ES2955736T3 - Producción de proteínas heteromultiméricas usando células de mamífero - Google Patents

Producción de proteínas heteromultiméricas usando células de mamífero Download PDF

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Abstract

En el presente documento se describen métodos para la producción eficaz de anticuerpos y otros complejos de proteínas multiméricas (denominados colectivamente en el presente documento proteínas heteromultiméricas) capaces de unirse específicamente a más de una diana. Las dianas pueden ser, por ejemplo, diferentes epítopos ubicados en una única molécula o ubicados en diferentes moléculas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de proteínas heteromultiméricas usando células de mamífero
Campo técnico
La presente invención se refiere a procedimientos para la producción de proteínas heteromultiméricas.
Antecedentes
Los anticuerpos monoclonales del tipo IgG contienen dos brazos de unión a antígeno idénticos y un dominio constante (Fc). Los anticuerpos con una especificidad diferente en sus brazos de unión normalmente no se producen en la naturaleza y, por lo tanto, se han de elaborar con la ayuda de ingeniería química (por ejemplo, reticulación química, etc.), ADN recombinante y/o tecnología de fusión celular.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden unir simultáneamente a dos antígenos diferentes. Esta propiedad permite el desarrollo de estrategias terapéuticas que no son posibles con los anticuerpos monoclonales convencionales. El gran panel de formatos de anticuerpos biespecíficos imaginativos que se ha desarrollado refleja el gran interés por estas moléculas. Véanse Berg J, Lotscher E, Steimer KS, et al., "Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain", Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88(11): 4723-4727 y Fischer N y Leger O., "Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies," Pathobiology (2007) 74:3-14.
Otra clase de moléculas multiespecíficas son las proteínas de fusión recombinantes. Las proteínas de fusión recombinantes que consisten en el dominio extracelular de proteínas inmunorreguladoras y el dominio constante (Fc) de inmunoglobulina (Ig) representan una clase creciente de agentes terapéuticos humanos. Las inmunoadhesinas combinan la región de unión de una secuencia de proteína, con una especificidad deseada, con el dominio efector de un anticuerpo. Las inmunoadhesinas tienen dos propiedades importantes que son significativas para su potencial como agentes terapéuticos: la especificidad de diana y la estabilidad farmacocinética (semivida in vivo que es comparable a la de los anticuerpos). Se pueden usar inmunoadhesinas como antagonistas para inhibir o bloquear interacciones perjudiciales o como agonistas para imitar o potenciar respuestas fisiológicas. Véase Chamow SM, Zhang Dz , Tan XY, et al., "A humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells", J Hematother 1995; 4(5): 439-446.
Otras moléculas multiespecíficas se han analizado en otra parte. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: Fisher et al., Pathobiology (2007) 74:3-14 (revisión de diversos formatos biespecíficos); patente de EE. UU. n.° 6.660.843, concedida el 9 de diciembre de 2003 a Feige et al. (pepticuerpos); publicación de patente de EE. UU. n.° 2002-004587 publicada el 10 de enero de 2002 (anticuerpos multiespecíficos); patente de EE. UU. n.° 7612181 concedida el 3 de noviembre de 2009 a Wu et al. (formato de dominio variable doble); patente de EE. UU. n.° 6.534.628, Nord K et al., Prot Eng (1995) 8:601-608, Nord K et al., Nat Biotech (1997) 15:772-777, y Gronwall et al., Biotechnol Appl Biochem. (2008) Jun; 50(Pt 2):97-112 (aficuerpos); Martens et al., Clin Cancer Res (2006), 12: 6144-6152 y Jin et al., Cancer Res (2008) 68(11):4360-4368 (anticuerpos de un brazo); Bostrom et al., Science (2009) 323:1610-1614 (Fab de doble acción, también conocidos como anticuerpos de valencia mixta). Otros formatos son conocidos para los expertos en la técnica.
La fabricación de material de calidad clínica sigue siendo un desafío para las moléculas multiespecíficas descritas anteriormente. Como se indica anteriormente, existen muchas vías para la producción de moléculas con brazos de unión mixtos, es decir, brazos de unión que no son idénticos entre sí. Cada uno de estos procedimientos tiene sus desventajas.
La reticulación química es laboriosa ya que puede que sea necesario que las especies pertinentes se purifiquen a partir de homodímeros y otros subproductos indeseables. Además, las etapas de modificación química pueden alterar la integridad de las proteínas dando lugar por tanto a una mala estabilidad. Por tanto, este procedimiento a menudo es ineficaz y puede dar lugar a una pérdida de actividad del anticuerpo.
La tecnología de fusión celular (por ejemplo, hibridomas híbridos) expresa dos cadenas pesadas y dos ligeras que se ensamblan aleatoriamente dando lugar a la generación de 10 combinaciones de anticuerpos. Los anticuerpos heteromultiméricos deseados solo son una pequeña fracción de los anticuerpos así producidos. La purificación de las proteínas heteromultiméricas deseadas reduce drásticamente los rendimientos de producción e incrementa los costes de fabricación.
Se han usado técnicas de ADN recombinante para generar diversos formatos heteromultiméricos, por ejemplo, Fv monocatenario, diacuerpos, etc., que no comprenden un dominio Fc. Una desventaja principal para este tipo de molécula de anticuerpo es la falta del dominio Fc y por tanto la capacidad del anticuerpo para desencadenar una función efectora (por ejemplo, activación del complemento, unión al receptor de Fc, etc.). Por tanto, se desea un anticuerpo biespecífico que comprenda un dominio Fc funcional.
También se han usado técnicas de ADN recombinante para generar anticuerpos biespecíficos de "botón en ojal". Véase la solicitud de patente de EE. UU. 20030078385 (Arathoon et al. - Genentech). Una limitación de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos originales tienen que ser idénticas para evitar el emparejamiento incorrecto y la formación de moléculas no deseadas y/o inactivas debidos a que se expresan en la misma célula.
Los documentos WO 2007/147901, WO 2011/131746, WO 2008/11953 y WO 2013/055958 describen procedimientos in vitro para generar anticuerpos biespecíficos.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de procedimientos alternativos de producción de proteínas heteromultiméricas. La invención descrita en el presente documento proporciona dichos procedimientos. Estos y otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción de la invención proporcionada en el presente documento.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona procedimientos eficaces y novedosos de producción de anticuerpos multiespecíficos en células de mamífero sobre los procedimientos conocidos en la técnica. Véanse los documentos WO2013/055958 y WO2011/133886.
En el presente documento se divulgan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que puede expresar un primer polipéptido que contiene bisagra y una primera cadena ligera;
(b) cultivar una segunda célula huésped que puede expresar un segundo polipéptido que contiene bisagra y una segunda cadena ligera; y
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica, y en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados aspectos de la divulgación, el medio de cultivo combinado se obtuvo sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped. En determinados aspectos de la divulgación, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
También se divulgan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que puede expresar un primer polipéptido que contiene bisagra y una primera cadena ligera, en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped que puede expresar un segundo polipéptido que contiene bisagra y una segunda cadena ligera, en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(d) incubar el medio de cultivo combinado en condiciones reductoras suficientes para permitir la formación de la proteína heteromultimérica; y
(e) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el primer polipéptido que contiene bisagra y el segundo polipéptido que contiene bisagra comprenden una primera y segunda cadenas pesadas. En determinados aspectos de la divulgación como se aplica a cualquiera de las divulgaciones descritas en el presente documento, el primer polipéptido que contiene bisagra y primera cadena ligera comprenden un primer semianticuerpo. En determinados aspectos de la divulgación como se aplica a cualquiera de las divulgaciones descritas en el presente documento, el segundo polipéptido que contiene bisagra y segunda cadena ligera comprenden un segundo semianticuerpo.
En determinados aspectos de la divulgación o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de las divulgaciones anteriores, obtener el medio de cultivo combinado comprende: (1) obtener un primer medio de cultivo para el primer cultivo de célula huésped;
(2) obtener un segundo medio de cultivo para el segundo cultivo de célula huésped; y
(3) combinar el primer medio de cultivo y el segundo medio de cultivo para obtener el medio de cultivo combinado.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, obtener el medio de cultivo combinado comprende obtener medio de cultivo de un cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la célula huésped. En determinados aspectos de la divulgación, el medio de cultivo combinado se obtuvo sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped.
