CN112442127A - 针对tfpi的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药生物领域。具体而言，本发明公开了一种针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及其医药用途。

Description

针对TFPI的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及医药生物领域。具体而言，本发明公开了一种针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及其医药用途。
发明背景
血液凝固是血液形成稳定的凝块以使出血停止的过程。该过程涉及血液中循环的许多酶原和辅因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和辅因子原经由序贯或同时将它们转化成活化形式的数种途径而相互作用。最后，所述过程导致在存在因子Va、离子钙、和血小板的情况下由激活的因子X(FXa)将凝血酶原激活为凝血酶。激活的凝血酶继而诱导血小板聚集，而且将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，其然后被激活的因子XIII(FXIIIa)交联以形成凝块。
可以通过两种独特的途径来实现因子X激活：接触激活途径(以前称为内源性途径)和组织因子途径(以前称为外源性途径)。现在知道用于启动血液凝固的主要途径是组织因子途径。
因子X可以被与激活的因子VII(FVIIa)联合的组织因子(TF)激活。FVIIa和其必需的辅因子TF的复合物是凝固级联的有力引发剂。
凝固的组织因子途径受组织因子途径抑制剂(“TFPI”)的负控制。TFPI是FVIIa/TF复合物的一种天然的、FXa依赖性反馈抑制剂。它是多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物的成员。在生理学上，TFPI结合激活的因子X(FXa)以形成异二聚体复合物，其随后与FVIIa/TF复合物相互作用以抑制其活性，因此关闭凝固的组织因子途径。原则上，阻断TFPI活性可以恢复FXa和FVIIa/TF活性，因此延长组织因子途径作用的持续时间，而且放大FXa的生成。血友病A和B均缺乏FXa。
本领域仍然需要能够阻断TFPI活性的药剂例如TFPI特异性的抗体来治疗凝血相关疾病。
附图简述
图1示出人源化轻链与鼠源轻链(A)，人源化重链变体与鼠源重链(B)的氨基酸序列比对结果。
图2示出人源化h7G6抗体对hTFPI的亲和力。
图3示出人源化h7G6抗体对FXa-TFPI相互作用的阻断效果。
具体实施方式
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，术语“组织因子途径抑制剂”或“TFPI”指由细胞天然表达的人TFPI的任何变体、同种型和物种同系物。示例性的人TFPI包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段，例如抗肿瘤细胞抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗原结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗原的抗体。
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917；和Nelson et al.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，Harlow&Lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H’)和两条轻链(其可以标示为L和L’)和两个抗原结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab’)2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有最小的源自非人免疫球蛋白的序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面结构，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域，其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR)，CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”和“抗原结合位点”同义地用来指抗体内的识别并与相应抗原物理相互作用的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点，每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补决定区(CDR)。
如本文所用，“高变区”、“HV”、“互补决定区”和“CDR”和“抗体CDR”可交换地用来指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。例如，轻链可变区结构域包含3个CDR，命名为VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；重链可变区结构域包含3个CDR，命名为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。可变区中的3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。
如本文所述，本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如，Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。本领域中还已知对CDR的氨基酸残基进行编号的替代方法。例如，AbM CDR代表的是Kabat超变区和Chothia结构环的折中，并且在Oxford Molecular's AbM抗体建模软件中使用。“接触(Contact)”CDR则基于对可获得的复合物晶体结构的分析。来自每种方法的CDR的残基描述如下：
Figure BDA0002183502000000041
Figure BDA0002183502000000051
然而应注意，如本领域中所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。例如，CDR可以包括“扩展的(extended)CDR”，例如：在VL中的24-36或24-34(LCDR1)，46-56或50-56(LCDR2)以及89-97或89-96(LCDR3)；在VH中的26-35(HCDR1)，50-65或49-65(HCDR2)以及93-102、94-102或95-102(HCDR3)。
如本文所用，框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域；在氨基酸序列方面，FR区比高变区相对更保守。
如本文所用，“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域，其包含比可变区结构域的氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中，每条轻链具有单个轻链恒定区(CL)结构域，而每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域，包括CH1、CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM包含CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂，因此有助于与抗原相互作用以及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能，例如但不限于清除该抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×107M-1或1x 108M-1或更大的亲和常数Ka(或者1x 10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54；Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages 332-336(1989))。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，BiaCore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare LifeSciences；Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。
