および特定の標的への結合においても有用である。インサイツ画像処理は、細胞培養物または組織切片などの生体試料におけるタンパク質分解活性および標的の局在化を可能にする技術である。この技術を使用して、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づき、所定の標的への結合およびタンパク質分解活性の両方を確認できる。
これらの技術は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）または健康組織由来の任意の凍結細胞または組織で有用である。これらの技術は、新しい細胞または組織試料でも有用である。
これらの技術において、活性化可能抗体は、検出可能な標識により標識される。検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、発蛍光団、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識）、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチンおよびストレプトアビジンなどの増幅試薬、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）であり得る。
標識された活性化可能抗体と共にインキュベートされた試料における標識の検出は、試料が標的を含み、かつ活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）および１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）を含むことを示す。いくつかの実施形態では、ＭＭＰの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものを用いて、および／またはプロテアーゼに対し特異的である薬剤、例えば、プロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）に対し特異的であり、マトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害する、抗体、例えば、Ａ１１を用いることにより、確認され得る；例えば、２０１０年１１月１１日に公開の国際公開第ＷＯ２０１０／１２９６０９号を参照されたい。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものを使用する、および／またはより選択的な阻害剤を用いることによる同じ手法が、プロテアーゼ、または活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的なＭＭＰおよびＳＰを特定するために使用できる。いくつかの実施形態では、標的の存在は、その標的に特異的な薬剤、例えば、別の抗体を使用して確認でき、または、検出可能な標識を、標識されていない標的と競合させることができる。いくつかの実施形態では、標識されていない活性化可能抗体は、標識された二次抗体またはより複雑な検出システムによる検出で、使用され得る。
類似する技術は、インビボイメージングのためにも有用であり、対象、例えば、人を含む哺乳動物における蛍光シグナルの検出は、疾患部位が標的を含み、かつ活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的であるＭＭＰおよびＳＰを含むことを示す。
これらの技術はまた、活性化可能抗体中のプロテアーゼ特異的ＣＭ１－ＣＭ２基質に基づく種々の細胞、組織および生物におけるプロテアーゼ活性の検出、特定または特徴づけのための、キットにおいておよび／または試薬としても有用である。
本開示は、種々の診断および／または予防適用において抗体および／または活性化可能抗体を使用する方法を提供する。例えば、本開示は、（ｉ）対象または試料を活性化可能抗体と接触させることであって、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含み、活性化可能抗体は、未切断の、非活性化状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、ＡＢの天然の結合パートナーの修飾形ではなく；（ｂ）未切断の、非活性化状態では、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断され、活性化された状態では、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合しない、接触させること；および（ｉｉ）対象または試料における活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することであって、対象または試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルは、切断剤および標的が対象または試料に存在することを示し、対象または試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルの非存在は、切断剤、標的または切断剤および標的の両方が対象または試料に存在せず、および／または十分には存在しないことを示す、測定すること、により対象または試料中の目的の切断剤および標的の存在または非存在を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢに配置される。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルを測定することは、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
本開示はまた、（ｉ）対象または試料を活性化可能抗体と、目的の標的、例えば、標的の存在下で接触させることであって、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含み、活性化可能抗体は、未切断の、非活性化状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、ＡＢの天然の結合パートナーの修飾形ではなく；（ｂ）未切断の、非活性化状態では、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断され、活性化された状態では、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合しない、接触させること；および（ｉｉ）対象または試料における活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することであって、対象または試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルは、切断剤が対象または試料に存在することを示し、対象または試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルの非存在は、切断剤が対象または試料に存在せず、および／または十分には存在しないことを示す、測定すること、により対象または試料中の切断剤の存在または非存在を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢに配置される。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルを測定することは、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象または試料中の切断剤および標的の存在または非存在を検出する方法における使用のためのキットを提供し、キットは、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体を少なくとも含み、活性化可能抗体は、未切断の、非活性化状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、ＡＢの天然の結合パートナーの修飾形ではなく；（ｂ）未切断の、非活性化状態では、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断され、活性化された状態では、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合せず、（ｉｉ）対象または試料における活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することであって、対象または試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルは、切断剤が対象または試料に存在することを示し、対象または試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルの非存在は、切断剤が対象または試料に存在しない、および／または十分には存在しないことを示す、測定すること。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢに配置される。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
本開示は、（ｉ）対象または試料を活性化可能抗体と接触させることであって、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的および検出可能標識を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含み、活性化可能抗体は、未切断の、非活性化状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、ＡＢの天然の結合パートナーの修飾形ではなく；未切断の、非活性化状態では、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断された、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合せず；検出可能標識は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断後に放出される活性化可能抗体の一部の上に配置される、接触させること；および（ｉｉ）対象または試料における活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することであって、対象または試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルは、切断剤および標的が対象または試料に存在することを示し、対象または試料における検出可能標識の検出レベルの非存在は、切断剤が対象または試料に存在しないことを示す、測定すること、により対象または試料中の切断剤および目的の標的の存在または非存在を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢに配置される。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象または試料中の切断剤および標的の存在または非存在を検出する方法における使用のためのキットを提供し、キットは、対象または生物学的試料を接触させることにおける使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体（例えば、治療薬が接合される活性化可能抗体）、および対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の検出レベルは、切断剤および標的が対象または生物学的試料に存在することを示し、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の検出レベルの非存在は、切断剤、標的または切断剤および標的の両方が対象または生物学的試料に存在せず、および／または十分には存在せず、そのため活性化可能抗体の標的結合および／またはプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料において検出され得ないことを示す。
本開示は、（ｉ）対象または生物学的試料を、活性化可能抗体と、標的の存在下で接触させること、および（ｉｉ）対象または生物学的試料における活性化された活性化可能抗体のレベルを測定すること、により対象または試料中の切断剤の存在または非存在を検出するための方法を提供し、対象または生物学的試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルは、切断剤が対象または生物学的試料に存在することを示し、対象または生物学的試料における検出可能標識の検出レベルの非存在は、切断剤が対象または生物学的試料に検出可能なレベルで存在せず、そのため活性化可能抗体のプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料中で検出され得ないことを示す。このような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含み、活性化可能抗体は、未切断の（すなわち、非活性化の）状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、（ｂ）未切断状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断された（すなわち、活性化された）状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合しない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、マスキング部分に付着される。いくつかの実施形態では、検出可能標識は、プロテアーゼ切断部位のＮ末端側の切断可能部分に付着される。いくつかの実施形態では、ＡＢの単一の抗原結合部位は、マスクされる。本開示の抗体が少なくとも２つの抗原結合部位を有するいくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされ、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされない。いくつかの実施形態では、すべての抗原結合部位はマスクされる。いくつかの実施形態では、測定するステップは、検出可能な標識を含む二次試薬の使用を含む。
本開示はまた、対象または試料中の切断剤および標的の存在または非存在を検出する方法における使用のためのキットを提供し、キットは、対象または生物学的試料を活性化可能抗体と標的の存在下で接触させること、および対象または生体試料中の活性化された活性化可能抗体レベルを測定することにおける使用のための本明細書で記載の活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を少なくとも含み、対象または生物学的試料における活性化された活性化可能抗体の検出レベルは、切断剤が対象または生物学的試料中に存在することを示し、対象または生物学的試料中の検出可能標識の検出レベルの非存在は、切断剤が対象または生物学的試料に検出可能なレベルで存在せず、そのため活性化可能抗体のプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料中で検出できないことを示唆する。このような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含み、活性化可能抗体は、未切断（すなわち、非活性化）状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、（ｂ）未切断状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断された（すなわち、活性化された）状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合しない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、検出可能な標識はマスキング部分に付着される。いくつかの実施形態では、検出可能標識は、プロテアーゼ切断部位のＮ末端側の切断可能部分に付着される。いくつかの実施形態では、ＡＢの単一の抗原結合部位は、マスクされる。本開示の抗体が少なくとも２つの抗原結合部位を有するいくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされ、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされない。いくつかの実施形態では、すべての抗原結合部位はマスクされる。いくつかの実施形態では、測定するステップは、検出可能な標識を含む二次試薬の使用を含む。
本開示はまた、対象または試料中の切断剤の存在または非存在を検出する方法における使用のためのキットを提供し、キットは、対象または生物学的試料を接触させることにおける使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分上に配置された検出可能な標識を含み、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の検出可能なレベルは、切断剤が対象または生物学的試料中に存在せず、および／または十分に存在せず、そのため活性化可能抗体の標的結合および／またはプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料で検出できないことを示し、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の検出レベルの非存在は、切断剤が検出可能なレベルで、対象または生物学的試料中に存在しないことを示す。
本開示は、（ｉ）対象または生物学的試料と活性化可能抗体を接触させることであって、活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分上に配置される検出可能な標識を含む、接触させること、および（ｉｉ）対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することであって、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤、標的、または切断剤および標的の両方が対象または生物学的試料中に存在せず、および／または十分には存在せず、そのため活性化可能抗体の標的結合および／またはプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料で検出できないことを示し、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の低下した検出可能レベルは、切断剤および標的が対象または生物学的試料中に存在することを示す、測定すること、により対象または試料中の切断剤および標的の存在または非存在を検出する方法を提供する。検出可能な標識の低下されたレベルは、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、および／または約１００％の低下である。このような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含み、活性化可能抗体は、未切断の（すなわち、非活性化の）状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、（ｂ）未切断状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断された（すなわち、活性化された）状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合しない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢに配置される。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象または試料中の切断剤および標的の存在または非存在を検出する方法における使用のためのキットを提供し、キットは、対象または生物学的試料を接触させることにおける使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤、標的、または切断剤および標的の両方が対象または生物学的試料中に存在せず、および／または十分には存在せず、そのため活性化可能抗体の標的結合および／またはプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料中で検出できないことを示し、対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体の低下された検出可能レベルは、切断剤および標的が対象または生物学的試料に存在することを示す。低下された検出可能な標識のレベルは、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、および／または約１００％の低下である。
