KR20210102318A - 매트릭스 메탈로프로테이스-절단성 기질 및 세린 또는 시스테인 프로테이스-절단성 기질 그리고 이들의 사용 방법 - Google Patents

매트릭스 메탈로프로테이스-절단성 기질 및 세린 또는 시스테인 프로테이스-절단성 기질 그리고 이들의 사용 방법 Download PDF

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KR20210102318A
KR20210102318A KR1020217021064A KR20217021064A KR20210102318A KR 20210102318 A KR20210102318 A KR 20210102318A KR 1020217021064 A KR1020217021064 A KR 1020217021064A KR 20217021064 A KR20217021064 A KR 20217021064A KR 20210102318 A KR20210102318 A KR 20210102318A
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activatable antibody
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올가 바실리예바
마이클 비. 윈터
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싸이톰스 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 적어도 제1 절단성 모이어티(CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP) 또는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)를 포함하는 폴리펩타이드, 활성화 가능한 항체 및 적어도 하나의 MMP 프로테이스에 대한 기질인 적어도 CM1과 적어도 하나의 SP 프로테이스 또는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 CM2를 포함하는 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 다른 더 큰 분자, 및 다양한 치료적, 진단적 및 예방적 적응증에서 적어도 하나의 MMP 프로테이스에 대한 기질인 적어도 CM1과 적어도 하나의 SP 프로테이스 또는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 CM2를 포함하는 이러한 폴리펩타이드를 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

매트릭스 메탈로프로테이스-절단성 기질 및 세린 또는 시스테인 프로테이스-절단성 기질 그리고 이들의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 6일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/776,409호 및 2018년 12월 11일자로 출원된 제62/778,062호의 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(matrix metalloprotease: MMP)에 대한 기질인 적어도 제1 절단성 모이어티(first cleavable moiety: CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(serine protease: SP) 및/또는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스(cysteine protease: CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(second cleavable moiety: CM2)를 포함하는 폴리펩타이드, 적어도 하나의 MMP 프로테이스에 대한 기질인 적어도 CM1 및 적어도 하나의 SP 프로테이스 및/또는 적어도 하나의 CP 프로테이스에 대한 기질인 CM2를 포함하는 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 활성화 가능한 항체 및 기타 더 큰 분자 및 다양한 치료적, 진단적 및 예방적 적응증에서 적어도 하나의 MMP 프로테이스에 대한 기질인 적어도 CM1 및 적어도 하나의 SP 프로테이스 및/또는 적어도 하나의 CP 프로테이스에 대한 기질인 CM2를 포함하는 이러한 폴리펩타이드를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
파일명 "CYTX-058-PCT_ST25"로 EFS-Web을 통해 컴퓨터 판독 가능한 형식(CFR)으로 37 C.F.R. § 1.821에 따라 본 출원과 함께 전자적으로 동시에 제출된 "서열 목록"은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 서열 목록의 전자 사본은 2019년 11월 26일에 생성되었으며, 디스크 크기는 159 킬로바이트이다.
프로테이스는 아미노산 잔기 사이의 펩타이드 결합을 절단하여 단백질을 분해하는 효소이다. 프로테이스는 모든 유기체에서 자연적으로 발생하며, 단순한 분해에서 고도로 조절된 경로에 이르기까지 다양한 생리학적 반응에 관여한다. 일부 프로테이스는 단백질 내 특정 아미노산 서열의 존재에 기초하여 특정 펩타이드 결합을 끊는 것으로 알려져 있다.
따라서, 프로테이스에 대한 새로운 기질을 확인하고, 이러한 기질을 다양한 치료적, 진단적 및 예방적 적응증에 사용할 필요가 있다.
본 발명의 양태에서, 탠덤 기질(tandem substrate)을 포함하는 단리된 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공되되, 탠덤 기질은 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 적어도 제1 절단성 모이어티(CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP) 또는 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)를 포함하고, CM1은 아미노산 서열 AHGL 또는 PRQV를 포함하고, 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM1-CM2 또는 CM2-CM1이다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드의 CM1은 ALAHGLF(서열번호 1), ALAHGL(서열번호 52), LAHGLF(서열번호 50), LAHGL(서열번호 53) 및 AHGLF(서열번호 51)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드의 CM1은 HVPRQV(서열번호 8) 및 VPRQV(서열번호 60)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 연결 펩타이드에 의해 연결된 CM1과 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드의 CM1 및 CM2는 서로 직접 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 CP 효소에 대한 기질을 포함하는 CM2를 포함하되, CP 효소는 레구마인(legumain)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 유로카이네이스(urokinase), 매트립테이스(matriptase) 및 호중구 엘라스테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 SP 효소에 대한 기질을 포함하는 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 유로카이네이스, 매트립테이스 및 호중구 엘라스테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 SP 효소에 대한 기질 및 CP 효소에 대한 기질을 포함하는 CM2를 포함하되, CP 효소는 레구마인이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 MMP2, MMP9 또는 MMP14로 이루어진 군으로부터 선택되는 MMP 효소에 대한 기질을 포함하는 CM1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 SGR, LSGR(서열번호 73), ARG, PRS, TFVH(서열번호 141), AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 152)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 SGR, LSGR(서열번호 73), LSGRS(서열번호 72), LSGRSD(서열번호 71), LSGRSA(서열번호 110), LSGRSDN(서열번호 70), LSGRSAN(서열번호 109), LSGRSDNH(서열번호 20), LSGRSGNH(서열번호 78), LSGRSDNP(서열번호 90), LSGRSDNI(서열번호 84), LSGRSANI(서열번호 108), LSGRSANP(서열번호 114), LSGRSDYH(서열번호 86), LSGRSDTH(서열번호 92), LSGRSDQH(서열번호 96), LSGRSDIH(서열번호 100) 및 LSGRSDDH(서열번호 104)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 ARGP(서열번호 128), TARG(서열번호 125) 및 TARGP(서열번호 124)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 APRS(서열번호 131), APRSF(서열번호 130) 및 PRSF(서열번호 132)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 GLPTFVHL(서열번호 135), GLPTFVH(서열번호 136), GLPTFV(서열번호 137), LPTFVHL(서열번호 138), LPTFVH(서열번호 139) 및 LPTFV(서열번호 140)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 152)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 152)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및 SGR, LSGR(서열번호 73), LSGRS(서열번호 72), LSGRSD(서열번호 71), LSGRSA(서열번호 110), LSGRSDN(서열번호 70), LSGRSAN(서열번호 109), LSGRSDNH(서열번호 20), LSGRSGNH(서열번호 78), LSGRSDNP(서열번호 90), LSGRSDNI(서열번호 84), LSGRSANI(서열번호 108), LSGRSANP(서열번호 114), LSGRSDYH(서열번호 86), LSGRSDTH(서열번호 92), LSGRSDQH(서열번호 96), LSGRSDIH(서열번호 100) 및 LSGRSDDH(서열번호 104)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열이 CM1-CM2이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열이 CM2-CM1이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 80%인 MMP9 및 MMP14에 의한 CM1 제1 절단성 모이어티의 절단성(cleavability)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 85%인 MMP9 및 MMP14에 의한 CM1 제1 절단성 모이어티의 절단성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 90%인 MMP9 및 MMP14에 의한 CM1 제1 절단성 모이어티의 절단성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 활성화가 30% 미만인 CM1 제1 절단성 모이어티의 생체내 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 활성화가 25% 미만인 CM1 제1 절단성 모이어티의 생체내 안정성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 30%인 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 50%인 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 70%인 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 15%인 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성을 가지며, 매트립테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 30%이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 30%인 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성을 가지며, 매트립테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 30%이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 50%인 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성을 가지며, 매트립테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 50%이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 각각 적어도 70%인 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성을 가지며, 매트립테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 70%이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 활성화가 40% 미만인 생체내 안정성을 갖는 탠덤 기질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 활성화가 30% 미만인 생체내 안정성을 갖는 탠덤 기질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 활성화가 25% 미만인 생체내 안정성을 갖는 탠덤 기질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 활성화가 20% 미만인 생체내 안정성을 갖는 탠덤 기질을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 서열번호 25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 서열번호　25, 26, 29, 31, 32, 34, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 서열번호　27, 28, 30, 33 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 서열번호　25, 29, 31, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 서열번호　26, 32 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 서열번호　27, 28 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 서열번호　30 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB); 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 적어도 제1 절단성 모이어티(CM1); 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP) 또는 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)를 포함하는 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되되, CM1은 아미노산 서열 AHGL 또는 PRQV를 포함하고, 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM1-CM2 또는 CM2-CM1이다. 일부 실시형태에서, MMP, CP 및 SP 중 적어도 하나는 표적과 함께 조직에 공동-국재화(co-localized)된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 CM1에 연결된 AB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 CM1에 직접 연결된 AB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 연결 펩타이드를 통해 CM1에 연결된 AB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 CM2에 연결된 AB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 CM2에 직접 연결된 AB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 연결 펩타이드를 통해 CM2에 연결된 AB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, CM1 또는 CM2는 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, CM1 또는 CM2는 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 차폐 모이어티(masking moiety: MM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 표적에 결합하기 위한 AB의 해리 상수보다 큰 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는 MM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 40개의 아미노산 길이 이하의 폴리펩타이드인 MM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 절단되지 않은 상태의 단리된 폴리펩타이드가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 포함하도록 CM1에 연결된 MM을 포함한다: MM-CM1-CM2-AB or AB-CM2-CM1-MM. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 MM과 CM1 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 CM2와 AB 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 MM과 CM1 사이의 연결 펩타이드 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 절단되지 않은 상태의 단리된 폴리펩타이드가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 포함하도록 CM1에 연결된 MM을 포함한다: MM-CM2-CM1-AB 또는 AB-CM1-CM2-MM. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 MM과 CM2 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 CM1과 AB 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 MM과 CM2 사이의 연결 펩타이드 및 CM1과 AB 사이의 연결 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 제1 연결 펩타이드(first linking peptide: LP1) 및 제2 연결 펩타이드(second linking peptide: LP2)를 포함하되, 단리된 폴리펩타이드는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM-LP1-CM2-CM1-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM. 일부 실시형태에서, 2개의 연결 펩타이드는 서로 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드는 CM1과 CM2 사이에 제3 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, LP2는 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, LP2는 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 MM을 포함하되, MM의 아미노산 서열은 표적의 것과 상이하며, AB의 천연 결합 파트너의 아미노산 서열과 10% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 절단된 상태에서 표적에 결합하기 위한 AB를 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는 MM을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드는 서열번호 450 내지 462로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드는 서열번호 450 내지 462로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 400을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB), AB에 결합된 차폐 모이어티(MM)를 포함하는 활성화된 상태에서 표적에 특이적으로 결합하는 활성화 가능한 항체가 본 명세서에서 제공되되, MM은 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태일 때 표적에 대한 AB의 결합을 억제하고; 절단성 모이어티(CM)는 본 명세서에서 제공된 탠덤 기질 중 어느 하나에 따른 탠덤 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 표적에 결합하기 위한 AB의 해리 상수보다 큰 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는 MM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 40개의 아미노산 길이 이하의 폴리펩타이드인 MM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 표적에 결합하기 위한 AB의 해리 상수보다 큰 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는 MM을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 포함하도록 CM1에 연결되는 MM을 포함한다: MM-CM1-CM2-AB 또는 AB-CM2-CM1-MM. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM2와 AB 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1 사이의 연결 펩타이드 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 포함하도록 CM1에 연결된 MM을 포함한다: MM-CM2-CM1-AB 또는 AB-CM1-CM2-MM. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM2 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 AB 사이에 연결 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM2 사이의 연결 펩타이드 및 CM1과 AB 사이의 연결 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, CM1 또는 CM2는 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, CM1 또는 CM2는 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 제1 연결 펩타이드(LP1) 및 제2 연결 펩타이드(LP2)를 포함하되, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM-LP1-CM2-CM1-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM. 일부 실시형태에서, 2개의 연결 펩타이드는 서로 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 제3 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, LP2는 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 AB를 포함하되, LP2는 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 서열번호 450 내지 462로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 서열번호 450 내지 462로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 400을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 표적의 것과 상이하며, AB의 천연 결합 파트너의 아미노산 서열과 10% 이하 동일한 MM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 절단된 상태에서 표적에 결합하기 위한 AB를 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는 MM을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 작용제에 접합된 활성화 가능한 항체를 포함하는 접합된 활성화 가능한 항체가 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 절단성 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 비-절단성 링커를 통해 AB에 접합된다.
일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 독소 또는 이의 단편인 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 미세소관 저해제(microtubule inhibitor)인 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 핵산 손상제(nucleic acid damaging agent)인 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 돌라스타틴 또는 이의 유도체, 아우리스타틴 또는 이의 유도체, 메이탄시노이드(maytansinoid) 또는 이의 유도체, 듀오카마이신(duocarmycin) 또는 이의 유도체, 칼리키아미신(calicheamicin) 또는 이의 유도체, 아우리스타틴 E(auristatin E) 또는 이의 유도체, 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E: MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 D(monomethyl auristatin D: MMAD), 또는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택되는 메이탄시노이드인 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 모이어티 또는 진단제인 작용제를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체 또는 본 개시내용의 접합된 활성화 가능한 항체; 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가적인 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료제인 추가적인 작용제를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 본 개시내용의 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 세포를 배양함으로써 항체 또는 활성화 가능한 항체를 생산하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 본 발명의 다른 양태에서, 활성화된 상태에서 표적에 결합하는 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 방법은 본 개시내용의 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체 또는 본 개시내용의 접합된 활성화 가능한 항체 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물을 장애 또는 질환의 치료, 증상의 완화 또는 진행의 지연을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 장애 또는 질환을 치료, 이의 증상을 완화 또는 진행을 지연시키는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 장애 또는 질환은 암이다. 일부 실시형태에서, 방법은 추가적인 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 추가적인 치료제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 nu/nu 마우스에의 투여 후 생체내에서 절단되는 것으로 관찰된 본 개시내용의 명시된 활성화 가능한 항-EGFR 항체의 백분율의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다. 이러한 예시적인 결과는 테스트된 활성화 가능한 항체 중 몇몇이 다중 효소에 의해 절단될 수 있는 다른 기질보다 더 높은 수준의 안정성을 나타냄을 보여주었다.
도 2a 및 도 2b는 본 개시내용의 명시된 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 EGFR에 대한 시험관내 결합의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다. 이러한 예시적인 결과는 MMP 기질이 활성화 가능한 항체의 프로도메인의 차폐 효율에 영향을 미침을 보여주었다.
도 3a 및 도 3b는 마우스 H292 이종이식 모델을 사용하여 본 개시내용의 명시된 활성화 가능한 항-EGFR 항체의 생체내 효능의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다. 이러한 예시적인 결과는 본 개시내용의 소정의 MMP 기질을 갖는 활성화 가능한 항체가 차폐되지 않은 항-EGFR 세툭시맙에 필적하는 이러한 이종이식 모델에서 효능을 나타냄을 보여주었다.
도 4는 마우스 H292 이종이식 모델에 투여한 후 종양내 조직 내에서 활성화된 본 개시내용의 명시된 활성화 가능한 항-EGFR 항체의 백분율의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 nu/nu 마우스에 투여 후 생체내에서 절단되는 것으로 관찰된 본 개시내용의 단일 MMP 또는 탠덤 기질을 갖는 명시된 활성화 가능한 항-EGFR 항체의 백분율의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다. 이러한 예시적인 결과는 탠덤 기질을 갖는 테스트된 활성화 가능한 항체 중 몇몇이 다중 효소에 의해 절단될 수 있는 다른 기질보다 더 높은 수준의 생체내 안정성을 나타냄을 보여주었다.
도 6은 마우스 H292 이종이식 모델을 사용하여 본 개시내용의 명시된 활성화 가능한 항-EGFR 항체의 생체내 효능의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다. 이러한 예시적인 결과는 본 개시내용의 소정의 MMP 기질을 갖는 활성화 가능한 항체가 차폐되지 않은 항-EGFR 세툭시맙 항체에 필적하는 이러한 이종이식 모델에서 효능을 나타냄을 보여주었다.
도 7은 마우스 H292 이종이식 모델에 투여한 후 종양내 조직 내에서 활성화된 본 개시내용의 명시된 활성화 가능한 항-EGFR 항체의 백분율의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 개시내용의 명시된 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 EGFR에 대한 시험관내 결합으로부터 계산된, 계산된 차폐 효율의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다. 이러한 예시적인 결과는 탠덤 기질이 활성화 가능한 항체의 프로도메인의 차폐 효율에 영향을 미침을 보여주었다.
도 9는 인간 종양 조직과 함께 인큐베이션 후 활성화된 본 개시내용의 명시된 활성화 가능한 항-EGFR 항체의 백분율의 예시적인 결과를 보여주는 그래프이다.
본 개시내용은 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 적어도 제1 절단성 모이어티(CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP) 및/또는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)를 포함하는 아미노산 서열을 제공한다. 이러한 아미노산 서열은 본 명세서에서 집합적으로 "탠덤 기질"로 지칭된다. 이 용어는 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 제1 절단성 모이어티(CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP) 및/또는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)의 배향 또는 다른 구조적 배열에 관한 임의의 요구 사항을 전하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 용어 "탠덤 기질"은 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 CM1-CM2 기질을 포함한다: CM1-CM2 또는 CM2-CM1. 용어 "탠덤 기질"은 또한 CM1 서열의 적어도 일부가 CM2 서열의 적어도 일부와 겹치는 기질을 포함한다.
일부 실시형태에서, CM2는 적어도 2개의 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM2는 제1 세린 프로테이스에 대한 기질 및 제2 세린 프로테이스에 대한 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM2는 세린 프로테이스에 대한 기질 및 시스테인 프로테이스에 대한 기질을 포함한다.
본 명세서에 기재된 CM1-CM2 기질은 다양한 치료적, 진단적 및 예방적 적응증에 유용하다. 예를 들어, 이러한 CM1-CM2 기질은 프로도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB)을 포함하는 활성화 가능한 항체에 유용하다. 프로도메인은 MM의 커플링이 AB의 표적에 결합하는 AB의 능력을 감소시키도록 AB의 적어도 하나의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인에 연결된 적어도 하나의 차폐 모이어티(MM)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 적어도 제1 CM(CM1) 및 제2 CM(CM2)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열의 적어도 일부는 CM2 서열의 적어도 일부와 겹친다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열 및 CM2 기질 서열은 공통으로 적어도 하나의 아미노산 잔기를 공유한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열 및 CM2 기질 서열은 공통으로 적어도 2개의 아미노산 잔기를 공유한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열 및 CM2 기질 서열은 공통으로 적어도 3개의 아미노산 잔기를 공유한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열 및 CM2 기질 서열은 공통으로 3개 이상의 아미노산 잔기를 공유한다.
일부 실시형태에서, CM1 및 CM2는 함께 작동 가능하게 연결된 별개의 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, CM1 및 CM2는 함께 직접 연결된 별개의 폴리펩타이드이며, 즉, 한 기질의 N-말단이 다른 기질 폴리펩타이드의 C-말단에 직접 연결된다. 일부 실시형태에서, CM1의 N-말단은 CM2의 C-말단에 직접 연결된다. 일부 실시형태에서, CM2의 N-말단은 CM1의 C-말단에 직접 연결된다.
일부 실시형태에서, CM1 및 CM2는 적어도 하나의 연결 모이어티를 통해 함께 작동 가능하게 연결된 별개의 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체에서 제1 절단성 모이어티 CM1 및 제2 절단성 모이어티 CM2는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB 또는 AB-CM1-CM2-MM.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM)와 CM1 사이에 연결 펩타이드(LP'')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM2와 AB 사이에 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP'') 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP'') 및 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP''), CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이에 연결 펩타이드(LP'')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM2와 차폐 모이어티(MM) 사이에 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP'') 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP'') 및 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP''), CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP''')를 포함한다.
일부 실시형태에서, LP'는 GG이다. 일부 실시형태에서, LP'는 GGSGGS(서열번호　218)이다.
일부 실시형태에서, CM1은 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질이다. MMP의 예는 MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; 및 MMP27을 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1은 MMP2, MMP9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11 및/또는 MMP19에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 MMP2에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 MMP9에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 MMP14에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 2개 이상의 MMP에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 적어도 MMP9 및 MMP14에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 MMP2 및 MMP9에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 적어도 MMP2 및 MMP14에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 3개 이상의 MMP에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 적어도 MMP2, MMP9 및 MMP14에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM1은 동일한 MMP에 대한 2개 이상의 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 적어도 2개 이상의 MMP2 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 적어도 2개 이상의 MMP9 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 적어도 2개 이상의 MMP14 기질을 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1은 MMP에 대한 기질이며, 적어도 서열 ALAHGLF(서열번호　1); DLAHPLL(서열번호　2); AFRHLR(서열번호　3); PHGFFQ(서열번호　4); SVHHLI(서열번호　5); RGPKLYW(서열번호　6); RFPYGVW(서열번호　7); HVPRQV(서열번호　8); SNPFKY(서열번호　9); RFPLKV(서열번호　10); PFHLSR(서열번호　11); STVFHM(서열번호　12); MGPWFM(서열번호　13); RHLAKL(서열번호　14); PLGVRGK(서열번호　15); 및 QNQALRIA(서열번호　16)를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 ALAHGLF(서열번호　1)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 DLAHPLL(서열번호　2)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 AFRHLR(서열번호　3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 PHGFFQ(서열번호　4)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 SVHHLI(서열번호　5)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 RGPKLYW(서열번호 6)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 RFPYGVW(서열번호　7)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 HVPRQV(서열번호　8)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 SNPFKY(서열번호　9)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 RFPLKV(서열번호　10)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 PFHLSR(서열번호　11)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 STVFHM(서열번호　12)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 MGPWFM(서열번호　13)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 RHLAKL(서열번호　14)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 PLGVRGK(서열번호　15)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 QNQALRIA(서열번호　16)를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 LAHGLF(서열번호 50)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 AHGLF(서열번호 51)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 ALAHGL(서열번호 52)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 LAHGL(서열번호 53)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 AHGL(서열번호 54)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 ALAHG(서열번호　55)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 LAHG(서열번호　56)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 AHG를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 VPRQV(서열번호 60)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 PRQV(서열번호 61)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 HVPRQ(서열번호 62)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 VPRQ(서열번호 63)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1은 아미노산 서열 PRQ를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM2는 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP)에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, SP는 u-형 플라스미노겐 활성화제(uPA, 유로카이네이스로도 칭함), 매트립테이스(본 명세서에서 MT-SP1 또는 MTSP1로도 칭함), 호중구 엘라스테이스(예를 들어, 인간 호중구 엘라스테이스) 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 본 명세서에 기재된 CM2를 절단하는 다른 SP의 예는 비제한적인 예로서, 활성화된 단백질 C; 카텝신 A; 카텝신 G; 카이메이스; 예를 들어, FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa; 엘라스테이스; 그랜자임 B; 구아니다이노벤조아테이스; HtrA1; 락토페린; 마랍신; NS3/4A; PACE4; 플라스민; PSA; tPA; 트롬빈; 트립테이스와 같은 응고 인자 프로테이스; 예를 들어, DESC1, DPP-4, FAP, 헵신, 매트립테이스-2, TMPRSS2, TMPRSS3 및/또는 TMPRSS4와 같은 II형 막관통 세린 프로테이스(Type II Transmembrane Serine Protease: TTSP)를 포함한다.
예를 들어, 적합한 CM2는 적어도 하나의 세린 프로테이스에 의해 절단되며, 다음 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다: LSGRSDNH(서열번호 20), LSGRSDN(서열번호 70), LSGRSD(서열번호 71), LSGRS(서열번호 72), LSGR(서열번호 73), SGRSDN(서열번호 74), SGRSD(서열번호 75), SGRS(서열번호 76), SGR, LSGRSGNH(서열번호 78), LSGRSGN(서열번호 79), LSGRSG(서열번호 80), SGRSGNH(서열번호 81), SGRSGN(서열번호 82), SGRSG(서열번호 83), LSGRSDNI(서열번호 84), SGRSDNI(서열번호 85), LSGRSDYH(서열번호 86), LSGRSDY(서열번호 87), SGRSDYH(서열번호 88), SGRSDY(서열번호 89), LSGRSDNP(서열번호 90), SGRSDNP(서열번호 91), LSGRSDTH(서열번호 92), LSGRSDT(서열번호 93), SGRSDTH(서열번호 94), SGRSDT(서열번호 95), LSGRSDQH(서열번호 96), LSGRSDQ(서열번호 97), SGRSDQH(서열번호 98), SGRSDQ(서열번호 99), LSGRSDIH(서열번호 100), LSGRSDI(서열번호 101), SGRSDIH(서열번호 102), SGRSDI(서열번호 103), LSGRSDDH(서열번호 104), LSGRSDD(서열번호 105), SGRSDDH(서열번호 106), SGRSDD(서열번호 107), LSGRSANI(서열번호 108), LSGRSAN(서열번호 109), LSGRSA(서열번호 110), SGRSANI(서열번호 111), SGRSAN(서열번호 112), SGRSA(서열번호 113), LSGRSANP(서열번호 114) 및 SGRSANP(서열번호 115).
일부 실시형태에서, 적합한 CM2는 적어도 하나의 세린 프로테이스에 의해 절단되며, 다음 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다: TARGPSFK(서열번호 120), ARGPSFK(서열번호 121), TARGPSF(서열번호 122), TARGPS(서열번호 123), TARGP(서열번호 124), TARG(서열번호 125), ARGPSF(서열번호 126), ARGPS(서열번호 127), ARGP(서열번호 128) 및 ARG.
일부 실시형태에서, 적합한 CM2는 적어도 하나의 세린 프로테이스에 의해 절단되며, 다음 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다: APRSF(서열번호 130), APRS(서열번호 131) 및 PRSF(서열번호 132).
일부 실시형태에서, 적합한 CM2는 적어도 하나의 세린 프로테이스에 의해 절단되며, 다음 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다: GLPTFVHL(서열번호 135), GLPTFVH(서열번호 136), GLPTFV(서열번호 137), LPTFVHL(서열번호 138), LPTFVH(서열번호 139) 및 LPTFV(서열번호 140).
일부 실시형태에서, CM2는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, CP는 레구마인이다. 일부 실시형태에서, 적합한 CM2는 적어도 하나의 시스테인 프로테이스에 의해 절단되며, 다음의 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다: AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 152).
일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질은 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), HVPRQVLSGRS(서열번호 27), HVPRQVLSGRSAN(서열번호 28), TARGPALAHGLF(서열번호 29), TARGPVPRQV(서열번호 30), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), HVPRQVAPRSF(서열번호 33), ALAHGLPTFVHL(서열번호 34), GLPTFVHLPRQV(서열번호 35), AANALAHGLF(서열번호 36), GPTNALAHGLF(서열번호 37), ISSGLLSGRSNI(서열번호 38), AVGLLAPPGGLSGRSNI(서열번호 39), ISSGLLSGRSNIGS(서열번호 40), AVGLLAPPGGLSGRSNIGS(서열번호 41), ISSGLLSGRSNIG(서열번호 42) 및 AVGLLAPPGGLSGRSNIG(서열번호 43)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB 또는 AB-CM1-CM2-MM.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 제1 연결 펩타이드(LP1) 및 제2 연결 펩타이드(LP2)를 포함하며, 절단되지 않은 상태의 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM. 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 2개의 연결 펩타이드는 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM)와 CM1 사이에 연결 펩타이드(LP1)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM2와 AB 사이에 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드(LP1), CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이에 연결 펩타이드(LP1)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM2와 차폐 모이어티(MM) 사이에 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP1), CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다.
일부 실시형태에서, LP'는 GG이다. 일부 실시형태에서, LP'는 GGSGGS(서열번호　218)이다.
일부 실시형태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(서열번호　200) 및 (GGGS)n(서열번호　201)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하되, n은 적어도 1의 정수이다.
일부 실시형태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 GGSG(서열번호　202), GGSGG(서열번호　203), GSGSG(서열번호　204), GSGGG(서열번호　205), GGGSG(서열번호　206) 및 GSSSG(서열번호　207)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, LP1은 아미노산 서열 GSSGGSGGSGGSG(서열번호　208), GSSGGSGGSGG(서열번호　209), GSSGGSGGSGGS(서열번호　210), GSSGGSGGSGGSGGGS(서열번호　211), GSSGGSGGSG(서열번호　212) 또는 GSSGGSGGSGS(서열번호　213), GGGSSGGS(서열번호 214) 및 GSSGGSGGSGGSG(서열번호 215)를 포함한다.
일부 실시형태에서, LP2는 아미노산 서열 GSS, GGS, GGGS(서열번호　216), GSSGT(서열번호　217) 또는 GSSG(서열번호　218)를 포함한다. 일부 실시형태에서, LP2는 아미노산 서열 GGS를 포함한다. 일부 실시형태에서, LP2는 아미노산 서열 GGGS(서열번호　216)를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1은 MMP에 대한 기질이며, 적어도 서열 ALAHGLF(서열번호　1); DLAHPLL(서열번호　2); AFRHLR(서열번호　3); PHGFFQ(서열번호　4); SVHHLI(서열번호　5); RGPKLYW(서열번호　6); RFPYGVW(서열번호　7); HVPRQV(서열번호　8); SNPFKY(서열번호　9); RFPLKV(서열번호　10); PFHLSR(서열번호　11); STVFHM(서열번호　12); MGPWFM(서열번호　13); RHLAKL(서열번호　14); PLGVRGK(서열번호　15); 및 QNQALRIA(서열번호　16)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질 및 LP2 링커를 포함하되, CM1-CM2는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), HVPRQVLSGRS(서열번호 27), HVPRQVLSGRSAN(서열번호 28), TARGPALAHGLF(서열번호 29), TARGPVPRQV(서열번호 30), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), HVPRQVAPRSF(서열번호 33), ALAHGLPTFVHL(서열번호 34), GLPTFVHLPRQV(서열번호 35), AANALAHGLF(서열번호 36), GPTNALAHGLF(서열번호 37), ISSGLLSGRSNI(서열번호 38) 및 AVGLLAPPGGLSGRSNI(서열번호 39)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LP2 링커는 GGGS(서열번호 216)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질 및 LP2 링커를 포함하되, CM1-CM2는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), HVPRQVLSGRS(서열번호 27), HVPRQVLSGRSAN(서열번호 28), TARGPALAHGLF(서열번호 29), TARGPVPRQV(서열번호 30), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), HVPRQVAPRSF(서열번호 33), ALAHGLPTFVHL(서열번호 34), GLPTFVHLPRQV(서열번호 35), AANALAHGLF(서열번호 36), GPTNALAHGLF(서열번호 37), ISSGLLSGRSNI(서열번호 38) 및 AVGLLAPPGGLSGRSNI(서열번호 39)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LP2 링커는 GGS를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질 및 LP2 링커를 포함하되, CM1-CM2 및 LP2는 LSGRSALAHGLFGGGS(서열번호 226), ALAHGLFSGRSANGGGS(서열번호 227), HVPRQVLSGRSGGGS(서열번호 228), HVPRQVLSGRSANGGGS(서열번호 229), TARGPALAHGLFGGGS(서열번호 230), TARGPVPRQVGGGS(서열번호 231), APRSALAHGLFGGGS(서열번호 232), ALAHGLFAPRSFGGGS(서열번호 233), HVPRQVAPRSFGGGS(서열번호 234), ALAHGLPTFVHLGGGS(서열번호 235), GLPTFVHLPRQVGGGS(서열번호 236), AANALAHGLFGGGS(서열번호 237), GPTNALAHGLFGGGS(서열번호 238), ISSGLLSGRSNIGGGS(서열번호 239) 및 AVGLLAPPGGLSGRSNIGGGS(서열번호 240)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드 또는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질 및 LP2 링커를 포함하되, CM1-CM2 및 LP2는 LSGRSALAHGLFGGS(서열번호 241), ALAHGLFSGRSANGGS(서열번호 242), HVPRQVLSGRSGGS(서열번호 243), HVPRQVLSGRSANGGS(서열번호 244), TARGPALAHGLFGGS(서열번호 245), TARGPVPRQVGGS(서열번호 246), APRSALAHGLFGGS(서열번호 247), ALAHGLFAPRSFGGS(서열번호 248), HVPRQVAPRSFGGS(서열번호 249), ALAHGLPTFVHLGGS(서열번호 250), GLPTFVHLPRQVGGS(서열번호 251), AANALAHGLFGGS(서열번호 252), GPTNALAHGLFGGS(서열번호 253), ISSGLLSGRSNIGGS(서열번호 254) 및 AVGLLAPPGGLSGRSNIGGS(서열번호 255)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, AB는 표적에 결합하기 위해 약 100nM 이하의 해리 상수를 갖는다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB)을 포함한다. 일부 실시형태에서, AB는 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, AB는 면역학적으로 활성인 단편이다. 일부 실시형태에서, AB는 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, AB는 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 또는 단일 도메인 경쇄 항체이다. 일부 실시형태에서, 이러한 AB는 마우스, 기타 설치류, 키메라, 인간화된 또는 완전 인간 단일클론 항체이다.
일부 실시형태에서, MMP 프로테이스는 조직에 표적과 함께 공동-국재화되고, MMP 프로테이스는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM1을 절단한다. 일부 실시형태에서, SP 프로테이스는 조직에서 표적과 함께 공동-국재화되고, SP 프로테이스는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM2 기질을 절단한다. 일부 실시형태에서, CP 프로테이스는 조직에서 표적과 함께 공동-국재화되고, CP 프로테이스는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM2 기질을 절단한다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스 및/또는 SP 프로테이스는 조직에 표적과 함께 공동-국재화되고, MMP 프로테이스 및/또는 SP 프로테이스는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스 및 SP 프로테이스는 조직에 표적과 함께 공동-국재화되고, MMP 프로테이스 및 SP 프로테이스 중 적어도 하나는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스 및/또는 CP 프로테이스는 조직에 표적과 함께 공동-국재화되고, MMP 프로테이스 및/또는 CP 프로테이스는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스 및 CP 프로테이스는 조직에 표적과 함께 공동-국재화되고, MMP 프로테이스 및 CP 프로테이스 중 적어도 하나는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스 및/또는 CP 프로테이스 및/또는 SP 프로테이스는 조직에 표적과 함께 공동-국재화되고, MMP 프로테이스 및/또는 CP 프로테이스 및/또는 SP 프로테이스는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스 및 CP 프로테이스 및 SP 프로테이스는 조직에 표적과 함께 공동-국재화되고, MMP 프로테이스, SP 프로테이스 및 CP 프로테이스 중 적어도 하나는 항체가 프로테이스에 노출될 때 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다.