如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位，由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者，在第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低的情况中，可以但不必需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体的结合的情况中，无论是相同、更高或更低程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其片段)，本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。
如本文所用，“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用。
"分离的蛋白质"、"分离的多肽"或"分离的抗体"指所述蛋白质、多肽或抗体(1)不与在其天然状态下伴随其天然相关成分关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在天然中发生。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分"分离"。还可通过分离以使蛋白质实质上不含天然相关成分，即使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
在肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biology ofthe Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J AppliedMath 48:1073(1988))。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
“密码子优化”是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases:status for theyear2000.Nucl.Acids Res.，28:292(2000)。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。
二、针对TFPI的单克隆抗体
因此，在一方面，本发明提供一种针对TFPI的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:13具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:14具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:8具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:9具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在一些实施方案中，其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列；
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体是人源化抗体。
在一些实施方式中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或与SEQID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11具有约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或与SEQID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:6具有约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列(人源化重链可变区版本1)。在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列(人源化重链可变区版本2)。
在一些实施方式中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列(人源化轻链可变区版本1)。在一些实施方式中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列(人源化轻链可变区版本2)。在一些实施方式中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列(人源化轻链可变区版本3)。
在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链还包含人IgG4的恒定区或其变体，例如所述人IgG4的恒定区的变体包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链还包含人Igκ恒定区或其变体，例如所述人Igκ恒定区包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链包含选自SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列。
在一方面，本发明提供一种针对TFPI的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与包含SEQ ID NO:11的轻链可变区以及SEQ ID NO:6的重链可变区的抗体竞争结合TFPI。
在一方面，本发明提供一种针对TFPI的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与包含SEQ ID NO:11的轻链可变区以及SEQ ID NO:6的重链可变区的抗体结合TFPI上的相同表位。
在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合TFPI。在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够阻断FXa-TFPI之间的相互作用。
三、核酸、载体和抗体产生方法
在另一方面，本发明提供分离的核酸分子，其编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段。例如，所述核酸分子可以编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链。
在一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。
在一些实施方式中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:5和/或10所示核苷酸序列。
在一些实施方式中，本发明的核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
本发明还提供表达载体，其包含前述本发明的核酸分子。
本发明还提供宿主细胞，其由前述本发明的核酸分子或表达载体转化。
在另一方面，本发明提供一种生产本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(i)在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和
(ii)分离并纯化由所述宿主细胞表达的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及通过上述本发明的方法获得的分离的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合TFPI和/或能够阻断FXa-TFPI之间的相互作用。
四、医药用途