本開示はまた、（ｉ）対象または生物学的試料を活性化可能抗体と接触させることであって、活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分の上に配置される検出可能標識を含む、接触させること、および（ｉｉ）対象または生物学的試料中の検出可能抗体のレベルを測定することであって、対象または生物学的試料中の検出可能抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象または生物学的試料中に存在せず、および／または十分には存在せず、そのため活性化可能抗体のプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料中で検出できないことを示し、対象または生物学的試料中の検出可能抗体の低下された検出可能レベルは、切断剤が対象または生物学的試料に存在することを示す、測定すること、により対象または試料中の切断剤の存在または非存在を検出する方法を提供する。低下された検出可能な標識のレベルは、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、および／または約１００％の低下である。このような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、および標的を特異的に結合する抗原結合ドメインまたはそのフラグメント（ＡＢ）を含み、活性化可能抗体は、未切断の（すなわち、非活性化の）状態では、次のような、Ｎ末端からＣ末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、（ｂ）未切断状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、および切断された（すなわち、活性化された）状態では、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、またはそれと競合しない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢに配置される。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象または試料中の目的の切断剤の存在または非存在を検出する方法における使用のためのキットを提供し、キットは、対象または生物学的試料を接触させることにおける使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体、および対象または生物学的試料中の活性化された活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分の上に配置される検出可能標識を含み、対象または生物学的試料中の検出可能抗体の検出可能レベルは、切断剤、標的、または切断剤および標的の両方が対象または生物学的試料に存在せず、および／または十分には存在せず、そのため活性化可能抗体の標的結合および／またはプロテアーゼ切断が対象または生物学的試料に検出され得ないことを示し、対象または生物学的試料における活性化された、活性化可能抗体の低下された検出可能レベルは、切断剤および標的が対象または生物学的試料に存在することを示す。検出可能な標識の低下されたレベルは、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、および／または約１００％の低下である。
これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、活性化できる活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、検出可能な標識としては、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１種または複数の金属イオン、またはリガンドベースの標識が挙げられる。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、イメージング剤は、放射性同位元素を含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、放射性同位元素は、インジウムまたはテクネチウムである。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウムまたは酸化鉄を含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはβ－ガラクトシダーゼを含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、またはユーロピウム誘導体を含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、標識は、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識を含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは１つまたは複数のハプテンを含む。
これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類、伴侶動物（ネコ、イヌ、ウマなど）、家畜、作業用動物、動物園動物などの非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類である。
これらの方法のいくつかの実施形態では、方法は、インビボ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、方法は、インサイツ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、方法は、エクスビボ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、方法は、インビトロ法である。
いくつかの実施形態では、インサイツイメージングおよび／またはインビボイメージングは、治療する患者を特定するための方法において有用である。例えば、インサイツイメージングでは、活性化可能抗体は、患者試料をスクリーンするために使用されて、適切な位置で、例えば、腫瘍部位で、適切なプロテアーゼおよび標的を有するそれらの患者を特定する。
いくつかの実施形態では、インサイツイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を特定するか、あるいは、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、および試験される活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの両方について陽性である患者（例えば、疾患部位で活性化された抗体を蓄積する）は、このようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補として特定される。同様に、これらの方法を用いて試験される、標的、および活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼのいずれかまたは両方について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、第１の活性化可能抗体に関して陰性であるこのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が特定されるまで、異なるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態では、患者は次に、陽性である患者のための治療的有効量の接合型活性化可能抗体を投与される。
いくつかの実施形態では、インビボイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を特定するか、あるいは、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、および試験される活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質中の基質を切断するプロテアーゼの両方について陽性である患者（例えば、疾患部位で活性化された抗体を蓄積する）は、このようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補として特定される。同様に、陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、第１の活性化可能抗体に関して陰性であるこのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が特定されるまで、異なるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態では、患者は次に、陽性である患者のための治療的有効量の接合型活性化可能抗体を投与される。
方法およびキットのいくつかの実施形態では、方法またはキットは、本開示の活性化可能抗体による治療に好適する患者集団を特定するか、あるいは、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、およびこれらの方法により試験される活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質中の基質を切断するプロテアーゼの両方について陽性である患者は、このようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補として特定される。同様に、これらの方法を用いて試験される、標的、および活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質中の基質を切断するプロテアーゼの両者について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、このような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が特定されるまで、他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態では、標的のいずれかについて陰性である患者は、このようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含むこのような活性化可能抗体による治療のための適切な候補として特定される。いくつかの実施形態では、標的のいずれか（例えば、標的）について陰性である患者は、このようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補ではない。いくつかの実施形態では、このような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が特定されるまで、他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、治療薬が接合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、薬剤に接合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢに配置される。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
いくつかの実施形態では、方法またはキットは、本開示の抗標的活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体（例えば、治療薬が接合される活性化可能抗体）による治療、続いて、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を、それを必要としている対象に投与することによる治療のために適切な患者集団を特定するか、あるいは、絞り込むために使用される。例えば、標的、およびこれらの方法により試験される活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断するプロテアーゼの両方について陽性である患者は、このようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む、このような抗体および／またはこのような接合型活性化可能抗体による治療のための適切な候補として特定され、患者は次に、治療的有効量の試験された活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を投与される。同様に、これらの方法を用いて試験される、標的、および活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質中の基質を切断するプロテアーゼのいずれかまたは両方について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、このような患者は、治療のための適切な抗体および／または接合型活性化可能抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体）が特定されるまで、他の抗体および／または接合型活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態では、患者は次に、患者が陽性であると試験された、治療的有効量の活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体を投与される。
これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＭＭは、約４～４０アミノ酸長を有するペプチドである。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、リンカーペプチドを含み、リンカーペプチドは、ＭＭとＣＭ１－ＣＭ２基質の間に配置される。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、リンカーペプチドを含み、リンカーペプチドは、ＡＢとＣＭ１－ＣＭ２基質の間に配置される。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、第１のリンカーペプチド（ＬＰ１）および第２のリンカーペプチド（ＬＰ２）を含み、第１のリンカーペプチドは、ＭＭとＣＭ１－ＣＭ２基質の間に配置され、第２のリンカーペプチドは、ＡＢとＣＭ１－ＣＭ２基質の間に配置される。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１およびＬＰ２の各々は、約１～２０アミノ酸長のペプチドであり、ＬＰ１およびＬＰ２の各々は、同じリンカーである必要はない。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１およびＬＰ２の一方または両方は、グリシン－セリンポリマーを含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１およびＬＰ２の少なくとも一方は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ｎは、少なくとも１の整数である。これらの方法およびキットのいくついくつかの実施形態では、ＬＰ１およびＬＰ２の少なくとも一方は、式（ＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは少なくとも１の整数である）を有するアミノ酸配列を含む。これらの方法およびキットのいくついくつかの実施形態では、ＬＰ１およびＬＰ２の少なくとも一方は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号３８３）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号３８４）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号３８５）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号３８６）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号３８７）、およびＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号３８８）。
これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＡＢは、本明細書で提示される交差反応性抗体配列から選択される抗体または抗体フラグメント配列を含む。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＡＢは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖまたは単鎖抗体（ｓｃＡｂ）を含む。
これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、切断剤は、標的と対象または試料中で共局在するプロテアーゼであり、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、プロテアーゼに対する基質として機能するペプチドであり、プロテアーゼは、活性化可能抗体がそのプロテアーゼに暴露されると活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列およびＣＭ２基質配列のそれぞれは独立に、最大１５アミノ酸長のポリペプチドである。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＡＢのＮ末端に結合される。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＡＢのＣ末端に結合される。これらの方法およびキットのいくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＡＢのＶＬ鎖のＮ末端に結合される。
本開示の活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、診断用および予防用製剤に使用される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、前述の炎症、炎症性障害、癌または他の障害の１種または複数の発症の危険のある患者に投与される。
前述の障害の１種または複数に対する患者または器官の素因は、遺伝子型、血清学的または生化学的マーカーを使用して決定できる。
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、１種または複数の前述の障害に関連する臨床兆候を有すると診断されたヒト個体に投与される。診断に基づいて、活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、臨床兆候の影響を軽減するかまたは回復するために投与される。
本開示の活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体はまた、患者試料中の標的の検出においても有用であり、従って、診断薬として有用である。例えば、本開示の活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体は、患者試料中の標的レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにおいて使用される。
一実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された活性化可能抗体は、試験試料中に存在する可能性のある任意の標的のための捕捉抗体としての役割をする。固定された抗体を患者試料と接触させる前に、固体支持体は、分析物の非特異的吸着を防ぐために、洗浄されかつ乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤により処理される。
その後ウェルを、抗原を含むことが疑われる試験試料、または標準量の抗原を含む溶液で処理する。このような試料は、例えば、病状の特徴と見なされる循環抗原のレベルを有することが疑われる対象からの血清試料である。試験試料または標準物質を洗い流した後、固体支持体は、検出可能に標識された第２の抗体で処理される。標識された第２の抗体は、検出抗体として機能する。検出可能な標識のレベルが、測定され、試験試料中の標的抗原の濃度が、標準試料から作成された検量線との比較により決定される。
インビトロ診断アッセイで本開示の抗体を用いて得られた結果に基づいて、標的抗原の発現レベルに基づき患者における疾患を病期分類できることが、理解されよう。所定の疾患について、血液試料を、疾患の進行の様々な段階にある、および／または疾患の治療的処置での様々な時点にあると診断された対象から採取する。進行または治療の各段階に対し統計的に有意な結果を与える試料の集団を用いて、各段階の特徴と見なされ得る抗原の濃度範囲が、特定される。