La primera y segunda células huésped en los procedimientos divulgados se pueden cultivar en cualquier entorno que permita la expresión y aislamiento de los polipéptidos de interés. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la primera célula huésped y la segunda célula huésped se cultivan por separado antes de combinarse en el cultivo celular combinado.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, los procedimientos comprenden además la etapa de cultivar el cultivo celular combinado a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el medio de cultivo combinado se incuba durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 7 días después de que se obtiene el medio de cultivo combinado. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el medio de cultivo combinado se incuba a de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 8 °C. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, se agita el medio de cultivo combinado.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, los procedimientos comprenden además aislar la proteína heteromultimérica del medio de cultivo combinado. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la proteína heteromultimérica se aísla usando una columna de proteína A. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína heteromultimérica se purifica además usando procedimientos conocidos en la técnica.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, los procedimientos comprenden además añadir un agente reductor al primer medio de cultivo celular y/o al segundo medio de cultivo celular antes o después de que se obtengan el primer y segundo medios de cultivo celular. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, los procedimientos comprenden además añadir un agente reductor al medio de cultivo del cultivo celular combinado antes de que se obtenga el medio de cultivo del cultivo celular combinado. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor se añade de aproximadamente 4 a aproximadamente 24, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 o de aproximadamente 15 a aproximadamente 18 horas antes de la etapa de obtención. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor se añade aproximadamente 15 horas antes de la etapa de obtención.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, los procedimientos comprenden además añadir un agente reductor al medio de cultivo celular combinado. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el medio de cultivo combinado que contiene el agente reductor se incuba además durante de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 7 días. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el medio de cultivo combinado que contiene el agente reductor se incuba además durante aproximadamente 15 horas. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor se añade al medio de cultivo combinado antes de aislar la proteína heteromultimérica del medio de cultivo combinado. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el medio de cultivo combinado que contiene el agente reductor se incuba durante al menos aproximadamente 24 horas antes de aislar la proteína heteromultimérica. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el medio de cultivo combinado que contiene el agente reductor se incuba durante al menos aproximadamente 48 horas antes de aislar la proteína heteromultimérica. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la proteína heteromultimérica se aísla usando una columna de proteína A.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en glutatión, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), cisteína, cisteína, ditiotreitol, cisteinditiotreitol, ditiolbutilamina o combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor es glutatión, y en el que el glutatión se añade a una concentración de aproximadamente 5 mM a no más de aproximadamente 20 mM. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor es glutatión, y en el que el glutatión se añade a una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor es glutatión, y en el que el glutatión se añade a una concentración de aproximadamente 5 mM a menos de aproximadamente 20 mM. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el agente reductor es glutatión, y en el que el glutatión se añade a una concentración de aproximadamente 15 mM.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la primera célula huésped es una línea celular estable. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la segunda célula huésped es una línea celular estable. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la primera célula huésped es célula CHO. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la segunda célula huésped es célula CHO.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la proporción de la primera célula huésped y la segunda célula huésped se ajusta de modo que la proporción molar del primer polipéptido que contiene bisagra y el segundo polipéptido que contiene bisagra es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1 cuando el primer cultivo de célula huésped y el segundo cultivo de célula huésped se combinan para formar un cultivo combinado. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la proporción molar del primer polipéptido que contiene bisagra expresado por la primera célula huésped y el segundo polipéptido que contiene bisagra expresado por la segunda célula huésped es 1:1 cuando el cultivo de célula huésped y el segundo cultivo de célula huésped se combinan para formar un cultivo combinado.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, los polipéptidos que contienen bisagra comprenden una región Fc o variante de la misma. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el primer y/o el segundo polipéptido que contiene bisagra comprende una cadena pesada de anticuerpo.
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el primer dominio de heterodimerización comprende una modificación de botón en la interfase y el segundo dominio de heterodimerización comprende una modificación de ojal en la interfase. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la modificación de botón comprende sustituir un residuo aminoacídico original del primer dominio de heterodimerización con un residuo aminoacídico con una cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el residuo aminoacídico de sustitución se selecciona del grupo que consiste en triptófano, fenilalanina, tirosina y arginina. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la modificación de ojal comprende sustituir un residuo aminoacídico original del segundo dominio de heterodimerización con un residuo aminoacídico con una cadena lateral más pequeña que el residuo aminoacídico original. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el residuo aminoacídico de sustitución se selecciona del grupo que consiste en serina, treonina, valina y alanina. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la modificación de botón comprende la sustitución T366W (numeración EU). En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la modificación de ojal comprende dos o más sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo que consiste en T366S, L368A e Y407V (numeración EU).
En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, dicho enlace disulfuro intercatenario está entre regiones bisagra. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la proteína heteromultimérica es un anticuerpo. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la proteína heteromultimérica es un anticuerpo biespecífico. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que comprende al menos una porción del dominio CH2 y/o CH3 humano. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgA e IgD. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el anticuerpo es IgG. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, el anticuerpo es IgG1, IgG2 o IgG4. En determinados aspectos de la divulgación de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los aspectos de la divulgación anterior, la primera cadena ligera y la segunda cadena ligera comprenden diferentes secuencias de dominio variable.
La presente invención proporciona procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica, en la que la proteína heteromultimérica es un anticuerpo biespecífico que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar un cultivo combinado de una primera célula huésped y una segunda célula huésped, en el que la primera célula huésped puede expresar el primer polipéptido que contiene bisagra, en el que el polipéptido que contiene bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y la primera cadena ligera, en el que la segunda célula huésped puede expresar el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera, y en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero;
(b) añadir un agente reductor como se define en las reivindicaciones al cultivo combinado como se define en las reivindicaciones; y
(c) obtener un medio de cultivo combinado del cultivo combinado sin romper la membrana celular de 4 horas a 24 horas después de que se añade el agente reductor al cultivo combinado, en el que la etapa de obtener un medio de cultivo combinado comprende retirar la primera célula huésped y segunda célula huésped del medio de cultivo combinado, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica, la proteína heteromultimérica es un anticuerpo biespecífico como se define en las reivindicaciones.
En determinados modos de realización, la primera célula huésped secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras, en los que la segunda célula huésped secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras, en los que el cultivo combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero. En determinados modos de realización, añadir el agente reductor al cultivo combinado permite la formación de la proteína heteromultimérica.
En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el agente reductor se añade después de que el cultivo combinado se haya cultivado durante no más de aproximadamente 18 días. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el medio de cultivo combinado se obtiene de 4 horas a 24 horas después de que se añade el agente reductor. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la etapa de obtener un medio de cultivo combinado comprende retirar la primera célula huésped y segunda célula huésped del medio de cultivo combinado. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el medio de cultivo combinado se incuba durante de 4 horas a 7 días.
En determinados modos de realización, los procedimientos comprenden además la etapa de ajustar la proporción célula:célula de la primera célula huésped y segunda célula huésped en un cultivo combinado. En determinados modos de realización, la proporción célula:célula se ajusta de modo que la proporción molar del primer polipéptido que contiene bisagra (con la cadena ligera asociada) expresado de la primera célula huésped con respecto al segundo polipéptido que contiene bisagra (con la cadena ligera asociada) expresado de la segunda célula huésped en un cultivo combinado alcanza una proporción molar deseada. En determinados modos de realización, la célula huésped es una línea celular estable. En determinados modos de realización, la línea celular estable se transfecta de forma estable con la molécula(s) de ácido nucleico que puede(n) expresar un polipéptido que contiene bisagra y una cadena ligera.
Se debe entender que los procedimientos de la invención pueden incluir otras etapas que en general son etapas habituales evidentes para iniciar y/o completar el procedimiento englobado por los procedimientos de la invención como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en un modo de realización, la etapa (a) de un procedimiento de la invención se precede por una etapa en la que un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que contiene bisagra se introduce en una primera célula huésped, y un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene bisagra se introduce en una segunda célula huésped. En un modo de realización, los procedimientos de la invención comprenden además una etapa de purificar proteínas heteromultiméricas que tienen especificidad de unión para al menos dos dianas distintas.
En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera (o su cadena ligera asociada) comprenden un primer dominio de unión para una primera diana. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera (o su cadena ligera asociada) comprenden un segundo dominio de unión para una segunda diana. La primera y segunda dianas pueden ser diferentes epítopos localizados en una sola molécula o localizados en diferentes moléculas.
En otro aspecto, se proporciona una proteína heteromultimérica producida por cualquiera de los procedimientos anteriores, tal como un anticuerpo biespecífico.