本发明单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗凝血相关疾病，例如遗传性或获得性凝血缺乏。例如，可以使用本发明单克隆抗体或其抗原结合片段来阻断TFPI与FXa的相互作用，或者阻止对TF/FVIIa活性的TFPI依赖性抑制。另外，还可以使用本发明单克隆抗体或其抗原结合片段来恢复TF/FVIIa驱动的FXa生成，从而避免FVIII或FIX依赖性FXa扩增不足。
本发明单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗凝血相关疾病，诸如血小板减少(thrombocytopenia)、血小板病症和出血病症(例如血友病如血友病A、血友病B和血友病C)。
因此，本发明提供一种治疗凝血相关疾病，诸如血小板减少(thrombocytopenia)、血小板病症和出血病症(例如血友病如血友病A、血友病B和血友病C)的方法，所述方法包括对有需要的患者施用治疗有效量的本发明单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明单克隆抗体或其抗原结合片段也可以用于治疗适应症诸如外伤和出血性中风(hemorrhagic stroke)中不受控制的出血。
因此，本发明还提供了一种用于缩短出血时间的方法，包括对有需要的患者施用治疗有效量的本发明单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明单克隆抗体或其抗原结合片段可以作为单一疗法或者与其他疗法联合使用以治疗凝血相关疾病。例如，本发明单克隆抗体或其抗原结合片段可以与凝固因子诸如因子VII、因子VIII或因子IX共施用来治疗血友病。
因此，本发明提供了一种用于治疗凝血相关疾病例如遗传性或获得性凝血缺乏的方法，包括施用本发明单克隆抗体或其抗原结合片段，和凝血因子。在一些实施方案中，所述凝固因子是因子VII、因子VIII或因子IX。在一些实施方案中，所述遗传性或获得性凝血缺乏例如是血友病。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学可接受的载体。
如本文所用，“药学可接受的载体”是可以添加至活性药物成分以帮助配制或稳定制剂而不对患者引起显著不利的毒物学效果的物质，包括但不限于崩解剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、等张剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂或润滑剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包括凝固因子，诸如因子VII、因子VIII或因子IX。
可以以推注或者通过连续输注来对有需要的患者施用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。例如，本发明的单克隆抗体的抗原结合片段的推注施用的量可以为0.0025至100mg/kg体重、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10-0.50mg/kg。对于连续输注，可以以0.001至100mg/kg体重/分钟、0.0125至1.25mg/kg/分钟、0.010至0.75mg/kg/分钟、0.010至1.0mg/kg/分钟或0.10-0.50mg/kg/分钟施用本发明的单克隆抗体的抗原结合片段，持续一段1-24小时、1-12小时、2-12小时、6-12小时、2-8小时、或1-2小时的时间。对于本发明的全长单克隆抗体，施用剂量可以是约1-10mg/kg体重、2-8mg/kg、或5-6mg/kg。此类全长抗体通常会通过延续一段30分钟至3小时的时间的输注来施用。施用频率将取决于状况的严重程度。频率范围可以为每周三次至每两周或每三周一次。
另外，可以经由皮下注射来对患者施用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。例如，可以经由皮下注射每周、每两周或每月对患者施用10至100mg剂量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。
实施例
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
实施例1：针对TFPI的单克隆抗体的生产
1.1免疫和融合
使用TFPI仅含有前2个Kunitz结构域的截段形式(SEQ ID NO:27)免疫小鼠，收获与hTFPI抗原(SEQ ID NO:28)有较强抗体特异性反应的多只小鼠脾细胞进行细胞整合生产杂交瘤细胞。
1.2 Elisa结合试验初步筛选阳性杂交瘤细胞
将同一浓度的hTFPI加入到TFPI杂交瘤细胞上清包被的酶标板上充分孵育，使得细胞上清中的TFPI抗体与hTFPI充分结合，然后加入过氧化物酶标记的Anti-6×His tagantibody，充分孵育后加TMB底物，过氧化物酶水解过氧化物产生氧自由基并氧化TMB生成蓝色产物，用硫酸终止反应后产物由蓝色变成黄色，在450nm处读OD值。通过OD值判断TFPI抗体的亲和力，OD值越高，则亲和力越强。最后选择了与hTFPI具有亲和性较强的35株细胞，具体结果见表1。
表1. 35株杂交瘤细胞上清结合试验结果
细胞株 OD值 细胞株 OD值 细胞株 OD值 细胞株 OD值
1B6 1.908 8F2 0.854 6D3 1.954 10D3 1.057
2A1 1.854 9C6 1.715 6F5 1.856 9F11 0.964
2G1 1.933 9C10 1.473 6H11 0.854 6E4 0.344
2B2 1.13 10H7 1.01 7D1 1.767 9D6 0.271
2H2 1.223 6E7 1.679 7H2 1.641 9C4 1.622
2F6 1.728 4F10 1.752 7G6 1.994 8A9 1.559
2G7 1.493 3A7 1.796 7H7 1.763 5B1 0.034
2F9 1.861 1D6 1.831 7D9 1.627 5G1 0.088
4B5 1.886 10F10 1.756 8H1 1.768
1.3 Elisa竞争试验初步筛选阳性杂交瘤细胞
包被2μg/mL FXa Protease(NEB，批号0941404)，BSA封闭之后加入同样稀释的TFPI杂交瘤细胞上清与50ng/mL hTFPI1(本公司自制，批号为TE20140825)充分孵育，再加入1:1500稀释的THETM His Tag Antibody[HRP]mAb,mouse(GenScript，批号为14C000744)，TMB显色后加入1M H2SO4终止液终止显色并于酶标仪上读数。以650nm为参比波长，在450nm和650nm处读OD值。根据检测数据分析TFPI抗体对FXa和hTFPI结合的阻断作用，筛选阻断效果好的细胞克隆。OD值越低，则TFPI抗体的阻断作用越好。表2为35株杂交瘤细胞上清的竞争实验结果，其中7G6表现出较好的阻断效果。
表2. 35株杂交瘤细胞上清的竞争试验结果
Figure BDA0002183502000000131
1.4 Elisa结合试验确定杂交瘤细胞亚克隆
对TFPI-7G6细胞株进行亚克隆，ELISA结合试验结果表明31株亚克隆细胞对hTFPI均有较强反应，试验方法同1.1。
表3. 31株TFPI-7G6亚克隆细胞结合试验结果
细胞株 OD 细胞株 OD 细胞株 OD
TFPI-7G6-1F2 1.362 TFPI-7G6-1A8 1.27 TFPI-7G6-2C9 1.293
TFPI-7G6-1H3 1.16 TFPI-7G6-1G8 1.277 TFPI-7G6-3G1 1.3
TFPI-7G6-1E9 1.335 TFPI-7G6-1D11 1.244 TFPI-7G6-3B5 1.292
TFPI-7G6-2E3 1.343 TFPI-7G6-1C12 1.244 TFPI-7G6-3B6 1.305
TFPI-7G6-2C6 1.367 TFPI-7G6-4A10 1.243 TFPI-7G6-3E7 1.422
TFPI-7G6-2C12 1.37 TFPI-7G6-4F9 1.261 TFPI-7G6-5F9 1.234
TFPI-7G6-2H8 1.493 TFPI-7G6-4B9 1.251 TFPI-7G6-5H5 1.227
TFPI-7G6-1E7 1.369 TFPI-7G6-5F11 1.351 TFPI-7G6-3H11 1.148