活性化可能抗体および／または接合型活性化可能抗体はまた、診断および／またはイメージング方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、このような方法は、インビトロ法である。いくつかの実施形態では、このような方法は、インビボ法である。いくつかの実施形態では、このような方法は、インサイツ法である。いくつかの実施形態では、このような方法は、エクスビボ法である。例えば、酵素的に切断可能なＣＭ１－ＣＭ２基質を有する活性化可能抗体を、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる酵素の存在または非存在を検出するために使用できる。このような活性化可能抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞または組織中の活性化された抗体（すなわち、活性化可能抗体の切断に起因する抗体）の蓄積の測定による酵素活性（または、いくつかの実施形態では、高められた還元電位の環境、例えば、ジスルフィド結合の還元を提供できる環境）のインビボ検出（例えば、定性的または定量的）を含み得る診断で使用できる。活性化された抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（またはＣＭ１－ＣＭ２基質の性質に依存して、高められた還元電位）を発現するのみならず、組織が、活性化抗体が結合する標的を発現することも示す。
例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、腫瘍の部位で、ウィルスまたは細菌感染の部位で、生物学的に閉じ込められた部位（例えば、膿瘍、器官等において）などの部位で見出されるプロテアーゼに対するプロテアーゼ基質であるように選択できる。ＡＢは、標的抗原を結合するものであり得る。当業者によく知られている方法を使用して、検出可能な標識（例えば、蛍光標識または放射性標識または放射性トレーサー）を、ＡＢまたは活性化可能抗体の他の領域に接合することができる。好適な検出可能な標識は、上記のスクリーニング方法に関連して考察されており、追加の特定の例を、以下に示す。その活性が目的の疾患組織において高められているプロテアーゼと共に、疾患状態のタンパク質またはペプチドに特異的なＡＢを用いることにより、活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質特異的酵素が検出可能なレベルで存在しないかまたは疾患組織中より低いレベルで存在するか、または不活性である（例えば、チモーゲンの形態で、または阻害剤との複合体で）組織に比べて、疾患組織に対する高められた結合速度を示す。小タンパク質およびペプチドは腎濾過システムにより血液から急速に排出されるため、およびＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的な酵素は検出レベルで存在しない（または非疾患組織においては低レベルで存在するか、または不活性コンホメーションで存在する）ので、疾患組織中の活性化された抗体の蓄積は、非疾患組織と比較して増強される。
別の例では、活性化可能抗体は、試料中の切断剤の存在または非存在を検出するために使用できる。例えば、活性化可能抗体が酵素による切断を受けやすいＣＭ１－ＣＭ２基質を含む場合、活性化可能抗体を、試料中の酵素の存在を検出するために（定性的にまたは定量的に）使用できる。別の例では、活性化可能抗体が還元剤による切断を受けやすいＣＭ１－ＣＭ２基質を含む場合、活性化可能抗体を、試料中の還元状態の存在を検出するために（定性的または定量的に）使用できる。これらの方法での分析を促進するために、活性化可能抗体は、検出可能に標識されてよく、支持体（例えば、固体支持体、例えばスライドまたはビーズ）に結合されてよい。検出可能標識は、活性化可能抗体の切断後に放出されない部分の上に配置でき、例えば、検出可能標識は、消光蛍光標識、または切断が生じるまで検出できない他の標識であり得る。アッセイは例えば、固定され、検出可能的に標識された活性化可能抗体を、酵素および／または還元剤を含むことが疑われる試料と、切断が生じるのに十分な時間にわたり接触させること、次いで過剰の試料および混入物質を除去するために洗浄することにより実施できる。試料中の切断（例えば、酵素または還元剤による）の存在または非存在が次に、試料との接触の前の活性化可能抗体の検出可能シグナルの変化、例えば、試料中の切断剤による活性化可能抗体の切断による検出可能シグナルの存在および／または増大、により評価される。
このような検出方法は、切断されると活性化可能抗体のＡＢを結合できる標的の存在または非存在の検出を提供するようにも適合され得る。したがって、アッセイは、切断剤の存在または非存在、および目的の標的の存在または非存在を評価するように適合されてよい。切断剤の存在または非存在は、上記のような活性化可能抗体の検出可能レベルの存在および／または増大により検出でき、標的の存在または非存在は、標的－ＡＢ複合体の検出により、例えば、検出可能に標識された抗標的抗体の使用により、検出できる。
活性化可能抗体はまた、例えば、プロテアーゼ切断による、活性化可能抗体の活性化、および特定の標的への結合の検証のためのインサイツイメージングにおいても有用である。インサイツ画像処理は、細胞培養物または組織切片などの生体試料中におけるタンパク質分解活性および標的の局在化を可能にする、技術である。この技術を使用して、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づき所定の標的への結合およびタンパク質分解活性の両方を、確認できる。
これらの技術は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）または健康組織由来の任意の凍結細胞または組織で有用である。これらの技術は、新しい細胞または組織試料でも有用である。
これらの技術では、活性化可能抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能な標識は、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチンおよびストレプトアビジンなどの増幅試薬、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）であり得る。
標識された活性化可能抗体と共にインキュベートされた試料中の標識の検出は、試料が標的を含みかつ活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるものを用いて、および／またはプロテアーゼに対し特異的である薬剤、例えば、プロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）に対し特異的であり、マトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害する、抗体、例えば、Ａ１１を用いて、確認できる；例えば、２０１０年１１月１１日に公開の国際公開第ＷＯ２０１０／１２９６０９号を参照されたい。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものを使用する、および／またはより選択的阻害剤を用いる同じ手法が、活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的なプロテアーゼ、またはプロテアーゼの種類を特定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、標的の存在は、その標的に特異的な薬剤、例えば、別の抗体を使用して確認でき、または、検出可能な標識を、標識されていない標的と競合させることができる。いくつかの実施形態では、標識されていない活性化可能抗体を、標識された二次抗体またはより複雑な検出システムによる検出でに使用し得る。
類似の技術は、インビボイメージングにも有用であり、対象、例えば、ヒトを含む哺乳動物における蛍光シグナルの検出は、疾患部位が標的を含み、かつ活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対し特異的であるプロテアーゼを含むことを示す。
これらの技術はまた、活性化可能抗体中のプロテアーゼ特異的ＣＭ１－ＣＭ２基質に基づく、種々の細胞、組織および生物におけるプロテアーゼ活性の検出、特定または特徴づけのための、キットにおいておよび／または試薬としても有用である。
いくつかの実施形態では、インサイツイメージングおよび／またはインビボイメージングは、治療する患者を特定するための方法において有用である。例えば、インサイツイメージングでは、活性化可能抗体は、適切な位置で、例えば、腫瘍部位で、適切なプロテアーゼおよび標的を有するそれらの患者を特定するために患者試料をスクリーンするために使用される。
いくつかの実施形態では、インサイツイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を特定するか、あるいはさらに絞り込むために使用される。例えば、標的、および試験される活性化可能抗体中の切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２基質）において基質を切断するプロテアーゼの両方について陽性である患者（例えば、疾患部位で、活性化された抗体を蓄積する）は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補として特定される。同様に、これらの方法を用いて試験される、標的、および活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼのいずれかまたは両方について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補として特定され得る（すなわち、試験された活性化可能抗体による治療には好適でない）。いくつかの実施形態では、第１の活性化可能抗体に関して陰性であるそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が特定されるまで、異なるＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。
いくつかの実施形態では、インビボイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を特定するか、あるいはさらに絞り込むために使用される。例えば、標的、および試験される活性化可能抗体中の切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２基質）において基質を切断するプロテアーゼの両方について陽性である患者（例えば、疾患部位で、活性化された抗体を蓄積する）は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補として特定される。同様に、陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補として特定され得る（すなわち、試験された活性化可能抗体による治療に好適でない）。いくつかの実施形態では、第１の活性化可能抗体に関して陰性であるそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が特定されるまで、異なるＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。
医薬組成物
本開示の複合化抗体、活性化可能抗体、および／または接合型活性化可能抗体（本明細書において「活性化合物」とも称する）、およびその誘導体、フラグメント、類似体および相同体は、投与のために適切な医薬組成物中に組込まれ得る。このような組成物は、典型的には、接合型抗体、活性化可能抗体、および／または接合型活性化可能抗体および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。好適な担体は、本分野の標準的な参考テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載され、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。このような担体または希釈剤の好適な例としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ビークルも使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物中でのこれらの使用が意図される。補助的な活性化合物も組成物中に組み込まれてよい。
本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、もしくは皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、次の成分：注射用の水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌希釈剤、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化剤、アセテート、シトレート、もしくはホスフェートのような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような張度調節用の薬剤を挙げることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基により調節できる。非経口用調製剤は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または反復投与用バイアル瓶に封入できる。
注射用途に適した医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射可能溶液もしくは分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォアＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、注射が容易にできる程度に流動性である必要がある。それは、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び菌類のような微生物の汚染作用に対し保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。いくつかの実施形態では、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが望ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより生じさせ得る。
滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記で列挙した成分の１種または組み合わせと共に適切な溶媒中に組み込み、その後ろ過滅菌することにより調製できる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記に列挙したもの由来の必要な他の成分を含む滅菌ビークルに組み込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分の粉末および以前に滅菌ろ過した溶液から任意の追加の所望の成分が得られる。
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用の担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入でき、または加圧して錠剤にできる。治療用経口投与では、活性化合物を、賦形剤とともに組み込むことができ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用できる。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体担体を用いて調製でき、その際、流体担体中の化合物は、経口適用され、うがいをして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性のある結合剤、および／または補助物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ剤などは、微結晶セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロートなど滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、または、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバのような香味料のいずれかの成分または化合物を含み得る。
吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレー、またはネブライザーの形態で送達される。
全身投与はまた、経粘膜または経皮的手段によることもできる。経粘膜または経皮的投与の場合、通過すべきバリアに適した浸透剤が、配合物中で使用される。このような浸透剤は通常、当技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与のために、浄化剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐剤の使用により達成され得る。経皮的投与の場合、活性化合物は、当該技術分野において一般に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに処方される。
化合物は、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または直腸送達用の停留かん腸剤の形態でも調製され得る。
一実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む、制御放出製剤などの、化合物が身体から急速に排泄されるのを防ぐ担体とともに調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーを、使用できる。このような製剤の調製方法は、当業者には自明である。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の、当業者に既知の方法に従って調製され得る。
投与を容易にするために、また投薬量を一様にするために、経口または非経口組成物を投与単位剤形に処方することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位剤形は、治療すべき被験体にとって１回投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された、所定の量の活性化合物を含有する。本開示の投与単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特性および得られる特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにこのような活性化合物を配合する技術上の固有の制約によって決定され、また、それらに直接依存する。
医薬組成物は、投与のための指示書と共に容器、パック、またはディスペンサーに含められてよい。
本発明は、以下の実施例でさらに説明され、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１：活性化可能抗体およびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断可能基質
本明細書で提供される試験は、本開示の例示的マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質および本開示のＭＭＰ基質を含む例示的活性化可能抗体について記載する。
例示的活性化可能抗体を、それぞれ１つが、表１に記載のＭＭＰ基質の１種を含むように構築した。配列を表２に記載した本開示の例示的活性化可能抗体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合するマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体をベースにした抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む。例示的活性化可能抗体はまた、ＡＢの軽鎖のＮ末端に結合されたプロドメインを含む。各プロドメインは、マスキング部分（ＭＭ）および切断可能部分（ＣＭ）を含み、ＣＭは、表１の少なくとも１つのＭＭＰ基質配列を含む。
Figure 2022512124000013
 表２：活性化可能抗体配列
抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５）重鎖（アミノ酸配列）（配列番号４００）
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＱＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号３９９）
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０１）
ＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－ＮＳＵＢ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０２）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体軽鎖（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００１ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０３）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００１ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０４）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００２ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０５）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＤＬＡＨＰＬＬＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００３ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０６）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００４ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０７）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００５ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０８）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００６ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４０９）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００６ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１０）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００７ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１１）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００８ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１２）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００８ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１３）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４００９ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１４）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１０ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１５）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１１ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１６）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１２ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１７）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１３ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１８）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１３ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４１９）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１４ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４２０）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１５ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４２１）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１５ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４２２）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－４０１６）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４２３）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－２０１１ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８０）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－３０１１ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８１）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－１００１ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８２）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－１００１ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８３）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－１００４ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８４）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－１００４ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８５）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－１００５ＳＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８６）
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抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－１００５ＬＬ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８７）
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実施例２：ＭＭＰ切断可能基質を有する活性化可能抗体のインビトロ安定性
本明細書で提供される試験は、本開示のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質を含む活性化可能抗体のインビトロ安定性を評価する。
本開示の活性化可能抗体の安定性を、組換えＭＭＰ９または組換えＭＭＰ１４マトリックスメタロプロテアーゼの存在下で測定した。各活性化可能抗体（１００μｇ／ｍＬ）を、５０ｍＭの示した組換えプロテアーゼと共に３７℃で２４時間インキュベートし、切断された活性化可能抗体の画分を、それぞれのプロテアーゼ酵素についてキャピラリー電気泳動法により測定した。このインビトロ試験の結果を、表３にまとめる。
これらの例示的結果は、本開示の基質が、ＭＭＰ９またはＭＭＰ１４による広範な切断性を示したことを示す。これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも８５％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）、またはＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも９０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
Figure 2022512124000014
実施例３：ＭＭＰ切断可能基質を有する活性化可能抗体のインビボ安定性
本明細書で提供される試験は、本開示のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質を含む活性化可能抗体のインビボ安定性を評価する。
これらの例示的試験は、１回分の活性化可能抗体をマウスに投与し、その後、ウェスタンブロットで血漿中の切断が観察された活性化可能抗体の画分をウェスタンブロットにより測定することにより、本開示のＭＭＰ基質を含む活性化可能抗体の安定性を測定した。安定性を、基質、例えば、少なくとも１種のＭＭＰ基質および少なくともセリンプロテアーゼ基質を含む２０１１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ、配列番号２１）、および３０１１（ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ、配列番号２２）または少なくとも１種のＭＭＰ基質を含む基質１００１（ＩＳＳＧＬＬＳＳ、配列番号１７）を有する他の既知の活性化可能抗体と比較した。
この試験では、約７～８週齢のｎｕ／ｎｕマウスの腹腔内に、１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で示した試験品を投与した。投与の７日後に、終末血を心臓穿刺により収集し、収集後１時間以内に血漿へと処理した。収集した試料を、リン酸塩緩衝生理食塩水中で１：１００に希釈し、変性させ、Ａ１１０ＵＫヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）および抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いるＷＥＳウェスタンブロットプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて分析した。切断された活性化可能抗体の画分を、切断された活性化可能抗体に対応するより高い移動度のポリペプチドの画分を定量化することにより決定した。これらの例示的アッセイの結果を、表４および図１にまとめる。
Figure 2022512124000015
これらの例示的結果は、本開示のＭＭＰ基質を含む特定の活性化可能抗体が、セリンプロテアーゼおよびＭＭＰ基質の両方を有する活性化可能抗体より高いインビボ安定性を示すことを明らかにした。
これらの例示的結果はまた、インビボ安定性インビボ安定性が３０％活性化未満である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）またはＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、インビボ安定性インビボ安定性が２５％活性化未満である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）またはＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
実施例４：ＭＭＰ切断可能基質を有する活性化可能抗体のマスキング効率
本明細書で提供される試験は、本開示のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質を含む活性化可能抗体のインビトロマスキング効率を評価する。
これらの試験では、固相結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、本開示のＭＭＰ基質を含む抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の組換えＥＧＦＲに対する結合親和性を実証した。図２Ａおよび２Ｂに示すように、本開示の示した基質を有する活性化可能抗体のＥＧＦＲに対する結合親和性を、測定し、ｃ２２５ｖ５親抗体と比較した。マスキング効率を、既知の基質、例えば、少なくとも１種のＭＭＰ基質および少なくともセリンプロテアーゼ基質を含む２００１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ、配列番号２３）または少なくとも１種のＭＭＰ基質を含む基質１００１（ＩＳＳＧＬＬＳＳ、配列番号１７）、１００４（ＡＶＧＬＬＡＰＰ、配列番号１８）、および１００５（ＧＰＳＨＬＶＬＴ、配列番号１９）を有する、他の活性化可能抗体と比較した。これらの例示的結果の要約を、表５および図２Ａおよび２Ｂに示す。
これらの例示的結果は、ＭＭＰ基質が活性化可能抗体のマスキング部分のマスキング効率に影響を与え、いくつかの事例では、活性化可能抗体のプロドメイン中のマスキング部分の見かけのマスキング効率が次第に増加することを示した。
これらの例示的結果はまた、マスキング効率が７０より大きい、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）、またはＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、マスキング効率が１６０より大きい、一群の基質も示す。これらの例示的結果はまた、マスキング効率が１６０～３５０である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）またはＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
Figure 2022512124000016
実施例５：抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビボ有効性
本明細書で提供される試験は、マウスＨ２９２（ヒト肺癌細胞株）異種移植モデルを用いて、本開示のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質を含む活性化可能抗体のインビボ有効性を評価する。
これらの試験では、６～８週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウス中のＨ２９２（ヒト肺癌由来細胞株）皮下異種移植腫瘍を、１８０～２６０ｍｍ３の平均体積に増殖させた。Ｈ２９２細胞株は、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブに応答する。マウスを次に、各７匹のマウスの群に無作為化し、各群に対し、示した試験品の１０ｍｇ／ｋｇを１日目に、腹腔内に投与した。平均腫瘍体積±ＳＥＭを、図３Ａに示すように、試験品投与後のそれぞれの時点に対しプロットした。図３Ｂは、示した基質またはセツキシマブまたは免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）対照を含む活性化抗体で治療した各マウスについての、２８日目の絶対腫瘍体積の分布を示す。有効性を、既知の基質、例えば、少なくとも１種のＭＭＰ基質を含む１００１（ＩＳＳＧＬＬＳＳ）、１００４（ＡＶＧＬＬＡＰＰ）、および１００５（ＧＰＳＨＬＶＬＴ）を有する活性化可能抗体、または非切断性グリシン－セリンリンカー（ＮＳＵＢ）を有する活性化可能抗体で測定した。
図３Ａおよび３Ｂに示すように、本開示のＭＭＰ基質を有する特定の活性化可能抗体は、プロドメインを欠くセツキシマブと同等のインビボ有効性を示した。
実施例６：抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビボ腫瘍内活性化
本明細書で提供される試験は、マウスＨ２９２（ヒト肺癌細胞株）異種移植モデルに投与後の本開示のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質を含む活性化可能抗体のインビボ腫瘍内活性化を評価する。
これらの試験では、６～８週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウス中のＨ２９２（ヒト肺癌由来細胞株）皮下異種移植腫瘍を、１８０～２６０ｍｍ３の平均体積に増殖させた。Ｈ２９２細胞株は、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブに応答する。マウスを次に、各７匹のマウスの群に無作為化し、各群に対し、示した試験品の１０ｍｇ／ｋｇを１日目に腹腔内に投与した。各マウスを、示した基質を有する、またはセツキシマブまたは免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）対照を有する活性化抗体で治療した。有効性を、既知の基質、例えば、少なくとも１種のＭＭＰ基質を含む１００１（ＩＳＳＧＬＬＳＳ、配列番号１７）、１００４（ＡＶＧＬＬＡＰＰ、配列番号１８）、および１００５（ＧＰＳＨＬＶＬＴ、配列番号１９）を有する活性化可能抗体、または非切断性グリシン－セリンリンカー（ＮＳＵＢ）を有する活性化可能抗体で測定した。
腫瘍および血漿を、投与の４日後のマウスから収集した。腫瘍組織を、ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＥＤＴＡ含有免疫沈降緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解し、さらにＢａｒｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて溶解した。試料を、Ａ１１０ＵＫヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）および抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いるＷＥＳウェスタンブロットプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて分析した。切断された活性化可能抗体の画分を、切断された活性化可能抗体に対応するより高い移動度のポリペプチドの画分を定量化することにより決定した。これらの例示的アッセイの結果を、表６および図４にまとめる。
本開示のＭＭＰ基質を有する特定の活性化可能抗体の性質の要約を、表６に示す。実施例３、表４からの示した試験品のインビボ安定性を、比較として提示する。これらの例示的結果は、ＭＭＰ基質４００１が、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の両方による切断性を含む、望ましい特性を実証したことを示す。いくつかの基質はまた、他の参照ＭＭＰ基質（１００１および１００４）より高い相対的安定性を示した。
これらの例示的結果はまた、インビボ非腫瘍安定性および／または腫瘍内安定性が３０％活性化未満である、一群の基質も示す。これらの例示的結果はまた、インビボ非腫瘍安定性および／または腫瘍内安定性が２０％～３０％活性化である、一群の基質も示す。これらの例示的結果はまた、インビボ非腫瘍安定性および／または腫瘍内安定性が２２％～２７％活性化である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）、またはＲＦＰＹＧＶＷ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
Figure 2022512124000017
