JP6996981B2 - マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能及びセリンプロテアーゼ切断可能な基質並びにそれらの使用方法 - Google Patents

マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能及びセリンプロテアーゼ切断可能な基質並びにそれらの使用方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０１５年１月２０日に提出された米国特許仮出願第６２／１０５，４９０号、２０１５年１１月２０日に提出された米国特許仮出願第６２／２５８，０１５号、及び２０１６年１月１４日に提出された米国特許仮出願第６２／２７８，７１３号の利益を主張するものであり、それらのそれぞれの内容を参照によりそれらの全体について本明細書に援用する。
配列表の組込み
「ＣＹＴＭ０３７００１ＷＯ＿ＳＴ２５」と名付けたテキストファイル（２０１６年１月１５日に作成済みであり、サイズは４５６ＫＢである）の内容を、参照によってそれらの全体について本明細書中に援用する。
本発明の分野
本発明は広く、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である少なくとも第一切断可能部分（ＣＭ１）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質である少なくとも第二切断可能部分（ＣＭ２）を含むポリペプチド、少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼのための基質であるＣＭ１及び少なくとも１つのＳＰプロテアーゼのための基質であるＣＭ２を少なくとも含むこれらのポリペプチドを含む活性化可能抗体及び他の大分子、そして、少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼのための基質であるＣＭ１及び少なくとも１つのＳＰプロテアーゼのための基質であるＣＭ２を少なくとも含むそれらのポリペプチドの製造方法及び種々の治療的、診断的及び予防的適用におけるそれらの使用方法に関する。
プロテアーゼは、アミノ酸残基間のペプチド結合を切断することにより、タンパク質を分解する酵素である。プロテアーゼは天然において、すべての生物に存在し、そして単純な分解から高度に制御された経路までの種々の生理的反応に関与している。いくつかのプロテアーゼは、タンパク質内の特定のアミノ酸配列の存在に基づいて、特定のペプチド結合を切断することが知られている。
従って、プロテアーゼのための新規基を同定し、そして種々の治療的、診断的及び予防的適用のためにそれらの基質を使用する必要性が存在する。
本開示は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である少なくとも第一切断可能部分（ＣＭ１）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）の基質である少なくとも第二切断可能部分（ＣＭ２）を含むアミノ酸配列を提供する。これらのアミノ酸配列は、「ＣＭ１－ＣＭ２基質」と本明細書中でまとめて呼ばれる。この用語は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のために基質である第一切断可能部分（ＣＭ１）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質である少なくとも第二切断可能部分（ＣＭ２）の方向又は他の構造配置に関していずれの要件も伝える意図はない。よって、「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語は、以下：ＣＭ１－ＣＭ２又はＣＭ２－ＣＭ１、のようにＮ末端からＣ末端への構造配置を有する基質ＣＭ１－ＣＭ２を網羅する。「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語はまた、ＣＭ１配列の少なくとも一部分がＣＭ２配列の少なくとも一部分に重なる基質も網羅する。
本明細書中に記載したＣＭ１－ＣＭ２基質は、種々の治療的、診断的及び予防的適用において有用である。例えば、これらのＣＭ１－ＣＭ２基質は、抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体であって、該ＡＢの少なくとも１つの抗原－又はエピトープ結合ドメインに連結した少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含んでいて、該ＭＭのカップリングが、その標的に結合するＡＢの能力を低減するような抗体に有用である。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、少なくとも第一ＣＭ（ＣＭ１）及び第二ＣＭ（ＣＭ２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１基質配列の少なくとも一部は、ＣＭ２配列の少なくとも一部に重なる。いくつかの実施形態において、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、共通して少なくとも１つのアミノ酸残基を共有する。いくつかの実施形態において、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、共通して少なくとも２つのアミノ酸残基を共有する。いくつかの実施形態において、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、共通して少なくとも３つのアミノ酸残基を共有する。いくつかの実施形態において、ＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列は、共通して３つ以上のアミノ酸残基を共有する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１とＣＭ２は、一緒に作動可能に連結された別々のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１とＣＭ２は、直接連結された別々のポリペプチドである、すなわち、一方の基質のＮ末端が他方の基質ポリペプチドのＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態において、ＣＭ１のＮ末端は、ＣＭ２のＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態において、ＣＭ２のＮ末端は、ＣＭ１のＣ末端に直接連結される。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１とＣＭ２は、少なくとも１つの連結部分を介して一緒に作動可能に連結された別々のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、未切断状態における活性化可能抗体の第一切断可能部分ＣＭ１と第二切断可能部分ＣＭ２は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ、ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、マスキング部分（ＭＭ）とＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ２とマスキング部分（ＭＭ）の間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ１とＣＭ２の間の連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド、（ＬＰ’）及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５０）である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である。ＭＭＰの例としては、ＭＭＰ１；ＭＭＰ２；ＭＭＰ３；ＭＭＰ７；ＭＭＰ８；ＭＭＰ９；ＭＭＰ１０；ＭＭＰ１１；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ１３；ＭＭＰ１４；ＭＭＰ１５；ＭＭＰ１６；ＭＭＰ１７；ＭＭＰ１９；ＭＭＰ２０；ＭＭＰ２３；ＭＭＰ２４；ＭＭＰ２６；及びＭＭＰ２７を包含する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１、及び／又はＭＭＰ１９のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、ＭＭＰ２のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、ＭＭＰ９のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、ＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、２以上のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ９とＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ２とＭＭＰ９のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ２とＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、３以上のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくともＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、同じＭＭＰのために２以上の基質を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくとも２以上のＭＭＰ２基質を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくとも２以上のＭＭＰ９基質を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、少なくとも２以上のＭＭＰ１４基質を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、ＭＭＰのための基質であり、少なくとも配列ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２０）；ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２１）；ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号３５１）；ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号３５２）；ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号３５３）；ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号３５４）；ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号３５５）；ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号３５６）；ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号３５７）；ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号３５８）；ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号３５９）；ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号３６０）；ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号３６１）；ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号３６２）；ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号３６３）；ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号３６４）；ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号３６５）；ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号３６６）；ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号３６７）；ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号３６８）；ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号３６９）；ＩＳＳＧＬ（配列番号４８０）；ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号４８１）；ＩＳＳＧＬＬ（配列番号４８２）；及び／又はＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１１）を包含する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号３５１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号３５２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号３５３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号３５４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号３５５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号３５６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号３５７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号３５８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号３５９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号３６０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号３６１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号３６２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号３６３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号３６４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号３６５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号３６６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号３６７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号３６８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号３６９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬ（配列番号４８０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号４８１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬ（配列番号４８２）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質である。いくつかの実施形態において、ＳＰは、ｕ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、また、ウロキナーゼとも呼ばれる）、マトリプターゼ（また、本明細書中ではＭＴ－ＳＰ１又はＭＴＳＰ１とも呼ばれる）、及びその組合せから選択される。本明細書中に記載したＣＭ２を切断する他のＳＰの例としては、制限されることのない例によると、活性化プロテインＣ；カテプシンＡ；カテプシンＧ；キマーゼ；凝固因子プロテアーゼ、例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａなど；エラスターゼ；グランザイムＢ；グアニジノベンゾアターゼ；ＨｔｒＡ１；ヒト好中球エラスターゼ；ラクトフェリン；マラプシン；ＮＳ３／４Ａ；ＰＡＣＥ４；プラスミン；ＰＳＡ；ｔＰＡ；トロンビン；トリプターゼ；ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、及び／又はＴＭＰＲＳＳ４を包含する。
例えば、好適なＣＭ２は、少なくとも１つのセリンプロテアーゼによって切断され、配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号３７０）；ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号３７１）；ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号３７２）；ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号１８）；ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号３７３）；ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号３７４）；ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号３７５）；ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号３７６）；ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号３７７）；ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号３７８）；ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号３７９）；ＲＧＰＡ（配列番号３８０）；ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４１２）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４１３）；ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号４１４）；ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４６８）；ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号４１５）；ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５４７）；ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５４８）；ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４９）；ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５５０）；ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５５１）；ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５５２）；ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５５３）；ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５５４）；及び／又はＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７１）を包含する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号３７０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号３７２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号１８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号３７３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号３７４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号３７５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号３７６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号３７７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号３７８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号３７９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＲＧＰＡ（配列番号３８０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４１２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４６８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号４１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号４１５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５４７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５４８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５４９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５５０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５５１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５５２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５５３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５５４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７１）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号１）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号６）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号７）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号８）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号９）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１０）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１１）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１２）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号１３）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１４）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号１５）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号１７）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２２）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４６９）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４７０）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４７１）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号４８３）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号４８４）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号４８５）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号４８６）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号４８７）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号４８８）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号４８９）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号４９０）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５１５）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５１６）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５１７）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５１８）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５１９）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５２０）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５２１）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５２２）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号５５５）；及び／又はＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号５５７）を包含する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号１５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号１６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号１７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４６９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４７０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４７１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号４８３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号４８４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号４８５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号４８６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号４８７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号４８８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号４８９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号４９０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号５１５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号５１６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号５１７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号５１８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号５１９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号５２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号５２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号５２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号５５５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号５５７）を含む。
いくつかの実施形態において、未切断状態における活性化可能抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ、ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は第一連結ペプチド（ＬＰ１）と第二連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして、未切断状態にある抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、又はＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ。いくつかの実施形態において、それぞれＬＰ１とＬＰ２は、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態において、２種の連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、マスキング部分（ＭＭ）とＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ２とマスキング部分（ＭＭ）の間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５０）である。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも一方が、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）｛式中、ｎは少なくとも１つの整数である｝から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも一方が、ＧＧＳＧ（配列番号３８３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３８４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３８５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３８６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３８７）、又はＧＳＳＳＧ（配列番号３８８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３８９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３９１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３９２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３９３）、又はＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号３９４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号３９５）、ＧＳＳＧＴ（配列番号３９６）又はＧＳＳＧ（配列番号３９７）を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＢは、標的に結合するために約１００ｎＭ以下の解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢは完全長の抗体である。いくつかの実施形態において、ＡＢは免疫学的活性フラグメントである。いくつかの実施形態において、ＡＢは抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、ＡＢは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、又は単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態において、斯かるＡＢは、マウス、他の齧歯動物、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、ＭＭＰプロテアーゼは、組織内で標的と共局在化され、そして、ＭＭＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体内のＣＭ１を切断する。いくつかの実施形態において、ＳＰプロテアーゼは、組織内で標的と共局在化され、そして、ＳＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体内のＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態において、ＭＭＰプロテアーゼ及び／又はＳＰプロテアーゼは、組織内で標的と共局在化され、そして、ＭＭＰプロテアーゼ及び／又はＳＰプロテアーゼは、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体内のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。いくつかの実施形態において、ＭＭＰプロテアーゼ及びＳＰプロテアーゼは、組織内で標的と共局在化され、そして、ＭＭＰプロテアーゼ及びＳＰプロテアーゼのうちの少なくとも一方は、抗体がプロテアーゼに晒されるとき、抗体内のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列とＣＭ２基質配列のそれぞれは、独立に、長さが最大１５アミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１つのＭＭＰのための基質であり、そして、同じＭＭＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１つのＭＭＰのための基質であり、そして、同じＭＭＰプロテアーゼによって自然に切断される任意の哺乳類ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１つのＭＭＰのための基質であり、そして、同じＭＭＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のヒトポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１つのＭＭＰのための基質であり、そして、同じＭＭＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％又はそれ以上同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１つのＭＭＰのための基質であり、そして、同じＭＭＰプロテアーゼによって自然に切断される任意の哺乳類ポリペプチド配列とせいぜい９０％又はそれ以上同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列は、少なくとも１つのＭＭＰのための基質であり、そして、同じＭＭＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のヒトポリペプチド配列とせいぜい９０％又はそれ以上同一であるポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１つのＳＰのための基質であり、そして、同じＳＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１つのＳＰのための基質であり、そして、同じＳＰプロテアーゼによって自然に切断される任意の哺乳類ポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１つのＳＰのための基質であり、そして、同じＳＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のヒトポリペプチド配列と実質的に同一でないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１つのＳＰのための基質であり、そして、同じＳＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のポリペプチド配列、例えば任意の動物ポリペプチド配列とせいぜい９０％又はそれ以上同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１つのＳＰのための基質であり、そして、同じＳＰプロテアーゼによって自然に切断される任意の哺乳類ポリペプチド配列とせいぜい９０％又はそれ以上同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ２基質配列は、少なくとも１つのＳＰのための基質であり、そして、同じＳＰプロテアーゼによって自然に切断される任意のヒトポリペプチド配列とせいぜい９０％又はそれ以上同一であるポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、並びに標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、及びＡＢの抗原－又はエピトープ結合ドメインが標的に結合する能力を低減するマスキング部分（ＭＭ）を含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、及び本明細書中に開示された抗Jagged抗体のアミノ酸配列を含む抗Jagged抗体を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、及び配列番号１６２又は配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＬ鎖と配列番号６７又は配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＨ鎖を有する抗体を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２は、配列番号４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３９、４７７、４７９、５０７－５１４、５３９－５４６、５６１、及び５６２から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列と配列番号６７のＨ鎖アミノ酸配列を有する活性化可能抗体に含まれる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２は、配列番号４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３９、４７７、４７９、５０７－５１４、５３９－５４６、５６１、及び５６２から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列と配列番号１６３のＨ鎖アミノ酸配列を有する活性化可能抗体に含まれる。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、並びに本明細書中に開示された抗ＥＧＦＲ抗体のアミノ酸配列を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、並びに配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＬ鎖と配列番号１０８、配列番号１０９、又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖を有する抗体を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２は、配列番号４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４７２、４７４、４９９－５０６、５３１－５３８、５５９、及び５６０から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列と、配列番号１０８のＨ鎖アミノ酸配列を有する活性化可能抗体に含まれる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２は、配列番号４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４７２、４７４、４９９－５０６、５３１－５３８、５５９、及び５６０から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列と、配列番号１０９のＨ鎖アミノ酸配列を有する活性化可能抗体に含まれる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２は、配列番号４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４７２、４７４、４９９－５０６、５３１－５３８、５５９、及び５６０から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列と、配列番号１１０のＨ鎖アミノ酸配列を有する活性化可能抗体に含まれる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質はまた、少なくとも１つの追加プロテアーゼのための基質でもある。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加プロテアーゼは、ＣＭ１を切断するＭＭＰプロテアーゼと異なるＭＭＰプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加プロテアーゼは、ＭＭＰ１；ＭＭＰ２；ＭＭＰ３；ＭＭＰ７；ＭＭＰ８；ＭＭＰ９；ＭＭＰ１０；ＭＭＰ１１；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ１３；ＭＭＰ１４；ＭＭＰ１５；ＭＭＰ１６；ＭＭＰ１７；ＭＭＰ１９；ＭＭＰ２０；ＭＭＰ２３；ＭＭＰ２４；ＭＭＰ２６；及びＭＭＰ２７から成る群から選択されるＭＭＰプロテアーゼである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加プロテアーゼは、ＣＭ２を切断するＳＰプロテアーゼと異なるＳＰプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加ＳＰプロテアーゼが、ｕＰＡ；マトリプターゼ；活性化プロテインＣ；カテプシンＡ；カテプシンＧ；キマーゼ；凝固因子プロテアーゼ、例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａなど；エラスターゼ；グランザイムＢ；グアニジノベンゾアターゼ；ＨｔｒＡ１；ヒト好中球エラスターゼ；ラクトフェリン；マラプシン；ＮＳ３／４Ａ；ＰＡＣＥ４；プラスミン；ＰＳＡ；ｔＰＡ；トロンビン；トリプターゼ；ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、及びＴＭＰＲＳＳ４から成る群から選択される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加プロテアーゼは、表６に示されたものから成る群から選択される。
Figure 0006996981000001
本開示はまた、少なくとも第一ＣＭ１と第二ＣＭ２を含み、そして、剤に結合された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、第一ＣＭ１と第二ＣＭ２は、それぞれ１５アミノ酸長以下のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、結合された活性化可能抗体であり、そして、未切断状態では、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ－剤、剤－ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ、ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ－剤、又は剤－ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、結合された活性化可能抗体であり、そして、未切断状態では、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：剤－ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ－剤、剤－ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ－剤。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が、結合された活性化可能抗体であり、そして、未切断状態では、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：剤－ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ－剤、剤－ＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭ－剤、剤－ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ－剤、又は剤－ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭ－剤。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、第一連結ペプチド（ＬＰ１）、及び第二連結ペプチド（ＬＰ２）を含む結合された活性化可能抗体であり、そして、未切断状態にある抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ－剤、剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ－剤、又は剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ。いくつかの実施形態において、それぞれＬＰ１とＬＰ２は、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態において、２種の連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、第一連結ペプチド（ＬＰ１）、及び第二連結ペプチド（ＬＰ２）を含む結合された活性化可能抗体であり、そして、未切断状態にある抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ－剤、剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、又はＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ－剤。いくつかの実施形態において、それぞれＬＰ１とＬＰ２は、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態において、２種の連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、第一連結ペプチド（ＬＰ１）、及び第二連結ペプチド（ＬＰ２）を含む結合された活性化可能抗体であり、そして、未切断状態にある抗体は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ－剤、剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ－剤、剤－ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ－剤、又は剤－ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ－剤。いくつかの実施形態において、それぞれＬＰ１とＬＰ２は、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態において、２種の連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、マスキング部分（ＭＭ）とＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、及びＣＭ２とＡＢの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＣＭ２とマスキング部分（ＭＭ）の間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）及びＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。いくつかの実施形態において、結合された活性化可能抗体が、ＡＢとＣＭ１の間に連結ペプチド（ＬＰ’’）、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）、及びＣＭ２とＭＭの間に連結ペプチド（ＬＰ’’’）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５０）である。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも一方が、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）｛式中、ｎは少なくとも１つの整数である｝から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも一方が、ＧＧＳＧ（配列番号３８３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３８４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３８５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３８６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３８７）、又はＧＳＳＳＧ（配列番号３８８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３８９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３９１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３９２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３９３）、又はＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号３９４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号３９５）、ＧＳＳＧＴ（配列番号３９６）又はＧＳＳＧ（配列番号３９７）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、抗体に連結されるか又は別の方法で取り付けられる。例えば、ＣＭ１－ＣＭ２は、ＭＭＰ及び／又はＳＰに晒された時にＣＭ１－ＣＭ２が切断されて、剤がＡＢから放出されるように、所定の標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）に１若しくは複数の剤を連結するのに使用される。代表的な標的としては、これだけに限定されるものではないが、表１に示された標的を包含する。代表的なＡＢとしては、これだけに限定されるものではないが、表２に示された抗体を包含する。
いくつかの実施形態において、ＡＢは、標的に結合するために約１００ｎＭ以下の解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、抗体としては、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを包含する。いくつかの実施形態において、標的に結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、又は単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態において、標的に結合するような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、他の齧歯動物、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、ＭＭは、標的に対するＡＢの解離定数以下であるＡＢに結合するための解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭは、切断状態において標的への結合に関してＡＢと干渉もしないし競合もしない。
いくつかの実施形態において、ＭＭは、長さが約２～４０アミノ酸のポリペプチドである。例えば、ＭＭは、長さが最大約４０アミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢのあらゆる天然の結合パートナーの配列と異なっている。いくつかの実施形態において、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢのあらゆる天然の結合パートナーと５０％以下同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢのあらゆる天然の結合パートナーと４０％以下、３０％、２５％、２０％、１５％、又は１０％同一である。
いくつかの実施形態において、ＡＢ又は活性化可能抗体のＡＢに結合される剤は、治療剤である。いくつかの実施形態において、剤は、抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態において、剤は毒素又はそのフラグメントである。本明細書において使用される場合、毒素フラグメントは、毒性活性を保存するフラグメントである。いくつかの実施形態において、剤は切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、少なくとも１つのＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含むリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は非切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、剤は、核酸損傷剤、例えばＤＮＡアルキル化剤又はＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態において、剤は、表３に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤は、メイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態において、剤は抗炎症剤である。
いくつかの実施形態において、抗体及び／又は活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は、診断剤である。
いくつかの実施形態において、結合された抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。いくつかの実施形態において、イメージング剤は、放射性同位体を含む。いくつかの実施形態において、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。いくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。いくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ－ガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔダイマー２（ＲＦＰ ｔダイマー２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識, 例えばAlex Fluor（登録商標）680又はAlexa Fluor（登録商標）750を含む。いくつかの実施形態において、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は１又は２以上のハプテンを含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の抗体及び／又はＡＢは天然において、１又は２以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢは、１又は２以上のジスルフィド結合を含むよう操作され得る。