TFPI-7G6-2H2 1.301 TFPI-7G6-5B10 1.053 TFPI-7G6-4G3 1.197
TFPI-7G6-2B8 1.308 TFPI-7G6-5A10 1.254 TFPI-7G6-3A6 1.269
TFPI-7G6-2G8 1.268
然后对7G6的31株亚克隆细胞上清进行不同稀释度阻断实验，试验方法同1.2。
表4 31株TFPI-7G6亚克隆细胞竞争试验结果
Figure BDA0002183502000000132
Figure BDA0002183502000000141
考虑阻断效果以及细胞状态，选择7G6-2G8、7G6-5A10、7G6-1C12、7G6-5F11作为最终细胞株。
实施例2：小鼠TFPI-7G6抗体的克隆和测序
从4株杂交瘤细胞：7G6-2G8，7G6-5A10，7G6-1C12，7G6-5F11，克隆抗TFPI抗体的鼠重链和轻链序列。使用Takara的RANiso Plus试剂盒，从4株杂交瘤细胞中分别提取总DNA，并用作cDNA的模板。使用Takara的PrimeScript RTase从总RNA合成1st strand cDNA。用PCR扩增HC和LC可变区片段，并在末端加A。
扩增LC可变区引物对：
KF-1-EcoRV：GGTGATATCKTGMTSACCCAAWCTCCA(SEQ ID NO:1)
KR-BamHI：GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC(SEQ ID NO:2)
扩增HC可变区引物：
GF-2-PstI：AGGTSMAACTGCAGSAGTCWGG(SEQ ID NO:3)
GR-HindIII：CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT(SEQ ID NO:4)
通过凝胶电泳分离出PCR产物，使用来自AXYGEN的AxyPrep DNA Gel ExtractionKit回收目标重链轻链可变区基因片段，连接到T-vector中，转化至化学感受态Mach1-T1中。使用M13F/M13R对选择的菌落进行菌落PCR。阳性克隆送测序，测序引物M13F(-47)，测得一条重链可变区序列和一条轻链可变区序列，具体序列信息如下：
>VH核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTCACAAGTTATGGTATAAGTTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTTATCCTAGAAGTACTAATACTTACTACAATGAGAAGTTCATGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTTCATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAATCCTTCTATGGTGACTATGGGGCTATGGACTTCTGGGGTCAGGGAGCCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:5)
>VH氨基酸序列
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYSFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTYYNEKFMGKATLTADKSSSTAFMELRSLTSEDSAVYFCARESFYGDYGAMDFWGQGASVTVSS(SEQ ID NO:6)
>VH CDR1
SYGIS(SEQ ID NO:7)
>VH CDR2
EIYPRSTNTYYNEKFMG(SEQ ID NO:8)
>VH CDR3
ESFYGDYGAMDF(SEQ ID NO:9)
>VL核苷酸序列
GATATCGTGCTGACCCAATCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTTTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGAAAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTTATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGCCAAGGTACACATTTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:10)
>VL氨基酸序列
DIVLTQSPLTLSVTIGQPASIFCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCCQGTHFPRTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:11)
>VL CDR1
KSSQSLLESDGKTYLN(SEQ ID NO:12)
>VL CDR2
LVSKLDS(SEQ ID NO:13)
>VL CDR3
QGTHFPRT(SEQ ID NO:14)
实施例3：人源化的TFPI-7G6抗体的设计和构建
3.1 TFPI-7G6抗体的人源化
人源化方法采用蛋白表面氨基酸人源化(resurfacing)的方法及VH和VL人源化通用框架移植法(CDR grafting to a universal framework)完成。
人源化步骤如下：对抗体株7G6的VH以及VL分别进行同源建模，建模软件为Modeller9。参考VL同源序列PDB编号为：1nldL，VLK2；VH的同源序列的PDB编号为：1xgyI，VH1B。之后根据KABAT编号，将CDR区移植到人源同源序列框架中。同时，蛋白三维结构计算氨基酸的相对溶剂可及性(relative solvent accessibility)。对于未暴露在溶剂内的氨基酸，可适当替换为原始抗体序列相同位置的氨基酸。
对TFPI-7G6进行人源化，重链获得2种不同的人源化序列：h7G6VH-v1(SEQ ID NO:15)、hu7G6VH-v2(SEQ ID NO:16)；轻链获得3种不同的人源化序列：h7G6VL-v1(SEQ ID NO:17)、h7G6VL-v2(SEQ ID NO:18)、7G6VL-v3(SEQ ID NO:19)。图1列出这些人源化变体与鼠源抗体的比对结果。
3.2人源化的h7G6的表达载体的制备
根据上述抗体的人源化设计，合成(GENEWIZ)了人源化的h7G6-2-VH1、h7G6-2-VH2、h7G6-2-VL1、h7G6-2-VL2、h7G6-2-VL3的DNA序列。在构建体中包含各个LC和HC信号肽以及紧邻起始密码子上游的Kozak序列(5’-GCCACC-3’)。
基于蛋白数据库uniprot上人IgG4的恒定区氨基酸序列(P01861)，为了消除单体抗体片段(即由1个LC和1个HC组成的“半抗体”)的形成，将108位Ser替换为Pro，得到人IgG4-Fc区氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。通过密码子优化，基因合成得到编码人IgG4-Fc的核酸片段，再通过酶切连接得到由上述实施例获得的h7G6抗体重链可变区的编码氨基酸片段，并克隆至常规哺乳动物表达载体，得到h7G6抗体重链1(SEQ ID NO:21)和h7G6抗体重链2(SEQ ID NO:22)。通过DNA测序，验证最终构建体的序列。
根据蛋白数据库uniprot上人Ig kappa的恒定区氨基酸序列(P01834)，得到人Igkappa恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。通过密码子优化，基因合成得到编码人Igkappa恒定区的核酸片段，再通过酶切连接得到由上述实施例获得的h7G6抗体轻链可变区的编码氨基酸片段，并克隆至常规哺乳动物表达载体，得到h7G6抗体轻链1(SEQ ID NO:24)、h7G6抗体轻链2(SEQ ID NO:25)和h7G6抗体轻链3(SEQ ID NO:26)。通过DNA测序，验证最终构建体的序列。
3.3表达蛋白的质粒组合的选定
每ml细胞培养物中，使用0.2ugHC载体DNA+0.3ugLC载体DNA的混合物。其中抗体重链1与抗体轻链1组合为Hu7G61，抗体重链2和抗体轻链2组合为Hu7G62-v1，抗体重链2和抗体轻链3组合Hu7G62-v2。混合DNA转染HEK293细胞进行抗体表达。同时和最初的鼠源抗体进行比较。三种人源化序列以及最初的鼠源序列的表达水平和纯度见下表：
表5.