También se divulgan composiciones que comprenden una proteína heteromultimérica producida por cualquiera de los procedimientos anteriores (tal como un anticuerpo biespecífico) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las proteínas heteromultiméricas de la invención en general se pueden unir, preferentemente de forma específica, a antígenos. Dichos antígenos incluyen, por ejemplo, antígenos tumorales, factores reguladores de la supervivencia celular, factores reguladores de la proliferación celular, moléculas asociadas con (por ejemplo, conocidas por o sospechosas de contribuir funcionalmente a) el desarrollo o diferenciación tisular, moléculas de la superficie celular, linfocinas, citocinas, moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular, moléculas implicadas en la vasculogénesis y moléculas asociadas con (por ejemplo, conocidas por o sospechosas de contribuir funcionalmente a) la angiogénesis. Un antígeno al que una proteína heteromultimérica de la invención se puede unir puede ser un miembro de un subconjunto de una de las categorías mencionadas anteriormente, en la que el/los otro(s) subconjunto(s) de dicha categoría comprende(n) otras moléculas/antígenos que tienen una característica distinta (con respecto al antígeno de interés). Un antígeno de interés también se puede considerar que pertenece a dos o más categorías. En un modo de realización, la invención proporciona una proteína heteromultimérica que se une, preferentemente de forma específica, a un antígeno tumoral que no es una molécula de la superficie celular. En un modo de realización, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular, tal como un polipéptido receptor. En otro ejemplo, en algunos modos de realización, una proteína heteromultimérica de la invención se une, preferentemente de forma específica, a un antígeno tumoral que no es un factor de diferenciación de grupos. En otro ejemplo, una proteína heteromultimérica de la invención se puede unir, preferentemente de forma específica, a un factor de diferenciación de grupos, que en algunos modos de realización no es, por ejemplo, CD3 o CD4. En algunos modos de realización, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo anti-VEGF. En algunos modos de realización, una proteína heteromultimérica de la invención es un anticuerpo biespecífico seleccionado del grupo que consiste en IL-1 alfa/IL-1 beta, IL-12/IL-18; IL-13/IL-9; IL-13/IL-4; IL-13/IL-5; IL-5/IL-4; IL-13/IL-1 beta; IL-13/IL-25; IL-13/TARC; IL-13/MDC; IL-13/MEF; IL-13/TGF-P; IL-13/agonista LHR; IL-12/TWEAK, IL-13/CL25; IL-13/SPRR2a; IL-13/SPRR2b; IL-13/ADAM8, IL-13/PED2, IL17A/IL17F, CD3/CD19, CD138/CD20; CD138/CD40; CD19/CD20; CD20/CD3; CD38/CD138; CD38/CD20; CD38/CD40; CD40/CD20; CD-8/IL-6; CD20/BR3, TNFalfa/TGF-beta, TNFalfa/IL-1beta; TNFalfa/IL-2, TNF alfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL-6, TNFalfa/IL-8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL-10, TNFalfa/IL-11, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNFalfa/IL-15, TNFalfa/IL-16, TNFalfa/IL-17, TNFalfa/IL-18, TNFalfa/IL-19, TNFalfa/IL-20, TNFalfa/IL-23, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, TNFalfa/VEGF, TNFalfa/MIF, TNFalfa/ICAM-1, TNFalfa/PGE4, TNFalfa/PEG2, TNFalfa/ligando RANK, TNFalfa/Te38; TNFalfa/BAFF; TNFalfa/CD22; TNFalfa/CTLA-4; TNFalfa/GP130; TNFa/IL-12p40; VEGHHER2, VEGF-A/HER2, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-CNEGF-D, HER2/DR5, VEGF/IL-8, VEGF/MET, VEGFR/receptor MET, VEGFR/EGFR, HER2/CD64, HER2/CD3, HER2/CD16, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, IL-13/CD40L, IL-4/CD40L, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R, TNFR1/IL-18R, EpCAM/CD3, MAPG/CD28, EGFR/CD64, CSPG/RGM A; CTLA-4/BTNO2; IGF1/IGF2; IGF1/2/Erb2B; MAG/RGM A; NgR/RGM A; NogoA/RGM A; OMGp/RGM A; PDL-l/CTLA-4; y RGM A/RGM B, IL-1 p/IL-18, NRP1/VEGFA, VEGFA/NRP2, cMET/EGFR, ALK1/BMP9, VEGFA/a5p1, HER1/HER3-BU y CMV. En algunos modos de realización, una proteína heteromultimérica de la invención se une a al menos dos moléculas diana seleccionadas del grupo que consiste en: a5p1, ALK1, BMP9, IL-1 alfa, IL-1beta, TARC, MDC, MEF, TGF-p, agonista LHR, TWEAK, CL25, SPRR2a, SPRR2b, ADAM8, PED2, CD3, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD28, CD40, CD38, CD64, CD138, CD-8, BR3, TNFalfa, TGF-beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-23, IL-25, IFNalfa, MIF, ICAM-1, PGE4, PEG2, ligando RANK, Te38, BAFF, CTLA-4, GP130, IL-12p40, VEGF, VEGF-A, PDGF, HER1, HER2, HER3, HER3-BU, HER4, VEGF-C, VEGF-D, DR5, cMET, MET, receptor MET, VEGFR, EGFR, CD40L, TNFR1, IL-1R, IL-6R, IL-18R, EpCAM, MAPG, CSPG, BTNO2, IGF1, IGF2, IGF1/2, Erb2B, MAG, NgR, NogoA, NRP1, NRP2, OMGp, PDL-I, RGM A y RGM B. En algunos modos de realización, una proteína heteromultimérica de la presente invención se une a CD3 y al menos una molécula diana adicional seleccionada de BLR1, BR3, CD19, CD20, CD22, CD72, CD79A, CD79B, CD180 (RP105), CR2, FcRH1, FcRH2, FcRH5, FCER2, FCRL4, HLA-DOB y NAG14.
Las proteínas heteromultiméricas se pueden modificar para potenciar y/o añadir características deseadas adicionales. Dichas características incluyen funciones biológicas tales como funciones efectoras inmunitarias, una semivida/aclaramiento in vivo deseable, biodisponibilidad, biodistribución u otras características farmacocinéticas. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica y también se pueden determinar empíricamente, y pueden incluir modificaciones por restos que pueden o no estar basados en péptidos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser glucosilados o aglucosilados, dependiendo en general, al menos en parte, de la naturaleza de la célula huésped. Preferentemente, los anticuerpos de la invención son aglucosilados. Un anticuerpo aglucosilado producido por un procedimiento de la invención se puede glucosilar posteriormente, por ejemplo, usando procedimientos de glucosilación in vitro bien conocidos en la técnica. Como se describe anteriormente y en el presente documento, las proteínas heteromultiméricas de la invención se pueden producir en una célula procariota, tal como, por ejemplo, E. coli. Las proteínas heteromultiméricas producidas por E. coli en general son aglucosiladas y carecen de las funciones biológicas normalmente asociadas con los perfiles de glucosilación encontrados en proteínas heteromultiméricas producidas por células huésped de mamífero (por ejemplo, CHO).
La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden una proteína heteromultimérica de la invención conjugada con un resto heterólogo. Cualquier resto heterólogo sería adecuado siempre que su conjugación con el anticuerpo no reduzca sustancialmente una función y/o característica deseada del anticuerpo. Por ejemplo, en algunos modos de realización, un inmunoconjugado comprende un resto heterólogo que es un agente citotóxico. En algunos modos de realización, dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un isótopo radioactivo, un agente quimioterápico y una toxina. En algunos modos de realización, dicha toxina se selecciona del grupo que consiste en calicheamicina, maitansina y tricoteno. En algunos modos de realización, un inmunoconjugado comprende un resto heterólogo que es un marcador detectable. En algunos modos de realización, dicho marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un isótopo radioactivo, un miembro de un par ligando-receptor, un miembro de un par enzima-sustrato y un miembro de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.
En otro aspecto, se proporcionan células huésped que comprenden un polinucleótido o vector recombinante que codifica un primer polipéptido que contiene bisagra de la proteína heteromultimérica descrita anteriormente, en las que la célula huésped no expresa un segundo polipéptido que contiene bisagra de la proteína heteromultimérica. De acuerdo con la invención, el polipéptido que contiene bisagra es una cadena pesada de anticuerpo. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, el polipéptido que contiene bisagra se empareja con una cadena ligera de anticuerpo. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la célula huésped es una línea celular estable. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la célula huésped es una célula de mamífero. En determinados modos de realización de acuerdo con (o como se aplica a) cualquiera de los modos de realización anteriores, la célula huésped es una célula CHO.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A ilustra un semianticuerpo completamente oxidado. No se muestra el "botón" u "ojal" u otros dominios de heterodimerización. El semianticuerpo representado en esta figura es un isotipo IgG1. Un experto en la técnica apreciará que los otros isotipos de inmunoglobulinas se pueden prever como semianticuerpos con los correspondientes enlaces inter e intracatenarios. En un Ab intacto, las cisteínas bisagra formarán enlaces disulfuro intercatenarios.
La figura 1B ilustra un anticuerpo biespecífico de longitud completa. No se representan los enlaces disulfuro entre cadenas pesadas en la región bisagra.
La figura 2 muestra diagramas de flujo para dos ensayos que se pueden usar para determinar el % de semianticuerpo y el % de anticuerpo biespecífico covalente.
La figura 3 muestra el % de anticuerpo biespecífico formado cuando se añade un reductor a un cultivo celular combinado que comprende una primera célula huésped de mamífero que expresa anti-diana A (botón) y una segunda célula huésped de mamífero que expresa anti-diana B (ojal) 4 horas, 15 horas o 24 horas antes de obtener el medio de cultivo combinado.
La figura 4 muestra grupos de captura de botón y ojal que se procesaron en SDS PAGE con Tris-glicina al 4-20 %. La figura 5A muestra el cromatograma de muestras separadas en base a la hidrofobia para anti-diana G en el que el homodímero y el semianticuerpo se coeluyeron en un pico ancho. La figura 5B muestra el cromatograma de muestras separadas en base a la hidrofobia para anti-diana H.
La figura 6 muestra los resultados de la espectrometría de masas para el anticuerpo biespecífico anti-diana G/anti-diana H.
La figura 7A muestra los resultados de un experimento de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por electropulverización (EM ESI-TOF) realizado en medio de cultivo combinado tratado con GSH y sin tratar en el que se secretaron semianticuerpos anti-diana A y anti-diana B. La figura 7B muestra una ampliación del intervalo m/z del pico de anticuerpo biespecífico. La figura 7C muestra una ampliación del intervalo m/z del pico de semianticuerpo.
Abreviaturas
ADCC = citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
API = inmunoadhesinas anti-patógeno
BPI = proteína bactericida/incrementadora de la permeabilidad
C1q = factor del complemento 1q
CD = grupo de diferenciación
CDC = citotoxicidad dependiente del complemento
CH1 o CH1 = primer dominio constante de la cadena pesada
CH2 o CH2 = segundo dominio constante de la cadena pesada
CH3 o CH3 = tercer dominio constante de la cadena pesada
CH4 o CH4 = cuarto dominio constante de la cadena pesada
CL o CL = dominio constante de la cadena ligera
CTLA = molécula asociada a linfocitos T citotóxicos
Fc = fragmento cristalizable
Fc(R = receptor gamma para la porción Fc de IgG
VIH = virus de la inmunodeficiencia humana
ICAM = molécula de adhesión intercelular
BsAb = anticuerpo biespecífico
BsDb = diacuerpo biespecífico
dsFv = Fv estabilizado con disulfuro
Fc = fragmento constante de un anticuerpo
Fd = Vh+Ch1 de un anticuerpo
FcR = receptor de Fc
Fv = fragmento variable de un anticuerpo
IgG = inmunoglobulina G
mAb = anticuerpo monoclonal
PBL = linfocito de sangre periférica
scDb = diacuerpo monocatenario
scFv = Fv monocatenario
(scFv)2 = tándem scFv-scFv
Tandab = diacuerpo en tándem
VH o Vh = dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo
VL o Vl = dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo
Descripción detallada
La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia usando solo las siguientes definiciones y ejemplos.
