JP2020504123A - Klk6媒介性cns特異的抗体プロドラッグ活性化 - Google Patents
Klk6媒介性cns特異的抗体プロドラッグ活性化 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020504123A JP2020504123A JP2019535841A JP2019535841A JP2020504123A JP 2020504123 A JP2020504123 A JP 2020504123A JP 2019535841 A JP2019535841 A JP 2019535841A JP 2019535841 A JP2019535841 A JP 2019535841A JP 2020504123 A JP2020504123 A JP 2020504123A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- klk6
- peptide
- disease
- cns
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Neurology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
中枢神経系(CNS)においてプロテアーゼKLK6によって選択的に活性化され得る抗体プロドラッグには、前記CNSにおいて疾患または障害を治療するための抗体、抗体の重鎖および/または軽鎖のN末端に融合したKLK6切断可能ペプチド、およびKLK6切断可能ペプチドのN末端に融合したブロッカーが含まれる。前記疾患または障害は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患である。
Description
本発明は、一般にCNS関連疾患の治療のための抗体に基づく分子に関する。
治療は、しばしば有害作用に関連している。有害作用を最小減に抑えるために、治療薬の特異性、すなわち疾患剤または細胞/組織だけを攻撃することを改善する必要がある。しかし、そのような選択性を有することが常に可能とは限らない。例えば、抗体は、それらの標的抗原に対して高い親和性で非常に特異的であり、一部の疾患では治療的または診断的適用について承認されている。しかし、標的抗原発現は、必ずしも疾患特異的ではない。そのため、大部分の治療用抗体は、疾患病変を標的とすることに加えて、正常組織も標的とすることがあり、それによって有害作用を引き起こすことがある。
有害作用を減らすためのもう一つのアプローチは、治療薬を標的部位だけで活性化されるプロドラッグとして送達することである。多くのプロドラッグが望ましくない副作用を低減させるのに効果的であることが示されている。しかし、大部分のプロドラッグは小分子である。
中枢神経系(CNS)は、治療薬を特異的に標的化することに特有の課題を提示する。そのため、CNS疾患または障害の治療へのより良好なアプローチが依然として必要とされている。
本発明の実施形態は、抗原認識機能の低下したプロドラッグ抗体(プロ抗体)を製造するために抗体のN末端と融合するKLK6基質を含有する組換えタンパク質またはペプチドの使用に関する。これらのプロ抗体は、高濃度のKLK6プロテアーゼを有する組織、例えばCNSなどにおいて活性化させることができる。
本発明の発明者らは、プロ抗体中のKLK6基質配列が、血清中のKLK6の濃度が低いために血清中でKLK6によって切断されないことを見出した。対照的に、プロ抗体は、CNS中のKLK6の濃度が高いために、CNSにおいてKLK6によって切断される。そのため、抗体の機能は、有害作用を防ぎ、末梢組織における抗体の消耗を最小減に抑えるために、末梢血中で抑制され得る。これらのプロ抗体は、CNSに入った後に、活性化してCNS関連疾患または障害を標的化できる。
一態様では、本発明の実施形態は、中枢神経系(CNS)においてプロテアーゼKLK6によって選択的に活性化され得る抗体プロドラッグに関する。本発明の一実施形態による抗体プロドラッグには、CNSにおいて疾患または障害を治療するための抗体、またはその結合フラグメント、抗体の重鎖および/または軽鎖のN末端に融合したKLK6切断可能ペプチド、およびKLK6切断可能ペプチドのN末端に融合したブロッカーが含まれる。
本発明の実施形態によれば、中枢神経系(CNS)における疾患または障害は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患であり得る。
本発明の実施形態によれば、ブロッカーは、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドを含む。本発明の実施形態によれば、KLK6切断可能ペプチドは、天然のKLK6基質、ペプチドファージライブラリー、合成ペプチドライブラリー、またはKLK6によって切断され得るペプチド配列に由来する。
本発明の実施形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体もしくはその結合フラグメント、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体(ADC)、免疫サイトカイン、免疫ホルモン、または免疫毒素である。抗体は、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。本発明の実施形態によれば、抗体は任意の適した抗体、例えば抗VEGF抗体または抗PD−1抗体であり得る。