일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM1 기질 서열 및 CM2 기질 서열 각각은 독립적으로 최대 15개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP 및/또는 하나의 CP에 대한 기질이며, 동일한 SP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP 및/또는 하나의 CP에 대한 기질이며, 동일한 SP 및/또는 CP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP 및/또는 하나의 CP에 대한 기질이며, 동일한 SP 및/또는 CP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP 및/또는 하나의 CP에 대한 기질이며, 동일한 SP 및/또는 CP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP 및/또는 하나의 CP에 대한 기질이며, 동일한 SP 및/또는 CP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질의 CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP 및/또는 하나의 CP에 대한 기질이며, 동일한 SP 및/또는 CP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CM1-CM2 기질은 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CM1-CM2 기질은 서열번호　25, 26, 29, 31, 32, 34, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CM1-CM2 기질은 서열번호　27, 28, 30, 33 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CM1-CM2 기질은 서열번호　25, 29, 31, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CM1-CM2 기질은 서열번호　26, 32 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CM1-CM2 기질은 서열번호　27, 28 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CM1-CM2 기질은 서열번호　30 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호　25, 26, 29, 31, 32, 34, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호　27, 28, 30, 33 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호　25, 29, 31, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호　26, 32 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호　27, 28 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호　30 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질 및 본 명세서에 개시된 항-EGFR 항체의 아미노산 서열을 포함하는 항-EGFR 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질 및 서열번호　401의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 서열번호　400의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1-CM2는 서열번호　450 내지 462로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호　400의 중쇄 아미노산 서열을 갖는 활성화 가능한 항체에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함하는 CM1 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM1 기질 서열은 적어도 하나의 MMP에 대한 기질이며, 동일한 MMP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 MMP에 대한 기질인 CM1 기질 서열은 ALAHGLF(서열번호 1), DLAHPLL(서열번호 2), RGPKLYW(서열번호 6), RFPYGVW(서열번호 7) 및 QNQALRIA(서열번호 16)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 ALAHGLF(서열번호 1), DLAHPLL(서열번호 2), RGPKLYW(서열번호 6), RFPYGVW(서열번호 7) 및 QNQALRIA(서열번호 16)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 SP에 대한 기질 프로테이스인 CM2 기질을 포함하며, 동일한 SP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP에 대한 기질이며, 동일한 SP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP에 대한 기질이며, 동일한 SP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일하지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP에 대한 기질이며, 동일한 SP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 임의의 동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP에 대한 기질이며, 동일한 SP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 포유동물 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CM2 기질 서열은 적어도 하나의 SP에 대한 기질이며, 동일한 SP 프로테이스에 의해 자연적으로 절단된 임의의 인간 폴리펩타이드 서열과 90% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 SP에 대한 기질인 CM2 기질 서열은 APRSF(서열번호 130) 및 GLPTFVHL(서열번호 135)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 APRSF(서열번호 130) 및 GLPTFVHL(서열번호 135)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM2 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 기질뿐만 아니라 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB) 및 표적에 결합하는 AB의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1-CM2, CM1 또는 CM2 기질은 또한 적어도 하나의 추가적인 프로테이스에 대한 기질이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 프로테이스는 CM1을 절단하는 MMP 프로테이스와 상이한 MMP 프로테이스이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 프로테이스는 MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; 및 MMP27로 이루어진 군으로부터 선택되는 MMP 프로테이스이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 프로테이스는 CM2를 절단하는 SP 프로테이스와 상이한 SP 프로테이스이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 SP 프로테이스는 uPA; 매트립테이스; 활성화된 단백질 C; 카텝신 A; 카텝신 G; 카이메이스; 예를 들어, FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa와 같은 응고 인자 프로테이스; 엘라스테이스; 그랜자임 B; 구아니다이노벤조아테이스; HtrA1; 인간 호중구 엘라스테이스; 락토페린; 마랍신; NS3/4A; PACE4; 플라스민; PSA; tPA; 트롬빈; 트립테이스; 예를 들어, DESC1과 같은 II형 막관통 세린 프로테이스(TTSP), DPP-4, FAP, 헵신, 매트립테이스-2, TMPRSS2, TMPRSS3 및 TMPRSS4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 프로테이스는 표 6에 나타낸 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00001
본 개시내용은 또한 적어도 제1 CM1 및 제2 CM2를 포함하며, 작용제에 접합된 항체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 CM1 및 제2 CM2는 각각 15개의 아미노산 길이 이하의 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 접합된 활성화 가능한 항체이다: MM-CM1-CM2-AB-작용제, 작용제-AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB-작용제 또는 작용제-AB-CM1-CM2-MM. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 접합된 활성화 가능한 항체이다: 작용제-MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM-작용제, 작용제-MM-CM2-CM1-AB 또는 AB-CM1-CM2-MM-작용제. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 접합된 활성화 가능한 항체이다: 작용제-MM-CM1-CM2-AB-작용제, 작용제-AB-CM2-CM1-MM-작용제, 작용제-MM-CM2-CM1-AB-작용제 또는 작용제-AB-CM1-CM2-MM-작용제.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 제1 연결 펩타이드(LP1)와 제2 연결 펩타이드(LP2) 및 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 절단되지 않은 상태의 항체를 포함하는 접합된 활성화 가능한 항체이다: MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-작용제, 작용제-AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB-작용제 또는 작용제-AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM. 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 2개의 연결 펩타이드는 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 제1 연결 펩타이드(LP1)와 제2 연결 펩타이드(LP2) 및 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 절단되지 않은 상태의 항체를 포함하는 접합된 활성화 가능한 항체이다: 작용제-MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM-작용제, 작용제-MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-작용제. 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 2개의 연결 펩타이드 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 제1 연결 펩타이드(LP1)와 제2 연결 펩타이드(LP2) 및 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 절단되지 않은 상태의 항체를 포함하는 접합된 활성화 가능한 항체이다: 작용제-MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-작용제, 작용제-AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM-작용제, 작용제-MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB-작용제 또는 작용제-AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-작용제. 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 2개의 연결 펩타이드 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM)와 CM1 사이에 연결 펩타이드(LP1)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 CM2와 AB 사이에 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드(LP1), CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이에 연결 펩타이드(LP1)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 CM2와 차폐 모이어티(MM) 사이에 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP1) 및 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP')를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 활성화 가능한 항체는 AB와 CM1 사이의 연결 펩타이드(LP1), CM1과 CM2 사이의 연결 펩타이드(LP') 및 CM2와 MM 사이의 연결 펩타이드(LP2)를 포함한다.
일부 실시형태에서, LP'는 GG이다. 일부 실시형태에서, LP'는 GGSGGS(서열번호 218)이다.
일부 실시형태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(서열번호　381) 및 (GGGS)n(서열번호　382)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다.
일부 실시형태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 GGSG(서열번호　202), GGSGG(서열번호　203), GSGSG(서열번호　204), GSGGG(서열번호　205), GGGSG(서열번호　206) 및 GSSSG(서열번호　207)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, LP1은 아미노산 서열 GSSGGSGGSGGSG(서열번호　208), GSSGGSGGSGG(서열번호　209), GSSGGSGGSGGS(서열번호　210), GSSGGSGGSGGSGGGS(서열번호　211), GSSGGSGGSG(서열번호　212) 또는 GSSGGSGGSGS(서열번호　213) 및 GGGSSGGS(서열번호 214)를 포함한다.
일부 실시형태에서, LP2는 아미노산 서열 GSS, GGS, GGGS(서열번호　215), GSSGT(서열번호　216) 또는 GSSG(서열번호　217)를 포함한다.
일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질은 항체에 연결되거나 또는 그렇지 않으면 부착된다. 예를 들어, CM1-CM2는 하나 이상의 작용제를 주어진 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)에 연결하는데 사용되며, CM1-CM2는 MMP 및/또는 SP에 노출될 때 절단되고/되거나 CP 및 작용제는 AB로부터 방출된다. 예시적인 표적은 표 1에 나타낸 표적을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 AB는 표 2에 나타낸 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, AB는 표적에 결합하기 위해 약 100nM 이하의 해리 상수를 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편은 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 또는 단일 도메인 경쇄 항체이다. 일부 실시형태에서, 표적에 결합하는 이러한 항체 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편은 마우스, 기타 설치류, 키메라, 인간화된 또는 완전 인간 단일클론 항체이다.
일부 실시형태에서, MM은 표적에 대한 AB의 해리 상수보다 크지 않은 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는다.
일부 실시형태에서, MM은 절단된 상태에서 표적에 결합하기 위한 AB를 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다.
일부 실시형태에서, MM은 약 2개 내지 40개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드이다. 예를 들어, MM은 최대 약 40개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, MM 폴리펩타이드 서열은 임의의 AB의 천연 결합 파트너의 것과 상이하다. 일부 실시형태에서, MM 폴리펩타이드 서열은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 50% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM 폴리펩타이드 서열은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 40%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 이하 동일하다.
일부 실시형태에서, AB 또는 활성화 가능한 항체의 AB에 접합된 작용제는 치료제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 항신생물제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 독소 또는 이의 단편이다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 독소의 단편은 독성 활성을 유지하는 단편이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 절단성 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 적어도 하나의 CM1-CM2 기질 서열을 포함하는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 비절단성 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 미세소관 저해제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 핵산 손상제, 예컨대, DNA 알킬화제 또는 DNA 삽입제 또는 기타 DNA 손상제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 표 3에 열거된 군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 듀오카마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀 이량체이다.
일부 실시형태에서, 작용제는 항염증제이다.
일부 실시형태에서, 항체 및/또는 활성화 가능한 항체는 또한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 모이어티는 진단제이다.
일부 실시형태에서, 접합된 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 이미징제, 조영제, 효소, 형광 표지, 발색단, 염료, 하나 이상의 금속 이온 또는 리간드-기반 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이미징제는 방사성 동위원소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방사성 동위원소는 인듐 또는 테크네튬이다. 일부 실시형태에서, 조영제는 아이오다인, 가돌리늄 또는 산화철을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소는 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리 포스파테이스 또는 β-갈락토시데이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형광 표지는 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein: YFP), 청록색 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein: mRFP), 적색 형광 단백질 tdimer2(red fluorescent protein tdimer2: RFP tdimer2), HCRED 또는 유로퓸 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발광 표지는 N-메틸아크리듐 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표지는 Alexa Fluor® 표지, 예컨대 Alex Fluor® 680 또는 Alexa Fluor® 750을 포함한다. 일부 실시형태에서, 리간드-기반 표지는 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 하나 이상의 합텐을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 항체 및/또는 AB는 자연적으로 하나 이상의 이황화물 결합을 함유한다. 일부 실시형태에서, AB는 하나 이상의 이황화물 결합을 포함하도록 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 및/또는 접합된 항체는 단일 특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 접합된 항체는 다중 특이적이며, 본 명세서에서 다중 특이적 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 항체로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 항체는 이중 특이적 또는 3작용성이다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 접합된 항체는 전구-이중 특이적 T 세포 관여항체(pro-Bispecific T cell Engager: pro-BITE) 분자의 일부로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 항체 및/또는 접합된 항체는 전구-키메라 항원 수용체(pro-Chimeric Antigen Receptor: pro-CAR) 변형된 T 세포 또는 기타 조작된 수용체 또는 기타 면역 효과기 세포, 예컨대 CAR 변형된 NK 세포의 일부로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 전구-키메라 항원 수용체(CAR) 변형된 T 세포의 일부로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 전구-키메라 항원 수용체(CAR) 변형된 NK 세포의 일부로서 제형화된다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 단일 특이적이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 다중 특이적이며, 본 명세서에서 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체로 지칭된다. "활성화 가능한 항체"와 같은 본 명세서에서 사용된 용어 및 이의 모든 문법적 변형은, 달리 언급되지 않는 한, 활성화 가능한 항체가 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체인 실시형태를 포함하는 것으로 의도되지만, 이로 제한되지 않는다. "접합된 활성화 가능한 항체"와 같은 본 명세서에서 사용된 용어 및 이의 모든 문법적 변형은, 달리 언급되지 않는 한, 접합된 활성화 가능한 항체가 본 개시내용의 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체인 실시형태를 포함하는 것으로 의도되지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 이중 특이적 또는 3작용성이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 전구-이중 특이적 T 세포 관여항체(pro-BITE) 분자의 일부로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 전구-키메라 항원 수용체(pro-CAR) 변형된 T 세포 또는 기타 조작된 수용체의 일부로서 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체, 항체 접합체, 활성화 가능한 항체, 접합된 활성화 가능한 항체, 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 추가적인 작용제 또는 추가적인 작용제의 조합과 함께 사용된다. 적합한 추가적인 작용제는 현재의 약제 및/또는 예를 들어, 암과 같은 의도된 적용을 위한 외과적 요법을 포함한다. 예를 들어, 활성화 가능한 항체, 접합된 활성화 가능한 항체, 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 추가적인 화학치료제 또는 항-신생물제와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 다중 특이적 활성화 가능한 항체이다. 본 명세서에서 제공된 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하고, 차폐 모이어티(MM)의 커플링이 표적에 결합하는 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키는 다중 특이적 항체의 적어도 하나의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인에 연결된 적어도 하나의 MM을 포함하는 다중 특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, MM은 적어도 하나의 MMP 프로테이스 및 적어도 하나의 SP 프로테이스에 대한 기질로서 기능하는 CM1-CM2 기질을 통해 다중 특이적 항체의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인에 결합된다. 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 다중 특이적 항체는 순환계에서 안정하고, 요법 및/또는 진단의 의도된 부위에서 활성화되지만 정상, 즉, 건강한 조직에서는 활성화되지 않으며, 활성화될 때 상응하는 비변형된 다중 특이적 항체와 적어도 유사한 표적에 대한 결합을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 상피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR)에 특이적으로 결합하며 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열 및 VH CDR3 서열의 조합을 함유하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하되, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열 및 VH CDR3 서열 중 적어도 하나는 적어도 아미노산 서열 NYGVH(서열번호　220)를 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호　221)를 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호　222)를 포함하는 VH CDR3 서열; 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하며 VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하되, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열 중 적어도 하나는 적어도 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호 223)를 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호 224)를 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호 225)를 포함하는 VL CDR3 서열 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하며 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열 및 VH CDR3 서열의 조합을 함유하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하되, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열 및 VH CDR3 서열 중 적어도 하나는 아미노산 서열 NYGVH(서열번호　220)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호　221)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호　222)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하며 VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하되, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열 중 적어도 하나는 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호　223)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호　224)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호　225)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하며 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하되, VH CDR1 서열은 적어도 아미노산 서열 NYGVH(서열번호　220)를 포함하고; VH CDR2 서열은 적어도 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호　221)를 포함하며; VH CDR3 서열은 적어도 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호　222)를 포함하고; VL CDR1 서열은 적어도 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호　223)를 포함하며; VL CDR2 서열은 적어도 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호　224)를 포함하고; 그리고 VL CDR3 서열은 적어도 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호　225)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하며 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하되, VH CDR1 서열은 아미노산 서열 NYGVH(서열번호　220)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VH CDR2 서열은 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호　221)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하며; VH CDR3 서열은 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호　222)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VL CDR1 서열은 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호　223)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하며; VL CDR2 서열은 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호　224)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; 그리고 VL CDR3 서열은 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호　225)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질 및 본 명세서에 개시된 항-재그드(anti-Jagged) 항체의 아미노산 서열을 포함하는 항-재그드 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CM1-CM2 기질 및 서열번호　401의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 서열번호　400의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 서열번호　400의 적어도 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호　403 내지 423 및 450 내지 462로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 또한 AB에 접합된 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 치료제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 항신생물제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 독소 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 미세소관 저해제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DNA 알킬화제 또는 DNA 삽입제 또는 기타 DNA 손상제와 같은 핵산 손상제이다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 적어도 하나의 CM1-CM2 기질 서열을 포함하는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 표 3에 열거된 군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 듀오카마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀 이량체이다.
일부 실시형태에서, 작용제는 항염증제이다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 또한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 모이어티는 진단제이다.
일부 실시형태에서, 접합된 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 이미징제, 조영제, 효소, 형광 표지, 발색단, 염료, 하나 이상의 금속 이온 또는 리간드-기반 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이미징제는 방사성 동위원소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방사성 동위원소는 인듐 또는 테크네튬이다. 일부 실시형태에서, 조영제는 아이오다인, 가돌리늄 또는 산화철을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소는 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리 포스파테이스 또는 β-갈락토시데이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형광 표지는 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP), 적색 형광 단백질 tdimer2(RFP tdimer2), HCRED 또는 유로퓸 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발광 표지는 N-메틸아크리듐 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표지는 Alexa Fluor® 표지, 예컨대 Alex Fluor® 680 또는 Alexa Fluor® 750을 포함한다. 일부 실시형태에서, 리간드-기반 표지는 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 하나 이상의 합텐을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 또한 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 스페이서를 통해 활성화 가능한 항체에 접합된다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 신호 펩타이드의 부재하에 활성화 가능한 항체에 접합된다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 활성화 가능한 항체의 MM에 직접 결합된다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 스페이서-MM-CM1-CM2 기질-AB의 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열에서 활성화 가능한 항체의 MM에 직접 결합된다. 활성화 가능한 항체의 MM의 N-말단에 직접 결합된 스페이서의 예는 QGQSGQ(서열번호　153), GQSGQ(서열번호　154), QSGQ(서열번호　155), SGQ, GQ 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 QGQSGQ(서열번호　153)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 GQSGQ(서열번호　154)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 QSGQ(서열번호　155)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 SGQ를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 GQ를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 Q를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 AB는 자연적으로 하나 이상의 이황화물 결합을 함유한다. 일부 실시형태에서, AB는 하나 이상의 이황화물 결합을 포함하도록 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 항체의 것보다 길고; 예를 들어, 활성화 가능한 항체의 pK는 상응하는 항체의 것보다 길다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 항체의 것과 유사하다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 15일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 12일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 11일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 10일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 9일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 8일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 7일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 6일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 5일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 4일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 3일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 2일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 24시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 20시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 18시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 16시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 14시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 12시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 10시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 8시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 6시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 4시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 3시간이다.
본 개시내용은 또한 주어진 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하는 활성화 가능한 항체를 포함하는 조성물 및 방법을 제공하되, AB는 표적에 결합하는 AB의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM)에 결합된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 적어도 하나의 MMP 및 적어도 하나의 SP에 대한 기질인 CM1-CM2 기질을 더 포함한다. 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법은 활성화 가능한 항체의 활성(예를 들어, 차폐, 활성화 또는 결합 활성)을 손상시키지 않으면서 AB의 하나 이상의 시스테인 잔기에 하나 이상의 작용제의 부착을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법은 MM 내에서 하나 이상의 이황화물 결합을 환원시키거나 또는 그렇지 않으면 방해하지 않으면서 AB의 하나 이상의 시스테인 잔기에 하나 이상의 작용제의 부착을 가능하게 한다. 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법은 예를 들어, 일부 실시형태에서, 임의의 작용제(들)가 활성화 가능한 항체의 MM에 접합되지 않으면서 하나 이상의 작용제, 예를 들어, 임의의 다양한 치료제, 진단제 및/또는 예방제에 접합된 활성화 가능한 항체를 생산한다. 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법은 MM이 절단되지 않은 상태에서 활성화 가능한 항체의 AB를 효과적이고 효율적으로 차폐하는 능력을 유지하는 접합된 활성화 가능한 항체를 생산한다. 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법은 활성화 가능한 항체가 CM1-CM2 기질을 절단할 수 있는 MMP의 존재하에 여전히 활성화된, 즉, 절단되는 접합된 활성화 가능한 항체를 생산한다.
활성화 가능한 항체는 작용제에 대한 적어도 하나의 접합 지점을 갖지만, 본 명세서에서 제공된 방법 및 조성물에서 작용제에 접합하기 위해 이용 가능한 모든 가능한 접합 지점보다 적다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 접합 지점은 이황화물 결합에 관여하는 황 원자이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 접합 지점은 사슬간 이황화물 결합에 관여하는 황 원자이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 접합 지점은 사슬간 황화물 결합에 관여하는 황 원자이지만, 사슬내 이황화물 결합에 관여하는 황 원자는 아니다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 접합 지점은 시스테인 또는 황 원자를 함유하는 다른 아미노산 잔기의 황 원자이다. 이러한 잔기는 항체 구조에서 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 부위-지정 돌연변이유발, 화학적 전환 또는 비-천연 아미노산의 잘못된 혼입에 의해 항체에 혼입될 수 있다.
또한, AB 내에 하나 이상의 사슬간 이황화물 결합과 MM 내에 하나 이상의 사슬내 이황화물 결합을 갖는 활성화 가능한 항체의 접합체를 제조하는 방법이 제공되며, 유리 티올과 반응성인 약물이 제공된다. 방법은 일반적으로 예를 들어, TCEP와 같은 환원제를 사용하여 활성화 가능한 항체에서 사슬간 이황화물 결합을 부분적으로 환원시키는 단계; 및 유리 티올과 반응성인 약물을 부분적으로 환원된 활성화 가능한 항체와 접합시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 부분적 환원은 활성화 가능한 항체가 환원제와 접촉되고, 모든 이황화물 결합보다 적게, 예를 들어, 가능한 모든 접합 부위보다 적게 환원되는 상황을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 가능한 모든 접합 부위의 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 미만 또는 5% 미만이 환원된다.
일부 실시형태에서, 작용제, 예를 들어, 약물을 활성화 가능한 항체에 대해 환원시키고 접합시켜 작용제의 배치에 선택성을 초래하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 활성화 가능한 항체의 차폐 모이어티 또는 기타 비-AB의 일부에서 임의의 접합 부위가 환원되지 않도록 환원제를 사용하여 활성화 가능한 항체를 부분적으로 환원시키는 단계 및 AB에서 작용제를 사슬간 티올에 접합시키는 단계를 포함한다. 접합 부위(들)는 목적하는 부위에서 접합이 일어나게 작용제의 목적하는 배치를 허용하도록 선택된다. 환원제는 예를 들어, TCEP이다. 예를 들어, 환원제 대 활성화 가능한 항체의 비, 인큐베이션의 기간, 인큐베이션 동안의 온도, 환원 반응 용액의 pH 등과 같은 환원 반응 조건은 MM이 절단되지 않은 상태에서 활성화 가능한 항체의 AB를 효과적이고 효율적으로 차폐하는 능력을 유지하는 접합된 활성화 가능한 항체를 생산하는 조건을 확인함으로써 결정된다. 환원제 대 활성화 가능한 항체의 비는 활성화 가능한 항체에 따라 달라질 것이다. 일부 실시형태에서, 환원제 대 활성화 가능한 항체의 비는 약 20:1 내지 1:1, 약 10:1 내지 1:1, 약 9:1 내지 1:1, 약 8:1 내지 1:1, 약 7:1 내지 1:1, 약 6:1 내지 1:1, 약 5:1 내지 1:1, 약 4:1 내지 1:1, 약 3:1 내지 1:1, 약 2:1 내지 1:1, 약 20:1 내지 1:1.5, 약 10:1 내지 1:1.5, 약 9:1 내지 1:1.5, 약 8:1 내지 1:1.5, 약 7:1 내지 1:1.5, 약 6:1 내지 1:1.5, 약 5:1 내지 1:1.5, 약 4:1 내지 1:1.5, 약 3:1 내지 1:1.5, 약 2:1 내지 1:1.5, 약 1.5:1 내지 1:1.5 또는 약 1:1 내지 1:1.5의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비는 약 5:1 내지 1:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 5:1 내지 1.5:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 4:1 내지 1:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 4:1 내지 1.5:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 8:1 내지 약 1:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 2.5:1 내지 1:1의 범위이다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 AB에서 사슬간 이황화물 결합을 환원시키고, 작용제, 예를 들어, 약물과 같은 티올-함유 작용제를 생성된 사슬간 티올에 접합시켜 AB에 작용제(들)를 선택적으로 위치시키는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 환원제를 사용하여 AB를 부분적으로 환원시켜 활성화 가능한 항체에서 모든 가능한 사슬간 티올을 형성하지 않고 적어도 2개의 사슬간 티올을 형성하는 단계; 및 작용제를 부분적으로 환원된 AB의 사슬간 티올에 접합시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 활성화 가능한 항체의 AB는 목적하는 환원제:활성화 가능한 항체의 비로 약 37℃에서 약 1시간 동안 부분적으로 환원된다. 일부 실시형태에서, 환원제 대 활성화 가능한 항체의 비는 약 20:1 내지 1:1, 약 10:1 내지 1:1, 약 9:1 내지 1:1, 약 8:1 내지 1:1, 약 7:1 내지 1:1, 약 6:1 내지 1:1, 약 5:1 내지 1:1, 약 4:1 내지 1:1, 약 3:1 내지 1:1, 약 2:1 내지 1:1, 약 20:1 내지 1:1.5, 약 10:1 내지 1:1.5, 약 9:1 내지 1:1.5, 약 8:1 내지 1:1.5, 약 7:1 내지 1:1.5, 약 6:1 내지 1:1.5, 약 5:1 내지 1:1.5, 약 4:1 내지 1:1.5, 약 3:1 내지 1:1.5, 약 2:1 내지 1:1.5, 약 1.5:1 내지 1:1.5 또는 약 1:1 내지 1:1.5의 범위일 것이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 5:1 내지 1:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 5:1 내지 1.5:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 4:1 내지 1:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 4:1 내지 1.5:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 8:1 내지 약 1:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 비는 약 2.5:1 내지 1:1의 범위이다.
티올-함유 시약은 예를 들어, 시스테인 또는 N-아세틸 시스테인일 수 있다. 환원제는 예를 들어, TCEP일 수 있다. 일부 실시형태에서, 환원된 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 투석 또는 투석여과를 사용하여 접합 전에 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환원된 항체는 부분적 환원 후 및 접합 전에 정제되지 않는다.
본 개시내용은 또한 활성화 가능한 항체에서 적어도 하나의 사슬간 이황화물 결합이 활성화 가능한 항체에서 임의의 사슬내 이황화물 결합을 방해하지 않으면서 환원제로 환원된 부분적으로 환원된 활성화 가능한 항체를 제공하되, 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB), 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체의 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 차폐 모이어티(MM) 및 AB에 결합된 CM1-CM2 기질을 포함하고, CM1-CM2 기질은 적어도 하나의 MMP 및 하나의 SP에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, MM은 CM1-CM2 기질을 통해 AB에 결합된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 사슬내 이황화물 결합(들)은 환원제에 의해 방해받지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 내에서 MM의 하나 이상의 사슬내 이황화물 결합(들)은 환원제에 의해 방해받지 않는다. 일부 실시형태에서, 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM. 일부 실시형태에서, 환원제는 TCEP이다.
본 개시내용은 또한 활성화 가능한 항체에서 적어도 하나의 사슬간 이황화물 결합이 활성화 가능한 항체의 활성 및/또는 효능을 방해하거나 또는 그렇지 않으면 손상시키지 않으면서 환원제를 사용하여 환원된 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 부분적으로 환원된 활성화 가능한 항체를 제공하되, 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB), 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체의 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 차폐 모이어티(MM) 및 AB에 결합된 CM1-CM2 기질을 포함하고, CM1-CM2 기질은 프로테이스에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩타이드이다. 활성화 가능한 항체의 활성 및/또는 효능은, 비제한적인 예로서, 차폐 활성, 활성화 가능한 항체의 활성화 및/또는 활성화된 활성화 가능한 항체의 결합 활성이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 사슬내 이황화물 결합(들)은 환원제에 의해 방해받지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 내 MM의 하나 이상의 사슬내 이황화물 결합(들)은 환원제에 의해 방해받지 않는다. 일부 실시형태에서, 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM. 일부 실시형태에서, 환원제는 TCEP이다.
본 개시내용은 또한 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD) 페이로드(payload)에 연결된 활성화 가능한 항체를 포함하는 접합된 활성화 가능한 항체를 제공하되, 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB), 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체의 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 차폐 모이어티(MM) 및 AB에 결합된 CM1-CM2 기질을 포함하고, CM1-CM2 기질은 적어도 하나의 MMP 프로테이스 및 적어도 하나의 SP 프로테이스에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, MMAD-접합된 활성화 가능한 항체는 작용제를 AB에 부착시키기 위한 다음의 임의의 여러 방법을 사용하여 접합될 수 있다: (a) AB의 탄수화물 모이어티에 부착, 또는 (b) AB의 설피드릴기에 부착, 또는 (c) AB의 아미노기에 부착, 또는 (d) AB의 카복실레이트기에 부착.
일부 실시형태에서, MMAD 페이로드는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, MMAD 페이로드는 링커를 통해 AB에서 시스테인에 접합된다. 일부 실시형태에서, MMAD 페이로드는 링커를 통해 AB에서 라이신에 접합된다. 일부 실시형태에서, MMAD 페이로드는 링커를 통해 AB의 다른 잔기, 예컨대 본 명세서에 개시된 것과 같은 잔기에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 티올-함유 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 비-절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 표 5 및 표 6에 나타낸 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및 MMAD 페이로드는 말레이미드 카프로일-발린-시트룰린 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및 MMAD 페이로드는 말레이미드 PEG-발린-시트룰린 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및 MMAD 페이로드는 말레이미드 카프로일-발린-시트룰린-파라-아미노벤질옥시카보닐 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및 MMAD 페이로드는 말레이미드 PEG-발린-시트룰린-파라-아미노벤질옥시카보닐 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, MMAD 페이로드는 본 명세서에 개시된 부분적 환원 및 접합 기술을 사용하여 AB에 접합된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 제시된 CM1-CM2 기질 서열 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드 및 다른 더 큰 분자를 제공한다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 제시된 CM1-CM2 기질 서열은 프로드러그 조성물 및 이의 사용 방법에 유용하다. 이러한 본 명세서에 제시된 CM1-CM2 기질 서열은 또한 프로브 및 기타 검출제 및 이의 사용 방법에 유용하다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 CM1-CM2 기질 서열은 이미징제와 같은 검출제를 생성하기 위한 플루오르 및 다른 소광제(quencher) 및/또는 다른 진단제와 함께 사용될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 제시된 CM1-CM2 기질 서열이 임의의 조성물 및/또는 적어도 하나의 MMP 및 적어도 하나의 SP에 의해 절단될 수 있는 기질을 사용하는 당업계의 방법에 유용하다는 것을 이해할 것이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 항체 및/또는 활성화 가능한 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라 이러한 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 항체 및/또는 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 세포를 배양함으로써 항체 및/또는 활성화 가능한 항체를 생산하는 방법을 제공하되, 세포는 이러한 벡터를 포함한다.
본 개시내용은 (a) 항체의 발현을 유도하는 조건하에 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, (i) 항체는 CM1-CM2 기질을 포함하고, (ii) CM1-CM2 기질은 매트릭스 메탈로프로테이스 및 세린 프로테이스에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩타이드인, 세포를 배양하는 단계; (b) 항체를 회수하는 단계; 및 (c) 회수된 항체를 하나 이상의 추가적인 작용제에 접합시키는 단계에 의해 주어진 표적에 결합하는 본 개시내용의 접합된 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 (a) 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), CM1-CM2 기질 및 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하되, (i) CM1-CM2 기질은 MMP 및 SP에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩타이드이고; (ii) CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 MM이 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 MM이 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않도록 활성화 가능한 항체에 위치하는, 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계에 의해 주어진 표적에 활성화된 상태로 결합하는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 (a) 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), CM1-CM2 기질 및 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하되, (i) CM1-CM2 기질은 MMP 및 SP 및/또는 CP에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩타이드이고; (ii) CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 MM이 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 MM이 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않도록 활성화 가능한 항체에 위치하는, 세포를 배양하는 단계; (b) 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계; 및 (c) 회수된 항체를 하나 이상의 추가적인 작용제에 접합시키는 단계에 의해 주어진 표적에 활성화된 상태로 결합하는 본 개시내용의 접합된 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 표적-관련 질환의 예방, 진행의 지연, 증상의 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선을 필요로 하는 대상체에 투여함으로써, 대상체에서 표적-관련 질환을 예방, 이의 진행을 지연, 이의 증상을 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 염증 및/또는 염증성 장애의 예방, 진행의 지연, 증상의 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선을 필요로 하는 대상체에 투여함으로써, 대상체에서 염증 및/또는 염증성 장애를 예방, 이의 진행을 지연, 이의 증상을 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 암의 예방, 진행의 지연, 증상의 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선을 필요로 하는 대상체에 투여함으로써, 대상체에서 암을 예방, 이의 진행을 지연, 이의 증상을 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 자가면역 질환의 예방, 진행의 지연, 증상의 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선을 필요로 하는 대상체에 투여함으로써, 대상체에서 자가면역 질환을 예방, 이의 진행을 지연, 이의 증상을 치료, 완화 또는 그렇지 않으면 개선하는 방법을 제공한다.
이러한 방법 및 용도의 임의의 실시형태에서 사용된 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 질환의 임의의 단계에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 초기부터 전이성까지 임의의 단계의 암을 앓고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 용어 대상체 및 환자는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 반려 동물(예를 들어, 고양이, 개, 말), 경작용 동물(farm animal), 작업용 동물(work animal) 또는 동물원 동물과 같은 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 반려 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 수의사의 보살핌을 받는 동물이다.
접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 이들의 치료적 제형은 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 이에 취약한 대상체에 투여된다. 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 이에 취약한 대상체는 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법을 사용하여 확인된다. 예를 들어, 암 또는 다른 신생물성(neoplastic) 병태를 앓고 있는 대상체는 건강 상태를 평가하기 위해 신체 검사 및 혈액, 소변 및/또는 대변 분석과 같은 임의의 다양한 임상 및/또는 실험실 테스트를 사용하여 확인된다. 예를 들어, 염증 및/또는 염증성 장애를 앓고 있는 대상체는 건강 상태를 평가하기 위해 신체 검사 및/또는 체액 분석, 예를 들어, 혈액, 소변 및/또는 대변 분석과 같은 임의의 다양한 임상 및/또는 실험실 테스트를 사용하여 확인된다.
접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 투여하는 것은 임의의 다양한 실험실 또는 임상 목표가 달성되면 성공적인 것으로 간주된다. 예를 들어, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 투여하는 것은 질환 또는 장애와 관련된 증상 중 하나 이상이 완화, 감소, 저해되거나 또는 더 이상, 즉, 더 나쁜 상태로 진행되지 않는 경우 성공적인 것으로 간주된다. 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자에 투여하는 것은 질환 또는 장애가 관해에 들어가거나 또는 더 이상, 즉, 더 나쁜 상태로 진행되지 않는 경우 성공적인 것으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 추가적인 작용제 또는 추가적인 작용제의 조합과 함께 사용된다. 적합한 추가적인 작용제는 예를 들어, 암과 같은 의도된 적용을 위한 현재의 약제학적 요법 및/또는 외과적 요법을 포함한다. 예를 들어, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 추가적인 화학치료제 또는 항-신생물제와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 추가적인 작용제(들)는 도세탁셀, 파클리탁셀, 아브락산(즉, 알부민-접합된 파클리탁셀), 독소루비신, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 시스플라틴, 이리노테칸 및 젬시타빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학치료제와 같은 화학치료제이다.
일부 실시형태에서, 추가적인 작용제(들)는 관문 저해제, 카이네이스 저해제, 종양 미세환경에서 저해제를 표적화하는 작용제 및/또는 T 세포 또는 NK 효능제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제(들)는 방사선 요법 단독이거나, 또는 화학치료제 또는 항-신생물제와 같은 다른 추가적인 작용제(들)와의 조합이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제(들)는 백신, 종양바이러스 및/또는 비제한적인 예로서, 톨-유사 수용체(toll-like receptor: TLR) 효능제 및/또는 α-CD40과 같은 DC-활성화제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제(들)는 ADCC를 통해 또는 독소(예를 들어, 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate: ADC))에 대한 직접 접합을 통해 종양을 죽이도록 설계된 종양-표적화된 항체이다.
일부 실시형태에서, 관문 저해제 CTLA-4, LAG-3, PD-1, PD-1, TIGIT, TIM-3, B7H4, BTLA 및 Vista로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 카이네이스 저해제는 이브루티닙과 같은 B-RAFi, MEKi 및 Btk 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 카이네이스 저해제는 크리조티닙이다. 일부 실시형태에서, 종양 미세환경 저해제는 IDO 저해제, α-CSF1R 저해제, α-CCR4 저해제, TGF-베타, 골수-유래 억제 세포 또는 T-조절 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 효능제는 Ox40, GITR, CD137, ICOS, CD27 및 HVEM으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 저해제는 CTLA-4 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 LAG-3 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 PD-1 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 PD-1 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 TIGIT 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 TIM-3 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 B7H4 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 Vista 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 B-RAFi 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 MEKi 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 Btk 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 이브루티닙이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 크리조티닙이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 IDO 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 α-CSF1R 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 α-CCR4 저해제이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 TGF-베타이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 골수-유래 억제 세포이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 T-조절 세포이다.