実施例７：活性化可能抗体およびタンデム切断可能基質
本明細書で提供される試験は、本開示のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質により切断可能な少なくとも１種の基質およびセリンプロテアーゼにより切断可能な少なくとも１種の基質を含む、本開示の例示的タンデム基質について記載する。
例示的活性化可能抗体を、それぞれ１つが表７に記載のタンデム基質の１種を含むように構築した。配列が表７に記載される本開示の例示的活性化可能抗体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合するマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体をベースにした抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む。例示的活性化可能抗体はまた、ＡＢの軽鎖のＮ末端に結合したプロドメインを含む。各プロドメインは、マスキング部分（ＭＭ）および切断可能部分（ＣＭ）を含み、ＣＭは、表７の少なくとも１種のタンデム基質配列を含む。
Figure 2022512124000018
表７：活性化可能抗体配列
抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００１）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５０）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００２）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５１）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００３）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５２）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００４）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５３）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００５）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５４）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００６）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５５）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＴＡＲＧＰＶＰＲＱＶＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００７）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５６）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００８）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５７）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５００９）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５８）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＨＶＰＲＱＶＡＰＲＳＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５０１０）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４５９）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５０１１）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４６０）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５０１２）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４６１）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－５０１３）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４６２）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－２００１）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８８）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨＧＳＳＧＴＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－２００１ＴＴ）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４８９）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（ｃ２２５ｖ５－３９５４－３００１）軽鎖（アミノ酸配列）（配列番号４９０）
ＱＧＱＳＧＱＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹＧＧＧＳＳＧＧＳＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＧＳＱＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
実施例８：タンデム基質を有する活性化可能抗体のインビトロ安定性
本明細書で提供される試験は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質により切断可能な少なくとも１種の基質およびセリンプロテアーゼにより切断可能な少なくとも１種の基質を含む、本開示の例示的タンデム基質を含む活性化可能抗体のインビトロ安定性を評価する。
本開示の活性化可能抗体の安定性を、示した組換えプロテアーゼ（マトリプターゼ、レグマイン、好中球エラスターゼ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１４）の存在下で測定した。各活性化可能抗体（２５０ｎＭ ／ ３８．５μｇ／ｍＬ）を、１０ｍＭの示したプロテアーゼと共に３７℃で２４時間インキュベートし、切断された活性化可能抗体の画分を、それぞれのプロテアーゼ酵素についてキャピラリー電気泳動法により測定した。試料を、Ａ１１０ＵＫヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）および抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いるＷＥＳウェスタンブロットプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて分析した。切断された活性化可能抗体の画分を、切断された活性化可能抗体に対応するより高い移動度のポリペプチドの画分を定量化することにより特定した。このインビトロ試験の例示的結果を、表８Ａにまとめる。
加えて、示したプロテアーゼ酵素を用いて本開示の示した基質の切断性動力学（すなわち、Ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｍ－１ｓ－１））を測定するための例示的試験を実施した。このインビトロ試験の例示的結果を、表８Ａにまとめる。
これらの例示的結果は、本開示の基質が、示されたプロテアーゼによる広範な切断性を示したことを示す。
これらの例示的結果は、本開示のタンデム基質がマトリプターゼ、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、レグマイン、および／または好中球エラスターゼ酵素による広範な切断性を示したことを示す。これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも３０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも５０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも７０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）またはＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも１５％でありマトリプターゼの切断性が少なくとも５０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳ（配列番号２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号２８）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、またはＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも１５％であり好中球エラスターゼの切断性が少なくとも３０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳ（配列番号２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号２８）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも３０％であり好中球エラスターゼの切断性が少なくとも３０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも５０％であり好中球エラスターゼの切断性が少なくとも５０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
これらの例示的結果はまた、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４の切断性が両方とも少なくとも７０％であり好中球エラスターゼの切断性が少なくとも７０％である、一群の基質も示す。いくつかの実施形態では、このような基質は、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）またはＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを含み得る。
Figure 2022512124000019
Figure 2022512124000020
実施例９：タンデム基質を有する抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビボ有効性
本明細書で提供される試験は、マウスＨ２９２（ヒト肺癌細胞株）異種移植モデルを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ基質を含む本開示の活性化可能抗体のインビボ有効性を評価する。
これらの試験では、６～８週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウス中のＨ２９２（ヒト肺癌由来細胞株）皮下異種移植腫瘍を、１８０～２６０ｍｍ３の平均体積に増殖させた。Ｈ２９２細胞株は、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブに応答する。マウスを次に、各７匹のマウス群に無作為化し、各群に対し、示した試験品の１２．５ｍｇ／ｋｇを１日目に腹腔内に投与した。平均腫瘍体積±ＳＥＭを、図６に示すように、試験品投与後のそれぞれの時点に対しプロットした。各マウスを、示した基質、またはセツキシマブまたは免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）対照を有する活性化抗体で治療した。有効性を、既知の基質、例えば、２００１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ）および３００１（ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ）を有する活性化可能抗体を用いて測定した。
インビボ安定性アッセイに加えて、腫瘍内アッセイを、図７に示すように示した活性化可能抗体を用いて実施した。腫瘍および血漿を、投与の４日後のマウスから収集した。腫瘍組織を、ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＥＤＴＡ含有免疫沈降緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解し、さらにＢａｒｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて溶解した。試料を、Ａ１１０ＵＫヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）および抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いるＷＥＳウェスタンブロットプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて分析した。切断された活性化可能抗体の画分を、切断された活性化可能抗体に対応するより高い移動度のポリペプチドの画分を定量化することにより特定した。これらの例示的アッセイの結果を、図７にまとめる。
図６に示すように、本開示のタンデムＭＭＰ基質およびセリンプロテアーゼ基質を有する特定の活性化可能抗体は、プロドメインを欠くセツキシマブと同等のインビボ有効性を示した。
実施例１０：タンデム基質を有する活性化可能抗体のマスキング効率
本明細書で提供される試験は、タンデムマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼ基質を含む本開示の活性化可能抗体のインビトロマスキング効率を評価する。
これらの試験では、固相結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、本開示のＭＭＰ基質を含む、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の組換えＥＧＦＲに対する結合親和性を実証した。本開示の示された基質を有する活性化可能抗体のＥＧＦＲに対する結合親和性を、測定し、ｃ２２５ｖ５親抗体と比較した。これらの例示的結果の要約を、表９および図８に示す。
これらの例示的結果は、タンデム基質が活性化可能抗体のマスキング部分の見かけマスキング効率を高めることにより効果を有したことを示した。
Figure 2022512124000021
実施例１１：タンデム基質を有する活性化可能抗体のインビボ安定性
本明細書で提供される試験は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により切断可能な少なくとも１種の基質およびセリンおよび／またはシステインプロテアーゼにより切断可能な少なくとも１種の基質を含む、本開示の例示的タンデム基質を含む活性化可能抗体のインビボ安定性を評価する。
これらの例示的試験は、１回分の活性化可能抗体をマウスに投与すること、その後、血漿中の切断が観察された活性化可能抗体の画分をウェスタンブロットにより測定することにより、本開示のＭＭＰ基質を含む活性化可能抗体の安定性を測定した。安定性を、基質、例えば、少なくとも１種のＭＭＰ基質および少なくともセリンプロテアーゼ基質を含む２００１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ）、および３００１（ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ）を有する、他の既知の活性化可能抗体と比較した。
この試験では、約７～８週齢のｎｕ／ｎｕマウスの腹腔内に、１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で示した試験品を投与した。投与の７日後に、終末血を、心臓穿刺により終末血を収集し、収集後１時間以内に血漿へと処理した。収集した試料を、リン酸塩緩衝生理食塩水中で１：１００に希釈し、変性させて、Ａ１１０ＵＫヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）および抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いるＷＥＳウェスタンブロットプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて分析した。切断された活性化可能抗体の画分を、切断された活性化可能抗体に対応するより高い移動度のポリペプチドの画分を定量化することにより特定した。これらの例示的アッセイの結果を、表１０にまとめる。
これらの例示的結果は、本開示のタンデム基質を含む特定の活性化可能抗体が、セリンプロテアーゼおよびＭＭＰ基質の両方を有する活性化可能抗体より高いインビボ安定性を示したことを明らかにした。
Figure 2022512124000022
実施例１２：抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビボ腫瘍組織活性化
本明細書で提供される試験は、ヒト腫瘍溶解物により、本開示のタンデム基質を含む活性化可能抗体のインビトロ活性化を評価する。
これらの試験では、ヒト腫瘍組織（頭頸部癌または膵臓癌）を、図９に示される基質を有する抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体と共にインキュベートした。例示的結果は、５００７基質（ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ；配列番号３１）を有する活性化可能抗体が、タンデム基質２００１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ；配列番号２３）または３００１（ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ；配列番号２４）を有する活性化可能抗体に比べて、より高いレベルの活性化を示すことを明らかにした。
さらなる試験では、本発明の５００７タンデム基質（ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ；配列番号３１）を有する活性化可能抗体の類似の活性化試験を、ガラルジン（ｇａｌａｒｄｉｎ）、ＥＤＴＡ、アプロチニン、またはシベレスタットから選択されるクラス特異的プロテアーゼ阻害剤を用いて頭頸部腫瘍組織または膵臓腫瘍組織で実施した。試験は、広域性のセリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニンが活性化の量を５％以下に低下させたことを示した。比較すると、他の３種の阻害剤による処理は、非阻害剤対照試験と同等のレベルの活性化を示した。これらの例示的結果は、この活性化がＭＭＰ阻害剤（ガラルジン、ＥＤＴＡ）または好中球エラスターゼ阻害剤（シベレスタット）により阻害されないことを示した。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、前出の説明は、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図するものではない。他の態様、利点、および変形は、下記の範囲内に入る。

Claims (159)

  1. タンデム基質を含む単離ポリペプチドであって、前記タンデム基質が、少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する基質である少なくとも第１の切断可能部分（ＣＭ１）および少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）またはシステインプロテアーゼ（ＣＰ）に対する基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）を含み、ＣＭ１が、アミノ酸配列ＡＨＧＬ（配列番号５４）またはＰＲＱＶ（配列番号６１）を含み、前記タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置が、ＣＭ１－ＣＭ２またはＣＭ２－ＣＭ１である、単離ポリペプチド。