いくつかの実施形態において、抗体及び／又は結合された抗体は、単一特異的である。いくつかの実施形態において、抗体及び／又は結合された抗体は、多重特異的であり、本明細書においては、多重特異的抗体及び／又は結合された多重特異的抗体とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、多重特異的抗体及び／又は結合された多重特異的抗体は、二重特異的又は三重特異的である。いくつかの実施形態において、抗体及び／又は結合された抗体は、プロ－二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（プロ－ＢＩＴＥ）分子の一部として処方される。いくつかの実施形態において、抗体及び／又は結合された抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（プロ－ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の操作された受容体若しくは他の免疫エフェクター細胞、例えばＣＡＲ修飾ＮＫ細胞などの一部として処方される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞の一部として処方される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ＮＫ細胞の一部として処方される。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、単一特異的である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、多重特異的であり、本明細書においては、多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体としても言及される。本明細書においてし使用される場合、用語、「活性化可能抗体（activatable antibody）」及びそのすべての文法的変形は、特に断らない限り、活性化可能抗体が、本開示の多重特異的活性化可能抗体である実施形態を包含することが意図されるが、但しそれらだけには限定されない。本明細書においてし使用される場合、用語、「結合された活性化可能抗体（conjugated activatable antibody）」及びそのすべての文法的変形は、特に断らない限り、結合された活性化可能抗体が、本開示の結合された多重特異的活性化可能抗体である実施形態を包含することが意図されるが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体は、二重特異的又は三重特異的である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、プロ－二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（プロ－ＢＩＴＥ）分子の一部として処方される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、プロ－キメラ抗原受容体（プロ－ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の操作された受容体の一部として処方される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、抗体コンジュゲート、活性化可能抗体、結合された活性化可能抗体、多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体は、１又は２以上の追加の剤又は追加の剤の組合せと共に使用される。適切な追加の剤は、意図される用途、例えば癌のための現医薬品及び／又は外科的治療剤を包含する。例えば、活性化可能抗体、結合された活性化可能抗体、多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体は、追加の化学療法又は抗腫瘍剤と共に使用され得る。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、多重特異的活性化可能抗体である。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、複数の抗原又はエピトープを認識し、そして多重特異的抗体の少なくとも１つの抗原－又はエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む多重特異的抗体であり、ここでＭＭのカップリングが、抗原－又はエピトープ－結合ドメインのその標的を結合する能力を低減する。いくつかの実施形態において、ＭＭは、少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼ及び少なくとも１つのＳＰプロテアーゼのための基質として機能するＣＭ１－ＣＭ２基質を介して、多重特異的抗体の抗原－又はエピトープ－結合ドメインにカップリングされる。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常な、すなわち健康な組織においては活性化されず、そして活性化される場合、その対応する、修飾されていない多重特異的抗体に、少なくとも匹敵する標的への結合を示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３９８）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９９）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ（配列番号４００）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を特異的に結合し、そしてＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ（配列番号４０１）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４０２）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ（配列番号４０３）を含むＶＬ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３９８）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９９）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ（配列番号４００）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を特異的に結合し、そしてＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ（配列番号４０１）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４０２）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ（配列番号４０３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＬ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＨ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３９８）を少なくとも含み；ＶＨ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９９）を少なくとも含み；ＶＨ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ（配列番号４００）を含み；ＶＬ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ（配列番号４０１）を少なくとも含み；ＶＬ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４０２）を少なくとも含み；そしてＶＬ ＣＤＲ３配列はアミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ（配列番号４０３）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３９８）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ ＣＤ２配列は、アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９９）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ（配列番号４００）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ（配列番号４０１）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４０２）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；そしてＶＬ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ（配列番号４０３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号４０４）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号４０５）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号４０６）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４０７）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号４０８）を少なくとも含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号４０９）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列及びＶＨ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号４０４）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号４０５）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号４０６）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４０７）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号４０８）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号４０９）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここで前記ＶＨ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号４０４）を少なくとも含み；ＶＨ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号４０５）を少なくとも含み；ＶＨ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号４０６）を含み；ＶＬ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４０７）を少なくとも含み；ＶＬ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号４０８）を少なくとも含み；そしてＶＬ ＣＤＲ３配列はアミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号４０９）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、例えば本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体（但し、それらだけには限定されない）は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号４０４）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ ＣＤ２配列は、アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号４０５）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号４０６）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４０７）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号４０８）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み；そしてＶＬ ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ（配列番号４０９）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含む。
いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、並びに本明細書中に開示された抗Jagged抗体のアミノ酸配列を含む抗Jagged抗体を含む。いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、並びに配列番号１６２又は配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＬ鎖及び配列番号６７又は配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＨ鎖を有する抗体を含む。
いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、少なくとも配列番号６７のＨ鎖アミノ酸配列と配列番号４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３９、４７７、４７９、５０７－５１４、５３９－５４６、５６１、及び５６２から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、並びに本明細書中に開示された抗ＥＧＦＲ抗体のアミノ酸配列を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、配列番号１－１７、２２、４６９－４７１、４８３－４９０、５１５－５２２、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＭ１－ＣＭ２基質、並びに配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＬ鎖と配列番号１０８、配列番号１０９、又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨ鎖を有する抗体を含む。
いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、少なくとも配列番号１０８のＨ鎖アミノ酸配列及び配列番号４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４７２、４７４、４９９－５０６、５３１－５３８、５５９、及び５６０から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である少なくともＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３９、４７７、４７９、５０７－５１４、５３９－５４６、５６１、及び５６２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、これだけに限定されるものではないが、本開示の多重特異的活性化可能抗体及び／又は結合された多重特異的活性化可能抗体を含めた、本明細書中に提供される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である少なくともＨ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４７２、４７４、４９９－５０６、５３１－５３８、５５９、及び５６０から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるＬ鎖アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施形態において、剤は治療剤である。いくつかの実施形態において、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態において、剤は毒素又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、剤は核酸損傷剤、例えばＤＮＡアルキル化剤又はＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、剤は、少なくとも１つのＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含むリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、表３に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤は、メイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において剤はピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態において、剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態において、剤は抗炎症剤である。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は、診断剤である。
いくつかの実施形態において、結合された抗体は、検出できる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。いくつかの実施形態において、イメージング剤は、放射性同位体を含む。いくつかの実施形態において、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。いくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。いくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ－ガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔダイマー２（ＲＦＰ ｔダイマー２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識, 例えばAlex Fluor（登録商標）680又はAlexa Fluor（登録商標）750を含む。いくつかの実施形態において、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は１又は２以上のハプテンを含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態において、スペーサーは、すぐなるペプチドの不在下で活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態において、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接的に連結される。いくつかの実施形態において、スペーサーは、スペーサー－ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢのＮ－末端からＣ－末端への構造配置において活性化可能抗体のＭＭに直接的に連結される。活性化可能抗体のＭＭのＮ末端に直接連結されるスペーサーの例は、ＱＧＱＳＧＱ（配列番号４１０）、ＧＱＳＧＱ（配列番号４１６）、ＱＳＧＱ（配列番号４１７）、ＳＧＱ（配列番号４１８）、ＧＱ、及びＱから成る群から選択されるアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱ（配列番号４１０）を包含する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱＳＧＱ（配列番号４１６）を包含する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＳＧＱ（配列番号４１７）を包含する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＳＧＱ（配列番号４１８）を包含する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱを包含する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列Ｑを包含する。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体中のＡＢは天然において、１又は２以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢは、１又は２以上のジスルフィド結合を含むよう操作され得る。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する抗体の半減期よりも長く；例えば、活性化可能抗体のｐＫは、その対応する抗体のｐＫよりも長い。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する抗体の半減期に類似する。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
本開示はまた、所定の標的を特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体を含む組成物及び方法も提供し、ここで前記ＡＢは、ＡＢのその標的を結合する能力を低減するマスキング部分（ＭＭ）にカップリングされる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体はさらに、少なくとも１つのＭＭＰ及び少なくとも１つのＳＰのための基質であるＣＭ１－ＣＭ２基質も含む。本明細書に提供される組成物及び方法は、活性化可能抗体の活性（例えば、マスキング、活性化又は結合活性）を損なうことなく、ＡＢにおける１又は２以上のシステイン残基への１又は２以上の剤の結合を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される組成物及び方法は、ＭＭ内の１又は２以上のジスルフィド結合も還元しないで、又は他方では妨害しないで、ＡＢにおける１又は２以上のシステイン残基への１又は２以上の剤の結合を可能にする。本明細書に提供される組成物及び方法は、１又は２以上の剤、例えば種々の治療、診断及び／又は予防剤の何れかに結合される活性化可能抗体を生成し、例えば、いくつかの実施形態において、前記剤の何れも活性化可能抗体のＭＭの何れにも結合されていない。本明細書に提供される組成物及び方法は、ＭＭが切断されていない状態下で活性化可能抗体のＡＢを効果的且つ効率的にマスキングする能力を保持している、結合された活性化可能抗体を生成する。本明細書に提供される組成物及び方法は、活性可能抗体が、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できるＭＭＰの存在下で、まだ活性化されている、すなわち切断されている、結合された活性化可能抗体を生成する。
活性化可能抗体は、剤のための少なくとも１つの結合点を有するが、本明細書に提供される方法及び組成物においては、すべての可能な結合点が剤への結合のために利用できる。いくつかの実施形態において、１又は２以上の結合点は、ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態において、１又は２以上の結合点は、鎖間ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態において、１又は２以上の結合点は、鎖間スルフィド結合に含まれる硫黄原子であるが、しかし鎖内ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子ではない。いくつかの実施形態において、１又は２以上の結合点は、システイン、又は硫黄原子を含む他のアミノ酸残基の硫黄原子である。そのような残基は、抗体構造で天然において存在することができるか、又は部位特異的突然変異誘発、化学的変換、又は非天然アミノ酸の誤取り込みにより抗体中に組込まれ得る。
１又は２以上のＡＢに、１又は２以上の鎖間ジスルフィド結合及びＭＭに１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合を有する活性化可能抗体の結合体の調製方法がまた提供され、そして遊離チオールと反応性の薬剤が提供される。前記方法は一般的に、活性化可能抗体における鎖間ジスルフィド結合を、還元剤、例えばＴＣＥＰにより部分的に還元し；そしてその部分的に還元された活性化可能抗体に、遊離チオールと反応性の薬物を結合することを包含する。本明細書において使用される場合、用語「部分的還元」とは、多重特異的活性化可能抗体が、還元剤と接触され、そしてすべて未満ジスルフィド結合、例えばすべて未満の可能な結合部位が還元される状況を意味する。いくつかの実施形態において、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％未満のすべての可能な結合部位が還元される。
いくつかの実施形態において、剤、例えば薬剤を還元し、そして前記剤の置換下で選択をもたらす活性化可能抗体に結合する方法が提供される。前記方法は、還元剤により活性化可能抗体を還元し、結果的に、活性化可能抗体のマスキング部分又は他の非－ＡＢ部分の何れかにおける任意の結合部位が還元されず、そして活性化可能抗体の１又は２以上のＡＢにおける鎖間チオールに剤を結合することを包含する。結合部位（単数又は複数）は、所望する部位での結合の発生を可能にする剤の所望する置換を可能にするよう選択される。例えば、還元剤は、ＴＣＥＰである。還元反応条件、例えば還元剤：活性化可能抗体の比、インキュベーションの長さ、インキュベーションの間の温度、還元反応溶液のｐＨ、等は、ＭＭが、切断されていない状態下で活性化可能抗体のＡＢを効果的且つ効率的にマスキングする能力を保持している、結合された活性化可能抗体を生成する条件を同定することにより決定される。還元剤：活性化可能抗体の比は、活性化可能抗体に依存して変化するであろう。いくつかの実施形態において、還元剤：活性化可能抗体の比は、約 ２０：１－１：１、約 １０：１－１：１、約 ９：１－１：１、約 ８：１－１：１、約 ７：１－１：１、約 ６：１－１：１、約５：１－１：１、約４：１－１：１、約３：１－１：１、約２：１－１：１、約 ２０：１－１：１．５、約１０：１－１：１．５、約 ９：１－１：１．５、約 ８：１－１：１．５、約７：１－１：１．５、約 ６：１－１：１．５、約５：１－１：１．５、約 ４：１－１：１．５、約 ３：１－１：１．５、約 ２：１－１：１．５、約 １．５：１－１：１．５又は 約 １：１－１：１．５の範囲下にあるであろう。いくつかの実施形態において、前記比は、約５：１－１．５：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記化は、約４：１－１：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記化は、約４：１－１．４：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記比は、約８：１－約１：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記比は、約２．５：１－１：１の範囲にある。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体のＡＢ中の鎖間ジスルフィド結合を還元し、そして得られる鎖間チオールに、剤、例えばチオール含有剤、例えば薬剤を結合し、前記ＡＢ上に剤（単数又は複数）を選択的に位置決定する方法が提供される。前記方法は、活性化可能抗体中のすべての可能な鎖間チオールを形成しないで、少なくとも２つの鎖間チオールを形成するために、１又は２以上のＡＢを還元剤により部分的に還元し；そして前記部分的に還元されたＡＢの鎖間チオールに、前記剤を結合することを一般的に包含する。例えば、活性化可能抗体の１又は２以上のＡＢは、還元剤：活性化可能抗体の所望する比で、約３７℃で約１時間、部分的に還元される。いくつかの実施形態において、還元剤：活性化可能抗体の比は、約 ２０：１－１：１、約 １０：１－１：１、約 ９：１－１：１、約 ８：１－１：１、約 ７：１－１：１、約 ６：１－１：１、約５：１－１：１、約４：１－１：１、約３：１－１：１、約２：１－１：１、約 ２０：１－１：１．５、約１０：１－１：１．５、約 ９：１－１：１．５、約 ８：１－１：１．５、約７：１－１：１．５、約 ６：１－１：１．５、約５：１－１：１．５、約 ４：１－１：１．５、約 ３：１－１：１．５、約 ２：１－１：１．５、約 １．５：１－１：１．５又は 約 １：１－１：１．５の範囲下にあるであろう。いくつかの実施形態において、前記比は、約５：１－１．５：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記化は、約４：１－１：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記化は、約４：１－１．４：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記比は、約８：１－約１：１の範囲にある。いくつかの実施形態において、前記比は、約２．５：１－１：１の範囲にある。
チオール含有試薬は、例えばシステイン又はＮ－アセチルシステインであり得る。還元剤は、例えばＴＣＥＰであり得る。いくつかの実施形態において、還元された活性化可能抗体は、結合の前、例えばカラムクロマトグラフィー、透析又はダイアフィルトレーションを用いて精製され得る。他方では、還元された抗体は、部分的還元の後、及び結合の前、精製されない。
本開示はまた、活性化可能抗体中の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が、活性化可能抗体中の何れの鎖内ジスルフィド結合も妨害しないで、還元剤により還元されている、部分的に還元された活性化可能抗体も提供し、ここで前記活性化可能抗体は、標的に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、末切断状態下での活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、及びＡＢにカップリングされるＣＭ１－ＣＭ２基質（少なくとも１つのＭＭＰ及び１つのＳＰのための基質として機能するポリペプチドである）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＡＢにカップリングされる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合（単数又は複数）は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体内のＭＭの１又は２以上の鎖内ジスルフド結合（単数又は複数）は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態において、末切断状態下での活性化可能抗体は、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ。いくつかの実施形態において、還元剤はＴＣＥＰである。
本開示はまた、活性化可能抗体中の少なくとも１つの鎖内ジスルフィド結合が、活性化可能抗体の活性及び／又は効力を妨害しないで、又は他方では、損なわないで、還元剤により還元されている、部分的還元されている活性化可能抗体（例えば、本開示の多重特異的活性化可能抗体を包含するが、但しそれらだけには限定されない）も提供し、ここで前記活性化可能抗体は、標的に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、末切断状態下での活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、及びＡＢにカップリングされるＣＭ１－ＣＭ２基質（プロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである）を含む。活性化可能抗体の活性及び／又は効力は、非制限的例によれば、マスキング活性、活性化可能抗体の活性化、及び／又は活性化された活性化可能抗体の結合活性である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合（単数又は複数）は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体内のＭＭの１又は２以上の鎖内ジスルフド結合（単数又は複数）は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態において、末切断状態下での活性化可能抗体は、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有する：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ。いくつかの実施形態において、還元剤はＴＣＥＰである。
本開示はまた、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）ペイロードに連結される活性化可能抗体を含む結合された活性化可能抗体も提供し、ここで前記活性化可能抗体は、標的に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、標的への未切断状態での活性化可能抗体のＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、及びＡＢにカップリングされるＣＭ１－ＣＭ２基質（前記ＣＭ１－ＣＭ２基質は少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼ及び少なくとも１つのＳＰプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである）を含む。
いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤ－結合された活性化可能抗体は、次のような、ＡＢに剤を結合するためのいくつかの方法の何れかを用いて結合され得る：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への結合、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への結合、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への結合、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への結合。
いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してシステインに結合される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢにおけるリシンに結合される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤは、リンカー、例えば本明細書に開示されるそれらの残基を介してＡＢの別の残基に結合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、チオール含有リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、非切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、表５及び６に示されるリンカーから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイド－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードは、本明細書に開示される部分的還元及び結合技法を用いて、ＡＢに結合される。
本開示はまた、本明細書に提供される１又は２以上のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含む、ポリペプチド及び他の大分子も提供する。非制限的例によれば、本明細書に提供されるＣＭ１－ＣＭ２基質配列は、プロドラッグ組成物及びその使用方法において有用である。本明細書に提供されるそれらのＣＭ１－ＣＭ２基質配列もまた、プローブ及び他の検出剤、及びその使用方法においても有用である。例えば、本明細書に提供されるＣＭ１－ＣＭ２基質配列は、検出剤、例えばイメージング剤及び／又は他の診断剤を生成するために、フラワー及びクエンチャーと組合して使用され得る。当業者は、本明細書に提供されるＣＭ１－ＣＭ２基質配列が、少なくとも１つのＭＭＰ及び少なくとも１つのＳＰにより切断できる基質を用いるであろう当該技術分野における任意の組成物及び／又は方法において有用であることを理解するであろう。
本開示はまた、本明細書に記載される抗体及び／又は活性化可能抗体をコードする単離核酸分子、及びそれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、抗体及び／又は活性化可能抗体の発現を導く条件下で、前記ベクターを含む細胞を培養することによる、抗体及び／又は活性化可能抗体の製造方法を提供する。
本開示は、（ａ）抗体の発現を導く条件下で、抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を培養し、ここで（ｉ）抗体はＣＭ１－ＣＭ２基質を含み、そして（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質はマトリックスメタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり；（ｂ）抗体を回収し；そして（ｃ）１又は２以上の追加の剤に、前記回収される抗体を結合することによる、所定の標的を結合する本開示の結合をされた抗体の製造方法を提供する。
本開示はまた、（ａ）活性化可能抗体の発現を導く条件下で、活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を培養し、ここで前記活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、ＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）前記ＣＭ１－ＣＭ２基質はＭＭＰ及びＳＰのための基質として機能するポリペプチドであり；そして（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態下で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、そして切断された状態下で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害しないか、又はそれと競争しないよう、活性化可能抗体に配置され；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収することによる、所定の標的を、活性化された状態下で結合する本開示の活性化可能抗体の製造方法も提供する。
本開示はまた、（ａ）活性化可能抗体の発現を導く条件下で、活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を培養し、ここで前記活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、ＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）前記ＣＭ１－ＣＭ２基質はＭＭＰ及びＳＰのための基質として機能するポリペプチドであり；そして（ｉｉ）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、未切断状態下で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、そして切断された状態下で、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合を妨害しないか、又はそれと競争しないよう、活性化可能抗体に配置され；（ｂ）活性化可能抗体を回収し；そして（ｃ）１若しくは複数の追加の剤を回収した抗体に結合することによる、所定の標的を、活性化された状態下で結合する本開示の結合された活性化可能抗体の製造方法も提供する。
本開示は、治療的有効量の本明細書に記載される結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を、その必要な対象に投与することにより、対象における標的関連疾患を、予防し、その進行を遅延し、それを治療し、その症状を軽減するか、又は他方では、改善する方法を提供する。
本開示は、治療的有効量の本明細書に記載される結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を、その必要な対象に投与することにより、対象における炎症及び／又は炎症性疾患を、予防し、その進行を遅延し、それを治療し、その症状を軽減するか、又は他方では、改善する方法を提供する。本開示は、治療的有効量の本明細書に記載される結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を、その必要な対象に投与することにより、対象における癌を、予防し、その進行を遅延し、それを治療し、その症状を軽減するか、又は他方では、改善する方法を提供する。本開示は、治療的有効量の本明細書に記載される結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を、その必要な対象に投与することにより、対象における自己免疫疾患を、予防し、その進行を遅延し、それを治療し、その症状を軽減するか、又は他方では、改善する方法を提供する。
それらの方法及び使用の実施形態の何れかに使用される、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能を抗体は、疾患の任意の段階で投与され得る。例えば、そのような結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、早期～転移性の任意の段階の癌を有する患者に投与され得る。用語、対象及び患者は本明細書においては、交換可能的に使用される。
いくつかの実施形態において、対象は、哺乳類、例えばヒト、非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、農業用動物、作業用動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は愛玩動物である。いくつかの実施形態において、対象は、獣医師のケア動物である。
結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及びそれらの治療用製剤は、異常標的発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有するか、又はそれの影響を受けやすい対象に投与される。異常標的発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有するか、又はそれの影響を受けやすい対象は、当業界において知られている種々の方法の何れかを用いて、同定される。例えば、癌又は他の腫瘍性状態を有する対象は、種々の臨床学的及び／又は実験室試験の何れか、例えば物理的試験、及び健康状態を評価するための血液、尿及び／又はスツール分析を用いて、同定される。例えば、炎症及び／又は炎症性障害を有する対象は、種々の臨床学的及び／又は実験室試験の何れか、例えば物理的試験及び／又は体液分析、例えば、健康状態を評価するための血液、尿及び／又はスツール分析を用いて、同定される。
異常標的発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を有する患者への結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体の投与は、種々の実験室又は臨床目的の何れかが達成されると、成功したとして見なされる。例えば、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、疾患又は障害に関連する１又は２以上の症状が軽減されるか、低められるか、阻害されるか、又はさらに悪化状態に進行しない場合、成功したとして見なされる。結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、患者又は障害が寛解に入るか、又はさらに悪化状態に進行しない場合、成功したとして見なされる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、１若しくは複数の追加の剤と結合状態で又は追加の剤と組み合わせて使用される。好適な追加の剤としては、対象とする用途、例えば癌などのための現在の医薬的及び／又は外科的治療法を包含する。例えば、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、追加の化学療法剤又は抗癌剤と結合状態で使用できる。
いくつかの実施態様によれば、（単数若しくは複数の）追加の剤は、化学療法剤、例えばドセタキセル、パクリタキセル、アブラキサン（すなわち、アルブミン結合パクリタキセル）、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、イリノテカン、及びゲムシタビンから成る群から選択された化学療法剤である。
いくつかの実施態様によれば、（単数若しくは複数の）追加の剤は、チェックポイント阻害剤、キナーゼ阻害剤、腫瘍微小環境における阻害剤を標的化する剤、及び／又はＴ細胞又はＮＫアゴニストである。いくつかの実施態様によれば、（単数若しくは複数の）追加の剤は、単独で、又は（単数若しくは複数の）別の追加の剤、例えば化学療法剤又は抗新生物剤の組合せの放射線療法である。いくつかの実施態様によれば、（単数若しくは複数の）追加の剤は、ワクチン、オンコウイルス、及び／又はＣＤ－活性化剤、例えばトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト及び／又はα－ＣＤ４０（但し、それらだけには限定されない）である。いくつかの実施態様によれば、（単数若しくは複数の）追加の剤は、ＡＤＣＣを介して、又は毒素への直接的結合（例えば、抗体薬物結合体（ＡＤＣ））を介して腫瘍を死滅させるよう設計された腫瘍標的化抗体である。
いくつかの実施態様によれば、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、Ｂ７Ｈ４、及びＶｉｓｔａから成る群から選択される。いくつかの実施態様によれば、キナーゼ阻害剤は、Ｂ－ＲＡＦｉ、ＭＥＫｉ、及びＢｔｋ阻害剤、例えば、イブルチニブから成る群から選択される。いくつかの実施態様によれば、キナーゼ阻害剤は、クリゾチニブである。いくつかの実施態様によれば、腫瘍微小環境阻害剤は、ＩＤＯ阻害剤、α－ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、α－ＣＣＲ４阻害剤、ＴＧＦ－ベータ、骨髄由来サプレッサー細胞、又はＴ－調節細胞から成る群から選択される。いくつかの実施態様によれば、前記アゴニストは、Ｏｘ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、及びＨＶＥＭから成る群から選択される。
いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、ＬＡＧ－３阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、ＴＩＧＩＴ阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、ＴＩＭ－３阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、Ｂ７Ｈ４阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、Ｖｉｓｔａ阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、Ｂ－ＲＡＦｉ阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、ＭＥＫｉ阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、Ｂｔｋ阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は、イブルチニブである。いくつかの実施態様によれば、阻害剤はクリゾチニブである。いくつかの実施態様によれば、阻害剤はＩＤＯ阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤はα－ＣＳＦ１Ｒ阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤はα－ＣＣＲ４阻害剤である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤はＴＧＦ－βである。いくつかの実施態様によれば、阻害剤は骨髄由来サプレッサー細胞である。いくつかの実施態様によれば、阻害剤はＴ－制御性細胞である。
いくつかの実施態様によれば、アゴニストは、Ｏｘ４０である。いくつかの実施態様によれば、アゴニストは、ＧＩＴＲである。いくつかの実施態様によれば、アゴニストは、ＣＤ１３７である。いくつかの実施態様によれば、アゴニストは、ＩＣＯＳである。いくつかの実施態様によれば、アゴニストは、ＣＤ２７である。いくつかの実施態様によれば、アゴニストは、ＨＶＥＭである。
いくつかの実施態様によれば、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、１又は２以上の追加の剤、例えば化学療法剤、抗炎症剤、及び／又は免疫抑制剤と組み合わせて、治療の間及び／又は治療の後、投与される。いくつかの実施態様によれば、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤は、単一の治療組成物に製剤化され、そして抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤は、同時に投与される。他方では、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤は、お互い別々であり、例えば個々は、別の治療組成物に製剤化され、そして抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤は同時に投与されるか、又は抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤は、治療レジメンの間、異なった時点で投与される。例えば、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、追加の剤の投与の前に投与される、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、追加の剤の投与に続いて投与される、又は抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤は、交互に投与される。本明細書に記載されるように、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤は、単回投与、又は複数回投与される。
いくつかの実施態様によれば、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び（単数若しくは複数の）追加の剤は、同時投与される。例えば、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び（単数若しくは複数の）追加の剤は、単一の組成物に製剤化され、又は複数の別々の組成物として投与され得る。いくつかの実施態様によれば、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び（単数若しくは複数の）追加の剤は、連続的に投与され、或いは、抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び（単数若しくは複数の）追加の剤は、治療レジメンの間、異なった時点で投与される。
いくつかの実施形態において、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、１又は２以上の追加の剤、例えば、非制限的例によれば、抗炎症剤、免疫抑制剤、化学療法剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞毒性抗生物質及び／又は何れか他の核酸損傷剤と組合せて、治療の間及び／又は治療の後、投与される。いくつかの実施形態において、追加の剤は、タキサン、例えばパクリタキセル（例えば、Abraxane（登録商標））である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、代謝拮抗剤、例えばゲムシタビンである。いくつかの実施形態において、追加の剤は、アルキル化剤、例えば白金を用いた化学療法剤、例えばカルボプラチン又はシスプラチンである。いくつかの実施形態において、追加の剤は、標的剤、例えばキナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ又はエルロチニブである。いくつかの実施形態において、追加の剤は、標的剤、例えば別の抗体、例えばモノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、二重特異的抗体、又は多重特異的抗体である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブ又はカーフィルゾミブである。いくつかの実施形態において、追加の剤は、免疫調節剤、例えばレノリドマイド又はＩＬ－２である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、放射線である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、当業者によるケアの標準として見なされる剤である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、当業者に良く知られている化学療法剤である。
いくつかの実施形態において、追加の剤は、抗体、別の結合された抗体、別の活性化可能抗体及び／又は別の結合された活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、第一の結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体と同じ標的に対する抗体、別の結合された抗体、別の活性化可能抗体及び／又は別の結合された活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、第一の結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体の標的と異なる標的に対する抗体、別の結合された抗体、別の活性化可能抗体及び／又は別の結合された活性化可能抗体である。
いくつかの実施形態において、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤（単数又は複数）は、同時に投与される。例えば、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤（単数又は複数）は、単一組成物に配合され、又は複数の別々の組成物として投与され得る。いくつかの実施形態において、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び追加の剤（単数又は複数）は、連続的に投与されるか、又は抗体及び／又は結合された抗体及び追加の剤が、治療計画の間、異なった時点で、投与される。例えば、抗体及び／又は結合された抗体は、追加の剤の投与の前、投与され、抗体及び／又は結合された抗体は、追加の剤の投与に続いて投与されるか、又は抗体及び／又は結合された抗体及び追加の剤は、交互に投与される。本明細書に記載されるように、抗体及び／又は結合された抗体及び追加の剤は、単回用量又は複数回用量で投与される。
本開示はまた、種々の診断的及び／又は予防的適用のためへの結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体の使用方法及びキットも提供する。
本開示による医薬組成物は、本開示の抗体、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、並びに担体を含むことができる。これらの医薬組成物は、例えば診断キットなどのキットに含まれ得る。
図１Ａ及び１Ｂは、抗Jagged抗体、並びにマスク及び活性化された活性化可能抗体の結合を実証するヒトJagged１結合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連のグラフである。（Ａ）２００１及び（Ｂ）１００１／ＬＰ’／０００１基質含有活性化可能抗体の両方が、ｕＰＡ（セリンプロテアーゼ）、ＭＭＰ１４（ＭＭＰ）、及びＭＭＰ１４と組み合わせたｕＰＡによって活性化された。活性化された活性化可能抗体は、抗Jagged抗体と同等な結合を示した。
図２は、単回の５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与の結果として起こる、抗Jagged抗体、並びに１００１／ＬＰ’／０００１及び２００１活性化可能抗体に関するヒトＩｇＧ血清濃度を示すグラフである。抗Jagged抗体は、標的媒介クリアランスのため、急速に取り除かれる。対照的に、抗Jagged活性化可能抗体は、循環中でマスクされたままである。
図３は、初回投薬後の時間に対してスポットしたＨＣＣ１８０６腫瘍体積（群平均±ＳＥＭ、ｎ＝８）を示すグラフである。群には、試験の１日目と８日目に投薬された。抗Jagged－ＳＰＤＢ－ＤＭ４抗体及び抗Jagged２００１活性化可能抗体－ＳＰＤＢ－ＤＭ４群が共に腫瘍退縮を示したのに対して、アイソタイプ－ＳＰＤＢ－ＤＭ４群は腫瘍増殖阻害を示さなかった。
図４は、初回投薬後の時間に対してスポットした初期体重に対するパーセント（群平均、ｎ＝８）を示すグラフである。群には、試験の１日目と８日目に投薬された。抗Jagged－ＳＰＤＢ－ＤＭ４ ＡＤＣ処理群の動物が有意な体重減少を示したのに対して、ＰＢＳ、アイソタイプ－ＳＰＤＢ－ＤＭ４ＡＤＣ、及び抗Jagged２００１活性化可能抗体－ＳＰＤＢ－ＤＭ４処理した動物は、有意な体重減少を示さなかった。
図５は、Ｈ２９２異種移植腫瘍担持マウスにおける、１２．５ｍｇ／ｋｇの斯かるＥＧＦＲ活性化可能抗体の投与後８日の血漿中で計測される、ＥＧＦＲ活性化可能抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性化を示すグラフである。
図６は、Ｈ２９２異種移植腫瘍担持マウスにおける、ＥＧＦＲ活性化可能抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示すグラフである。
図７は、Ｈ２９２異種移植腫瘍内微小環境における、ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化のｉｎ ｓｉｔｕにおける評価を示すグラフである。