A menos que se defina de otro modo en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2.a Ed., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferentes. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los profesionales sanitarios se dirigen en particular a Sambrook et al., 1989, y Ausubel FM et al., 1993, para consultar definiciones y términos de la técnica. Se debe entender que la presente invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar.
Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente.
Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modos de realización de la invención que se pueden tener por referencia a la memoria descriptiva como un todo. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva como un todo.
I. Definiciones
Un "heteromultímero", "complejo heteromultimérico" o "proteína heteromultimérica" se refiere a una molécula que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero" formado por el primer polipéptido que contiene bisagra, la primera cadena ligera, el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera. De forma alternativa, el heteromultímero puede formar, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los polipéptidos del heteromultímero pueden interactuar entre sí por un enlace covalente no peptídico (por ejemplo, enlace disulfuro) y/o una interacción no covalente (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals y/o interacciones hidrófobas).
Como se usa en el presente documento, "dominio de heteromultimerización" se refiere a alteraciones o adiciones a una molécula biológica para promover la formación de heteromultímeros e impedir la formación de homomultímeros. Cualquier dominio de heterodimerización que tiene una preferencia fuerte para formar heterodímeros sobre homodímeros está dentro del alcance de la invención. Los ejemplos ilustrativos incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. 20030078385 (Arathoon et al. - Genentech; que describe botones en ojales); documento WO2007147901 (Kj^rgaard et al. - Novo Nordisk: que describe interacciones iónicas); documento WO 2009089004 (Kannan et al. - Amgen: que describe efectos de conducción electrostática); documento WO2011/034605 (Christensen et al. - Genentech; que describe superhélices). Véanse también, por ejemplo, Pack, P. y Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992) que describe la cremallera de leucinas o Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993) que describe el motivo de hélice-giro-hélice. La frase "dominio de heteromultimerización" y "dominio de heterodimerización" se usan de manera intercambiable en el presente documento.
La frase "polipéptido que contiene bisagra" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que comprende una región correspondiente a la región bisagra de una inmunoglobulina como se entiende en la técnica, por ejemplo, la región entre los dominios Ch1 y Ch2 de la cadena pesada. La "región bisagra", "secuencia bisagra" y variaciones de la misma, como se usa en el presente documento, incluye el significado conocido en la técnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway's Immunobiology, (Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, NY) (7.a ed., 2008); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202. Véanse también, por ejemplo, Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985) y Papadea, C. e I. J. Check (1989) "Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses: biochemical, genetic, and clinical aspects". Crit Rev Clin Lab Sci 27(1): 27-58. Se apreciará por un experto en la técnica que el número de aminoácidos así como el número de residuos cisteína disponibles para la formación de enlaces disulfuro intercatenarios varía entre las clases y los isotipos de inmunoglobulinas. Todas dichas regiones bisagra pueden estar en los polipéptidos que contienen bisagra y están dentro del alcance de la invención. En determinados modos de realización, el primer polipéptido que contiene bisagra comprende una primera cadena pesada de anticuerpo. En determinados modos de realización, la primera cadena pesada se asocia con una primera cadena ligera para formar un primer semianticuerpo. El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y se refiere a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, y cualquier fragmento, mutante, variante o derivado de la misma, siempre que presente la actividad biológica deseada (por ejemplo, actividad de unión a epítopo). Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo como se describe en el presente documento. Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado en afinidad.
Como marco de referencia, como se usa en el presente documento, un anticuerpo se referirá a la estructura de una inmunoglobulina G (IgG). Sin embargo, un experto en la técnica entenderá/reconocerá que se puede utilizar un anticuerpo de cualquier clase de inmunoglobulina en el procedimiento inventivo descrito en el presente documento. Para mayor claridad, una molécula de IgG contiene un par de cadenas pesadas (HC) idénticas y un par de cadenas ligeras (LC) idénticas. Cada LC tiene un dominio variable (Vl) y un dominio constante (Cl), mientras que cada HC tiene un dominio variable (Vh) y tres constantes (Ch1, Ch2 y Ch3). Los dominios Ch1 y Ch2 se conectan por una región bisagra. Esta estructura es bien conocida en la técnica. Se hace referencia a la figura 1B.
Como se usa en el presente documento, "semianticuerpo" se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina asociada con una cadena ligera de inmunoglobulina. Un semianticuerpo ejemplar se representa en la figura 1A. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que un semianticuerpo también puede tener un dominio de unión a antígeno que consiste en un dominio variable único.
El término "maxicuerpo" se refiere a una proteína de fusión que comprende un scFv fusionado con un polipéptido Fc. Se hace referencia a la figura 8a del documento WO 2009089004. Se hace referencia a la figura 2 del documento WO 2009089004 para un maxicuerpo biespecífico.
El término "dominio Ch2" de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende de aproximadamente los residuos 231 a aproximadamente 340 de la IgG de acuerdo con el sistema de numeración EU. El dominio C h2 es único porque no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas enlazadas a N se interponen entre los dos dominios Ch2 de una molécula de IgG natural intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio Ch2. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985).
El término "dominio Ch3" comprende el tramo de residuos C terminales con respecto a un dominio Ch2 en una región Fc (es decir, de aproximadamente el residuo aminoacídico 341 a aproximadamente el residuo aminoacídico 447 de una IgG de acuerdo con el sistema de numeración EU).
El término "región Fc", como se usa en el presente documento, se refiere en general a un complejo dimérico que comprende las secuencias polipeptídicas C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que una secuencia polipeptídica C terminal es la que es obtenible por digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede comprender secuencias de Fc variantes o naturales. Aunque los límites de la secuencia de Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la secuencia de Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente para que se extienda de un residuo aminoacídico en aproximadamente la posición Cys226, o de aproximadamente la posición Pro230, al extremo carboxílico de la secuencia de Fc. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. La secuencia de Fc de una inmunoglobulina en general comprende dos dominios constantes, un dominio Ch2 y un dominio Ch3, y opcionalmente comprende un dominio Ch4. Por "polipéptido de Fc" en el presente documento se quiere decir uno de los polipéptidos que conforman una región Fc, por ejemplo, un Fc monomérico. Se puede obtener un polipéptido de Fc a partir de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o lgG4, IgA, IgE, IgD o IgM. La región Fc comprende las porciones carboxiterminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fc; esta región también es la parte reconocida por los receptores de Fc (FcR) encontrados en determinados tipos de células. En algunos modos de realización, un polipéptido de Fc comprende parte o toda una secuencia bisagra natural (en general en su extremo N). En algunos modos de realización, un polipéptido de Fc no comprende una secuencia bisagra natural o funcional.
Una "región Fc funcional" posee una "función efectora" de una región Fc de secuencia natural. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen unión a C1q; CDC; unión al receptor de Fc; ADCC; fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B, BCR), etc. Dichas funciones efectoras requieren, en general, que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar usando diversos ensayos como se divulga, por ejemplo, en definiciones en el presente documento.
Una "región Fc de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia natural incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia natural (alotipos A y distinto de A), región Fc de IgG2 humana de secuencia natural, región Fc de IgG3 humana de secuencia natural y región Fc de IgG4 humana de secuencia natural, así como variantes naturales de las mismas.
Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia natural en virtud de al menos una modificación aminoacídica, preferentemente una o más sustituciones aminoacídicas. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución aminoacídica en comparación con una región Fc de secuencia natural o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones aminoacídicas y, preferentemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones aminoacídicas en una región Fc de secuencia natural o en la región Fc del polipéptido original. La región Fc variante en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de un polipéptido original y, lo más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % de homología con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de homología con la misma.
"Componente de Fc" como se usa en el presente documento se refiere a una región bisagra, un dominio C h2 o un dominio Ch3 de una región Fc.
En determinados modos de realización, el polipéptido que contiene bisagra comprende una región Fc de IgG, preferentemente derivada de una región Fc de IgG humana natural. Por Fc de IgG humana "natural" se quiere decir una secuencia de aminoácidos que se produce de forma natural en la población humana. Por supuesto, al igual que la secuencia de Fc puede variar ligeramente entre individuos, se pueden realizar una o más alteraciones en una secuencia natural y seguir estando dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la región Fc puede contener alteraciones adicionales que no se relacionan con la presente invención, tales como una mutación en un sitio de glucosilación o inclusión de un aminoácido no natural.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (Vh y Vl, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007)). Un dominio Vh o Vl único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio Vh o Vl de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios Vl o Vh complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano et al., J.
Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El término "Fab" como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Como se indica anteriormente, la papaína se puede usar para digerir un anticuerpo intacto. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, es decir, fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual (es decir, la región Fc, supra). El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (Vh) y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1 ).
La frase "brazo de unión a antígeno", "brazo de unión a molécula diana", "brazo de unión a diana" y variaciones de las mismas, como se usa en el presente documento, se refiere a una parte componente de una proteína heteromultimérica de la invención que tiene una capacidad para unirse específicamente a una diana de interés. En general y preferentemente, el brazo de unión a antígeno es un complejo de secuencias polipeptídicas de inmunoglobulina, por ejemplo, CDR y/o secuencias de dominio variable de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina.