일부 실시형태에서, 효능제는 Ox40이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 GITR이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 CD137이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 ICOS이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 CD27이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 HVEM이다.
일부 실시형태에서, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 화학치료제, 항염증제 및/또는 면역억제제와 같은 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 치료 중 및/또는 이후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 단일 치료적 조성물로 제형화되고, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 동시에 투여된다. 대안적으로, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 서로 분리되어 있으며, 예를 들어, 각각은 별개의 치료적 조성물로 제형화되고, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 동시에 투여되거나 또는 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 치료 양생법 동안 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 추가적인 작용제, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체의 투여 전에 투여되고/되거나 접합된 활성화 가능한 항체는 추가적인 작용제의 투여 후에 투여되거나 또는 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 교대로 투여된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제(들)는 동시에 투여된다. 예를 들어, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제(들)는 단일 조성물로 제형화되거나 또는 2개 이상의 별개의 조성물로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제(들)는 순차적으로 투여되거나 또는 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제는 치료 양생법 동안 상이한 시간에 투여된다.
일부 실시형태에서, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 비제한적인 예로서, 항염증제, 면역억제제, 화학치료제, 예컨대 알킬화제, 항-대사제, 항-미소관제, 토포아이소머레이스 저해제, 세포독성 항생제 및/또는 임의의 다른 핵산 손상제와 같은 하나 이상의 추가적인 작용제와 조합하여 치료 중 및/또는 이후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 파클리탁셀(예를 들어, 아브락산®)과 같은 탁세인이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 젬시타빈과 같은 항-대사제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 카보플라틴 또는 시스플라틴과 같은 백금-기반 화학요법과 같은 알킬화제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 카이네이스 저해제, 예를 들어, 소라페닙 또는 에를로티닙과 같은 표적화제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 다른 항체, 예를 들어, 단일클론 항체(예를 들어, 베바시주맙), 이중 특이적 항체 또는 다중 특이적 항체와 같은 표적화제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 보르테조밉 또는 카필조밉과 같은 프로테오솜 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 레날리도마이드 또는 IL-2와 같은 면역 조절제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 방사선이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 당업자에 의해 표준 치료로 간주되는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 당업자에게 잘 알려져 있는 화학치료제이다.
일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 항체, 다른 접합된 항체, 다른 활성화 가능한 항체 및/또는 다른 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 작용제는 제1 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체와 동일한 표적에 대한 항체, 다른 접합된 항체, 다른 활성화 가능한 항체 및/또는 다른 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서 추가적인 작용제는 제1 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체의 표적과 상이한 표적에 대한 항체, 다른 접합된 항체, 다른 활성화 가능한 항체 및/또는 다른 접합된 활성화 가능한 항체이다.
일부 실시형태에서, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제(들)는 동시에 투여된다. 예를 들어, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제(들)는 단일 조성물로 제형화되거나 또는 2개 이상의 별개의 조성물로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 추가적인 작용제(들)는 순차적으로 투여되거나, 또는 항체 및/또는 접합된 항체 및 추가적인 작용제는 치료 양생법 동안 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어, 항체 및/또는 접합된 항체는 추가적인 작용제의 투여 전에 투여되고, 항체 및/또는 접합된 항체는 추가적인 작용제의 투여 이후에 투여되거나 또는 항체 및/또는 접합된 항체 및 추가적인 작용제는 교대로 투여된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체 및/또는 접합된 항체 및 추가적인 작용제는 단일 용량 또는 다중 용량이다.
본 개시내용은 또한 다양한 진단적 및/또는 예방적 적응증에서 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 사용하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 본 개시내용의 항체, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 담체를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 예를 들어, 진단 키트와 같은 키트에 포함될 수 있다.
접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB)을 포함한다. AB의 표적의 예시적인 부류는 세포 표면 수용체 및 분비된 결합 단백질(예를 들어, 성장 인자), 가용성 효소, 구조적 단백질(예를 들어, 콜라겐, 파이브로넥틴) 등을 포함하지만, 반드시 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 접합된 항체 및/또는 활성화 가능한 항체는 세포외 표적, 일반적으로 세포외 단백질 표적에 결합하는 AB를 갖는다. 일부 실시형태에서, 접합된 항체 및/또는 활성화 가능한 항체는 세포 흡수를 위해 설계되며, 세포 내에서 전환 가능(switchable)하다.
비제한적인 예로서, AB는 표 1에 열거된 임의의 표적에 대한 결합 파트너이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
비제한적인 예로서, AB는 표 2에 열거된 항체이거나, 또는 이로부터 유래된 것이다.
Figure pct00005
Figure pct00006
본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체 및 활성화 가능한 항체 조성물은 표적, 예를 들어, 인간 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 항체 또는 이의 항체 단편(본 개시내용 전반에 걸쳐 총괄하여 AB로 지칭됨)을 함유하되, AB는 차폐 모이어티(MM)에 의해 변형된다.
일부 실시형태에서, 차폐 모이어티는 특정 항체 또는 항체 단편과 함께 사용하기 위해 선택된다. 예를 들어, EGFR에 결합하는 항체와 함께 사용하기에 적합한 차폐 모이어티는 서열 CISPRG(서열번호　165)를 포함하는 MM을 포함한다. 비제한적인 예로서, MM은 CISPRGC(서열번호　166); CISPRGCG(서열번호　167); CISPRGCPDGPYVMY(서열번호　168); CISPRGCPDGPYVM(서열번호　169), CISPRGCEPGTYVPT(서열번호　170) 및 CISPRGCPGQIWHPP(서열번호　171)와 같은 서열을 포함할 수 있다. 다른 적합한 차폐 모이어티는 비제한적인 예로서 다음과 같은 PCT 공개 WO 2010/081173에 개시된 임의의 EGFR-특이적 마스크(mask)를 포함한다: GSHCLIPINMGAPSC(서열번호　172); CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC(서열번호　173); CNHHYFYTCGCISPRGCPG(서열번호　174); ADHVFWGSYGCISPRGCPG(서열번호　175); CHHVYWGHCGCISPRGCPG(서열번호　176); CPHFTTTSCGCISPRGCPG(서열번호　177); CNHHYHYYCGCISPRGCPG(서열번호　178); CPHVSFGSCGCISPRGCPG(서열번호　179); CPYYTLSYCGCISPRGCPG(서열번호　180); CNHVYFGTCGCISPRGCPG(서열번호　181); CNHFTLTTCGCISPRGCPG(서열번호　182); CHHFTLTTCGCISPRGCPG(서열번호　183); YNPCATPMCCISPRGCPG(서열번호　184); CNHHYFYTCGCISPRGCG(서열번호　185); CNHHYHYYCGCISPRGCG(서열번호　186); CNHVYFGTCGCISPRGCG(서열번호　187); CHHVYWGHCGCISPRGCG(서열번호　188); CPHFTTTSCGCISPRGCG(서열번호　189); CNHFTLTTCGCISPRGCG(서열번호　190); CHHFTLTTCGCISPRGCG(서열번호　191); CPYYTLSYCGCISPRGCG(서열번호　192); CPHVSFGSCGCISPRGCG(서열번호　193); ADHVFWGSYGCISPRGCG(서열번호　194); YNPCATPMCCISPRGCG(서열번호　195); CHHVYWGHCGCISPRGCG(서열번호　196); C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG(서열번호　197); CISPRGCGQPIPSVK(서열번호　198); CISPRGCTQPYHVSR(서열번호　199); 및/또는 CISPRGCNAVSGLGS(서열번호　164).
AB가 MM으로 변형되고 표적의 존재하에 있을 때, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 MM으로 변형되지 않은 AB의 특이적 결합 또는 모(parental) AB의 표적에 대한 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 저해된다.
MM으로 변형된 AB의 표적에 대한 Kd는 MM으로 변형되지 않은 AB 또는 모 AB의 표적에 대한 Kd보다 적어도 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 1,000,000배, 5,000,000배, 10,000,000배, 50,000,000배 이상 또는 5 내지 10배, 10 내지 100배, 10 내지 1,000배, 10 내지 10,000배, 10 내지 100,000배, 10 내지 1,000,000배, 10 내지 10,000,000배, 100 내지 1,000배, 100 내지 10,000배, 100 내지 100,000배, 100 내지 1,000,000배, 100 내지 10,000,000배, 1,000 내지 10,000배, 1,000 내지 100,000배, 1,000 내지 1,000,000배, 1000 내지 10,000,000배, 10,000 내지 100,000배, 10,000 내지 1,000,000배, 10,000 내지 10,000,000배, 100,000 내지 1,000,000배 또는 100,000 내지 10,000,000배 더 크다. 반대로, MM으로 변형된 AB의 표적에 대한 결합 친화도는 MM으로 변형되지 않은 AB 또는 모 AB의 표적에 대한 결합 친화도보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 40배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 1,000,000배, 5,000,000배, 10,000,000배, 50,000,000배 이상 또는 5 내지 10배, 10 내지 100배, 10 내지 1,000배, 10 내지 10,000배, 10 내지 100,000배, 10 내지 1,000,000배, 10 내지 10,000,000배, 100 내지 1,000배, 100 내지 10,000배, 100 내지 100,000배, 100 내지 1,000,000배, 100 내지 10,000,000배, 1,000 내지 10,000배, 1,000 내지 100,000배, 1,000 내지 1,000,000배, 1000 내지 10,000,000배, 10,000 내지 100,000배, 10,000 내지 1,000,000배, 10,000 내지 10,000,000배, 100,000 내지 1,000,000배 또는 100,000 내지 10,000,000배 더 낮다.
AB에 대한 MM의 해리 상수(Kd)는 일반적으로 AB의 표적에 대한 Kd보다 더 크다. AB에 대한 MM의 Kd는 AB의 표적에 대한 Kd보다 적어도 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배 또는 심지어 10,000,000배 더 클 수 있다. 반대로, AB에 대한 MM의 결합 친화도는 일반적으로 AB의 표적에 대한 결합 친화도보다 더 낮다. AB에 대한 MM의 결합 친화도는 AB의 표적에 대한 결합 친화도보다 적어도 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배 또는 심지어 10,000,000배 더 낮을 수 있다.
AB가 MM으로 변형되고 표적의 존재하에 있을 때, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 MM으로 변형되지 않은 AB의 특이적 결합 또는 모 AB의 표적에 대한 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 저해된다. MM으로 변형되지 않은 AB의 결합 또는 모 AB의 표적에 대한 결합과 비교할 때, MM으로 변형될 때 표적에 결합하는 AB의 능력은 생체내 또는 시험관내 검정에서 측정될 때 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 28시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 또는 96시간 또는 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 60일, 90일, 120일, 150일 또는 180일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이상 동안 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 심지어 100% 감소될 수 있다.
MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해한다. MM은 AB의 항원 결합 도메인에 결합하고, AB의 표적에 대한 결합을 저해한다. MM은 AB의 표적에 대한 결합을 입체적(sterically)으로 저해할 수 있다. MM은 AB의 표적에 대한 결합을 다른자리입체적(allosterically)으로 저해할 수 있다. 이러한 실시형태에서, AB가 변형되거나 또는 MM에 결합되고 표적의 존재하에 있을 때, 생체내 또는 시험관내 검정에서 측정될 때 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 28시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 또는 96시간 또는 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 60일, 90일, 120일, 150일 또는 180일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 또는 그 이상 동안 MM으로 변형되지 않은 AB, 모 AB 또는 MM에 결합되지 않은 AB의 표적에 대한 결합과 비교하여, AB의 표적에 대한 결합이 없거나 또는 실질적으로 결합이 없거나 또는 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50% 이하의 AB의 표적에 대한 결합이 있다.
AB가 MM에 커플링되거나 또는 이에 의해 변형될 때, MM은 AB의 표적에 대한 특정 결합을 '차폐' 또는 감소 또는 그렇지 않으면 저해한다. AB가 MM에 커플링되거나 또는 이에 의해 변형될 때, 이러한 커플링 또는 변형은 표적에 특이적으로 결합하는 AB의 능력을 감소시키거나 또는 저해하는 구조적 변화에 영향을 미칠 수 있다.
MM에 커플링되거나 또는 이로 변형된 AB는 다음 화학식으로 나타낼 수 있다(아미노(N) 말단 영역에서 카복실(C) 말단 영역의 순서로):
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
식 중, MM은 차폐 모이어티이고, AB는 항체 또는 이의 항체 단편이며, L은 링커이다. 많은 실시형태에서, 유연성을 제공하기 위해 하나 이상의 링커, 예를 들어, 가요성 링커를 조성물 내에 삽입하는 것이 바람직할 수 있다.
소정의 실시형태에서, MM은 AB의 천연 결합 파트너가 아니다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너에 대한 상동성을 포함하지 않거나 또는 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이하 유사하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 25% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 50% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 20% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 10% 이하 동일하다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 MM에 의해 변형된 AB를 포함하고, 또한 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 적어도 하나의 절단성 모이어티(CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP)에 대한 대상인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)를 포함한다. 이러한 활성화 가능한 항체는 AB의 표적에 대해 활성화 가능한/전환 가능한 결합을 나타낸다. 활성화 가능한 항체는 일반적으로 차폐 모이어티(MM) 및 CM1-CM2 기질에 의해 변형되거나 또는 이에 커플링되는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함한다.
활성화 가능한 항체의 요소는 MM 및 CM1-CM2 기질이 절단된(또는 상대적으로 활성인) 상태 및 표적의 존재하에, AB가 표적의 존재하에 절단되지 않은(또는 상대적으로 불활성인) 상태에 있는 동안 표적에 결합하게 배치되도록 배열되어, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 감소 또는 저해된다. AB의 표적에 대한 특이적 결합은 MM에 의해 표적에 특이적으로 결합하는 AB의 능력의 저해 또는 차폐로 인해 감소될 수 있다.
MM 및 CM1-CM2 기질로 변형된 AB의 표적에 대한 Kd는 MM 및 CM1-CM2 기질로 변형되지 않은 AB 또는 모 AB의 표적에 대한 Kd보다 적어도 5배, 10배, 20배, 25배, 40배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 1,000,000배, 5,000,000배, 10,000,000배, 50,000,000배 이상 또는 5 내지 10배, 10 내지 100배, 10 내지 1,000배, 10 내지 10,000배, 10 내지 100,000배, 10 내지 1,000,000배, 10 내지 10,000,000배, 100 내지 1,000배, 100 내지 10,000배, 100 내지 100,000배, 100 내지 1,000,000배, 100 내지 10,000,000배, 1,000 내지 10,000배, 1,000 내지 100,000배, 1,000 내지 1,000,000배, 1000 내지 10,000,000배, 10,000 내지 100,000배, 10,000 내지 1,000,000배, 10,000 내지 10,000,000배, 100,000 내지 1,000,000배 또는 100,000 내지 10,000,000배 더 크다. 반대로, MM 및 CM1-CM2 기질로 변형된 AB의 표적에 대한 결합 친화도는 MM 및 CM1-CM2 기질로 변형되지 않은 AB 또는 모 AB의 표적에 대한 결합 친화도보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 40배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 1,000,000배, 5,000,000배, 10,000,000배, 50,000,000배 이상 또는 5 내지 10배, 10 내지 100배, 10 내지 1,000배, 10 내지 10,000배, 10 내지 100,000배, 10 내지 1,000,000배, 10 내지 10,000,000배, 100 내지 1,000배, 100 내지 10,000배, 100 내지 100,000배, 100 내지 1,000,000배, 100 내지 10,000,000배, 1,000 내지 10,000배, 1,000 내지 100,000배, 1,000 내지 1,000,000배, 1000 내지 10,000,000배, 10,000 내지 100,000배, 10,000 내지 1,000,000배, 10,000 내지 10,000,000배, 100,000 내지 1,000,000배 또는 100,000 내지 10,000,000배 더 낮다.
AB가 MM 및 CM1-CM2 기질로 변형되고 표적의 존재하에 있지만 개질제(예를 들어, MMP 및 SP)의 존재하에 있지 않은 경우, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 MM 및 CM1-CM2 기질로 변형되지 않은 AB 또는 모 AB의 표적에 대한 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 저해된다. 모 AB의 결합 또는 MM 및 CM1-CM2 기질로 변형되지 않은 AB의 표적에 대한 결합과 비교할 때, MM 및 CM1-CM2 기질로 변형될 때 표적에 결합하는 AB의 능력은 생체내 또는 시험관내 검정에서 측정될 때 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 28시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 또는 96시간 또는 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 60일, 90일, 120일, 150일 또는 180일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 또는 그 이상 동안, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 심지어 100% 감소될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 절단된 상태는 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스 및/또는 적어도 하나의 세린 프로테이스에 의한 CM1-CM2 기질의 변형, 즉, 절단 후 활성화 가능한 항체의 상태를 지칭한다. 본 명세서에 나타낸 바와 같은 용어 절단되지 않은 상태 또는 완전 절단되지 않은 MMP 및/또는 SP에 의한 CM1-CM2 기질의 절단의 부재하에 활성화 가능한 항체의 상태를 지칭한다. 위에서 논의된 바와 같이, 용어 "활성화 가능한 항체"는 절단되지 않은(천연) 상태뿐만 아니라 절단된 상태 모두의 활성화 가능한 항체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 절단된 상태의 활성화 가능한 항체는 또한 활성화된 항체 및/또는 활성화된 활성화 가능한 항체로 본 명세서에서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 절단된 활성화 가능한 항체는 프로테이스에 의한 CM1-CM2 기질의 절단으로 인해 MM이 결여되어 적어도 MM이 방출될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
활성화 가능한 또는 전환 가능한이란 활성화 가능한 항체가 저해, 차폐 또는 절단되지 않은 상태(즉, 제1 형태)에 있을 때 표적에 대한 제1 결합 수준 및 저해되지 않은, 차폐되지 않은 및/또는 절단된 상태(즉, 제2 형태)에서 표적에 대한 제2 결합 수준을 나타냄을 의미하며, 여기서 제2 수준의 표적 결합은 제1 수준의 결합보다 크다. 일반적으로, 활성화 가능한 항체의 AB에 대한 표적의 접근은 이러한 절단제의 부재하에서보다 CM1-CM2 기질을 절단할 수 있는 절단제의 존재하에서 더 크다. 따라서, 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태에 있을 때 AB는 표적 결합으로부터 저해되며 표적 결합(즉, 제1 형태는 이러한 AB가 표적에 결합할 수 없음)으로부터 차폐될 수 있고, 절단된 상태에 있을 때 AB는 표적 결합에 대해 저해되지 않거나 또는 차폐되지 않는다.
활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질 및 AB는 AB가 주어진 표적에 대한 결합 모이어티를 나타내고 CM1-CM2 기질이 MMP 및 SP에 대한 기질을 나타내도록 선택될 수 있되, MMP 및/또는 SP는 대상체의 치료 부위 또는 진단적 부위에서 표적과 공동-국재화된다. 본 명세서에 개시된 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 각각 CM1-CM2 기질에서 부위를 절단할 수 있는 MMP 및 SP가 비-치료 부위(예를 들어, 건강한 조직)의 조직에서보다 치료 부위 또는 진단적 부위의 표적-함유 조직에서 상대적으로 더 높은 수준으로 존재하는 특정 용도를 찾는다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB가 차폐되지 않았거나 또는 그렇지 않으면 표적에 대한 결합이 억제되지 않은 경우, 비-치료 부위에서 AB의 결합으로 인해 달리 발생할 수 있는 감소된 독성 및/또는 부작용을 제공한다.
일반적으로, 활성화 가능한 항체는 관심 있는 AB를 선택하고, 활성화 가능한 항체의 나머지를 구성함으로써 설계될 수 있으므로, 구조적으로 제한될 때, MM은 AB의 차폐 또는 AB의 표적에 대한 결합의 환원을 제공한다. 이러한 기능적 특징을 제공하기 위해 구조적 설계 기준이 고려될 수 있다.
저해된 형태 대 저해되지 않은 형태에서 표적 결합에 대해 목적하는 동적 범위의 전환 가능한 표현형을 나타내는 활성화 가능한 항체가 제공된다. 동적 범위는 일반적으로 (a) 제1 조건 설정하에 매개변수의 최대 검출 수준 대 (b) 제2 조건 설정하에 해당 매개변수의 최소 검출 수준의 비를 지칭한다. 예를 들어, 활성화 가능한 항체의 맥락에서, 동적 범위는 (a) 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질을 절단할 수 있는 MMP 및 SP의 존재하에 활성화 가능한 항체에 결합하는 표적 단백질의 최대 검출 수준 대 (b) 프로테이스의 부재하에 활성화 가능한 항체에 결합하는 표적 단백질의 최소 검출 수준의 비를 지칭한다. 활성화 가능한 항체의 동적 범위는 활성화 가능한 항체 절단제(예를 들어, 효소) 처리의 해리 상수 대 활성화 가능한 항체 절단제 처리의 해리 상수의 비로 계산될 수 있다. 활성화 가능한 항체의 동적 범위가 클수록, 활성화 가능한 항체의 전환 가능한 표현형이 더 좋다. 상대적으로 높은 동적 범위 값(예를 들어, 1 이상)을 갖는 활성화 가능한 항체는 활성화 가능한 항체에 의한 표적 단백질 결합이 절단제의 부재하에서보다 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질을 절단할 수 있는 절단제(예를 들어, 효소)의 존재하에서 더 큰 정도(예를 들어, 주로 발생)로 발생하도록 더욱 바람직한 스위칭 표현형을 나타낸다.
활성화 가능한 항체는 다양한 구조적 배열로 제공될 수 있다. 활성화 가능한 항체에 대한 예시적인 화학식이 아래에 제공된다. AB, MM 및 CM1-CM2 기질의 N-말단에서 C-말단 순서는 활성화 가능한 항체 내에서 역전될 수 있음이 구체적으로 상정된다. 예를 들어, CM1-CM2 기질이 MM 내에 적어도 부분적으로 포함되도록 CM 및 MM이 아미노산 서열에서 겹칠 수 있음이 또한 구체적으로 상정된다.
예를 들어, 활성화 가능한 항체는 다음 화학식으로 표시될 수 있다(아미노(N) 말단 영역에서 카복실(C) 말단 영역의 순서로):
(MM)-(CM1-CM2 기질)-(AB)
(AB)-(CM1-CM2 기질)-(MM)
식 중, MM은 차폐 모이어티이고, CM1-CM2 기질은 절단성 모이어티이며, AB는 항체 또는 이의 단편이다. 위에 언급된 바와 같이, 용어 "CM1-CM2 기질"은 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 제1 절단성 모이어티(CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP)에 대한 기질인 제2 절단성 모이어티(CM2)의 배향 또는 다른 구조적 배열에 관한 임의의 요구 사항을 전하는 것으로 의도된 것이 아니다. 따라서, 용어 "CM1-CM2 기질"은 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는 CM1-CM2 기질을 포함한다: CM1-CM2 또는 CM2-CM1. 용어 "CM1-CM2 기질"은 또한 기질을 포함하되, CM1 서열의 적어도 일부는 CM2 서열의 적어도 일부와 겹친다. 또한, MM 및 CM1-CM2 기질이 위의 화학식에서 별개의 구성 요소로 표시되었지만, 본 명세서에 개시된 모든 예시적인 실시형태(화학식 포함)에서, MM 및 CM1-CM2 기질의 아미노산 서열은 예를 들어, CM1-CM2 기질이 MM 내에 완전히 또는 부분적으로 포함되도록 겹칠 수 있음이 상정된다는 것에 유의하여야 한다. 또한, 위의 화학식은 활성화 가능한 항체 요소에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치될 수 있는 추가적인 아미노산 서열을 제공한다.
소정의 실시형태에서, MM은 AB의 천연 결합 파트너가 아니다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와의 상동성을 전혀 포함하지 않거나 또는 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이하 유사하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 50% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 25% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 20% 이하 동일하다. 일부 실시형태에서, MM은 임의의 AB의 천연 결합 파트너와 10% 이하 동일하다.
많은 실시형태에서, MM-CM1-CM2 기질 접합부(junction), CM1-CM2 기질-AB 접합부 또는 둘 모두 중 하나 이상에 유연성을 제공하기 위해, 하나 이상의 링커, 예를 들어, 가요성 링커를 활성화 가능한 항체 작제물에 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, AB, MM 및/또는 CM1-CM2 기질은 목적하는 유연성을 제공하기에 충분한 수의 잔기(예를 들어, Gly, Ser, Asp, Asn, 특히 Gly 및 Ser, 구체적으로 Gly)를 포함하지 않을 수 있다. 이와 같이, 이러한 활성화 가능한 항체 작제물의 전환 가능한 표현형은 가요성 링커를 제공하기 위한 하나 이상의 아미노산의 도입으로부터 이익을 얻을 수 있다. 또한, 아래에 기재된 바와 같이, 활성화 가능한 항체가 구조적으로 제한된 작제물로서 제공되는 경우, 가요성 링커는 절단되지 않은 활성화 가능한 항체에서 고리형 구조의 형성 및 유지를 용이하게 하기 위해 작동 가능하게 삽입될 수 있다.
예를 들어, 소정의 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 다음 화학식 중 하나를 포함한다(아래 화학식은 N-말단에서 C-말단 방향 또는 C-말단에서 N-말단 방향의 아미노산 서열을 나타냄):
(MM)-LP1-(CM1-CM2 기질)-(AB)
(MM)-(CM1-CM2 기질)-LP2-(AB)
(MM)-LP1-(CM1-CM2 기질)-LP2-(AB)
식 중, MM, CM1-CM2 기질 및 AB는 위에 정의된 바와 같되; LP1 및 LP2는 각각 독립적으로 및 선택적으로 존재하거나 또는 부재하며, 적어도 1개의 가요성 아미노산(예를 들어, Gly)을 포함하는 동일하거나 상이한 가요성 링커이다. 또한, 위의 화학식은 활성화 가능한 항체 요소에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치될 수 있는 추가적인 아미노산 서열을 제공한다. 예는 표적화 모이어티(예를 들어, 표적 조직에 존재하는 세포의 수용체에 대한 리간드) 및 혈청 반감기 연장 모이어티(예를 들어, 면역글로불린(예를 들어, IgG) 또는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HAS)과 같은 혈청 단백질에 결합하는 폴리펩타이드)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
CM1-CM2 기질은 약 0.001 내지 1500×104 M-1S-1 또는 적어도 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 또는 1500×104 M-1S-1의 비율로 적어도 하나의 MMP에 의해 특이적으로 절단되며, 약 0.001 내지 1500×104 M-1S-1 또는 적어도 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 또는 1500×104 M-1S-1의 비율로 적어도 하나의 SP에 의해 특이적으로 절단된다.
효소에 의한 특정 절단을 위해, 효소와 CM1-CM2 기질 사이의 접촉이 이루어진다. MM 및 CM1-CM2 기질에 커플링된 AB를 포함하는 활성화 가능한 항체가 표적과 충분한 효소 활성의 존재하에 있을 때, CM1-CM2 기질은 절단될 수 있다. 충분한 효소 활성은 CM1-CM2 기질과 접촉하여 절단에 영향을 미치는 효소의 능력을 지칭할 수 있다. 효소가 CM1-CM2 기질의 근처에 있을 수 있지만 다른 세포 인자 또는 효소의 단백질 변형으로 인해 절단할 수 없다는 것을 쉽게 상상할 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물에 사용하기에 적합한 링커는 일반적으로 AB의 표적에 대한 결합의 저해를 촉진하도록 변형된 AB 또는 활성화 가능한 항체의 유연성을 제공하는 링커이다. 이러한 링커는 일반적으로 가요성 링커로 지칭된다. 적합한 링커는 쉽게 선택될 수 있고, 4개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 6개의 아미노산 내지 8개의 아미노산 또는 7개의 아미노산 내지 8개의 아미노산을 포함하여 1개의 아미노산(예를 들어, Gly) 내지 20개의 아미노산, 2개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 3개의 아미노산 내지 12개의 아미노산과 같은 임의의 적합한 상이한 길이일 수 있으며, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 아미노산 길이일 수 있다.
예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열번호　381) 및 (GGGS)n(서열번호　382)을 포함하되, n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 공지된 기타 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되지 않았으므로, 구성 요소 간의 중성 테더(tether) 역할을 할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 훨씬 많이 파이-프사이(phi-psi) 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 한정된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142(1992)] 참조). 예시적인 가요성 링커는 Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호　202), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(서열번호　203), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(서열번호　204), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호　205), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호　206), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(서열번호　207) 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 당업자는 활성화 가능한 항체의 설계가 가요성 링커뿐만 아니라 목적하는 활성화 가능한 항체 구조를 제공하기 위해 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록 모두 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 활성화 가능한 항체는 또한 활성화 가능한 항체에 접합된 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합된 작용제는 항-염증제 및/또는 항신생물제와 같은 치료제이다. 이러한 실시형태에서, 작용제는 활성화 가능한 항체의 탄수화물 모이어티에 접합되며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 탄수화물 모이어티는 활성화 가능한 항체의 항체 또는 항원-결합 단편의 항원-결합 영역 외부에 위치한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 활성화 가능한 항체의 항체 또는 항원-결합 단편의 설피드릴기에 접합된다.
일부 실시형태에서, 작용제는 독소(예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)와 같은 세포독성제이다.
일부 실시형태에서, 작용제는 예를 들어, 표지 또는 기타 마커와 같은 검출 가능한 모이어티이다. 예를 들어, 작용제는 마킹된 아비딘(예를 들어, 광학 또는 열량 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘), 하나 이상의 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종, 하나 이상의 형광 표지, 하나 이상의 효소적 표지 및/또는 하나 이상의 화학 발광제에 의해 검출될 수 있는 방사성 표지된 아미노산, 하나 이상의 바이오티닐 모이어티이거나 또는 이들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 모이어티는 스페이서 분자에 의해 부착된다.
본 개시내용은 또한 독소(예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체와 관련된다. 적합한 세포독성제는 예를 들어, 돌라스타틴 및 이의 유도체(예를 들어 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, DMAF, DMAE)를 포함한다. 예를 들어, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 표 3에 열거된 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 듀오카마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀 이량체이다.
일부 실시형태에서, 작용제는 말레이미드 카프로일-발린-시트룰린 링커 또는 말레이미드 PEG-발린-시트룰린 링커를 사용하여 AB에 연결된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 말레이미드 카프로일-발린-시트룰린 링커를 사용하여 AB에 연결된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 말레이미드 PEG-발린-시트룰린 링커를 사용하여 AB에 연결된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 말레이미드 PEG-발린-시트룰린-파라-아미노벤질옥시카보닐 링커를 사용하여 AB에 연결된 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이며, 이 링커 페이로드 작제물은 본 명세서에서 "vc-MMAD"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 말레이미드 PEG-발린-시트룰린-파라-아미노벤질옥시카보닐 링커를 사용하여 AB에 연결된 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이며, 이 링커 페이로드 작제물은 본 명세서에서 "vc-MMAE"로 지칭된다. vc-MMAD 및 vc-MMAE의 구조는 아래에 나타나 있다:
vc-MMAD:
Figure pct00007
vc-MMAE:
Figure pct00008
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀(sapaonaria officinalis) 저해제, 젤로닌, 마이토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성 핵종이 방사성 접합된 항체의 생산을 위해 이용 가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질-커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올레인(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-다이아이소사이아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science 238: 1098(1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오사이아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오타이드를 항체에 접합하기 위한 예시적인 킬레이트제이다. (WO94/11026 참조).
표 3은 본 명세서에 기술된 개시 내용에 사용될 수 있는 예시적인 약제학적 작용제의 일부를 열거하지만, 결코 완전한 목록을 의미하지는 않는다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
당업자는 매우 다양한 가능한 모이어티가 본 개시내용의 생성된 항체에 커플링될 수 있음을 인식할 것이다. (예를 들어, 문헌["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)] 참조, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
커플링은 항체와 다른 모이어티가 이들 각각의 활성을 유지하는 한 두 분자를 결합할 임의의 화학적 반응에 의해 달성될 수 있다. 이 연결은 많은 화학적 메커니즘, 예를 들어 공유 결합, 친화성 결합, 삽입(intercalation), 배위 결합 및 복합체화를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서, 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 기존 측쇄의 직접 축합에 의해 또는 외부 브리징 분자의 통합에 의해 달성될 수 있다. 많은 2가 또는 다가 연결제가 본 개시내용의 항체와 같은 단백질 분자를 다른 분자에 커플링하는데 유용하다. 예를 들어, 대표적인 커플링제는 티오에스터, 카보다이이미드, 석신이미드 에스터, 다이아이소사이아네이트, 글루타르알데하이드, 다이아조벤젠 및 헥사메틸렌다이아민과 같은 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이 목록은 당업계에 공지된 다양한 부류의 커플링제를 망라하려는 것이 아니라, 보다 일반적인 커플링제의 예시일 뿐이다(문헌[Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 및 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참조).
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법에 더하여, 접합된 활성화 가능한 항체는 또한 활성화 가능한 항체 서열에 삽입되거나 또는 그렇지 않으면 포함된 변형된 아미노산 서열을 통한 부위-특이적 접합을 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형된 아미노산 서열은 접합된 활성화 가능한 항체 내에서 접합된 작용제의 제어된 배치 및/또는 투여량을 허용하도록 설계된다. 예를 들어, 활성화 가능한 항체는 반응성 티올기를 제공하고, 단백질 폴딩 및 어셈블리에 부정적인 영향을 미치지 않으며, 항원 결합을 변경하지 않는 경쇄 및 중쇄 상의 위치에 시스테인 치환을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 접합에 적합한 부위를 제공하도록 활성화 가능한 항체 내에 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 그렇지 않으면 도입하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 활성화 가능한 항체 서열 내에 효소적으로 활성화 가능한 펩타이드 서열을 포함하거나 또는 그렇지 않으면 도입하도록 조작될 수 있다.
적합한 링커는 문헌에 기재되어 있다. (예를 들어, MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터의 사용을 설명하는 문헌[Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)] 참조). 또한, 올리고펩타이드 링커에 의해 항체에 커플링된 할로겐화된 아세틸 하이드라자이드 유도체의 사용을 설명하는 미국 특허 제5,030,719호 참조. 일부 실시형태에서, 적합한 링커는 (i) EDC(1-에틸-3-(3-다이메틸아미노-프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드; (ii) SMPT(4-석신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-다이티오)-톨루엔(피어스 케미칼 컴퍼니(Pierce Chem. Co.), Cat.(21558G); (iii) SPDP(석신이미딜-6 [3-(2-피리딜다이티오) 프로피온아미도]헥사노에이트(피어스 케미칼 컴퍼니, Cat #21651G); (iv) 설포-LC-SPDP(설포석신이미딜 6 [3-(2-피리딜다이티오)-프로피온아마이드] 헥사노에이트(피어스 케미칼 컴퍼니 Cat. #2165-G); 및 (v) EDC에 접합된 설포-NHS(N-하이드록시설포-석신이미드: 피어스 케미칼 컴퍼니, Cat. #24510)를 포함한다. 추가적인 링커는 SMCC, 설포-SMCC, SPDB 또는 설포-SPDB를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
위에 기재된 링커는 상이한 속성을 갖는 구성 요소를 함유하며, 따라서 서로 다른 물리-화학적 특성을 갖는 접합체로 이어진다. 예를 들어, 알킬 카복실레이트의 설포-NHS 에스터는 방향족 카복실레이트의 설포-NHS 에스터보다 더 안정하다. 링커를 함유하는 NHS-에스터는 설포-NHS 에스터보다 덜 가용성이다. 또한, 링커 SMPT는 입체장애 이황화물 결합을 함유하며, 안정성이 증가된 접합체를 형성할 수 있다. 이황화물 연결은 일반적으로 이황화물 연결이 시험관내에서 절단되어 이용 가능한 접합체가 적기 때문에 다른 연결보다 덜 안정하다. 특히, 설포-NHS는 카보다이이미드 커플링의 안정성을 향상시킬 수 있다. 카보다이이미드 커플링(예컨대, EDC)은 설포-NHS와 함께 사용될 때 카보다이이미드 커플링 반응 단독보다 가수분해에 더 저항성이 있는 에스터를 형성한다.