本発明のもう一つの態様では、本発明の実施形態は、CNSにおける疾患または障害を治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、有効量の本発明の抗体プロドラッグ(すなわちプロ抗体)を、それを必要とする対象に投与することを含む。
有効量は、望ましい治療効果を達成できる量である。当業者は、有効量が病状、投与経路、患者の状態(例えば、年齢、体重、性別等)に依存することを理解し、当業者は過度の実験を行うことなく有効量を決定することが可能であろう。例えば、本発明の実施形態によれば、有効量は、患者の体重に基づいて0.1μg/Kg〜10mg/Kg、好ましくは1μg/Kg〜1mg/Kg、より好ましくは1μg/Kg〜0.1mg/Kgの範囲であり得る。
本発明のその他の態様および利点は、以下の説明および添付される特許請求の範囲によって明らかであろう。
定義
本明細書において、用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、または抗体薬物複合体(ADC)をさす。「抗体薬物複合体」は、免疫サイトカイン、免疫ホルモン、または免疫毒素であり得る。用語「免疫サイトカイン」とは、組換え抗体−サイトカイン融合タンパク質をさす。用語「免疫ホルモン」とは、組換え抗体−ホルモン融合タンパク質をさす。免疫ホルモンの一例は、抗体−レプチン融合タンパク質である。用語「免疫毒素」とは、組換え抗体−毒素複合体をさす。抗体の結合フラグメントは、scFv、Fab、またはF(ab’)2であり得る。
本明細書において、用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、または抗体薬物複合体(ADC)をさす。「抗体薬物複合体」は、免疫サイトカイン、免疫ホルモン、または免疫毒素であり得る。用語「免疫サイトカイン」とは、組換え抗体−サイトカイン融合タンパク質をさす。用語「免疫ホルモン」とは、組換え抗体−ホルモン融合タンパク質をさす。免疫ホルモンの一例は、抗体−レプチン融合タンパク質である。用語「免疫毒素」とは、組換え抗体−毒素複合体をさす。抗体の結合フラグメントは、scFv、Fab、またはF(ab’)2であり得る。
用語「タンパク質のN末端に融合した」とは、タンパク質のN末端で融合タンパク質を形成することをさす。用語「ブロッカー」とは、抗体の活性を低下または遮断するために、すなわち抗体をプロドラッグに変換するために使用されるペプチドまたはタンパク質をさす。その上、ブロッカーを用いてCNS系への送達を促進することができる、例えば、Yu,Y.J.et al.,“Boosting brain uptake of a therapeutic antibody by reducing its affinity for a transcytosis target,”Sci.Trans.Med.3,84ra44(2011)を参照されたい。
用語「KLK6切断可能ペプチド」とは、トリプシン様プロテアーゼであるKLK6によって切断され得るペプチドをさす。多様なKLK6切断可能ペプチド配列が当技術分野で公知であり、当業者は特定の配列が過度の実験を行うことなくKLK6によって切断され得るかどうかを容易に決定することができる。
本発明の実施形態は、中枢神経系(CNS)における疾患または障害の治療のための治療用抗体に関する。これらの抗体は、プロドラッグ(プロ抗体)の形態であり、これには、抗体と標的抗原の結合を遮断するために抗体の可変ドメインのN末端に結合したペプチドフラグメント(ブロッキングペプチド、またはブロッカー)が含まれる。ブロッキングペプチドは、特定のプロ酵素のプロペプチドに類似している。選択的プロテアーゼによるブロッキングペプチドの切断により、活性抗体が放出される。
本発明の実施形態は、プロ抗体の特異的活性化をカリクレイン−6(KLK−6)に頼る。具体的には、本発明の実施形態は、KLK6基質を含有する組換えタンパク質またはペプチドを用いて抗体のN末端と融合する。KLK6基質含有組換えタンパク質またはペプチドは、プロペプチドのように機能して、抗体の抗原認識機能を遮断するかまたは低下させる。
KLK6基質は、末梢血中の血清中のKLK6の濃度が低いために、血液循環中のKLK6によって認識される程度には切断されないであろう。しかし、KLK6基質含有組換えタンパク質またはペプチドは、CNS中で見出される濃度のKLK6によって効率的に切断され得る。そのため、抗体の機能を末梢血中で遮断または最小化して、有害作用を防ぎ、抗体の不要な消耗を減らすことができる。これらのプロ抗体は、CNSに入った後に、活性化してCNS関連疾患を標的化できる。
ヒトカリクレイン(KLK)ファミリーには、様々な組織で発現する15の分泌セリンプロテアーゼが含まれる。これらの中で、KLK6は、CNSにおいて高度に発現することが見出されており、乳癌および卵巣癌組織においても過剰発現する。ザイム、プロテアーゼM、およびニューロシンとしても公知であるKLK6は、トリプシン様セリンプロテアーゼである。KLK6はCNSの乏突起神経膠細胞で構成的に発現し、その発現は脊髄損傷(SCI)後および活動性多発性硬化症(MS)病変で増強される。ヒトミエリン塩基性タンパク質(MBP)、βアミロイドペプチド(Aβ)、プラスミノゲン、ミエリン、およびα−シヌクレイン等を含む、多くのタンパク質がKLK6によって切断されることが示されている。