Una "diana" o "molécula diana" se refiere a un resto reconocido por un brazo de unión de la proteína heteromultimérica. Por ejemplo, si la proteína heteromultimérica es un anticuerpo, entonces la diana puede ser epítopos en una sola molécula o en diferentes moléculas, o un patógeno o una célula tumoral, dependiendo del contexto. De forma similar, si la proteína heteromultimérica es una proteína de fusión receptor-Fc, la diana sería el compañero de unión análogo para el receptor. Un experto en la técnica apreciará que la diana se determina por la especificidad de unión del brazo de unión a diana y que diferentes brazos de unión a diana pueden reconocer diferentes dianas. Una diana preferentemente se une a una proteína heteromultimérica de la presente invención con una afinidad mayor que 1 uM de Kd (de acuerdo con el análisis de Scatchard). Los ejemplos de moléculas diana incluyen, pero no se limitan a, proteínas solubles en suero y/o sus receptores, tales como citocinas y/o receptores de citocinas, adhesinas, factores de crecimiento y/o sus receptores, hormonas, partículas víricas (por ejemplo, proteína F del VRS, CMV, estafilococo A, gripe, virus de la hepatitis C), microorganismos (por ejemplo, proteínas de células bacterianas, células fúngicas), adhesinas, proteínas CD y sus receptores.
Un ejemplo de un anticuerpo "intacto" o "de longitud completa" es uno que comprende un brazo de unión a antígeno así como un Cl y al menos dominios constantes de la cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos.
El término "acoplamiento" como se usa en el presente documento se refiere a las etapas necesarias para enlazar el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra entre sí, por ejemplo, formación de un enlace covalente. Dichas etapas comprenden la reducción, hibridación y/u oxidación de residuos cisteína en el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra para formar un enlace disulfuro intercatenario. El acoplamiento se puede lograr por reticulación química o el uso de un sistema redox. Véase, por ejemplo, Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1998) 217:1-10 y Zhu et al., Cancer Lett., (1994) 86: 127-134.
El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que tiene especificidad poliepitópica. Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), en el que la unidad VhVl tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios V l y Vh , uniéndose cada unidad VhVl a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos, uniéndose cada dominio variable único a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado de forma covalente o de forma no covalente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad para unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la(s) misma(s) o diferente(s) diana(s). "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unirse solo a un epítopo. De acuerdo con un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 μM a 0,001 μM, de 3 μM a 0,001 μM, de 1 μM a 0,001 μM, de 0,5 μM a 0,001 μM o de 0,1 μM a 0,001 μM. Un dibujo ilustrativo de un biespecífico se proporciona en la figura 1B.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión a antígeno o una región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos (Db); diacuerpos en tándem (taDb), anticuerpos lineales (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.641.870, Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); anticuerpos de un brazo, anticuerpos de dominio variable único, minicuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3 y (scFV)4-Fc).
La expresión "anticuerpos de dominio único" (sdAb) o "anticuerpos de dominio variable único (SVD)" se refiere en general a anticuerpos en los que un dominio variable único (Vh o Vl) puede conferir unión a antígeno. En otras palabras, el dominio variable único no necesita interactuar con otro dominio variable para reconocer el antígeno diana. Los anticuerpos de dominio único consisten en un dominio de anticuerpo variable monomérico único (Vh o Vl) en cada brazo de unión a antígeno. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen los derivados de camélidos (llamas y camellos) y peces cartilaginosos (por ejemplo, tiburones nodriza) y los derivados de procedimientos recombinantes de anticuerpos humanos y murinos (Ward et al., Nature (1989) 341:544-546; Dooley y Flajnik, Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Muyldermans et al., Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Holt et al., Trends Biotechnol (2003):21:484-490; documento WO 2005/035572; documento WO 03/035694; Davies y Riechmann, Febs Lett (1994) 339:285-290; documento WO00/29004; documento WO 02/051870). Un anticuerpo de dominio variable único puede estar presente en un brazo de unión a antígeno (por ejemplo, homo o heteromultímero) con otras regiones variables o dominios variables, caso en el que no es un anticuerpo de dominio único.
La expresión "anticuerpos lineales" en general se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng.
8(10): 1057-1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (Vh-Ch1-Vh-Ch1) que, conjuntamente con los polipéptidos de cadena ligera complementaria, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
El término tecnología "botón en ojal" o "KnH" como se menciona en el presente documento se refiere a la tecnología que dirige el emparejamiento entre sí in vitro o in vivo de dos polipéptidos introduciendo una protuberancia (botón) en un polipéptido y una cavidad (ojal) en el otro polipéptido en una interfase en la que interactúan. Por ejemplo, se han introducido KnH en las interfases de unión Fc:Fc, interfases Cl:Ch1 o interfases Vh /V l de anticuerpos (por ejemplo, documentos US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 y Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788). Esto es especialmente útil para impulsar el emparejamiento entre sí de dos cadenas pesadas diferentes durante la fabricación de anticuerpos multiespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos que tienen KnH en sus regiones Fc pueden comprender además dominios variables únicos enlazados a cada región Fc, o comprender además dominios variables de la cadena pesada diferentes que se emparejen con dominios variables de la cadena ligera similares o diferentes. También se puede usar la tecnología KnH para emparejar entre sí dos dominios extracelulares de receptores diferentes o cualquier otra secuencia polipeptídica que comprenda secuencias de reconocimiento de dianas diferentes (por ejemplo, que incluyan aficuerpos, pepticuerpos y otras fusiones de Fc).
"Fv" consiste en un dímero de un dominio de región variable de una cadena pesada y una ligera en estrecha asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos aminoacídicos para la unión a antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a menudo con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
"Fv monocatenario", también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo Vh y Vl conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V h y Vl, lo que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véanse Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados construyendo fragmentos sFv (véase el párrafo precedente) con conectores cortos (de aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios Vh y Vl de modo que se logra el emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv de "entrecruzamiento" en los que los dominios V h y Vl de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).
El término "anticuerpo de un brazo" o "anticuerpos de un brazo" se refiere a un anticuerpo que comprende (1) un dominio variable unido por un enlace peptídico a un polipéptido que comprende un dominio Ch2, un dominio Ch3 o un dominio Ch2-Ch3 y (2) un segundo dominio Ch2, Ch3 o Ch2-Ch3, en el que un dominio variable no se une por un enlace peptídico a un polipéptido que comprende el segundo dominio Ch2, Ch3 o Ch2-Ch3. En un modo de realización, el anticuerpo de un brazo comprende 3 polipéptidos (1) un primer polipéptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, Vh), Ch1, Ch2 y Ch3, (2) un segundo polipéptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, Vl) y un dominio Cl, y (3) un tercer polipéptido que comprende un dominio Ch2 y Ch3. En otro modo de realización, el anticuerpo de un brazo tiene una región bisagra parcial que contiene los dos residuos cisteína que forman enlaces disulfuro que enlazan las cadenas pesadas constantes. En un modo de realización, los dominios variables del anticuerpo de un brazo forman una región de unión a antígeno. En otro modo de realización, los dominios variables del anticuerpo de un brazo son dominios variables únicos, en los que cada dominio variable único es una región de unión a antígeno. En un modo de realización, el anticuerpo de un brazo es un anticuerpo de dominio variable único.
Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos primatizados que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, cercopitécidos, simios superiores, etc.) y secuencias de la región constante humana.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar además el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
"Pepticuerpo" o "pepticuerpos" se refiere a una fusión de péptidos generados aleatoriamente con un dominio Fc. Véase la patente de EE. UU. n.° 6.660.843, concedida el 9 de diciembre de 2003 a Feige et al. Incluyen uno o más péptidos enlazados al extremo N, extremo C, cadenas laterales de aminoácidos o a más de uno de estos sitios. La tecnología de los pepticuerpos permite el diseño de agentes terapéuticos que incorporan péptidos que seleccionan uno o más ligandos o receptores, péptidos de asentamiento en tumor, péptidos de transporte en membrana y similares. Se ha demostrado que la tecnología de los pepticuerpos es útil en el diseño de un número de dichas moléculas, incluyendo péptidos lineales y restringidos por disulfuros, "multímeros peptídicos en tándem" (es decir, más de un péptido en una única cadena de un dominio Fc). Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.660.843; solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0195156, publicada el 16 de octubre de 2003 (correspondiente al documento WO 02/092620, publicado el 21 de noviembre de 2002); solicitud de patente de e E. UU. n.° 2003/0176352, publicada el 18 de septiembre de 2003 (correspondiente al documento WO 03/031589, publicado el 17 de abril de 2003); patente de EE. UU. n.° 6.835.809 (correspondiente al documento WO 00/24770, publicado el 4 de mayo de 2000); solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0229023, publicada el 11 de diciembre de 2003; documento WO 03/057134, publicado el 17 de julio de 2003; solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0236193, publicada el 25 de diciembre de 2003 (correspondiente al documento PCT/US04/010989, presentado el 8 de abril de 2004); patente de EE. UU. n.° 6.919.426, presentada el 18 de septiembre de 2003 (correspondiente al documento WO 04/026329, publicado el 1 de abril de 2004).
"Aficuerpos" o "aficuerpo" se refiere al uso de una proteína enlazada por enlace peptídico a una región Fc, en el que la proteína se usa como andamio para proporcionar una superficie de unión para una molécula diana. La proteína a menudo es una proteína natural tal como la proteína A estafilocócica o el dominio B de unión a IgG, o la proteína Z derivada de la misma (véase Nilsson et al (1987), Prot Eng 1, 107-133, y la patente de EE. UU. n.° 5.143.844) o un fragmento o derivado de la misma. Por ejemplo, se pueden crear aficuerpos a partir de variantes de proteínas Z que tienen afinidad de unión alterada para molécula(s) diana, en las que un segmento de la proteína Z se ha mutado por mutagénesis aleatoria para crear una colección de variantes que se puede unir a una molécula diana. Los ejemplos de aficuerpos incluyen la patente de EE. UU. n.° 6.534.628, Nord K et al., Prot Eng 8:601-608 (1995) y Nord K et al., Nat Biotech 15:772-777 (1997). Biotechnol Appl Biochem., junio de 2008; 50(Pt 2):97-112.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con una especificidad de unión deseada, con una secuencia de aminoácidos que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga" en comparación con una región constante de un anticuerpo), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencia de Ch2 y/o Ch3 de una IgG). Las secuencias de adhesina ejemplares incluyen secuencias de aminoácidos contiguas que comprenden una porción de un receptor o un ligando que se une a una proteína de interés. Las secuencias de adhesinas también pueden ser secuencias que se unen a una proteína de interés, pero no son secuencias de receptor o ligando (por ejemplo, secuencias de adhesina en pepticuerpos). Dichas secuencias polipeptídicas se pueden seleccionar o identificar por diversos procedimientos, incluyen técnicas de presentación en fagos y procedimientos de clasificación de alto rendimiento. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA (incluyendo lgA1 e lgA2), IgE, IgD o IgM.