抗体 表达水平 SEC纯度
7G6 15mg/L 91.3％
Hu7G61 7mg/L 90％
Hu7G62-v1 30mg/L 99.2％
Hu7G62-v2 140mg/L 98.7％
上述结果表明，三种人源化抗体均能表达，且纯度>90％。其中后两种人源化序列在表达水平和纯度上都明显优于鼠源抗体母本。且最后一种人源化抗体Hu7G62-v2的表达水平最高。
3.4制备h7G6抗体蛋白
抗体重链2和抗体轻链3质粒混合物转染HEK293细胞进行抗体表达。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液，将每组质粒/PEI混合物分别加入HEK293细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L IGF-1。四小时后再补加EX293培养基、2mM谷氨酰胺和50μg/L IGF-1，135rpm培养。24小时后加3.8mM VPA。培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过Protein A亲和层析法，纯化得到目标hu7G6蛋白。
实施例4：鉴定hu7G6抗体蛋白的功能
4.1 h7G6抗体蛋白对hTFPI的亲和力
1)ELISA方法
hTFPI161蛋白0.5μg/孔4℃过夜包被平板。洗涤后加入上述实施例获得的h7G6抗体蛋白的梯度稀释系列，25℃±2℃孵育2h。洗涤后加入1:2000稀释的Mouse Anti-HumanIgG4 pFc’antibody[HP6023](HRP)，100μL/孔，25℃±2℃孵育2h。洗涤之后加入显色液，450/650nm波长处读吸光度值。应用软件SotfMax Pro v5.4进行数据处理和作图分析，通过四参数拟合，得到h7G6抗体对hTFPI161结合曲线及EC50值以反映抗体对hTFPI161的亲和能力。
结果见下表和图2，其中纵坐标为OD450，横坐标为h7G6抗体蛋白浓度(单位ng/mL)；Hu7G62-v2抗体蛋白对hTFPI161的有较好的亲和力。
表6.
Conc(ng/mL) hu7G6-2v2-G4ws
10000 2.785
3333.333 2.775
1111.111 2.824
370.37 2.816
123.457 2.189
41.152 1.399
13.717 0.677
4.572 0.279
1.524 0.106
0.508 0.048
0.169 0.027
EC<sub>50</sub>(ng/mL) 41.9
2)生物膜干涉法检测
本实验基于生物膜干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)技术检测了h7G6与人TFPI的亲和力。使用Fortibio的K2仪器。首先将KN057稀释至10μg/ml固化到Protein Abiosensor(型号18-5010)上，然后将hTFPI161-Chis稀释至30nM、15nM、7.5nM、3.75nM、1.875nM 5个浓度与h7G6结合，可检测到不同强度的结合信号。结果采用1:1模型拟合，计算得到样品的平衡常数(KD)值。分析得到的结果为：h7G6三批原液(180727DS、180808DS、180820DS)与人TFPI的KD分别为1.32E-09M、1.32E-09M、1.47E-09M，平均KD为(1.37±0.09)E-09M，RSD％为6.32％。
4.2 hu7G6抗体蛋白对FXa-TFPI相互作用的阻断效果
FXa Protease 0.2μg/孔4℃过夜包被平板，BSA封闭之后加入上述实施例获得的hu7G6抗体蛋白的梯度稀释系列，每孔100uL(稀释液中含有50ng/mL hTFPI161)，室温下反应1小时。洗涤之后加入按1:1500稀释的THETM His Tag Antibody[HRP]mAb,mouse，室温反应1小时。洗涤之后加入显色液，450/650nm波长处读取吸光度值。
应用软件SotfMax Pro v5.4进行数据处理和作图分析，通过四参数拟合，得到h7G6抗体对FXa-TFPI阻断曲线及EC50值。结果见图3，其中纵坐标为OD450，横坐标为h7G6抗体蛋白浓度(单位ng/mL)；Hu7G62-v2抗体蛋白能有效阻断FXa-TFPI之间的相互作用。
表7.h7G6抗体蛋白对FXa-TFPI相互作用的阻断效果
Conc(ng/mL) hu7G6-2v2(50ng/mL hTFPI161)
5000 0.220
1250 0.285
312.5 0.679
78.125 1.859
19.531 1.917
4.883 1.934
1.221 1.908
IC<sub>50</sub>(ng/mL) 222
实施例5：体内研究
28只新西兰兔，按体重随机分为4组：1-正常对照组(n＝4)、2-模型对照组(n＝8)、3-阳性对照组(n＝8)和4供试品组(n＝8)，雌雄各半。动物麻醉后，除正常对照组动物外，其余动物经耳缘静脉注射给予600μg/kg的BO2C11抗体(人凝血八因子中和抗体，序列来自文献：Structure of a factor VIII C2 domain–immunoglobulin G4k Fab complex:identification of an inhibitory antibody epitope on the surface of factorVIII)建立新西兰兔A型血友病模型。造模后10min通过耳缘静脉注射给予2mg/kg的供试品(h7G6抗体蛋白)或对照品(TFPI2021，此为Novartis的对照抗体)，正常对照组和模型对照组给予对应体积的PBS。给药后25min将动物左前肢置于37℃含有45mL生理盐水的溶液中预热，预热10min后用手术剪将动物左前肢第三个趾甲的顶端剪去，在流血的同时开始秒表测量出血时间，直至观察不到伤口处有血丝渗出为凝血观察终点，记录出血时间。
表8结果显示，出血时间由正常的6.3±2.3min(对照组)显著增加至28.1±14.4min(造模组)；给药后供试品和阳性对照品均可降低新西兰兔A型血友病的出血时间，且作用相似，说明Hu7G62-v2抗体对于治疗兔A型血友病有一定作用。
表8.各组动物出血时间
Figure BDA0002183502000000191
实施例6：剂量-效应关系的估测
将新西兰兔麻醉后，动物经耳缘静脉注射给予1mg/kg的anti-FVIII抗体(BO2C11)建立诱导的新西兰兔A型血友病模型。造模后10min通过耳缘静脉注射给予不同浓度(2/20mg/kg)的Hu7G62-v2抗体。35min后将动物左前肢第三个趾甲的顶端剪去，在流血的同时开始测量出血时间，直至观察不到伤口处有血丝渗出视为凝血观察终点。动物出血时间的观察上限为60min，若出血时间超过60min，则记为60min。具体分组与给药信息见表9。
表9分组给药信息
Figure BDA0002183502000000192
结果如表10所示：与对照组相比，注射anti-FVIII抗体后，兔出血时间明显延长(P＜0.01)，由正常的6.0±1.9min增加至54.0±13.4min。在单次静脉注射给予不同浓度的h7G6抗体后，动物出血时间明显缩短(P＜0.05)，并且呈现一定的剂量依赖性。通过检测血红蛋白可以反应观察期间内动物的出血量，结果表明，造模后血红蛋白含量明显增加，但在注射h7G6抗体后，血红蛋白含量均有所降低，说明h7G6抗体可以在缩短出血时间的同时，降低出血风险。
表10出血时间和血红蛋白含量
Figure BDA0002183502000000193
##：与对照组相比，P＜0.01；*：与模型组相比，P＜0.05；**：与模型组相比，P＜0.01。
实施例7：TFPI抗体在食蟹猴体内药代评估
本试验的目的是测定TFPI抗体在食蟹猴单次皮下多剂量和单次静脉给药后血浆中药物浓度，研究其在食蟹猴体内的药代动力学特征。同时比较静脉给药和皮下给药后TFPI抗体药物在食蟹猴体内的暴露差异和计算绝对生物利用度。
食蟹猴分为4组，每组包含3只雌性3只雄性动物。按照下表的剂量与方式给药。给药次数为一次。给药前和皮下注射结束后0.5、2、4、8、24、48、72(3天)、96(4天)、120(5天)、144(6天)、168(7天)、216(9天)、264(11天)、360(15天)、504(21天)、696(29天)、840(35天)，采血考察血药浓度。
表11.药代评估实验设计
Figure BDA0002183502000000201
得到的血药浓度数据通过Phoenix软件(版本号8.1)来计算相关药代参数。
所得结果如下表所示。
表12.药代评估实验结果
Figure BDA0002183502000000202
相关参数解释如下：
T1/2 消除半衰期
Cmax 最大血药浓度
Tmax 达到最大血药浓度时间
AUCnorm 药时曲线下的面积与给药剂量的比值
CL 清除率
MRT 平均滞留时间
Vss 表观分布容积
F％ 绝对生物利用度％