様々なヒトの体液中のKLK6レベルが決定されており、KLK6は、血液循環と比較して、脳脊髄液(CSF)において有意に濃縮されていることが見出されている。この発現レベルの差異が、CNSでのプロドラッグ活性化の機会を可能にする。
本発明の実施形態によれば、望ましくない副作用を減らすために、末梢血での機能が低下した抗体プロドラッグが開発された。これらの抗体プロドラッグは、中枢神経系でKLK6によって活性化される。本発明は、様々なCNS関連疾患、例えば、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患に適用できる。
図1は、KLK6に媒介されるCNS特異的抗体プロドラッグ作用の戦略を示す。本発明の実施形態によれば、抗体の軽鎖および/または重鎖のN末端をブロッカー(ブロッキングペプチド)と融合させて抗体をプロドラッグ(すなわちプロ抗体)に変換することができる。ブロッカーは、抗体の抗原認識を低下させる。ブロッカーはKLK6によって切断され得るペプチド配列を含む。ペプチド配列はKLK6基質(KLK6s)として機能する。
本発明の一部の実施形態によれば、軽鎖N末端だけがブロッカーを含む。本発明のその他の実施形態によれば、重鎖N末端だけがブロッカーを含む。抗原−抗体結合は重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインを伴うので、重鎖または軽鎖のいずれかのN末端を遮断すれば抗原−抗体結合を妨害するのに十分となろう。
本発明の一部の実施形態によれば、軽鎖N末端と重鎖N末端の両方がそれぞれブロッカーを含む。重鎖と軽鎖の両方の可変領域を二重に遮断することにより、抗原−抗体相互作用のより良好な遮断を生成することができる。
本発明の実施形態によれば、ブロッカーは、活性抗体が特定の濃度を超えるKLK6を有する環境においてのみ放出されるように、KLK6基質を含有するタンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドを含む。KLK6は、トリプシン様プロテアーゼであることが示されており、アルギニン残基のカルボキシル側で切断することを好む。Liらは、KLK6が、P1位がArgによって占められ、SerがP1’で強く優先されるペプチド基質を好むことを見出した。(Protein Sci.,17(4):664−672(2008))。Magklalraら(Biochem.Biophys.Res.Commun.,307(4):948−55(2003))も、KLK6はLysよりもArgの後ではるかに高い効率で切断し、P2位ではSerまたはProが優先されることを見出した。この情報に基づいて、KLK6によって効率的に切断されるペプチド配列を設計することができる。当業者は、多くのペプチド配列がこれらの基準を満たし、本発明の実施形態がこの説明に使用される特定の例に限定されないことを理解するであろう。そのようなペプチドは、本明細書において一般にKLK6基質(またはKLK6s)と呼ばれる。
本発明の実施形態は、KLK6が末梢血よりもはるかに高い濃度でCNSに存在するという知見に基づく。末梢血中のKLK6の濃度は0〜12.6μg/Lの範囲であるが、CNS中のKLK6の濃度は41〜2053μg/Lの範囲である。末梢血とCNSとの間のこのKLK6濃度の有意な違いによって、本発明のブロッカー融合抗体(プロ抗体)は、末梢血中ではその低い活性を維持して有害作用を防ぐことができるが、CNS中ではその治療機能のためにKLK6によって活性化され得る。
以下の説明は、本発明の実施形態を説明するために具体例を使用する。当業者は、これらの例が例示のためだけのものであり、本発明の範囲から逸脱することなくその他の変形および変更が可能であるので本発明の範囲を限定するものではないことを理解するであろう。
以下の例では、様々な融合タンパク質が、所望の配列を含有する発現ベクター構築することによって調製される。当技術分野で公知の任意の適したベクターが使用されてよい。以下の例では、KLK6s含有ペプチド/タンパク質融合抗体を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって構築し、pTCAE8ベクター(プラスミド)の多重クローニング部位にクローニングした。これらのタンパク質およびベクターの特定のcDNA配列は当技術分野で公知であり、容易に入手可能である。使用される方法は従来のものである。様々なベクターおよび試薬は、商業的供給源から入手することができる。したがって、当業者はこれらの試薬を入手し、過度の実験を行うことなく記載される実験を行うことが可能であろう。
実施例1:プロ抗体からのブロックタンパク質の特異的切断
この実施例では、アバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sをプロ抗体として使用して、アバスチンFabを放出するKLK6の能力を試験する。融合タンパク質(プロ抗体)を、それぞれ血清濃度、CSF濃度、1μM、または2μMのKLK6とともに24時間インキュベートする。図2は、KLK6基質(KLK6s)含有タンパク質融合抗体FabのインビトロKLK6切断の結果を示す。この実施例では、KLK6s(KLK6基質配列)は、好ましいKLK6切断部位−R−S−を含むYMTRSAMG(配列番号1)の配列を有するオクタペプチドである。