  2. ＣＭ１が、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＡＬＡＨＧＬ（配列番号５２）、ＬＡＨＧＬＦ（配列番号５０）、ＬＡＨＧＬ（配列番号５３）、およびＡＨＧＬＦ（配列番号５１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  3. ＣＭ１が、ＨＶＰＲＱＶ（配列番号８）およびＶＰＲＱＶ（配列番号６０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  4. ＣＭ１およびＣＭ２が、連結ペプチドを介して連結される、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  5. ＣＭ１とＣＭ２が、互いに直接連結される、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  6. 前記ＣＭ２が、ＣＰ酵素に対する基質を含み、かつ前記ＣＰ酵素が、レグマインである、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  7. 前記ＣＭ２が、ウロキナーゼ、マトリプターゼ、および好中球エラスターゼからなる群より選択されるＳＰ酵素に対する基質を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  8. ＣＭ２が、ウロキナーゼ、マトリプターゼ、および好中球エラスターゼからなる群より選択されるＳＰ酵素に対する基質、およびＣＰ酵素に対する基質を含み、かつ前記ＣＰ酵素が、レグマインである、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  9. 前記ＭＭＰが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、またはＭＭＰ１４である、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  10. ＣＭ２が、ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＡＲＧ、ＰＲＳ、ＴＦＶＨ（配列番号１４１）、ＡＡＮ、ＳＡＮ、ＬＰＴＦＶ（配列番号１４０）、およびＧＰＴＮ（配列番号１５２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  11. ＣＭ２が、ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＬＳＧＲＳ（配列番号７２）、ＬＳＧＲＳＤ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＡ（配列番号１１０）、ＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号７０）、ＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号１０９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８４）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１０８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１４）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８６）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９２）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９６）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１００）、およびＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  12. ＣＭ２が、ＡＲＧＰ（配列番号１２８）、ＴＡＲＧ（配列番号１２５）、およびＴＡＲＧＰ（配列番号１２４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  13. ＣＭ２が、ＡＰＲＳＦ（配列番号１３０）、ＡＰＲＳ（配列番号１３１）、およびＰＲＳＦ（配列番号１３２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  14. ＣＭ２が、ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  15. ＣＭ２が、ＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３５）、ＧＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３６）、ＧＬＰＴＦＶ（配列番号１３７）、ＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３８）、ＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３９）、およびＬＰＴＦＶ（配列番号１４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  16. ＣＭ２が、ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５０）からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに、ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＬＳＧＲＳ（配列番号７２）、ＬＳＧＲＳＤ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＡ（配列番号１１０）、ＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号７０）、ＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号１０９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８４）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１０８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１４）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８６）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９２）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９６）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１００）、およびＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  17. 前記タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置が、ＣＭ１－ＣＭ２である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  18. 前記タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置が、ＣＭ２－ＣＭ１である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  19. 前記タンデム基質が、
    （ａ）配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２５、２６、２９、３１、３２、３４、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２７、２８、３０、３３、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｄ）配列番号２５、２９、３１、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｅ）配列番号２６、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｆ）配列番号２７、２８、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列、および
    （ｇ）配列番号３０および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  20. 単離ポリペプチドであって、
    標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、
    少なくとも１種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である少なくとも第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および
    少なくとも１種のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）またはシステインプロテアーゼ（ＣＰ）のための基質である少なくとも第２の切断可能部分（ＣＭ２）、を含み、
    ＣＭ１が、アミノ酸配列ＡＨＧＬ（配列番号５４）またはＰＲＱＶ（配列番号６１）を含み、および
    前記タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置が、ＣＭ１－ＣＭ２またはＣＭ２－ＣＭである、単離ポリペプチド。
  21. ＣＭ１が、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＡＬＡＨＧＬ（配列番号５２）、ＬＡＨＧＬＦ（配列番号５０）、ＬＡＨＧＬ（配列番号53）、およびＡＨＧＬＦ（配列番号５１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の単離ポリペプチド。
  22. ＣＭ１が、ＨＶＰＲＱＶ（配列番号８）およびＶＰＲＱＶ（配列番号６０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の単離ポリペプチド。
  23. ＣＭ１およびＣＭ２が、連結ペプチドを介して連結される、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  24. ＣＭ１とＣＭ２が、互いに直接連結される、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  25. 前記ＣＭ２が、ＣＰ酵素に対する基質を含み、かつ前記ＣＰ酵素が、レグマインである、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  26. 前記ＣＭ２が、ウロキナーゼ、マトリプターゼ、および好中球エラスターゼからなる群より選択されるＳＰ酵素に対する基質を含む、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  27. ＣＭ２が、
    ウロキナーゼ、マトリプターゼ、および好中球エラスターゼからなる群より選択されるＳＰ酵素に対する基質、および
    ＣＰ酵素に対する基質を含み、かつ前記ＣＰ酵素が、レグマインである、請求項２０～２６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  28. 前記ＭＭＰが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、またはＭＭＰ１４である、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  29. ＣＭ２が、ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＡＲＧ、ＰＲＳ、ＴＦＶＨ（配列番号１４１）、ＬＰＴＦＶ（配列番号１４０）、ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  30. ＣＭ２が、ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＬＳＧＲＳ（配列番号７２）、ＬＳＧＲＳＤ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＡ（配列番号１１０）、ＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号７０）、ＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号１０９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８４）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１０８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１４）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８６）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９２）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９６）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１００）、およびＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  31. ＣＭ２が、ＡＲＧＰ（配列番号１２８）、ＴＡＲＧ（配列番号１２５）、およびＴＡＲＧＰ（配列番号１２４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  32. ＣＭ２が、ＡＰＲＳＦ（配列番号１３０）、ＡＰＲＳ（配列番号１３１）、およびＰＲＳＦ（配列番号１３２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  33. ＣＭ２が、ＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３５）、ＧＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３６）、ＧＬＰＴＦＶ（配列番号１３７）、ＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号１３８）、ＬＰＴＦＶＨ（配列番号１３９）、およびＬＰＴＦＶ（配列番号１４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  34. ＣＭ２が、ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  35. ＣＭ２が、
    ＡＡＮ、ＳＡＮ、およびＧＰＴＮ（配列番号１５０）からなる群より選択されるアミノ酸配列、および
    ＳＧＲ、ＬＳＧＲ（配列番号７３）、ＬＳＧＲＳ（配列番号７２）、ＬＳＧＲＳＤ（配列番号７１）、ＬＳＧＲＳＡ（配列番号１１０）、ＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号７０）、ＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号１０９）、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８）、ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号９０）、ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号８４）、ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号１０８）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号１１４）、ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号８６）、ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号９２）、ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号９６）、ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号１００）、およびＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号１０４）からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  36. 前記タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置が、ＣＭ１－ＣＭ２である、請求項２０～３５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  37. 前記タンデム基質のＮ末端からＣ末端への配置が、ＣＭ２－ＣＭ１である、請求項２０～３５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  38. 前記タンデム基質が、
    （ａ）配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２５、２６、２９、３１、３２、３４、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２７、２８、３０、３３、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｄ）配列番号２５、２９、３１、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｅ）配列番号２６、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｆ）配列番号２７、２８、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列、および
    （ｇ）配列番号３０および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～３７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  39. 前記ＭＭＰ、前記ＣＰ、およびＳＰの少なくとも１つが、前記標的と組織中で共局在化される、請求項２０～３８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  40. 前記その抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される、請求項２０～３９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  41. 前記ＡＢが、前記ＣＭ１に連結される、請求項２０～４０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  42. 前記ＡＢが、前記ＣＭ１に直接連結される、請求項４１に記載の単離ポリペプチド。
  43. 前記ＡＢが、連結ペプチドを介してＣＭ１に連結される、請求項４１に記載の単離ポリペプチド。
  44. 前記ＡＢが、前記ＣＭ２に連結される、請求項２０～４０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  45. 前記ＡＢが、ＣＭ２に直接連結される、請求項４４に記載の単離ポリペプチド。
  46. 前記ＡＢが、結合ペプチドを介してＣＭ２に連結される、請求項４４に記載の単離ポリペプチド。
  47. 前記ＡＢが、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＣＭ１または前記ＣＭ２が、前記ＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項２０～４６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  48. 前記ＡＢが、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＣＭ１または前記ＣＭ２が、前記ＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項２０～４６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  49. 前記単離ポリペプチドが、マスキング部分（ＭＭ）を含む、請求項２０～４８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  50. 前記ＭＭが、前記標的への結合についての前記ＡＢの解離定数よりも大きい前記ＡＢへの結合についての解離定数を有する、請求項４９に記載の単離ポリペプチド。