"Complejo" o "complejado" como se usa en el presente documento se refiere a la asociación de dos o más moléculas que interactúan entre sí a través de enlaces y/o fuerzas (por ejemplo, fuerzas de van der Waals, hidrófobas, hidrófilas) que no son enlaces peptídicos. En un modo de realización, el complejo es heteromultimérico. Se debe entender que el término "complejo proteico" o "complejo polipeptídico" como se usa en el presente documento incluye complejos que tienen una entidad no proteica conjugada a una proteína en el complejo proteico (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, moléculas químicas tales como una toxina o un agente de detección).
Una proteína heteromultimérica de la presente invención "que se une a" un antígeno de interés es una que se une a la diana con afinidad suficiente de modo que la proteína heteromultimérica es útil como agente diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar una proteína o una célula o tejido que expresa la diana, y no reacciona de forma cruzada significativamente con otras proteínas. En dichos modos de realización, el grado de unión de la proteína heteromultimérica a una proteína "no diana" será de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a su proteína diana particular, como se determina por análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA) o ELISA. Con respecto a la unión de una proteína heteromultimérica a una molécula diana, el término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular quiere decir la unión que es mensurablemente diferente de una interacción inespecífica (por ejemplo, una interacción inespecífica se puede unir a seroalbúmina bovina o caseína). La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control. Por ejemplo, se puede determinar la unión específica por competencia con una molécula de control que sea similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la unión específica se indica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe de forma competitiva por un exceso de diana no marcada. El término "unión específica" o "se une específicamente a" o "es específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular, como se usa en el presente documento, se puede presentar, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd para la diana de al menos aproximadamente 200 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 150 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 100 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 60 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 50 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 40 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 30 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 20 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 10 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 8 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 6 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 4 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 2 nM, de forma alternativa al menos aproximadamente 1 nM o mayor. En un modo de realización, el término "unión específica" se refiere a la unión donde una proteína heteromultimérica se une a un polipéptido particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.
"Afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). Por ejemplo, la Kd puede ser de aproximadamente 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM o más fuerte. La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad en general se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de procedimientos de medición de la afinidad de unión son conocidos en la técnica, pudiéndose usar cualquiera para los propósitos de la presente invención.
En un modo de realización, la "Kd" o "valor de Kd" de acuerdo con la presente invención se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips de CM5 de diana (por ejemplo, antígeno) inmovilizada a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 μg/ml (~0,2 μM) antes de la inyección a un caudal de 5 μl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (por ejemplo, de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 μl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y tasas de disociación (kdis) usando un modelo de Langmuir de unión uno a uno sencillo (programa informático de evaluación de BIAcore versión 3.2) ajustando simultáneamente el sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación excede 106 M-1s-1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medida en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
"Biológicamente activo" y "actividad biológica" y "características biológicas" con respecto a una proteína heteromultimérica de la presente invención, tal como un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo, quiere decir que tiene la capacidad de unirse a una molécula biológica, excepto cuando se especifique de otro modo.
"Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos heteromultiméricos quiere decir un heteromultímero que se ha separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del que se expresó. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del heteromultímero, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En determinados modos de realización, el heteromultímero se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso de proteína como se determina por el procedimiento de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna por el uso de un secuenciador de vaso giratorio o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
Los heteromultímeros de la presente invención se purifican en general hasta una homogeneidad sustancial. Las expresiones "sustancialmente homogénea", "forma sustancialmente homogénea" y "homogeneidad sustancial" se usan para indicar que el producto está sustancialmente desprovisto de subproductos originados a partir de combinaciones de polipéptidos indeseados (por ejemplo, homomultímeros).
Expresada en términos de pureza, homogeneidad sustancial quiere decir que la cantidad de subproductos no excede de un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % en peso o es de menos de un 1 % en peso. En un modo de realización, el subproducto está por debajo de un 5 %.
"Molécula biológica" se refiere a un ácido nucleico, una proteína, un carbohidrato, un lípido y combinaciones de los mismos. En un modo de realización, la molécula biológica existe en la naturaleza.
Por "enlazado" o "enlaces" como se usa en el presente documento se quiere decir una unión por enlace peptídico directo entre una primera y segunda secuencia de aminoácidos o una unión que implica una tercera secuencia de aminoácidos que se enlaza peptídicamente a y entre la primera y segunda secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, un péptido conector enlazado al extremo C terminal de una secuencia de aminoácidos y al extremo N terminal de la otra secuencia de aminoácidos.
Por "conector" como se usa en el presente documento se quiere decir una secuencia de aminoácidos de dos o más aminoácidos de longitud. El conector puede consistir en aminoácidos neutros polares o no polares. Un conector puede ser, por ejemplo, de 2 a 100 aminoácidos de longitud, tal como entre 2 y 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud. Un conector puede ser "escindible", por ejemplo, por autoescisión o escisión enzimática o química. Los sitios de escisión en las secuencias de aminoácidos y las enzimas y productos químicos que escinden en dichos sitios son bien conocidos en la técnica y también se describen en el presente documento.
Por "anclaje" como se usa en el presente documento se quiere decir un conector aminoacídico que une otras dos secuencias de aminoácidos. Un anclaje como se describe en el presente documento puede enlazar el extremo N de un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina con el extremo C de un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina. En modos de realización particulares, un anclaje tiene entre aproximadamente 15 y 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, entre 20 y 26 aminoácidos de longitud (por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 aminoácidos de longitud). Un anclaje puede ser "escindible", por ejemplo, por autoescisión, o escisión enzimática o química usando procedimientos y reactivos estándar en la técnica.
La escisión enzimática de un "conector" o un "anclaje" puede implicar el uso de una endopeptidasa tal como, por ejemplo, Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, quimotripsina, tripsina, pepsina, papaína, trombina, genenasa, factor Xa, TEV (cisteína proteasa del virus del grabado del tabaco), enterocinasa, c 3 de RVH (proteasa C3 del rinovirus humano), cininogenasa, así como proproteína convertasas de tipo subtilisina (por ejemplo, furina (PC1), PC2 o PC3) o N-arginina dibásico convertasa. La escisión química puede implicar el uso de, por ejemplo, hidroxilamina, N-clorosuccinimida, N-bromosuccinimida o bromuro de cianógeno.
Un "sitio de escisión de endopeptidasa Lys-C" como se usa en el presente documento es un residuo lisina en una secuencia de aminoácidos que se puede escindir en el lado C terminal por endopeptidasa Lys-C. La endopeptidasa Lys-C escinde en el lado C terminal de un residuo lisina.
Por "agente caotrópico" se quiere decir una sustancia soluble en agua que rompe la estructura tridimensional de una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) interfiriendo con la estabilización de interacciones intramoleculares (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o efectos hidrófobos). Los agentes caotrópicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, urea, guanidina-HCl, perclorato de litio, histidina y arginina.
Por "detergente suave" se quiere decir una sustancia soluble en agua que rompe la estructura tridimensional de una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) interfiriendo con la estabilización de interacciones intramoleculares (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o efectos hidrófobos), pero que no rompe permanentemente la estructura de proteína como para provocar una pérdida de actividad biológica (es decir, no desnaturaliza la proteína). Los detergentes suaves ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Tween (por ejemplo, Tween-20), Triton (por ejemplo, Triton X-100), NP-40 (nonilfenoxilpolietoxiletanol), Nonidet P-40 (octilfenoxilpolietoxiletanol) y dodecilsulfato de sodio (SDS).
Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que las Ig secretadas unidas a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con agentes citotóxicos. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y se requieren absolutamente para dicha destrucción. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyR i I y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998).
"Receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano. Además, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas de forma alternativa de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol.
9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se vayan a identificar en el futuro, se engloban por el término "FcR" en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol.
24:249(1994)).
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; siendo preferentes PBMC y linfocitos NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente natural, por ejemplo, de sangre.
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía del complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada), que se unen a su antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso de un tumor (por ejemplo, un tumor canceroso), la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo) puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede evitar el crecimiento de y/o destruir células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para el tratamiento del cáncer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo, evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo transcurrido hasta la progresión de la enfermedad (t Tp ), las tasas de respuesta (RR), duración de la respuesta y/o calidad de vida.
Por "reducir o inhibir" se quiere decir la capacidad para provocar una disminución global preferentemente de un 20 % o mayor, más preferentemente de un 50 % o mayor, y lo más preferentemente de un 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor. Reducir o inhibir se puede referir a los síntomas del trastorno que se está tratando, la presencia o tamaño de las metástasis, el tamaño del tumor primario, o el tamaño o número de los vasos sanguíneos en los trastornos angiogénicos.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento/proliferación celular no regulado. En esta definición se incluyen cánceres benignos y malignos. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen carcinoma de células escamosas, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, glioma, cáncer cervicouterino, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células renales), cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. Por "cáncer en fase precoz" se quiere decir un cáncer que no es invasivo o metastásico o se clasifica como un cáncer en fase 0, I o II. El término "precanceroso" se refiere a una condición o un crecimiento que típicamente precede o se desarrolla en un cáncer. Por "no metastásico" se quiere decir un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema linfático o de los vasos sanguíneos ni en tejidos distintos del sitio primario. En general, un cáncer no metastásico es cualquier cáncer que sea un cáncer en fase 0, I o II y ocasionalmente un cáncer en fase III.