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ、及び８Ｆは、対照静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、図８Ａ）、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（図８Ｂ）、抗ＥＧＦＲ２００１活性化可能抗体と本明細書中で呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４４９のＬ鎖配列を含む）（図８Ｃ）；本明細書中で抗ＥＧＦＲ２００３活性化可能抗体と呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４７２のＬ鎖配列を含む）（図８Ｄ）；又は本明細書中で抗ＥＧＦＲ２００５活性化可能抗体と呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４７４のＬ鎖配列を含む）（図８Ｅ）を投与後の様々な時点でのｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨ２９２異種移植腫瘍の腫瘍体積を示す一連のグラフである。図８Ｃ及び８Ｄに示されたデータに関して、体重減少のため、各群それぞれ１匹の動物を失った。図８Ｆは、１つのグラフで、図８Ａ－８Ｅに提示されたデータをプロットし、比較するグラフである。 図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ、及び８Ｆは、対照静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、図８Ａ）、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（図８Ｂ）、抗ＥＧＦＲ２００１活性化可能抗体と本明細書中で呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４４９のＬ鎖配列を含む）（図８Ｃ）；本明細書中で抗ＥＧＦＲ２００３活性化可能抗体と呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４７２のＬ鎖配列を含む）（図８Ｄ）；又は本明細書中で抗ＥＧＦＲ２００５活性化可能抗体と呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４７４のＬ鎖配列を含む）（図８Ｅ）を投与後の様々な時点でのｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨ２９２異種移植腫瘍の腫瘍体積を示す一連のグラフである。図８Ｃ及び８Ｄに示されたデータに関して、体重減少のため、各群それぞれ１匹の動物を失った。図８Ｆは、１つのグラフで、図８Ａ－８Ｅに提示されたデータをプロットし、比較するグラフである。
図９は、アイソタイプ対照静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、本明細書中で４Ｄ１１と呼ばれる抗Jagged抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号１６２のＬ鎖配列を含む）の２０ｍｇ／ｋｇ用量、４Ｄ１１抗体の１０ｍｇ／ｋｇ用量、４Ｄ１１抗体の５ｍｇ／ｋｇ用量、本明細書中で抗Jagged２００１活性化可能抗体と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４２０のＬ鎖配列を含む）、本明細書中で抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４３２のＬ鎖配列を含む）、本明細書中で抗Jagged２００３活性化可能抗体と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４７７のＬ鎖配列を含む）、並びに本明細書中で抗Jagged２００５活性化可能抗体と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４７９のＬ鎖配列を含む）を投与後の体重（ＢＷ）の損失によって計測される毒性を示すグラフである。結果は、試験中の様々な時点における相対体重（ＢＷ）変化パーセント（％）として示される。
図１０は、アイソタイプ対照静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、本明細書中で４Ｄ１１と呼ばれる抗Jagged抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号１６２のＬ鎖配列を含む）の２０ｍｇ／ｋｇ用量、４Ｄ１１抗体の１０ｍｇ／ｋｇ用量、４Ｄ１１抗体の５ｍｇ／ｋｇ用量、本明細書中で抗Jagged２００１活性化可能抗体（「２００１」）と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４２０のＬ鎖配列を含む）、本明細書中で抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４３２のＬ鎖配列を含む）、並びに本明細書中で抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００３活性化可能抗体と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４２４のＬ鎖配列を含む）を投与後の体重（ＢＷ）の損失によって計測される毒性を示すグラフである。結果は、試験中の様々な時点における相対体重（ＢＷ）変化パーセント（％）として示される。
図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、及び図１２は、本開示の活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体に組み込まれた本開示の様々な基質の有効性を示す一連のグラフである。基質の有効性は、投与後の様々な時点における腫瘍体積（ＴＶ ｍｍ３）を計測することによって評価された。 図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、及び図１２は、本開示の活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体に組み込まれた本開示の様々な基質の有効性を示す一連のグラフである。基質の有効性は、投与後の様々な時点における腫瘍体積（ＴＶ ｍｍ３）を計測することによって評価された。
図１３は、対照静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、本開示の抗Jagged抗体、及び本開示の様々な基質を含む本開示の活性化可能抗Jagged抗体の投与後のＤＢＡ／１マウスにおける体重（ＢＷ）の損失の関数として計測される毒性を示すグラフである。
図１４は、Ｈ２９２（白抜き矢印）及びＦａＤｕ（黒塗り矢印）を同時移植した異種移植腫瘍モデルにおける、タンデム基質を含むセツキシマブ及び２種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体に関するＦＬＩＴ－μＣＴ画像化データの３Ｄ再構成を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本開示は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である少なくとも第一切断可能部分（ＣＭ１）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質である少なくとも第二切断可能部分（ＣＭ２）を包含するアミノ酸配列を提供する。これらのＣＭ１－ＣＭ２基質は、種々の治療的、診断的及び予防的適用に有用である。例えば、これらのＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＭＭのカップリングが、標的に結合するＡＢの能力を低減するような、ＡＢの少なくとも１つの抗原－又はエピトープ結合ドメインに連結した少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体に有用である。
本明細書に提供される実施例は、それらのＣＭ１－ＣＭ２基質が、特定の条件下で少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼ及び／又は少なくとも１つのＳＰプロテアーゼに暴露される場合の多くの所望する切断特徴を示すことを実証する。
本開示はまた、１又は２以上のそれらのＣＭ１－ＣＭ２基質を含む抗体も提供する。例えば、それらのＣＭ１－ＣＭ２基質は、結合された抗体を生成するために、抗体を、１又は２以上の追加の剤に結合する場合、有用である。それらのＣＭ１－ＣＭ２基質はまた、活性化可能抗体及び／又は活性化可能抗体コンジュゲートにおいて有用である。
結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含む。ＡＢの典型的な種類の標的は、細胞表面受容体及び分泌された結合タンパク質（例えば、成長因子）、可溶性酵素、構造タンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態において、結合された抗体及び／又は活性化可能抗体は、細胞外標的、通常、細胞外タンパク質標的を結合するＡＢを有する。いくつかの実施形態において、結合された抗体及び／又は活性化可能抗体は、細胞摂取のために企画され、そして細胞内で切替え可能である。
非制限的な例として、ＡＢは、表１に列挙される任意の標的のための結合パートナーである。
Figure 0006996981000002
非制限的な例として、ＡＢは、表２に列挙される抗体であるか、又はその抗体に由来する。
Figure 0006996981000003
本開示の典型的な結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は例えば、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を結合し、そしてインターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を結合する、「Ａｖ１」抗体として、本明細書において言及される抗体であるか、又はその抗体に由来するＨ鎖及びＬ鎖を含む抗体を包含する。Ａｖ１ Ｈ鎖及びＡｖ１ Ｌ鎖についてのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１００及び配列番号１０１として下記に示されている。

Ａｖ１抗体Ｈ鎖アミノ酸配列：
Figure 0006996981000004
 Ａｖ１抗体Ｌ鎖アミノ酸配列：
Figure 0006996981000005
本開示の典型的な活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は例えば、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を結合し、そしてＡｖ１抗体であるか、又はその抗体に由来するＨ鎖及びＬ鎖、及びマスキング部分を含む抗体を包含する。本開示の典型的な活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、ＡＶ１Ｌ鎖のＮ－末端に結合されるアミノ酸配列を含む。それらのＮ－末端アミノ酸配列は、例えばＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ（配列番号１０２）；ＱＧＤＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＩＴ（配列番号１０３）；ＭＧＶＰＡＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＤＣ（配列番号１０４）；ＱＧＱＳＧＱＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ（配列番号１０５）；ＱＧＱＳＧＱＧＤＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＩＴ（配列番号１０６）；又はＱＧＱＳＧＱＭＧＶＰＡＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＤＣ（配列番号１０７）を含む。そのようなアミノ酸配列は、ＡＶ１Ｈ鎖のＮ－末端に、又はＡＶ１Ｈ又はＬ鎖のＣ－末端に結合され得ることがまた理解されるべきである。
本開示の典型的な活性化可能抗体は、例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を結合し、そして「ｃ２２ｖ５」抗体（本明細書中でＣ２２５ｖ５抗体とも呼ばれる）として、本明細書において言及される抗体、「ｃ２２５ｖ４」抗体（本明細書中でＣ２２５ｖ４抗体とも呼ばれる）として、本明細書において言及される抗体、及び「ｃ２２５ｖ６」抗体（本明細書中でＣ２２５ｖ６抗体とも呼ばれる）として、本明細書に言及される抗体（それぞれ、ＥＧＦＲを結合する）から成る群から選択される抗体であるか、又はその抗体に由来するＨ鎖及びＬ鎖を含む抗体を包含する。ｃ２２５ｖ５抗体、ｃ２２５ｖ４抗体及びｃ２２５ｖ６抗体は、「ｃ２２５Ｌ鎖」として、本明細書において言及される同じＬ鎖配列を共有する。ｃ２２５ｖ５Ｈ鎖、ｃ２２５ｖ４抗体、ｃ２２５ｖ６抗体、及びｃ２２５Ｌ鎖についてのアミノ酸配列が下記に示される。

Ｃ２２５ｖ５抗体Ｈ鎖アミノ酸配列：
Figure 0006996981000006
 Ｃ２２５ｖ４抗体Ｈ鎖アミノ酸配列：
Figure 0006996981000007
 Ｃ２２５ｖ６抗体Ｈ鎖アミノ酸配列：
Figure 0006996981000008
 Ｃ２２５抗体Ｌ鎖アミノ酸配列：
Figure 0006996981000009
本開示の典型的な結合された抗体及び／又は活性化可能抗体は、例えば、Jagged標的、例えばJagged－１、Jagged－２及び／又はJagged－１及びJagged－２の両方を結合し、そして下記に示される可変Ｈ鎖及び可変Ｌ鎖配列であるか、又はそれらに由来する、可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む抗体を包含する。

可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ４
Figure 0006996981000010
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ４
Figure 0006996981000011
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ５
Figure 0006996981000012
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ５
Figure 0006996981000013
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ７
Figure 0006996981000014
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ７
Figure 0006996981000015
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ８
Figure 0006996981000016
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ８
Figure 0006996981000017
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ１３
Figure 0006996981000018
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ１３
Figure 0006996981000019
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ１６
Figure 0006996981000020
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ１６
Figure 0006996981000021
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ１９
Figure 0006996981000022
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ１９
Figure 0006996981000023
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ２１
Figure 0006996981000024
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ２１
Figure 0006996981000025
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ２４
Figure 0006996981000026
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ２４
Figure 0006996981000027
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ２６
Figure 0006996981000028
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ２６
Figure 0006996981000029
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ２７
Figure 0006996981000030
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ２７
Figure 0006996981000031
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ２８
Figure 0006996981000032
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ２８
Figure 0006996981000033
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ３０
Figure 0006996981000034
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ３０
Figure 0006996981000035
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ３１
Figure 0006996981000036
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ３１
Figure 0006996981000037
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ３２
Figure 0006996981000038
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ３２
Figure 0006996981000039
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ３７
Figure 0006996981000040
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ３７
Figure 0006996981000041
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ３９
Figure 0006996981000042
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ３９
Figure 0006996981000043
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ４０
Figure 0006996981000044
 Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ４０
Figure 0006996981000045
 可変Ｌ鎖アミノ配列Ｌｃ４７
Figure 0006996981000046
 可変Ｈ鎖アミノ配列Ｈｃ４７
Figure 0006996981000047
 可変４Ｂ２Ｌ鎖
Figure 0006996981000048
 可変４Ｂ２Ｈ鎖
Figure 0006996981000049
 可変４Ｄ１１Ｌ鎖
Figure 0006996981000050
 可変４Ｄ１１Ｈ鎖
Figure 0006996981000051
 可変４Ｅ７Ｌ鎖
Figure 0006996981000052
 可変４Ｅ７Ｈ鎖
Figure 0006996981000053
 可変４Ｅ１１Ｌ鎖
Figure 0006996981000054
 可変４Ｅ１１Ｈ鎖
Figure 0006996981000055
 可変６Ｂ７Ｌ鎖
Figure 0006996981000056
 可変６Ｂ７Ｈ鎖
Figure 0006996981000057
 可変６Ｆ８Ｌ鎖
Figure 0006996981000058
 可変６Ｆ８Ｈ鎖
Figure 0006996981000059
本開示の典型的な結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、例えば、Jagged標的、例えばJagged－１、Jagged－２及び／又はJagged－１及びJagged－２の両方を結合し、そして下記に示されるＨ鎖及びＬ鎖配列であるか、又はそれらに由来する、Ｈ鎖領域及びＬ鎖領域の組合せを含む抗体を包含する。

４Ｄ１１Ｌ鎖配列：
Figure 0006996981000060
 ４Ｄ１１Ｈ鎖配列：
Figure 0006996981000061
 ４Ｄ１１ｖ２Ｈ鎖配列
Figure 0006996981000062
 ４Ｄ１１ｖ２Ｌ鎖配列
Figure 0006996981000063
本明細書に提供される活性化可能抗体及び活性化可能抗体組成物は、標的、例えばヒト標的を特異的に結合する抗体又はその抗体フラグメント（集合的には、本開示を通してＡＢとして言及される）を少なくとも含み、ここで前記ＡＢはマスキング部分（ＭＭ）により修飾される。
いくつかの実施形態において、マスキング部分は、特定の抗体又は抗体フラグメントとの使用のために選択される。例えば、ＥＧＦＲを結合する抗体との使用のための適切なマスキング部分は、配列ＣＩＳＰＲＧ（配列番号１６５）を含むＭＭを包含する。非制限的例によれば、ＭＭは、配列、例えばＣＩＳＰＲＧＣ（配列番号１６６）；ＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１６７）；ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号１６８）；ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭ（配列番号１６９）；ＣＩＳＰＲＧＣＥＰＧＴＹＶＰＴ（配列番号１７０） 及びＣＩＳＰＲＧＣＰＧＱＩＷＨＰＰ（配列番号１７１）を含むことができる。他の適切なマスキング部分は、ＰＣＴ国際公開番号２０１０／０８１１７３号に開示されるＥＧＦＲ－特異的マスクの何れか、例えば、非制限的例によれば、ＧＳＨＣＬＩＰＩＮＭＧＡＰＳＣ（配列番号１７２）；ＣＩＳＰＲＧＣＧＧＳＳＡＳＱＳＧＱＧＳＨＣＬＩＰＩＮＭＧＡＰＳＣ（配列番号１７３）;ＣＮＨＨＹＦＹＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７４）；ＡＤＨＶＦＷＧＳＹＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７５）；ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７６）;ＣＰＨＦＴＴＴＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７７）；ＣＮＨＨＹＨＹＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７８）；ＣＰＨＶＳＦＧＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１７９）；ＣＰＹＹＴＬＳＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８０）；ＣＮＨＶＹＦＧＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８１）;ＣＮＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８２）；ＣＨＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８３）；ＹＮＰＣＡＴＰＭＣＣＩＳＰＲＧＣＰＧ（配列番号１８４）；ＣＮＨＨＹＦＹＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８５）；ＣＮＨＨＹＨＹＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８６）;ＣＮＨＶＹＦＧＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８７）；ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８８）；ＣＰＨＦＴＴＴＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１８９）；ＣＮＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９０）；ＣＨＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９１）;ＣＰＹＹＴＬＳＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９２）；ＣＰＨＶＳＦＧＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９３）；ＡＤＨＶＦＷＧＳＹＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９４）；ＹＮＰＣＡＴＰＭＣＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９５）；ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９６）;Ｃ（Ｎ/Ｐ）Ｈ（Ｈ/Ｖ/Ｆ）（Ｙ/Ｔ）（Ｆ/Ｗ/Ｔ/Ｌ）（Ｙ/Ｇ/Ｔ/Ｓ）（Ｔ/Ｓ/Ｙ/Ｈ）ＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号１９７）；ＣＩＳＰＲＧＣＧＱＰＩＰＳＶＫ（配列番号１９８）；ＣＩＳＰＲＧＣＴＱＰＹＨＶＳＲ（配列番号１９９）；及び/又は ＣＩＳＰＲＧＣＮＡＶＳＧＬＧＳ（配列番号２００）を含む。
Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を結合する抗体との使用のための適切なマスキング部分は、非制限的例によれば、配列、例えばＱＧＱＳＧＱＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＱＧ（配列番号２０１）；ＱＧＱＳＧＱＧＱＱＱＷＣＮＩＷＩＮＧＧＤＣＲＧＷＮＧ（配列番号２０２）；ＰＷＣＭＱＲＱＤＦＬＲＣＰＱＰ（配列番号２０３）；ＱＬＧＬＰＡＹＭＣＴＦＥＣＬＲ（配列番号２０４）；ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＧＧＬＱＧ（配列番号２０５）；ＳＣＳＬＷＴＳＧＳＣＬＰＨＳＰ（配列番号２０６）；ＹＣＬＱＬＰＨＹＭＱＡＭＣＧＲ（配列番号２０７）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＮＮＴ（配列番号２０８）；ＰＷＣＭＱＲＱＤＹＬＲＣＰＱＰ（配列番号２０９）；ＣＮＬＷＩＳＧＧＤＣＲＧＬＡＧ（配列番号２１０）;ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＧＶＱＧ（配列番号２１１）；ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＧＬＲＧ（配列番号２１２）；ＣＮＬＷＩＳＧＧＤＣＲＧＬＰＧ（配列番号２１３）；ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＤＡＰＷ（配列番号２１４）；ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＤＬＬＧ（配列番号２１５）；ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＧＬＱＧ（配列番号２１６）；ＣＮＬＷＬＨＧＧＤＣＲＧＷＱＧ（配列番号２１７）;ＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＱＧ（配列番号２１８）；ＣＴＴＷＦＣＧＧＤＣＧＶＭＲＧ（配列番号２１９）；ＣＮＩＷＧＰＳＶＤＣＧＡＬＬＧ（配列番号２２０）；ＣＮＩＷＶＮＧＧＤＣＲＳＦＥＧ（配列番号２２１）；ＹＣＬＮＬＰＲＹＭＱＤＭＣＷＡ（配列番号２２２）；ＹＣＬＡＬＰＨＹＭＱＡＤＣＡＲ（配列番号２２３）；ＣＦＬＹＳＣＧＤＶＳＹＷＧＳＡ（配列番号２２４）；ＣＹＬＹＳＣＴＤＳＡＦＷＮＮＲ（配列番号２２５）；ＣＹＬＹＳＣＮＤＶＳＹＷＳＮＴ（配列番号２２６）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷ（配列番号２２７）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＮＳＡ（配列番号２２８）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＧＤＴ（配列番号２２９）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＧＮＳ（配列番号２３０）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＮＮＴ（配列番号２３１）；ＣＦＬＹＳＣＧＤＶＳＹＷＧＮＰＧＬＳ（配列番号２３２）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＳＧＬ（配列番号２３３）；ＣＹＬＹＳＣＴＤＧＳＹＷＮＳＴ（配列番号２３４）；ＣＦＬＹＳＣＳＤＶＳＹＷＧＮＩ（配列番号２３５）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷ（配列番号２３６）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＧＳＴ（配列番号２３７）；ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＧＤＴ（配列番号２３８）;ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＶＤＰＬＱＧ（配列番号２３９）；ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＩＧＤＴＮＧ（配列番号２４０）；ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＩＥＤＳＮＧ（配列番号２４１）;ＧＣＮＩＷＡＮＧＧＤＣＲＧＷＩＤＮＩＤＧ（配列番号２４２）；ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＬＧＥＡＶＧ（配列番号２４３）；ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＬＥＥＡＶＧ（配列番号２４４）;ＧＧＰＡＬＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＳＧ（配列番号２４５）；ＧＡＰＶＦＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＭＧ（配列番号２４６）；ＧＱＱＱＷＣＮＩＷＩＮＧＧＤＣＲＧＷＮＧ（配列番号２４７）;ＧＫＳＥＦＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＩＧ（配列番号２４８）；ＧＴＰＧＧＣＮＩＷＡＮＧＧＤＣＲＧＷＥＧ（配列番号２４９）；ＧＡＳＱＹＣＮＬＷＩＮＧＧＤＣＲＧＷＲＧ（配列番号２５０）;ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＰＷＶＥＧＧ（配列番号２５１）；ＧＣＮＩＷＡＶＧＧＤＣＲＰＦＶＤＧＧ（配列番号２５２）；ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＡＷＶＤＴＧ（配列番号２５３）；ＧＣＮＩＷＩＶＧＧＤＣＲＰＦＩＮＤＧ（配列番号２５４）；ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＰＶＶＦＧＧ（配列番号２５５）;ＧＣＮＩＷＬＳＧＧＤＣＲＭＦＭＮＥＧ（配列番号２５６）；ＧＣＮＩＷＶＮＧＧＤＣＲＳＦＶＹＳＧ（配列番号２５７）；ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＥＡＳＧ（配列番号２５８）;ＧＣＮＩＷＡＨＧＧＤＣＲＧＦＩＥＰＧ（配列番号２５９）；ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＴＦＶＡＳＧ（配列番号２６０）；ＧＣＮＩＷＡＨＧＧＤＣＲＧＦＩＥＰＧ（配列番号２６１）；ＧＦＬＥＮＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＴＧ（配列番号２６２）；ＧＩＹＥＮＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＭＧ（配列番号２６３）；及び/又はＧＩＰＤＮＣＮＩＷＩＮＧＧＤＣＲＹＧ（配列番号２６４）を含むマスキング部分を含む。
インターロイキン６標的、例えばインターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）を結合する抗体との使用のためのマスキング部分は、非制限的例によれば、配列、例えばＱＧＱＳＧＱＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ（配列番号２６５）；ＱＧＱＳＧＱＧＤＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＩＴ（配列番号２６６）；ＱＧＱＳＧＱＭＧＶＰＡＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＤＣ（配列番号２６７）；ＹＲＳＣＮＷＮＹＶＳＩＦＬＤＣ（配列番号２６８）；ＰＧＡＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＮＴ（配列番号２６９）；ＥＳＳＣＶＷＮＹＶＨＩＹＭＤＣ（配列番号２７０）；ＹＰＧＣＫＷＮＹＤＲＩＦＬＤＣ（配列番号２７１）；ＹＲＴＣＳＷＮＹＶＧＩＦＬＤＣ（配列番号２７２）；ＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ（配列番号２７３）；ＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２７４）；ＹＧＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２７５）；ＹＴＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ（配列番号２７６）；ＹＰＧＣＫＷＮＹＤＲＩＦＬＤＣ（配列番号２７７）；ＷＲＳＣＮＷＮＹＡＨＩＦＬＤＣ（配列番号２７８）；ＷＳＮＣＨＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２７９）；ＤＲＳＣＴＷＮＹＶＲＩＳＹＤＣ（配列番号２８０）；ＳＧＳＣＫＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２８１）；ＳＲＳＣＩＷＮＹＡＨＩＨＬＤＣ（配列番号２８２）；ＳＭＳＣＹＷＱＹＥＲＩＦＬＤＣ（配列番号２８３）；ＹＲＳＣＮＷＮＹＶＳＩＦＬＤＣ（配列番号２８４）；ＳＧＳＣＫＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２８５）；ＹＫＳＣＨＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２８６）；ＹＧＳＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ（配列番号２８７）；ＦＳＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２８８）；ＷＲＳＣＮＷＮＹＡＨＩＦＬＤＣ（配列番号２８９）；ＹＧＳＣＱＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２９０）；ＹＲＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２９１）；ＮＭＳＣＨＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ（配列番号２９２）；ＦＧＰＣＴＷＮＹＡＲＩＳＷＤＣ（配列番号２９３）；ＸＸｓＣＸＷＸＹｖｈＩｆＸｄＣ（配列番号２９４）；ＭＧＶＰＡＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＤＣ（配列番号２９５）；ＲＤＴＧＧＱＣＲＷＤＹＶＨＩＦＭＤＣ（配列番号２９６）；ＡＧＶＰＡＧＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ（配列番号２９７）；ＶＧＶＰＮＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＥＣ（配列番号２９８）；ＤＧＧＰＡＧＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ（配列番号２９９）；ＡＶＧＰＡＧＣＷＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ（配列番号３００）；ＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣＧＥＧＥＧＰ（配列番号３０１）；ＧＧＶＰＥＧＣＴＷＮＹＡＨＩＦＭＥＣ（配列番号３０２）；ＡＥＶＰＡＧＣＷＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ（配列番号３０３）；ＡＧＶＰＡＧＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ（配列番号３０４）；ＳＧＡＳＧＧＣＫＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ（配列番号３０５）；ＴＰＧＣＲＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣＥＡＬ（配列番号３０６）；ＶＧＶＰＮＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＥＣ（配列番号３０７）；ＰＧＡＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＮＴ（配列番号３０８）；ＲＧＡＣＤＩＰＦＰＡＨＷＩＰＮＴ（配列番号３０９）；ＱＧＤＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＩＴ（配列番号３１０）；ＸＧａｆＤＩＰＦＰＡＨＷｖＰｎＴ（配列番号３１１）；ＲＧＤＧＮＤＳＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ（配列番号３１２）；ＳＧＶＧＲＤＲＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ（配列番号３１３）；ＷＡＧＧＮＤＣＤＩＰＦＰＡＨＷＩＰＮＴ（配列番号３１４）；ＷＧＤＧＭＤＶＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＶＴ（配列番号３１５）；ＡＧＳＧＮＤＳＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ（配列番号３１６）；ＥＳＲＳＧＹＡＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ（配列番号３１７）；及び／又はＲＥＣＧＲＣＧＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ（配列番号３１８）を含むマスキング部分を含む。
ＡＢがＭＭにより修飾され、そして標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合、又は親ＡＢの標的への特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。
標的に対する、ＭＭにより修飾されたＡＢのＫｄは、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又はそれ以上又は ５－１０、１０－１００、１０－１，０００、１０－１０，０００、１０－１００，０００、１０－１，０００，０００、１０－１０，０００，０００、１００－１，０００、１００－１０，０００、１００－１００，０００、１００－１，０００，０００、１００－１０，０００，０００、１，０００－１０，０００、１，０００－１００，０００、１，０００－１，０００，０００、１０００－１０，０００，０００、１０，０００－１００，０００、１０，０００－１，０００，０００、１０，０００－１０，０００，０００、１００，０００－１，０００，０００又は１００，０００－１０，０００，０００倍、高い。逆に、ＭＭにより修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭにより修飾されていないＡＢ又は親ＡＢの標的に対する結合親和性によも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又はそれ以上、又は５－１０、１０－１００、１０－１，０００、１０－１０，０００、１０－１００，０００、１０－１，０００，０００、１０－１０，０００，０００、１００－１，０００、１００－１０，０００、１００－１００，０００、１００－１，０００，０００、１００－１０，０００，０００、１，０００－１０，０００、１，０００－１００，０００、１，０００－１，０００，０００、１０００－１０，０００，０００、１０，０００－１００，０００、１０，０００－１，０００，０００、１０，０００－１０，０００，０００、１００，０００－１，０００，０００又は１００，０００－１０，０００，０００倍、低い。
ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は一般的に、標的に対するＡＢのＫｄよりも高い。ＡＢに対するＭＭのＫｄは、標的に対するＡＢのＫｄよりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００又はさらに１０，０００，０００倍、高い。逆に、ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、一般的に標的に対するＡＢの結合親和性よりも低い。ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、標的に対するＡＢの結合親和性よりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００又はさらに１０，０００，０００倍、低い。
ＡＢがＭＭにより修飾され、そしてその標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合又は親ＡＢの標的への特異的結合に比べて、低められるか又は阻害される。ＭＭにより修飾されていないＡＢの標的への結合又は親ＡＢの標的への結合に比較される場合、ＭＭにより修飾される場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４又は ９６ 時間、又は ５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０又は１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに １００％、低められ得る。
ＭＭは、ＡＢのその標的に対する結合を阻害する。ＭＭはＡＢの抗原結合ドメインを結合し、そしてＡＢのその標的への結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢのその標的への結合を立体的に阻害する。ＭＭはＡＢのその標的への結合をアロステリックに阻害することができる。それらの実施形態において、ＡＢが修飾されるか又はＭＭにカップリングされ、そして標的の存在下にある場合、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４又は ９６ 時間、又は ５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０又は１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月又はそれ以上での間、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、親ＡＢ、又はＭＭにカップリングされていないＡＢの標的に対する結合に比べて、ＡＢの標的への結合は存在しないか、又は実質的に存在しないか、又はわずか０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は５０％の標的に対するＡＢの結合が存在する。
ＡＢがＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾される場合、ＭＭはＡＢのその標的への特異的結合を「マスキングするか」又は低減するか、又は他方では、阻害する。ＡＢがＭＭにカップリングするか又はＭＭにより修飾される場合、そのようなカップリング又は修飾は、ＡＢのその標的への特異的結合能力を低減するか、阻害する構造変化に影響を及ぼすことができる。
ＭＭにカップリングされているか、又はＭＭにより修飾されたＡＢは、次の式によって表され得る（アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順に）：
（ＭＭ）－（ＡＢ）
（ＡＢ）－（ＭＭ）
（ＭＭ）－Ｌ－（ＡＢ）
（ＡＢ）－Ｌ－（ＭＭ）
ここで、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは抗体又はその抗体フラグメントであり、そしてＬはリンカーである。多くの実施形態において、１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカーを、組成物中に挿入し、柔軟性を提供することが所望される。
特定の実施形態において、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーを含まないか又はそのパートナーに対する相同性を含まない。他の実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、せいぜい５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％しか、同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２５％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５０％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２０％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか１０％しか同一ではない。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＭＭによって修飾され、そしてまた、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である少なくとも１つの切断可能部分（ＣＭ１）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質である少なくとも第二切断可能部分（ＣＭ２）も含むＡＢを含む。そのような活性化可能抗体は、ＡＢの標的への活性化可能／スイッチング可能結合を示す。活性化可能抗体は一般的に、マスキング部分（ＭＭ）及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されるか又はそれにカップリングされる少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む。
活性化可能抗体中の要素は、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質が位置決定され、従って、切断された（又は比較的活性）状態下で及び標的の存在下で、ＡＢが標的を結合するが、ところが標的の存在下で、切断されていない（又は相対的に不活性）状態下で、ＡＢのその標的への特異的結合が低められるか又は阻害されるよう、配置される。ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭによりその標的を特異的に結合するＡＢの能力の阻害又はマスキングのために、低められ得る。
標的に対する、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されたＡＢのＫｄは、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢ、又は標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又はそれ以上,又は ５－１０、１０－１００、１０－１，０００、１０－１０，０００、１０－１００，０００、１０－１，０００，０００、１０－１０，０００，０００、１００－１，０００、１００－１０，０００、１００－１００，０００、１００－１，０００，０００、１００－１０，０００，０００、１，０００－１０，０００、１，０００－１００，０００、１，０００－１，０００，０００、１０００－１０，０００，０００、１０，０００－１００，０００、１０，０００－１，０００，０００、１０，０００－１０，０００，０００、１００，０００－１，０００，０００又は１００，０００－１０，０００，０００倍、高い。逆に、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢ又は標的に対する親ＡＢの結合親和性によりも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又はそれ以上,又は ５－１０、１０－１００、１０－１，０００、１０－１０，０００、１０－１００，０００、１０－１，０００，０００、１０－１０，０００，０００、１００－１，０００、１００－１０，０００、１００－１００，０００、１００－１，０００，０００、１００－１０，０００，０００、１，０００－１０，０００、１，０００－１００，０００、１，０００－１，０００，０００、１０００－１０，０００，０００、１０，０００－１００，０００、１０，０００－１，０００，０００、１０，０００－１０，０００，０００、１００，０００－１，０００，０００又は１００，０００－１０，０００，０００倍、低い。
ＡＢがＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾され、そしてその標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、ＭＭＰ及びＳＰ）の存在下でわない場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢの特異的結合又は親ＡＢの標的への特異的結合に比べて、低められるか又は阻害される。親ＡＢの結合、又はＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾されていないＡＢの標的への結合に比較される場合、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質により修飾される場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４又は ９６時間、又は ５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０又は１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
本明細書において使用される場合、用語、切断された状態とは、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼによりＣＭ１－ＣＭ２基質の修飾、すなわち、切断に続く活性化可能抗体の状態を意味する。用語、切断されていない状態又は完全に未切断とは、本明細書において使用される場合、ＭＭＰ及び／又はＳＰによるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断の不在下での活性化可能抗体の状態を意味する。上記で論じられたように、用語「活性化可能抗体（activatable antibodies）」とは、その切断されていない（生来）状態及びその切断された状態の両者での活性化可能抗体を言及するよう、本明細書において使用される。その切断状態にある活性化可能抗体はまた、本明細書中で活性化された抗体及び／又は活性化された活性化可能抗体とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、切断された活性化可能抗体は、プロテアーゼによるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断のために、ＭＭを欠いており、少なくともＭＭの放出をもたらすことは、当業者に明らかであろう。
活性化可能又はスイッチング可能とは、活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた、又は切断されていない状態下で、標的への結合の第一レベル（第一コンホメーション）、及び阻害されていない、マスキングされていない、及び／又は切断された状態下で、標的への結合の第二レベル（すなわち、第二コンホメーション）を示し、ここで標的結合の第二レベルは、結合の第一レベルよりも大きいことを意味する。一般的に、活性化可能抗体のＡＢへの標的のアクセスは、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる切断剤の存在下において、そのような切断剤の不在下でよりも高い。従って、活性化可能抗体が切断されていない状態下にある場合、ＡＢが標的結合から阻害され、そして標的結合からマスキングされ得（すなわち、第一コンホメーションは、ＡＢが標的を結合できないようなものである）、そして切断された状態下で、ＡＢは阻害されないか、又は標的結合にマスキングされない。
活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質及びＡＢは、ＡＢが所定の標的のための結合部分を表し、そしてＣＭ１－ＣＭ２基質がＭＭＰ及びＳＰのための基質を表し、そしてそこでは、ＭＭＰ及び／又はＳＰが対象における治療部位又は診断部位で標的と共局在されるように、選択される。本明細書に開示される活性化可能抗体は、例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質における部位を切断できるＭＭＰが、非治療部位の組織においてよりも（例えば、健康組織においてよりも）、治療部位又は診断部位の標的含有組織において、比較的高いレベルで存在する場合、特に有用である。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＡＢがマスキングされないか、又は他方では、その標的の結合から阻害される場合、非治療部位での第一ＡＢの結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
一般的に、活性化可能抗体は、目的の第一ＡＢで選択し、そして活性化可能抗体の残りを構築することにより設計され得、結果的に、コンホメーション的に制約される場合、ＭＭはＡＢのマスキング、又はＡＢのその標的への結合の低減を提供する。構築設計基準は、この機能的特徴を提供するよう考慮されるべきである。
阻害されていないコンホメーションに対する阻害されたコンホメーションでの標的結合のための所望するダイナミック範囲のスイッチング可能表現型を示す活性化可能抗体が提供される。ダイナミック範囲とは一般的に、（ｂ）第二組の条件下でのパラメーターの最小検出レベルに対する（ａ）第一組の条件下でのパラメーターの最大検出レベルの比率を意味する。例えば、活性化可能抗体の場合、ダイナミック範囲は、（ｂ）プロテアーゼの不在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最小検出レベルに対する（ａ）活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できるＭＭＰ及びＳＰの存在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最大検出レベルの比率を意味する。活性化可能抗体のダイナミック範囲は、活性化可能抗体切断剤、治療の解離定数に対する、活性化可能抗体切断剤（例えば、酵素）治療の解離定数の比率として計算され得る。活性化可能抗体のダイナミック範囲が大きいほど、活性化可能抗体のスイッチング可能表現型は良好である。比較的高いダイナミック範囲値（例えば、１よりも高い）を有する活性化可能抗体は、活性化可能抗体により結合する標的タンパク質が、切断剤の不在下においてよりも、活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる切断剤（例えば、酵素）の存在下で、より高い程度に発生する（例えば、主に発生する）ような、より所望のスイッチング表現型を示す。
活性化可能抗体は、種々の構造的構成で提供され得る。活性化可能抗体の少なくとも一部についての典型的な式が、下記に提供される。ＡＢのＮ－からＣ－末端への順に、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質が活性化可能抗体内で逆になされ得ることが特に企画される。ＣＭ及びＭＭが、例えばＣＭ１－ＣＭ２基質がＭＭ内に少なくとも部分的に含まれるよう、アミノ酸配列においてオーバーラップすることができることがまた、特に企画される。
例えば、活性化可能抗体の少なくとも一部がアミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順に、次の式により表され得る：
（ＭＭ）－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－（ＡＢ）
（ＡＢ）－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－（ＭＭ）
ここで、ＭＭはマスキング成分であり、ＣＭ１－ＣＭ２基質は切断可能部分であり、そしてＡＢは抗体又はそのフラグメントである。先に述べたように、「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のために基質である第一切断可能部分（ＣＭ１）と少なくとも少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質である第二切断可能部分（ＣＭ２）の方向又はの他の構造配置に関するあらゆる要件を伝えることを意図していない。よって、「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語は、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有するＣＭ１－ＣＭ２基質を包含する：ＣＭ１－ＣＭ２又はＣＭ２－ＣＭ１。「ＣＭ１－ＣＭ２基質」という用語はまた、ＣＭ１配列の少なくとも一部がＣＭ２配列の少なくとも一部に重なる基質も包含する。ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質は上記式において異なる成分として示されるが、本明細書において開示されるすべての典型的な実施形態（式を含む）によれば、ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質のアミノ酸配列は、ＣＭ１－ＣＭ２基質がＭＭ内に完全に又は部分的に含まれるよう、オーバーラップできることを企図することにも注意すべきである。さらに、上記式は、活性化可能抗体要素に対してＮ末端又はＣ末端に位置決定され得る追加のアミノ酸配列を提供する。