この実施例では、アバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sをプロ抗体として使用して、アバスチンFabを放出するKLK6の能力を試験する。融合タンパク質(プロ抗体)を、それぞれ血清濃度、CSF濃度、1μM、または2μMのKLK6とともに24時間インキュベートする。図2は、KLK6基質(KLK6s)含有タンパク質融合抗体FabのインビトロKLK6切断の結果を示す。この実施例では、KLK6s(KLK6基質配列)は、好ましいKLK6切断部位−R−S−を含むYMTRSAMG(配列番号1)の配列を有するオクタペプチドである。
タンパク質をSDS−PAGEによって分離し、クーマシーブリリアントブルーR−250(CBR)で染色するか(図2A)またはウエスタンブロットによって分析した(図2B)。対照(レーン1、2、および3)と比較して、血清濃度のKLK6は、ブロッカーの切断に効果がなかったが(レーン4)、CSF濃度またはそれよりも高濃度のKLK6は、矢印によって示される切断タンパク質(レーン5、6、および7)から明らかなように、効率的な切断を示した。
これらの結果は、本発明の実施形態によるプロ抗体が末梢血中に残存し、CNS中で一度効率的に活性化され得ることを示す。
実施例2:プロ抗体および再活性化抗体による抗原結合
この実施例では、抗VEGF Fab(Lucentics(登録商標);ラニビズマブ)またはアバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sの結合速度を表面プラズモン共鳴(SPR)(BIAcore)によって求める。図3は、KLK6消化の前後のKLK6基質(KLK6s)含有タンパク質融合抗体Fabの抗原認識能を示す。Lucentics(登録商標)対照と比較して(図3A)、KLK6消化の無いアバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sは、その抗原VEGFに対する結合親和性を示さなかった(図3B)。対照的に、KLK6消化後のアバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sは、VEGFに対して良好な結合親和性を示した(図3C)。
この実施例では、抗VEGF Fab(Lucentics(登録商標);ラニビズマブ)またはアバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sの結合速度を表面プラズモン共鳴(SPR)(BIAcore)によって求める。図3は、KLK6消化の前後のKLK6基質(KLK6s)含有タンパク質融合抗体Fabの抗原認識能を示す。Lucentics(登録商標)対照と比較して(図3A)、KLK6消化の無いアバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sは、その抗原VEGFに対する結合親和性を示さなかった(図3B)。対照的に、KLK6消化後のアバスチンFabに融合したレプチン−KLK6sは、VEGFに対して良好な結合親和性を示した(図3C)。
これらの結果は、ブロッキングペプチド/タンパク質がプロ抗体のその抗原との結合を防止するのに有効であること、そしてブロッカー(プロペプチドまたはプロタンパク質)の切断後に、活性抗体が放出されてその標的に特異的に結合できたことを示す。これらの結果は本発明のアプローチの正当性を立証する。
実施例3:プロペプチドのKLK6切断の効率
この実施例では、アバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sをCSF濃度のKLK6とともにそれぞれ6、24、または48時間インキュベートした。ここで、FR1ペプチドはアバスチンのフレームワーク領域1である。次に、タンパク質をSDS−PAGEによって分離し、CBRで染色した。図4は、抗体に融合したKLK6基質(KLK6s)含有ペプチドのインビトロKLK6切断の結果を示す。対照(レーン1)と比較して、異なる時点のCSF濃度のKLK6は、矢印で示されるように切断されたタンパク質を示した。6時間で切断は実質的に終了し、切断が極めて効率的であることを示している。
この実施例では、アバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sをCSF濃度のKLK6とともにそれぞれ6、24、または48時間インキュベートした。ここで、FR1ペプチドはアバスチンのフレームワーク領域1である。次に、タンパク質をSDS−PAGEによって分離し、CBRで染色した。図4は、抗体に融合したKLK6基質(KLK6s)含有ペプチドのインビトロKLK6切断の結果を示す。対照(レーン1)と比較して、異なる時点のCSF濃度のKLK6は、矢印で示されるように切断されたタンパク質を示した。6時間で切断は実質的に終了し、切断が極めて効率的であることを示している。
実施例4:KLK6によるブロッカーの時間依存的切断