Un "trastorno alérgico o inflamatorio" en el presente documento es una enfermedad o trastorno que resulta de una hiperactivación del sistema inmunitario de un individuo. Los trastornos alérgicos o inflamatorios ejemplares incluyen, pero no se limitan a, asma, psoriasis, artritis reumatoide, dermatitis atópica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, eccema, trasplante de órganos, degeneración macular senil, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esofagitis eosinofílica, y enfermedades autoinmunitarias asociadas con inflamación.
Una "enfermedad autoinmunitaria" en el presente documento es una enfermedad o trastorno que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo o un cosegregado o manifestación del mismo o afección resultante del mismo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a artritis (artritis reumatoide tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, borreliosis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, artritis vertebral y artritis reumatoide de inicio juvenil, artrosis, artritis crónica progresiva, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades cutáneas hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis tal como psoriasis en placas, psoriasis en gotas, psoriasis pustular y psoriasis ungueal, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiforme y dermatitis atópica, síndrome de hiper-IgM ligado al cromosoma X, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmunitaria crónica, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistémica), esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (EM) tal como EM espino-óptica, EM progresiva primaria (EMPP) y EM en recidiva/remisión (EMRR), esclerosis sistémica progresiva, ateroesclerosis, arteriesclerosis, esclerosis múltiple y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales autoinmunitarias, colitis tal como colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagénica, colitis poliposa, enterocolitis necrosante y colitis transparietal, y enfermedad inflamatoria intestinal autoinmunitaria), piodermia gangrenosa, eritema nudoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hemático autoinmunitario, espondilitis reumatoide, hipoacusia repentina, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxia y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o del tronco encefálico, uveítis, tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior o uveítis autoinmunitaria, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN inmunitaria, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN membranoproliferativa o membranosa proliferativa (GNMP), incluyendo de tipo I y de tipo II, y GN de rápida progresión, afecciones alérgicas, reacción alérgica, eccema incluyendo eccema alérgico o atópico, asma tal como asma bronquial y asma autoinmunitario, afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adherencia de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus sistémico eritematoso tal como LES cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus eritematoso neonatal (LEN), lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrico, no renal, extrarrenal, discoide, alopecia), diabetes mellitus de tipo 1, incluyendo diabetes mellitus insulinoide pediátrica (IDDM), diabetes mellitus de tipo 2, diabetes autoinmunitaria, diabetes insípida idiopática, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y panarteritis nudosa), poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vasculitis necrosante, cutánea o por hipersensibilidad, vasculitis necrosante sistémica y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (SCS)), arteritis de células gigantes, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmunitaria, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmunitaria incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de la serie roja (APSR), insuficiencia del factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión multiorgánica tal como los posteriores a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpo antifosfolipídico, neuritis alérgica, enfermedad de Behget, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso y penfigoide cutáneo, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo de membrana mucosa y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis de inmunocomplejo, nefritis mediada por anticuerpo, neuromielitis óptica, polineuropatías, neuropatía crónica tal como polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (como se desarrolla por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y trombocitopenia autoinmunitaria o inmunitaria tal como púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) incluyendo PTI crónica o aguda, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovarios incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitarias, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o de la persona rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave asociada a timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonia, opsoclonía o síndrome de opsoclonía y mioclonía (SOM), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis crónica, hepatitis lúpica, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfática, bronquiolitis obliterante (distinta de trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía de IgA), nefropatía de IgA idiopática, dermatosis con depósitos lineales de IgA, cirrosis biliar primaria, neumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmunitaria, celiaquía, enfermedad celíaca (enteropatía por gluten), esprúe resistente a tratamiento, esprúe idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), arteriopatía coronaria, enfermedad autoinmunitaria del αdo tal como enfermedad autoinmunitaria del αdo interno (EAOI), hipoacusia autoinmunitaria, síndrome de opsoclonía y mioclonía (SOM), policondritis tal como policondritis resistente a tratamiento o recidivada, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de linfocitos B monoclonales (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significado incierto, GMSI), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis segmentaria y focal (GESF), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno hepatológico autoinmunitario, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, disfunción esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infecundidad autoinmunitaria masculina y femenina, enfermedad del tejido conjuntivo mixto, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto habitual, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome poscardiotomía, síndrome de Cushing, neumopatía de los avicultores, angitis granulomatosa alérgica, angitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción por transfusión, lepra, malaria, leishmaniosis, tripanosomiasis, esquistosomosis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis cística, endoftalmia, eritema elevado persistente, eritroblastosis fetal, facitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariosis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infección por virus ECHO, miocardiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus de la rubéola, síndromes posvacunación, infección por rubéola congénita, infección por virus de Epstein-Barr, parotiditis, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmunitaria, corea de Sydenham, nefritis posestreptocócica, tromboangeítis obliterante, hipertiroidismo, tabes dorsal, coroiditis, polimialgia de células gigantes, oftalmopatía endocrina, neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión por reperfusión e isquemia hereditaria benigna, autoinmunidad retiniana, inflamación de articulaciones, bronquitis, enfermedad de las vías respiratorias obstructiva crónica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioescleróticos, aspermiogenese, hemólisis autoinmunitaria, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, hipoacusia sensoneuronal, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmia simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, piodermia gangrenosa, tiroiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, infecundidad debida a anticuerpos anti-espermatozoides, timoma no maligno, vitiligo, enfermedades asociadas con el virus de Epstein-Barr e IDCG, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), parasitosis tales como leishmania, síndrome del choque tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que implican infiltración de linfocitos T, deficiencia de adherencia de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunitarias, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmunitaria, oftalmia simpática, enfermedades reumáticas, enfermedades del tejido conjuntivo mixto, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio adulto (AOIH), alopecia total, miocardiopatía dilatada, epidermólisis ampollosa adquirida (EAA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoide, frontal, maxilar o esfenoide, un trastorno eosinofílico tal como eosinofilia, eosinofilia con infiltración pulmonar, síndrome miálgico eosinofílico, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis-bronconeumonía, aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritis seronegativa, enfermedad autoinmunitaria poliendocrina, colangitis esclerosante, candidiasis mucocutánea crónica, esclerótica, epiesclerótica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia-telangiectasia, trastornos autoinmunitarios asociados con conjuntivopatía, reumatismo, enfermedad neurológica, trastorno por isquemia-reperfusión, reducción en la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, angiectasia, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y enfermedad concomitante con vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de tejidos miocárdicos u otros, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados con transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, inflamación grave aguda, inflamación intratable crónica, pielitis, neumonocirrosis, retinopatía diabética, trastorno diabético en arterias de gran tamaño, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis.
El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de una célula y/o provoca la destrucción de una célula. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterápicos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales, antineoplásicos y quimioterápicos divulgados en el presente documento. Otros agentes citotóxicos se describen en el presente documento. Un agente tumoricida provoca la destrucción de células tumorales.
Un "agente quimioterápico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán) (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, clormetina, clorhidrato de óxido de clormetina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uramustina; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos, tales como los antibióticos enodiinos (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma 1 (véase, por ejemplo, Angew. Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos enodiinos de cromoproteínas relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolinodoxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; eflornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet, pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente, toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; 5-pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers-Squibb Oncology, Princeton, NJ), formulación de paclitaxel en nanopartículas genomanipuladas con albúmina libres de Cremophor ABRAXANETM (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL) y doxetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura para un tratamiento combinado de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina.
También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer, y que a menudo están en forma de tratamiento sistémico o de todo el cuerpo. Pueden ser las propias hormonas. Los ejemplos incluyen antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; antiprogesteronas; reguladores por disminución del receptor de estrógenos (ERD); agentes que funcionan para suprimir o apagar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) tales como acetato de leuprorrelina LUPRON® y ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIL®, formestano, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®. Además, dicha definición de agentes quimioterápicos incluye bifosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato Zo META®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® o risedronato ACTONEL®; así como troxacitabina (un análogo 1,3-dioxolano nucleosídico de citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR); vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de tratamiento génico, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña doble de las tirosinas cinasas ErbB-2 y EGFR, también conocido como GW572016); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, in vitro o bien in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Los bloqueantes de fase M clásicos incluyen las vincas (por ejemplo, vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que interrumpen la G1 también actúan sobre la interrupción de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbacina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y Ara-C. Se puede encontrar información adicional en The Molecular Basis of Cancer, MendeIsohn and Israel, eds., capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), en especial p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos antineoplásicos derivados ambos del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos previniendo la despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de mitosis en células.
"Tratamiento antineoplásico" como se usa en el presente documento se refiere a un tratamiento que reduce o inhibe el cáncer en un sujeto. Los ejemplos de tratamiento antineoplásico incluyen radioterapia citotóxica así como la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente citotóxico, un agente quimioterápico, un agente inhibidor del crecimiento, una vacuna contra el cáncer, un inhibidor de la angiogénesis, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, un corticoesteroide, un agente inmunosupresor, un antiemético, un anticuerpo 0 fragmento de anticuerpo, o un analgésico al sujeto.
El término "profármaco" como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para células tumorales en comparación con el fármaco original y se puede activar o convertir enzimáticamente en la forma original más activa. Véanse, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con aminoácidos D, profármacos glucosilados, profármacos que contienen beta-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterápicos descritos anteriormente.