特定の実施形態において、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーを含まないか又はそのパートナーに対する相同性を含まない。他の実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、せいぜい５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％しか、同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５０％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２５％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２０％しか同一ではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか１０％しか同一ではない。
多くの実施形態において、１又は２以上のＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質結合、ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ結合、又は両者で柔軟性を提供するために、活性化可能抗体コンストラクト中に、１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカーを挿入することが所望される。例えば、ＡＢ、ＭＭ及び／又はＣＭ１－ＣＭ２基質は、所望する柔軟性を提供するために、十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙ及びＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含むことはできない。そのような活性化可能抗体コンストラクトのスイッチング可能表現型は、柔軟リンカーを提供するために、１又は２以上のアミノ酸の導入から利益を得ることができる。さらに、下記のように、活性化可能抗体がコンホメーション的に制約されたコンストラクトとして提供される場合、柔軟リンカーは、切断されていない活性化可能抗体における環状構造の形成及び維持を促進するために、操作可能的に導入され得る。
例えば、特定の実施形態において、活性化可能抗体は、次の式の１つを含む（ここで、下記式は、Ｎ－からＣ－末端方向に、又はＣ－からＮ－末端方向に、アミノ酸配列を表す）：
（ＭＭ）－Ｌ１－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－（ＡＢ）
（ＭＭ）－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－Ｌ２－（ＡＢ）
（ＭＭ）－Ｌ１－（ＣＭ１－ＣＭ２基質）－Ｌ２－（ＡＢ）
ここで、ＭＭ、ＣＭ１－ＣＭ２基質、及びＡＢは、上記に定義された通りであり；Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、及び任意には、存在し、又は不在であり、少なくとも１つの柔軟アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含む同じか又は異なった柔軟リンカーである。さらに、上記式は、活性化可能抗体要素に対してＮ末端又はＣ末端に配置され得る追加のアミノ酸配列を提供する。例として、次のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない：標的化部分（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体のためのリガンド）及び血清半減期延長部分（例えば、血清タンパク質、例えば免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）又は血清アルブミン（例えば、ヒト結成アルブミン（ＨＡＳ））を結合するポリペプチド。
ＣＭは、約０．００１－１５００×１０４Ｍ－１Ｓ－１又は少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７.５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０又は １５００×１０４Ｍ－１Ｓ－１の速度で少なくとも１つのＭＭＰにより特異的に切断され、そして、約０．００１－１５００×１０４Ｍ－１Ｓ－１又は少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７.５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０又は １５００×１０４Ｍ－１Ｓ－１の速度で少なくとも１つのＳＰにより特異的に切断される。
酵素による特異的切断のためには、酵素とＣＭ１－ＣＭ２基質との間の接触が行われる。ＭＭ及びＣＭ１－ＣＭ２基質にカップリングされるＡＢを含む活性化可能抗体が、標的及び十分な酵素活性の存在下にある場合、ＣＭ１－ＣＭ２基質は切断され得る。十分な酵素活性とは、ＣＭ１－ＣＭ２基質と接触し、そして切断をもたらす酵素の能力を意味する。酵素はＣＭ１－ＣＭ２基質の近くにあっても良いが、しかし他の細胞因子又は酵素のタンパク質修飾のために切断できないことが容易に想定される。
本明細書に記載される組成物への使用のために適切なリンカーは一般的に、標的への少なくとも第一ＡＢの結合の阻害を促進するために、修飾されたＡＢ又は活性化可能抗体の柔軟性を提供するリンカーである。適切なリンカーは、容易に選択され、そして何れかの適切な異なった長さのものであり得、例えば１個のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）－２０個のアミノ酸、２個のアミノ酸－１５個のアミノ酸、３個のアミノ酸－１２個のアミノ酸、４個のアミノ酸－１０個のアミノ酸、５個のアミノ酸－９個のアミノ酸、６個のアミノ酸－８個のアミノ酸、又は７個のアミノ酸－８個のアミノ酸であり得、そして１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の長さのアミノ酸であり得る。
典型的な柔軟リンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１） 及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）、ここでｎ は、少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン －セリンポリマー、及び当業界において知られている他の柔軟リンカーを包含する。グリシン及びグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、そして従って、構成成分間で中立的テザー（neutral tether）として作用することができる。グリシンは、あってもアラニンよりも著しくファイ・プサイ空間にアクセスし、そしてより長い側鎖を有する残基よりもはるかに低く制限される（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142（1992）を参照のこと）。典型的な柔軟リンカーは、次の配列を含むが、但しそれらだけには限定されない：Gly-Gly-Ser-Gly（配列番号３８３）、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly（配列番号３８４）、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（配列番号３８５）、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号３８６）、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly（配列番号３８７）、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly（配列番号３８８）、及び同様のもの。当業者は、活性化可能抗体の企画がすべて又は部分的に柔軟であるリンカーを含むことができ、結果的に、そのリンカーは柔軟リンカー及び所望する多重特異的活性化可能抗体構造を提供するために低い柔軟性の構造を付与する１又は２以上の部分を含むことができることを認識するであろう。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体に結合される剤も包含する。いくつかの実施形態において、結合された剤は、治療剤、例えば抗炎症剤及び／又は抗腫瘍剤である。そのような実施形態において、剤は、活性化可能抗体の炭水化物部分に結合され、例えば、いくつかの実施形態において、前記炭水化物部分は、抗体の抗原結合領域又は活性化可能抗体における抗原結合フラグメントの外部に位置する。いくつかの実施形態において、剤は、抗体のスルフヒドリル基、又は活性化可能抗体における抗原結合フラグメントに結合される。
いくつかの実施形態において、剤は細胞毒性剤、例えば毒素（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（すなわち、放射性結合体）である。
いくつかの実施形態において、剤は、検出可能部分、例えば標識又は他のマーカーである。例えば、剤は、放射性標識されたアミノ酸、マーキングされたアビジン（例えば、光学的又は比色法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出され得る１又は２以上のビオチニル部分、１又は２以上の蛍光標識、１又は２以上の酵素標識、及び／又は１又は２以上の化学蛍光剤により検出され得る。
本開示はまた、細胞毒性剤、例えば毒素（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（すなわち、放射性結合体）に結合される抗体を含む免疫結合体にも関連する。適切な細胞毒性剤は、例えばドラスタチン及びその誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）を含む。例えば、細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、前記剤は、表３に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤はメイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態において、剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドカプロイル－シトルリンリンカー又はマレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリンリンカーを用いて、ＡＢに連結される。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリンリンカーを用いて、ＡＢに連結される。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリンリンカーを用いて、ＡＢに連結される。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンゾイルオキシカルボニルリンカーを用いて、ＡＢに連結されるモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）であり、そしてこのリンカーペイロードコンストラクトは、本明細書において、「ｖｃ－ＭＭＡＤ」として呼ばれる。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラ－アミノベンゾイルオキシカルボニルリンカーを用いて、ＡＢに連結されるモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、そしてこのリンカーペイロードコンストラクトは、本明細書において、「ｖｃ－ＭＭＡＥ」として呼ばれる。ｖｃ－ＭＭＡＤ及びｖｃ－ＭＭＡＥの構造は、下記に示される：
ｖｃ－ＭＭＡＤ：
Figure 0006996981000064
 ｖｃ－ＭＭＡＥ：
Figure 0006996981000065
使用され得る酵素的活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌からの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロトン、サポナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種が放射性結合された抗体の生成のために利用できる。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅを挙げることができる。
抗体及び細胞毒性剤の結合体は、種々の二官能タンパク質－カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（p－アジドベンゾイル） ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス －（p－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２,４－ジニトロベンゼン）を用いて製造される。例えば、リシン免疫毒素がVitetta et al., Science 238: 1098（1987）に記載のようにして調製され得る。14Ｃ－標識された１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の結合のための典型的なキレート剤である。（国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。
表３は、本明細書に記載される開示に使用され得る典型的な薬剤のいくつかを列挙するが、しかし決して網羅的な列挙を意味するものではない。
Figure 0006996981000066
当業者は、多くの種類の可能性ある部分が、得られる本開示の抗体にカップリングされ得ることを認識するであろう（例えば、“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr（eds）, Carger Press, New York,（1989）を参照のこと、この全内容は、引用により本明細書に組込まれる）。
カップリングは、抗体及び他の部分がそれらのそれぞれの活性をできるだけ長く保持するよう、２つの分子を結合するであろう任意の化学反応により達成される。この結合は、多くの化学機構、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合及び錯体形成を包含することができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的縮合により又は外部架橋分子の取り組みにより達成され得る。多くの二価又は多価結合剤が、タンパク質分子、例えば本開示の抗体を、他の分子にカップリングすることにおいて有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンを包含することができる。この列挙は、当業界において知られている種々の種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例である。（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549（1984）；Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216（1982）；及びVitetta et al., Science 238:1098（1987）を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される組成物及び方法の他に、結合された活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体配列に挿入されるか、又は他方では、含まれる修飾されたアミノ酸配列を通して、部位特異的結合のために修飾され得る。それらの修飾されたアミノ酸配列は、結合された活性化可能抗体内での結合された剤の制御された置換及び／又は投与を可能にするよう企画される。例えば、活性化可能抗体は、反応性チオール基を提供し、そしてタンパク質の折りたたみ及びアセンブリーに負の影響を与えず、又は抗原結合も変更しない、Ｌ及びＨ鎖上の位置でのシステイン置換を含むよう操作され得る。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、結合のための適切な部位を提供するために、活性化可能抗体内に１又は２以上の非天然のアミノ酸残基を含むか又は他方では、導入するよう操作され得る。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、その活性化可能抗体配列内に酵素的に活性化可能ペプチド配列を含むか又は他方では、導入するよう操作され得る。
適切なリンカーは、文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載する、Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208（1984）を参照のこと）。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体にカップリングされる、ハロゲン化されたアセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照のこと。いくつかの実施形態において、適切なリンカーは、次のものを包含する：（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノ－プロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉi）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジル－ジチオ）－トルエン（Pierce Chem. Co., カタログ番号（21558G））；（iii）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Pierce Chem. Co. カタログ番号21651G）；（iv）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル－６－［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］－ヘキサノエート（Pierce Chem. Co. カタログ番号2165-G）；及び（v）ＥＤＣに結合されるスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホ－スクシンイミドPierce Chem. Co. カタログ番号24510）：。追加のリンカーは、ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ又はスルホ－ＳＰＤＢを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
上記に記載されるリンカーは、異なった属性を有する成分を含み、従って、異なった物理－化学性質を有する結合体を導く。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルよりも、より安定性である。ＮＨＳ－エステル含有リンカーは、スルホ－ＮＨＳエステルよりも低い溶解性である。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体的にヒンダードされたジスルフィド結合を含み、そして高められた安定性を有する結合体を形成することができる。ジスルフィド結合は一般的に、ジスルフィド結合がインビトロで切断され、低い利用可能な結合体をもたらすので、他の結合よりも安定性が低い。特に、スルホ－ＮＨＳは、カルボジイミドカップリングの安定性を増強することができる。カルボジイミドカップリング（例えば、ＥＤＣ）は、スルホ－ＮＨＳと併用して使用される場合、カルボジイミドカップリング反応のみよりも、加水分解に対して、より耐性である。
いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能である。いくつかの実施形態において、リンカーは非切断可能である。いくつかの実施形態において、複数のリンカーが存在する。それらの複数のリンカーはすべて同じである。例えば切断可能か又は非切断可能であり、又はそれらの複数のリンカーは異なっており、例えば、少なくとも１つは切断可能であり、そして少なくとも１つは非切断可能である。
本開示は、次のように、ＡＢに剤を結合するためのいくつかの方法を利用する：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への結合、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への結合、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への結合、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシル基への結合。本開示によれば、ＡＢは、少なくとも２つの反応性基を有する中間リンカーを通して剤に共有結合され得、ここで１つの反応性基はＡＢと反応し、そして１つの基は剤と反応する。任意の適合性有機化合物を含むことができるリンカーは、ＡＢ（又は剤）との反応がＡＢ反応性及び選択性に悪影響を及ぼさないよう選択される。さらに、剤へのリンカーの結合は、剤の活性を破壊しない。酸化された抗体又は酸化された抗体フラグメントとの反応のための適切なリンカーは、第一アミン、第二アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミフルバジド基から成る群から選択されたアミンを含むそれらのリンカーである。そのような反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在するか、又はそのような基を含まないリンカーの適切な化学的修飾により導入され得る。
本開示によれば、還元されたＡＢへの結合のための適切なリンカーは、還元された抗体又はフラグメントのスルフヒドリル基と反応できる特定の反応性基を有するそれらのリンカーを包含する。そのような反応性基は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基を包含する）、ｐ－マーキュリー安息香酸基及びマイケル型付加反応することができる基（例えば、マレイミド、及びMitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110により記載されるタイプの基を包含する）。
本開示によれば、酸化も又は還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、ＡＢにおける修飾されていないリシン残基に存在する第一アミンと反応することができる特定の官能基を有するそれらのリンカーである。そのような反応性基は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、スルホ－ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、４－ニトロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、ペンクフルオロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート及びインチオシアネート。
本開示によれば、酸化も、還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、適切な試薬により活性化された、ＡＢにおけるアスパラギン酸又はグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応することができる特定の官能基を有するそれらのリンカーを包含する。適切な活性化試薬は、付加されたＮＨＳ又はスルホ－ＮＨＳを有するか又は有さないＥＤＣ、及びカルボキサミド形成のために利用される他の脱水剤を包含する。それらの場合、適切なリンカーに存在する官能基は、第一及び第二アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン及びヒドラジドを包含する。
剤は、リンカーがＡＢに結合される前又は後、リンカーに結合され得る。特定の用途によれば、リンカーが関連する剤を有さないＡｂ－リンカー中間体を、最初に生成することが所望される。特定の用途に依存して、特定の剤がリンカーに共有結合され得る。他の実施形態において、ＡＢが、ＭＭ、ＣＭ１－ＣＭ２基質及び関連するリンカーに、まず結合され、そして次に、結合目的のためにリンカーに結合される。
分枝状リンカー：特定の実施形態において、剤の結合のための複数の部位を有する分枝状リンカーが使用される。複数部位リンカーに関しては、ＡＢへの単一の共有結合が、多数の部位で剤を結合できるＡＢ－リンカー中間体をもたらす。前記部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得るか、又は剤が結合され得る任意の化学部位であり得る。
いくつかの実施形態において、より高い比活性（又はＡＢに対する剤の高い比率）が、ＡＢ上の複数の部位での単一の部位リンカーの結合により達成され得る。この複数の部位は、２種の方法の何れかによりＡＢ中に導入され得る。最初に、１つの方法は、同じＡＢに複数のアルデヒド基及び／又はスルフヒドリル基を生成することができる。第二に、１つの方法は、リンカーへの続く結合のために複数の官能部位を有する「分枝状リンカー」を、ＡＢのアルデヒド又はスルフヒドリルに結合することができる。分枝状リンカー又は複数部位リンカーの官能部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得るか、又はリンカーが結合され得る任意の化学部位であり得る。さらに高い比活性がそれらの２種のアプローチを組合すことにより、すなわち、ＡＢ上のいくつかの部位で複数部位リンカーを結合することにより得られる。
切断可能リンカー：補体系の酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素（但し、それだけには限定されない）による切断に対して敏感であるペプチドリンカーが、本開示の１つの実施形態に使用され得る。本開示の１つの方法によれば、剤が補体による切断に感受性のリンカーを介して結合される。抗体は、補体を活性化できる種類から選択される。従って、抗体－剤結合体は、補体カスケードを活性化し、そして標的部位で剤を開放する。本開示の別の方法によれば、剤は、タンパク質分解活性を有する酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン、活性化因子、プラスミン又はトリプシンによる切断に対して感受性のリンカーを介して結合される。それらの切断可能リンカーは、細胞外毒素、例えば非制限的例によれば、表３に示される細胞外毒性の何れかを含む、結合された活性化可能抗体において有用である。
切断可能リンカー配列の非制限的剤が、表４に提供される。
Figure 0006996981000067
さらに、剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン残基上のジスルフィド結合）を介してＡＢに結合され得る。多くの腫瘍は天然において、高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するので、これがジスルフィド結合を還元し、送達の部位での剤の続く放出を引き起す。特定の実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質を修飾する還元剤はまた、結合された活性化可能抗体のリンカーを修飾するであろう。
スペーサー及び切断可能要素：さらに別の実施形態において、剤と、活性可能抗体のＡＢとの間の空間を最適化するような手段でリンカーを構成する必要がある。これは、下記一般構造のリンカーの使用により達成され得る：
Ｗ－（ＣＨ２）ｎ－Ｑ
｛式中、
Ｗは、－Ｎ－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０－２０の整数である｝。
いくつかの実施形態において、リンカーはスペーサー要素及び切断可能要素を含むことができる。スペーサー要素は、切断可能要素が切断を担当する酵素により接近できるようＡＢのコアーから離れて、切断可能要素を位置決定するよう作用する。上記に記載される特定の分枝リンカーが、スペーサー要素として作用することができる。
この議論を通して、剤へのリンカーの結合（又は切断可能要素へのスペーサー要素の、又は剤への切断可能要素の結合）は、結合又は反応の特定のモードである必要はないことが理解されるべきである。適切な安定性及び生物学的適合性の生成物を提供する任意の反応が許容できる。
血清補体及びリンカーの選択：本開示の１つの方法によれば、剤の放出が所望される場合、補体を活性化できる種類の抗体であるＡＢが使用される。その得られる結合体は、抗原を結合し、そしてカスケードを活性化する両能力を保持する。従って、本開示のこの実施形態において、剤は、切断可能リンカー又は切断可能要素の一端に連結され、そしてリンカー基の他端がＡＢ上の特異的部位に結合される。例えば、剤がヒドロキシ基又はアミノ基を有する場合、それは、ペプチド、アミノ酸又は他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に、それぞれ、エステル又はアミド結合を介して結合され得る。例えば、そのような剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに結合され得る。剤が、リンカーへの結合を妨げる官能基を含む場合、それらの妨害官能基は、結合の前、ブロックされ、そして生成物の結合体又は中間体が製造されるとすぐに、脱ブロックされる。次に、リンカーの反対又はアミノ末端が、直接、又は補体を活性化できるＡＢへの結合のために、さらなる修飾の後、使用される。
リンカー（又はリンカーのスペーサー要素）は何れかの所望する長さのものであり、その一端は、活性化可能抗体のＡＢ上の特異的部位に共有結合される。リンカー又はスペーサー要素の他の末端は、アミノ酸又はペプチドリンカーに結合され得る。
従って、それらの結合体が補体の存在下で抗原に結合する場合、剤をリンカーに結合するアミド又はエステル結合が切断され、その活性形での剤の放出がもたらされる。それらの結合体は、対象に投与される場合、標的部位での剤の送達又は放出を達成し、そして表３のそれら（但し、それらに制限されない）に提示されるように、薬剤、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤及び同様のもののインビボ送達のために特に効果的である。
補体活性化なしでの放出のためのリンカー：標的化された送達のさらなる別の用途によれば、補体活性化なしでの剤の放出は、補体カスケードの活性化が最終的には、標的細胞を溶解するので、所望される。従って、このアプローチは、剤の送達及び放出が標的細胞を死滅しないで、達成されるべきである場合、有用である。細胞メディエーター、例えばホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物質、遺伝子又は酵素の標的細胞への送達が所望される場合、そのようなことが目的である。それらの結合体は、血清プロテアーゼによる切断に対して軽度に敏感であるリンカーを介して、補体を活性化できないＡＢに剤を結合することにより調製され得る。この結合体が個人に投与される場合、抗原－抗体補体がすばやく形成するが、ところが剤の切断はゆっくり生じ、従って、標的部位での化合物の放出がもたらされる。
生化学架橋剤：他の実施形態において、活性化可能抗体は、特定の生化学的架橋剤を用いて、１又は２以上の治療剤に結合され得る。架橋試薬は、２種の異なった分子の官能基を一緒に結合する分子橋を形成する。段階的に２つの異なったタンパク質を連結するためには、所望しないホモポリマー形成を排除するヘテロ－二官能性架橋剤が使用され得る。
リソソームプロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカー、例えばＶａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ又は他のジペプチドがまた有用である。さらに、リソソームの低ｐＨ環境下で切断可能な酸－不安定性リンカー、例えばビス－シアリルエーテルが使用され得る。他の適切なリンカーは、カテプシン－不安定性基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示すそれらを包含する。
典型的なヘテロ－二官能性架橋剤が表５に参照される。
Figure 0006996981000068
非切断可能リンカー又は直接的結合：本開示のさらに他の実施形態において、結合体は、剤が標的に送達されるが、しかし放出されないよう企画され得る。これは、ＡＢに剤を、直接的に又は非切断可能リンカーを介して結合することにより達成され得る。
それらの非切断リンカーは、続いて、本明細書に記載される方法によりＡＢへの結合に利用され得る官能基を含むよう修飾され得る、アミノ酸、ペプチド、Ｄ－アミノ酸又は他の有機化合物を含むことができる。そのような有機リンカーのための一般式は、下記式であり得る：
Ｗ－（ＣＨ２）ｎ－Ｑ
｛式中、
Ｗは、－Ｎ－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０－２０の整数である｝。
非切断可能結合体：いくつかの実施形態において、化合物は、補体を活性化できないＡＢに結合され得る。補体活性化することができないＡＢを用いる場合、この結合は、活性化された補体による切断に敏感であるリンカーを用いて、又は活性化された補体による切断に敏感ではないリリンカーを用いて、達成され得る。
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化され得る。抗体を含むリポソームは、当業界において知られている方法、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688（1985）；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030（1980）；及び米国特許第４，４８５，０４５号 及び米国特許第４，５４４，５４５号に記載される方法により調製される。向上された循環時間を有するリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ－誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発方法により生成され得る。リポソームは、所望する直径を有するリポソームを生成するために、定義された孔サイズのフィルターを通して押出される。本開示の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド－交換反応を介して、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288（1982）に記載されるリポソームに結合され得る。
定義
特にことわらない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者により通常、理解される意味を有するであろう。用語「ａ」実体又は「ａｎ」実体とは、１又は２以上のその実体を意味する。たとえば、１つの化合物とは、１又は２以上の化合物を言及する。従って、用語「ａ」、「ａｎ」、「１又は２以上（one or more）」及び「少なくとも１つ（at least one）」とは、交換可能的に使用され得る。さらに、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は、複数形も含み、そして複数形の用語は単数形も含むであろう。一般的に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、及びタンパク質及びオリゴ－又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して及びそれらの技法に関連して使用される命名法は、当業界において良く知られており、そして通常使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に関しては、標準技法が使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様に従って、又は当核技術分野において通常に達成されるようにして、又は本明細書に記載されるようにして、実施される。前述の技法及び手順は、一般的に、当業界において良く知られている従来の技法に従って、及び本明細書を通して引用され、そして議論される種々の一般的な及びより具体的な参考文献に記載されるようにして実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（1989））を参照のこと。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、及び医薬品及び製薬化学に関連して使用される命名法、及びそれらの実験手順及び技法は、良く知られており、そして一般的に当業界において使用される。化学合成、化学分析、医薬製剤、製剤化及び送達、及び患者の治療についての標準技法が用いられる。
本開示に従って使用される場合、次の用語は、特にことわらない限り、次の意味を有することが理解されるであろう。
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。「特異的に結合する（specifically bind）」又は「～と免疫反応する（immunoreacts with）」、又は「免疫特異的に結合する（immunospecifically bind）」とは、抗体が所望の抗原の１又は２以上の抗原決定基と反応し、そして他のポリペプチドとは反応しないか、又はより低い親和性（Ｋｄ＞１０－６）で結合することを意味する。抗体とは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ドメイン抗体、一本鎖、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ及びＦａｂ発現ライブラリーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
基本的抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「Ｌ鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「Ｈ鎖」（約５０－７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する約１００－１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、エフェクター機能を主に担当する不変領域を定義する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれかに関し、それらは分子に存在するＨ鎖の性質によりお互い異なる。特定のクラスは、サブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及び他のものを有する。さらに、ヒトにおいては、Ｌ鎖は、κ鎖又はλ鎖であり得る。
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」（ｍＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物（monoclonal antibody composition）」とは、本明細書において使用される場合、ユニークＬ鎖遺伝子生成物及びユニークＨ鎖遺伝子生成物から成る抗体分子の１つの分子種のみを含み抗体分子集団を言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、前記集団の分子全てにおいて同一である。ＭＡｂは、それに対するユニーク結合親和性により特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
用語「抗原－結合部位（antigen-binding site）」又は「結合部分（binding portion）」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を言及する。抗原結合部位は、Ｈ鎖（Ｈ）及びＬ鎖（Ｌ）のＮ－末端可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域（hyperrariable regions）」として言及される、Ｈ及びＬ鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「骨格領域（framework regions）」又はＦＲとして知られている、より保存されたフランキングストレッチ間に介在する。従って、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリンにおける超可変領域間に天然において見出され、そしてその領域に隣接して存在するアミノ酸配列を言及する。抗体分子においては、Ｌ鎖の３つの超可変領域及びＨ鎖の３つの超可変領域が、抗原－結合表面を形成するために、立体空間でお互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合される抗原の立体表面に相補的であり、そしてＨ鎖及びＬ鎖の個々の３つの超可変領域は、「相補性－決定領域（Complementarity-determining regions）」又は「ＣＤＲ」として言及される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md.（1987 and 1991））又は Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917（1987）, Chothia et al. Nature 342:878-883（1989）の定義に従う。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ（epitope）」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ又はＴ－細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ－細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は通常、分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の化学的活性表面基から成り、そして通常、特異的立体構造特性、及び特異的電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ－末端又はＣ－末端ペプチドに対して高められる。抗体は、解離定数が≦１μＭである場合、例えば、いくつかの実施形態において、≦１００ｎＭ、及びいくつかの実施形態において、≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合（specific binding）」、「免疫学的結合（immunological binding）」及び「免疫学的結合性質（immunological binding properties）」とは、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を言及する。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表され得、ここでより小さなＫｄがより高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合性質は、当業界において良く知られている方法を用いて定量化され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度の測定を必要とし、ここでそれらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性及び両方向にその速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数（on rate constant）」（Ｋｏｎ）及び「オフ速度定数（「off rate constant」）（Ｋｏｆｆ）の両者は、濃度、及び会合及び解離の実際の速度の計算により決定され得る。（Nature 361:186-87（1993）を参照のこと）。Ｋｏｆｆ/Ｋｏｎの比率は、親和性に関係しないすべてのパラメーターの取り消しを可能にし、そして解離定数Ｋｄに等しい。（一般的に、Davies et al.（1990） Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本開示の抗体は、当業者に知られているアッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ又は類似するアッセイにより測定される場合、結合定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、例えば、いくつかの実施形態において、≦１００ｎＭ、いくつかの実施形態において、≦１０ｎＭ、及びいくつかの実施形態において、≦１００ｐＭ－約１ｐＭである場合、ＥＧＦＲに対して特異的に結合すると言われる。
用語「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成起源、又はそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源により、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見出される、ポリヌクレオチドのすべて又は一部に関連せず、（２）それが天然において連結されないポリヌクレオチドに操作可能的に連結されるか、又は（３）大きな配列の一部として、天然において存在しない。本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び本明細書に示されるＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
本明細書において言及される用語「単離されたタンパク質（isolated protein）」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源又はそれらのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源又は誘導源により、「単離されたタンパク質」は、（１）天然において見出されるタンパク質とは関連せず、（２）同じ源からの他のタンパク質、例えばネズミタンパク質を有さず、（３）異なった種からの細胞により発現されるか、又は（４）天然において存在しない。
用語「ポリペプチド（polypeptide）」とは、天然タンパク質フラグメント又はポリペプチドの配列の類似体を言及するための遺伝子用語として、本明細書において使用される。従って、天然タンパク質フラグメント及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本開示のポリペプチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子、及び本明細書に示されるＬ鎖免疫グロブリン分子、並びに、Ｌ鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパＬ鎖免疫グロブリンと共に、Ｈ鎖免疫グロブリン分子を含む組合せにより形成される抗体分子を含み、そして逆もまた同様に、及びそれらのフラグメント及び類似体も含む。
本明細書において使用される、用語「天然に存在する（naturally-occurring）」とは、目的に適用される場合、目的が天然において見出され得る事実を意味する。例えば、天然源から単離され得る生物（ウィルスを含む）に存在し、そして実験室においてヒトにより意図的に修飾されておらず、又は他方では、天然に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を挙げることができる。
用語「操作可能的に連結される（operably linked）」とは、本明細書において使用される場合、そのように記載される成分の位置が、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「操作可能的に連結される」制御配列は、そのコード配列の発現が制御配列と適合できる条件下で達成されるような手段で連結される。
用語「制御配列（control sequence）」とは、本明細書において使用される場合、連結されるコード配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすのに必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存して異なり、そのような制御配列は一般的に、真核生物では、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み、一般的に、そのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセッシングのために必須であるすべての成分を、少なくとも含むよう意図され、そしてまた、その存在が好都合である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができる。用語「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１０個の長さの塩基のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド、又は何れかのタイプのヌクレオチドの修飾形を意味する。この用語は、単鎖及び二本鎖形のＤＮＡを包含する。
本明細書において言及される用語、ポリヌクレオチドは、天然に存在し、そして天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に連結される、天然に存在し、そして修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、２００個又はそれよりも少ない長さの塩基を一般的に含むポリヌクレオチドポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０－６０個の長さの塩基、及び、いくつかの実施形態において、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０－４０個の長さの塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、プローブについては一本鎖であるが、但しオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異体の構成への使用に関しては、二本鎖であり得る。本開示のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスの何れかのオリゴヌクレオチドである。
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「修飾されたヌクレオチド（modified nucleotides）」は、修飾されたか又は置換された糖基等を有するヌクレオチドを含む。本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド結合（oligonucleotide linkages）」は、オリゴヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデート及び同様のものを包含する。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081（1986）；Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077（1984）, Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209（1988）, Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539（1991）；Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108（F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England（1991））；Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543（1990）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望には、検出のための標識を含むことができる。
本明細書において使用される場合、２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、慣用的用法に従う。Immunology - A Synthesis（2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass.（1991））を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸、例えばα－置換されたアミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）もまた、本開示のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、次のものを包含する：４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、ε－Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、δ－Ｎ－メチルアルギニン及び他の類似するアミノ酸、及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）。本明細書において使用されるポリペプチド表記においては標準の使用法及び慣習によれば、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、特にことわらない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は、５’末端であり、そして二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向として言及される。新生ＲＮＡ転写体の５’から３’への付加の方向は、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖との転写方向配列と称され、そしてＲＮＡ転写体の５’から５’末端への方向は、「上流配列（upstream sequences）」、すなわちＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域と称され、そしてＲＮＡ転写体の３’から３’末端への方向は、「下流配列（downstream sequences）」と称される。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な同一性（substantial identity）」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップウェイト（default gap weights）を用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％の配列同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも９５％の配列同一性、及びいくつかの実施形態において、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
いくつかの実施形態において、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
本明細書において論じられる場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における小さな変動が、本開示により包含されるよう意図され、但しアミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも８０％、９０％、９５％、及びいくつかの実施形態において、９９％、維持されるべきである。特に、保存性アミノ酸置換が意図される。保存性置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で生じるものである。遺伝子的にコードされるアミノ酸は一般的に、次のファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニンヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり；そして（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン及びトレオニンを包含する。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。アミノ酸の他のファミリーは、次のものを包含する：（ｉ）脂肪族－ヒドロキシファミリーである、セリン及びトレオニン；（ii）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン；（iii）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；及び（iv）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの単離された置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸、セリンによるトレオニン、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似する置換が、特に、その置換が骨格部位内にアミノ酸を含まない場合、その得られる分子の結合又は性質に対して主要な影響を与えないであろうことを予測するのは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより、容易に決定され得る。アッセイは、本明細書において詳細に記載されている。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又は類似体は、当業者により容易に調製され得る。フラグメント又は類似体の適切なアミノ－及びカルボキシ－末端は、機能的ドメインの境界近くに存在する。構造及び機能ドメインは、公的又は独自の配列データベースに、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を比較することにより、同定され得る。いくつかの実施形態において、コンピュータ化された比較方法が、既知構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測されるタンパク質立体構造ドメインを同定するために使用され得る。既知の三次元構造に折りたたむタンパク質を同定する方法は知られている（Bowie et al. Science 253:164（1991））。従って、前述の例は、当業者が本開示に従って構造的及び機能的ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフ及び構造コンホメーションを認識できることを示す。
適切なアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更し、（４）結合親和性を変更し、そして（５）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的性質を付与するか、又は修飾するそれらの置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々の変異を含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において（分子間接触を形成するドメイン（単数又は複数）外のポリペプチドの部分において）、行われ得る。保存性アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変えるべきではない（例えば、アミノ酸置換は、親配列に存在するへリックスを破壊するか又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を分裂する傾向があるべきではない）。当技術分野で認識されるポリペプチドの二次及び三次構造の例は、タンパク質、構造及び分子の原則（Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York（1984））；タンパク質構造の紹介（C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.（1991））；及びThornton et at. Nature 354:105（1991）に記載されている。