この実施例では、抗VEGF抗体(アバスチン)、またはアバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sの結合速度をSPR(BIAcore)によって求める。図5は、KLK6消化の前後の、抗体に融合したKLK6基質(KLK6s)含有ペプチドの抗原認識能の結果を示す。アバスチン対照(図5A)と比較して、KLK6消化の無いアバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sは、その抗原VEGFとの結合親和性の低下を示した(図5Bの0時)が、KLK6消化時間の増加とともに、アバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sはVEGF結合のために再活性化された(それぞれ、図5C、5D、および5Eの6、24、および48時間)。これらの結果は、本発明の実施形態がKLK6によって活性化され得ることを裏付ける。
この実施例では、抗VEGF抗体(アバスチン)、またはアバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sの結合速度をSPR(BIAcore)によって求める。図5は、KLK6消化の前後の、抗体に融合したKLK6基質(KLK6s)含有ペプチドの抗原認識能の結果を示す。アバスチン対照(図5A)と比較して、KLK6消化の無いアバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sは、その抗原VEGFとの結合親和性の低下を示した(図5Bの0時)が、KLK6消化時間の増加とともに、アバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sはVEGF結合のために再活性化された(それぞれ、図5C、5D、および5Eの6、24、および48時間)。これらの結果は、本発明の実施形態がKLK6によって活性化され得ることを裏付ける。
実施例5:異なるペプチドブロッカーおよびKLK6基質によるプロ抗体のKLK6媒介性ブロッカー切断
この実施例では、アバスチンと融合した異なるKLK6s含有ペプチドブロッカーを、CSF濃度のKLK6とともに24時間インキュベートする。図6は、SDS−PAGEにより分析され、CBRで染色された、KLK6s含有ペプチド融合アバスチンのインビトロKLK6切断の結果を示す(図6Aおよび6B)。アバスチンと融合したブロッカーを含有する全てのKLK6切断可能ペプチドは、KLK6によって切断され得る。KLK6消化の前後のVEGFとアバスチンまたはアバスチン誘導体との相互作用は、SPR(BIAcore)によって決定される(図6C)。
この実施例では、アバスチンと融合した異なるKLK6s含有ペプチドブロッカーを、CSF濃度のKLK6とともに24時間インキュベートする。図6は、SDS−PAGEにより分析され、CBRで染色された、KLK6s含有ペプチド融合アバスチンのインビトロKLK6切断の結果を示す(図6Aおよび6B)。アバスチンと融合したブロッカーを含有する全てのKLK6切断可能ペプチドは、KLK6によって切断され得る。KLK6消化の前後のVEGFとアバスチンまたはアバスチン誘導体との相互作用は、SPR(BIAcore)によって決定される(図6C)。
アバスチン対照と比較して、KLK6消化無しではアバスチンに融合したブロッカーを含有する異なるKLK6切断可能ペプチドは、応答の低下を示したが、KLK6消化有りでは、アバスチンに融合したブロッカーを含有する異なるKLK6切断可能ペプチドはVEGF結合のために再活性化された。切断不能なリンカー配列(SSYISNYG;配列番号13)を有するアバスチンと融合したペプチドブロッカーにおいて、アバスチンと融合したペプチドブロッカーのVEGF結合能は、KLK6消化の前後で応答単位の低下を示した。これらの結果は、異なるブロッカー配列またはKLK6基質配列を有する本発明の実施形態が、KLK6によって活性化され得ることを実証した。この例では、ペプチドブロッカー配列およびKLK6s配列が表1に記載される。示されるように、ペプチドブロッカー配列には、KLK6基質配列を抗体配列から分離するためのスペーサーとして機能する特定のアミノ酸が含まれ得る。スペーサーは、KLK6が切断配列にアクセスできることを確実にするように機能する。切断配列のN末端側へのペプチドブロッカー配列は、任意のタンパク質または任意のペプチド配列であり得る。
実施例6:オプジーボ(登録商標)のプロ抗体からのペプチドブロッカーの特異的切断
この実施例では、抗PD−1mAbs(ニボルマブ;オプジーボ(登録商標))のN末端に融合したKLK6s含有ペプチドブロッカーを、CSF濃度のKLK6とともに24時間インキュベートする。図7Aは、SDS−PAGEによって分析され、CBRで染色された、KLK6s含有ペプチド融合オプジーボ(登録商標)のインビトロKLK6切断の結果を示す図である。KLK6s含有ペプチド融合オプジーボ(登録商標)は、KLK6によって切断され得る。KLK6消化の前後のPD−1と抗PD−1 mAb(オプジーボ(登録商標))またはオプジーボ(登録商標)誘導体との相互作用は、SPR(BIAcore)によって決定される(図7B)。オプジーボ(登録商標)対照と比較して、KLK6消化無しではオプジーボ(登録商標)に融合したKLK6s含有ペプチドブロッカーは、応答の低下を示したが、KLK6消化有りではオプジーボ(登録商標)に融合したKLK6s含有ペプチドブロッカーはPD−1結合のために再活性化された。これらの結果は、異なる抗体に適用される本発明の実施形態が、KLK6によっても活性化され得ることを裏付ける。この例では、ペプチドブロッカー配列およびKLK6s配列が表2に記載される。