일부 실시형태에서, 링커는 절단성이다. 일부 실시형태에서, 링커는 비-절단성이다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 링커가 존재한다. 2개 이상의 링커는 모두 동일하고, 즉, 절단성 또는 비-절단성 또는 2개 이상의 링커는 상이하고, 즉, 적어도 하나는 절단성이고 적어도 하나는 비-절단성이다.
본 개시내용은 작용제를 AB에 부착시키기 위한 여러 방법을 사용한다: (a) AB의 탄수화물 모이어티에 부착, 또는 (b) AB의 설피드릴기에 부착, 또는 (c) AB의 아미노기에 부착, 또는 (d) AB의 카복실레이트기에 부착. 본 개시내용에 따르면, AB는 적어도 2개의 반응성기를 갖는 중간 링커(하나는 AB와 반응하고, 다른 하나는 작용제와 반응함)를 통해 작용제에 공유적으로 부착될 수 있다. 임의의 상용성 유기 화합물을 포함할 수 있는 링커는 AB(또는 작용제)와의 반응이 AB 반응성 및 선택성에 악영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다. 또한, 링커를 작용제에 부착시켜도 작용제의 활성이 파괴되지 않을 수 있다. 산화된 항체 또는 산화된 항체 단편과의 반응에 적합한 링커는 1차 아민기, 2차 아민기, 하이드라진기, 하이드라자이드기, 하이드록실아민기, 페닐하이드라진기, 세미카바자이드 및 티오세미카바자이드기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아민을 함유하는 것들을 포함한다. 이러한 반응성 작용기는 링커의 구조의 일부로 존재할 수 있거나 또는 이러한 기를 함유하지 않는 링커의 적합한 화학적 변형에 의해 도입될 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 환원된 AB에 부착시키기에 적합한 링커는 환원된 항체 또는 단편의 설피드릴기와 반응할 수 있는 소정의 반응성기를 갖는 것들을 포함한다. 이러한 반응성기는 반응성 할로알킬기(예를 들어, 할로아세틸기 포함), p-머큐리벤조에이트기 및 마이클-형 첨가 반응(Michael-type addition reaction)이 가능한 기(예를 들어, 말레이미드 및 문헌[Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110]에 의해 기술된 유형의 기 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용에 따르면, 산화 또는 환원되지 않은 AB에 부착시키기에 적합한 링커는 AB의 비변형된 라이신 잔기에 존재하는 1차 아미노기와 반응할 수 있는 소정의 작용기를 갖는 것을 포함한다. 이러한 반응성기는 NHS 카복실산 에스터 또는 탄산 에스터, 설포-NHS 카복실산 에스터 또는 탄산 에스터, 4-나이트로페닐 카복실산 에스터 또는 탄산 에스터, 펜타플루오로페닐 카복실산 에스터 또는 탄산 에스터, 아실 이미다졸, 아이소사이아네이트 및 아이소티오사이아네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용에 따르면, 산화 또는 환원되지 않은 AB에 부착시키기에 적합한 링커는 적합한 시약으로 활성화된 AB의 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기에 존재하는 카복실산기와 반응할 수 있는 소정의 작용기를 갖는 것을 포함한다. 적합한 활성화 시약은 NHS 또는 설포-NHS가 첨가되거나 첨가되지 않은 EDC 및 카복사마이드 형성을 위해 사용되는 기타 탈수제를 포함한다. 이러한 예에서, 적합한 링커에 존재하는 작용기는 1차 아민 및 2차 아민, 하이드라진, 하이드록실아민 및 하이드라자이드를 포함할 것이다.
작용제는 링커가 AB에 부착되기 전 또는 후에 링커에 부착될 수 있다. 소정의 적용에서, 링커에 관련 작용제가 없는 AB-링커 중간체를 먼저 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 적용에 따라, 특정 작용제가 그 후 링커에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, AB는 MM, CM1-CM2 기질 및 관련 링커에 먼저 부착된 다음, 접합 목적을 위해 링커에 부착된다.
분지형 링커: 특정 실시형태에서, 작용제의 부착을 위한 다중 부위를 갖는 분지형 링커가 사용된다. 다중 부위 링커의 경우, AB에 대한 단일 공유 부착은 여러 부위에서 작용제에 결합할 수 있는 AB-링커 중간체를 생성할 것이다. 부위는 알데하이드기 또는 설피드릴기 또는 작용제가 부착될 수 있는 임의의 화학적 부위일 수 있다.
일부 실시형태에서, AB 상의 복수의 부위에 단일 부위 링커를 부착시킴으로써 더 높은 특이적 활성(또는 작용제 대 AB의 더 높은 비)이 달성될 수 있다. 이러한 복수의 부위는 두 가지 방법 중 하나에 의해 AB에 도입될 수 있다. 첫째, 동일한 AB에서 여러 알데하이드기 및/또는 설피드릴기를 생성할 수 있다. 둘째, 링커에 대한 후속 부착을 위한 다중 작용 부위를 갖는 "분지형 링커"인 AB의 알데하이드 또는 설피드릴에 부착될 수 있다. 분지형 링커 또는 다중 부위 링커의 작용 부위는 알데하이드기 또는 설피드릴기일 수 있거나, 또는 링커가 부착될 수 있는 임의의 화학적 부위일 수 있다. 즉, AB 상의 여러 부위에 다중 부위 링커를 부착시키는 이러한 두 가지 접근법을 조합함으로써 더 높은 특이적 활성이 얻어질 수 있다.
절단성 링커: 유로카이네이스, 조직 플라스미노겐 활성화제, 트립신, 플라스민 또는 단백질 가수분해 활성을 갖는 기타 효소와 같지만 이들로 제한되지 않는 보체 시스템의 효소에 의한 절단에 민감한 펩타이드 링커는 본 개시내용의 한 실시형태에서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 한 방법에 따르면, 작용제는 보체에 의한 절단에 민감한 링커를 통해 부착된다. 항체는 보체를 활성화할 수 있는 클래스로부터 선택된다. 따라서, 항체-작용제 접합체는 보체 캐스케이드를 활성화하고, 표적 부위에서 작용제를 방출한다. 본 개시내용의 다른 방법에 따르면, 작용제는 유로카이네이스, 조직 플라스미노겐 활성화제, 플라스민 또는 트립신과 같은 단백질 가수분해 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 민감한 링커를 통해 부착된다. 이러한 절단성 링커는 세포외 독소, 예를 들어, 비제한적인 예로서, 표 3에 나타낸 임의의 세포외 독소를 포함하는 접합된 활성화 가능한 항체에 유용하다.
절단성 링커 서열의 비제한적인 예는 표 4에 제공된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
또한, 작용제는 이황화물 결합(예를 들어, 시스테인 분자 상의 이황화물 결합)을 통해 AB에 부착될 수 있다. 많은 종양이 자연적으로 높은 수준의 글루타티온(환원제)을 방출하기 때문에, 이는 전달 부위에서 작용제의 후속 방출과 함께 이황화물 결합을 환원시킬 수 있다. 소정의 특정 실시형태에서, CM1-CM2 기질을 변형시킬 환원제는 또한 접합된 활성화 가능한 항체의 링커를 변형시킬 것이다.
스페이서 및 절단성 요소: 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 작용제와 AB 사이의 간격을 최적화하는 방식으로 링커를 구축하는 것이 필요할 수 있다. 이는 일반 구조의 링커를 사용하여 확립될 수 있다:
W-(CH2)n-Q
식 중,
W는 --NH--CH2-- 또는 --CH2--이고;
Q는 아미노산, 펩타이드이며; 그리고
n는 0 내지 20의 정수이다.
일부 실시형태에서, 링커는 스페이서 요소 및 절단성 요소를 포함할 수 있다. 스페이서 요소는 절단성 요소가 절단을 담당하는 효소에 더 접근 가능하도록 절단성 요소를 AB의 코어로부터 멀리 위치시키는 역할을 한다. 위에 기재된 소정의 분지형 링커는 스페이서 요소의 역할을 할 수 있다.
이 논의를 통해, 링커를 작용제에(또는 스페이서 요소를 절단성 요소에 또는 절단성 요소를 작용제에) 부착시키는 것은 특정 방식의 부착 또는 반응일 필요는 없음을 이해하여야 한다. 적합한 안정성 및 생물학적 상용성의 생성물을 제공하는 임의의 반응이 허용된다.
혈청 보체 및 링커의 선별: 본 개시내용의 한 방법에 따르면, 작용제의 방출이 요구되는 경우, 보체를 활성화할 수 있는 클래스의 항체인 AB가 사용된다. 생성된 접합체는 항원에 결합하고 보체 캐스케이드를 활성화하는 능력을 모두 보유한다. 따라서, 본 개시내용의 이 실시형태에 따르면, 작용제는 절단성 링커 또는 절단성 요소의 한쪽 말단에 결합되고, 링커기의 다른 말단은 AB 상의 특정 부위에 부착된다. 예를 들어, 작용제가 하이드록시기 또는 아미노기를 갖는 경우, 이는 각각 에스터 또는 아마이드 결합을 통해 펩타이드, 아미노산 또는 기타 적합하게 선택된 링커의 카복시 말단에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 작용제는 카보다이이미드 반응을 통해 링커 펩타이드에 부착될 수 있다. 작용제가 링커에 대한 부착을 방해하는 작용기를 포함하는 경우, 이러한 간섭 작용기는 부착 전 차단되며, 생성물 접합체 또는 중간체가 만들어지면 차단 해제될 수 있다. 그런 다음, 링커의 반대쪽 또는 아미노 말단은 보체를 활성화할 수 있는 AB에 대한 결합을 위해 직접 또는 추가 변형 후 사용된다.
링커(또는 링커의 스페이서 요소)는 임의의 목적하는 길이일 수 있고, 그 한쪽 말단은 활성화 가능한 항체의 AB 상의 특정 부위에 공유적으로 부착될 수 있다. 링커 또는 스페이서 요소의 다른 말단은 아미노산 또는 펩타이드 링커에 부착될 수 있다.
따라서, 이러한 접합체가 보체의 존재하에 항원에 결합될 때, 작용제를 링커에 부착시키는 아마이드 또는 에스터 결합이 절단되어 작용제가 활성 형태로 방출될 것이다. 이러한 접합체는 대상체에 투여될 때 표적 부위에서 작용제의 전달 및 방출을 달성할 것이며, 표 3에 있는 것에 제시된 바와 같지만 이들로 제한되지 않는 약제학적 작용제, 항생제, 항대사물질, 항증식제 등의 생체내 전달에 특히 효과적이다.
보체 활성화 없이 방출하기 위한 링커: 표적화된 전달의 또 다른 적용에서, 보체 캐스케이드의 활성화는 궁극적으로 표적 세포를 용해시킬 것이기 때문에 보체 활성화 없이 작용제를 방출하는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 접근법은 작용제의 전달 및 방출이 표적 세포를 죽이지 않고 달성되어야 하는 경우에 유용하다. 이는 호르몬, 효소, 코르티코스테로이드, 신경전달물질, 유전자 또는 효소와 같은 세포 매개체를 표적 세포에 전달하고자 하는 경우에 바람직하다. 이러한 접합체는 혈청 프로테이스에 의한 절단에 약간 민감한 링커를 통해 보체를 활성화할 수 없는 AB에 작용제를 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 접합체가 개체에 투여될 때, 항원-항체 복합체가 빠르게 형성되는 반면, 작용제의 절단은 느리게 발생하여 표적 부위에서 화합물이 방출될 것이다.
생화학적 가교 링커: 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 소정의 생화학적 가교-링커를 사용하여 하나 이상의 치료제에 접합될 수 있다. 가교-연결 시약은 2개의 상이한 분자의 작용기를 함께 묶는 분자 브리지를 형성한다. 단계적 방식으로 2개의 상이한 단백질을 연결하기 위해, 원치않는 단일중합체 형성을 제거하는 이종-이작용성 가교-연결제가 사용될 수 있다.
라이소솜 프로테이스에 의해 절단 가능한 펩타이딜 링커, 예를 들어, Val-Cit, Val-Ala 또는 다른 다이펩타이드도 유용하다. 또한, 라이소솜의 낮은-pH 환경에서 절단 가능한 산에 불안정한 링커, 예를 들어, 비스-시알릴 에터가 사용될 수 있다. 다른 적합한 링커는 카텝신에 불안정한 기질, 특히 산성 pH에서 최적의 기능을 나타내는 것을 포함한다.
예시적인 이종-이작용성 가교-링커는 표 5에 언급되어 있다.
Figure pct00014
비-절단성 링커 또는 직접 부착: 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 접합체는 작용제가 표적에 전달되지만 방출되지 않도록 설계될 수 있다. 이는 비-절단성 링커에 직접 또는 이를 통해 작용제를 AB에 부착시킴으로써 달성될 수 있다.
이러한 비-절단성 링커는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 AB에 대한 부착에 후속적으로 사용될 수 있는 작용기를 포함하도록 변형될 수 있는 아미노산, 펩타이드, D-아미노산 또는 다른 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 유기 링커에 대한 일반 화학식은 다음과 같을 수 있다:
W-(CH2)n-Q
식 중,
W는 --NH--CH2-- 또는 --CH2--이고;
Q는 아미노산, 펩타이드이며; 그리고
n은 0 내지 20의 정수이다.
비-절단성 접합체: 일부 실시형태에서, 화합물은 보체를 활성화하지 않는 AB에 부착될 수 있다. 보체 활성화가 불가능한 AB를 사용하는 경우, 이러한 부착은 활성화된 보체에 의한 절단에 민감한 링커를 사용하거나 또는 활성화된 보체에 의한 절단에 민감하지 않은 링커를 사용하여 달성될 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체는 또한 면역리포솜으로서 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포솜은 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 향상된 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역-상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 수득하기 위해 정의된 기공 크기의 필터를 통하여 압출된다. 본 개시내용의 항체의 Fab' 단편은 이황화물-교환 반응을 통해 문헌[Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288(1982)]에 기재된 바와 같은 리포솜에 접합될 수 있다.
정의:
달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 용어 단수 형태의 개체는 하나 이상의 개체를 지칭한다. 예를 들어, 화합물은 하나 이상의 화합물을 지칭한다. 이와 같이, 용어 단수 형태, "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기법이 사용된다. 효소적 반응 및 정제 기법은 제조업체의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기법 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있는 종래의 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))] 참조. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 실험실 절차 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며 통상적으로 사용된다. 표준 기법이 화학적 합성, 화학적 분석, 약제 제조, 제형화 및 전달 및 환자의 치료에 사용된다.
본 개시내용에 따라 이용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, 하기 용어는 다음의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 특이적으로 결합하는(이와 면역반응하는) 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 지칭한다. "특이적으로 결합하는" 또는 "면역반응하는" 또는 "면역특이적으로 결합하는"은 항체가 목적하는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하며, 다른 폴리펩타이드와 반응하지 않거나 또는 매우 낮은 친화도(Kd>10-6)로 결합함을 의미한다. 항체는 다중클론, 단일클론, 키메라, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab 및 F(ab')2 단편, scFv 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50kDa 내지 70kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시-말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 일반적으로, 인간으로부터 얻어진 항체 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 클래스 중 임의의 것과 관련되며, 이는 분자 내에 존재하는 중쇄의 특성에 의해 서로 상이하다. 소정의 클래스는 IgG1, IgG2 등과 같은 하위클래스도 있다. 또한, 인간에서, 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"(mAb) 또는 "단일클론 항체 조성물"은 고유한 경쇄 유전자 산물 및 고유한 중쇄 유전자 산물로 구성된 항체 분자의 하나의 분자 종만을 포함하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 특히, 단일클론 항체의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAB는 고유한 결합 친화도를 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다.
용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 일부"는 항원 결합에 관여하는 면역글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내에서 3개의 고도로 분기된 스트레치는 "초가변 영역"으로 지칭되며, "프레임워크 영역" 또는 "FR"로 공지된 보다 보존된 측면에 있는 스트레치 사이에 삽입되어 있다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 내의 초가변 영역 사이에, 그리고 이에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 항원-결합 표면을 형성하기 위해 3차원 공간에서 서로에 대해 배치된다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이고, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 면역학적 관심 단백질의 카바트(Kabat) 서열(문헌[National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 and 1991)]) 또는 코티아(문헌[Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987), Chothia et al. Nature 342:878-883(1989)])의 정의에 따른다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 면역글로불린, scFv 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 예를 들어, 항체는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 펩타이드에 대해 생성될 수 있다. 항체는 해리 상수가 1μM 이하; 일부 실시형태에서, 100nM 이하, 및 일부 실시형태에서, 10nM 이하일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "특이적 결합", "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 특성"은 면역글로불린 분자와 면역글로불린이 특정 항원 사이에서 발생하는 유형의 비-공유 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(Kd)의 용어로 표현될 수 있되, 작은 Kd는 더 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩타이드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 수반하되, 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도 및 양쪽 방향의 속도에 동등하게 영향을 미치는 기하학적 매개변수에 의존한다. 따라서, "온 속도 상수"(K온) 및 "오프 속도 상수"(K오프)는 모두 회합 및 해리의 농도 및 실제 속도를 계산함으로써 결정될 수 있다. (문헌[Nature 361:186-87(1993)] 참조). K오프/K온의 비는 친화도와 관련없는 모든 매개변수의 상쇄를 가능하게 하고, 해리 상수 Kd와 동일하다. (일반적으로, 문헌[Davies et al.(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 개시내용의 항체는 방사성 리간드 결합 검정 또는 당업자에게 공지된 유사한 검정과 같은 검정에 의해 측정된 바와 같이, 결합 상수(Kd)가 1μM 이하, 일부 실시형태에서 100nM 이하, 일부 실시형태에서 10nM 이하, 및 일부 실시형태에서 100pM 내지 약 1pM일 때, 표적에 특이적으로 결합한다고 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 일부 조합물을 의미할 것이며, 그 기원으로 인해 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 (1) "단리된 폴리뉴클레오타이드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 관련되지 않거나, (2) 자연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되거나 또는 (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 나타낸 중쇄 면역글로불린 분자를 암호화하는 핵산 분자 및 본 명세서에 나타낸 경쇄 면역글로불린 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에서 언급되는 용어 "단리된 단백질"은 cDNA, 재조합 RNA 또는 합성 기원의 단백질 또는 이들의 일부 조합물을 의미하며, 그 기원 또는 유도체의 공급원으로 인해 "단리된 단백질"은 (1) 자연에서 발견되는 단백질과 관련되지 않거나, (2) 동일한 공급원으로부터 유래된 다른 단백질이 없는, 예를 들어, 뮤린 단백질이 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는다.
용어 "폴리펩타이드"는 폴리펩타이드 서열의 천연 단백질, 단편 또는 유사체를 지칭하는 일반 용어로서 본 명세서에서 사용된다. 따라서, 천연 단백질 단편 및 유사체는 폴리펩타이드 속의 종이다. 본 개시내용에 따른 폴리펩타이드는 본 명세서에 나타낸 중쇄 면역글로불린 분자 및 본 명세서에 나타낸 경쇄 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 카파 경쇄 면역글로불린 분자 및 그 반대의 경우뿐만 아니라 이들의 단편 및 유사체와 같은 중쇄 면역글로불린 분자와 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합에 의해 형성된 항체 분자를 포함한다.
하나의 대상에 적용되는 바와 같이 본 명세서에서 사용되는 용어 "자연-발생적"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 인간에 의해 실험실 또는 다른 곳에서 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 자연-발생적이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 구성 요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 구성 요소의 위치를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 상용성인 조건하에 달성되는 그러한 방식으로 결찰된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조절 서열"은 그것이 결찰된 코딩 서열의 발현 및 처리를 달성하는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이러한 조절 서열의 특성은 원핵생물에서 숙주 유기체에 따라 상이하며, 이러한 조절 서열은 일반적으로 진핵생물에서 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고, 일반적으로 이러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소한 그 존재가 발현 및 처리에 필수적인 모든 구성 요소를 포함하는 것으로 의도되고, 그 존재가 유리한 추가적인 구성 요소, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다. 본 명세서에서 언급된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 이들 중 한 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태인 적어도 10개의 염기 길이의 뉴클레오타이드를 의미한다. 용어는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
본 명세서에서 언급된 용어 올리고뉴클레오타이드는 자연 발생적 및 비-자연 발생적 올리고뉴클레오타이드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생적 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 200개 이하의 염기 길이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서브세트이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 10개 내지 60개의 염기 길이이고, 일부 실시형태에서, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 내지 40개의 염기 길이이다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로, 예를 들어, 프로브를 위해서는 단일 가닥이지만, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 유전자 돌연변이체의 구축에 사용하기 위해서는 이중 가닥일 수 있다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 하나이다.
본 명세서에서 언급된 용어 "자연 발생적 뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 언급된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 변형되거나 치환된 당기 등을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 언급된 용어 "올리고뉴클레오타이드 연결"은 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포르아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오타이드 연결을 포함한다. 예를 들어, 문헌[LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)] 참조. 올리고뉴클레오타이드는 원한다면 검출을 위한 표지를 포함할 수 있다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 20개의 전통적인 아미노산 및 이의 약어는 관용적인 용법을 따른다. 문헌[Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))] 참조. 20개의 전통적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산), α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산과 같은 비천연 아미노산 및 기타 비전통적인 아미노산이 또한 본 개시내용의 폴리펩타이드에 대한 적합한 구성 요소일 수 있다. 비전통적인 아미노산의 예는 4 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트라이메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 폴리펩타이드 표기에서, 표준 용법 및 관습에 따라서 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른쪽 방향은 카복시-말단 방향이다.
유사하게는, 달리 명시되지 않는 한, 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고, 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3' 첨가의 방향은 전사 방향으로 지칭되고, RNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5' 말단을 향한 5'인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로 지칭되며, RNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 3' 말단을 향한 3'인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로 지칭된다.
폴리펩타이드에 적용되는 바와 같이, 용어 "실질적인 동일성"은 2개의 펩타이드 서열이, 디폴트 갭 가중을 사용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우, 적어도 80 퍼센트 서열 동일성, 일부 실시형태에서, 적어도 90 퍼센트 서열 동일성, 일부 실시형태에서, 적어도 95 퍼센트 서열 동일성 및 일부 실시형태에서, 적어도 99 퍼센트 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 따라 상이하다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에서의 경미한 변화는 본 개시내용에 포함되는 것으로 상정되되, 아미노산 서열에서의 변화는 적어도 75%, 일부 실시형태에서, 적어도 80%, 90%, 95% 및 일부 실시형태에서, 99%를 유지한다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 상정된다. 보존적 대체는 측쇄와 관련된 아미노산의 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 다음의 패밀리로 나뉜다: (1) 산성 아미노산은 아스파테이트, 글루타메이트이고; (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 (4) 비하전된 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 타이로신 및 발린을 포함한다. 다른 아미노산 패밀리는 (i) 지방족-하이드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아마이드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함한다. 예를 들어, 류신을 아이소류신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로의 단리된 대체 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체는 특히 대체가 프레임워크 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는 경우 생성된 분자의 결합 또는 특성에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 펩타이드를 초래하는지 여부는 폴리펩타이드 유도체의 특정 활성을 검정함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 검정은 본 명세서에 상세히 기재되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 적합한 아미노-말단 및 카복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공개 또는 독점적 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 컴퓨터화된 비교 방법은 공지의 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 형태 도메인을 확인하는데 사용된다. 공지된 3차원 구조로 폴딩된 단백질 서열을 확인하기 위한 방법은 공지되어 있다. 문헌[Bowie et al. Science 253:164(1991)]. 따라서, 전술한 예는 당업자가 본 개시내용에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 정의하기 위해 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태를 인식할 수 있음을 보여준다.
적합한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 단백질 복합체 형성에 대한 결합 친화도를 변화시키고, (4) 결합 친화도를 변화시키며, (5) 기타 이러한 유사체의 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것들이다. 유사체는 자연-발생적 펩타이드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인(mutein)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)은 자연-발생적 서열에서(예를 들어, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩타이드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키면 안된다(예를 들어, 대체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나 또는 모 서열을 특징짓는 다른 유형의 2차 구조를 파괴하지 않아야 함). 당업계에서 인식된 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et at. Nature 354:105 (1991)]에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카복시-말단 결실 및/또는 하나 이상의 내부 결실(들)을 갖지만, 나머지 아미노산 서열이 예를 들어, 전장 cDNA 서열로부터 추론된 자연-발생적 서열의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩타이드를 지칭한다. 단편은 전형적으로 적어도 5개, 6개, 8개 또는 10개의 아미노산 길이, 일부 실시형태에서, 적어도 14개의 아미노산 길이, 일부 실시형태에서, 적어도 20개의 아미노산 길이, 일반적으로 적어도 50개의 아미노산 길이 및 일부 실시형태에서, 적어도 70개의 아미노산 길이이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유사체"는 추론된 아미노산 서열의 일부와 실질적으로 동일하고 적합한 결합 조건하에 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 25개 아미노산의 세그먼트로 구성되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩타이드 유사체는 자연-발생적 서열에 대하여 보존적 아미노산 치환(또는 첨가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 적어도 20개의 아미노산 길이, 일부 실시형태에서, 적어도 50개의 아미노산 길이 이상이며, 종종 전장의 자연-발생적 폴리펩타이드의 길이만큼 길 수 있다.
용어 "작용제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로 제조된 추출물을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "표지" 또는 "표지된"은 마킹된 아비딘(예를 들어, 형광 마커 또는 광학 또는 열량 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 모이어티의 폴리펩타이드에, 예를 들어, 방사성 표지된 아미노산의 혼입 또는 부착에 의한 검출 가능한 마커의 혼입을 지칭한다. 소정의 상황에서, 표지 또는 마커는 또한 치료적일 수 있다. 폴리펩타이드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소적 표지(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스, p-갈락토시데이스, 루시퍼레이스, 알칼리 포스파테이스), 화학발광, 바이오티닐기, 2차 리포터에 의해서 인식되는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 실시형태에서, 표지는 잠재적인 입체장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암(arm)에 의해 부착된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 작용제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여될 때 목적하는 치료적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
본 명세서에서 다른 화학 용어는 문헌[The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 예시된 바와 같이 당업계에서의 관용적인 용법에 따라 사용된다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 대상 종이 존재하는 우세한 종이라는 것을 의미하며(즉, 몰 기준으로, 조성물에서 그것이 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부함), 일부 실시형태에서, 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종에서 적어도 약 50 퍼센트(몰 기준으로)를 차지하는 조성물이다.
일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80 퍼센트 초과, 일부 실시형태에서, 약 85%, 90%, 95% 및 99% 초과를 차지할 것이다. 일부 실시형태에서, 대상 종은 본질적인 균질성(오염 종이 종래의 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음)까지 정제되되, 조성물은 단일 거대분자 종으로 본질적으로 구성된다.
용어 환자는 인간 및 수의 대상체를 포함한다.
본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 주어진 표적, 예를 들어, 인간 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 또한, 본 명세서에 기재된 활성화 가능한 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 활성화 가능한 항체가 본 개시내용에 포함된다.
당업자는 과도한 실험 없이 단일클론 항체(예를 들어, 뮤린 단일클론 또는 인간화된 항체)가 본 명세서에 기재된 방법에 사용된 단일클론 항체가 표적에 결합하는 것을 방지하는지 여부를 확인함으로써, 단일 클론 항체가 본 명세서에 기재된 방법에 사용된 단일클론 항체와 동일한 특이성을 갖는지 여부를 결정할 수 있음을 인식할 것이다. 테스트되는 단일클론 항체가 본 개시내용의 단일클론 항체에 의한 결합의 감소로 나타낸 바와 같이 본 개시내용의 단일클론 항체와 경쟁한다면, 2개의 단일클론 항체는 동일한 또는 밀접하게 관련된 에피토프에 결합한다. 단일클론 항체가 본 개시내용의 단일클론 항체의 특이성을 갖는지 여부를 결정하는 방법은 본 개시내용의 단일클론 항체를 표적과 함께 사전 인큐베이션한 다음, 테스트되는 단일클론 항체를 추가하여 표적에 결합하는 능력이 저해되었는지 여부를 결정하는 것이다. 테스트되는 단일클론 항체가 저해된다면, 모든 가능성에서, 그것은 본 개시내용의 단일클론 항체와 동일하거나 또는 기능적으로 동등한 에피토프 특이성을 갖는다.
다중 특이적 활성화 가능한 항체
본 개시내용은 또한 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 제공한다. 본 명세서에서 제공된 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하고, MM의 커플링이 표적에 결합하는 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인의 능력을 감소시키도록 다중 특이적 항체의 적어도 하나의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인에 연결된 적어도 하나의 차폐 모이어티(MM)를 포함하는 다중 특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, MM은 적어도 하나의 MMP 프로테이스 및 적어도 하나의 SP에 대한 기질로서 기능하는 CM1-CM2 기질을 통해 다중 특이적 항체의 항원-결합 도메인 또는 에피토프-결합 도메인에 결합된다. 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 다중 특이적 항체는 순환계에서 안정하고, 요법 및/또는 진단의 의도된 부위에서 활성화되지만 정상, 즉, 건강한 조직에서는 활성화되지 않으며, 활성화될 때, 상응하는 비변형된 다중 특이적 항체와 적어도 유사한 표적에 대한 결합을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 면역 효과기 세포가 관여하도록 설계되며, 본 명세서에서 면역-효과기 세포 관여(engaging) 다중 특이적 활성화 가능한 항체로도 지칭된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 백혈구가 관여하도록 설계되며, 본 명세서에서 백혈구 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체로도 지칭된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 T 세포가 관여하도록 설계되며, 본 명세서에서 T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체로도 지칭된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 백혈구, 예컨대 T 세포, 천연 살해(NK) 세포, 골수성 단핵 세포, 대식세포 및/또는 다른 면역 효과기 세포 상에 표면 항원을 관여시킨다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 백혈구이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 골수성 단핵 세포와 같은 단핵 세포이다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 표적 및/또는 하나 이상의 에피토프에 결합하거나 또는 그렇지 않으면 이들과 상호작용하도록 설계되며, 본 명세서에서 다중-항원 표적화 활성화 가능한 항체로도 지칭된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "표적" 및 "항원"은 상호교환적으로 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 면역 효과기 세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 면역 효과기 세포 관여 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하되, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 면역 효과기 세포 관여 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 면역 효과기 세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 면역 효과기 세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 비-면역 효과기 세포 관여 항체는 암 표적화 항체이다. 일부 실시형태에서, 비-면역 세포 효과기 항체는 IgG이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포 관여 항체는 scFv이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체(예를 들어, 비-면역 세포 효과기 항체)는 IgG이고, 면역 효과기 세포 관여 항체는 scFv이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 백혈구이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 골수성 단핵 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 T-세포 관여 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하되, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 T-세포 관여 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, T-세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 T-세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, T-세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 T-세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 T-세포 관여 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하되, 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 T-세포 관여 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, T-세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 T-세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, T-세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 T-세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 T-세포 관여 scFv를 포함하되, 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 T-세포 관여 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, T-세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 T-세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, T-세포 관여 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 T-세포 관여 표적에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 제1 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
면역 효과기 세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 일부 실시형태에서, 한 항원은 전형적으로 EGFR, erbB2, EpCAM, 재그드, PD-L1, B7H3 또는 CD71(트랜스페린 수용체)과 같지만 이들로 제한되지 않는 표 1에 열거된 임의의 표적과 같지만 이들로 제한되지 않는 종양 세포 또는 질환과 관련된 다른 세포 유형의 표면에 존재하는 항원이며, 다른 항원은 전형적으로 B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 또는 VISTA와 같지만 이들로 제한되지 않는 T-세포, 천연 살해(NK) 세포, 골수성 단핵 세포, 대식세포 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면에 존재하는 자극 수용체 또는 저해 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원은 T 세포 또는 NK 세포의 표면에 존재하는 자극 수용체이며; 이러한 자극 수용체의 예는 CD3, CD27, CD28, CD137(4-1BB로도 지칭됨), GITR, HVEM, ICOS, NKG2D 및 OX40을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원은 T-세포의 표면에 존재하는 저해 수용체이며; 이러한 저해 수용체의 예는 BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3 및 NK-발현된 KIR을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. T-세포 표면 항원에 특이성을 부여하는 항체 도메인은 또한 B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2 또는 TNFSF9와 같지만 이들로 제한되지 않는 T-세포 수용체, NK-세포 수용체, 대식세포 수용체 및/또는 다른 면역 효과기 세포 수용체에 결합하는 리간드 또는 리간드 도메인에 의해 치환될 수 있다.
본 개시내용의 일 실시형태는 암 미세환경에서 활성화 가능하고, 종양 표적에 대해 지시된 항체, 예를 들어, IgG 또는 scFv 및 활성화된 T 세포 또는 NK 세포의 표면에 발현된 공-자극 수용체에 대해 지시된 효능제 항체, 예를 들어, IgG 또는 scFv를 포함하는 다중 특이적 활성화 가능한 항체이되, 암 표적 항체 및/또는 효능제 항체 중 적어도 하나는 차폐된다. 공-자극 수용체의 예는 CD27, CD137, GITR, HVEM, NKG2D 및 OX40을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이 실시형태에서, 일단 종양-관련 프로테이스에 의해 활성화되면, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 내인성 T 세포 항원 또는 NK-활성화 수용체를 통해 임의의 종양 항원에 반응하는 T 세포의 활성을 향상시키기 위해 종양-의존적 방식으로 T 세포 또는 NK 세포 발현된 공-자극 수용체를 효과적으로 가교 또는 활성화할 것이다. 이러한 T 세포 또는 NK 세포 공자극 수용체의 활성화-의존적 특성은 항원 특이성과 무관하게 모든 T 세포를 활성화하지 않으면서 활성화된 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 활성을 종양-특이적 T 세포에 집중시킬 것이다. 일 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 적어도 공-자극 수용체 항체는 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 종양 표적-지시된 항체에 의해 인식된 항원을 또한 발현하지만, 공동-수용체 관여의 부족으로 인해 활성이 제한된 조직에 존재할 수 있는 자가-반응성 T 세포의 활성화를 방지하기 위해 차폐된다.