该结果与Jian-Ming Gu等人2017年发表的拜耳公司的TFPI抗体BAY1093884在食蟹猴中的药代数据(参考文献Gu J,Zhao X,Schwarz T,et al.Mechanistic Modeling ofthe Pharmacodynamic and Pharmacokinetic Relationship of Tissue Factor PathwayInhibitor-Neutralizing Antibody(BAY 1093884)in Cynomolgus Monkeys[J].AapsJournal,2017,19(4):1186-1195.)相比较，本发明的TFPI抗体在3mg/kg以及更高的剂量下，皮下注射，其体内半衰期以及药物平均滞留时间明显高于BAY1093884 5mg/kg皮下注射(T1/2＝25hr，MRT＝40hr for BAY1093884)；其相对药物暴露情况(通过AUCnorm表示)也明显高于BAY1093884(AUCnorm＝517kg hr/L)。同时，本发明的TFPI抗体在10mg/kg剂量下静脉注射时，其血药清除速率要明显低于BAY1093884在5mg/kg以及20mg/kg剂量下静脉给药的清除速率(1.2mL/hr/kg for 5mg/mL剂量组，0.6mL/hr/kg for20mg/kg剂量组)。上述结果说明，本发明的TFPI抗体与拜耳的BAY1093884相比，其在体内的循环时间更长，清除更慢；更低给药剂量下，其药物暴露情况更好。
序列表
>SEQ ID NO:1 引物KF-1-EcoRV
GGTGATATCKTGMTSACCCAAWCTCCA
>SEQ ID NO:2 引物KR-BamHI
GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC
>SEQ ID NO:3 引物GF-2-PstI
AGGTSMAACTGCAGSAGTCWGG
>SEQ ID NO:4 引物GR-HindIII
CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT
>SEQ ID NO:5 7G6VH核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTCACAAGTTATGGTATAAGTTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTTATCCTAGAAGTACTAATACTTACTACAATGAGAAGTTCATGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTTCATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAATCCTTCTATGGTGACTATGGGGCTATGGACTTCTGGGGTCAGGGAGCCTCAGTCACCGTCTCCTCA
>SEQ ID NO:6 7G6VH氨基酸序列
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYSFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTYYNEKFMGKATLTADKSSSTAFMELRSLTSEDSAVYFCARESFYGDYGAMDFWGQGASVTVSS
>SEQ ID NO:7 7G6 VH CDR1 KABATSYGIS
>SEQ ID NO:8 7G6 VH CDR2 KABATEIYPRSTNTYYNEKFMG
>SEQ ID NO:9 7G6 VH CDR3 KABATESFYGDYGAMDF
>SEQ ID NO:10 7G6VL核苷酸序列
GATATCGTGCTGACCCAATCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTTTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGAAAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTTATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGCCAAGGTAC
>SEQ ID NO:11 7G6VL氨基酸序列
DIVLTQSPLTLSVTIGQPASIFCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCCQGTHFPRTFGGGTKLEIK
>SEQ ID NO:12 7G6 VL CDR1 KABATKSSQSLLESDGKTYLN
>SEQ ID NO:13 7G6 VL CDR2 KABATLVSKLDS
>SEQ ID NO:14 7G6 VL CDR3 KABATQGTHFPRT
>SEQ ID NO:15 h7G6VH-v1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGEIYPRSTNTYYNEKFMGRVTMTRDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARESFYGDYGAMDFWGQGTLVTVSS
>SEQ ID NO:16 hu7G6VH-v2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYGISWVKQAPGQGLEWIGEIYPRSTNTYYNEKFMGKATLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARESFYGDYGAMDFWGQGTLVTVSS
>SEQ ID NO:17 h7G6VL-v1
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIK
>SEQ ID NO:18 h7G6VL-v2
DIVLTQSPLSLPVTPGEPASIFCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQGTHFPRTFGQGTKVEIK
>SEQ ID NO:19 7G6VL-v3
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQGTHFPRTFGQGTKVEIK
>SEQ ID NO:20 突变体人IgG4-Fc区氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
>SEQ ID NO:21 h7G6抗体重链1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGEIYPRSTNTYYNEKFMGRVTMTRDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARESFYGDYGAMDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
>SEQ ID NO:22 h7G6抗体重链2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYGISWVKQAPGQGLEWIGEIYPRSTNTYYNEKFMGKATLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARESFYGDYGAMDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
>SEQ ID NO:23 人Ig kappa恒定区氨基酸序列
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>SEQ ID NO:24 h7G6抗体轻链1
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>SEQ ID NO:25 h7G6抗体轻链2
DIVLTQSPLSLPVTPGEPASIFCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQGTHFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>SEQ ID NO:26 h7G6抗体轻链3
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQGTHFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>SEQ ID NO:27 hTFPI-K1K2
DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRIIKTTLQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDGPNGFQVDNYG
>SEQ ID NO:28 huTFPI(SP labeled as underline,3Kunitz domains labeledas bold)
MIYTMKKVHALWASVCLLLNLAPAPLNADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRIIKTTLQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDGPNGFQVDNYGTQLNAVNNSLTPQSTKVPSLFEFHGPSWCLTPADRGLCRANENRFYYNSVIGKCRPFKYSGCGGNENNFTSKQECLRACKKGFIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM
序列表
<110> 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司
<120> 针对TFPI的单克隆抗体
<130> I2019TC3296CB
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物KF-1-EcoRV
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> k is G or T
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> m is A or C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> s is C or G
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> w is A or T
<400> 1
ggtgatatck tgmtsaccca awctcca 27
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物KR-BamHI
<400> 2
gggaagatgg atccagttgg tgcagcatca gc 32
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物GF-2-PstI
<400> 3
aggtsmaact gcagsagtcw gg 22
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物GR-HindIII
<400> 4
ccaggggcca gtggatagac aagcttgggt gtcgtttt 38
<210> 5
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6VH核苷酸序列
<400> 5
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agttatggta taagttgggt gaagcagaga 120
actggacagg gccttgagtg gatcggagag atttatccta gaagtactaa tacttactac 180
aatgagaagt tcatgggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcgttc 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagagaatcc 300
ttctatggtg actatggggc tatggacttc tggggtcagg gagcctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6VH氨基酸序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6 VH CDR1 KABAT
<400> 7
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6 VH CDR2 KABAT
<400> 8
Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Met
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6 VH CDR3 KABAT
<400> 9
Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asp Phe
1 5 10
<210> 10
<211> 290
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6VL核苷酸序列
<400> 10
gatatcgtgc tgacccaatc tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atcttttgca agtcaagtca gagcctctta gaaagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttgcaga ggccaggcca gtctccaaag cgccttatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct gccaaggtac 290
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6VL氨基酸序列
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Phe Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6 VL CDR1 KABAT
<400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6 VL CDR2 KABAT
<400> 13
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6 VL CDR3 KABAT
<400> 14
Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6VH-v1
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Met Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hu7G6VH-v2
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6VL-v1
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6VL-v2
<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Phe Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7G6VL-v3
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 突变体人IgG4-Fc区氨基酸序列
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 21
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6抗体重链1
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Met Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 22
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6抗体重链2
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ala Met Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人Ig kappa恒定区氨基酸序列
<400> 23
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 24
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6抗体轻链1
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 25
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6抗体轻链2
<400> 25
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Phe Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h7G6抗体轻链3