  51. 前記ＭＭが、４０アミノ酸長さ以下のポリペプチドである、請求項４９または５０に記載の単離ポリペプチド。
  52. 前記ＭＭが、未切断状態での前記単離ポリペプチドが次のようなＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭを含むように前記ＣＭ１に連結される、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  53. 前記単離ポリペプチドが、前記ＭＭと前記ＣＭ１の間に連結ペプチドを含む、請求項５２に記載の単離ポリペプチド。
  54. 前記単離ポリペプチドが、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチドを含む、請求項５２に記載の単離ポリペプチド。
  55. 前記単離ポリペプチドが、
    前記ＭＭと前記ＣＭ１の間に連結ペプチド、および
    前記ＣＭ２と前記ＡＢの間に連結ペプチド、
    を含む、請求項５２に記載の単離ポリペプチド。
  56. 前記ＭＭが、未切断状態での前記単離ポリペプチドが次のようなＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭを含むようにＣＭ２に連結される、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  57. 前記単離ポリペプチドが、前記ＭＭと前記ＣＭ２の間に連結ペプチドを含む、請求項５６に記載の単離ポリペプチド。
  58. 前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１とＡＢの間に連結ペプチドを含む、請求項５６に記載の単離ポリペプチド。
  59. 前記単離ポリペプチドが、
    前記ＭＭと前記ＣＭ２の間に連結ペプチド、および
    前記ＣＭ１と前記ＡＢの間に連結ペプチド、
    を含む、請求項５６に記載の単離ポリペプチド。
  60. 前記ＡＢが、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＣＭ１または前記ＣＭ２が、前記ＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項４９～５９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  61. 前記ＡＢが、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＣＭ１または前記ＣＭ２が、前記ＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項４９～５９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  62. 前記単離ポリペプチドが、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、かつ前記単離ポリペプチドが、未切断状態で次のようなＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、またはＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭを有する、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  63. 前記２つの連結ペプチドが、互いに同一ではない、請求項６２に記載の単離ポリペプチド。
  64. ＬＰ１およびＬＰ２の各々が、約１～２０アミノ酸長のペプチドである、請求項６２または６３に記載の単離ポリペプチド。
  65. 前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１とＣＭ２の間に第３の連結ペプチド（ＬＰ’）を含む、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  66. ＬＰ１またはＬＰ２が、ＧＧＳＧ（配列番号２０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２０６）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号２０７）のアミノ酸配列を含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  67. ＬＰ１が、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２０８）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２０９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２１２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１４）、およびＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２１５）を含む、請求項６２～６６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  68. ＬＰ２が、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２１６）、ＧＳＳＧＴ（配列番号２１７）またはＧＳＳＧ（配列番号２１８）を含む、請求項６２～６７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  69. ＬＰ１が、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２０８）またはＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１４）を含みおよびＬＰ２が、アミノ酸配列ＧＧＳまたはＧＧＧＳ（配列番号２１６）を含む、請求項６２～６８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  70. 前記ＡＢが、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＬＰ２が、前記ＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項６２～６９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  71. 前記ＡＢが、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＬＰ２が、前記ＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項４９～５９のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  72. 前記ＭＭのアミノ酸配列が、前記標的の配列と異なりかつ前記ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列に対し１０％以下同一である、請求項４９～７１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  73. 前記ＭＭが、切断状態で前記標的への結合について前記ＡＢに干渉しないまたはそれと競合しない、請求項４９～７２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  74. 薬剤に接合された請求項１９～７３のいずれかに記載の単離ポリペプチドを含む接合型ポリペプチド。
  75. 活性化状態で、標的に特異的に結合する活性化可能抗体であって、
    前記標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、
    前記ＡＢに結合されたマスキング部分（ＭＭ）であって、前記活性化可能抗体が未切断状態にある場合に前記標的への前記ＡＢの結合を抑制する、ＭＭ、および
    請求項１～１９のいずれか１項に記載のタンデム基質を含む切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２）、
    を含む、活性化可能抗体。
  76. 活性化状態で、標的に特異的に結合する活性化可能抗体であって、
    前記標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、
    前記ＡＢに結合されたマスキング部分（ＭＭ）であって、前記活性化可能抗体が未切断状態にある場合に前記標的への前記ＡＢの結合を抑制する、ＭＭ、および
    （ａ）配列番号２５～４３からなる群より選択されるアミノ酸配列、

    （ｂ）配列番号２５、２６、２９、３１、３２、３４、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２７、２８、３０、３３、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｄ）配列番号２５、２９、３１、３６、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｅ）配列番号２６、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （ｆ）配列番号２７、２８、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列、および
    （ｇ）配列番号３０および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンデム基質を含む切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２）
    を含む、活性化可能抗体。
  77. 前記ＭＭが、前記標的への結合についての前記ＡＢの解離定数よりも大きい前記ＡＢへの結合についての解離定数を有する、請求項７５または７６に記載の活性化可能抗体。
  78. 前記ＭＭが、４０アミノ酸長以下のポリペプチドである、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  79. 前記その抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群より選択される、請求項７５～７８のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  80. 前記ＭＭが、未切断状態での前記活性化可能抗体が次のようなＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭを含むように前記ＣＭ１に連結される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  81. 前記活性化可能抗体が、前記ＭＭと前記ＣＭ１の間に連結ペプチドを含む、請求項８０に記載の活性化可能抗体。
  82. 前記活性化可能抗体が、ＣＭ２と前記ＡＢの間に連結ペプチドを含む、請求項８０に記載の活性化可能抗体。
  83. 前記活性化可能抗体が、
    前記ＭＭと前記ＣＭ１の間に連結ペプチド、および
    前記ＣＭ２と前記ＡＢの間に連結ペプチド、
    を含む、請求項８０に記載の活性化可能抗体。
  84. 前記ＭＭが、未切断状態での前記活性化可能抗体が次のようなＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢまたはＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭを含むようにＣＭ２に連結される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  85. 前記単離ポリペプチドが、前記ＭＭと前記ＣＭ２の間に連結ペプチドを含む、請求項８４に記載の活性化可能抗体。
  86. 前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１と前記ＡＢの間に連結ペプチドを含む、請求項８４に記載の活性化可能抗体。
  87. 前記活性化可能抗体が、
    前記ＭＭと前記ＣＭ２の間に連結ペプチド、および
    前記ＣＭ１と前記ＡＢの間に連結ペプチド、
    を含む、請求項８６に記載の活性化可能抗体。
  88. 前記ＡＢが、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＣＭ１または前記ＣＭ２が、前記ＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項７５～８７のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  89. 前記ＡＢが、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＣＭ１または前記ＣＭ２が、前記ＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項７５～８７のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  90. 前記活性化可能抗体が、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、かつ前記活性化可能抗体が、未切断状態でＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、またはＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭを有する、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  91. 前記２種の連結ペプチドが、互いに同一ではない、請求項９０に記載の活性化可能抗体。
  92. 各ＬＰ１およびＬＰ２が、約１～２０アミノ酸長のペプチドである、請求項９０または９１に記載の活性化可能抗体。
  93. 前記活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に第３の連結ペプチド（ＬＰ’）を含む、請求項９０～９２のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  94. ＬＰ１またはＬＰ２が、ＧＧＳＧ（配列番号２０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２０６）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号２０７）のアミノ酸配列を含む、請求項９０～９３のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  95. ＬＰ１が、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２０８）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２０９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２１２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号２１３）、ＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１４）、およびＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２１５）を含む、請求項９０～９４のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  96. ＬＰ２が、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２１６）、ＧＳＳＧＴ（配列番号２１７）またはＧＳＳＧ（配列番号２１８）を含む、請求項９０～９５のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  97. ＬＰ１が、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２０８）またはＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１４）を含みおよびＬＰ２が、アミノ酸配列ＧＧＳまたはＧＧＧＳ（配列番号２１６）を含む、請求項９０～９６のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  98. 前記ＡＢが、抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＬＰ２が、前記ＡＢの軽鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項９０～９７のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  99. 前記ＡＢが、抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントを含み、および
    前記ＬＰ２が、前記ＡＢの重鎖可変領域のＮ末端に連結される、
    請求項９０～９７のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  100. 前記ＭＭのアミノ酸配列が、前記標的の配列と異なりかつ前記ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列に対し１０％以下同一である、請求項７５～９９のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  101. 前記ＭＭが、切断状態での前記標的への結合について前記ＡＢに干渉しないまたはそれと競合しない、請求項７５～１００のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  102. 前記活性化可能抗体が、配列番号４５０～４６２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列、および配列番号４００を含む重鎖アミノ酸配列を含む、請求項７５～１０１のいずれか１項に記載の活性化可能抗体。
  103. 薬剤に接合される請求項７５～１０２のいずれか１項に記載の活性化可能抗体を含む複合化活性化可能抗体。
  104. 前記薬剤が、リンカーを介して前記ＡＢに接合される、請求項１０３に記載の複合化活性化可能抗体。
  105. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項１０４に記載の複合化活性化可能抗体。
  106. 前記リンカーが、切断不能なリンカーである、請求項１０４に記載の複合化活性化可能抗体。
  107. 前記薬剤が、毒素またはそのフラグメントである、請求項１０３～１０６のいずれか１項に記載の複合化活性化可能抗体。
  108. 前記薬剤が、微小管阻害剤である、請求項１０３～１０６のいずれか１項に記載の複合化活性化可能抗体。
  109. 前記薬剤が、核酸損傷剤である、請求項１０３～１０６のいずれか１項に記載の複合化活性化可能抗体。
  110. 前記薬剤が、ドラスタチンまたはその誘導体、オーリスタチンまたはその誘導体、マイタンシノイドまたはその誘導体、デュオカルマイシンまたはその誘導体、およびカリケアマイシンまたはその誘導体からなる群より選択される、請求項１０９に記載の複合化活性化可能抗体。
  111. 前記薬剤が、オーリスタチンＥまたはその誘導体である、請求項１１０に記載の複合化活性化可能抗体。
  112. 前記薬剤が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項１１０に記載の複合化活性化可能抗体。
  113. 前記薬剤が、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である、請求項１１０に記載の複合化活性化可能抗体。
  114. 前記薬剤が、ＤＭ１およびＤＭ４からなる群より選択されるマイタンシノイドである、請求項１１０に記載の複合化活性化可能抗体。
  115. 前記薬剤が、検出可能な部分である、請求項１０３～１０６のいずれか１項に記載の複合化活性化可能抗体。