본 개시내용의 한 실시형태는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 미세환경과 같지만 이들로 제한되지 않는 T 세포 과자극을 특징으로 하는 질환에서 활성화 가능한 다중 특이적 활성화 가능한 항체이다. 이러한 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 항체, 예를 들어, 자가면역 또는 염증성 질환에서 T 세포에 의해 표적화된 조직에서 발현되는 표면 항원을 포함하는 표적에 대해 지시된 항체, 예를 들어, IgG 또는 scFv 및 T 세포 또는 NK 세포의 표면에 발현된 저해 수용체에 대해 지시된 항체, 예를 들어 IgG 또는 scFv를 포함하되, 질환 조직 표적 항체 및/또는 T 세포 저해 수용체 항체 중 적어도 하나는 차폐된다. 저해 수용체의 예는 BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3 및 NK-발현된 KIR을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 자가면역 질환에서 T 세포에 의해 표적화된 조직 항원의 예는 다발성 경화증에서 마이엘린 또는 신경 세포에서 발현된 표면 항원 또는 제1형 당뇨병에서 췌도 세포에서 발현된 표면 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이 실시형태에서, 자가면역 공격 또는 염증하에 조직에 국재화될 때, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 활성화되고, 내인성 TCR 또는 활성화 수용체를 통해 임의의 질환 조직-표적화된 항원에 반응하는 자가반응성 T 세포의 활성을 억제하기 위해 T 세포 또는 NK 세포 저해 수용체를 공동-관여시킨다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 또는 다수의 항체가 표적 항원이 또한 발현될 수 있는 비-질환 조직에서 T 세포 반응의 억제를 방지하기 위해 차폐된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 항-CD3 엡실론(CD3ε, 본 명세서에서 CD3ε 및 CD3으로도 지칭됨) scFv 및 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하되, 항-CD3ε scFv 및/또는 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, CD3ε scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, CD3ε scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 항-CD3ε scFv 및 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하되, 항-CD3ε scFv 및/또는 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, CD3ε scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, CD3ε scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 항-CD3ε scFv 및 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하되, 항-CD3ε scFv 및/또는 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, CD3ε scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, CD3ε scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 암 표적화 항체 IgG 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 OKT3으로부터 유래된 항-CD3 엡실론(CD3ε) scFv를 포함하되, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv 및 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하되, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv 및/또는 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 암 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv 및 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하되, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv 및/또는 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 암 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3-유래 scFv는 CD3ε에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CD3ε에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 암 표적화 항체 IgG 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 암-관련 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 암-관련 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 항-CTLA-4 scFv를 포함하되, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 항-CTLA-4 scFv 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 scFv는 CTLA-4에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CTLA-4에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 scFv는 CTLA-4에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CTLA-4에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 표적화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 항-CTLA-4 scFv 및 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하되, 항-CTLA-4 scFv 및/또는 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 적어도 하나는 차폐된다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 scFv는 CTLA-4에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CTLA-4에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 표적화 IgG 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 scFv는 CTLA-4에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1)을 포함하되, AB1은 MM1의 커플링이 CTLA-4에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 부착되고, 표적화 항체 IgG 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 표적에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 2차 항체 또는 이의 단편을 포함하되, AB2는 MM2의 커플링이 제2 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM2)에 부착된다.
일부 실시형태에서, 다중-항원 표적화 항체 및/또는 다중-항원 표적화 활성화 가능한 항체는 제1 표적 및/또는 제1 에피토프에 결합하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 제2 표적 및/또는 제2 에피토프에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중-항원 표적화 항체 및/또는 다중-항원 표적화 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 다중-항원 표적화 항체 및/또는 다중-항원 표적화 활성화 가능한 항체는 동일한 표적 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 다중-항원 표적화 항체 및/또는 다중-항원 표적화 활성화 가능한 항체는 동일한 표적 상의 2개 이상의 상이한 표적 및 2개 이상의 상이한 에피토프의 조합에 결합한다.
일부 실시형태에서, IgG를 포함하는 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 차폐된 IgG 가변 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, scFv를 포함하는 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 차폐된 scFv 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인을 모두 갖되, IgG 가변 도메인 중 적어도 하나는 차폐 모이어티에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인을 모두 갖되, scFv 도메인 중 적어도 하나는 차폐 모이어티에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인을 모두 갖되, IgG 가변 도메인 중 적어도 하나는 차폐 모이어티에 커플링되고, scFv 도메인 중 적어도 하나는 차폐 모이어티에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인 모두를 갖되, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인 각각은 이들 자신의 차폐 모이어티에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체 중 하나의 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지며, 다른 항체 도메인은 T-세포 표면 항원에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체 중 하나의 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지며, 다른 항체 도메인은 다른 표적 항원에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체 중 하나의 항체 도메인은 표적 항원의 에피토프에 대한 특이성을 가지며, 다른 항체 도메인 표적 항원의 다른 에피토프에 대한 특이성을 갖는다.
다중 특이적 활성화 가능한 항체에서, scFv는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄의 카복실 말단, IgG 활성화 가능한 항체의 경쇄의 카복실 말단 또는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 카복실 말단에 융합될 수 있다. 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서, scFv는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄의 아미노 말단, IgG 활성화 가능한 항체의 경쇄의 아미노 말단 또는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 아미노 말단에 융합될 수 있다. 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서, scFv는 IgG 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 카복실 말단 및 하나 이상의 아미노 말단의 임의의 조합에 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질에 연결된 차폐 모이어티(MM)는 IgG의 항원 결합 도메인에 부착되어 이를 차폐한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질에 연결된 차폐 모이어티(MM)는 적어도 하나의 scFv의 항원 결합 도메인에 부착되어 이를 차폐한다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질에 연결된 차폐 모이어티(MM)는 IgG의 항원 결합 도메인에 부착되어 이를 차폐하고, CM1-CM2 기질에 연결된 차폐 모이어티(MM)는 적어도 하나의 scFv의 항원 결합 도메인에 부착되어 이를 차폐한다.
본 개시내용은 다음 (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2; (MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; 또는 (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2 를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다중 특이적 활성화 가능한 항체 구조의 예를 제공하되, VL 및 VH는 IgG에 포함된 제1 특이성의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 나타내고; VL* 및 VH*는 scFv에 포함된 제2 특이성의 가변 도메인을 나타내며; LP1은 차폐 모이어티(MM)와 CM1-CM2 기질을 연결하는 링커 펩타이드이고; LP2는 CM1-CM2 기질과 항체를 연결하는 링커 펩타이드이며; L3은 scFv의 가변 도메인을 연결하는 링커 펩타이드이고; L4는 제1 특이성의 항체를 제2 특이성의 항체에 연결하는 링커 펩타이드이며; CL은 경쇄-사슬 불변 도메인이고; CH1, CH2, CH3은 중쇄 불변 도메인이다. 제1 특이성 및 제2 특이성은 임의의 항원 또는 에피토프에 대한 것일 수 있다.
T-세포 관여 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 일부 실시형태에서, 한 항원은 전형적으로 종양 세포 또는 EGFR, erbB2, EpCAM, 재그드, PD-L1, B7H3 또는 CD71(트랜스페린 수용체)과 같지만 이들로 제한되지 않는 표 1에 열거된 임의의 표적과 같지만 이들로 제한되지 않는 질환과 관련된 기타 세포 유형의 표면에 존재하는 항원이며, 다른 항원은 전형적으로 T-세포, 천연 살해(NK) 세포, 골수성 단핵 세포, 대식세포 및/또는 B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137(TNFRSF9로도 지칭됨), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 또는 VISTA와 같지만 이들로 제한되지 않는 다른 면역 효과기 세포의 표면에 존재하는 자극(본 명세서에서 활성화로도 지칭됨) 또는 저해 수용체이다. T-세포 표면 항원에 특이성을 부여하는 항체 도메인은 또한 T-세포 수용체, NK-세포 수용체, 대식세포 수용체 및/또는 B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2 또는 TNFSF9와 같지만 이들로 제한되지 않는 다른 면역 효과기 세포 수용체에 결합하는 리간드 또는 리간드 도메인에 의해 치환될 수 있다. 다중-항원 표적화 활성화 가능한 항체의 일부 실시형태에서, 한 항원은 표 1에 열거된 표적의 군으로부터 선택되고, 다른 항원은 표 1에 열거된 표적의 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 표적화 항체는 항-EGFR 항체이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체는 EGFR과의 결합에 특이적인 C225v5이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체는 EGFR과의 결합에 특이적인 C225이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체는 EGFR과의 결합에 특이적인 C225v4이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체는 EGFR과의 결합에 특이적인 C225v6이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체는 항-재그드 항체이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체는 인간 및 마우스 재그드 1 및 재그드 2와의 결합에 특이적인 4D11이다. 일부 실시형태에서, 표적화 항체는 인간 및 마우스 재그드 1 및 재그드 2와의 결합에 특이적인 4D11v2이다.
일부 실시형태에서, 표적화 항체는 활성화 가능한 항체의 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, scFv(들)는 전구-scFv(예를 들어, WO　2009/025846, WO 2010/081173 참조)의 형태일 수 있다.
일부 실시형태에서, scFv는 CD3ε과의 결합에 특이적이고, CD3ε에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, CH2527, FN18, H2C, OKT3, 2C11, UCHT1 또는 V9이거나 또는 이들로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, scFv는 CTLA-4(본 명세서에서 CTLA 및 CTLA4로도 지칭됨)와의 결합에 특이적이다.
일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 scFv는 다음 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00015
일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 scFv는 서열번호　347의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD3ε scFv는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00016
일부 실시형태에서, 항-CD3ε scFv는 서열번호　349의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, scFv는 하나 이상의 T-세포, 하나 이상의 NK-세포 및/또는 하나 이상의 대식세포와의 결합에 대해 특이적이다. 일부 실시형태에서, scFv는 B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 또는 VISTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적과의 결합에 대해 특이적이다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 또한 AB에 접합된 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 치료제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 항신생물제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 독소 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 링커를 통해 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 절단성 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 적어도 하나의 CM1-CM2 기질 서열을 포함하는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 비-절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 미세소관 저해제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DNA 알킬화제 또는 DNA 삽입제 또는 기타 DNA 손상제와 같은 핵산 손상제이다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 표 4에 열거된 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 듀오카마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀 이량체이다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 또한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 모이어티는 진단제이다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 자연적으로 하나 이상의 이황화물 결합을 함유한다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 이황화물 결합을 포함하도록 조작될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라 이러한 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 세포를 배양함으로써 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 생산하는 방법을 제공하되, 세포는 이러한 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 이러한 벡터를 포함한다.
본 개시내용은 또한 (a) 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 (b) 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계에 의해 본 개시내용의 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 제1 표적 또는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1) 및 제2 표적 또는 제2 에피토프에 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함하는 다중 특이적 활성화 가능한 항체 및/또는 다중 특이적 활성화 가능한 항체 조성물을 제공하되, 적어도 AB1은 MM1의 커플링이 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키도록 차폐 모이어티(MM1)에 커플링되거나 또는 그렇지 않으면 부착된다. 일부 실시형태에서, MM1은 MMP 및 SP에 대한 CM1-CM2 기질을 통해 AB1에 커플링되되, MMP 및 SP 중 적어도 하나는 대상체의 치료 부위 또는 진단적 부위에서 AB1의 표적과 공동-국재화된다. 본 명세서에서 제공된 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 순환계에서 안정하고, 요법 및/또는 진단의 의도된 부위에서 활성화되지만 정상, 즉, 건강한 조직에서는 활성화되지 않으며, 활성화될 때 상응하는 비변형된 다중 특이적 항체와 적어도 유사한 AB1의 표적에 대한 결합을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 MM1 및 CM1-CM2 기질 사이에 연결 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질 및 AB1 사이에 연결 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 제1 연결 펩타이드(LP1) 및 제2 연결 펩타이드(LP2)를 포함하며, 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM1-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-AB1 또는 AB1-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM1. 일부 실시형태에서, 2개의 연결 펩타이드 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(서열번호　381) 및 (GGGS)n(서열번호　382)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하되, n은 적어도 1의 정수이다. 일부 실시형태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 GGSG(서열번호　383), GGSGG(서열번호　384), GSGSG(서열번호　385), GSGGG(서열번호　386), GGGSG(서열번호　387) 및 GSSSG(서열번호　388)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 연결 펩타이드(LP')를 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 제1 연결 펩타이드(LP1), 제2 연결 펩타이드(LP2) 및 연결 펩타이드(LP')를 포함하고, 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM1-LP1-CM1-CM2 기질-LP2-AB1 또는 AB1-LP2-CM1-CM2 기질-LP1-MM1. 일부 실시형태에서, 연결 펩타이드 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, LP'는 GG이다. 일부 실시형태에서, LP'는 GGSGGS(서열번호 218)이다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 제1 표적 또는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 1차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB1) 및 제2 표적 또는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 단편(AB2)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 AB 각각은 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 AB 각각은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 키메라, 인간화된 또는 완전 인간 단일클론 항체이다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 AB 각각은 상응하는 표적 또는 에피토프에 결합하기 위한 해리 상수가 약 100nM 이하이다.
일부 실시형태에서, MM1은 상응하는 AB에 결합하기 위한 해리 상수가 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수보다 크다.
일부 실시형태에서, MM1은 상응하는 AB에 결합하기 위한 해리 상수가 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수보다 크지 않다.
일부 실시형태에서, MM1은 다중 특이적 활성화 가능한 항체가 절단된 상태인 경우 상응하는 표적 또는 에피토프와 결합하기 위한 상응하는 AB를 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다.
일부 실시형태에서, MM1은 약 2개 내지 40개의 아미노산 길이인 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 40개의 아미노산 길이 이하인 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, MM1은 상응하는 AB의 표적의 것과 상이한 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, MM1은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 50% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, MM1은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 25% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, MM1은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 10% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링될 때 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 20배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링될 때 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 40배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소킨다.
일부 실시형태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링될 때 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 100배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링될 때 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 1000배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링될 때 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 10,000배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, MM1은 본 명세서에 개시된 MM으로부터 선택되는 아미노산 서열이다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 다중 특이적 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태인 경우 그 표적에 대한 AB2의 결합을 저해하는 적어도 제2 차폐 모이어티(MM2) 및 AB2에 커플링된 추가적인 절단성 모이어티(CM')를 포함하되, CM'는 제2 프로테이스에 대한 기질로서 기능하는 CM1-CM2 기질 또는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CM'는 15개의 아미노산 길이 이하인 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CM'는 CM1-CM2 기질이되, CM1-CM2 기질에서 CM1 및 CM2 각각은 독립적으로 15개의 아미노산 길이 이하이다.
일부 실시형태에서, MMP 프로테이스, SP 프로테이스 및/또는 제2 프로테이스는 조직에서 제2 표적 또는 에피토프와 공동-국재화되되, MMP 프로테이스, SP 프로테이스 및/또는 제2 프로테이스는 다중 특이적 활성화 가능한 항체가 MMP 프로테이스, SP 프로테이스 및/또는 제2 프로테이스에 노출될 때 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 CM'를 절단한다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스, SP 프로테이스 및/또는 제2 프로테이스는 조직에서 제1 표적 또는 에피토프 및 제2 표적 또는 에피토프와 함께 공동-국재화된다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스, SP 프로테이스 및/또는 제2 프로테이스는 동일한 MMP 프로테이스 및 동일한 SP 프로테이스이다. 일부 실시형태에서, MMP 프로테이스, SP 프로테이스 및/또는 제2 프로테이스는 동일하지 않은 MMP 프로테이스 및 동일하지 않은 SP 프로테이스이다. 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질 및 CM'는 동일한 MMP 프로테이스 및 동일한 SP 프로테이스에 대한 상이한 기질이다. 일부 실시형태에서, CM'를 절단하는 프로테이스는 표 6에 나타낸 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체, 예를 들어, MM1 및 적어도 MM2에서 MM 각각은 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수보다 큰 상응하는 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수 이하인 상응하는 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 다중 특이적 활성화 가능한 항체가 절단된 상태인 경우 상응하는 표적 또는 에피토프에 결합하기 위한 상응하는 AB를 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 약 2개 내지 40개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 40개의 아미노산 길이 이하의 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 상응하는 AB의 표적의 것과 상이한 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 50% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 25% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 MM 각각은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 10% 이하 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 각각의 MM의 커플링은, MM에 커플링될 때 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 20배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 각각의 MM의 커플링은, MM에 커플링되는 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 40배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 각각의 MM의 커플링은, MM에 커플링되는 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 100배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 각각의 MM의 커플링은, MM에 커플링되는 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 1000배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 각각의 MM의 커플링은, MM에 커플링되는 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않은 경우 그 상응하는 표적 또는 에피토프에 대한 AB의 Kd보다 적어도 10,000배 더 크도록, 그 표적 또는 에피토프에 결합하는 상응하는 AB의 능력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 각각의 MM은 본 명세서에 개시된 MM으로부터 선택되는 아미노산 서열이다.
일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질 서열을 절단하는 프로테이스는 조직의 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 AB1의 표적과 함께 공동-국재화되며, MMP 프로테이스 및/또는 SP 프로테이스, 즉, MMP 프로테이스 및 SP 프로테이스 중 적어도 하나는 다중 특이적 활성화 가능한 항체가 프로테이스에 노출될 때 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 CM1-CM2 기질 서열을 포함하며, 적어도 하나의 CM1-CM2 기질 서열을 절단하는 MMP 프로테이스 및/또는 SP 프로테이스는 조직의 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 AB 영역 중 적어도 하나의 표적과 공동-국재화되고, MMP 프로테이스 및/또는 SP 프로테이스는 다중 특이적 활성화 가능한 항체가 프로테이스에 노출될 때 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 2배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 3배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 4배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는, AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 5배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는, AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 10배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는, AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 20-배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는, AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는, AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 40-배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는, AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는, AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 50-배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는, AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는, AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 100-배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는, AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
일부 실시형태에서, 각각 CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는, AB 영역 중 하나의 표적에 대한 다중 특이적 활성화 가능한 항체의 결합이 그 표적에 대한 비변형된 AB의 결합의 해리 상수보다 적어도 200-배 더 큰 해리 상수로 일어나게 감소되는 반면, 절단된 상태에서는, AB가 그 표적에 결합하도록 다중 특이적 활성화 가능한 항체에 위치된다.
본 개시내용은 또한 적어도 표적에 특이적으로 결합하는 1차 항체 또는 항체 단편(AB1) 및 2차 항체 또는 항체 단편(AB2)을 포함하는 다중 특이적 활성화 가능한 항체를 포함하는 조성물 및 방법을 제공하되, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 적어도 제1 AB는 그 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM1)에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 각각의 AB는 상응하는 AB가 각각의 표적에 결합하는 능력을 감소시키는 MM에 커플링된다. 예를 들어, 이중 특이적 활성화 가능한 항체 실시형태에서, AB1은 그 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키는 제1 차폐 모이어티(MM1)에 커플링되고, AB2는 그 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키는 제2 차폐 모이어티(MM2)에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 AB 영역을 포함하며; 이러한 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 각각의 AB에 대해, AB1은 그 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키는 제1 차폐 모이어티(MM1)에 커플링되고, AB2는 그 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키는 제2 차폐 모이어티(MM2)에 커플링되며, AB3은 그 표적에 결합하는 AB3의 능력을 감소시키는 제3 차폐 모이어티(MM3)에 결합된다.
일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 MMP 프로테이스 및 SP 프로테이스에 대한 기질인 적어도 하나의 CM1-CM2 기질을 더 포함하되, CM1-CM2 기질은 MM을 AB에 연결한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 1차 항체 또는 항체 단편(AB1) 및 2차 항체 또는 항체 단편(AB2)을 포함하되, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 적어도 제1 AB는 제1 CM1-CM2 기질을 통해 그 표적에 결합하는 AB1의 능력을 감소시키는 차폐 모이어티(MM1)에 커플링된다. 일부 이중 특이적 활성화 가능한 항체 실시형태에서, AB1은 제1 CM1-CM2 기질을 통해 MM1에 커플링되고, AB2는 제2 CM1-CM2 기질을 통해 그 표적에 결합하는 AB2의 능력을 감소시키는 제2 차폐 모이어티(MM2)에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 AB 영역을 포함하며; 이러한 실시형태 중 일부에서, 다중 특이적 활성화 가능한 항체에서 각각의 AB에 대해, AB1은 제1 CM1-CM2 기질을 통해 MM1에 커플링되고, AB2는 제2 CM1-CM2 기질을 통해 MM2에 커플링되며, AB3은 제3 CM1-CM2 기질을 통해 그 표적에 결합하는 AB3의 능력을 감소시키는 제3 차폐 모이어티(MM3)에 커플링된다.
비-결합 입체 모이어티 또는 비-결합 입체 모이어티에 대한 결합 파트너를 갖는 활성화 가능한 항체
본 개시내용은 또한 비-결합 입체 모이어티(NB) 또는 비-결합 입체 모이어티에 대한 결합 파트너(BP)를 포함하는 활성화 가능한 항체를 제공하되, BP는 NB를 활성화 가능한 항체에 동원하거나 또는 그렇지 않으면 유인한다. 본 명세서에서 제공된 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 비-결합 입체 모이어티(NB), CM1-CM2 기질 및 표적에 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하는 활성화 가능한 항체; 비-결합 입체 모이어티(BP)에 대한 결합 파트너, CM1-CM2 기질 및 AB를 포함하는 활성화 가능한 항체; 및 NB가 동원된 BP, CM1-CM2 기질 및 표적에 결합하는 AB를 포함하는 활성화 가능한 항체를 포함한다. NB가 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질 및 AB에 공유적으로 연결되거나 또는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질 및 AB에 공유적으로 연결된 BP와의 상호작용에 의해 연결된 활성화 가능한 항체는 본 명세서에서 "NB-함유 활성화 가능한 항체"로 지칭된다. 활성화 가능한 또는 전환 가능한이란 활성화 가능한 항체가 저해, 차폐 또는 절단되지 않은 상태(즉, 제1 형태)에 있을 때 활성화 가능한 항체가 표적에 대한 제1 수준의 결합을 나타내고, 활성화 가능한 항체가 저해, 차폐 및/또는 절단되지 않은 상태(즉, 제2 형태, 즉, 활성화된 항체)에 있을 때 표적에 대한 제2 수준의 결합을 나타내는 것을 의미하되, 제2 수준의 표적 결합은 제1 수준의 표적 결합보다 크다. 활성화 가능한 항체 조성물은 종래의 항체 치료제와 비교하여 증가된 생체이용률 및 더 유리한 생체분포를 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 AB가 차폐되지 않았거나 또는 그렇지 않으면 이러한 부위에 대한 결합이 저해되지 않은 경우, 비-치료 부위 및/또는 비-진단적 부위에서의 결합으로 인해 발생할 수 있는 감소된 독성 및/또는 부작용을 제공한다.
일 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 비-결합 입체 모이어티(NB); CM1-CM2 기질; 및 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하되, NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩타이드이고; CM1-CM2 기질은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이며; CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않도록 위치되고; NB는 효소에 의한 CM1-CM2 기질의 절단을 저해하지 않는다. 본 명세서에서 그리고 전체적으로 사용되는 용어 폴리펩타이드는 더 큰 폴리펩타이드, 전장 단백질 및 이의 단편을 포함하여 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 지칭하고, 용어 폴리펩타이드는 단일-사슬 폴리펩타이드로 제한되지 않으며, 다중-단위, 예를 들어, 다중-사슬 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드가 더 짧은 길이, 예를 들어, 총 50개 아미노산 미만인 경우에, 용어 펩타이드 및 폴리펩타이드는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 폴리펩타이드가 더 긴 길이, 예를 들어, 50개 아미노산 이상인 경우에, 용어 폴리펩타이드 및 단백질은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
일 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 비-결합 입체 모이어티(NB); CM1-CM2 기질; 및 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하되, (i) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩타이드를 포함하고; (ii) CM1-CM2 기질은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 최대 50개의 아미노산 길이인 폴리펩타이드이며; (iii) CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않도록 위치되고; 그리고 (iv) NB는 효소에 의한 CM1-CM2 기질의 절단을 저해하지 않는다. 예를 들어, CM1-CM2 기질에서 CM1 기질 서열 및 CM2 기질 서열 각각은 독립적으로 최대 15개의 아미노산 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 비-결합 입체 모이어티(NB); CM1-CM2 기질; 및 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하되, (i) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩타이드를 포함하고; (ii) CM1-CM2 기질은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이며; (iii) CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않도록 위치되고; (iv) NB는 효소에 의한 CM1-CM2 기질의 절단을 저해하지 않으며; 그리고 (v) 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: NB-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-NB.
일 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 비-결합 입체 모이어티(NB); CM1-CM2 기질; 및 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하되, (i) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩타이드를 포함하고; (ii) CM1-CM2 기질은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이며; (iii) CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않도록 위치되되, 절단되지 않은 활성화 가능한 항체에서 NB는 표적에 결합하는 절단된 AB의 능력과 비교하여 표적에 결합하는 AB의 능력을 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100% 감소시키고; 그리고 (iv) NB는 효소에 의한 CM1-CM2 기질의 절단을 저해하지 않는다. 표적에 결합하는 AB의 능력의 감소는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 검정 또는, 예를 들어, PCT 공개 WO　2009/025846 및 WO　2010/081173에 기재된 검정과 같은 시험관내 표적 변위 검정을 사용하여 결정된다.
일 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 비-결합 입체 모이어티(NB)에 대한 결합 파트너(BP); CM1-CM2 기질; 및 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하되, BP는 노출될 때 NB에 결합하는 폴리펩타이드이고; NB AB에 특이적으로 결합하지 않는; CM1-CM2 기질은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이며; CM1-CM2 기질은 NB의 존재하에 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않도록 위치되고, BP는 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않으며; 그리고 NB 및 BP는 효소에 의한 CM1-CM2 기질의 절단을 저해하지 않는다. 이 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체의 BP는 선택적으로 NB에 결합된다. 일 실시형태에서, NB는 생체내에서 활성화 가능한 항체의 BP에 의해 동원된다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 조성물로서 제형화된다. 이러한 실시형태의 일부에서, 조성물은 또한 NB를 포함하되, NB는 BP, CM1-CM2 기질 및 AB를 포함하는 활성화 가능한 항체와 공동-제형화된다. 이 실시형태의 일부 예에서, BP는 알부민 결합 펩타이드, 피브리노겐 결합 펩타이드, 파이브로넥틴 결합 펩타이드, 헤모글로빈 결합 펩타이드, 트랜스페린 결합 펩타이드, 면역글로불린 도메인 결합 펩타이드 및 기타 혈청 단백질 결합 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, NB는 가용성의 구형 단백질이다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, NB는 혈류에서 순환하는 단백질이다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, NB는 알부민, 피브리노겐, 파이브로넥틴, 헤모글로빈, 트랜스페린, 면역글로불린 도메인 및 기타 혈청 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, CM1-CM2 기질은 프로테이스에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 프로테이스는 조직에서 공동 국재화되고, 프로테이스는 활성화 가능한 항체가 프로테이스에 노출될 때 활성화 가능한 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, CM1-CM2 기질은 최대 50개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드이다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, CM1-CM2 기질은 최대 15개의 아미노산 길이, 예를 들어, 3개의 아미노산 길이, 4개의 아미노산 길이, 5개의 아미노산 길이, 6개의 아미노산 길이, 7개의 아미노산 길이, 8개의 아미노산 길이, 9개의 아미노산 길이, 10개의 아미노산 길이, 11개의 아미노산 길이, 12개의 아미노산 길이, 13개의 아미노산 길이, 14개의 아미노산 길이 또는 15개의 아미노산 길이를 갖는 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: NB-CM1-CM2 기질-AB, AB-CM1-CM2 기질-NB, BP-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-BP. 활성화 가능한 항체가 BP를 포함하며 활성화 가능한 항체가 상응하는 NB의 존재하에 있는 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: NB:BP-CM1-CM2-AB, NB:BP-CM2-CM1-AB, AB-CM1-CM2-BP:NB 또는 AB-CM2-CM1-BP:NB, 여기서 ":"은 상호작용, 예를 들어, NB와 BP 간의 결합을 나타낸다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 주어진 표적에 특이적으로 결합하며, 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 또는 단일 도메인 경쇄 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적에 결합하는 이러한 항체 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편은 표적 마우스, 기타 설치류, 키메라, 인간화된 또는 완전 인간 단일클론 항체이다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 본 명세서에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 본 명세서에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 본 명세서에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 본 명세서에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역의 조합을 포함한다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 또한 AB에 접합된 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 치료제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 항신생물제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 독소 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 비절단성 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 표 3에 열거된 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 미세소관 저해제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DNA 알킬화제 또는 DNA 삽입제 또는 기타 DNA 손상제와 같은 핵산 손상제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 듀오카마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀 이량체이다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 또한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 모이어티는 진단제이다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 또한 스페이서를 포함한다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 또한 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 스페이서를 통해 활성화 가능한 항체에 접합된다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 스페이서는 활성화 가능한 항체의 MM에 직접 결합된다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 항체의 것보다 더 길며; 예를 들어, 활성화 가능한 항체의 pK는 상응하는 항체의 것보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 항체의 것과 유사하다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 15일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 12일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 11일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 10일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 9일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 8일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 7일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 6일이다. 임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 5일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 4일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 3일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 2일이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 24시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 20시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 18시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 16시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 14시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 12시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 10시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 8시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 6시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 4시간이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 때 적어도 3시간이다.
본 개시내용은 또한 임의의 이러한 활성화 가능한 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라 이러한 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 세포 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 항체를 배양함으로써 활성화 가능한 항체를 생산하는 방법을 제공하되, 세포는 이러한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 이러한 벡터를 포함한다.
표적에 대한 NB-함유 활성화 가능한 항체의 해리 상수(Kd)는 NB 또는 NB:BP와 관련되지 않은 경우 표적에 대한 AB의 Kd보다 더 크다. 표적에 대한 NB-함유 활성화 가능한 항체의 해리 상수(Kd)는 표적에 대한 모 AB의 Kd보다 더 크다. 예를 들어, 표적에 대한 NB-함유 활성화 가능한 항체의 Kd는 NB 또는 NB:BP와 관련되지 않은 경우 AB의 Kd 또는 표적에 대한 모 AB의 Kd보다 적어도 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 1,000,000배, 5,000,000배, 10,000,000배, 50,000,000배 이상 또는 5 내지 10배, 10 내지 100배, 10 내지 1,000배, 10 내지 10,000배, 10 내지 100,000배, 10 내지 1,000,000배, 10 내지 10,000,000배, 100 내지 1,000배, 100 내지 10,000배, 100 내지 100,000배, 100 내지 1,000,000배, 100 내지 10,000,000배, 1,000 내지 10,000배, 1,000 내지 100,000배, 1,000 내지 1,000,000배, 1000 내지 10,000,000배, 10,000 내지 100,000배, 10,000 내지 1,000,000배, 10,000 내지 10,000,000배, 100,000 내지 1,000,000배 또는 100,000 내지 10,000,000배 더 크다. 반대로, 표적에 대한 NB-함유 활성화 가능한 항체의 결합 친화도는 NB 또는 NB:BP와 관련되지 않을 경우 AB의 결합 친화도보다 낮거나 또는 표적에 대한 모 AB의 결합 친화도보다 낮다. 예를 들어, 표적에 대한 NB-함유 활성화 가능한 항체의 결합 친화도는 NB 또는 NB:BP와 관련되지 않을 경우 AB의 결합 친화도 또는 표적에 대한 모 AB의 결합 친화도보다 적어도 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 250배, 500배, 1,000배, 2,500배, 5,000배, 10,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 1,000,000배, 5,000,000배, 10,000,000배, 50,000,000배 이상 또는 5 내지 10배, 10 내지 100배, 10 내지 1,000배, 10 내지 10,000배, 10 내지 100,000배, 10 내지 1,000,000배, 10 내지 10,000,000배, 100 내지 1,000배, 100 내지 10,000배, 100 내지 100,000배, 100 내지 1,000,000배, 100 내지 10,000,000배, 1,000 내지 10,000배, 1,000 내지 100,000배, 1,000 내지 1,000,000배, 1000 내지 10,000,000배, 10,000 내지 100,000배, 10,000 내지 1,000,000배, 10,000 내지 10,000,000배, 100,000 내지 1,000,000배 또는 100,000 내지 10,000,000배 더 낮다.
NB-함유 활성화 가능한 항체가 표적의 존재하에 있을 때, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 NB 또는 NB:BP와 관련이 없을 때 AB의 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 저해된다. NB-함유 활성화 가능한 항체가 표적의 존재하에 있을 때, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 모 AB의 표적에 대한 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 저해된다. NB 또는 NB:BP와 관련되지 않은 AB의 결합 또는 표적에 대한 모 AB의 결합과 비교할 때, 표적에 결합하는 NB-함유 활성화 가능한 항체의 능력은 예를 들어, 시험관내 및/또는 생체내에서 측정될 때 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 28시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 또는 96시간 또는 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 60일, 90일, 120일, 150일 또는 180일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이상 동안 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100% 감소된다.
NB-함유 활성화 가능한 항체가 표적의 존재하에 있지만 개질제(예를 들어, 프로테이스 또는 기타 효소)의 존재하에 있지 않을 때, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 NB 또는 NB:BP와 관련되지 않을 때 AB의 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 저해된다. NB-함유 활성화 가능한 항체는 표적의 존재하에 있지만 개질제(예를 들어 프로테이스, 기타 효소, 환원제 또는 경쇄)의 존재하에 있지 않을 때, AB의 표적에 대한 특이적 결합은 모 AB의 표적에 대한 특이적 결합과 비교하여 감소 또는 저해된다. NB 또는 NB:BP와 관련이 없는 AB의 결합 또는 표적에 대한 모 AB의 결합과 비교할 때, 표적에 결합하는 NB-함유 활성화 가능한 항체의 능력은 예를 들어, 시험관내 및/또는 생체내에서 측정될 때 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 28시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 또는 96시간 또는 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 60일, 90일, 120일, 150일 또는 180일 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이상 동안 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100% 감소된다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 활성화 가능한 항체 접합체를 생산하기 위해 AB에 접합된 작용제를 포함한다. 활성화 가능한 항체 접합체의 일부 실시형태에서, 작용제는 치료제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 진단제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 검출 가능한 마커이다. 활성화 가능한 항체 접합체의 일부 실시형태에서, 작용제는 항신생물제이다. 활성화 가능한 항체 접합체의 일부 실시형태에서, 작용제는 독소 또는 이의 단편이다. 활성화 가능한 항체 접합체의 일부 실시형태에서, 작용제는 링커를 통해 AB에 접합된다. 활성화 가능한 항체 접합체의 일부 실시형태에서, 링커는 절단성 링커이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 비절단성 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 미세소관 저해제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DNA 알킬화제 또는 DNA 삽입제 또는 기타 DNA 손상제와 같은 핵산 손상제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 표 3에 열거된 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 듀오카마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀이다. 일부 실시형태에서, 작용제는 피롤로벤조다이아제핀 이량체이다.
임의의 이러한 활성화 가능한 항체 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체는 이중-표적 결합 활성화 가능한 항체이다. 이러한 이중 표적 결합 활성화 가능한 항체는 동일하거나 상이한 표적에 결합할 수 있는 2개의 AB를 함유한다. 특정 실시형태에서, 이중-표적화 활성화 가능한 항체는 이중 특이적 항체 또는 항체 단편을 함유한다.