用語「ポリペプチドフラグメント（polypeptide fragment）」とは、本明細書において使用される場合、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失及び／又は１又は２以上の内部欠失を有するが、しかし残るアミノ酸配列が、例えば完全な長さのｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列におけるその対応する位置と同一である、ポリペプチドを意味する。フラグメントは典型的には、少なくとも５、６、８又は１０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１４個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態において、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、通常、少なくとも５０個の長さのアミノ酸、及びいくつかの実施形態において、７０個の長さのアミノ酸である。用語「類似体（analog）」とは、本明細書において使用される場合、推定されるアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有し、そして適切な結合条件下で標的に対する特異的結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に対して保存性アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、そしてしばしば、完全な長さの天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
用語「剤（agent）」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は生体材料から製造される抽出物を示すために、本明細書において使用される。
本明細書において使用される場合、用語「標識（label）」又は「標識された（labeled）」とは、例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み、又はマーキングされたアビジン（例えば、光学的又は比色法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能マーカーの組込みを意味する。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法が当業界において知られており、そして使用され得る。ポリペプチドのための標識の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、種々の長さのスペーサーアームにより結合される。用語「薬剤又は薬物（pharmaceutical agent or drug）」とは、本明細書において使用される場合、患者に正しく投与される場合、所望の治療効果を誘発できる化合物又は組成物を意味する。
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms（Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco（1985））により例示されるように、当業界における従来の用法に従って使用される。
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な（substantially pure）」とは、目的種が存在する主要種であり（すなわち、モル基準で、組成物中のいずれか他の個々の種よりも豊富である）、そしていくつかの実施形態において，実質的に精製された画分が組成物であり、ここで、目的種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を占めることを意味する。
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物の存在するすべての高分子種の約８０％以上、いくつかの実施形態において、約８５％、９０％、９５％及び９９％以上を占めるであろう。いくつかの実施形態において、目的種は、本質的に均質に精製され（組成物中の汚染種は、従来の検出法によっては検出され得ない）、ここで組成物は単一の高分子種から本質的に成る。
用語「患者（patient）」とは、ヒト及び獣医学的対象を含む。
本開示の活性化可能抗体は、所定の標的、例えばヒト標的タンパク質を、特異的に結合する。本明細書に記載される活性化可能抗体と同じエピトープに結合する活性化可能抗体もまた、本開示に結合される。
当業者は、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル又はヒト化抗体）が、前者が後者の標的への結合を妨げるかどうかを確かめることにより、本明細書に記載される方法に使用されるモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、過度の実験を行わないで、決定することが可能であることを認識するであろう。試験されるモノクローナル抗体が、本開示のモノクローナル抗体による結合の低下により示されるように、本開示のモノクローナル抗体と競争する場合、それらの２種のモノクローナル抗体は、同じか又は密接に関連するエピトープに結合する。モノクローナル抗体が本開示のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するための方法は、標的と共に、本開示のモノクローナル抗体とをプレインキュベートし、そして次に、試験されるモノクローナル抗体を添加し、試験されるモノクローナル抗体が標的を結合するその能力を阻害するかどうかを決定することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、ほぼ確実に、それは本開示のモノクローナル抗体と同じか、又は機能的に同等のエピトープ特異性を有する。
多重特異的活性化可能抗体
本開示はまた、多重特異的活性化可能抗体を提供する。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、複数の抗原又はエピトープを認識し、そして多重特異的抗体の少なくとも１つの抗原－又はエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む多重特異的抗体であり、結果的に、ＭＭのカップリングが、抗原－又はエピトープ－結合ドメインのその標的を結合する能力を低減する。いくつかの実施形態において、ＭＭは、少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼ及び少なくとも１つのＳＰのための基質として機能する切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２基質）を介して、多重特異的抗体の抗原－又はエピトープ－結合ドメインにカップリングされる。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常な、すなわち健康な組織においては活性化されず、そして活性化される場合、その対応する、修飾されていない多重特異的抗体に、少なくとも匹敵する標的への結合を示す。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、また本明細書において免疫エフェクター係合多重特異的活性化可能抗体としても言及される免疫エフェクター細胞を係合するよう企画される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、また白血病係合多重特異的活性化可能抗体として本明細書において言及される、白血球を係合するよう企画される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、またＴ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体として本明細書において言及される、Ｔ－細胞を係合するよう企画される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、白血球、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、及び／又は別の免疫エフェクター細胞上の表面抗原を係合する。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、白血球である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、単核細胞、例えば骨髄単核細胞である。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、多抗原標的化活性化可能抗体としても本明細書において言及される、複数の標的及び／又は複数のエピトープを結合するか、又は他方では、それと反応するよう企画される。本明細書において使用される場合、用語「標的（target）」及び「抗原（antigen）」とは、交換可能的に使用される。
いくつかの実施形態において、本開示の免疫エフェクター細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫エフェクター細胞係合抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／又は免疫エフェクター細胞係合抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一免疫エフェクター細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一免疫エフェクター細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減し、そして標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一免疫エフェクター細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、非免疫エフェクター細胞係合抗体は、癌標的化抗体である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞係合抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、標的化抗体（例えば、非免疫細胞エフェクター抗体）は、ＩｇＧであり、そして免疫エフェクター細胞係合抗体はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は白血球である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は骨髄単核細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示のＴ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ－細胞係合抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／又はＴ－細胞係合抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一Ｔ－細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一Ｔ－細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ－細胞係合抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／又はＴ－細胞係合抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一Ｔ－細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一Ｔ－細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二癌関連標的を結合する、第二抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ－細胞係合ｓｃＦｖを含み、ここで癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／又はＴ－細胞係合抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一Ｔ－細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一Ｔ－細胞係合標的を結合する、第一抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第一標的を結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二癌関連標的を結合する、第二抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
免疫エフェクター係合多重特異的活性化可能抗体のいくつかの実施形態において、１つの抗原は典型的には、腫瘍細胞、又は疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば、表１に列挙されるに任意の標的、例えばＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ３又はＣＤ７１（トランスフェリン受容体）であるが、但しそれらだけには限定されず、そして別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激又は阻害受容体、例えばＢ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡであるが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態において、抗原は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面上に存在する刺激受容体であり；そのような刺激受容体の例は、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（又は４－１ＢＢとしても言及される）、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＯＸ４０を包含するが、但しそれらだけには制限されない。いくつかの実施形態において、抗原は、Ｔ－細胞の表面上に存在する阻害受容体であり；そのような阻害受容体の例は、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＰＤ－1、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＮＫ－発現ＫＩＲを包含するが、但しそれらだけには限定されない。Ｔ－細胞表面抗原に対して特異性を与える抗体エフェクター細胞受容体、例えばＢ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２又はＴＮＦＳＦ９（但し、それらだけには限定されない）に結合する、リガンド又はリガンドドメインにより置換され得る。
本開示の１つの実施形態は、癌微小環境において活性化でき、そして抗体、例えば腫瘍標的及びアゴニスト抗体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖ、例えば活性化されたＴ細胞又はＮＫ細胞の表面上で発現される共刺激受容体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖを含む多重特異的活性化可能抗体であり、ここで前記癌標的抗体及び／又はアゴニスト抗体の少なくとも１つはマスキングされている。共刺激受容体の例は、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＮＫＧ２Ｄ及びＯＸ４０を包含するが、但しそれらだけには限定されない。この実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、腫瘍関連プロテーゼにより活性化されると、任意の腫瘍抗原に応答するＴ細胞の活性を、それらの内因性Ｔ細胞抗原又はＮＫ－活性化受容体を介して増強するために、腫瘍依存性態様でＴ細胞又はＮＫ細胞発現共刺激受容体を効果的に架橋し、そして活性化するであろう。それらのＴ細胞又はＮＫ細胞共刺激受容体の活性化－依存性質は、それらの抗原特異性に関係なく、すべてのＴ細胞を活性化しないで、腫瘍特異的Ｔ細胞に、活性化された多重特異的活性化可能抗体の活性の焦点を当てている。１つの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の少なくとも共刺激受容体抗体、多重特異的活性化可能抗体において腫瘍標的指向抗体により認識される抗原をまた発現する組織に存在することができる自己反応性Ｔ細胞の活性化を防止するために、マスキングされているが、しかしそれらの活性は、共受容体の係合の欠如により制限されている。
本開示の１つの実施形態は、Ｔ細胞過剰刺激により特徴づけられる疾患、例えば自己免疫疾患又は炎症性疾患の微小環境（但し、それらだけには限定されない）において活性化できる多重特異的活性化可能抗体である。そのような多重特異的活性化可能抗体は、抗体、例えば自己免疫炎症性疾患においてＴ細胞により標的化される組織において発現される表面抗原を含む標的に向けられたＩｇＧ又はｓｃＦｖ、及び抗体、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の表面上に発現される阻害受容体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖを含み、ここで疾患組織標的抗体及び／又はＴ細胞受容体抗体の少なくとも１つはマスキングされている。阻害受容体の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＰＤ－1、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＮＫ－発現ＫＩＲ。自己免疫疾患におけるＴ細胞により標的化される組織抗原の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：多発生硬化症におけるミエリン又は神経細胞上に発現される表面抗原、又は１型糖尿病における膵島細胞上に発現される表面抗原。この実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、自己免疫攻撃又は炎症下で組織に局在化される場合、活性化され、そして任意の疾患組織の組織－標的化抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制するために、Ｔ細胞又はＮＫ細胞阻害受容体を、それらの内因性ＴＣＲ又は活性化受容体を介して共同係合する。１つの実施形態において、少なくとも１つの又は複数の抗体が、標的抗原がまた発現され得る非疾患組織における所望のＴ細胞応答の抑制を防ぐために、マスキングされる。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、抗－ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε、またＣＤ３ｅ及びＣＤ３としても本明細書において言及される）ｓｃＦｖ及び標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗－ＣＤ３ε ｓｃＦｖ及び／又は標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、抗－ＣＤ３ε ｓｃＦｖ及び癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗－ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二の癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、抗－ＣＤ３ε ｓｃＦｖ及び癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗－ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二の癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態においてＴ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、ＯＫＴ３由来の抗－ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）ｓｃＦｖを含み、ここで標的抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又はＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖの少なくとも１つがマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖ及び癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここでＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖ及び／又は癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二の癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖ及び癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここでＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖ及び／又は癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二の癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３－由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二癌関連標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態においてＴ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖを含み、ここで標的抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又は抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖの少なくとも１つがマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体は、抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ、及び標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖ及び／又は標的ＩｇＧ抗体又はその抗原結合部分の少なく１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。いくつかの実施形態において、前記抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４を結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ－４を結合するＡＢ１の能力を低減し、そして前記標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二標的を結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第二抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第二標的を結合するＡＢ２の能力を低減する。
いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、第一標的及び／又は第一エピトープを結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント、及び第二標的及び／又は第二エピトープを結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なった標的を結合する。いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、同じ標的上の複数の異なったエピトープを結合する。いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なった標的及び同じ標的上の複数の異なったエピトープの組合せを結合する。
いくつかの実施形態において、ＩｇＧを含む多重特異的活性化可能抗体は、マスキングされたＩｇＧ可能ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖを含む多重特異的活性化可能抗体は、マスキングされたｓｃＦｖドメインを有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキングのブ部にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキング部分にカップリングされ、そしてｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの個々は、それ自体のマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、Ｔ－細胞表面抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、別の標的抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原のエピトープに対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、標的抗原の別のエピトープに対する特異性を有する。
多重特異的活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性可能抗体のＨ鎖のカルボキシル末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体のＬ鎖のカルボキシル末端、又はＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両鎖のカルボキシル末端に融合され得る。多重特異的活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖のアミノ末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体のＬ鎖のアミノ末端に、又はＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両鎖のアミノ末端に融合され得る。多重特異的活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性可能性抗体の１又は２以上のカルボキシル末端及び１又は２以上のアミノ末端の何れかの組合せに融合され得る。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに連結され、そしてそのドメインをマスキングし、そしてＣＭ１－ＣＭ２基質に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。
本開示は、以下のもの（但し、それらだけには限定されない）を含む多重特異的活性化可能抗体構造の例を提供し：（ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２；（ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２；（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊）２；（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊）２；（ＶＬ－ＣＬ）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＬ－ＣＬ）２:（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊）２:（ＭＭ－Ｌ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ２－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２；又は（ＶＬ－ＣＬ－Ｌ４－ＶＬ＊－Ｌ３－ＶＨ＊－Ｌ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－Ｌ１－ＭＭ）２:（ＶＨ＊－Ｌ３－ＶＬ＊－Ｌ４－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）２、ここで、ＶＬ及びＶＨは、ＩｇＧに含まれる、第一特異性のＬ及びＨ可変ドメインを表し；ＶＬ＊及びＶＨ＊は、ｓｃＦｖに含まれる、第二特異性の可変ドメインを表し；Ｌ１は、マスキング部分（ＭＭ）及びＣＭ１－ＣＭ２基質を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ２は、ＣＭ１－ＣＭ２基質及び抗体を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ３は、ｓｃＦｖの可変ドメインを連結するリンカーペプチドであり；Ｌ４は、第二特異性の抗体に、第一特異性の抗体を有するリンカーペプチドであり；ＣＬは、Ｌ鎖不変ドメインであり；そしてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３は、Ｈ鎖不変ドメインである。前記第一及び第二特異性は、何れかの抗原又はエピトープに対して存在することができる。
Ｔ－細胞係合多重特異的活性化可能抗体のいくつかの実施形態において、１つの抗原は典型的には、腫瘍細胞又は疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば表１に列挙される何れかの標的（但し、それらだけには限定されない）、例えばＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ３又は ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）（但し、それらだけには制限されない）であり、そして別の抗原は典型的には、Ｔ－細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激（また、本明細書においては、活性化として言及される）又は阻害受容体、例えばＢ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７（または、ＴＮＦＲＳＦ９としても言及される）、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡ（但し、それらだけには制限されない）である。Ｔ－細胞表面抗原に対して特異性を提供する抗体ドメインはまた、Ｔ－細胞受容体、ＮＫ－細胞受容体、マクロファージ受容体及び／又は他の免疫エフェクター細胞受容体、例えばＢ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２又はＴＮＦＳＦ９（但し、それらだけには制限されない）に結合するリガンド又はリガンドドメインにより置換され得る。多重抗原標的化活性化可能抗原のいくつかの実施形態において、１つの抗原は、表１に列挙される標的群から選択され、そして別の抗原は、表１に列挙される標的群から選択される。
いくつかの実施形態において、標的化抗体は、抗－ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ５である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ４である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ６である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、抗－Ｊａｇｇｅｄ抗体である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ヒト及びマウスＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２への結合に対して特異的である４Ｄ１１である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ヒト及びマウスＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２への結合に対して特異的である４Ｄ１１ｖ２である。
いくつかの実施形態において、標的化抗体は、活性化可能抗体の形で存在することができる。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、プロ－ｓｃＦｖの形で存在することができる（例えば、国際公開第２００９／０２５８４６号、国際公開第２０１０／０８１１７３号を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ３εの結合に対して特異的であり、そしてＣＤ３ε、例えばＣＨ２５２７、ＦＮ１８、Ｈ２Ｃ、ＯＫＴ３、２Ｃ１１、ＵＣＨＴ１又はＶ９を結合する、抗体又はそのフラグメントであるか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ－４（また、本明細書においては、ＣＴＬＡ及びＣＴＬＡ４としても言及される）の結合に対して特異的である。
いくつかの実施形態において、抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、下記アミノ酸配列を含む：
Figure 0006996981000069
いくつかの実施形態において、抗－ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖは、配列番号３４７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗－ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、下記アミノ酸配列を含む：
Figure 0006996981000070
いくつかの実施形態において、抗－ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、配列番号３４９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、１又は２以上のＴ－細胞、１又は２以上のＮＫ細胞及び／又は１又は２以上のマクロファージを結合することに対して特異的である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡから成る群から選択された標的を結合することに対して特異的である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施形態において、前記剤は、抗腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記剤は、トキシン又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、前記剤は、リンカーを介して多重特異的活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態において、前記剤は、切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、前記剤は、少なくとも１つのＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含むリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、非切断性リンカーである。いくつかの実施形態において、前記剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は、核酸損傷剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、又はＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、前記剤は、表４に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は、トラスタチンである。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、前記剤は、メイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、ＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において前記剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態において、前記剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含むことができる。いくつかの実施形態において、前記検出可能部分は、診断剤である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、天然において、１又は２以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、１又は２以上のジスルフィド結合を含むよう操作され得る。
本開示はまた、本明細書に記載される多重特異的活性化可能抗体をコードする単離核酸分子、及びそれらの単離核酸配列を含むベクターを提供する。本開示は、活性化可能抗体の発現を導く条件下で、そのような核酸分子を含む細胞を培養するこによる、多重特異的抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、そのようなベクターを含む。
本開示はまた、（ａ）多重特異的活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、多重特異的活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、そして（ｂ）多重特異的活性化可能抗体を回収することによる、本開示の多重特異的活性化可能抗体の製造方法も提供する。
本開示はまた、第一標的又は第一エピトープを特異的に結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、及び第二標的又は第二エピトープを結合する、第二抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異的抗体及び／又は多重特異的活性化可能抗体組成物も提供し、ここで少なくともＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされるか、又は他方では、結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングが、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減する。いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、ＭＭＰ及びＳＰのためのＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＡＢ１にカップリングされ、ここで、ＭＭＰ及びＳＰのうちの少なくとも１つが対象における治療部位又は診断部位でＡＢ１の標的と共局在される。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常、すなわち健康組織において活性化されず、そして活性化される場合、その対応する修飾されていない多重特異的抗体に少なくとも匹敵するＡＢ１の標的への結合を示す。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＭＭ１とＣＭ１－ＣＭ２基質との間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質とＡＢ１との間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、第一連結ペプチド（ＬＰ１）及び第二連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして多重特異的活性化可能抗体の少なくとも一部が、切断されていない状態で次のようなＮ－末端からＣ－末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＡＢ１又はＡＢ１－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ１。いくつかの実施形態において、前記２つの連結ペプチドはお互い同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）n、（ＧＧＳ）n、（ＧＳＧＧＳ）n（配列番号３８１） 及び（ＧＧＧＳ）n（配列番号３８２）（ｎは少なくとも１つの整数である）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、ＧＧＳＧ（配列番号３８３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３８４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３８５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３８６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３８７）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号３８８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２の間に連結ペプチド（ＬＰ’）を含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、第一連結ペプチド（ＬＰ１）、第二連結ペプチド（ＬＰ２）、及びＣＭ１とＣＭ２の間の連結ペプチド（ＬＰ’）を含み、そして多重特異的活性化可能抗体の少なくとも一部が、未切断状態で次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ２－ＡＢ１又はＡＢ１－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＬＰ１－ＭＭ１。いくつかの実施形態において、連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧである。いくつかの実施形態において、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５０）である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、第一標的又は第一エピトープを特異的に結合する、第一抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、及び第二標的又は第二エピトープを特異的に結合する、第二抗体又はその抗体結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢは、モノクローナル抗体、ドメイン、抗体、一本鎖、Ｆaｂフラグメント、Ｆ（ａb’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ，ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、及び単一ドメインＬ鎖抗体から成る群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢは、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢは、その対応する標的又はエピトープに結合するために、約１００ｎＭ又はそれ以下の解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープへの結合のための解離定数よりも高い、その対応するＡＢへの結合のための解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープへの結合のための解離定数に過ぎない、その対応するＡＢへの結合のための解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、多重特異的活性化可能抗体が切断された状態で存在する場合、その対応する標的又はエピトープに結合するために、その対応するＡＢを阻止しないか、又はそれと競争しない。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、約２－４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して５０％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して２５％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して１０％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも２０倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも４０倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１００倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０，０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、本明細書に提供される実施例に示されるＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、その多重特異的活性化可能抗体が切断されていない状態にある場合、ＡＢ２のその標的への結合を阻害する、第二マスキング部分（ＭＭ２）、及びＣＭ１－ＣＭ２基質又は第二プロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドのいずれかである、ＡＢ２にカップリングされる追加の切断可能部分（ＣＭ’）を少なくとも含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ’は、長さが１５アミノ酸以下のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＣＭ’は、ＣＭ１－ＣＭ２基質であり、ここで、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１とＣＭ２のそれぞれは独立に、長さが１５アミノ酸以下のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、及び／又は第二プロテアーゼは、組織において第二標的又はエピトープと共局在化され、そしてＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、及び／又は第二プロテアーゼは、多重特異的活性化可能抗体がＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、及び／又は第二プロテアーゼに暴露される場合、多重特異的活性化可能抗体におけるＣＭ’を切断する。いくつかの実施形態において、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、及び／又は第二プロテアーゼは、組織において、第一標的又はエピトープ及び第二標的又はエピトープと共局在化される。いくつかの実施形態において、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、及び／又は第二プロテアーゼは、同じプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、ＭＭＰプロテアーゼ、ＳＰプロテアーゼ、及び／又は第二プロテアーゼは、同じＭＭＰプロテアーゼではなく、且つ、同じＳＰプロテアーゼではない。いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質及びＣＭ’は、同じＭＭＰプロテアーゼ及び同じＳＰプロテアーゼのための異なった基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ’を切断するプロテアーゼは、表６に示されるそれらから成る群から選択されるプロテアーゼである。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭ、例えばＭＭ１及び少なくともＭＭ２は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープに結合するための解離定数よりも高い、その対応するＡＢに結合するための解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭ、例えばＭＭ１及び少なくともＭＭ２は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープに結合するための解離定数以下である、その対応するＡＢに結合するための解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、多重特異的活性化可能抗体が切断された状態にある場合、対応する標的又はエピトープに結合するためにその対応するＡＢを妨げないか、又はそれと競争しない。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、約２－４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して２５％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して１０％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも２０倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも４０倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１００倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低減し、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０，０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭは、本明細書に開示されるＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質配列を切断するプロテアーゼは、組織において多重特異的活性化可能抗体におけるＡＢ１の標的と共局在し、そしてＭＭＰプロテアーゼ及び／又はＳＰプロテアーゼ、すなわち、ＭＭＰプロテアーゼ及びＳＰプロテアーゼのうちの少なくとも一方は、多重特異的活性化可能抗体がそのプロテアーゼに暴露される場合、多重特異的活性化可能抗体におけるＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、複数のＣＭ１－ＣＭ２基質配列を含み、そして少なくとも１つのＣＭ１－ＣＭ２基質配列を切断するＭＭＰプロテアーゼ及び／又はＳＰプロテアーゼは、組織において多重特異的活性化可能抗体におけるＡＢ領域の少なくとも１つの領域の標的と共局在され、そしてＭＭＰプロテアーゼ及び／又はＳＰプロテアーゼは、多重特異的活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、多重特異的活性化可能抗体におけるＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも２倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも３倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも４倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも５倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも１０倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも２０倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも４０倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも５０倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも１００倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの解離定数よりも少なくとも２００倍、高い解離定数を伴って生じるよう低められ、そして一方で、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
本開示はまた、標的を特異的に結合する第一抗体又はフラグメント（ＡＢ１）、及び第二抗体又はフラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異的活性化可能抗体を包含する組成物及び方法も提供し、ここで少なくとも多重特異的活性化可能抗体における第一ＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減するマスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされている。いくつかの実施形態において、各ＡＢは、その対応するＡＢの各標的を結合する能力を低減するＭＭにカップリングされる。例えば多重特異的活性化可能抗体の実施形態において、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減する第一マスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされ、そしてＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低減する第二マスキング部分（ＭＭ２）にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、２つ以上のＡＢ領域を含み；そのような実施形態において、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減する第一マスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされ、ＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低減する第二マスキング部分（ＭＭ２）にカップリングされ、ＡＢ３は、ＡＢ３のその標的を結合する能力を低減する第三マスキング部分（ＭＭ３）にカップリングされそして多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢについても同様である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＭＭＰプロテアーゼ及びＳＰプロテアーゼのための基質である少なくとも１つのＣＭ１－ＣＭ２基質をさらに含み、ここでＣＭ１－ＣＭ２基質はＭＭをＡＢに連結する。例えば、いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する第一抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）及び第二抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含み、多重特異的活性化可能抗体における少なくとも第一ＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低減するマスキング部分（ＭＭ１）に、第一ＣＭ１－ＣＭ２基質を介してカップリングされる。いくつかの多重特異的活性化可能抗体の実施形態において、ＡＢ１はＣＭ１を介してＭＭ１にカップリングされ、そしてＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低減する第二マスキング部分（ＭＭ２）に、第二ＣＭ１－ＣＭ２基質を介してカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、２以上のＡＢ領域を含み；それらの実施形態のいくつかによれば、ＡＢ１は第一ＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＭＭ１にカップリングされ、ＡＢ２は第二ＣＭ１－ＣＭ２基質を介してＭＭ２にカップリングされ、そしてＡＢ３は第三ＣＭ１－ＣＭ２基質を介して、ＡＢ３のその標的を結合する能力を低減する第三マスキング部分（ＭＭ３）にカップリングされ、そして多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢについても同様である。
非結合立体部分又は非結合立体部分のための結合パートナーを有する活性化可能抗体