  116. 前記検出可能な部分が、診断薬である、請求項１１５に記載の複合化活性化可能抗体。
  117. 医薬組成物であって、
    請求項２０～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドまたは請求項７５～１０２のいずれか１項に記載の活性化可能抗体または請求項１０３～１１６のいずれか１項に記載の接合型活性化可能抗体、および
    担体、
    を含む、医薬粗製物。
  118. 追加の薬剤を含む請求項１１７に記載の医薬組成物。
  119. 前記追加の薬剤が、治療薬である、請求項１１８に記載の医薬組成物。
  120. 請求項２０～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドまたは請求項７５～１０２のいずれか１項に記載の活性化可能抗体をコードする単離核酸分子。
  121. 請求項１２０に記載の単離核酸分子を含むベクター。
  122. 請求項２０～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドまたは請求項７５～１０２にいずれか１項に記載の活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で細胞を培養することにより抗体または活性化可能抗体を製造する方法であって、前記細胞が、請求項１２０に記載の核酸分子を含む、方法。
  123. 活性化状態で、標的を結合する活性化可能抗体を製造する方法であって、
    （ａ）請求項７５～１０２のいずれか１項に記載の活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養すること、および
    （ｂ）前記活性化可能抗体を回収すること、
    を含む方法。
  124. 障害または疾患を治療する、その症状を緩和する、またはその進行を遅らせる方法であって、請求項２０～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドまたは請求項７５～１０２のいずれか１項に記載の活性化可能抗体または請求項１０３～１１６のいずれか１項に記載の複合化活性化可能抗体または請求項１１７～１１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量をそれを必要としている対象に投与することを含む、方法。
  125. 前記障害または疾患が、癌である、請求項１２４に記載の方法。
  126. 追加の薬剤を前記対象に投与することを含む、請求項１２４または請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記追加の薬剤が、治療薬である、請求項１２６に記載の方法。
  128. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記第１の切断可能部分ＣＭ１の切断性が、それぞれ少なくとも８０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  129. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記第１の切断可能部分ＣＭ１の切断性が、それぞれ少なくとも８５％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  130. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記第１の切断可能部分ＣＭ１の切断性が、それぞれ少なくとも９０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  131. 前記単離ポリペプチドが、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）、ＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）、またはＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  132. 前記単離ポリペプチドが、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）およびＤＬＡＨＰＬＬ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  133. 前記単離ポリペプチドが、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  134. 前記第１の切断可能部分ＣＭ１のインビボ安定性が、３０％未満の活性化である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  135. 前記第１の切断可能部分ＣＭ１のインビボ安定性が、２５％未満の活性化である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  136. 前記単離ポリペプチドが、ＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号１）またはＲＧＰＫＬＹＷ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む、請求項１３４または請求項１３５に記載の単離ポリペプチド。
  137. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも３０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  138. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも５０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  139. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも７０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  140. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、請求項１３７～１３９のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
  141. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、請求項１３７～１３９のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
  142. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）またはＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含む、請求項１３７～１３９のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
  143. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも１５％でありかつマトリプターゼによる前記タンデム基質の切断性が、少なくとも５０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  144. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳ（配列番号２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号２８）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、またはＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含む、請求項１４３に記載の単離ポリペプチド。
  145. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも１５％でありかつ好中球エラスターゼによる前記タンデム基質の切断性が、少なくとも３０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  146. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも３０％でありかつ好中球エラスターゼによる前記タンデム基質の切断性が、少なくとも３０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  147. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも５０％でありかつ好中球エラスターゼによる前記タンデム基質の切断性が、少なくとも５０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  148. ＭＭＰ９およびＭＭＰ１４による前記タンデム基質の切断性が、それぞれ少なくとも７０％でありかつ好中球エラスターゼによる前記タンデム基質の切断性が、少なくとも７０％である、請求項１～７３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  149. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳ（配列番号２７）、ＨＶＰＲＱＶＬＳＧＲＳＡＮ（配列番号２８）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、請求項１４５～１４８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  150. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＬＡＨＧＬＦＳＧＲＳＡＮ（配列番号２６）、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、請求項１４５～１４８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  151. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＦＡＰＲＳＦ（配列番号３２）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、請求項１４５～１４８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  152. 前記単離ポリペプチドが、ＬＳＧＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２５）またはＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含む、請求項１４５～１４８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  153. 前記インビボ安定性が、４０％未満の活性化である、請求項１３７～１５２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  154. 前記インビボ安定性が、３０％未満の活性化である、請求項１３７～１５２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  155. 前記インビボ安定性が、２５％未満の活性化である、請求項１３７～１５２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  156. 前記インビボ安定性が、２０％未満の活性化である、請求項１３７～１５２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  157. 前記単離ポリペプチドが、ＴＡＲＧＰＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号２９）、ＴＡＲＧＰＶＰＲＱＶ（配列番号３０）、ＡＰＲＳＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３１）、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号３４）、ＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶ（配列番号３５）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、請求項１５３～１５６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  158. 前記単離ポリペプチドが、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号３４）、ＧＬＰＴＦＶＨＬＰＲＱＶ（配列番号３５）、ＡＡＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３６）、またはＧＰＴＮＡＬＡＨＧＬＦ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む、請求項１５３～１５６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  159. 前記単離ポリペプチドが、ＡＬＡＨＧＬＰＴＦＶＨＬ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含む、請求項１５３～１５６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3049111A2 (en) 2013-09-25 2016-08-03 Cytomx Therapeutics Inc. Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
EP4176896A1 (en) 2014-01-31 2023-05-10 Cytomx Therapeutics Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN110702669A (zh) * 2019-09-19 2020-01-17 湖北科益药业股份有限公司 一种快速阿昔洛韦凝胶含量测定的方法
US11365233B2 (en) 2020-04-10 2022-06-21 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
AU2021326469A1 (en) * 2020-08-11 2023-04-06 Janux Therapeutics, Inc. Cleavable linker compositions and methods
US11555078B2 (en) 2020-12-09 2023-01-17 Janux Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to tumor activated antibodies targeting PSMA and effector cell antigens
KR20230157448A (ko) 2021-03-16 2023-11-16 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 마스킹된 활성화 가능한 사이토카인 작제물 및 관련 조성물 및 방법
CA3233663A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Na CAI Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
TW202334185A (zh) 2021-10-08 2023-09-01 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 可經活化之細胞介素構築體和組合方法
KR102648687B1 (ko) 2022-01-25 2024-03-15 (주) 아이오에이 자동판매장치
WO2023183888A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antigen-binding protein constructs and uses of the same
WO2023183923A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable dual-anchored masked molecules and methods of use thereof
WO2023192973A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
WO2023192606A2 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd3-binding proteins and methods of use thereof
EP4260907A1 (en) * 2022-04-11 2023-10-18 Universität Zürich Agents for treatment of endometriosis and other benign gynecological neoplasms
WO2024030845A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030850A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030847A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030858A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030843A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010536370A (ja) * 2007-08-22 2010-12-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用
WO2011151426A2 (en) * 2010-06-02 2011-12-08 Promar As Carotenoid sunscreen
JP2012514982A (ja) * 2009-01-12 2012-07-05 サイトムエックス セラピューティクス，エルエルシー 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
DE3788058T2 (de) 1986-08-28 1994-04-21 Teijin Ltd Zelltoxischer antikörperkomplex und verfahren zu seiner herstellung.
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
EP2427479B1 (en) 2009-05-07 2018-11-21 The Regents of The University of California Antibodies and methods of use thereof
US9487590B2 (en) * 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
EP3049111A2 (en) * 2013-09-25 2016-08-03 Cytomx Therapeutics Inc. Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
EP4176896A1 (en) * 2014-01-31 2023-05-10 Cytomx Therapeutics Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010536370A (ja) * 2007-08-22 2010-12-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用
JP2012514982A (ja) * 2009-01-12 2012-07-05 サイトムエックス セラピューティクス，エルエルシー 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法
WO2011151426A2 (en) * 2010-06-02 2011-12-08 Promar As Carotenoid sunscreen

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