이중 표적 결합 활성화 가능한 항체는 활성화 가능한 항체의 AB에 결합할 수 있는 표적 중 하나 또는 둘 모두와 함께 표적 조직에 공동-국재화되는 절단제에 의해 절단 가능한 CM1-CM2 기질을 갖도록 설계된다. 동일하거나 상이한 표적에 대해 하나 이상의 AB를 갖는 이중 표적 결합 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 CM1-CM2 기질을 갖도록 설계될 수 있되, 제1 CM1-CM2 기질은 제1 표적 조직에서 절단제에 의해 절단 가능하고, 제2 CM1-CM2 기질은 활성화 가능한 항체의 AB에 결합하는 하나 이상의 표적과 함께 제2 표적 조직에서 절단제에 의해 절단 가능하다. 일 실시형태에서, 제1 표적 조직 및 제2 표적 조직은 예를 들어, 유기체의 상이한 부위에서 공간적으로 분리된다. 일 실시형태에서, 제1 표적 조직 및 제2 표적 조직은 일시적으로 분리된 동일한 조직, 예를 들어, 2개의 상이한 시점에서 동일한 조직이며, 예를 들어, 제1 시점은 조직이 조기 종양일 때이고, 제2 시점은 조직이 말기 종양일 때이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시내용은 또한 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 명세서에 기재된 활성화 가능한 항체는 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 세포를 배양함으로써 생산되되, 세포는 이러한 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다.
본 개시내용은 또한 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 (a) 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 (i) 비-결합 입체 모이어티(NB); (ii) CM1-CM2 기질; 및 (iii) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하되, (1) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않고; (2) CM1-CM2 기질은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이며; (3) CM1-CM2 기질은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않도록 위치되고; 그리고 (4) NB는 효소에 의한 CM1-CM2 기질의 절단을 저해하지 않는, 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 (a) 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 (i) 비-결합 입체 모이어티(NB)에 대한 결합 파트너(BP); (ii) CM1-CM2 기질; 및 (iii) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하되, (1) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않고; (2) CM1-CM2 기질은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩타이드이며; (3) CM1-CM2 기질은 NB의 존재하에 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않으며, BP는 AB의 표적에 대한 결합을 방해하지 않도록 위치되고; 그리고 (4) NB 및 BP는 효소에 의한 CM1-CM2 기질의 절단을 저해하지 않는, 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 이 실시형태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체의 BP는 NB에 결합된다.
활성화 가능한 항체 및 접합된 활성화 가능한 항체의 용도
본 개시내용에 따른 치료제의 투여는 적합한 담체, 부형제 및 개선된 이송, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제형에 혼입되는 기타 작용제와 함께 투여될 것임을 이해할 것이다. 여러 가지 적절한 제형은 모든 제약 화학자에게 알려진 처방서에서 찾을 수 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA(1975)), 특히 Blaug, Seymour에 의한 챕터 87]. 이러한 제형은 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포를 함유하는 지질(양이온 또는 음이온)(예컨대, Lipofectin™), DNA 접합체, 무수 흡스 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔 및 카보왁스를 함유하는 반 고체 혼합물을 포함한다. 제형 내의 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고, 제형이 투여 경로와 생리학적으로 양립하고 이에 견딜 수 있다면, 임의의 전술한 혼합물은 본 개시내용에 따른 적절한 치료제 및 요법일 수 있다. 또한, 문헌[Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of 고체 protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 제약 화학자에게 잘 알려진 제형, 부형제 및 담체와 관련된 추가적인 정보에 대한 그 안의 인용 참조.
접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 포함하는 본 개시내용의 치료적 제형은 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 예방, 치료 또는 그렇지 않으면 개선하는데 사용된다. 예를 들어, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 포함하는 본 개시내용의 치료적 제형은 염증, 염증성 장애, 자가면역 질환 및/또는 암 또는 기타 신생물성 병태를 치료 또는 그렇지 않으면 개선하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 암은 표적이 발현된 고형 종양 또는 혈액암이다. 일부 실시형태에서, 암은 표적이 발현된 고형 종양이다. 일부 실시형태에서, 암은 표적이 발현된 혈액암이다. 일부 실시형태에서, 표적은 실질(parenchyma)(예를 들어, 암에서, 종종 기관 또는 조직의 기능(들)을 수행하는 기관 또는 조직의 부분)에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 표적은 세포, 조직 또는 기관에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 표적은 기질(stroma)(즉, 세포, 조직 또는 기관의 결합 지지 프레임워크)에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 표적은 골아세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 표적은 내피(맥관구조)에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 표적은 암 줄기 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체가 접합되는 작용제는 미세소관 저해제이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체가 접합되는 작용제는 핵산 손상제이다.
예방, 개선 또는 치료의 유효성은 예를 들어, 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 같은 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 진단 또는 치료하기 위한 임의의 공지된 방법과 관련하여 결정된다. 대상체의 생존을 연장시키거나 또는 그렇지 않으면 대상체에서 표적 발현 및/또는 활성, 예를 들어, 비정상적인 표적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 장애의 진행을 지연시키는 것은 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체가 임상적 이익을 부여함을 나타낸다.
접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는데 관련된 원칙 및 고려사항뿐만 아니라 구성 요소의 선택에 대한 지침은 예를 들어, 문헌[Remington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, 그리고 Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; 및 Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York]에 제공된다.
항체 단편이 사용되는 일부 실시형태에서, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 단편이 선택된다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩타이드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩타이드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. (예를 들어, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893(1993) 참조). 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 서로 불리한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서 또는 추가로, 조성물은 예를 들어, 세포독성제, 사이토카인, 화학치료제 또는 성장-저해제와 같은 이의 기능을 향상시키는 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀션에서 각각 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균이어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(바이닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-바이닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다. 에틸렌-바이닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 소정의 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다.
일부 실시형태에서, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 함유한다. 온전한 항체 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, scFv 또는 F(ab)2)이 사용된다. 프로브 또는 항체와 관련하여 용어 "표지된"은 검출 가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링(즉, 물리적 연결)하는 것에 의한 프로브 또는 항체의 직접 라벨링뿐만 아니라 직접 표지된 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접 라벨링을 포함하는 것으로 의도된다. 간접 라벨링의 예는 형광-표지된 2차 항체 및 형광-표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 바이오틴을 이용한 DNA 프로브의 말단-라벨링을 사용하여 1차 항체를 검출하는 것을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하도록 의도된다. 따라서, 용어 "생물학적 샘플"의 사용에는 혈청, 혈장 또는 림프를 포함하는 혈액의 분획 또는 성분이 포함된다. 즉, 본 개시내용의 검출 방법은 시험관내뿐만 아니라 생체내 생물학적 샘플에서 분석물 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용된다. 예를 들어, 분석물 mRNA의 검출을 위한 시험관내 기법은 노던 혼성화 및 인시츄(in situ) 혼성화를 포함한다. 분석물 단백질의 검출을 위한 시험관내 기법은 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침강, 면역화학적 염색 및 면역형광을 포함한다. 분석물 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기법은 서던 혼성화를 포함한다. 면역검정을 수행하기 위한 절차는 예를 들어, 문헌["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; 및 "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기술되어 있다. 또한, 분석물 단백질의 검출을 위한 생체내 기법은 표지된 항-분석물 단백질 항체를 대상체에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 표준 이미징 기법에 의해 대상체에서 그 존재 및 위치가 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
본 개시내용의 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 또한 다양한 진단적 및 예방적 제형에 유용하다. 일 실시형태에서, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 전술된 장애가 발생할 위험이 있는 환자에 투여된다. 하나 이상의 전술된 장애에 대한 환자 또는 장기의 소인(predisposition)은 유전형, 혈청학적 또는 생화학적 마커를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 전술된 장애와 관련된 임상 적응증을 갖는 것으로 진단된 인간 개체에 투여된다. 진단시, 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 임상 적응증의 효과를 완화 또는 역전시키기 위해 투여된다.
본 개시내용의 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 또한 환자 샘플에서 표적의 검출에 유용하므로, 진단으로서 유용하다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체 및/또는 활성화 가능한 항체 및 이들의 접합된 버전은 환자 샘플에서 표적 수준을 검출하기 위해 시험관내 검정, 예를 들어, ELISA에서 사용된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 고체 지지체(예를 들어, 마이크로역가 플레이트의 웰(들)) 상에 고정된다. 고정된 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 테스트 샘플에 존재할 수 있는 임의의 표적에 대한 항체를 포획하는 역할을 한다. 고정된 항체를 환자 샘플과 접촉시키기 전에, 고체 지지체는 분석물의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 헹구어지고 우유 단백질 또는 알부민과 같은 차단제로 처리된다.
그 후, 웰은 항원을 함유하는 것으로 의심되는 테스트 샘플 또는 표준량의 항원을 함유하는 용액으로 처리된다. 이러한 샘플은 예를 들어, 병리의 진단으로 간주되는 순환하는 항원의 수준을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 혈청 샘플이다. 테스트 샘플 또는 표준물질을 씻어낸 후, 고체 지지체는 검출 가능하게 표지된 2차 항체로 처리된다. 표지된 2차 항체는 검출 항체의 역할을 한다. 검출 가능한 표지의 수준이 측정되며, 테스트 샘플에서 표적 항원의 농도는 표준 샘플로부터 생성된 표준 곡선과의 비교에 의해 결정된다.
시험관내 진단적 검정에서 본 개시내용의 항체 및 이의 접합된 버전을 사용하여 얻어진 결과에 기초하여, 표적 항원의 발현 수준에 기초하여 대상체에서 질환을 병기(stage)하는 것이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 주어진 질환에 대해, 질환의 진행의 다양한 단계 및/또는 질환의 치료적 치료의 다양한 시점에 있는 것으로 진단된 대상체로부터 혈액 샘플을 채취한다. 진행 또는 요법의 각 단계에 대해 통계적으로 유의미한 결과를 제공하는 샘플의 집단을 사용하여, 각 단계의 특징으로 간주될 수 있는 항원의 농도 범위가 지정된다.
접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 또한 진단적 및/또는 이미징 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 시험관내 방법이다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 생체내 방법이다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 인시츄 방법이다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 생체외 방법이다. 예를 들어, 효소적으로 절단 가능한 CM1-CM2 기질을 갖는 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질을 절단할 수 있는 효소의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 활성화 가능한 항체는 주어진 숙주 유기체의 주어진 세포 또는 조직에서 활성화된 항체(즉, 활성화 가능한 항체의 절단으로 인한 항체)의 측정된 축적을 통해 효소 활성(또는, 일부 실시형태에서, 이황화물 결합의 환원을 제공할 수 있는 것과 같이 환원 가능성이 증가된 환경)의 생체내 검출(예를 들어, 정성적 또는 정량적)을 포함할 수 있는 진단에 사용될 수 있다. 이러한 활성화된 항체의 축적은 조직이 효소적 활성(또는 CM1-CM2 기질의 특성에 따라 증가된 환원 가능성)을 나타낼 뿐만 아니라 조직이 활성화된 항체가 결합하는 표적을 발현함을 나타낸다.
예를 들어, CM1-CM2 기질은 종양 부위에서, 생물학적으로 제한된 부위(예를 들어, 예컨대 농양, 장기 등)의 바이러스 또는 세균 감염 부위 등에서 발견되는 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 및 세린 프로테이스(SP)에 대한 기질로 선택될 수 있다. AB는 표적 항원에 결합하는 것일 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법 또는 적절한 경우, 당업자에 익숙한 방법을 사용하여, 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지 또는 방사성 표지 또는 방사성 트레이서)는 항체 및/또는 활성화 가능한 항체의 AB 또는 기타 영역에 접합될 수 있다. 적합한 검출 가능한 표지는 위의 스크리닝 방법의 맥락에서 논의되고, 추가적인 특정 예가 아래에 제공된다. 관심 있는 질환 조직에서 활성이 상승된 MMP와 함께 질환 상태의 단백질 또는 펩타이드에 특이적인 AB를 사용하면, 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질이 있는 조직에 비해 질환 조직에 대한 증가된 결합 속도를 나타낼 것이며, 특정 효소는 검출 가능한 수준으로 존재하지 않거나 또는 질환 조직보다 낮은 수준으로 존재하거나 또는 불활성(예를 들어, 자이모겐 형태 또는 저해제와의 복합체)이다. 작은 단백질 및 펩타이드는 신장 여과 시스템에 의해 혈액으로부터 빠르게 제거되며, CM1-CM2 기질에 특이적인 효소가 검출 가능한 수준으로 존재하지 않기 때문에(또는 비-질환 조직에서 낮은 수준으로 존재하거나 또는 불활성 형태로 존재), 질환 조직에서 활성화된 항체의 축적은 비-질환 조직에 비해 향상된다.
다른 예에서, 활성화 가능한 항체는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 가능한 항체가 효소에 의해 절단되기 쉬운 CM1-CM2 기질을 함유하는 경우, 활성화 가능한 항체는 샘플에서 효소의 존재를 검출(정성적으로 또는 정량적으로)하는데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 활성화 가능한 항체가 환원제에 의해 절단되기 쉬운 CM1-CM2 기질을 함유하는 경우, 활성화 가능한 항체는 샘플에서 환원 조건의 존재를 검출(정성적으로 또는 정량적으로)하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서 분석을 용이하게 하기 위해, 활성화 가능한 항체는 검출 가능하게 표지될 수 있고, 지지체(예를 들어, 슬라이드 또는 비드와 같은 고체 지지체)에 결합될 수 있다. 검출 가능한 표지는 절단 후 방출되지 않은 활성화 가능한 항체의 일부에 위치될 수 있으며, 예를 들어, 검출 가능한 표지는 절단이 일어날 때까지 검출할 수 없는 ??칭된 형광 표지 또는 다른 표지일 수 있다. 검정은 예를 들어, 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안, 고정되고 검출 가능하게 표지된 활성화 가능한 항체를 효소 및/또는 환원제를 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킨 다음, 과도한 샘플 및 오염물을 제거하기 위해 세척함으로써 수행될 수 있다. 그 후, 샘플에서 절단제(예를 들어, 효소 또는 환원제)의 존재 또는 부재는 샘플과 접촉하기 전 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 신호의 변화, 예를 들어, 샘플에서 절단제에 의한 활성화 가능한 항체의 절단으로 인한 검출 가능한 신호의 존재 및/또는 증가에 의해 평가된다.
이러한 검출 방법은 또한 절단될 때 활성화 가능한 항체의 AB에 결합할 수 있는 표적의 존재 또는 부재의 검출을 제공하도록 조정될 수 있다. 따라서, 검정은 절단제의 존재 또는 부재 및 관심 있는 표적의 존재 또는 부재를 평가하도록 조정될 수 있다. 절단제의 존재 또는 부재는 위에 기재된 바와 같은 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 표지의 존재 및/또는 증가에 의해 검출될 수 있고, 표적의 존재 또는 부재는 표적-AB 복합체의 검출에 의해, 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 항-표적 항체의 사용에 의해 검출될 수 있다.
활성화 가능한 항체는 또한 예를 들어, 프로테이스 절단 및 특정 표적에 대한 결합에 의한 활성화 가능한 항체 활성화의 검증을 위한 인시츄 이미징에 유용하다. 인시츄 이미징은 세포 배양물 또는 조직 절편과 같은 생물학적 샘플에서 단백질 가수분해 활성 및 표적의 국재화를 가능하게 하는 기법이다. 이러한 기법을 사용하여, 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지)의 존재에 기초하여 주어진 표적에 대한 결합 및 단백질 가수분해 활성을 모두 확인할 수 있다.
이러한 기법은 질환 부위(예를 들어, 종양 조직) 또는 건강한 조직으로부터 유래된 임의의 냉동된 세포 또는 조직에 유용하다. 이러한 기법은 또한 새로운 세포 또는 조직 샘플에 유용하다.
이러한 기법에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지로 표지된다. 검출 가능한 표지는 형광 염료(예를 들어, 형광단, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 로다민 아이소티오사이아네이트(TRITC)), 근적외선(NIR) 염료(예를 들어, Qdot® 나노결정), 콜로이드성 금속, 합텐, 방사성 표지 마커, 바이오틴, 및 스트렙타비딘과 같은 증폭 시약 또는 효소(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스 또는 알칼리 포스파테이스)일 수 있다.
표지된 활성화 가능한 항체와 함께 인큐베이션된 샘플에서 표지의 검출은 샘플이 표적을 함유하며, 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 및 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에 특이적인 하나의 세린 프로테이스(SP)를 함유함을 나타낸다. 일부 실시형태에서, MMP의 존재는 본 명세서에 기재된 것과 같은 광범위 스펙트럼 프로테이스 저해제를 사용하고/하거나 프로테이스에 특이적인 작용제, 예를 들어, 프로테이스 매트립테이스(MT-SP1)에 특이적이고 매트립테이스의 단백질 가수분해 활성을 저해하는 A11과 같은 항체를 사용하여 확인될 수 있다; 예를 들어, 2010년 11월 11일에 공개된 국제 공개 번호 WO 2010/129609 참조. 본 명세서에 기재된 것과 같은 광범위 스펙트럼 프로테이스 저해제를 사용하고/하거나 보다 선택적인 저해제를 사용하는 동일한 접근법이 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에 특이적인 MMP 및 SP를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적의 존재는 표적에 특이적인 작용제를 사용하여 확인될 수 있으며, 예를 들어, 다른 항체 또는 검출 가능한 표지는 비표지된 표적과 경쟁할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비표지된 활성화 가능한 항체는 표지된 2차 항체 또는 더 복잡한 검출 시스템에 의한 검출과 함께 사용될 수 있다.
유사한 기법이 또한 대상체, 예를 들어, 인간을 포함하는 포유동물에서 형광 신호의 검출이 질환 부위가 표적을 함유하며, 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에 특이적인 MMP 및 SP를 함유함을 나타내는 생체내 이미징에 유용하다.
이러한 기법은 또한 활성화 가능한 항체의 프로테이스-특이적 CM1-CM2 기질에 기초하여 다양한 세포, 조직 및 유기체에서 프로테이스 활성의 검출, 확인 또는 특성화를 위한 키트 및/또는 시약으로서 유용하다.
본 개시내용은 다양한 진단적 및/또는 예방적 적응증에서 항체 및/또는 활성화 가능한 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 (i) 대상체 또는 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질 및 관심 있는 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 절단되지 않은, 비-활성화된 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하되; (a) MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이고, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, AB의 천연 결합 파트너의 변형된 형태가 아니고; (b) 절단되지 않은 비-활성화된 상태에서 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된 활성화된 상태에서 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는, 대상체 또는 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및 (ii) 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계로서, 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준은 절단제 및 표적이 대상체 또는 샘플에 존재함을 나타내며, 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준이 없음은 절단제, 표적 또는 절단제와 표적 모두가 대상체 또는 샘플에 부재하고/하거나 충분히 존재하지 않음을 나타내는, 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계에 의해 대상체 또는 샘플에서 절단제 및 관심 있는 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 샘플에서 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 것은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 사용하여 달성되되, 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 개시내용은 또한 (i) 관심 있는 표적, 예를 들어, 표적의 존재하에 대상체 또는 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질 및 관심 있는 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하되, 절단되지 않은, 비-활성화된 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하고; (a) MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이며, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않고, AB의 천연 결합 파트너의 변형된 형태가 아니며; 그리고 (b) 절단되지 않은 비-활성화된 상태에서 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된 활성화된 상태에서 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는, 대상체 또는 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및 (ii) 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계로서, 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준은 절단제가 대상체 또는 샘플에 존재함을 나타내고, 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준이 없음은 절단제가 대상체 또는 샘플에서 부재하고/하거나 충분히 존재하지 않음을 나타내는, 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계에 의해 대상체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 샘플에서 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 것은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 사용하여 달성되되, 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 개시내용은 또한 대상체 또는 샘플에서 절단제 및 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하되, 키트는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질 및 관심 있는 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하는 적어도 활성화 가능한 항체를 포함하되, 절단되지 않은, 비-활성화된 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하고; (a) MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이고, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, AB의 천연 결합 파트너의 변형된 형태가 아니고; (b) 절단되지 않은 비-활성화된 상태에서, MM은 특이적 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된 활성화된 상태에서 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않고; 그리고 (ii) 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하되, 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준은 절단제가 대상체 또는 샘플에 존재함을 나타내고, 대상체 또는 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준이 없음은 절단제가 부재하고/하거나 대상체 또는 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 샘플에서 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 것은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 사용하여 달성되되, 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 개시내용은 또한 (i) 대상체 또는 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인(AB) 및 검출 가능한 표지를 포함하되, 절단되지 않은, 비-활성화된 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하고; MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이고, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않고 AB의 천연 결합 파트너의 변형된 형태가 아니며; 절단되지 않은 비-활성화된 상태에서 MM은 특이적 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된 활성화된 상태에서 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않고; 그리고 검출 가능한 표지는 CM1-CM2 기질의 절단 후 방출된 활성화 가능한 항체의 일부에 위치되는, 대상체 또는 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및 (ii) 대상체 또는 샘플에서 검출 가능한 표지의 수준을 측정하는 단계로서, 대상체 또는 샘플에서 검출 가능한 표지의 검출 가능한 수준은 절단제가 부재하고/하거나 대상체 또는 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타내며, 대상체 또는 샘플에서 검출 가능한 표지의 검출 가능한 수준이 없음은 절단제가 대상체 또는 샘플에 존재함을 나타내는, 검출 가능한 표지의 수준을 측정하는 단계에 의해 대상체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 샘플에서 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 것은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 사용하여 달성되되, 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 개시내용은 또한 대상체 또는 샘플에서 절단제 및 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하되, 키트는 대상체 또는 생물학적 샘플과의 접촉에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 적어도 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체(예를 들어, 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체) 및 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체의 수준을 검출하기 위한 수단을 포함하며, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준은 절단제 및 표적이 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타내고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준이 없음은 절단제, 표적 또는 절단제와 표적 모두가 부재하고/하거나 대상체 또는 생물학적 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 표적 결합 및/또는 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없다.
본 개시내용은 또한 (i) 표적의 존재하에 대상체 또는 생물학적 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계에 의해 대상체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공하되, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준은 절단제가 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타내고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준이 없음은 절단제가 부재하고/하거나 검출 가능한 수준으로 대상체 또는 생물학적 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없다. 이러한 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질 및 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하되, 절단되지 않은(즉, 비-활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하고; (a) MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이고, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며; 그리고 (b) 절단되지 않은 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된(즉, 활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 차폐 모이어티에 부착된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 프로테이스 절단 부위의 절단성 모이어티 N-말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, AB의 단일 항원 결합 부위는 차폐된다. 본 개시내용의 항체가 적어도 2개의 항원 결합 부위를 갖는 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 부위는 차폐되고, 적어도 하나의 항원 결합 부위는 차폐되지 않는다. 일부 실시형태에서, 모든 항원 결합 부위가 차폐된다. 일부 실시형태에서, 측정 단계는 검출 가능한 표지를 포함하는 2차 시약의 사용을 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체 또는 샘플에서 절단제 및 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하되, 키트는 표적의 존재하에 대상체 또는 생물학적 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키고 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 적어도 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 포함하고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준은 절단제가 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타내고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준이 없음은 절단제가 부재하고/하거나 검출 가능한 수준으로 대상체 또는 생물학적 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없다. 이러한 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질 및 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하되, 절단되지 않은(즉, 비-활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하고; (a) MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이고, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며; 그리고 (b) 절단되지 않은 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된(즉, 활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 차폐 모이어티에 부착된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 프로테이스 절단 부위의 절단성 모이어티 N-말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, AB의 단일 항원 결합 부위는 차폐된다. 본 개시내용의 항체가 적어도 2개의 항원 결합 부위를 갖는 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 부위는 차폐되고, 적어도 하나의 항원 결합 부위는 차폐되지 않는다. 일부 실시형태에서, 모든 항원 결합 부위는 차폐된다. 일부 실시형태에서, 측정 단계는 검출 가능한 표지를 포함하는 2차 시약의 사용을 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하되, 키트는 대상체 또는 생물학적 샘플을 접촉시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 적어도 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체의 수준을 검출하기 위한 수단을 포함하며, 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질의 절단 후 방출된 활성화 가능한 항체의 일부에 위치되는 검출 가능한 표지를 포함하고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체는 절단제가 부재하고/하거나 대상체 또는 생물학적 샘플에서 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 표적 결합 및/또는 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체는 절단제가 검출 가능한 수준으로 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타낸다.
본 개시내용은 (i) 대상체 또는 생물학적 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질의 절단 후 방출된 활성화 가능한 항체의 일부에 위치하는 검출 가능한 표지를 포함하는, 대상체 또는 생물학적 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계로서, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준은 절단제, 표적 또는 절단제 및 표적 모두가 부재하고/하거나 대상체 또는 생물학적 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 표적 결합 및/또는 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 감소된 검출 가능한 수준은 절단제 및 표적이 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타내는, 활성화된 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계에 의해 대상체 또는 샘플에서 절단제 및 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 검출 가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들어, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다. 이러한 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질 및 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하되, 절단되지 않은(즉, 비-활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하고; (a) MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이고, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며; 그리고 (b) 절단되지 않은 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된(즉, 활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 샘플에서 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 것은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 사용하여 달성되되, 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 개시내용은 또한 대상체 또는 샘플에서 절단제 및 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하되, 키트는 대상체 또는 생물학적 샘플과 접촉시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 적어도 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체의 수준을 검출하기 위한 수단을 포함하며, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 수준이 절단제, 표적 또는 절단제와 표적 모두가 부재하고/하거나 대상체 또는 생물학적 샘플에서 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 표적 결합 및/또는 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체의 감소된 검출 가능한 수준은 절단제 및 표적이 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타낸다. 검출 가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들어, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다.
본 개시내용은 또한 (i) 대상체 또는 생물학적 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질의 절단 후 방출된 활성화 가능한 항체의 일부에 위치된 검출 가능한 표지를 포함하는, 대상체 또는 생물학적 샘플을 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및 (ii) 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출 가능한 표지의 수준을 측정하는 단계로서, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출 가능한 표지의 검출 가능한 수준이 절단제가 부재하고/하거나 검출 가능한 수준으로 대상체 또는 생물학적 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출 가능한 표지의 감소된 검출 가능한 수준은 절단제가 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타내는, 검출 가능한 표지의 수준을 측정하는 단계에 의해 대상체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 검출 가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들어, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다. 이러한 활성화 가능한 항체는 차폐 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질 및 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하되, 절단되지 않은(즉, 비-활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2 기질-AB 또는 AB-CM1-CM2 기질-MM을 포함하고; (a) MM은 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는 펩타이드이며, MM은 AB의 자연 발생적 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며; 그리고 (b) 절단되지 않은 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하고, 절단된(즉, 활성화된) 상태에서 활성화 가능한 항체의 MM은 AB의 표적에 대한 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁한다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 샘플에서 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 것은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 사용하여 달성되되, 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 개시내용은 또한 대상체 또는 샘플에서 관심 있는 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하되, 키트는 대상체 또는 생물학적 샘플과 접촉시키기 위한 본 명세서에 기재된 적어도 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 대상체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체의 수준을 검출하기 위한 수단을 포함하고, 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질의 절단 후 방출된 활성화 가능한 항체의 일부에 위치된 검출 가능한 표지를 포함하며, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출 가능한 표지의 검출 가능한 수준이 절단제, 표적 또는 절단제와 표적 모두가 부재하고/하거나 대상체 또는 생물학적 샘플에 충분히 존재하지 않음을 나타내는 경우, 활성화 가능한 항체의 표적 결합 및/또는 프로테이스 절단은 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출될 수 없고, 대상체 또는 생물학적 샘플에서 검출 가능한 표지의 감소된 검출 가능한 수준은 절단제 및 표적이 대상체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 나타낸다. 검출 가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들어, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다.
이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 이미징제, 조영제, 효소, 형광 표지, 발색단, 염료, 하나 이상의 금속 이온 또는 리간드-기반 표지를 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 이미징제는 방사성 동위원소를 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 방사성 동위원소는 인듐 또는 테크네튬이다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 조영제는 아이오다인, 가돌리늄 또는 산화철을 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 효소는 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리 포스파테이스 또는 β-갈락토시데이스를 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 형광 표지는 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP), 적색 형광 단백질 tdimer2(RFP tdimer2), HCRED 또는 유로퓸 유도체를 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 발광 표지는 N-메틸아크리듐 유도체를 포함한다. 이러한 방법의 일부 실시형태에서, 표지는 Alexa Fluor® 표지, 예컨대 Alex Fluor® 680 또는 Alexa Fluor® 750을 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 리간드-기반 표지는 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 하나 이상의 합텐을 포함한다.
이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 반려 동물(예를 들어, 고양이, 개, 말), 경작용 동물, 작업용 동물 또는 동물원 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 설치류이다.
이러한 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 생체내 방법이다. 이러한 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 인시츄 방법이다. 이러한 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 생체외 방법이다. 이러한 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 시험관내 방법이다.
일부 실시형태에서, 인시츄 이미징 및/또는 생체내 이미징은 치료할 환자를 확인하는 방법에 유용하다. 예를 들어, 인시츄 이미징에서, 활성화 가능한 항체는 적절한 위치, 예를 들어, 종양 부위에 적절한 프로테이스(들) 및 표적(들)을 갖는 환자를 확인하기 위해 환자 샘플을 스크리닝하는데 사용된다.
일부 실시형태에서, 인시츄 이미징은 본 개시내용의 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 환자 집단을 확인하거나 또는 그렇지 않으면 재정의(refine)하기 위해 사용된다. 예를 들어, 표적(예를 들어, 표적) 및 테스트되는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에서 기질을 절단(예를 들어, 질환 부위에서 활성화된 항체를 축적)하는 프로테이스 모두에 대해 양성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인된다. 마찬가지로, 표적(예를 들어, 표적) 및 이러한 방법을 사용하여 테스트되는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에서 기질을 절단하는 프로테이스 중 하나 또는 모두에 대해 음성으로 테스트된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 활성화 가능한 항체에 대해 음성으로 테스트된 이러한 환자는 치료에 적합한 활성화 가능한 항체(예를 들어, 질환의 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체)가 확인될 때까지 상이한 CM1-CM2 기질을 포함하는 다른 활성화 가능한 항체로 테스트될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 그 후 치료적 유효량의 환자가 양성으로 테스트된 접합된 활성화 가능한 항체가 투여된다.
일부 실시형태에서, 생체내 이미징은 본 개시내용의 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 환자 집단을 확인 또는 그렇지 않으면 재정의하기 위해 사용된다. 예를 들어, 표적(예를 들어, 표적) 및 테스트되는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에서 기질을 절단(예를 들어, 질환 부위에 활성화된 항체를 축적)하는 프로테이스 모두에 대해 양성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인된다. 마찬가지로, 음성으로 테스트된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 활성화 가능한 항체에 대해 음성으로 테스트된 이러한 환자는 치료에 적합한 활성화 가능한 항체(예를 들어, 질환의 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체)가 확인될 때까지 상이한 CM1-CM2 기질을 포함하는 다른 활성화 가능한 항체로 테스트될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 그 후 치료적 유효량의 환자가 양성으로 테스트된 접합된 활성화 가능한 항체가 투여된다.
방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 방법 또는 키트는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 환자 집단을 확인 또는 그렇지 않으면 재정의하기 위해 사용된다. 예를 들어, 표적(예를 들어, 표적) 및 이러한 방법을 사용하여 테스트되는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에서 기질을 절단하는 프로테이스 모두에 대해 양성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인된다. 마찬가지로, 표적(예를 들어, 표적) 및 이러한 방법을 사용하여 테스트되는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에서 기질을 절단하는 프로테이스 모두에 대해 음성으로 테스트된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 환자는 치료에 적합한 활성화 가능한 항체(예를 들어, 질환의 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체)가 확인될 때까지 다른 활성화 가능한 항체로 테스트될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적(예를 들어, 표적) 중 하나에 대해 음성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인된다. 일부 실시형태에서, 표적(예를 들어, 표적) 중 하나에 대해 음성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보가 아닌 것으로 확인된다. 일부 실시형태에서, 이러한 환자는 치료에 적합한 활성화 가능한 항체(예를 들어, 질환의 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체)가 확인될 때까지 다른 활성화 가능한 항체로 테스트될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 작용제에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 샘플에서 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 것은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 사용하여 달성되되, 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 항체이다.
일부 실시형태에서, 방법 또는 키트는 본 개시내용의 항-표적 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체(예를 들어, 치료제가 접합된 활성화 가능한 항체)로 치료하기에 적합한 환자 집단을 확인 또는 그렇지 않으면 재정의하고, 이어서 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 치료하기 위해 사용된다. 예를 들어, 표적(예를 들어, 표적) 및 이러한 방법으로 테스트되는 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질을 절단하는 프로테이스 모두에 대해 양성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 항체 및/또는 이러한 접합된 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인되며, 환자는 그 후 치료적 유효량의 테스트된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체가 투여된다. 마찬가지로, 표적(예를 들어, 표적) 및 이러한 방법을 사용하여 테스트되는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에서 기질을 절단하는 프로테이스 중 하나 또는 둘 다에 대해 음성으로 테스트된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 환자는 치료에 적합한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체(예를 들어, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 질환의 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체)가 확인될 때까지 다른 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체로 테스트될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 그 후 치료적 유효량의 환자가 양성으로 테스트된 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체가 투여된다.
이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, MM은 약 4개 내지 40개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 링커 펩타이드를 포함하되, 링커 펩타이드는 MM과 CM1-CM2 기질의 사이에 위치된다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 링커 펩타이드를 포함하되, 링커 펩타이드는 AB와 CM1-CM2 기질의 사이에 위치된다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 제1 링커 펩타이드(LP1) 및 제2 링커 펩타이드(LP2)를 포함하되, 제1 링커 펩타이드는 MM과 CM1-CM2 기질의 사이에 위치되고, 제2 링커 펩타이드는 AB와 CM1-CM2 기질의 사이에 위치된다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드이되, LP1 및 LP2 각각은 동일한 링커일 필요는 없다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 중 하나 또는 둘 다는 글리신-세린 중합체를 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 중 적어도 하나는 (GS)n, (GSGGS)n(서열번호　381) 및 (GGGS)n(서열번호　382)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하되, n은 적어도 1의 정수이다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 중 적어도 하나는 화학식(GGS)n을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, n은 적어도 1의 정수이다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, LP1 및 LP2 중 적어도 하나는 Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호　383), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(서열번호　384), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(서열번호　385), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호　386), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호　387) 및 Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(서열번호　388)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, AB는 본 명세서에 제시된 교차-반응성 항체 서열로부터 선택되는 항체 또는 항체 단편 서열을 포함한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, AB는 Fab 단편, scFv 또는 단일 사슬 항체(scAb)를 포함한다.
이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 절단제는 표적과 함께 대상체 또는 샘플에 공동-국재화되는 프로테이스이며, CM1-CM2 기질은 프로테이스에 대한 기질로 기능하는 폴리펩타이드이되, 프로테이스는 활성화 가능한 항체가 프로테이스에 노출될 때 활성화 가능한 항체에서 CM1-CM2 기질을 절단한다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질에서 CM1 기질 서열 및 CM2 기질 서열 각각은 독립적으로 최대 15개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드이다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질은 AB의 N-말단에 커플링된다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질은 AB의 C-말단에 커플링된다. 이러한 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, CM1-CM2 기질은 AB의 VL 사슬의 N-말단에 커플링된다.
본 개시내용의 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 진단적 및 예방적 제형에 사용된다. 일 실시형태에서, 활성화 가능한 항체는 전술된 염증, 염증성 장애, 암 또는 기타 장애 중 하나 이상이 발생할 위험이 있는 환자에 투여된다.
하나 이상의 전술된 장애에 대한 환자 또는 장기의 소인은 유전형, 혈청학적 또는 생화학적 마커를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 전술된 장애와 관련된 임상 적응증으로 진단된 인간 개체에 투여된다. 진단시, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 임상 적응증의 효과를 완화 또는 역전시키기 위해 투여된다.