本開示はまた、非結合立体部分（ＮＢ）、又は非結合立体部分のための結合パートナー（ＢＰ）を含む活性化可能抗体を提供し、ここでＢＰは、活性化可能抗体にＮＢを動員するか、又は他方では、引き付ける。本明細書に提供される活性化可能抗体は例えば、非結合立体部分（ＮＢ）、ＣＭ１－ＣＭ２基質及び標的を結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体；非結合立体部分（ＢＰ）のための結合パートナー、ＣＭ１－ＣＭ２基質及びＡＢ１を含む活性化可能抗体；及びＮＢが動員されているＢＰ、ＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的を結合するＡＢを含む活性化可能抗体を包含する。ＮＢが活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質及びＡＢに共有結合されているか、又は活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質及びＡＢに共有結合されるＢＰとの相互作用により会合される活性化可能抗体は、「ＮＢ－含有活性化可能抗体」として、本明細書において言及される。活性化可能又はスイッチング可能とは、活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた、又は切断されていない状態下にある場合、標的への結合の第一レベル（第一コンホメーション）、及び阻害されていない、マスキングされていない、及び／又は切断された状態下にある場合、標的への結合の第二レベル（すなわち、第二コンホメーション）を示し、ここで標的結合の第二レベルは、結合の第一レベルよりも大きいことを意味する。活性化可能抗体組成物は、従来の抗体療法に比べて、高められた生物学的利用能及びより良好な生体分布を示すことができる。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＡＢがマスキングされていないか、又は他方では、そのような部位への結合から阻害されていない場合、非治療部位及び／又は非診断部位の結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；及び標的に対して特異的に結合する少なくとも抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここでＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢのその標的への結合を妨害しないよう位置決定され；そしてＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。本明細書及びそれを通して使用される場合、用語、ポリペプチドとは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む任意のポリペプチド、例えばより大きなポリペプチド、完全長タンパク質及びそれらのフラグメントを意味し、そして用語、ポリペプチドとは、単鎖ポリペプチドに制限されず、そして複数ユニット、例えば多鎖ポリペプチドを包含することができる。ポリペプチドが短い長さのもの、例えば合計５０個以下のアミノ酸のものである場合、用語、ペプチド及びポリペプチドは、本明細書においては、交換可能的に使用され、そしてポリペプチドがより長いもの、例えば５０個又はそれ以上のアミノ酸のものである場合、用語、ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書においては、交換可能的に使用される。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；及び標的に対して特異的に結合する少なくとも抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（i）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドであり；（ii）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素のための基質（Ｓ）を含む、５０個までの長さのアミノ酸のポリペプチドであり；（iii）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢのその標的への結合を妨害しないよう位置決定され；そして（iv）ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列及びＣＭ２基質配列のそれぞれは、独立に、最大１５アミノ酸の長さを有する。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（i）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドであり；（ii）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（iii）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢのその標的への結合を妨害しないよう位置決定され；（iv）ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害せず；そして（ｖ）多重特異的活性化可能抗体の少なくとも一部が、切断されていない状態で、次の通りのＮ－末端からＣ－末端側に構造配置を有する：ＮＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＮＢ。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（i）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドであり；（ii）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（iii）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢの結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢのその標的への結合を妨害しないよう位置決定され；そして切断されていない活性化可能抗体におけるＮＢが、切断されたＡＢのその標的を結合する能力に比べて、ＡＢのその標的を結合する能力を、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、低め；そして（iv）ＮＢは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。ＡＢのその標的を結合する能力の低下は、例えば、本明細書に記載されるようなアッセイ、又はインビトロ標的置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、決定される。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢＰ）；ＣＭ１－ＣＭ２基質；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここでＢＰは、ＮＢに暴露される場合、そのＮＢに結合するポリペプチドであり；ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＮＢの存在下で、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢ１の結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢ１のその標的への結合を妨害せず、そしてＢＰがＡＢの標的への結合を妨害しないよう位置決定され；そしてＮＢ及びＢＰは、酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない。この実施形態のいくつかの例によれば、活性化可能抗体のＢＰは、任意には、ＮＢに結合される。１つの実施形態において、ＮＢは、インビボで、活性化可能抗体のＢＰにより動員される。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、組成物として製剤化される。それらの実施形態のいくつかによれば、組成物はまた、ＮＢも含み、ここでＮＢは、ＢＰ、ＣＭ１－ＣＭ２基質及びＡＢを含む活性化可能抗体と同時製剤化される。この実施形態のいくつかの例によれば、ＢＰは、アルブミン結合ペプチド、フィブリノーゲン結合ペプチド、フィブロネクチン結合ペプチド、ヘモグロビン結合ペプチド、トランスフェリン結合ペプチド、免疫グロブリンドメイン結合ペプチド及び他の血清タンパク質結合ペプチドから成る群から選択される。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは可溶性球状タンパク質である。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは血流において循環するタンパク質である。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘモグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリンドメイン及び他の血清タンパク質から成る群から選択される。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、プロテマーゼのための基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、プロテアーゼは、組織において、その標的と共局在され、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、活性化可能抗体におけるＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、５０個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、１５個までの長さのアミノ酸、例えば３個の長さのアミノ酸、４個の長さのアミノ酸、５個の長さのアミノ酸、６個の長さのアミノ酸、７個の長さのアミノ酸、８個の長さのアミノ酸、９個の長さのアミノ酸、１０個の長さのアミノ酸、１１個の長さのアミノ酸、１２個の長さのアミノ酸、１３個の長さのアミノ酸、１４個の長さのアミノ酸、又は１５個の長さのアミノ酸を有する基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、切断されていない状態で次の通りのＮ－末端からＣ－末端側に構造配置を有する：ＮＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＮＢ、ＢＰ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＢＰ。活性化可能抗体がＢＰを含み、そして活性化可能抗体がその対応するＮＢの存在下にある実施形態において、活性化可能抗体は、切断されていない状態で次の通りのＮ－末端からＣ－末端側に構造配置を有する：ＮＢ：ＢＰ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ、ＮＢ：ＢＰ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ、ＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＢＰ：ＮＢ又はＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＢＰ：ＮＢ、ここで「：」は、ＮＢとＢＰとの間の相互作用、例えば結合を表す。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、所定の標的を特異的に結合し、そしてモノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一のドメインＨ鎖抗体、及び単一のドメインＬ鎖抗体である、抗体又はその抗原結合抗体を包含する。いくつかの実施形態において、その標的を結合する、そのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、他のげっ歯類動物、キメラ、ヒト化、又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖領域及び本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖領域の組合せを含む。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、本明細書に提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖領域及び本明細書に提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖領域の組合せを含む。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施形態において、剤は治療剤である。いくつかの実施形態において、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態において、剤は毒素又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、剤は、非切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、表３に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態において、剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、剤は、核酸損傷剤、例えばＤＮＡアルキル化剤又はインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤は、メイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピン二量体である。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施形態において、検出可能部分は、診断剤である。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、スペーサーも含む。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接、結合される。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する抗体の半減期よりも長く；例えば、活性化可能抗体のｐＫは、その対応する抗体のｐＫよりも長い。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する多抗体の半減期に類似する。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
本開示はまた、それらの活性化可能抗体の何れかをコードする単離された核酸分子、及びそれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、活性化可能抗体の発現を導く条件下で、そのような核酸配列を含む細胞を培養することによる、活性化可能抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、そのようなベクターを含む。
標的に対するＮＢ－含有活性化可能抗体の解離例数（Ｋｄ）は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰと関連しない場合、標的に対するＡＢのＫｄよりも高い。標的に対するＮＢ－含有活性化可能抗体の解離定数は、標的に対する親ＡＢのＫｄよりも高い。例えば、標的に対するＮＢ－含有活性化可能抗体のＫｄは、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢのＫｄ、又は標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又はそれ以上,又は ５－１０、１０－１００、１０－１，０００、１０－１０，０００、１０－１００，０００、１０－１，０００，０００、１０－１０，０００，０００、１００－１，０００、１００－１０，０００、１００－１００，０００、１００－１，０００，０００、１００－１０，０００，０００、１，０００－１０，０００、１，０００－１００，０００、１，０００－１，０００，０００、１０００－１０，０００，０００、１０，０００－１００，０００、１０，０００－１，０００，０００、１０，０００－１０，０００，０００、１００，０００－１，０００，０００又は１００，０００－１０，０００，０００倍、高い。逆に、標的に対するＮＢ－含有活性化可能抗体の結合親和性は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰと関連しない場合、ＡＢの結合親和性よりも低く、又は標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも低い。例えば、標的に対するＮＢ－含有活性化可能抗体の結合親和性は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢの結合親和性、又は標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも１０、２０、２５、４０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又はそれ以上,又は ５－１０、１０－１００、１０－１，０００、１０－１０，０００、１０－１００，０００、１０－１，０００，０００、１０－１０，０００，０００、１００－１，０００、１００－１０，０００、１００－１００，０００、１００－１，０００，０００、１００－１０，０００，０００、１，０００－１０，０００、１，０００－１００，０００、１，０００－１，０００，０００、１０００－１０，０００，０００、１０，０００－１００，０００、１０，０００－１，０００，０００、１０，０００－１０，０００，０００、１００，０００－１，０００，０００又は１００，０００－１０，０００，０００倍、低い。
ＮＢ－含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢの特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ－含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、親ＡＢのその標的への特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しないＡＢの結合、又は親ＡＢのその標的への結合に比較される場合、その標的を結合するＮＢ－含有活性化可能抗体の能力は、例えばインビトロ及び／又はインビボで測定される場合、その標的を結合するＮＢ－含有活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４又は ９６ 時間、又は ５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０又は１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに １００％、低められ得る。
ＮＢ－含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼ又は他の酵素）の存在下ではない場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢの特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ－含有活性化可能抗体が、その標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼ、他の酵素、還元剤又は光）の存在下ではない場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、親ＡＢのその標的への特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しないＡＢの結合、又は親ＡＢのその標的への結合に比較される場合、その標的を結合するＮＢ－含有活性化可能抗体の能力は、例えばインビトロ及び／又はインビボで測定される場合、その標的を結合するＮＢ－含有活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４又は ９６ 時間、又は ５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０又は１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに １００％、低められ得る。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体結合体を生成するために、ＡＢに結合される剤も含む。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、剤は治療剤である。いくつかの実施形態において、剤は診断剤である。いくつかの実施形態において、剤は検出可能マーカーである。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、剤は抗腫瘍剤である。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、剤は毒素又はそのフラグメントである。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、剤は、非切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、剤は、核酸損傷剤、例えばＤＮＡアルキル化剤又はインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態において、剤は、表３に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤は、メイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピン二量体である。
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、二重－標的結合活性化可能抗体である。そのような二重標的結合活性化可能抗体は、同じが又は異なった標的結合できる２個のＡｂを含む。特定の実施形態において、二重－標的化活性化可能抗体は、二重特特異的抗体又はそのフラグメントを含む。
二重標的結合活性化可能抗体は、活性化可能抗体のＡＢに結合できる１つ又は両標的と共に標的組織において共局在される切断剤により切断できるＣＭ１－ＣＭ２基質を有するよう企画される。同じが又は異なった標的に対する複数のＡＢを有する二重標的結合活性化可能抗体は、複数のＣＭ１－ＣＭ２基質を有するよう企画され得、ここで第一ＣＭ１－ＣＭ２基質は第一標的組織において切断剤により切断でき、そして第二ＣＭ１－ＣＭ２基質は、第二標的組織において切断剤により切断でき、そして１又は２以上の標的が活性化可能抗体のＡＢに結合する。１つの実施形態において、第一及び第二標的組織は、例えば、生物における異なった部位で、空間的に分離されている。１つの実施形態において、第一及び第二標的組織は、一時的に分離された同じ組織であり、例えば２種の異なった時点で同じ組織であり、例えば第一時点は、組織が初期段階の腫瘍である場合であり、そして第二時点は、組織が後期段階の腫瘍である場合である。
本開示はまた、本明細書に記載される活性化可能抗体をコードする核酸分子を提供する。本開示はまた、それらの核酸を含むベクターも提供する。本明細書に記載される活性化可能抗体は、活性化可能抗体の発現を導く条件下で、それらの核酸分子又はベクターを含む細胞を培養することにより生成され得る。
本開示はまた、活性化可能抗体の製造方法も提供する。１つの実施形態において、前記方法は、（ａ）活性化可能抗体の発現を導く条件下で、活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を培養し、ここで活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）；（ii）ＣＭ１－ＣＭ２基質；及び（iii）標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（３）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、切断されていない状態で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害しないよう、位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収する段階を包含する。
別の実施形態において、前記方法は、（ａ）活性化可能抗体の発現を導く条件下で、活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を培養し、ここで活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢＰ）；（ii）ＣＭ１－ＣＭ２基質；及び（iii）標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（３）ＣＭ１－ＣＭ２基質は、切断されていない状態で、及びＮＢの存在下で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害せず、そしてＢＰがＡＢの標的への結合を妨害しないよう、位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＣＭ１－ＣＭ２基質の切断を阻害しない；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収する段階を包含する。この実施形態のいくつかの例によれば、活性化可能抗体のＢＰは、ＮＢに結合される。
活性化可能抗体及び結合された活性化可能抗体の使用
本開示に従っての治療実態の投与が、改善された伝達、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されるであろうことは理解されるであろう。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に知られている処方に見出され得る：Blaug, Seymour による、Remington’s Pharmaceutical Sciences（15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA（1975））, 特に 、Chapter 87。それらの製剤は例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン又はアニオン性）含有小胞（例えば、リポフェクチン（登録商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸収性ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及び半固体混合物含有カーボワックスを包含する。前述の混合物の何れでも、本開示に従っての治療及び療法において適切であるが、但し、製剤中の活性成分は、製剤により不活性化されず、そして製剤は投与経路と生理学的に適合し、且つ許容できるべきである。また、薬剤師に良く知られている、製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報については、またBaldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32（2）:210-8（2000）, Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203（1-2）:1-60（2000）, Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89（8）:967-78（2000）, Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311（1998）及びそこにおける引用文献を参照のこと。
結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を含む、本開示の治療製剤は、異常標的発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を予防し、治療し又は他方では、改善するために使用される。例えば、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を含む、本開示の治療製剤は、炎症、炎症性障害、自己免疫疾患及び／又は癌又は他の腫瘍状態を治療するか、又は他方では、改善するために使用される。いくつかの実施形態において、癌は、標的が発現される、固形腫瘍又は造血器悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、癌は、標的が発現される固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、癌は、標的が発現される造血器悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、標的は、実質組織（例えば癌における、器官又は組織の機能を、しばしば担持する、器官又は組織の部分）上で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、細胞、組織又は器官上で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、間質（すなわち、細胞、組織又は器官の結合支持骨格）上で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、骨芽細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、内皮（血管系）上で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、癌幹細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が結合されている剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体が結合されている剤は、核酸損傷剤である。
予防、改善又は治療の有効性は、標的発現及び／又は活性、例えば異常標的発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を診断するか又は治療するための任意の既知方法に関連して決定される。対象の生存性の延長、又は他方では、対象における標的発現及び／又は活性、例えば異常標的発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害の進行の遅延は、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体が臨床的有益性を付与することを示唆する。
結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、医薬組成物の形で結合され得る。そのような組成物の調製に関与する原理及び考慮事項、及び成分の選択の指針は例えば、次の文献に提供される：Remington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.（Alfonso R. Gennaro, et al, editors） Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995；Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；及びPeptide And Protein Drug Delivery（Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4）, 1991, M. Dekker, New York。
抗体フラグメントが使用されるいくつかの実施形態において、標的タンパク質の結合ドメインに対して特異的に結合する最も小さなフラグメントが選択される。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子が企画され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成され得、そして／又は組換えＤＮＡ技法により生成され得る。（例えば、Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893（1993）を参照のこと）。製剤はまた、治療される特定の徴候のために必要な複数の活性化合物、例えば、いくつかの実施形態において、お互い悪影響を与えない相補的活性を有するそれらの化合物も含むことができる。いくつかの実施形態において、又はさらに、組成物は、その機能を増強する剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤を含むことができる。そのような分子は適切には、意図される目的のために効果的である量で、組合して存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技法により、又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマイクロエマルジョン中、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入され得る。
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通しての濾過により、容易に達成される。
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、ここで前記マトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸及びγエチル－Ｌ－グルタノートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－クリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能マイクロスフェア）、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を包含する。ポリマー、例えばエチレン－酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸は１００日間にわたって分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。
いくつかの実施形態において、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。損なわれていない抗体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ）２）が使用される。プローブ又は抗体に関しての用語「標識された」とは、プローブ又は抗体に検出可能物質をカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブ又は抗体の直接的標識化、及び直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識化を包含することが意図される。関接的標識化の例は、蛍光標識された二次抗体を用いての一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプトアビジンにより検出され得るよう、ビオチンによるＤＮＡ抗体の末端標識化を包含する。用語「生物学的サンプル」とは、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体を包含することが意図される。従って、血液、及び血液の画分又は成分、例えば血清、血漿又はリンパは、用語「生物学的サンプル」の使用法内に含まれる。すなわち、本開示の検出方法は、インビトロで及びインビボで生物学的サンプルにおける分析ｍＲＮＡ、タンパク質又はゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、分析ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技法は、ノザンハイブリダイゼーション及びインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。分析タンパク質の検出のためのインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスターンプロット、免疫沈降、免疫化学染色及び免疫蛍光を包含する。分析ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技法は、サザンハイブリダイゼーションを包含する。イムノアッセイを行うための手順は、例えば“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther（Ed.） Human Press, Totowa, NJ, 1995；“Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996;及び“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載される。さらに、分析タンパク質の検出のためのインビボ技法は、標識された抗－分析タンパク質抗体を、対象中に導入することを包含する。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び位置が標準のイメージング技法により検出され得る放射性マーカーにより標識され得る。
本開示の結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体はまた、種々の診断及び予防製剤において有用である。１つの実施形態において、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体が、１又は２以上の前述の障害を発症する危険性がある患者に投与される。１又は２以上の障害に対する患者又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的または生化学マーカーを用いて決定され得る。
いくつかの実施形態において、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、１又は２以上の前述の障害に関連する臨床学的徴候を有するものとして診断されたヒト個人に投与される。診断に基づいて、結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、臨床学的徴候の効果を軽減するか、又は逆転するために結合される。
結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体はまた、患者サンプルにおける１又は２以上の標的の検出に有用であり、そして従って、診断剤としても有用である。例えば、前記抗体及び／又は活性化可能抗体、及びその結合されたバージョンは、患者サンプルにおける１又は２以上の標的レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに使用される。
１つの実施形態において、本開示の結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、試験サンプルに存在することができる任意の標的のための捕捉抗体として作用する。固定された抗体と患者サンプルとの接触の前、固体支持体は、分析物の非特異的吸着を妨げるために、ブロッキング剤、例えば乳タンパク質により洗浄され、そして処理される。
続いて、ウェルが、抗原を含む疑いのある試験サンプルにより、又は標準量の抗原を含む溶液により処理される。そのようなサンプルは、例えば病理診断であると思われる循環抗原のレベルを有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準を洗い流した後、固体支持体が、検出的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中の標的抗原の濃度が、標準サンプルから開発される標準曲線との比較により決定される。
インビトロ診断アッセイにおいて本開示の抗体及びその結合されたバージョンを用いて得られる結果に基づいて、標的抗原の発現レベルに基づいて患者における疾患を分類することが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関して、血液サンプルが、疾患の進行での種々の段階で、及び／又は、疾患の治療処理における種々の点で、診断される対象から採取される。進行又は治療の各段階のために統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階で特徴的であると思われる抗原の濃度範囲が指定される。
結合された抗体、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体はまた、診断及び／又はイメージング方法に使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような方法は、インビトロ方法である。いくつかの実施形態において、そのような方法は、インビボ方法である。いくつかの実施形態において、そのような方法は、インサイチュ方法である。いくつかの実施形態において、そのような方法は、エクスビボ方法である。例えば、酵素的に切断可能なＣＭ１－ＣＭ２基質を有する活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる酵素の存在又は不在を検出するために使用され得る。そのような活性化可能抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞又は組織における活性化された抗体（すなわち、活性化可能抗体の切断に起因する抗体）の測定される蓄積を通して、酵素活性（又は、いくつかの実施形態において、高められた還元電位の環境、例えばジスルフィド結合の還元を提供できる環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を包含する診断に使用される。活性化された抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭ１－ＣＭ２基質の性質に依存して、高められた還元電位）を発現するのみならず、また組織が、活性化された抗体が結合する少なくとも１つの標的を発現することを示唆する。
例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、腫瘍の部位で、ウィルス又は細菌感染の部位で、生物学的に限られた部位（例えば、膿瘍、器官等において）で、及び同様の部位で見出されるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質であるよう選択され得る。ＡＢは、標的抗原を結合するものである。本明細書に開示されるような方法を用いて、又は適切な場合、当業者に知られている方法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）が、抗体及び／又は活性化可能抗体のＡＢ又は他の領域に結合され得る。適切な検出可能標識は、上記スクリーニング方法に論じられており、そして追加の特定の例が下記に提供される。その活性が目的の疾患組織において高められているＭＭＰと共に、疾患状態のタンパク質又はペプチドに対して特異的なＡＢを用いて、活性化可能抗体は、組織への疾患組織の高められた相対的結合速度を示し、ここでＣＭ１－ＣＭ２基質特異的抗体は、検出レベルで存在しないか、又は疾患組織においてよりも低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、チモーゲン形で、又は阻害剤との複合体形で）。小タンパク質及びペプチドは腎濾過システムにより血液から急速にクリアランスされるので、ＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的な酵素は検出レベルで存在しない（又は非疾患組織においては低レベルで存在するか、又は不活性コンホメーションで存在する）ので、疾患組織における活性化された活性化可能抗体の蓄積が、非疾患組織と比較して増強される。
別の例によれば、活性化可能抗体は、サンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するために使用され得る。例えば、活性化可能抗体が酵素による切断に対して感受性のＣＭ１－ＣＭ２基質を含む場合、活性化可能抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出するために（定性的に又は定量的に）、使用され得る。それらの方法での分析を促進するために、活性化可能抗体が、検出可能に標識され得、そして支持体（例えば、固体支持体、例えばスライド又はビーズ）に結合され得る。検出可能標識は、切断に続いて放出されない活性化可能抗体の一部を位置決定し、例えば検出可能標識は、消光蛍光標識、又は切断が生じるまで、検出できない他の標識であり得る。アッセイは例えば、固定された、検出可能的に標識された活性化可能抗体と、酵素及び／又は還元剤を含むことが疑われるサンプルとを、切断が生じるのに十分な時間、接触し、次に、過剰のサンプル及び汚染物を除去するために洗浄することにより実施され得る。次に、サンプルにおける切断（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は不在が、サンプルとの接触の前、活性化可能抗体の検出可能シグナルの変化、例えばサンプルにおける切断剤による活性化可能抗体の切断のために検出可能シグナルの存在及び／又は上昇により評価される。
そのような検出方法は、切断される場合、活性化可能抗体の少なくとも１つのＡＢを結合できる標的の存在又は不在の検出を提供するよう適合され得る。従って、アッセイは、切断剤の存在又は不在、及び目的の標的の存在又は不在を評価するよう適合され得る。接断剤の存在又は不在は、上記のような活性化可能抗体の検出可能レベルの存在及び／又は不在により検出され得、そして標的の存在又は不在は、標的－ＡＢ複合体の検出により、例えば検出可能に標識された抗－標的抗体の使用により検出され得る。
活性化可能抗体はまた、例えばプロテアーゼ切断による活性化可能抗体の活性化の検証のためにインサイチュイメージング、及び特定の標的への結合においても有用である。インサイチュイメージングは、生物学的サンプル、例えば細胞培養物又は組織切片におけるタンパク質分解活性及び標的の局在化を可能にする技法である。この技法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づいて、所定の標的への結合及びタンパク質分解活性の両者を認識することが可能である。
それらの技法は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健康組織に由来する何れかの凍結された細胞又は組織において有用である。それらの技法はまた、新鮮な細胞又は組織サンプルにおいても有用である。
それらの技法によれば、検出可能抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能標識は、蛍光色素（例えば、蛍光団、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Alexa Fluor（登録商標））、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Qdot（登録商標）ナノクリスタル）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン、及び増幅試薬、例えばストレプトアビジン、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ）であり得る。
標識された活性化可能抗体と共にインキュベートされたサンプルにおける標識の検出は、サンプルが標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）を含むことを示唆する。いくつかの実施形態において、ＭＭＰの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを用いて、及び／又はプロテアーゼに対して特異的である剤、例えばプロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）に対して特異的であり、そしてマトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害する、抗体、例えばＡ１１を用いて、確認され得る；例えば、２０１０年１１月に公開された国際公開第２０１０／１２９６０９号を参照のこと。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを使用することの、及び／又はより選択的阻害剤を用いることによる同じアプローチが、プロテアーゼ、又は活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的なＭＭＰ及びＳＰを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的の存在は、標的、例えば別の抗体に対して特異的である剤を用いて確かめられ得るか、又は検出可能標識が標識されていない標的と競争され得る。いくつかの実施形態において、標識されていない活性化可能抗体が、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出と共に使用され得る。
類似する技法がまた、インビボイメージングのためにも有用であり、ここで対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおける蛍光シグナルの検出は、疾患部位が標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的であるＭＭＰを含むことを示唆する。
それらの技法はまた、活性化可能抗体におけるプロテアーゼ特異的ＣＭ１－ＣＭ２基質に基づいて、種々の細胞、組織及び生物におけるプロテアーゼ活性の検出、同定又は特徴づけのために、キットに、及び／又は試薬としても有用である。
本開示は、種々の診断的及び／又は予防的適用のためへの抗体及び／又は活性化可能抗体の使用方法を提供する。例えば、本開示は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで活性化可能抗体は、未切断、非活性化状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの変性形ではなく；そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は非存在を検出するための方法を提供し、ここで対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルが、切断剤及び標的が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出レベルの不在は、切断剤、標的又は切断剤及び標的の両者が対象又はサンプルに存在せず、そして／又は十分には存在しないことを示唆する。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化できる活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態において、対象又はサンプル中の活性化できる活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された活性化可能抗体に対して特異的に結合する、検出可能標識を含む二次試薬を用いて達成される。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出できる標識を含む抗体である。
本開示は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを、目的の標的、例えば前記標的の存在下で、接触し、ここで活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで活性化可能抗体は、未切断、非活性化状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの変性形ではなく；そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は非存在を検出するための方法を提供し、ここで対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルが、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出レベルの不在は、切断剤が対象又はサンプルに存在せず、そして／又は十分には存在しないことを示唆する。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化できる活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態において、対象又はサンプル中の活性化できる活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された活性化可能抗体に対して特異的に結合する、検出可能標識を含む二次試薬を用いて達成される。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出できる標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び標的の存在又は非存在の検出方法への使用のためのキットを提供し、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを接触し；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び標的の存在又は非存在を検出するためのキットを提供し、ここで前記キットは、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体を、少なくとも含み、ここで活性化可能抗体は、未切断、非活性化状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの変性形ではなく；そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争せず、ここで対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルが、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出レベルの不在は、切断剤が対象又はサンプルに存在せず、そして／又は十分には存在しないことを示唆する。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化できる活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態において、対象又はサンプル中の活性化できる活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された活性化可能抗体に対して特異的に結合する、検出可能標識を含む二次試薬を用いて達成される。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出できる標識を含む抗体である。
本開示は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的及び検出可能標識を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで活性化可能抗体は、未切断、非活性化状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの変性形ではなく；そして未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合を妨害し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争せず；そして検出可能標識が、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分上に位置し；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は非存在を検出するための方法を提供し、ここで対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルが、切断剤及び標的が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出レベルの不在は、切断剤が対象又はサンプルに存在しないことを示唆する。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化できる活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態において、対象又はサンプル中の活性化できる活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された活性化可能抗体に対して特異的に結合する、検出可能標識を含む二次試薬を用いて達成される。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出できる標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び標的の存在又は非存在の検出方法への使用のためのキットを提供し、ここで、前記キットは、対象又は生物学的サンプルとの接触への使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体（例えば、治療剤が結合されている活性化可能抗体）、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルが、切断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出レベルの不在は、切断剤、標的又は切断剤及び標的の両者が対象又は生物学的サンプルに存在せず、そして／又は十分には存在せず、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルにおいて検出され得ないことを示唆する。
本開示は、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを、標的の存在下で接触し、そして（ｉｉ）対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は非存在を検出するための方法を提供し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける検出可能標識の検出レベルの不在は、切断剤が対象又は生物学的サンプルに検出できるレベルで存在せず、結果的に、活性化可能抗体のプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルに検出され得ないことを示唆する。そのような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで活性化可能抗体は、未切断（すなわち、非活性化）状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、そして、ここで切断（すなわち、活性化）状態で、活性化可能抗体のＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、マスキング部分に結合される。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、プロテアーゼ切断部位のＮ－末端側の切断可能部分に結合される。いくつかの実施形態において、ＡＢの単一の抗原結合部位がマスキングされる。本開示の抗体が少なくとも２つの抗原結合部位を有するいくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされ、そして少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされていない。いくつかの実施形態において、すべての抗原結合部位がマスキングされている。いくつかの実施形態において、測定段階は検出できる標識を含む二次試薬の使用を包含する。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び標的の存在又は非存在の検出方法への使用のためのキットを提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを、標的の存在下で接触し、そして対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体レベルを測定することへの使用のために、本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を少なくとも含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける検出可能標識の検出レベルの不在は、切断剤が対象又は生物学的サンプルに検出できるレベルで存在せず、結果的に、活性化可能抗体のプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルに検出され得ないことを示唆する。そのような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで活性化可能抗体は、未切断（すなわち、非活性化）状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、そして、ここで、切断（すなわち、活性化）状態で、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、マスキング部分に結合される。いくつかの実施形態において、検出できる標識は、プロテアーゼ切断部位のＮ－末端側の切断可能部分に結合される。いくつかの実施形態において、ＡＢの単一の抗原結合部位がマスキングされる。本開示の抗体が少なくとも２つの抗原結合部位を有するいくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされ、そして少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされていない。いくつかの実施形態において、すべての抗原結合部位がマスキングされている。いくつかの実施形態において、測定段階は検出できる標識を含む二次試薬の使用を包含する。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は非存在の検出方法への使用のためのキットを提供し、ここで、前記キットは、対象又は生物学的サンプルとの接触への使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、ここで活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分上に位置する検出可能標識を含み、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出できるレベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在せず、そして／又は十分に存在せず、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルに検出され得ないことを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出レベルの不在が、切断剤が検出できるレベルで、対象又は生物学的サンプルに存在しないことを示唆する。