この実施例では、抗PD−1mAbs(ニボルマブ;オプジーボ(登録商標))のN末端に融合したKLK6s含有ペプチドブロッカーを、CSF濃度のKLK6とともに24時間インキュベートする。図7Aは、SDS−PAGEによって分析され、CBRで染色された、KLK6s含有ペプチド融合オプジーボ(登録商標)のインビトロKLK6切断の結果を示す図である。KLK6s含有ペプチド融合オプジーボ(登録商標)は、KLK6によって切断され得る。KLK6消化の前後のPD−1と抗PD−1 mAb(オプジーボ(登録商標))またはオプジーボ(登録商標)誘導体との相互作用は、SPR(BIAcore)によって決定される(図7B)。オプジーボ(登録商標)対照と比較して、KLK6消化無しではオプジーボ(登録商標)に融合したKLK6s含有ペプチドブロッカーは、応答の低下を示したが、KLK6消化有りではオプジーボ(登録商標)に融合したKLK6s含有ペプチドブロッカーはPD−1結合のために再活性化された。これらの結果は、異なる抗体に適用される本発明の実施形態が、KLK6によっても活性化され得ることを裏付ける。この例では、ペプチドブロッカー配列およびKLK6s配列が表2に記載される。
実施例7:プロ抗体活性化のインビトロ試験
この実施例では、アバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sを静脈注射によってBALB/cマウスに注射した。血清試料および脳試料をそれぞれ注射後0.08、2、4、および8時間に回収した。活性抗体および総抗体濃度をELISAによって決定した。
この実施例では、アバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sを静脈注射によってBALB/cマウスに注射した。血清試料および脳試料をそれぞれ注射後0.08、2、4、および8時間に回収した。活性抗体および総抗体濃度をELISAによって決定した。
図8は、マウスにおけるKLK6基質(KLK6s)含有ペプチド融合抗体のインビボ抗体活性化の結果を示す。血漿において、アバスチン−KLK6s−レプチンに融合した活性FR1ペプチド−KLK6sの割合は低下したレベルに維持されたが、脳においてアバスチン−KLK6s−レプチンに融合したFR1ペプチド−KLK6sは活性抗体の割合の増加を示した。これらの結果は、ブロッカー−KLK6s融合抗体がCNSにおいてインビボで再活性化され得ることを示す。
本発明の一部の実施形態は、CNS疾患を治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、有効量の本発明のプロ抗体をそれを必要とする対象に投与することを含む。プロ抗体は、抗体またはその結合フラグメントの重鎖および/または軽鎖のN末端と結合したブロッキングペプチドを含む。抗体の結合フラグメントは、Fab、scFv、またはF(ab’)2等であり得る。
本発明を限られた数の実施形態に関して説明してきたが、本開示の恩恵を受ける当業者であれば、本明細書に開示した本発明の範囲から逸脱しないその他の実施形態が考案され得ることを理解するであろう。例えば、他の抗体をこれらの例に示した抗体の代わりに使用してもよい。同様に、ブロッキングペプチドフラグメントには、KLK6基質配列によって抗体に連結された任意のタンパク質またはペプチドが含まれ得る。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
Claims (11)
- 中枢神経系(CNS)においてプロテアーゼKLK6によって選択的に活性化され得る抗体プロドラッグであって、
前記CNSにおいて疾患または障害を治療するための、抗体、またはその結合フラグメント、
前記抗体の重鎖および/または軽鎖のN末端に融合したKLK6切断可能ペプチド、および
前記KLK6切断可能ペプチドのN末端に融合したブロッカーを含む、
抗体プロドラッグ。 - 前記ブロッカーが、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドを含む、
請求項1に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記KLK6切断可能ペプチドが、天然のKLK6基質、ペプチドファージライブラリー、合成ペプチドライブラリー、またはKLK6によって切断され得るペプチド配列に由来する、
請求項1または2に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、または抗体薬物複合体(ADC)である、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記抗体薬物複合体が、免疫サイトカイン、免疫ホルモン、または免疫毒素である、