활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 또한 환자 샘플에서 표적의 검출에 유용하며, 따라서 진단적으로 유용하다. 예를 들어, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 환자 샘플에서 표적 수준을 검출하기 위해 시험관내 검정, 예를 들어, ELISA에서 사용된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 고체 지지체(예를 들어, 마이크로역가 플레이트의 웰(들)) 상에 고정된다. 고정된 활성화 가능한 항체는 테스트 샘플에 존재할 수 있는 임의의 표적에 대한 항체를 포획하는 역할을 한다. 고정된 항체를 환자 샘플과 접촉시키기 전에, 고체 지지체는 분석물의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 헹구어지고 우유 단백질 또는 알부민과 같은 차단제로 처리된다.
그 후, 웰은 항원을 함유하는 것으로 의심되는 테스트 샘플 또는 표준량의 항원을 함유하는 용액으로 처리된다. 이러한 샘플은 예를 들어, 병리의 진단으로 간주되는 순환하는 항원의 수준을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 혈청 샘플이다. 테스트 샘플 또는 표준물질을 씻어낸 후, 고체 지지체는 검출 가능하게 표지된 2차 항체로 처리된다. 표지된 2차 항체는 검출 항체의 역할을 한다. 검출 가능한 표지의 수준이 측정되며, 테스트 샘플에서 표적 항원의 농도는 표준 샘플로부터 생성된 표준 곡선과의 비교에 의해 결정된다.
시험관내 진단적 검정에서 본 개시내용의 항체를 사용하여 얻어진 결과에 기초하여, 표적 항원의 발현 수준에 기초하여 대상체에서 질환을 병기하는 것이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 주어진 질환에 대해, 질환의 진행의 다양한 단계 및/또는 질환의 치료적 치료의 다양한 시점에 있는 것으로 진단된 대상체로부터 혈액 샘플을 채취한다. 진행 또는 요법의 각 단계에 대해 통계적으로 유의미한 결과를 제공하는 샘플의 집단을 사용하여, 각 단계의 특징으로 간주될 수 있는 항원의 농도 범위가 지정된다.
활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체는 또한 진단적 및/또는 이미징 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 시험관내 방법이다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 생체내 방법이다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 인시츄 방법이다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 생체외 방법이다. 예를 들어, 효소적으로 절단 가능한 CM1-CM2 기질을 갖는 활성화 가능한 항체는 CM1-CM2 기질을 절단할 수 있는 효소의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 활성화 가능한 항체는 주어진 숙주 유기체의 주어진 세포 또는 조직에서 활성화된 항체(즉, 활성화 가능한 항체의 절단으로 인한 항체)의 측정된 축적을 통해 효소 활성(또는, 일부 실시형태에서, 이황화물 결합의 환원을 제공할 수 있는 것과 같이 환원 가능성이 증가된 환경)의 생체내 검출(예를 들어, 정성적 또는 정량적)을 포함할 수 있는 진단에 사용될 수 있다. 이러한 활성화된 항체의 축적은 조직이 효소적 활성(또는 CM1-CM2 기질의 특성에 따라 증가된 환원 가능성)을 나타낼 뿐만 아니라 조직이 활성화된 항체가 결합하는 표적을 발현함을 나타낸다.
예를 들어, CM1-CM2 기질은 종양 부위에서, 생물학적으로 제한된 부위(예를 들어, 예컨대 농양, 장기 등)의 바이러스 또는 세균 감염 부위 등에서 발견되는 프로테이스에 대한 프로테이스 기질로 선택될 수 있다. AB는 표적 항원에 결합하는 것일 수 있다. 당업자에 익숙한 방법을 사용하여, 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지 또는 방사성 표지 또는 방사성 트레이서)는 활성화 가능한 항체의 AB 또는 기타 영역에 접합될 수 있다. 적합한 검출 가능한 표지는 위의 스크리닝 방법의 맥락에서 논의되고, 추가적인 특정 예가 아래에 제공된다. 관심 있는 질환 조직에서 활성이 상승된 프로테이스와 함께 질환 상태의 단백질 또는 펩타이드에 특이적인 AB를 사용하면, 활성화 가능한 항체 CM1-CM2 기질이 있는 조직에 비해 질환 조직에 대한 증가된 결합 속도를 나타낼 것이며, 특정 효소는 검출 가능한 수준으로 존재하지 않거나 또는 질환 조직보다 낮은 수준으로 존재하거나 또는 불활성(예를 들어, 자이모겐 형태 또는 저해제와의 복합체)이다. 작은 단백질 및 펩타이드는 신장 여과 시스템에 의해 혈액으로부터 빠르게 제거되며, CM1-CM2 기질에 특이적인 효소가 검출 가능한 수준으로 존재하지 않기 때문에(또는 비-질환 조직에서 낮은 수준으로 존재하거나 또는 불활성 형태로 존재), 질환 조직에서 활성화된 항체의 축적은 비-질환 조직에 비해 향상된다.
다른 예에서, 활성화 가능한 항체는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 가능한 항체가 효소에 의해 절단되기 쉬운 CM1-CM2 기질을 함유하는 경우, 활성화 가능한 항체는 샘플에서 효소의 존재를 검출(정성적으로 또는 정량적으로)하는데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 활성화 가능한 항체가 환원제에 의해 절단되기 쉬운 CM1-CM2 기질을 함유하는 경우, 활성화 가능한 항체는 샘플에서 환원 조건의 존재를 검출(정성적으로 또는 정량적으로)하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서 분석을 용이하게 하기 위해, 활성화 가능한 항체는 검출 가능하게 표지될 수 있고, 지지체(예를 들어, 슬라이드 또는 비드와 같은 고체 지지체)에 결합될 수 있다. 검출 가능한 표지는 절단 후 방출되지 않은 활성화 가능한 항체의 일부에 위치할 수 있으며, 예를 들어, 검출 가능한 표지는 절단이 일어날 때까지 검출할 수 없는 ??칭된 형광 표지 또는 다른 표지일 수 있다. 검정은 예를 들어, 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안, 고정되고 검출 가능하게 표지된 활성화 가능한 항체를 효소 및/또는 환원제를 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킨 다음, 과도한 샘플 및 오염물을 제거하기 위해 세척함으로써 수행될 수 있다. 그 후, 샘플에서 절단제(예를 들어, 효소 또는 환원제)의 존재 또는 부재는 샘플과 접촉하기 전 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 신호의 변화, 예를 들어, 샘플에서 절단제에 의한 활성화 가능한 항체의 절단으로 인한 검출 가능한 신호의 존재 및/또는 증가에 의해 평가된다.
이러한 검출 방법은 또한 절단될 때 활성화 가능한 항체의 AB에 결합할 수 있는 표적의 존재 또는 부재의 검출을 제공하도록 조정될 수 있다. 따라서, 검정은 절단제의 존재 또는 부재 및 관심 있는 표적의 존재 또는 부재를 평가하도록 조정될 수 있다. 절단제의 존재 또는 부재는 위에 기재된 바와 같은 활성화 가능한 항체의 검출 가능한 표지의 존재 및/또는 증가에 의해 검출될 수 있고, 표적의 존재 또는 부재는 표적-AB 복합체의 검출에 의해, 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 항-표적 항체의 사용에 의해 검출될 수 있다.
활성화 가능한 항체는 또한 예를 들어, 프로테이스 절단 및 특정 표적에 대한 결합에 의한 활성화 가능한 항체 활성화의 검증을 위한 인시츄 이미징에 유용하다. 인시츄 이미징은 세포 배양물 또는 조직 절편과 같은 생물학적 샘플에서 단백질 가수분해 활성 및 표적의 국재화를 가능하게 하는 기법이다. 이러한 기법을 사용하여, 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지)의 존재에 기초하여 주어진 표적에 대한 결합 및 단백질 가수분해 활성을 모두 확인할 수 있다.
이러한 기법은 질환 부위(예를 들어, 종양 조직) 또는 건강한 조직으로부터 유래된 임의의 냉동된 세포 또는 조직에 유용하다. 이러한 기법은 또한 새로운 세포 또는 조직 샘플에 유용하다.
이러한 기법에서, 활성화 가능한 항체는 검출 가능한 표지로 표지된다. 검출 가능한 표지는 형광 염료(예를 들어, 형광단, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 로다민 아이소티오사이아네이트(TRITC), Alexa Fluor® 표지), 근적외선(NIR) 염료(예를 들어, Qdot® 나노결정), 콜로이드성 금속, 합텐, 방사성 표지 마커, 바이오틴, 및 스트렙타비딘과 같은 증폭 시약 또는 효소(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스 또는 알칼리 포스파테이스)일 수 있다.
표지된 활성화 가능한 항체와 함께 인큐베이션된 샘플에서 표지의 검출은 샘플이 표적을 함유하며, 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에 특이적인 프로테이스를 함유함을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 프로테이스의 존재는 본 명세서에 기재된 것과 같은 광범위 스펙트럼 프로테이스 저해제를 사용하고/하거나 프로테이스에 특이적인 작용제, 예를 들어, 프로테이스 매트립테이스(MT-SP1)에 특이적이고 매트립테이스의 단백질 가수분해 활성을 저해하는 A11과 같은 항체를 사용하여 확인될 수 있다; 예를 들어, 2010년 11월 11일에 공개된 국제 공개 번호 WO 2010/129609 참조. 본 명세서에 기재된 것과 같은 광범위 스펙트럼 프로테이스 저해제를 사용하고/하거나 보다 선택적인 저해제를 사용하는 동일한 접근법이 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에 특이적인 프로테이스 또는 프로테이스의 클래스를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적의 존재는 표적에 특이적인 작용제를 사용하여 확인될 수 있으며, 예를 들어, 다른 항체 또는 검출 가능한 표지는 비표지된 표적과 경쟁할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비표지된 활성화 가능한 항체는 표지된 2차 항체 또는 더 복잡한 검출 시스템에 의한 검출과 함께 사용될 수 있다.
유사한 기법이 또한 대상체, 예를 들어, 인간을 포함하는 포유동물에서 형광 신호의 검출이 질환 부위가 표적을 함유하며, 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에 특이적인 프로테이스를 함유함을 나타내는 생체내 이미징에 유용하다.
이러한 기법은 또한 활성화 가능한 항체의 프로테이스-특이적 CM1-CM2 기질에 기초하여 다양한 세포, 조직 및 유기체에서 프로테이스 활성의 검출, 확인 또는 특성화를 위한 키트 및/또는 시약으로서 유용하다.
일부 실시형태에서, 인시츄 이미징 및/또는 생체내 이미징은 치료할 환자를 확인하기 위한 방법에 유용하다. 예를 들어, 인시츄 이미징에서, 활성화 가능한 항체는 적절한 위치, 예를 들어, 종양 부위에서 적절한 프로테이스(들) 및 표적(들)을 갖는 환자를 확인하기 위해 환자 샘플을 스크리닝하는데 사용된다.
일부 실시형태에서, 인시츄 이미징은 본 개시내용의 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 환자 집단을 확인 또는 그렇지 않으면 재정의하기 위해 사용된다. 예를 들어, 표적 및 테스트되는 활성화 가능한 항체의 절단성 모이어티(CM1-CM2 기질)에서 기질을 절단(예를 들어, 질환 부위에서 활성화된 항체를 축적)하는 프로테이스 모두에 대해 양성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인된다. 마찬가지로, 이러한 방법을 사용하여 테스트되는 활성화 가능한 항체의 CM1-CM2 기질에서 기질을 절단하는 프로테이스 중 하나 또는 둘 다에 대해 음성으로 테스트된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인된다(즉, 테스트중인 활성화 가능한 항체를 사용한 치료에 적합하지 않음). 일부 실시형태에서, 제1 활성화 가능한 항체에 대해 음성으로 테스트된 이러한 환자는 치료에 적합한 활성화 가능한 항체(예를 들어, 질환의 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체)가 확인될 때까지 상이한 CM을 포함하는 다른 활성화 가능한 항체로 테스트될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생체내 이미징은 본 개시내용의 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 환자 집단을 확인 또는 그렇지 않으면 재정의하기 위해 사용된다. 예를 들어, 표적 및 테스트되는 활성화 가능한 항체의 절단성 모이어티(CM1-CM2 기질)에서 기질을 절단(예를 들어, 질환 부위에서 활성화된 항체를 축적)하는 프로테이스 둘 다에 대해 양성으로 테스트된 환자는 이러한 CM1-CM2 기질을 포함하는 이러한 활성화 가능한 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인된다. 마찬가지로, 음성으로 테스트된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인된다(즉, 테스트중인 활성화 가능한 항체를 사용한 치료에 적합하지 않음). 일부 실시형태에서, 제1 활성화 가능한 항체에 대해 음성으로 테스트된 이러한 환자는 치료에 적합한 활성화 가능한 항체(예를 들어, 질환의 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM1-CM2 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체)가 확인될 때까지 상이한 CM을 포함하는 다른 활성화 가능한 항체로 테스트될 수 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용의 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체(본 명세서에서 "활성 화합물"로도 지칭됨) 및 이들의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 접합된 항체, 활성화 가능한 항체 및/또는 접합된 활성화 가능한 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여와 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 적합한 담체는 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 당업계의 표준 참고 문헌인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기재되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 적합한 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 리포솜 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 조성물에서 이들의 사용이 상정된다. 보충적 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 의도된 투여 투여와 상용성일 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하 경구(예를 들어, 흡입), 경피(즉, 국소), 점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 구성 요소를 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA); 완충액, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성의 조절을 위한 작용제, 예컨대 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 소듐 하이드록사이드로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 1회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사 가능한 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리학적 식염수, 정균수, 크레모포어 EL™(바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 주사하기에 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기적인 흡수는 조성물 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사용 용액은 위에 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합을 갖는 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 혼입하고, 필요하다면 그 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터의 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가적인 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 또는 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있되, 유체 담체 내의 화합물은 경구로 적용되며, 헹구고 뱉고 삼켜질 수 있다. 약제학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조제는 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 유사한 특성의 임의의 다음의 성분 또는 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트래거캔스 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로트(Sterote); 활택제, 예컨대 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진체, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체, 또는 네뷸라이저를 포함하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 분무 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 점막 또는 경피 투여를 위해, 침투될 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 점막 투여의 경우, 세제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같은 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
화합물은 또한 직장 전달을 위한 좌약(예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세라이드와 같은 종래의 좌약 기제를 사용) 또는 정체 관장의 형태로 제조될 수 있다.
일 실시형태에서, 활성 화합물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이 신체로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체로 제조된다. 에틸렌 바이닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼 인코포레이션(Nova Pharmaceuticals, Inc)으로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜을 포함)이 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 나타낸 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대해 일원화된 투여로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료적 효과 및 개체의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 내제된 한계에 의해 지시되며 이에 직접 의존한다.
약제학적 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예에서 더 설명될 것이며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 : 활성화 가능한 항체 및 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 절단성 기질
본 명세서에서 제공된 연구는 본 개시내용의 예시적인 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질 및 본 개시내용의 MMP 기질을 포함하는 예시적인 활성화 가능한 항체를 설명한다.
예시적인 활성화 가능한 항체는 각각이 표 1에 열거된 MMP 기질 중 하나를 포함하도록 구축하였다. 서열이 표 2에 열거된 예시적인 본 개시내용의 활성화 가능한 항체는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 마우스/인간 키메라 단일클론 항체에 기초한 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함한다. 예시적인 활성화 가능한 항체는 또한 AB의 경쇄의 N-말단에 커플링된 프로도메인을 포함한다. 각각 프로도메인은 차폐 모이어티(MM) 및 절단성 모이어티(CM)를 포함하며, CM은 표 1의 적어도 하나의 MMP 기질 서열을 포함한다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 2 : MMP-절단성 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 시험관내 안정성
본 명세서에서 제공된 연구는 본 개시내용의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질을 함유하는 활성화 가능한 항체의 시험관내 안정성을 평가한다.
본 개시내용의 활성화 가능한 항체의 안정성을 재조합 MMP9 또는 재조합 MMP14 매트릭스 메탈로프로테이스의 존재하에 측정하였다. 각각의 활성화 가능한 항체(100 ㎍/㎖)를 50mM의 명시된 재조합 프로테이스와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 절단된 활성화 가능한 항체의 분획을 각 프로테이스 효소에 대한 모세관 전기영동에 의해 측정하였다. 이 시험관내 연구의 예시적인 결과는 표 3에 요약되어 있다.
이러한 예시적인 결과는 본 개시내용의 기질이 MMP9 또는 MMP14 효소에 의한 다양한 절단성을 나타냄을 보여준다. 이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 85%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 ALAHGLF(서열번호 1), DLAHPLL(서열번호 2) 또는 RGPKLYW(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드일 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 90%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 ALAHGLF(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
Figure pct00027
실시예 3 : MMP-절단성 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 생체내 안정성
본 명세서에서 제공된 연구는 본 개시내용의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질을 함유하는 활성화 가능한 항체의 생체내 안정성을 평가한다.
이러한 예시적인 연구는 일정 용량의 활성화 가능한 항체를 마우스에 투여한 다음 절단되는 것으로 관찰된 혈장에서 활성화 가능한 항체의 분획을 웨스턴 블롯에 의해 측정함으로써 본 개시내용의 MMP 기질을 함유하는 활성화 가능한 항체의 안정성을 측정하였다. 안정성을 기질, 예를 들어, 적어도 하나의 MMP 기질과 적어도 세린 프로테이스 기질을 포함하는 2011(ISSGLLSGRSDNP, 서열번호 21)과 3011(AVGLLAPPGGLSGRSDNP, 서열번호 22) 또는 적어도 하나의 MMP 기질을 포함하는 기질 1001(ISSGLLSS, 서열번호 17)을 갖는 다른 공지된 활성화 가능한 항체와 비교하였다.
이 연구에서, 약 7 내지 8주령의 nu/nu 마우스에 명시된 테스트 물품을 12.5 ㎎/㎏의 투여량으로 복강내로 투여하였다. 투여 7일 후, 심장 천자에 의해 말단 혈액을 수집하고, 수집 1시간 이내에 혈장으로 처리하였다. 수집된 샘플을 포스페이트-완충 식염수 용액에 1:100으로 희석하고, 변성시키고, A110UK 염소 항-인간 IgG 항체(아메리칸 쿠알렉스(American Qualex)) 및 항-염소 2차 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 사용하여 WES 웨스턴 블롯 프로토콜(프로테인 심플(Protein Simple))을 사용하여 분석하였다. 절단된 활성화 가능한 항체의 분획을 절단된 활성화 가능한 항체에 상응하는 더 높은 이동성 폴리펩타이드의 분획을 정량화하여 결정하였다. 이러한 예시적인 검정의 결과는 표 4 및 도 1에 요약되어 있다.
Figure pct00028
이러한 예시적인 결과는 본 개시내용의 MMP 기질을 포함하는 소정의 활성화 가능한 항체가 세린 프로테이스 및 MMP 기질 둘 모두를 갖는 활성화 가능한 항체보다 더 높은 생체내 안정성을 나타냄을 보여주었다.
이러한 예시적인 결과는 또한 생체내 안정성이 활성화의 30% 미만인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 ALAHGLF(서열번호 1) 또는 RGPKLYW(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 생체내 안정성이 활성화의 25% 미만인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 ALAHGLF(서열번호 1) 또는 RGPKLYW(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
실시예 4 : MMP-절단성 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 차폐 효율
본 명세서에서 제공된 연구는 본 개시내용의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체의 시험관내 차폐 효율을 평가한다.
이 연구에서, 재조합 EGFR에 대한 본 개시내용의 MMP 기질을 포함하는 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 결합 친화도를 입증하기 위해 고형-상 결합 검정(ELISA)을 사용하였다. 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 명시된 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 EGFR에 대한 결합 친화도를 측정하고, c225v5 모 항체와 비교하였다. 차폐 효율을 공지된 기질, 예를 들어, 적어도 하나의 MMP 기질과 적어도 세린 프로테이스 기질을 포함하는 2001(ISSGLLSGRSDNH, 서열번호 23) 또는 기질 1001(ISSGLLSS, 서열번호 17), 1004(AVGLLAPP, 서열번호 18) 및 적어도 하나의 MMP 기질을 포함하는 1005(GPSHLVLT, 서열번호 19)를 갖는 다른 활성화 가능한 항체와 비교하였다. 이러한 예시적인 결과의 예는 표 5 및 도 2a와 도 2b에 나타나 있다.
이러한 예시적인 결과는 MMP 기질이 활성화 가능한 항체에서 차폐 모이어티의 차폐 효율에 영향을 미치며, 일부 경우에 활성화 가능한 항체의 프로도메인에서 차폐 모이어티의 겉보기 차폐 효율을 증가시킴을 보여주었다.
이러한 예시적인 결과는 또한 차폐 효율이 70 이상인 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 ALAHGLF(서열번호 1), RGPKLYW(서열번호 6) 또는 RFPYGVW(서열번호 7)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 차폐 효율이 160 이상인 기질의 그룹을 보여준다. 이러한 예시적인 결과는 또한 차폐 효율이 160 내지 350인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 ALAHGLF(서열번호 1) 또는 RFPYGVW(서열번호 7)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
Figure pct00029
실시예 5 : 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 생체내 효능
본 명세서에서 제공된 연구는 마우스 H292(인간 폐 암 세포주) 이종이식 모델을 사용하여 본 개시내용의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체의 생체내 효능을 평가한다.
이 연구에서, 6 내지 8주령의 암컷 nu/nu 마우스에서 H292(인간 폐 암-유래 세포주) 피하 이종이식 종양은 180㎣ 내지 260㎣의 평균 부피로 성장하였다. H292 세포주는 항-EGFR 항체 세툭시맙에 반응한다. 그런 다음, 마우스를 각각 7마리씩 그룹으로 무작위화하고, 각 그룹에 10 ㎎/㎏의 명시된 테스트 물품을 제1일에 복강내로 투여하였다. 평균 종양 부피±SEM을 도 3a에 나타낸 바와 같이 테스트 물품의 투여 후 각 시점에 대해 플롯팅하였다. 도 3b는 명시된 기질을 갖는 활성화된 항체, 또는 세툭시맙 또는 면역글로불린(IVIG) 대조군으로 처리된 각 마우스에 대해 제28일에서의 절대 종양 부피의 분포를 보여준다. 공지된 기질, 예를 들어, 적어도 하나의 MMP 기질을 포함하는 1001(ISSGLLSS), 1004(AVGLLAPP) 및 1005(GPSHLVLT)를 갖는 활성화 가능한 항체 또는 비절단성 글리신-세린 링커(NSUB)로 효능을 결정하였다.
도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 MMP 기질을 갖는 소정의 활성화 가능한 항체는 프로도메인이 결여된 세툭시맙에 필적하는 생체내 효능을 입증하였다.
실시예 6 : 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 생체내 종양내 활성화
본 명세서에서 제공된 연구는 마우스 H292(인간 폐 암 세포주) 이종이식 모델에 투여한 후 본 개시내용의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체의 생체내 종양내 활성화를 평가한다.
이 연구에서, 6 내지 8주령의 암컷 nu/nu 마우스에서 H292(인간 폐 암-유래 세포주) 피하 이종이식 종양은 180㎣ 내지 260㎣의 평균 부피로 성장하였다. H292 세포주는 항-EGFR 항체 세툭시맙에 반응한다. 그런 다음, 마우스를 각각 7마리씩 그룹으로 무작위화하고, 각 그룹에 10 ㎎/㎏의 명시된 테스트 물품을 제1일에 복강내로 투여하였다. 각각의 마우스를 명시된 기질을 갖는 활성화된 항체, 또는 세툭시맙 또는 면역글로불린(IVIG) 대조군으로 처리하였다. 공지된 기질, 예를 들어, 적어도 하나의 MMP 기질을 포함하는 1001(ISSGLLSS, 서열번호 17), 1004(AVGLLAPP, 서열번호 18) 및 1005(GPSHLVLT, 서열번호 19)를 갖는 활성화 가능한 항체 또는 비절단성 글리신-세린 링커(NSUB)로 효능을 결정하였다.
투여 4일 후 마우스로부터 종양 및 혈장을 수집하였다. 종양 조직을 HALT 프로테이스 저해제 칵테일(써모 피셔(Thermo Fisher)) 및 EDTA를 함유하는 면역침강 완충액(피어스(Pierce))으로 용해하고, Barocycler(프레셔 바이오사이언스(Pressure Bioscience))를 사용하여 용해하였다. A110UK 염소 항-인간 IgG 항체(아메리칸 쿠알렉스) 및 항-염소 2차 항체(잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 WES 웨스턴 블롯 프로토콜(프로테인 심플)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 절단된 활성화 가능한 항체의 분획을 절단된 활성화 가능한 항체에 상응하는 더 높은 이동성 폴리펩타이드의 분획을 정량화하여 결정하였다. 이러한 예시적인 검정의 결과는 표 6 및 도 4에 요약되어 있다.
본 개시내용의 MMP 기질을 갖는 소정의 활성화 가능한 항체의 특성의 요약은 표 6에 나타나 있다. 표 4가 제시되어 있는 실시예 3으로부터의 명시된 테스트 물품의 생체내 안정성을 비교하였다. 이러한 예시적인 결과는 MMP 기질 4001이 MMP9 및 MMP14 둘 다에 의한 절단성을 포함하는 바람직한 특성을 나타냄을 보여준다. 일부 기질은 또한 다른 참조 MMP 기질(1001 및 1004)보다 높은 상대적 안정성을 나타내었다.
이러한 예시적인 결과는 또한 생체내 비-종양 및/또는 종양내 안정성이 활성화의 30% 미만인 기질의 그룹을 보여준다. 이러한 예시적인 결과는 또한 생체내 비-종양 및/또는 종양내 안정성이 활성화의 20% 내지 30%인 기질의 그룹을 보여준다. 이러한 예시적인 결과는 또한 생체내 비-종양 및/또는 종양내 안정성이 활성화의 22% 내지 27%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 ALAHGLF(서열번호 1), RGPKLYW(서열번호 6) 또는 RFPYGVW(서열번호 7)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
Figure pct00030
실시예 7 : 활성화 가능한 항체 및 탠덤 절단성 기질
본 명세서에서 제공된 연구는 본 개시내용의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질에 의한 적어도 하나의 기질 절단성 및 세린 프로테이스에 의한 적어도 하나의 기질 절단성을 포함하는 본 개시내용의 예시적인 탠덤 기질을 설명한다.
예시적인 활성화 가능한 항체를 각각이 표 7에 열거된 탠덤 기질 중 하나를 포함하도록 구축하였다. 서열이 표 7에 열거된 본 개시내용의 예시적인 활성화 가능한 항체는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 마우스/인간 키메라 단일클론 항체에 기초한 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함한다. 예시적인 활성화 가능한 항체는 또한 AB의 경쇄의 N-말단에 커플링된 프로도메인을 포함한다. 각각 프로도메인은 차폐 모이어티(MM) 및 절단성 모이어티(CM)를 포함하며, CM은 표 7의 적어도 하나의 탠덤 기질 서열을 포함한다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
실시예 8 : 탠덤 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 시험관내 안정성
본 명세서에서 제공된 연구는 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질에 의한 적어도 하나의 기질 절단성 및 세린 프로테이스에 의한 적어도 하나의 기질 절단성을 포함하는 본 개시내용의 예시적인 탠덤 기질을 함유하는 활성화 가능한 항체의 시험관내 안정성을 평가한다.
본 개시내용의 활성화 가능한 항체의 안정성을 명시된 재조합 프로테이스(매트립테이스, 레구마인, 호중구 엘라스테이스, MMP2, MMP9 및 MMP14)의 존재하에 측정하였다. 각각의 활성화 가능한 항체(250nM/38.5 ㎍/㎖)를 10mM의 명시된 프로테이스와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 절단된 활성화 가능한 항체의 분획을 각각의 프로테이스 효소에 대한 모세관 전기영동에 의해 측정하였다. A110UK 염소 항-인간 IgG 항체(아메리칸 쿠알렉스) 및 항-염소 2차 항체(잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 WES 웨스턴 블롯 프로토콜(프로테인 심플)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 절단된 활성화 가능한 항체의 분획을 절단된 활성화 가능한 항체에 상응하는 더 높은 이동성 폴리펩타이드의 분획을 정량화하여 결정하였다. 이 시험관내 연구의 예시적인 결과는 표 8A에 요약되어 있다.
또한, 명시된 프로테이스 효소를 사용하여 본 개시내용의 명시된 기질의 절단성 동역학(즉, Kcat/Km(M-1s-1))을 결정하기 위한 예시적인 연구. 이 시험관내 연구의 예시적인 결과는 표 8A에 요약되어 있다.
이러한 예시적인 결과는 본 개시내용의 기질이 명시된 프로테이스에 의해 다양한 절단성을 나타냄을 보여준다.
이러한 예시적인 결과는 본 개시내용의 탠덤 기질이 매트립테이스, MMP9, MMP14, 레구마인 및/또는 호중구 엘라스테이스 효소에 의해 다양한 절단성을 나타냄을 보여준다. 이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 30%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), TARGPALAHGLF(서열번호 29), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 50%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 70%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25) 또는 APRSALAHGLF(서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 15%이고, 매트립테이스 절단성이 적어도 50%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), HVPRQVLSGRS(서열번호 27), HVPRQVLSGRSAN(서열번호 28), APRSALAHGLF(서열번호 31) 또는 ALAHGLFAPRSF(서열번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 15%이고, 호중구 엘라스테이스 절단성이 적어도 30%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), HVPRQVLSGRS(서열번호 27), HVPRQVLSGRSAN(서열번호 28), TARGPALAHGLF(서열번호 29), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 30%이고, 호중구 엘라스테이스 절단성이 적어도 30%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), TARGPALAHGLF(서열번호 29), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 50%이고, 호중구 엘라스테이스 절단성이 적어도 50%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이러한 예시적인 결과는 또한 MMP9 및 MMP14 절단성이 둘 다 적어도 70%이고, 호중구 엘라스테이스 절단성이 적어도 70%인 기질의 그룹을 보여준다. 일부 실시형태에서, 이러한 하위 상태는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25) 또는 APRSALAHGLF(서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
Figure pct00036
Figure pct00037
실시예 9 : 탠덤 기질을 갖는 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 생체내 효능
본 명세서에서 제공된 연구는 마우스 H292(인간 폐 암 세포주) 이종이식 모델을 사용하여 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 기질 및 적어도 하나의 세린 프로테이스 기질을 포함하는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체의 생체내 효능을 평가한다.
이 연구에서, 6 내지 8주령의 암컷 nu/nu 마우스에서 H292(인간 폐 암-유래 세포주) 피하 이종이식 종양은 180㎣ 내지 260㎣의 평균 부피로 성장하였다. H292 세포주는 항-EGFR 항체 세툭시맙에 반응한다. 그런 다음, 마우스를 각각 7마리씩 그룹으로 무작위화하고, 각 그룹에 12.5 ㎎/㎏의 명시된 테스트 물품을 제1일에 복강으로 투여하였다. 평균 종양 부피±SEM은 도 6에 나타낸 바와 같이 테스트 물품의 투여 후 각 시점에 대해 플롯팅하였다. 각각의 마우스를 명시된 기질을 갖는 활성화된 항체, 또는 세툭시맙 또는 면역글로불린(IVIG) 대조군으로 처리하였다. 공지된 기질, 예를 들어, 2001(ISSGLLSGRSDNH) 및 3001(AVGLLAPPGGLSGRSDNH)을 갖는 활성화 가능한 항체를 사용하여 효능을 결정하였다.
생체내 안정성 검정에 더하여, 종양내 검정을 도 7에 나타낸 바와 같은 명시된 활성화 가능한 항체를 사용하여 수행하였다. 투여 4일 후 마우스로부터 종양 및 혈장을 수집하였다. 종양 조직을 프로테이스 저해제 칵테일(써모 피셔) 및 EDTA를 함유하는 면역침강 완충액(피어스)으로 용해하고, Barocycler(프레셔 바이오사이언스)를 사용하여 용해하였다. A110UK 염소 항-인간 IgG 항체(아메리칸 쿠알렉스) 및 항-염소 2차 항체(잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 WES 웨스턴 블롯 프로토콜(프로테인 심플)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 절단된 활성화 가능한 항체의 분획을 절단된 활성화 가능한 항체에 상응하는 더 높은 이동성 폴리펩타이드의 분획을 정량화하여 결정하였다. 이러한 예시적인 검정의 결과는 도 7에 요약되어 있다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 탠덤 MMP 및 세린 프로테이스 기질을 갖는 소정의 활성화 가능한 항체는 프로도메인이 결여된 세툭시맙에 필적하는 생체내 효능을 입증하였다.
실시예 10 : 탠덤 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 차폐 효율
본 명세서에서 제공된 연구는 탠덤 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP) 및 세린 프로테이스 기질을 포함하는 본 개시내용의 활성화 가능한 항체의 시험관내 차폐 효율을 평가한다.
이 연구에서, 재조합 EGFR에 대한 본 개시내용의 MMP 기질을 포함하는 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 결합 친화도를 입증하기 위해 고형-상 결합 검정(ELISA)을 사용하였다. 본 개시내용의 명시된 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 EGFR에 대한 결합 친화도를 측정하고, c225v5 모 항체와 비교하였다. 이러한 예시적인 결과의 요약은 표 9 및 도 8에 나타나 있다.
이러한 예시적인 결과는 탠덤 기질이 활성화 가능한 항체에서 차폐 모이어티의 겉보기 차폐 효율을 증가시킴으로써 효과가 있음을 보여주었다.
Figure pct00038
실시예 11 : 탠덤 기질을 갖는 활성화 가능한 항체의 생체내 안정성
본 명세서에서 제공된 연구는 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 의한 적어도 하나의 기질 절단성 및 세린 및/또는 시스테인 프로테이스에 의한 적어도 하나의 기질 절단성을 포함하는 본 개시내용의 예시적인 탠덤 기질을 함유하는 활성화 가능한 항체의 생체내 안정성을 평가한다.
이러한 예시적인 연구는 마우스에 일정 용량의 활성화 가능한 항체를 투여한 다음 절단되는 것으로 관찰된 혈장에서 활성화 가능한 항체의 분획을 웨스턴 블롯에 의해 측정함으로써 본 개시내용의 MMP 기질을 함유하는 활성화 가능한 항체의 안정성을 측정하였다. 안정성을 기질, 예를 들어, 적어도 하나의 MMP 기질 및 적어도 세린 프로테이스 기질을 포함하는 2001(ISSGLLSGRSDNH) 및 3001(AVGLLAPPGGLSGRSDNH)을 갖는 다른 공지된 활성화 가능한 항체와 비교하였다.
이 연구에서, 약 7 내지 8주령의 nu/nu 마우스에 12.5 ㎎/㎏의 투여량으로 명시된 테스트 물품을 복강내로 투여하였다. 투여 7일 후, 심장 천자에 의해 말단 혈액을 수집하고, 수집 1시간 이내에 혈장으로 처리하였다. 수집된 샘플을 포스페이트-완충 식염수 용액에 1:100으로 희석하고, 변성시키고, A110UK 염소 항-인간 IgG 항체(아메리칸 쿠알렉스) 및 항-염소 2차 항체(잭슨 이뮤노리서치)을 사용하여 WES 웨스턴 블롯 프로토콜(프로테인 심플)을 사용하여 분석하였다. 절단된 활성화 가능한 항체의 분획을 절단된 활성화 가능한 항체에 상응하는 더 높은 이동성 폴리펩타이드의 분획을 정량화하여 결정하였다. 이러한 예시적인 검정의 결과는 표 10에 요약되어 있다.