本開示は、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分上に位置する検出可能標識を含み、そして（ｉｉ）対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び標的の存在又は非存在を検出する方法を提供し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤、標的、又は切断剤及び標的の両者が対象又は生物学的サンプルに存在せず、及び／又は十分には存在せず、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルに検出され得ないことを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の低められた検出可能レベルが、接断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは、例えば約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％及び／又は約１００％の低減率である。そのような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで活性化可能抗体は、未切断（すなわち、非活性化）状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、そして、ここで、切断（すなわち、活性化）状態で、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合されている活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び標的の存在又は非存在の検出方法への使用のためのキットを提供し、ここで、前記キットは、対象又は生物学的サンプルとの接触への使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤、標的、又は切断剤及び標的の両者が対象又は生物学的サンプルに存在せず、及び／又は十分には存在せず、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルに検出され得ないことを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の低められた検出可能レベルが、接断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは、例えば約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％及び／又は 約 １００％の低減率である。
本開示は、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分上に位置する検出可能標識を含み、そして（ｉｉ）対象又は生物学的サンプルにおける検出可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は非存在を検出する方法を提供し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける検出可能抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在せず、及び／又は十分には存在せず、結果的に、活性化可能抗体のプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルに検出され得ないことを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける検出可能抗体の低められた検出可能レベルが、接断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは、例えば約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％及び／又は 約１００％の低減率である。そのような活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質、及び標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで活性化可能抗体は、未切断（すなわち、非活性化）状態で、次のような、Ｎ－末端からＣ－末端への構造配置を有し；ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２基質－ＭＭ；ここで、（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭは、ＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、そして、ここで、切断（すなわち、活性化）状態で、活性化可能抗体のＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を妨害せず、又はそれと競争しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合されている活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける目的の切断の存在又は非存在の検出方法への使用のためのキットを提供し、ここで、前記キットは、対象又は生物学的サンプルとの接触への使用のための、本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体及び/又は結合された活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を少なくとも含み、ここで活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質の切断に続いて放出される活性化可能抗体の部分上に位置する検出可能標識を含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける検出可能抗体の検出可能レベルは、切断剤、標的、又は切断剤及び標的の両者が対象又は生物学的サンプルに存在せず、及び／又は十分には存在せず、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプルに検出され得ないことを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の低められた検出可能レベルが、接断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは、例えば約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％及び/又は 約 １００％の低減率である。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化できる活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、検出できる標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ－ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ＭＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔダイマー２（ＲＦＰ ｔダイマー２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。それらの方法のいくつかの実施形態において、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識, 例えばAlex Fluor（登録商標）680又はAlexa Fluor（登録商標）750を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は１又は２以上のハプテンを含む。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、対象は哺乳類である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、農業用動物、作業用動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態において、対象は齧歯動物である。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は愛玩動物である。いくつかの実施形態において、対象は、獣医師のケア動物である。
それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インサイチュ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、エキソビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロ方法である。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する患者を同定する方法において有用である。例えば、インサイチュイメージングにおいては、活性化可能抗体が、適切な位置で、例えば腫瘍部位で、適切なプロテアーゼ及び標的を有するそれらの患者を同定するために患者サンプルをスクリーンするために使用される。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、及び試験される活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者（例えば、疾患部位で、活性化された抗体を蓄積する）は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、それらの方法を用いて試験される、標的、及び活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの両者について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。いくつかの実施形態において、第一活性化可能抗体に関して陰性であるそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭ１－ＣＭ２基質を含む他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、次に、患者は、陽性である患者のための治療的有効量の結合された活性化可能抗体が投与される。
いくつかの実施形態において、インビボイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、及び試験される活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者（例えば、疾患部位で、活性化された抗体を蓄積する）は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。いくつかの実施形態において、第一活性化可能抗体に関して陰性であるそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭ１－ＣＭ２基質を含む他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、次に、患者は、陽性である患者のための治療的有効量の結合された活性化可能抗体が投与される。
方法及びキットのいくつかの実施形態において、前記方法又はキットは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、及びそれらの方法により試験される活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、それらの方法を用いて試験される、標的、及び活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの両者について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。いくつかの実施形態において、そのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が同定されるまで、他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、標的の何れかについて陰性である患者は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含むそのような活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。いくつかの実施形態において、標的の何れかについて陰性である患者は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補体ではない。いくつかの実施形態において、そのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が同定されるまで、他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合されている活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプル中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
いくつかの実施形態において、方法又はキットは、本開示の抗－標的活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体（例えば、治療剤が結合されている活性化可能抗体）による治療、続いて、前記活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を、その必要な対象に投与することによる治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、絞り込むために使用される。例えば、標的、及びそれらの方法により試験される活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む、そのような抗体及び／又はそのような結合された活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定され、そして次に、治療的有効量の試験された活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体を投与される。同様に、それらの方法を用いて試験される、標的、及び活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。いくつかの実施形態において、そのような患者は、治療のための適切な抗体及び／又は結合された活性化可能抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体）が固定されるまで、他の抗体及び／又は結合された活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、次に、患者は、患者が陽性であると試験された、治療的有効量の活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体が投与される。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＭＭは、約４－４０個の長さのアミノ酸を有するペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、リンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドはＭＭとＣＭ１－ＣＭ２基質との間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体はリンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＡＢとＣＭ１－ＣＭ２基質との間に位置する、それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、第一リンカーペプチド（Ｌ１）及び第二リンカーペプチド（Ｌ２）を含み、ここで前記第一リンカーペプチドはＭＭとＣＭ１－ＣＭ２基質の間に位置し、そして第二リンカーペプチドは、ＡＢとＣＭ１－ＣＭ２基質との間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の個々は、約１－２０個の長さのアミノ酸のペプチドであり、そしてＬ１及びＬ２の個々は同じリンカーである必要はない。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の１つ又は両者は、グリシン－セリンポリマーを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８１） 及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８２）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含み、ここでｎは少なくとも１つの整数である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、式（ＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１つの整数である）を有するアミノ酸配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、Gly-Gly-Ser-Gly（配列番号３８３）、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly（配列番号３８４）、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly（配列番号３８５）、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号３８６）、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly（配列番号３８７）及びGly-Ser-Ser-Ser-Gly（配列番号３８８）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＡＢは、本明細書に提供される交差反応性抗体配列が選択される抗体又は抗体フラグメント配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＡＢは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ又は一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）を含む。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、切断剤は、標的と共に、対象又はサンプルにおいて共局在化されるプロテアーゼであり、そしてＣＭ１－ＣＭ２基質は、プロテアーゼのための基質として機能するペプチドであり、ここで、プロテアーゼは、活性化可能抗体がそのプロテアーゼに暴露される場合、活性化可能抗体におけるＣＭ１－ＣＭ２基質を切断する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭは、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列及びＣＭ２基質配列のそれぞれは、独立に、長さが最長１５アミノ酸のポリペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＡＢのＮ－末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＡＢのＣ－末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、ＡＢのＶＬ鎖のＮ―末端にカップリングされる。
本開示の活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、診断用及び予防用製剤に使用される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、１又は２以上の前述の炎症、炎症性障害、癌又は他の障害の発症の危険性である患者に投与される。
１又は２以上の前述の障害に対する患者の又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的又は生物学的マーカーを用いて決定され得る。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、１又は２以上の前述の障害に関連する臨床学的徴候を有するとして診断されたヒト個体に投与される。診断に基づいて、活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、臨床学的徴候の効果を軽減するか又は逆戻りさせるために投与される。
本開示の活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体はまた、患者サンプルにおける標的の検出においても有用であり、そして従って、診断剤として有用である。例えば、本開示の活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体は、患者サンプルにおける標的レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにおいて使用される。
１つの実施形態において、本開示の活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された活性化可能抗体は、試験サンプルに存在することができる任意の標的のための捕捉抗体として作用する。固定された抗体と患者サンプルとの接触の前、固体支持体は、分析物の非特異的吸着を妨げるために、ブロッキング剤、例えば乳タンパク質により洗浄され、そして処理される。
続いて、ウェルが、抗原を含む疑いのある試験サンプルにより、又は標準量の抗原を含む溶液により処理される。そのようなサンプルは、例えば病理診断であると思われる循環抗原のレベルを有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準を洗い流した後、固体支持体が、検出的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中の標的抗原の濃度が、標準サンプルから開発される標準曲線との比較により決定される。
インビトロ診断アッセイにおいて本開示の抗体を用いて得られる結果に基づいて、標的抗原の発現レベルに基づいて患者における疾患を分類することが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関して、血液サンプルが、疾患の進行での種々の段階で、及び／又は、疾患の治療処理における種々の点で、診断される対象から採取される。進行又は治療の各段階のために統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階で特徴的であると思われる抗原の濃度範囲が指定される。
活性化可能抗体及び／又は結合された活性化可能抗体はまた、診断及び／又はイメージング方法に使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような方法は、インビトロ方法である。いくつかの実施形態において、そのような方法は、インビボ方法である。いくつかの実施形態において、そのような方法は、インサイチュ方法である。いくつかの実施形態において、そのような方法は、エクスビボ方法である。例えば、酵素的に切断可能なＣＭ１－ＣＭ２基質を有する活性化可能抗体は、ＣＭ１－ＣＭ２基質を切断できる酵素の存在又は不在を検出するために使用され得る。そのような性化可能抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞又は組織における活性化された抗体（すなわち、活性化可能抗体の切断に起因する抗体）の測定される蓄積を通して、酵素活性（又は、いくつかの実施形態において、高められた還元電位の環境、例えばジスルフィド結合の還元を提供できる環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を包含する診断に使用される。活性化された抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭ１－ＣＭ２基質の性質に依存して、高められた還元電位）を発現するのみならず、また組織が、活性化された抗体が結合する少なくとも１つの標的を発現することを示唆する。
例えば、ＣＭ１－ＣＭ２基質は、腫瘍の部位で、ウィルス又は細菌感染の部位で、生物学的に限られた部位（例えば、膿瘍、器官等において）で、及び同様の部位で見出されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ基質であるよう選択され得る。ＡＢの少なくとも１つは、標的抗原を結合するものである。当業者に知られている方法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）が、活性化可能抗体のＡＢ又は他の領域に結合され得る。適切な検出可能標識は、上記スクリーニング方法に論じられており、そして追加の特定の例が下記に提供される。その活性が目的の疾患組織において高められているプロテアーゼと共に、疾患状態のタンパク質又はペプチドに対して特異的なＡＢを用いて、活性化可能抗体は、組織への疾患組織の高められた相対的結合速度を示し、ここでＣＭ１－ＣＭ２基質特異的抗体は、検出レベルで存在しないか、又は疾患組織においてよりも低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、チモーゲン形で、又は阻害剤との複合体形で）。小タンパク質及びペプチドは腎濾過システムにより血液から急速にクリアランスされるので、ＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的な酵素は検出レベルで存在しない（又は非疾患組織においては低レベルで存在するか、又は不活性コンホメーションで存在する）ので、疾患組織における活性化された活性化された抗体の蓄積が、非疾患組織と比較して増強される。
別の例によれば、活性化可能抗体は、サンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するために使用され得る。例えば、活性化可能抗体が酵素による切断に対して感受性のＣＭ１－ＣＭ２基質を含む場合、活性化可能抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出するために（定性的に又は定量的に）、使用され得る。別の実施例では、活性化可能抗体が還元剤による切断に対して感受性のＣＭ１－ＣＭ２基質を含む場合、活性化可能抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出するために（定性的又は定量的に）、使用され得る。それらの方法での分析を促進するために、活性化可能抗体が、検出可能に標識され得、そして支持体（例えば、固体支持体、例えばスライド又はビーズ）に結合され得る。検出可能標識は、切断に続いて放出されない活性化可能抗体の一部を位置決定し、例えば検出可能標識は、消光蛍光標識、又は切断が生じるまで、検出できない他の標識であり得る。アッセイは例えば、固定された、検出可能的に標識された活性化可能抗体と、酵素及び／又は還元剤を含むことが疑われるサンプルとを、切断が生じるのに十分な時間、接触し、次に、過剰のサンプル及び汚染物を除去するために洗浄することにより実施され得る。次に、サンプルにおける切断（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は不在が、サンプルとの接触の前、活性化可能抗体の検出可能シグナルの変化、例えばサンプルにおける切断剤による活性化可能抗体の切断のために検出可能シグナルの存在及び／又は上昇により評価される。
そのような検出方法は、切断される場合、活性化可能抗体の少なくとも１つのＡＢを結合できる標的の存在又は不在の検出を提供するよう適合され得る。従って、アッセイは、切断剤の存在又は不在、及び目的の標的の存在又は不在を評価するよう適合され得る。接断剤の存在又は不在は、上記のような活性化可能抗体の検出可能レベルの存在及び／又は不在により検出され得、そして標的の存在又は不在は、標的－ＡＢ複合体の検出により、例えば検出可能に標識された抗－標的抗体の使用により検出され得る。
活性化可能抗体はまた、例えばプロテアーゼ切断による活性化可能抗体の活性化の検証のためにインサイチュイメージング、及び特定の標的への結合においても有用である。インサイチュイメージングは、生物学的サンプル、例えば細胞培養物又は組織切片におけるタンパク質分解活性及び標的の局在化を可能にする技法である。この技法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づいて、所定の標的への結合及びタンパク質分解活性の両者を認識することが可能である。
それらの技法は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健康組織に由来する何れかの凍結された細胞又は組織において有用である。それらの技法はまた、新鮮な細胞又は組織サンプルにおいても有用である。
それらの技法によれば、検出可能抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能標識は、蛍光色素（例えば、蛍光団、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Qdot（登録商標）ナノクリスタル）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン、及び増幅試薬、例えばストレプトアビジン、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ）であり得る。
標識された活性化可能抗体と共にインキュベートされたサンプルにおける標識の検出は、サンプルが標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを用いて、及び／又はプロテアーゼに対して特異的である剤、例えばプロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）に対して特異的であり、そしてマトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害する、抗体、例えばＡ１１を用いて、確認され得る；例えば、２０１０年１１月に公開された国際公開第２０１０／１２９６０９号を参照のこと。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを使用することの、及び／又はより選択的阻害剤を用いることによる同じアプローチが、プロテアーゼ、又は活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的な種類のプロテアーゼを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的の存在は、標的、例えば別の抗体に対して特異的である剤を用いて確かめられ得るか、又は検出可能標識が標識されていない標的と競争され得る。いくつかの実施形態において、標識されていない活性化可能抗体が、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出と共に使用され得る。
類似する技法がまた、インビボイメージングのためにも有用であり、ここで対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおける蛍光シグナルの検出は、疾患部位が標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭ１－ＣＭ２基質に対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する。
それらの技法はまた、活性化可能抗体におけるプロテアーゼ特異的ＣＭ１－ＣＭ２基質に基づいて、種々の細胞、組織及び生物におけるプロテアーゼ活性の検出、同定又は特徴づけのために、キットに、及び／又は試薬としても有用である。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する患者を同定する方法において有用である。例えば、インサイチュイメージングにおいては、活性化可能抗体が、適切な位置で、例えば腫瘍部位で、適切なプロテアーゼ及び標的を有するそれらの患者を同定するために患者サンプルをスクリーンするために使用される。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、及び試験される活性化可能抗体（例えば、疾患部位で活性化された抗体を蓄積する）中の切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２基質）において基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者（例えば、疾患部位で、活性化された抗体を蓄積する）は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、それらの方法を用いて試験される、標的、及び活性化可能抗体中のＣＭ１－ＣＭ２基質において基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る（すなわち、試験される活性化可能抗体による治療のために適切でない）。いくつかの実施形態において、第一活性化可能抗体に関して陰性であるそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。
いくつかの実施形態において、インビボイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、さらに絞り込むために使用される。例えば、標的、及び試験される活性化可能抗体中の切断可能部分（ＣＭ１－ＣＭ２基質）において基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者（例えば、疾患部位で、活性化された抗体を蓄積する）は、そのようなＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る（すなわち、試験される活性化可能抗体による治療のために適切でない）。いくつかの実施形態において、第一活性化可能抗体に関して陰性であるそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭ１－ＣＭ２基質を含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。
医薬組成物
本開示の結合された抗体、活性化可能抗体、及び／又は結合された活性化可能抗体（また、本明細書においては、「活性化合物」と称する）、及びその誘導体、フラグメント、類似体及び相同体が、投与のために適切な医薬組成物中に組込まれ得る。そのような組成物は、典型的には、結合された抗体、活性化可能抗体、及び／又は結合された活性化可能抗体及び医薬的に許容される担体を含む。本明細書において使用される場合、用語「医薬的に許容できる担体（pharmaceutically acceptable carrier）」とは、医薬投与と適合できる、何れか及びすべての溶媒、分散媒体、コーチング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び同様のものを含むことが意図される。適切な担体は、参照により本明細書に組込まれる、この分解においては標準的参考テキストであるRemington’s Pharmaceutical Scienceの最新版に記載される。そのような担体又は希釈剤の適切な例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。リポソーム及び非水性媒体、例えば固定油がまた使用され得る。医薬活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当業界においては良く知られている。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物へのその使用が企画される。補助的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。
本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合できるよう製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与を包含する。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、硝酸塩又はリン酸塩、及び張性の調整のための薬、例えば塩化ナトリウム及びデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス又はプラスチックから製造される複数回投与バイアルに封入され得る。
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性）又は分散液、及び無菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を包含する。すべての場合、組成物は、容易な注射針通過まで無菌で且つ流体であるべきである。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定すべきであり、そして微生物、例えば細菌及び菌類の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば水エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール及び同様のもの）及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばコーチング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同様のものにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが適切であろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物に含むことによりもたらされ得る。
無菌注射用溶液は、適切な溶媒中、必要とされる量での活性成分を、上記に列挙される成分の１つ又は組み合わせと共に組込むことにより、必要な場合、続いて、濾過減菌により調整され得る。一般的に、分散液は、基本的分散媒及び上記の列挙されるそれらからの必要とされる他の成分を含む無菌ビークル中に活性化合物を組込むことにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分及びその前もって減菌濾過された溶液からの任意の追加の所望する成分を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
経口組成物は一般的に不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮され得る。経口治療投与のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組込まれ、そして錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用される。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用のための液体担体を用いて調製され得、ここで液体担体中の化合物は、経口適用され、そしてスウィッシュされ、そして吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬的に適合できる結合剤、及び／又はアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ及び同様のものは、次の成分の何れか、又は類似する性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチン；賦形剤、例えば澱粉又はラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチ；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はSterotes；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン；又は風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料。
吸入による投与のためには、化合物は、適切な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧された容器又はディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾル噴霧の形で送達される。
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであっても良い。経粘膜又は経皮投与のためには、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般的に当業界において知られており、そして例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻腔内スプレー又は坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当業界において一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル又はクリーム中に配合される。
化合物はまた、直腸送達のために、坐剤（例えば、従来の製剤基材、例えばココアバター及び他のグリセリドを含む）又は保持浣腸の形で調製され得る。
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体、例えば制御放出製剤、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達システムを用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、Alza Corporation 及びNova Pharmaceuticals, Incから市販されている。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体により、感染された細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、医薬的に許容される担体として使用され得る。それらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られている方法に従って調製され得る。
投与の容易性及び投与量の均一性のための単位剤形で経口又は非経口組成物を製剤化することが特に好都合である。単位剤形とは、本明細書において使用される場合、治療される対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望する治療効果を生成するよう計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物のユニーク特徴及び達成されるべき特定の治療効果、及び個体の治療のためのそのような活性化合物を配合する技術的に固有の制限により決定され、そしてそれらに直接的に依存する。
医薬組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック又はディスペンサーに含まれる。
本発明は、さらに、次の実施例に記載されるが、但し、それらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１． マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びセリンプロテアーゼ（ＳＰ）で切断可能な抗Jagged活性化可能抗体
この実施例は、Jagged標的、例えば、Jagged１及び／又はJagged２に結合する活性化可能抗体であって、そしてそこで、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼの存在下で活性化される、活性化可能抗体の作出と評価を実証する。
本明細書中に記載の試験では、次の基質配列を使用し、そしてそこで、ＬＰ’はＣＭ１とＣＭ２との間の連結ペプチドである。ＣＭ１－ＣＭ２基質１００１／ＬＰ’／０００１に関して、ＬＰ’はＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５０）であり、及び以下の表中のすべてのその他のＣＭ１－ＣＭ２に関して、ＬＰ’はＧＧである：
Figure 0006996981000071
抗Jagged活性化可能抗体Ｌ鎖の構築を、次のように実施した。
ＣＭ１－ＣＭ２基質を、次のようにして（ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２０１３／１９２５５０に記載の）Jagged活性化可能抗体ベクター内に組み入れた。標準的な分子生物学的技術を使用して、ＣＭ１－ＣＭ２基質をコードするフォワード（Ｆ）プライマー（表Ａを参照）及びリバース（Ｒ）プライマーＣＸ１１９８を、Jagged活性化可能抗体の基質及びＶＬドメインを増幅するのに使用し、且つ、ＸｈｏＩ及びＢｓｉＷＩ制限部位を使用して活性化可能抗体ベクター内にそれに続いてクローニングした。得られたベクターは、以下の抗Jagged活性化可能抗体Ｌ鎖をコードした。
Figure 0006996981000072
 スペーサー配列を伴った抗Jagged２００１活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000073
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000074
 抗Jagged２００１活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000075
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000076
 スペーサー配列を伴った抗Jagged活性化可能抗体１００１／ＬＰ’／０００１ Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000077
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000078
 抗Jagged活性化可能抗体１００１／ＬＰ’／０００１ Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000079
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000080
 スペーサー配列を伴った抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000081
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000082
 抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000083
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000084
 スペーサー配列を伴った抗Jagged０００３／ＬＰ’／１００４活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000085
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000086
 抗Jagged０００３／ＬＰ’／１００４活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000087
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000088
 スペーサー配列を伴った抗Jagged１００３／ＬＰ’／０００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000089
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000090
 抗Jagged１００３／ＬＰ’／０００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000091
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000092
 スペーサー配列を伴った抗Jagged０００３／ＬＰ’／１００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000093
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000094
 抗Jagged０００３／ＬＰ’／１００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000095
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000096
 スペーサー配列を伴った抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000097
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000098
 抗１００４／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000099
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000100
 スペーサー配列を伴った抗Jagged０００１／ＬＰ’／１００４活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000101
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000102
 抗Jagged０００１／ＬＰ’／１００４活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000103
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000104
 スペーサー配列を伴った抗Jagged１００３／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000105
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000106
 抗Jagged１００３／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000107
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000108
 スペーサー配列を伴った抗Jagged０００１／ＬＰ’／１００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000109
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000110
 抗Jagged０００１／ＬＰ’／１００３活性化可能抗体 Ｌｃ
ヌクレオチド配列
Figure 0006996981000111
 アミノ酸配列
Figure 0006996981000112
 抗Jagged活性化可能抗体 Ｈｃ
Figure 0006996981000113
抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合及び活性化を、次のようにして評価した。
抗Jagged活性化可能抗体を、一時的に形質移入したＨＥＫ－２９３細胞から発現させ、培養上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体がＭＭＰ及びセリンプロテアーゼの両方によって活性化されることができるか実証するために、精製した活性化可能抗体をｕＰＡ及び／又はＭＭＰ１４で消化し、それに続いて、ＥＬＩＳＡによってヒトJagged１－Ｆｃに結合するそれらの能力について評価した。ＥＬＩＳＡプレート（Greiner Bio-1#655061）を、Ｈａｎｋ’ｓ平衡化塩溶液 ｐＨ７．４（ＨＢＳＳ）（Teknova #H8057）中のヒトＪａｇ１－Ｆｃ（R&D #1277-JG-050）１マイクログラム／ｍｌで４℃にて一晩コートした；本明細書中で使用する場合；マイクログラムは、ｕｇやμｇとも表される。プレートを、ＨＢＳＳ中の２％ 脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）を用いて室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングした。ブロックを取り除いて、抗Jagged抗体４Ｄ１１、抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体、又は消化した活性化可能抗体を、２％のＮＦＤＭ／ＨＢＳＳ中に指示された濃度まで加え、そして、ＲＴにて１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、過剰量のＨＢＳＳ、０．０５％ ＴＷＥＥＮ（ＨＢＳＳ－Ｔ）で３回洗浄し、その後、２％のＮＦＤＭ／ＨＢＳＳ中、１：３０，０００に希釈した、ＨＲＰ結合、Ｆ’Ａｂ（２）特異的、マウス抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch #209-035-097）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートをＨＢＳＳ－Ｔで続けて３回洗浄し、そして、１－ステップＴＭＢ基質（Pierce/Thermo Fisher #NC0140927）を使用して現像した。プレートを、ＯＤ４５０にて読み出し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットした。
図１は、抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体が（ａ）ｕＰＡ又はＭＭＰ１４による切断前に、効果的にマスクされ、そして、（ｂ）ｕＰＡ若しくはＭＭＰ１４によって切断したときの抗体、又はｕＰＡ及びＭＭＰ１４との組み合わせと同等な結合を示すことを実証する。
ＣＭ１－ＣＭ２基質含有抗Jagged活性化可能抗体
薬物動態を、次のようにして非腫瘍担持ヌードマウスで評価した。
マスク及び基質の安定性の代わりに、ＣＭ１－ＣＭ２基質２００１及び１００１／ＬＰ’／０００１を含む抗Jagged活性化可能抗体の薬物動態を、非腫瘍担持マウスにおいて抗Jagged抗体の薬物動態と比較した。マウス／ヒト交差反応性抗Jagged抗体は、正常組織におけるJagged１／２結合のため、マウスにおいて急速なクリアランスを示す。抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体が循環中でマスクされた（安定した）ままであれば、活性化可能抗体は、標的媒介型クリアランスを回避し、延長された血清中半減期を示すはずである。
抗Jagged抗体及び活性化可能抗体の血漿薬物動態を、次のようにして評価した。表Ｂに指示されたように、各群は５匹のマウスの２つのコホートから成った。マウスに、５ｍｇ／ｋｇの指示された化合物の単回静脈内投与を与えた。リチウムヘパリン化血漿を、投薬後２４時間、９６時間、及び１０日にコホート１から採取し、それに対し、血漿を、４８時間、７日、及び１４日にイソフルラン麻酔を用いて眼窩後方経路によってコホート２から採取した。総血漿ヒトＩｇＧレベルを、ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して検出した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレート（Costar 3590 Fisher Scientific Cat. # 07-200-35）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のAffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的（Jackson ImmunoResearch Cat. # 109-006-097）で１μｇ／ｍｌ、４℃にて一晩コートした。プレートを、Superblock（ScyTek Laboratories Cat. # AAA500）を用いて室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングした。ブロックを取り除き、標準（被験物質）及び試験サンプル（血漿サンプル）の適当な希釈物をプレートに加え、ＲＴにて１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、過剰量のＰＢＳ、０．０５％ ＴＷＥＥＮ（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄した後、１：２５，０００に希釈したAffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Jackson ImmunoResearch Cat. # 109-035-097）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ－Ｔで続けて３回洗浄し、製造業者のプロトコールに従って１ステップＴＭＢ基質（Pierce/Thermo Fisher #NC0140927）を使用して現像した。血清中ヒトＩｇＧレベルを、試験サンプル値を検量線と比較することによって算出した。薬物動態パラメータを、スパースサンプリングを用いたノンコンパートメント解析を使用して算出した（Phoenix WinNonlin v6.3）。
図２に示したとおり、抗Jagged抗体は、急速にクリアランスされ、１０日目にはアッセイの検出限界を下回った。対照的に、抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体、並びに１００１／ＬＰ’／０００１及び２００１は、有意に延長された半減期を示し、そして、活性化可能抗体が安定した状態を保って、循環中で十分にマスクされたことを示した。
表Ｂ．抗ＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体２００１及び１００１／ＬＰ’／０００１に関する薬物動態的解析のための群及び投薬