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 27
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hTFPI-K1K2
<400> 27
Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr
35 40 45
Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn
50 55 60
Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn
65 70 75 80
Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe
85 90 95
Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg
100 105 110
Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly
115 120 125
Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys
130 135 140
Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly
145 150 155 160
<210> 28
<211> 304
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys
35 40 45
Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys
50 55 60
Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu
65 70 75 80
Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser
85 90 95
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile
100 105 110
Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu
115 120 125
Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn
130 135 140
Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly
145 150 155 160
Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu
165 170 175
Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn
180 185 190
Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu
195 200 205
Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly
210 215 220
Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly
225 230 235 240
Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn
245 250 255
Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile
260 265 270
Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys
275 280 285
Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met
290 295 300

Claims (24)

1.一种针对TFPI的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:13具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:14具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:8具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:9具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列；
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列。
3.权利要求1或2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源化抗体。
4.权利要求1-3中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:17-19所示的氨基酸序列。
8.权利要求3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列。
9.权利要求3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列。
10.权利要求3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体的重链还包含人IgG4的恒定区或其变体，例如所述人IgG4的恒定区的变体包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列。
12.权利要求11的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体的重链包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示氨基酸序列。
13.权利要求1-12中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体的轻链还包含人Igκ恒定区或其变体，例如所述人Igκ恒定区包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列。
14.权利要求13的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体的轻链包含选自SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
15.权利要求11-14中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列。
16.权利要求11-14中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列。
17.权利要求11-14中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列。
18.一种针对TFPI的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与包含SEQ ID NO:11的轻链可变区以及SEQ ID NO:6的重链可变区的抗体竞争结合TFPI。
19.一种针对TFPI的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与包含SEQ ID NO:11的轻链可变区以及SEQ ID NO:6的重链可变区的抗体结合TFPI上的相同表位。
20.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-19中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学可接受的载体。
21.权利要求20的药物组合物，其包括凝固因子，例如因子VII、因子VIII或因子IX。
22.权利要求1-19中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗凝血相关疾病的药物中的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述凝血相关疾病是遗传性或获得性凝血缺乏。
24.权利要求22或23的用途，其中所述凝血相关疾病是血友病例如血友病A、血友病B和血友病C。
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