이러한 예시적인 결과는 본 개시내용의 탠덤 기질을 포함하는 소정의 활성화 가능한 항체가 세린 프로테이스 및 MMP 기질을 둘 다 갖는 활성화 가능한 항체보다 더 높은 생체내 안정성을 나타냄을 보여준다.
Figure pct00039
실시예 12 : 항-EGFR 활성화 가능한 항체의 생체내 종양 조직 활성화
본 명세서에서 제공된 연구는 인간 종양 용해물에 의해 본 개시내용의 탠덤 기질을 포함하는 활성화 가능한 항체의 시험관내 활성화를 평가한다.
이 연구에서, 인간 종양 조직(두경부암 또는 췌장암)을 도 9에 나타낸 기질을 갖는 항-EGFR 활성화 가능한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 예시적인 결과는 5007 기질(APRSALAHGLF; 서열번호 31)을 갖는 활성화 가능한 항체가 탠덤 기질 2001(ISSGLLSGRSDNH; 서열번호 23) 또는 3001(AVGLLAPPGGLSGRSDNH; 서열번호 24)을 갖는 활성화 가능한 항체와 비교하여 더 높은 수준의 활성화를 나타냄을 보여주었다.
추가 연구에서, 두경부 종양 조직 또는 췌장 종양 조직이 있는 본 발명의 5007 탠덤 기질(APRSALAHGLF; 서열번호 31)을 갖는 활성화 가능한 항체의 유사한 활성화 연구를 갈라딘, EDTA, 아프로티닌 또는 시베레스텟으로부터 선택되는 클래스-특이적 프로테이스 저해제를 사용하여 수행하였다. 연구는 광범위-스펙트럼 세린 프로테이스 저해제인 아프로티닌이 활성화의 양을 5% 이하로 감소시켰음을 보여주었다. 비교에서, 다른 세 가지 저해제를 사용한 처리는 비-저해제 대조군 연구와 유사한 수준에서 활성화를 나타내었다. 이러한 예시적인 결과는 이 활성화가 MMP(갈라딘, EDTA) 또는 호중구 엘라스테이스(시베레스텟) 저해제에 의해 저해되지 않음을 보여주었다.
기타 실시형태
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 예시하는 것으로 의도된다. 기타 양상, 이점 및 변형은 다음의 청구범위의 범주 내이다.
SEQUENCE LISTING <110> CYTOMX THERAPEUTICS, INC. <120> MATRIX METALLOPROTEASE-CLEAVABLE AND SERINE OR CYSTEINE PROTEASE-CLEAVABLE SUBSTRATES AND METHODS OF USE THEREOF <130> WO 2020/118109 <140> PCT/US2019/064779 <141> 2019-12-05 <150> 62/778,062 <151> 2018-12-11 <160> 490 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic <400> 1 Ala Leu Ala His Gly Leu Phe 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic <400> 2 Asp Leu Ala His Pro Leu Leu 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic <400> 3 Ala Phe Arg His Leu Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic <400> 4 Pro His Gly Phe Phe Gln 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic <400> 5 Ser Val His His Leu Ile 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic <400> 6 Arg Gly Pro Lys Leu Tyr Trp 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic <400> 7 Arg Phe Pro Tyr Gly Val Trp 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic <400> 8 His Val Pro Arg Gln Val 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic <400> 9 Ser Asn 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Synthetic <400> 180 Cys Pro Tyr Tyr Thr Leu Ser Tyr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 181 <211> 19 <212> PRT <213> Synthetic <400> 181 Cys Asn His Val Tyr Phe Gly Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 182 <211> 19 <212> PRT <213> Synthetic <400> 182 Cys Asn His Phe Thr Leu Thr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 183 <211> 19 <212> PRT <213> Synthetic <400> 183 Cys His His Phe Thr Leu Thr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 184 <211> 18 <212> PRT <213> Synthetic <400> 184 Tyr Asn Pro Cys Ala Thr Pro Met Cys Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys 1 5 10 15 Pro Gly <210> 185 <211> 18 <212> PRT <213> Synthetic <400> 185 Cys Asn His His Tyr Phe Tyr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 186 <211> 18 <212> PRT <213> Synthetic <400> 186 Cys Asn His His Tyr His Tyr Tyr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 187 <211> 18 <212> PRT <213> Synthetic <400> 187 Cys 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Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 211 <211> 16 <212> PRT <213> Synthetic <400> 211 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 212 <211> 10 <212> PRT <213> Synthetic <400> 212 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 213 <211> 11 <212> PRT <213> Synthetic <400> 213 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 214 <211> 8 <212> PRT <213> Synthetic <400> 214 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 215 <211> 4 <212> PRT <213> Synthetic <400> 215 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 216 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic <400> 216 Gly Ser Ser Gly Thr 1 5 <210> 217 <211> 4 <212> PRT <213> Synthetic <400> 217 Gly Ser Ser Gly 1 <210> 218 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic <400> 218 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 219 <400> 219 000 <210> 220 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic <400> 220 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 221 <211> 16 <212> PRT <213> Synthetic <400> 221 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 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Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly 130 135 140 Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 145 150 155 160 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 165 170 175 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 180 185 190 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 195 200 205 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 210 215 220 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 225 230 235 240 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 245 250 255 Cys <210> 462 <211> 258 <212> PRT <213> Synthetic <400> 462 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Pro Thr 20 25 30 Asn Ala Leu Ala His Gly Leu Phe Gly Gly Gly Ser Gln Ile Leu Leu 35 40 45 Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser 50 55 60 Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr 65 70 75 80 Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser 85 90 95 Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 100 105 110 Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala 115 120 125 Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala 130 135 140 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 145 150 155 160 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 165 170 175 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 180 185 190 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 195 200 205 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 225 230 235 240 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 245 250 255 Glu Cys <210> 463 <400> 463 000 <210> 464 <400> 464 000 <210> 465 <400> 465 000 <210> 466 <400> 466 000 <210> 467 <400> 467 000 <210> 468 <400> 468 000 <210> 469 <400> 469 000 <210> 470 <400> 470 000 <210> 471 <400> 471 000 <210> 472 <400> 472 000 <210> 473 <400> 473 000 <210> 474 <400> 474 000 <210> 475 <400> 475 000 <210> 476 <400> 476 000 <210> 477 <400> 477 000 <210> 478 <400> 478 000 <210> 479 <400> 479 000 <210> 480 <211> 265 <212> PRT <213> Synthetic <400> 480 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn Pro Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val 50 55 60 Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg 100 105 110 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser 115 120 125 Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn 130 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Arg 65 70 75 80 Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr 85 90 95 Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 100 105 110 Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 115 120 125 Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys 130 135 140 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 145 150 155 160 Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 165 170 175 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 180 185 190 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 195 200 205 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 210 215 220 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 225 230 235 240 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 245 250 255 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 260 265 270 <210> 482 <211> 255 <212> PRT <213> Synthetic <400> 482 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser 35 40 45 Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys 50 55 60 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile 85 90 95 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 100 105 110 Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr 115 120 125 Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 130 135 140 Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 165 170 175 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 180 185 190 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 195 200 205 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 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Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 165 170 175 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 180 185 190 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 195 200 205 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 210 215 220 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 225 230 235 240 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 245 250 255 Arg Gly Glu Cys 260 <210> 484 <211> 255 <212> PRT <213> Synthetic <400> 484 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Val Gly 20 25 30 Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser 35 40 45 Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys 50 55 60 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile 85 90 95 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 100 105 110 Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr 115 120 125 Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 130 135 140 Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 165 170 175 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 180 185 190 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 195 200 205 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 210 215 220 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 225 230 235 240 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 245 250 255 <210> 485 <211> 261 <212> PRT <213> Synthetic <400> 485 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Pro Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gln 35 40 45 Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu 50 55 60 Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile 65 70 75 80 His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys 85 90 95 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu 115 120 125 Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 130 135 140 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 145 150 155 160 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 165 170 175 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 180 185 190 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 195 200 205 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 210 215 220 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 225 230 235 240 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 245 250 255 Asn Arg Gly Glu Cys 260 <210> 486 <211> 255 <212> PRT <213> Synthetic <400> 486 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Pro Ser 20 25 30 His Leu Val Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser 35 40 45 Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys 50 55 60 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile 85 90 95 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 100 105 110 Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr 115 120 125 Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 130 135 140 Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 165 170 175 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 180 185 190 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 195 200 205 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 210 215 220 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 225 230 235 240 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 245 250 255 <210> 487 <211> 260 <212> PRT <213> Synthetic <400> 487 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Pro Ser His Leu Val Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gln Ile 35 40 45 Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg 50 55 60 Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 65 70 75 80 Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr 85 90 95 Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp 115 120 125 Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe 130 135 140 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 165 170 175 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 180 185 190 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 195 200 205 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 210 215 220 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 225 230 235 240 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 245 250 255 Arg Gly Glu Cys 260 <210> 488 <211> 261 <212> PRT <213> Synthetic <400> 488 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Thr Gln 35 40 45 Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu 50 55 60 Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile 65 70 75 80 His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys 85 90 95 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu 115 120 125 Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 130 135 140 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 145 150 155 160 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 165 170 175 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 180 185 190 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 195 200 205 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 210 215 220 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 225 230 235 240 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 245 250 255 Asn Arg Gly Glu Cys 260 <210> 489 <211> 260 <212> PRT <213> Synthetic <400> 489 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Ser Gln Ile 35 40 45 Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg 50 55 60 Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 65 70 75 80 Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr 85 90 95 Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp 115 120 125 Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe 130 135 140 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 165 170 175 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 180 185 190 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 195 200 205 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 210 215 220 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 225 230 235 240 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 245 250 255 Arg Gly Glu Cys 260 <210> 490 <211> 265 <212> PRT <213> Synthetic <400> 490 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly 1 5 10 15 Pro Tyr Val Met Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Val Gly 20 25 30 Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val 50 55 60 Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg 100 105 110 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser 115 120 125 Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn 130 135 140 Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr 145 150 155 160 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 165 170 175 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 180 185 190 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 195 200 205 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 210 215 220 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 225 230 235 240 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 245 250 255 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 260 265

Claims (159)

  1. 단리된 폴리펩타이드로서,
    탠덤 기질(tandem substrate)을 포함하되, 상기 탠덤 기질은 적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(matrix metalloprotease: MMP)에 대한 기질인 적어도 제1 절단성 모이어티(CM1) 및 적어도 하나의 세린 프로테이스(SP) 또는 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)를 포함하고,
    상기 CM1은 아미노산 서열 AHGL(서열번호 54) 또는 PRQV(서열번호 61)를 포함하며, 그리고
    상기 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM1-CM2 또는 CM2-CM1인, 단리된 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CM1은 ALAHGLF(서열번호 1), ALAHGL(서열번호 52), LAHGLF(서열번호 50), LAHGL(서열번호 53) 및 AHGLF(서열번호 51)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CM1은 HVPRQV(서열번호 8) 및 VPRQV(서열번호 60)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM1 및 CM2는 연결 펩타이드를 통해 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM1 및 CM2는 서로 직접 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 CP 효소에 대한 기질을 포함하되, 상기 CP 효소는 레구마인(legumain)인, 단리된 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 유로카이네이스(urokinase), 매트립테이스(matriptase) 및 호중구 엘라스테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 SP 효소에 대한 기질을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는
    유로카이네이스, 매트립테이스 및 호중구 엘라스테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 SP 효소에 대한 기질; 및
    CP 효소에 대한 기질을 포함하되, 상기CP 효소는 레구마인인, 단리된 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP는 MMP2, MMP9 또는 MMP14인, 단리된 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 SGR, LSGR(서열번호 73), ARG, PRS, TFVH(서열번호 141), AAN, SAN, LPTFV(서열번호 140) 및 GPTN(서열번호 152)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 SGR, LSGR(서열번호 73), LSGRS(서열번호 72), LSGRSD(서열번호 71), LSGRSA(서열번호 110), LSGRSDN(서열번호 70), LSGRSAN(서열번호 109), LSGRSDNH(서열번호 20), LSGRSGNH(서열번호 78), LSGRSDNP(서열번호 90), LSGRSDNI(서열번호 84), LSGRSANI(서열번호 108), LSGRSANP(서열번호 114), LSGRSDYH(서열번호 86), LSGRSDTH(서열번호 92), LSGRSDQH(서열번호 96), LSGRSDIH(서열번호 100) 및 LSGRSDDH(서열번호 104)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 ARGP(서열번호 128), TARG(서열번호 125) 및 TARGP(서열번호 124)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 APRSF(서열번호 130), APRS(서열번호 131) 및 PRSF(서열번호 132)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 150)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 GLPTFVHL(서열번호 135), GLPTFVH(서열번호 136), GLPTFV(서열번호 137), LPTFVHL(서열번호 138), LPTFVH(서열번호 139) 및 LPTFV(서열번호 140)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는
    AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 150)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
    SGR, LSGR(서열번호 73), LSGRS(서열번호 72), LSGRSD(서열번호 71), LSGRSA(서열번호 110), LSGRSDN(서열번호 70), LSGRSAN(서열번호 109), LSGRSDNH(서열번호 20), LSGRSGNH(서열번호 78), LSGRSDNP(서열번호 90), LSGRSDNI(서열번호 84), LSGRSANI(서열번호 108), LSGRSANP(서열번호 114), LSGRSDYH(서열번호 86), LSGRSDTH(서열번호 92), LSGRSDQH(서열번호 96), LSGRSDIH(서열번호 100) 및 LSGRSDDH(서열번호 104)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열
    을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM1-CM2인, 단리된 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM2-CM1인, 단리된 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탠덤 기질은
    (a) 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (b) 서열번호　25, 26, 29, 31, 32, 34, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (c) 서열번호 27, 28, 30, 33 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (d) 서열번호 25, 29, 31, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (e) 서열번호 26, 32 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (f) 서열번호 27, 28 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
    (g) 서열번호 30 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  20. 단리된 폴리펩타이드로서,
    표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB);
    적어도 하나의 매트릭스 메탈로프로테이스(MMP)에 대한 기질인 적어도 제1 절단성 모이어티(CM1); 및
    적어도 하나의 세린 프로테이스(SP) 또는 시스테인 프로테이스(CP)에 대한 기질인 적어도 제2 절단성 모이어티(CM2)를 포함하되,
    상기 CM1은 아미노산 서열 AHGL(서열번호 54) 또는 PRQV(서열번호 61)를 포함하고, 그리고
    탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM1-CM2 또는 CM2-CM인, 단리된 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 CM1은 ALAHGLF(서열번호 1), ALAHGL(서열번호 52), LAHGLF(서열번호 50), LAHGL(서열번호 53) 및 AHGLF(서열번호 51)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  22. 제20항에 있어서, 상기 CM1은 HVPRQV(서열번호 8) 및 VPRQV(서열번호 60)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM1 및 CM2는 연결 펩타이드를 통해 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM1 및 CM2는 서로 직접 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 CP 효소에 대한 기질을 포함하되, 상기 CP 효소는 레구마인인, 단리된 폴리펩타이드.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 유로카이네이스, 매트립테이스 및 호중구 엘라스테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 SP 효소에 대한 기질을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는
    유로카이네이스, 매트립테이스 및 호중구 엘라스테이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 SP 효소에 대한 기질; 및
    CP 효소에 대한 기질을 포함하되, 상기 CP 효소는 레구마인인, 단리된 폴리펩타이드.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP는 MMP2, MMP9 또는 MMP14인, 단리된 폴리펩타이드.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 SGR, LSGR(서열번호 73), ARG, PRS, TFVH(서열번호 141), LPTFV(서열번호 140), AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 152)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 SGR, LSGR(서열번호 73), LSGRS(서열번호 72), LSGRSD(서열번호 71), LSGRSA(서열번호 110), LSGRSDN(서열번호 70), LSGRSAN(서열번호 109), LSGRSDNH(서열번호 20), LSGRSGNH(서열번호 78), LSGRSDNP(서열번호 90), LSGRSDNI(서열번호 84), LSGRSANI(서열번호 108), LSGRSANP(서열번호 114), LSGRSDYH(서열번호 86), LSGRSDTH(서열번호 92), LSGRSDQH(서열번호 96), LSGRSDIH(서열번호 100) 및 LSGRSDDH(서열번호 104)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  31. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 ARGP(서열번호 128), TARG(서열번호 125) 및 TARGP(서열번호 124)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  32. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 APRSF(서열번호 130), APRS(서열번호 131) 및 PRSF(서열번호 132)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  33. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 GLPTFVHL(서열번호 135), GLPTFVH(서열번호 136), GLPTFV(서열번호 137), LPTFVHL(서열번호 138), LPTFVH(서열번호 139) 및 LPTFV(서열번호 140)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  34. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는 AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 150)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  35. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM2는
    AAN, SAN 및 GPTN(서열번호 150)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
    SGR, LSGR(서열번호 73), LSGRS(서열번호 72), LSGRSD(서열번호 71), LSGRSA(서열번호 110), LSGRSDN(서열번호 70), LSGRSAN(서열번호 109), LSGRSDNH(서열번호 20), LSGRSGNH(서열번호 78), LSGRSDNP(서열번호 90), LSGRSDNI(서열번호 84), LSGRSANI(서열번호 108), LSGRSANP(서열번호 114), LSGRSDYH(서열번호 86), LSGRSDTH(서열번호 92), LSGRSDQH(서열번호 96), LSGRSDIH(서열번호 100) 및 LSGRSDDH(서열번호 104)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열
    을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM1-CM2인, 단리된 폴리펩타이드.
  37. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탠덤 기질의 N-말단에서 C-말단 배열은 CM2-CM1인, 단리된 폴리펩타이드.
  38. 제20항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탠덤 기질은:
    (a) 서열번호　25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (b) 서열번호　25, 26, 29, 31, 32, 34, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (c) 서열번호 27, 28, 30, 33 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (d) 서열번호 25, 29, 31, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (e) 서열번호 26, 32 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (f) 서열번호 27, 28 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
    (g) 서열번호 30 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  39. 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP, CP 및 SP 중 적어도 하나는 표적과 함께 조직에서 공동-국재화(co-localized)되는, 단리된 폴리펩타이드.
  40. 제20항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이의 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 폴리펩타이드.
  41. 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AB는 상기 CM1에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  42. 제41항에 있어서, 상기 AB는 상기 CM1에 직접 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  43. 제41항에 있어서, 상기 AB는 연결 펩타이드를 통해 상기 CM1에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  44. 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AB는 CM2에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  45. 제44항에 있어서, 상기 AB는 CM2에 직접 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  46. 제44항에 있어서, 상기 AB는 연결 펩타이드를 통해 상기 CM2에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  47. 제20항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 CM1 또는 CM2는 상기 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  48. 제20항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 CM1 또는 CM2는 상기 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  49. 제20항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 차폐 모이어티(MM)를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 MM은 표적에 결합하기 위한 AB의 해리 상수보다 큰 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는, 단리된 폴리펩타이드.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 MM은 40개의 아미노산 길이 이하의 폴리펩타이드인, 단리된 폴리펩타이드.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM은 절단되지 않은 상태에서 단리된 폴리펩타이드가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2-AB 또는 AB-CM2-CM1-MM을 포함하도록 상기 CM1에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  53. 제52항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 상기 MM과 CM1의 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  54. 제52항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 상기 CM2와 AB의 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  55. 제52항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는
    상기 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드; 및
    상기 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드
    를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  56. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM은 절단되지 않은 상태에서 단리된 폴리펩타이드가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM2-CM1-AB 또는 AB-CM1-CM2-MM을 포함하도록 상기 CM2에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  57. 제56항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 상기 MM과 CM2 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  58. 제56항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 상기 CM1과 AB 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  59. 제56항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는
    상기 MM과 CM2 사이의 연결 펩타이드; 및
    상기 CM1과 AB 사이의 연결 펩타이드
    를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  60. 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 CM1 또는 CM2는 상기 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  61. 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 CM1 또는 CM2는 상기 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  62. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 제1 연결 펩타이드(LP1) 및 제2 연결 펩타이드(LP2)를 포함하되, 상기 단리된 폴리펩타이드는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM-LP1-CM2-CM1-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM을 갖는, 단리된 폴리펩타이드.
  63. 제62항에 있어서, 상기 2개의 연결 펩타이드는 서로 동일하지 않은, 단리된 폴리펩타이드.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드인, 단리된 폴리펩타이드.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 CM1과 CM2 사이에 제3 연결 펩타이드(LP')를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP1 또는 LP2는 GGSG(서열번호　202), GGSGG(서열번호　203), GSGSG(서열번호　204), GSGGG(서열번호　205), GGGSG(서열번호　206) 및 GSSSG(서열번호　207)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP1은 GSSGGSGGSGGSG(서열번호　208), GSSGGSGGSGG(서열번호　209), GSSGGSGGSGGS(서열번호　210), GSSGGSGGSGGSGGGS(서열번호　211), GSSGGSGGSG(서열번호　212) 또는 GSSGGSGGSGS(서열번호　213), GGGSSGGS(서열번호 214) 및 GSSGGSGGSGGSG(서열번호 215)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP2는 GSS, GGS, GGGS(서열번호　216), GSSGT(서열번호　217) 또는 GSSG(서열번호　218)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP1은 GSSGGSGGSGGSG(서열번호　208) 또는 GGGSSGGS(서열번호 214)의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LP2는 GGS 또는 GGGS(서열번호　216)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  70. 제62항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 LP2는 상기 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  71. 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 LP2는 상기 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 단리된 폴리펩타이드.
  72. 제49항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM의 아미노산 서열은 표적의 것과 상이하며, 상기 AB의 천연 결합 파트너의 아미노산 서열과 10% 이하 동일한, 단리된 폴리펩타이드.
  73. 제49항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM은 절단된 상태에서 표적에 결합하기 위한 AB를 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는, 단리된 폴리펩타이드.
  74. 접합된 폴리펩타이드로서, 작용제에 접합된 제19항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드를 포함하는, 접합된 폴리펩타이드.
  75. 활성화 가능한 항체로서, 활성화된 상태에서 표적에 특이적으로 결합하되,
    표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB);
    상기 AB에 커플링된 차폐 모이어티(MM)로서, 상기 MM은 상기 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태인 경우 상기 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는, 상기 AB에 커플링된 차폐 모이어티(MM); 및
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 탠덤 기질을 포함하는 절단성 모이어티(CM1-CM2)
    를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  76. 활성화 가능한 항체로서, 활성화된 상태에서 표적에 특이적으로 결합하되,
    표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB);
    상기 AB에 커플링된 차폐 모이어티(MM)로서, 상기 MM은 상기 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태인 경우 상기 AB의 표적에 대한 결합을 저해하는, 상기 AB에 커플링된 차폐 모이어티(MM); 및
    다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 탠덤 기질을 포함하는 절단성 모이어티(CM1-CM2):
    (a) 서열번호 25 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 25, 26, 29, 31, 32, 34, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (c) 서열번호 27, 28, 30, 33 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (d) 서열번호 25, 29, 31, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (e) 서열번호 26, 32 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (f) 서열번호 27, 28 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
    (g) 서열번호 30 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열
    을 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 상기 MM은 표적에 결합하기 위한 AB의 해리 상수보다 큰 AB에 결합하기 위한 해리 상수를 갖는, 활성화 가능한 항체.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM은 40개의 아미노산 길이 이하의 폴리펩타이드인, 활성화 가능한 항체.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이의 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 활성화 가능한 항체.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM은 절단되지 않은 상태에서 활성화 가능한 항체가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM1-CM2-AB 또는 AB-CM2-CM1-MM을 포함하도록 상기 CM1에 연결되는, 활성화 가능한 항체.
  81. 제80항에 있어서, 상기 활성화 가능한 항체는 상기 MM과 CM1의 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  82. 제80항에 있어서, 상기 활성화 가능한 항체는 상기 CM2와 AB 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  83. 제80항에 있어서, 상기 활성화 가능한 항체는
    상기 MM과 CM1의 사이의 연결 펩타이드; 및
    상기 CM2와 AB 사이의 연결 펩타이드
    를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  84. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM은 절단되지 않은 상태에서 상기 활성화 가능한 항체가 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-CM2-CM1-AB 또는 AB-CM1-CM2-MM을 포함하도록 상기 CM2에 연결되는, 활성화 가능한 항체.
  85. 제84항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 상기 MM과 CM2 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  86. 제84항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 상기 CM1과 AB 사이에 연결 펩타이드를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  87. 제86항에 있어서, 상기 활성화 가능한 항체는
    상기 MM과 CM2 사이의 연결 펩타이드; 및
    상기 CM1과 AB 사이의 연결 펩타이드
    를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  88. 제75항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 CM1 또는 CM2는 상기 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 활성화 가능한 항체.
  89. 제75항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 CM1 또는 CM2는 상기 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 활성화 가능한 항체.
  90. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화 가능한 항체는 제1 연결 펩타이드(LP1) 및 제2 연결 펩타이드(LP2)를 포함하되, 상기 활성화 가능한 항체는 절단되지 않은 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열: MM-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM-LP1-CM2-CM1-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM을 갖는, 활성화 가능한 항체.
  91. 제90항에 있어서, 상기 2개의 연결 펩타이드는 서로 동일하지 않은, 활성화 가능한 항체.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 LP1 및 LP2 각각은 약 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 펩타이드인, 활성화 가능한 항체.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화 가능한 항체는 CM1과 CM2 사이에 제3 연결 펩타이드(LP')를 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP1 또는 LP2는 GGSG(서열번호　202), GGSGG(서열번호　203), GSGSG(서열번호　204), GSGGG(서열번호　205), GGGSG(서열번호　206) 및 GSSSG(서열번호　207)의 아미노산 서열을 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  95. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP1은 GSSGGSGGSGGSG(서열번호　208), GSSGGSGGSGG(서열번호　209), GSSGGSGGSGGS(서열번호　210), GSSGGSGGSGGSGGGS(서열번호　211), GSSGGSGGSG(서열번호　212) 또는 GSSGGSGGSGS(서열번호　213), GGGSSGGS(서열번호 214) 및 GSSGGSGGSGGSG(서열번호 215)의 아미노산 서열을 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  96. 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP2는 GSS, GGS, GGGS(서열번호　216), GSSGT(서열번호　217) 또는 GSSG(서열번호　218)의 아미노산 서열을 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  97. 제90항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LP1은 GSSGGSGGSGGSG(서열번호　208) 또는 GGGSSGGS(서열번호 214)의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LP2는 GGS 또는 GGGS(서열번호　216)의 아미노산 서열을 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  98. 제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 LP2는 상기 AB의 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 활성화 가능한 항체.
  99. 제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AB는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 그리고
    상기 LP2는 상기 AB의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는, 활성화 가능한 항체.
  100. 제75항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM의 아미노산 서열은 상기 표적의 것과 상이하며, 상기 AB의 천연 결합 파트너의 아미노산 서열과 10% 이하 동일한, 활성화 가능한 항체.
  101. 제75항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MM은 절단된 상태에서 표적에 결합하기 위한 AB를 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는, 활성화 가능한 항체.
  102. 제75항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화 가능한 항체는 서열번호　450 내지 462로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호　400을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는, 활성화 가능한 항체.
  103. 접합된 활성화 가능한 항체로서, 작용제에 접합된 제75항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 활성화 가능한 항체를 포함하는, 접합된 활성화 가능한 항체.
  104. 제103항에 있어서, 상기 작용제는 링커를 통해 AB에 접합되는, 접합된 활성화 가능한 항체.
  105. 제104항에 있어서, 상기 링커는 절단성 링커인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  106. 제104항에 있어서, 상기 링커는 비-절단성 링커인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 독소 또는 이의 단편인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  108. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 미세소관 저해제인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  109. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 핵산 손상제인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  110. 제109항에 있어서, 상기 작용제는 돌라스타틴 또는 이의 유도체, 아우리스타틴 또는 이의 유도체, 메이탄시노이드 또는 이의 유도체, 듀오카마이신 또는 이의 유도체 및 칼리키아미신 또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합된 활성화 가능한 항체.
  111. 제110항에 있어서, 상기 작용제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  112. 제110항에 있어서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  113. 제110항에 있어서, 상기 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  114. 제110항에 있어서, 상기 작용제는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택되는 메이탄시노이드(maytansinoid)인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  115. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 검출 가능한 모이어티인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  116. 제115항에 있어서, 상기 검출 가능한 모이어티는 진단제인, 접합된 활성화 가능한 항체.
  117. 약제학적 조성물로서,
    제20항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드 또는 제75항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 활성화 가능한 항체 또는 제103항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 접합된 활성화 가능한 항체; 및
    담체
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  118. 제117항에 있어서, 추가적인 작용제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  119. 제118항에 있어서, 상기 추가적인 작용제는 치료제인, 약제학적 조성물.
  120. 단리된 핵산 분자로서, 제20항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드 또는 제75항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 활성화 가능한 항체를 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  121. 제120항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  122. 항체 또는 활성화 가능한 항체를 생산하는 방법으로서, 제20항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드 또는 제75항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에 세포를 배양함으로써 생산하되, 상기 세포는 제120항의 핵산 분자를 포함하는, 항체 또는 활성화 가능한 항체를 생산하는 방법.
  123. 활성화된 상태에서 표적에 결합하는 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제75항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 활성화 가능한 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법.
  124. 장애 또는 질환을 치료, 이의 증상을 개선 또는 진행을 지연하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제20항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드 또는 제75항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 활성화 가능한 항체 또는 제103항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 접합된 활성화 가능한 항체 또는 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 장애 또는 질환의 치료, 증상의 개선 또는 진행의 지연을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 장애 또는 질환은 암인, 방법.
  126. 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 방법은 추가적인 작용제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 추가적인 작용제는 치료제인, 방법.
  128. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 CM1 제1 절단성 모이어티의 절단성은 각각 적어도 80%인, 단리된 폴리펩타이드.
  129. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 CM1 제1 절단성 모이어티의 절단성은 각각 적어도 85%인, 단리된 폴리펩타이드.
  130. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 CM1 제1 절단성 모이어티의 절단성은 각각 적어도 90%인, 단리된 폴리펩타이드.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 ALAHGLF(서열번호 1), DLAHPLL(서열번호 2) 또는 RGPKLYW(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  132. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 ALAHGLF(서열번호 1) 및 DLAHPLL(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  133. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 ALAHGLF(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  134. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM1 제1 절단성 모이어티의 생체내 안정성은 활성화가 30% 미만인, 단리된 폴리펩타이드.
  135. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CM1 제1 절단성 모이어티의 생체내 안정성은 활성화가 25% 미만인, 단리된 폴리펩타이드.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 ALAHGLF(서열번호 1) 또는 RGPKLYW(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  137. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 30%인, 단리된 폴리펩타이드.
  138. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 50%인, 단리된 폴리펩타이드.
  139. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 70%인, 단리된 폴리펩타이드.
  140. 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), TARGPALAHGLF(서열번호 29), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  141. 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  142. 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25) 또는 APRSALAHGLF(서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  143. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 15%이며, 상기 매트립테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 50%인, 단리된 폴리펩타이드.
  144. 제143항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), HVPRQVLSGRS(서열번호 27), HVPRQVLSGRSAN(서열번호 28), APRSALAHGLF(서열번호 31) 또는 ALAHGLFAPRSF(서열번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  145. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 15%이며, 상기 호중구 엘라스테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 30%인, 단리된 폴리펩타이드.
  146. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 30%이며, 상기 호중구 엘라스테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 30%인, 단리된 폴리펩타이드.
  147. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 50%이며, 상기 호중구 엘라스테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 50%인, 단리된 폴리펩타이드.
  148. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MMP9 및 MMP14에 의한 탠덤 기질의 절단성은 각각 적어도 70%이며, 상기 호중구 엘라스테이스에 의한 탠덤 기질의 절단성은 적어도 70%인, 단리된 폴리펩타이드.
  149. 제145항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), HVPRQVLSGRS(서열번호 27), HVPRQVLSGRSAN(서열번호 28), TARGPALAHGLF(서열번호 29), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  150. 제145항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), ALAHGLFSGRSAN(서열번호 26), TARGPALAHGLF(서열번호 29), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  151. 제145항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLFAPRSF(서열번호 32), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  152. 제145항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 LSGRSALAHGLF(서열번호 25) 또는 APRSALAHGLF(서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  153. 제137항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체내 안정성은 활성화의 40% 미만인, 단리된 폴리펩타이드.
  154. 제137항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체내 안정성은 활성화의 30% 미만인, 단리된 폴리펩타이드.
  155. 제137항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체내 안정성은 활성화의 25% 미만인, 단리된 폴리펩타이드.
  156. 제137항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체내 안정성은 활성화의 20% 미만인, 단리된 폴리펩타이드.
  157. 제153항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 TARGPALAHGLF(서열번호 29), TARGPVPRQV(서열번호 30), APRSALAHGLF(서열번호 31), ALAHGLPTFVHL(서열번호 34), GLPTFVHLPRQV(서열번호 35), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  158. 제153항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 ALAHGLPTFVHL(서열번호 34), GLPTFVHLPRQV(서열번호 35), AANALAHGLF(서열번호 36) 또는 GPTNALAHGLF(서열번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
  159. 제153항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 ALAHGLPTFVHL(서열번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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DK3628328T3 (da) 2014-01-31 2022-12-05 Cytomx Therapeutics Inc Matriptase- og u-plasminogen-aktivatorsubstrater og andre spaltelige dele og fremgangsmåder til anvendelse deraf
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN110702669A (zh) * 2019-09-19 2020-01-17 湖北科益药业股份有限公司 一种快速阿昔洛韦凝胶含量测定的方法
BR112022020440A2 (pt) 2020-04-10 2022-12-27 Cytomx Therapeutics Inc Construtos de citocinas ativáveis e composições e métodos relacionados
US11512113B2 (en) * 2020-08-11 2022-11-29 Janux Therapeutics, Inc. Cleavable linker compositions and methods
EP4259193A1 (en) 2020-12-09 2023-10-18 Janux Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to tumor activated antibodies targeting psma and effector cell antigens
BR112023018735A2 (pt) 2021-03-16 2023-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Construtos de citocinas ativáveis mascarados e composições e métodos relacionados
CA3233707A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Alexey Yevgenyevich Berezhnoy Activatable cytokine constructs and combination methods
AU2022361492A1 (en) 2021-10-08 2024-05-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
WO2023183888A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antigen-binding protein constructs and uses of the same
WO2023183923A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable dual-anchored masked molecules and methods of use thereof
WO2023192606A2 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd3-binding proteins and methods of use thereof
WO2023192973A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
EP4260907A1 (en) * 2022-04-11 2023-10-18 Universität Zürich Agents for treatment of endometriosis and other benign gynecological neoplasms
WO2024030858A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030850A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030847A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030843A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030845A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
DE3788058T2 (de) 1986-08-28 1994-04-21 Teijin Ltd Zelltoxischer antikörperkomplex und verfahren zu seiner herstellung.
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
EP3492488A1 (en) 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
EP2427479B1 (en) 2009-05-07 2018-11-21 The Regents of The University of California Antibodies and methods of use thereof
GB201009271D0 (en) * 2010-06-02 2010-07-21 Promar As Compositions
US9487590B2 (en) * 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
AU2014324884B2 (en) * 2013-09-25 2020-03-26 Cytomx Therapeutics, Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
DK3628328T3 (da) * 2014-01-31 2022-12-05 Cytomx Therapeutics Inc Matriptase- og u-plasminogen-aktivatorsubstrater og andre spaltelige dele og fremgangsmåder til anvendelse deraf
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220042069A (ko) 2022-01-25 2022-04-04 이덕규 자동판매장치

Also Published As

Publication number Publication date
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IL283756A (en) 2021-07-29
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