Figure 0006996981000114
抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２基質含有活性化可能抗体薬剤コンジュゲートの安全及び有効性のｉｎ ｖｉｖｏにおける評価を、次のように実施した。
抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２基質含有２００１活性化可能抗体薬剤コンジュゲート（ＳＰＤＢリンカーを介してマイタンシノイドＤＭ４（例えばＵＳ７，２７６，４９７を参照）に結合させた抗Jagged２００１活性化可能抗体を含む）の有効性を、ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍モデルで評価した。ＨＣＣ１８０６細胞を、対数増殖中に採集し、５×１０７細胞／ｍｌの濃度で、ＰＢＳ中の５０％ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）中に再懸濁した。マウスには、５×１０６細胞を右脇腹に皮下注射し、１００－１５０ｍｍ３の平均体積まで増殖させた。マウスを、無作為化し、そして、表Ｃに示したとおり投薬した。試験継続期間中、腫瘍体積及び体重を毎週２回計測し、そして、それぞれ、有効性及び安全性の計測値を得た。
図３は、ＰＢＳ、アイソタイプ－ＳＰＤＢ－ＤＭ４、抗Jagged－ＳＰＤＢ－ＤＭ４薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）、及び抗Jagged２００１活性化可能抗体薬剤コンジュゲート動物処理に関する群平均腫瘍体積±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。どちらの対照群（ＰＢＳ及びアイソタイプ－ＳＰＤＢ－ＤＭ４）も腫瘍増殖阻害を示さなかったのに対して、抗Jagged ＡＤＣ及び抗Jagged２００１活性化可能抗体薬剤コンジュゲート群の両方が腫瘍退縮を示した。抗Jagged ＡＤＣで処理した動物は、図４に示したように、体重減少によって計測されるような有意な副作用を示した。しかしながら、抗Jagged２００１活性化可能抗体薬剤コンジュゲートで処理した動物は、体重減少がないことを示し（図４でも示した）、抗JaggedＣＭ１－ＣＭ２活性化可能抗体薬剤コンジュゲートの活性が腫瘍に局在したことを実証した。
Figure 0006996981000115
 実施例２．マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びセリンプロテアーゼ（ＳＰ）で切断可能な抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体
この実施例は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する活性化可能抗体の作出及び評価を実証し、そしてそこでは、該活性化可能抗体が、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼの存在下で活性化される。
この実施例に使用される活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体を、活性化可能抗Jagged抗体を作出するために実施例１で使用した方法と同様の方法を使用して作り出した。
本明細書中に記載した試験では、次の基質配列を使用し、そしてそこでは、ＬＰ’はＣＭ１とＣＭ２との間の連結ペプチドである。以下の表中のすべてのＣＭ１－ＣＭ２基質に関して、ＬＰ’は、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５０）である：
Figure 0006996981000116
 抗ＥＧＦＲＨ鎖（Ｈｃ）：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000117
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000118
 抗ＥＧＦＲ Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000119
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000120
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ０００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000121
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000122
 抗ＥＧＦＲ０００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000123
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000124
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ０００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000125
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000126
 抗ＥＧＦＲ０００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000127
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000128
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ１００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000129
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000130
 抗ＥＧＦＲ１００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000131
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000132
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ１００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000133
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000134
 抗ＥＧＦＲ１００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000135
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000136
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ２００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000137
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000138
 抗ＥＧＦＲ２００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000139
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000140
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ２００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000141
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000142
 抗ＥＧＦＲ２００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000143
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000144
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ０００１／ＬＰ’／１００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000145
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000146
 抗ＥＧＦＲ０００１／ＬＰ’／１００１の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000147
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000148
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ１００１／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000149
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000150
 抗ＥＧＦＲ１００１／ＬＰ’／０００１の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000151
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000152
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ０００２／ＬＰ’／１００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000153
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000154
 抗ＥＧＦＲ０００２／ＬＰ’／１００１の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000155
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000156
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ１００１／ＬＰ’／０００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000157
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000158
 抗ＥＧＦＲ１００１／ＬＰ’／０００２の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000159
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000160
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ０００１／ＬＰ’／１００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000161
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000162
 抗ＥＧＦＲ０００１／ＬＰ’／１００２の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000163
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000164
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ１００２／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000165
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000166
 抗ＥＧＦＲ１００２／ＬＰ’／０００１の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000167
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000168
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ０００２／ＬＰ’／１００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000169
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000170
 抗ＥＧＦＲ０００２／ＬＰ’／１００２の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000171
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000172
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ１００２／ＬＰ’／０００２活性化可能抗体Ｌ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000173
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000174
 抗ＥＧＦＲ１００２／ＬＰ’／０００２の活性化可能抗体のＬ鎖：
ヌクレオチド配列：
Figure 0006996981000175
 アミノ酸配列：
Figure 0006996981000176
以下の材料を、本明細書中に記載した試験に使用した。
試薬と菌株：ヒトｕ－ＰＡ（Research & Diagnostics Systems, Inc.）を修飾なしで使用した。ヒトマトリプターゼ（Research & Diagnostics Systems, Inc.）を修飾なしで使用した。ヒトＭＭＰ１４（Research & Diagnostics Systems, Inc.）を、提供されたプロトコールに従って活性化し、修飾なしで使用した。ＭＭＰ１４バッファーＨＣＭ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２）を使用した。ｕ－ＰＡ及びマトリプターゼバッファーＴＢＳＴ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用した。
以下の方法を使用して、活性化可能抗体のｉｎ Ｖｉｔｒｏ基質活性を評価した。
基質タンパク質分解：ｕ－ＰＡ、マトリプターゼ、及び／又はＭＭＰ１４によって切断される活性化可能抗体内の基質の能力を、次のように決定した。ＰＢＳ ｐＨ７．２中のプロテアーゼの存在又は不存在下、サンプルを、３７℃にて一晩１６～２４時間インキュベートした。プロテアーゼ消化物を、９対１の活性化可能抗体対プロテアーゼ比を維持するように調製した。タンパク質分解物を、キャピラリー電気泳動、ＥＬＩＳＡ、又はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。
基質切断の反応速度論（ｋｃａｔ／Ｋｍ）：マトリプターゼ及び／又はＭＭＰ１４によって切断される基質、２００１、２００２、０００１／ＬＰ’／１００１又は１００１／ＬＰ’／０００１を含むＥＧＦＲ活性化可能抗体の能力を次のようにして決定した。マトリプターゼプロテアーゼ消化を、ＴＢＳＴ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５において実施した。ＭＭＰ１４プロテアーゼ消化を、ＨＣＭ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ６．８）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２において実施した。種々の濃度の活性部位滴定マトリプターゼ又はＭＭＰ１４と、固定された濃度の活性化可能抗体とを組合し、プロテアーゼに対する基質の比率を５０に維持した。これらの基質を含むサンプルを、３７℃で２４時間までインキュベートした。反応を停止するために、５μｌの消化物を、２０ｍＭの２－メルカプトエタノールを含むHt Protein Express Sample Buffer（Caliper LifeSciences）７μｌに、９５℃で１０分間にわたって添加した。熱変性の後、３２μｌのｄｄＨ２Ｏを添加し、そしてサンプルを、LabChip GXII上で、その製造業者の説明書に従って分析した。LabChip GXIIソフトウェアを用いて、Ｌ鎖ピーク領域を定量化した。生成物転換を、次の等式中にＬ鎖ピーク領域を挿入することにより計算した：切断されたＬＣ（切断されたＬＣ＋切断されていないＬＣ）、ＬＣ＝Ｌ鎖ピーク面積。ｋｃａｔ／Ｋｍ値を、次の等式により決定した：
Figure 0006996981000177
 ここで、Ｃは生成物転換であり、ｔは時間（秒）であり、そしてｐはプロテアーゼ濃度（Ｍ）であり、これは、基質濃度がＫｍ以下であり、そしてプロテアーゼ濃度を越えていることを想定している。
以下の方法は、本明細書中に記載の活性化可能抗体のｉｎ ｖｉｖｏ基質安定性を評価するのに使用できる。
この項は、それらがＥＧＦＲ活性化可能抗体に組み込まれ、マウスに注入されたとき、実施形態の基質のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を評価するための実験方法を記載する。
３匹のヌードマウス（Crl：NU－Foxnlnu）は、０日目に１２．５ｍｇ／ｋｇで、それぞれ２００１、２００２、０００１／ＬＰ’／１００１、１００１／ＬＰ’／０００１、１００１／ＬＰ’／０００２、０００１／ＬＰ’／１００２、又は０００２／ＬＰ’／１００２基質を含むＥＧＦＲ活性化可能抗体の単一ＩＰ投与を受けた。マウスは、ＣＯ２窒息により、４日目（投与後、約９６時間）、安楽死させ、そして血液を、血漿－ＥＤＴＡとして素早く採取し、そして－８０℃にて保存した。
ＥＧＦＲ活性化可能抗体を、磁気ビーズを用いて、抗－ヒトＩｇＧ免疫沈澱により血漿から精製した。溶出された活性化可能抗体を、ｋｃａｔ／Ｋｍの項に記載されるようにして、キャピラリー電気泳動による分析のために調製した。簡単に言えば、５μｌの溶出されたＩｇＧを、７μｌのタンパク質発現サンプル緩衝液に、２－メルカプトエタノールと共に添加した。循環安定性の定量化は、生成物転換の定量化と同一であった。
次の方法を、活性化可能抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価するのに使用する。
この項は、マトリプターゼ切断可能基質、ＭＭＰ１４切断可能基質、又は実施形態の基質（すなわち、マトリプターゼとＭＭＰ１４で切断可能な基質）を含むＥＧＦＲ活性化可能抗体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効であることを評価するための実験法を記載する。マトリプターゼ及び／又はＭＭＰ１４のいずれか又はその両方で切断可能である基質配列、０００１、０００２、１００１、２００１、２００２、／０００１／ＬＰ’／１００１又は１００１／ＬＰ’ ／０００１を含む７種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体を、０日目、Ｈ２９２異種移植腫瘍担持（肺癌）マウスに対して、１２．５ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。マウスを、８日目（投薬後１９２時間）に眼窩後方から採血した。血液を血漿ＥＤＴＡとして素早く採取し、－８０℃にて保存した。ＥＧＦＲ活性化可能抗体を、磁性ビーズを使用した抗ヒトＩｇＧ免疫沈降反応によって血漿から精製した。溶出したＥＧＦＲ活性化可能抗体を、キャピラリー電気泳動による分析のために調製した。簡単に言えば、５μｌの溶出したＩｇＧに、２－メルカプトエタノールを含んだProtein Express Sampleバッファー７μｌに加えた。循環安定性の定量化は、生成物転換の定量化と同一であった。
８日目に、マトリプターゼ切断可能な基質、又はＭＭＰ１４切断可能な基質、０００１、０００２又は１００１を含む３種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体が、１４％から１５％の範囲の平均パーセント（％）活性化値を実証し、そして、実施形態の基質、２００１、２００２、０００１／ＬＰ’ ／１００１又は／１００１／ＬＰ’／０００１を含む４種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体（すなわち、マトリプターゼ及びＭＭＰ１４によって切断可能な基質）が、２８％から３３％の平均％活性化値を実証した。平均％活性化を（（試験群の生成物転換合計）＊１００％）／（試験群の動物数）として計算した。
０００１、０００２、１００１、２００１、２００２、０００１／ＬＰ’／１００１又は１００１／ＬＰ’／０００１の基質配列を含む全７種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体は、アミノ酸配列ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号１６８）を含むマスキング部分、並びにＬ鎖（配列番号１１１）とＨ鎖（配列番号１０８）を含む抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５ｖ５抗体も含んだ。活性化可能抗体のＬ鎖の立体配置は、マスキング部分－基質－Ｃ２２５ｖ５のＬ鎖であった。
２１日目に、マトリプターゼ切断可能な基質又はＭＭＰ１４切断可能な基質、０００１、０００２又は１００１を含む３種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体が、平均パーセント（％）阻害によって計測されるように４１％から５７％の範囲の腫瘍増殖阻害を実証し、そして、実施形態の基質、２００１、２００２、０００１／ＬＰ’／１００１又は１００１／ＬＰ’／０００１、すなわち、マトリプターゼ及びＭＭＰ１４で切断可能な基質を含む４種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体が、平均％阻害によって計測されるように、７７％から８０％の範囲の腫瘍増殖阻害を実証した。平均％阻害を（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））－（平均（Ｔ）－平均（Ｔ０））／（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））＊１００％として計算され、式中、Ｔは、現試験群の値であり、Ｔ０は現試験群の初期値であり、Ｃは対照群であり、及びＣ０は対照群の初期値である。２１日目のＥＧＦＲ抗体セツキシマブは、この試験での８６％阻害を実証した。
実施例３．抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のｉｎ ｓｉｔｕ撮像
本実施例は、無標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のｉｎ ｓｉｔｕ撮像の使用を記載する。切断及び結合を、活性化可能抗体のＡＢ部分に特異的に結合する二次抗体を使用して検出した。
Ｈ２９２肺癌腫瘍組織上の無標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４－２００１－Ｃ２２５ｖ５の活性化及び結合のｉｎ ｓｉｔｕ撮像を、次のように実施した：凍結組織切片をガラススライド上に置いた。無標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を含む溶液を組織に適用し、そして、例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＺｎＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０；約１μｇ／ｍｌの濃度の活性化可能抗体を含んでいる１０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファーｐＨ７．４のインキュベーションバッファー中、室温（約２２－２４℃）にて１時間インキュベートした。斯かるインキュベーション条件は、例えば、（例えば、中、約ｐＨ７から約ｐＨ８．５の範囲内の）溶液のｐＨ、（例えば、約２０℃から約４０℃の範囲内、例えば、室温又は３７℃の）インキュベーション温度、（例えば、約１５分から約１５０分の範囲内の）インキュベーション時間、及び／又は（例えば、約０．０５μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌの範囲内の）活性化可能抗体の濃度を変えることによって、組織切片内の切断剤に役立つように斯かる条件を調節できる。次に、組織を、広範囲にわたって洗浄して、非結合材料を取り除いた。組織上の活性化した抗体を、であるとした存在下、は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７でに標識した二次抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出した。その検出の条件は、検出試薬及び検出の種類（例えば、蛍光標識）に対して調整できる。例えば、蛍光標識を使用したとき、組織を蛍光顕微鏡に提示する。図６に示したとおり、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４－２００１－Ｃ２２５ｖ５が、親抗ＥＧＦＲ抗体に匹敵する強度及びパターンで染色することを実証した。抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４－２００１－Ｃ２２５ｖ５の蛍光シグナルは、広範囲阻害剤カクテルセットＩＩＩ（539134, EMD Millipore, Billerica, MA）の１：１００希釈物及び５０ｍＭのＥＤＴＡを用いた組織の前処理によって有意に阻害された。

実施例４．追加のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びセリンプロテアーゼ（ＳＰ）活性化可能抗体
この実施例は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼの存在下で活性化される追加の基質配列の作出及び評価を実証する。
本明細書中に記載した試験では、次の基質配列を使用した：
Figure 0006996981000178
ヒトマトリプターゼ及び／又はヒトｕＰＡによって切断される、基質、２００１、１００４／ＬＰ’／０００１、１００４／ＬＰ’／０００３、２００３、２００４、又は２００５の能力を、先の実施例２で記載したように測定した。
基質２００３は、基質２００１と比較して、マトリプターゼに関して切断速度において約５０倍の増大を実証し、そして、基質２００５は、基質１００４／ＬＰ’／０００１と比較して、マトリプターゼに関して切断速度における約５０倍の増大を実証した。
基質２００３及び２００５もまた、それぞれ２００１及び１００４／ＬＰ’／０００１と比較して、ｕＰＡ反応速度における約３から４倍の範囲のわずかな増大を実証した。基質２００３及び２００５も同様に、マウスｕＰＡの存在下で切断されることがわかった。
基質２００３、２００４、及び２００５を、次の活性化可能抗体内に組み込んだ：
抗ＥＧＦＲ Ｈ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000179
 抗ＥＧＦＲ Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000180
 抗ＥＧＦＲ２００３活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000181
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ２００３活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000182
 抗ＥＧＦＲ２００５活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000183
 スペーサー配列を有する抗ＥＧＦＲ２００５活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000184
先に示した抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のすべてで使用される基質は、ヒトｕＰＡ、ヒトマトリプターゼ、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ１４）、及びヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）によって切断された。
この項は、ｎｕ／ｎｕマウスのＨ２９２異種移植腫瘍を使用したＨ２９２腫瘍有効性試験において示された様々な抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の評価を記載する。Ｈ２９２腫瘍有効性試験は、実施例２に記載され、さらに、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２０１３／１６３６３１にも記載されている。
この試験では、マウスを、群に分け、そして、対照静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ、本明細書中で抗ＥＧＦＲ２００１活性化可能抗体とも呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４４９のＬ鎖配列を含む）；本明細書中で抗ＥＧＦＲ２００３活性化可能抗体とも呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４７２のＬ鎖配列を含む）；又は本明細書中で抗ＥＧＦＲ２００５活性化可能抗体とも呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号４７４のＬ鎖配列を含む）を使用して、以下の表とおり投薬した。
Figure 0006996981000185
先に示した抗ＥＧＦＲ抗体で使用される基質の有効性を、投与後の様々な時点における腫瘍体積（ＴＶ ｍｍ３）を計測することによって評価した。この試験の結果を、図８Ａ－８Ｆに示す。
この項は、図４に示したデータに関する、実施例２に記載のそれらと同様の方法を使用した毒性研究における様々な抗Jagged活性化可能抗体の評価を記載する。
この試験では、毒性を、対照静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、２０ｍｇ／ｋｇの投薬量の本明細書中で４Ｄ１１とも呼ばれる抗Jagged抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号１６２のＬ鎖配列を含む）、１０ｍｇ／ｋｇの投薬量の４Ｄ１１抗体、５ｍｇ／ｋｇの投薬量の４Ｄ１１抗体、本明細書中で抗Jagged２００１活性化可能抗体とも呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４２０のＬ鎖配列を含む）、本明細書中で抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００１活性化可能抗体とも呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４３２のＬ鎖配列を含む）、本明細書中で抗Jagged１００４／ＬＰ’／０００３活性化可能抗体とも呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４２４のＬ鎖配列を含む）、本明細書中で抗Jagged２００３活性化可能抗体とも呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（以下に示した配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４７７のＬ鎖配列を含む）、並びに本明細書中で抗Jagged２００５活性化可能抗体とも呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（以下に示した配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号４７９のＬ鎖配列を含む）を投与した後のＤＢＡ／１マウスにおける体重（ＢＷ）の損失の関数として計測した。

スペーサー配列を有する抗Jagged２００３活性化可能抗体 Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000186
 抗Jagged２００３活性化可能抗体 Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000187
 スペーサー配列を有する抗Jagged２００５活性化可能抗体 Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000188
 抗Jagged２００５活性化可能抗体 Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000189
図９に示した試験では、マウスを、群に分け、以下の表に示したように投与した：
Figure 0006996981000190
結果を、試験中の様々な時点における相対体重（ＢＷ）パーセント（％）変化として図９に示す。
結果を、試験中の様々な時点における相対体重（ＢＷ）パーセント（％）変化として図１０に示す。
図８Ａ－８Ｆ、図９、及び図１０に示したように、本開示の切断可能な基質を含む活性化可能抗体は、安全であり、且つ、有効である。特に、２００３基質は、２００１基質に匹敵する有効性を、及びＩＶＩＧに匹敵する安全性を実証し、そして、２００５基質は、親に匹敵する有効性、及び４分の１の投与量の親に匹敵する安全性を実証した。

実施例５．追加のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びセリンプロテアーゼ（ＳＰ）活性化可能抗体
この実施例は、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼの存在下で活性化される追加の基質配列の作出及び評価を実証する。
本明細書中に記載した試験では、以下の基質配列を使用した：
Figure 0006996981000191
当業者は、本明細書中に提示したヌクレオチド配列が典型例であることを理解し、そして、当業者はまた、同じペプチド配列を発現するために他のコドンの組み合わせ及び／又は（単数若しくは複数の）ヌクレオチド配列の縮重を使用することもできる。
基質２００６－２０１４及び基質３００６－３０１４を、以下の活性化可能抗体に組み込んだ：

抗ＥＧＦＲ Ｈ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000192
 抗ＥＧＦＲ Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000193
 抗ＥＧＦＲ２００６活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000194
 抗ＥＧＦＲ２００７活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000195
 抗ＥＧＦＲ２００８活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000196
 抗ＥＧＦＲ２００９活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000197
 抗ＥＧＦＲ２０１０活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000198
 抗ＥＧＦＲ２０１１活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000199
 抗ＥＧＦＲ２０１２活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000200
 抗ＥＧＦＲ２０１３活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000201
 抗ＥＧＦＲ２０１４活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000202
 抗ＥＧＦＲ３００６活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000203
 抗ＥＧＦＲ３００７活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000204
 抗ＥＧＦＲ３００８活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000205
 抗ＥＧＦＲ３００９活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000206
 抗ＥＧＦＲ３０１０活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000207
 抗ＥＧＦＲ３０１１活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000208
 抗ＥＧＦＲ３０１２活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000209
 抗ＥＧＦＲ３０１３活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000210
 抗ＥＧＦＲ３０１４活性化可能抗体Ｌ鎖：
アミノ酸配列：
Figure 0006996981000211
基質２００６（配列番号４８３）、基質２００７（配列番号４８４）、基質２００８（配列番号４８５）、基質２００９（配列番号４８６）、基質２０１０（配列番号４８７）、基質２０１１（配列番号４８８）、基質２０１２（配列番号４８９）、基質２０１３（配列番号４９０）、基質２０１４（配列番号５５５）、基質３００６（配列番号５１５）、基質３００７（配列番号５１６）、基質３００８（配列番号５１７）、基質３００９（配列番号５１８）、基質３０１０（配列番号５１９）、基質３０１１（配列番号５２０）、基質３０１２（配列番号５２１）、基質３０１３（配列番号５２２）、又は基質３０１４（配列番号５５７）の基質配列を含む全１８種類のＥＧＦＲ活性化可能抗体はまた、アミノ酸配列ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号１６８）を含むマスキング部分、並びにＬ鎖（配列番号１１１）及びＨ鎖（配列番号１０８）を含む抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５ｖ５抗体を含んだ。活性化可能抗体のＬ鎖の立体配置は、マスキング部分－基質－Ｃ２２５ｖ５のＬ鎖であった。
本明細書中に記載したものと同様の技術を使用したヒトマトリプターゼによる基質２００１、２００６－２０１０及び２０１２を含む抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の切断は、６Ｅ＋０２から２Ｅ＋０４の範囲に及ぶ種々のｋｃａｔ／Ｋｍ値を呈した。本明細書中に記載したものと同様の技術を使用したヒトマトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ１４）によるで基質２００１、２００６－２０１０、２０１２、及び２０１３を含む抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の切断は、１Ｅ＋０４から５Ｅ＋０４の範囲に及ぶ種々のｋｃａｔ／Ｋｍ値を呈した。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、これらの抗体はまた、本明細書中に記載したものと同様の技術を使用した標準及び担癌マウスの両方において４日に匹敵する安定性を呈した。
この項は、ｎｕ／ｎｕマウスのＨ２９２異種移植腫瘍を使用したＨ２９２腫瘍有効性試験において示された様々な抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の評価を記載する。Ｈ２９２腫瘍有効性試験は、実施例２に記載され、さらに、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２０１３／１６３６３１にも記載されており、そのそれぞれの内容をそれらの全体として参照によって本明細書に援用する。
この試験では、マウスを、群に分け、そして、以下の表で示すとおり、対照ＰＢＳ、活性化可能抗体（配列番号１０８のＨ鎖配列及び配列番号１１１のＬ鎖配列を含む）；抗ＥＧＦＲＣ２２５ｖ５－３９５４－２００１活性化可能抗体、抗ＥＧＦＲＣ２２５ｖ５－３９５４－２００６活性化可能抗体、抗ＥＧＦＲＣ２２５ｖ５－３９５４－２００７活性化可能抗体などを使用して以下の表に示したとおり投与した。
Figure 0006996981000212
先に示した抗ＥＧＦＲ抗体で使用される基質の有効性を、投与後の様々な時点における腫瘍体積（ＴＶ ｍｍ３）を計測することによって評価した。この試験の結果を、図１１Ａ－１１Ｈ及び１２に示す。
この項は、図４に示したデータに関する、実施例２に記載のそれらと同様の方法を使用した毒性研究における様々な抗Jagged活性化可能抗体の評価を記載する。
この試験では、２０ｍｇ／ｋｇの投薬量の本明細書中で４Ｄ１１とも呼ばれる抗Jagged抗体（配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号１６２のＬ鎖配列を含む）、１０ｍｇ／ｋｇの投薬量の４Ｄ１１抗体、５ｍｇ／ｋｇの投薬量の４Ｄ１１抗体、本明細書中で抗Jagged２００６活性化可能抗体とも呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体（以下に示す配列番号６７のＨ鎖配列及び配列番号５０７－５１４のＬ鎖配列を含む）。

抗Jagged２００６活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000213
 抗Jagged２００７活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000214
 抗Jagged２００８活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000215
 抗Jagged２００９活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000216
 抗Jagged２０１０活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000217
 抗Jagged２０１１活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000218
 抗Jagged２０１２活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000219
 抗Jagged２０１３活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000220
 抗Jagged２０１４活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000221
 抗Jagged３００６活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000222
 抗Jagged３００７活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000223
 抗Jagged３００８活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000224
 抗Jagged３００９活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000225
 抗Jagged３０１０活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000226
 抗Jagged３０１１活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000227
 抗Jagged３０１２活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000228
 抗Jagged３０１３活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000229
 抗Jagged３０１４活性化可能抗体Ｌｃ
アミノ酸配列
Figure 0006996981000230
基質２００６（配列番号４８３）、基質２００７（配列番号４８４）、基質２００８（配列番号４８５）、基質２００９（配列番号４８６）、基質２０１０（配列番号４８７）、基質２０１１（配列番号４８８）、基質２０１２（配列番号４８９）、基質２０１３（配列番号４９０）、２０１４年（配列番号５５５）；基質３００６（配列番号５１５）；基質３００７（配列番号５１６）；基質３００８（配列番号５１７）；基質３００９（配列番号５１８）；基質３０１０（配列番号５１９）；基質３０１１（配列番号５２０）；基質３０１２（配列番号５２１）；基質３０１３（配列番号５２２）；又は基質３０１４（配列番号５５７）の基質配列を含む全１８種類の抗Jagged活性化可能抗体はまた、アミノ酸配列を含むマスキング部分、並びにＬ鎖（配列番号１６２）及びＨ鎖（配列番号６７）を含む抗Jagged抗体４Ｄ１１抗体も含んだ。活性化可能抗体のＬ鎖の立体配置は、マスキング部分－基質－４Ｄ１１のＬ鎖であった。
この試験では、マウスを、群に分け、そして、以下の表に示したとおり投薬した：
Figure 0006996981000231
結果を、試験中の様々な時点における相対体重（ＢＷ）パーセント（％）変化として図１３に示す。
図１１Ａ－１１Ｈ、図１２、及び図１３に示したように、本開示の切断可能な基質を含む活性化可能抗体は、安全であり、且つ、有効である。

実施例６．ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
７から９週齢の雌無胸腺症ｎｕ／ｎｕ（Charles River Laboratories）マウスに、５×１０６個のＮＣＩ－Ｈ２９２（左後ろ脇腹）及びＦａＤｕ細胞（右後ろ脇腹）を皮下に植え付けた。ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ）及びＦａＤｕ細胞（ＡＴＣＣ）を、それぞれ無血清のＭａｔｒｉｇｅｌ又はＭａｔｒｉｇｅｌを含まない無血清培地と１：１で懸濁した。臨床的観察、体重、及びデジタルキャリパーでの腫瘍体積の測定を、腫瘍が測定可能になると、毎週２回おこなった。腫瘍体積を、式（ａｂ＾２）／２｛ここで、２つの直交する直径のうち、ａが長い方で、ｂが短い方である｝で計算した。２５０－５００ｍｍ３の腫瘍体積を有するＨ２９２及びＦａＤｕを異種移植した腫瘍担持マウスを、腫瘍の大きさによって１群あたりｎ＝３の３つの群に割り付けた。動物に、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（ＡＦ７５０）結合セツキシマブ（セツキシマブ－ＡＦ７５０）又は２００１及び１００４／ＬＰ’／０００１を含む活性化可能抗体基質（Ｐｂ２００１－ＡＦ７５０及びＰｂ１００４／ＬＰ’／０００１－ＳＦ７５０）を腹腔内に注射した。その後の蛍光画像化を伴ったコンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査を、ＩＶＩＳスペクトル／ＣＴ造影システム（Caliper Life Sciences, PE）を用いて得た。一群の蛍光表面放射輝度画像を、それぞれ７４５ｎｍ及びの８００ｎｍ励起及び発光波長にて着目の領域を含めた位置の多重透光法にて得た（図１４）。光学画像とマイクロＣＴ画像の三次元再構築、及びそれらの同時表示を、Living Imageソフトウェア４．２（Caliper Life Sciences）を用いて実施した。得られた造影データは、セツキシマブ親抗体と同様に、蛍光シグナルを伴った両異種移植腫瘍における活性化可能抗体の蓄積を実証した。

他の実施形態
本発明はその詳細な説明と併せて説明して来たが、前述の説明は例示であって、特許請求の範囲を限定するものではない。他の側面、利点及び修飾は、添付の特許請求の範囲内である。

Claims (25)

  1. 標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）と；
    少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である少なくとも第一切断可能部分（ＣＭ１）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）のための基質である少なくとも第二切断可能部分（ＣＭ２）を含むＣＭ１－ＣＭ２基質と
    を含む単離ポリペプチドであって、
    前記ＣＭ１－ＣＭ２基質が、配列番号１～４、７、８、１１～１７、２２、４６９～４７１、５５５、及び５５７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記少なくとも１つのＭＭＰが、ＭＭＰ１４である、単離ポリペプチド。
  2. 前記ＳＰが、ｕＰＡ又はマトリプターゼである、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  3. 前記ＭＭＰ、前記ＳＰ、又は前記ＭＭＰと前記ＳＰの両方が、前記標的と組織内に共局在する、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
  4. 前記その抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、及び単一ドメインＬ鎖抗体から成る群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  5. 前記ＡＢが、前記ＣＭ１に連結され、及び／又は任意に
    前記ＡＢが前記ＣＭ１に直接連結され、及び／又は任意に
    前記ＡＢが連結ペプチドを介して前記ＣＭ１に連結されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  6. 前記ＡＢが、ＣＭ２に連結され、及び／又は任意に
    前記ＡＢが前記ＣＭ２に直接連結され、及び／又は任意に
    前記ＡＢが連結ペプチドを介して前記ＣＭ２に連結されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  7. 前記単離ポリペプチドが、マスキング部分（ＭＭ）を含み、及び／又は任意に
    前記ＭＭが、前記標的への結合についての前記ＡＢの解離定数よりも高い、前記ＡＢへの結合についての解離定数を有し、及び／又は任意に
    前記ＭＭが、４０アミノ酸以下の長さのポリペプチドである、
    請求項１～６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  8. 前記ＭＭは、未切断状態での単離ポリペプチドが、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＭＭを含むように、前記ＣＭ１に連結され、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、前記ＭＭと前記ＣＭ１との間に連結ペプチドを含み、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、ＣＭ２と前記ＡＢとの間に連結ペプチドを含み、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを含み、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１とＣＭ２との間に第三連結ペプチド（ＬＰ’）を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
  9. 前記ＭＭは、未切断状態での前記単離ポリペプチドが、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＣＭ２－ＣＭ１－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ１－ＣＭ２－ＭＭを含むように、前記ＣＭ２に連結され、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、前記ＭＭと前記ＣＭ２との間に連結ペプチドを含み、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１と前記ＡＢとの間に連結ペプチドを含み、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを含み、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１とＣＭ２との間に第三連結ペプチド（ＬＰ’）を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
  10. 前記単離ポリペプチドが、第一連結ペプチド（ＬＰ１）及び第二連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そしてここで、前記単離ポリペプチドが、未切断状態で以下のＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ２－ＡＢ、ＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ、ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ２－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ、又はＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ１－ＣＭ２－ＬＰ１－ＭＭ、を有し、及び／又は任意に
    前記２種の連結ペプチドが、互いに同一である必要がなく、及び／又は任意に
    各ＬＰ１及びＬＰ２が、長さが約１～２０アミノ酸のペプチドであり、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、ＣＭ１とＣＭ２との間に第三連結ペプチド（ＬＰ’）を含む、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
  11. 前記ＭＭのアミノ酸配列が、前記標的の配列と異なり、そして、前記ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列に対して１０％以下の同一性である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  12. 前記ＭＭが、切断状態で前記標的に結合するために、前記ＡＢに干渉しないか、又は競合しない、請求項７～１１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  13. 前記単離ポリペプチドが、配列番号４２０、４３２、５６１、及び５６２から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列、並びに配列番号６７を含むＨ鎖アミノ酸配列を含み、及び／又は任意に
    前記単離ポリペプチドが、配列番号４４９、５５９、及び５６０から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列、並びに配列番号１０８を含むＨ鎖アミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  14. 剤をコンジュゲートした、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドを含み、及び／又は任意に
    前記前記剤がリンカーを介して前記ＡＢにコンジュゲートされており、及び／又は任意に
    前記リンカーが、切断可能もしくは切断不可能なリンカーである、コンジュゲート単離ポリペプチド。
  15. 前記剤が、毒素又はその断片であり、及び／又は任意に
    前記剤が、微小管阻害剤であり、及び／又は任意に
    前記剤が、核酸損傷剤であり、及び／又は任意に
    前記剤が、ドラスタチン又はその誘導体、アウリスタチン又はその誘導体、マイタンシノイド又はその誘導体、デュオカルマイシン又はその誘導体、及びカリケアマイシン又はその誘導体から成る群から選択され、及び／又は任意に
    前記剤が、オーリスタチンＥ又はその誘導体であり、及び／又は任意に
    前記剤が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、及び／又は任意に
    前記剤が、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）であり、及び／又は任意に
    前記剤が、ＤＭ１及びＤＭ４から成る群から選択されるマイタンシノイドである、請求項１４に記載のコンジュゲート単離ポリペプチド。
  16. 前記剤が、検出可能成分であり、及び／又は任意に
    前記検出可能成分が、診断用薬である、請求項１４に記載のコンジュゲート単離ポリペプチド。
  17. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド又は請求項１４～１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート単離ポリペプチドと、担体とを含み、任意に追加の剤を含み、任意に前記追加の剤が治療剤である、医薬組成物。
  18. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドをコードする単離核酸分子。
  19. 請求項１８に記載の単離核酸分子を含むベクター。
  20. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドの発現に導く条件下で細胞を培養することによって単離ポリペプチドを製造する方法であって、ここで、前記細胞が請求項１８に記載の核酸分子を含む、方法。
  21. 活性化状態で標的に結合する活性化可能抗体を製造する方法であって、以下の：
    （ａ）請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドをコードする核酸構築物を含む細胞を培養し；そして
    （ｂ）活性化可能抗体を採取すること、
    を含む方法。
  22. 障害又は疾患の治療、障害又は疾患の症状の緩和、あるいは障害又は疾患進行の遅延のために使用される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドであって、
    任意に、前記障害又は疾患が癌である、単離ポリペプチド。
  23. 障害又は疾患の治療、障害又は疾患の症状の緩和、あるいは障害又は疾患進行の遅延のために使用される、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート単離ポリペプチドであって、
    任意に、前記障害又は疾患が癌である、コンジュゲート単離ポリペプチド。
  24. 障害又は疾患の治療、障害又は疾患の症状の緩和、あるいは障害又は疾患進行の遅延のために使用される、請求項１７に記載の医薬組成物であって、
    任意に、前記障害又は疾患が癌である、医薬組成物。
  25. 障害又は疾患の治療、障害又は疾患の症状の緩和、あるいは障害又は疾患進行の遅延のための医薬の製造における、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート単離ポリペプチド、又は請求項１７に記載の医薬組成物の使用であって、
    任意に、前記障害又は疾患が癌である、使用。
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