請求項4に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記抗体が他の抗体関連用途で使用され得る、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記抗体関連用途が、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞のためのものである、
請求項6に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記疾患または障害が、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患である、
請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記抗体が、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、
請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。 - 前記抗体が抗VEGF抗体または抗PD−1抗体である、
請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。 - CNSにおける疾患または障害を治療する方法であって、
有効量の請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグを、それを必要とする対象に投与することを含む、
方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662440296P | 2016-12-29 | 2016-12-29 | |
US62/440,296 | 2016-12-29 | ||
PCT/US2017/069135 WO2018126232A1 (en) | 2016-12-29 | 2017-12-29 | Klk6-mediated cns-specific antibody prodrug activation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020504123A true JP2020504123A (ja) | 2020-02-06 |
Family
ID=62710784
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019535841A Pending JP2020504123A (ja) | 2016-12-29 | 2017-12-29 | Klk6媒介性cns特異的抗体プロドラッグ活性化 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190203192A1 (ja) |
EP (1) | EP3598866A1 (ja) |
JP (1) | JP2020504123A (ja) |
CN (1) | CN110636856A (ja) |
AU (1) | AU2017388894A1 (ja) |
CA (1) | CA3048467A1 (ja) |
TW (1) | TW201834685A (ja) |
WO (1) | WO2018126232A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113563473A (zh) * | 2020-04-29 | 2021-10-29 | 三生国健药业(上海)股份有限公司 | 四价双特异性抗体、其制备方法和用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011510954A (ja) * | 2008-02-01 | 2011-04-07 | アセンディス ファーマ エーエス | 自己切断可能なリンカーを含むプロドラッグ |
WO2016118629A1 (en) * | 2015-01-20 | 2016-07-28 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3543256A1 (en) * | 2009-01-12 | 2019-09-25 | Cytomx Therapeutics Inc. | Modified antibody compositions, methods of making and using thereof |
WO2011133886A2 (en) * | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Genentech, Inc. | Production of heteromultimeric proteins |
AU2014274215B2 (en) * | 2013-05-28 | 2019-02-28 | Dcb-Usa Llc | Antibody locker for the inactivation of protein drug |
ES2955736T3 (es) * | 2014-05-06 | 2023-12-05 | Hoffmann La Roche | Producción de proteínas heteromultiméricas usando células de mamífero |
-
2017
- 2017-12-29 CN CN201780087571.5A patent/CN110636856A/zh active Pending
- 2017-12-29 AU AU2017388894A patent/AU2017388894A1/en not_active Abandoned
- 2017-12-29 CA CA3048467A patent/CA3048467A1/en not_active Abandoned
- 2017-12-29 EP EP17885861.9A patent/EP3598866A1/en not_active Withdrawn
- 2017-12-29 JP JP2019535841A patent/JP2020504123A/ja active Pending
- 2017-12-29 TW TW106146601A patent/TW201834685A/zh unknown
- 2017-12-29 WO PCT/US2017/069135 patent/WO2018126232A1/en unknown
- 2017-12-30 US US15/859,500 patent/US20190203192A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011510954A (ja) * | 2008-02-01 | 2011-04-07 | アセンディス ファーマ エーエス | 自己切断可能なリンカーを含むプロドラッグ |
WO2016118629A1 (en) * | 2015-01-20 | 2016-07-28 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3598866A1 (en) | 2020-01-29 |
CN110636856A (zh) | 2019-12-31 |
TW201834685A (zh) | 2018-10-01 |
CA3048467A1 (en) | 2018-07-05 |
WO2018126232A1 (en) | 2018-07-05 |
AU2017388894A1 (en) | 2019-08-08 |
US20190203192A1 (en) | 2019-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9777058B2 (en) | Methods of treating a tauopathy | |
US20200148771A1 (en) | Inducible monovalent antigen binding protein | |
TWI419704B (zh) | 預防及治療與補體相關之眼部病症 | |
WO2018097308A1 (ja) | リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子 | |
JP2022140856A (ja) | 誘導性結合タンパク質及びその使用方法 | |
JP7460819B2 (ja) | ヒト抗セマフォリン4d抗体 | |
US10858447B2 (en) | Anti-PCSK9 antibody and use thereof | |
CN111630062A (zh) | 具有可调节的配体结合活性的配体结合分子 | |
CN115943210A (zh) | 配体结合融合蛋白 | |
WO2019230868A1 (ja) | 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子 | |
JP2020504123A (ja) | Klk6媒介性cns特異的抗体プロドラッグ活性化 | |
AU2018214222A1 (en) | Inhibition of platelet aggregation using anti-human GPVI antibodies | |
EP3766512A1 (en) | Fc-modified il-12 for local cns delivery | |
JP2017510577A (ja) | 抗TNF−α抗体療法の賦活剤としてのCD64ブロック剤の使用法 | |
CN112442127A (zh) | 针对tfpi的单克隆抗体 | |
CN115215937B (zh) | 抗人masp-2抗体及其制备方法和应用 | |
WO2023025309A1 (zh) | 一种cdc平台抗体 | |
WO2023169559A1 (en) | Modified antibodies and uses thereof | |
JP2011524748A (ja) | 方法および組成物 | |
AU2021207010A1 (en) | Prophylactic or therapeutic agent for dementia | |
TW202421661A (zh) | Igf1r抗體 | |
CN110882391A (zh) | 抑制平滑肌的损伤后增生的药物组合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201225 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211026 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220524 |