El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas del crecimiento tales como la hormona del crecimiento humano (HGH), hormona de crecimiento humano N-metionilo y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glucoproteínas, tales como hormona foliculoestimulante (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; hormona antimülleriana; péptido asociado a la gonadotropina murina; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-alfa; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF), tales como TGF-alfa y TGF-beta; factores insulínicos de crecimiento 1 y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma, factores estimuladores de formación de colonias (CSF), tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL), tales como IL-1, IL-1alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-18, un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural.
Por "antagonista de citocina" se quiere decir una molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de al menos una citocina. Por ejemplo, los antagonistas de citocinas pueden inhibir la actividad de la citocina por la inhibición de la expresión y/o secreción de citocinas, o por la unión a una citocina o a un receptor de citocinas. Los antagonistas de citocinas incluyen anticuerpos, péptidos sintéticos o de secuencia natural, inmunoadhesinas y antagonistas de molécula pequeña que se unen a una citocina o receptor de citocinas. El antagonista de citocina se conjuga opcionalmente o se fusiona con un agente citotóxico. Los antagonistas de TNF ejemplares son etanercept (En Br El®), infliximab (REMICADE®) y adalimumab (HUMIRA™).
El término "agente inmunosupresor", como se usa en el presente documento se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario del sujeto que se está tratando. Esto incluye sustancias que suprimen la producción de citocinas, regulan por disminución o suprimen la expresión de autoantígeno, o enmascaran los antígenos MHC. Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (véase la patente de EE. UU. n.° 4.665.077); micofenolato de mofetilo tal como CELLCEPT®; azatioprina (IMURAN®, AZASAN®/6-mercaptopurina; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.120.649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos de MHC; ciclosporin A; esteroides, tales como corticoesteroides y glucocorticoesteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona tal como PEDIAPRED® (fosfato sódico de prednisolona) u ORAPRED® (solución oral de fosfato sódico de prednisolona), metilprednisolona y dexametasona; metotrexato (oral o subcutáneo) (RHEUMATREX®, TREXALL™); hidroxicloroquina/cloroquina; sulfasalazina; leflunomida; citocinas o antagonistas de los receptores de citocinas incluyendo anticuerpos anti-interferón-Y, -p o -a, anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral-p (infliximab o adalimumab), inmunoadhesina anti-TNFa (ENBREL®, etanercept), anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral-p, anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos anti-receptor de iL-2; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CD11a y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina antilinfocítica heteróloga; anticuerpos policlonales o pan-T, o anticuerpos monoclonales anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión a LFA-3 (documento WO 90/08187); estreptocinasa; TGF-[3; estreptodornasa; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de linfocitos T (Cohen et al., patente de EE. UU. n.° 5.114.721); fragmentos de receptores de linfocitos T (Offner et al. Science 251: 430-432 (1991); documento WO 90/11294; Laneway, Nature 341:482 (1989); y documento WO 91/01133); anticuerpos para receptores de linfocitos T (documento EP 340.109) tales como T10B9; ciclofosfamida (CYTOXAN®); dapsona; penicilamina (CUPRIMINE®); intercambio de plasma; o inmunoglobulina intravenosa (IGIV). Estos se pueden usar solos o en combinación entre sí, en particular combinaciones de esteroide y otro agente inmunosupresor o dichas combinaciones seguidas de una dosis de mantenimiento con un agente no esteroideo para reducir la necesidad de esteroides.
Un "analgésico" se refiere a un fármaco que actúa para inhibir o suprimir el dolor en un sujeto. Los analgésicos ejemplares incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) incluyendo ibuprofeno (MOTRIN®), naproxeno (NAPROSYN®), ácido acetilsalicílico, indometacina, sulindac y tolmetina, incluyendo sales y derivados de los mismos, así como diversos otros medicamentos usados para reducir los dolores punzantes que se pueden producir, incluyendo antiepilépticos (gabapentina, fenitoína, carbamazepina) o antidepresivos tricíclicos. Los ejemplos específicos incluyen acetaminofeno, ácido acetilsalicílico, amitriptilina (ELAVIL®), carbamazepina (TEGRETOL®), fenitoína (DILANTIN®), gabapentina (NEURONTIN®), (E)-N-vainillil-8-metil-6-nonamida (CAPSAICIN®), o un bloqueante nervioso.
"Corticoesteroide" se refiere a una cualquiera de las varias sustancias sintéticas o naturales con la estructura química general de esteroides que imitan o aumentan los efectos de los corticoesteroides naturales. Los ejemplos de corticoesteroides sintéticos incluyen prednisona, prednisolona (incluyendo metilprednisolona), dexametasona, triamcinolona y betametasona.
Una "vacuna contra el cáncer", como se usa en el presente documento, es una composición que estimula una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un cáncer. Las vacunas contra el cáncer consisten típicamente en una fuente de material o células asociadas a cáncer (antígeno) que pueden ser autólogas (del mismo) o alogénicas (de otros) al sujeto, junto con otros componentes (por ejemplo, adyuvantes) para estimular y reforzar además la respuesta inmunitaria contra el antígeno. Las vacunas contra el cáncer pueden dar como resultado la estimulación del sistema inmunitario del sujeto para producir anticuerpos para uno o varios antígenos específicos y/o para producir linfocitos T citotóxicos para atacar a las células cancerosas que tienen esos antígenos.
"Radioterapia citotóxica" como se usa en el presente documento se refiere a un tratamiento con radiación que inhibe o evita la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. La radioterapia puede incluir, por ejemplo, irradiación de haz externo o tratamiento con un agente marcado radioactivo, tal como un anticuerpo. El término pretende incluir el uso de isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32 e isótopos radioactivos de Lu).
Un "sujeto" es un vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo, un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja (tales como vacas), animales de competición, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.
Excepto que se indique de otro modo por contexto, los términos "primer" polipéptido que contiene bisagra y "segundo" polipéptido que contiene bisagra, y variaciones de los mismos, son meramente identificadores genéricos y no se deben tomar como identificativos de un polipéptido o componente específico o uno particular de anticuerpos de la invención.
Los reactivos comercialmente disponibles a los que se hace referencia en los ejemplos, si los hay, se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique de otro modo. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, si la hay, y en toda la memoria descriptiva, por números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. A menos que se indique de otro modo, la presente invención usa procedimientos estándar de tecnología de ADN recombinante, tales como los descritos anteriormente en el presente documento y en los siguientes libros de texto: Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., NY, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.
En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, el término "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.
Se entiende que los aspectos y modos de realización de la invención descritos en el presente documento incluyen "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en" aspectos y modos de realización.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que se refieren a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción en referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/a", "o" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Se entiende que los aspectos y variaciones de la invención descrita en el presente documento incluyen "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en" aspectos y variaciones.
II. Procedimientos de preparación de proteínas heteromultiméricas en células huésped de mamífero
La producción de proteínas heteromultiméricas, por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos, usando técnicas actuales tiene desventajas que incluyen la producción de una mezcla de productos, rendimiento reducido y disminución/eliminación de la función efectora entre otros. Por tanto, es deseable producir proteínas heteromultiméricas eficazmente y a niveles altos.
La producción de moléculas de anticuerpo, por diversos medios, en general se entiende bien. La patente de EE. UU. n.° 6331415 (Cabilly et al.), por ejemplo, describe un procedimiento para la producción recombinante de inmunoglobulina donde las cadenas pesada y ligera se expresan simultáneamente desde un solo vector o desde dos vectores separados en una sola célula. Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191 -202) y Lee y Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198) describen la producción de anticuerpos monoclonales a partir de las cadenas pesada y ligera producidas por separado, usando plásmidos expresados en cultivos separados de E. coli. Diversas otras técnicas pertinentes para la producción de anticuerpos se describen, por ejemplo, en Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988) y el documento WO2006028936. Aún, cada uno de estos tiene desventajas tales como bajo rendimiento, uso de productos químicos.
Los procedimientos proporcionados en el presente documento se basan en el descubrimiento sorprendente de que un primer polipéptido que contiene bisagra y una primera cadena ligera se expresan y secretan a partir de una primera célula huésped de mamífero y un segundo polipéptido que contiene bisagra y una segunda cadena ligera se expresan y secretan por una segunda célula huésped de mamífero que se ensambla para formar una proteína heteromultimérica en un medio de cultivo combinado. Como se analiza con mayor detalle a continuación, el medio de cultivo combinado se puede obtener cultivando la primera célula huésped de mamífero en un primer cultivo celular, cultivando una segunda célula huésped de mamífero en un segundo cultivo celular, obteniendo el primer y segundo medios de cultivo sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped, y combinando el primer y segundo medios de cultivo obtenidos para obtener el medio de cultivo combinado que comprende la proteína heteromultimérica. De forma alternativa, el medio de cultivo combinado se puede obtener cultivando la primera y segunda células huésped de mamífero en un cultivo celular combinado y obteniendo del cultivo combinado el medio de cultivo celular combinado que comprende la proteína heteromultimérica. En determinados modos de realización, la etapa de obtención comprende retirar la primera y/o segunda células huésped sin romper la membrana celular.
Los procedimientos proporcionados en el presente documento son sorprendentes, ya que en general se creía que el sistema de control de calidad de proteínas de las células eucariotas (tales como células de mamífero) puede no producir eficazmente anticuerpos incompletos. Véase, por ejemplo, Spiess et al. (2013) Nature, 31(8): 753-758.
Los solicitantes también han descubierto sorprendentemente que se puede formar una proteína heteromultimérica con alto rendimiento en condiciones reductoras en un medio de cultivo combinado que comprende un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras que se han secretado por una primera célula huésped y un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras que se han secretado por una segunda célula huésped.
Por tanto, en determinados modos de realización, se proporcionan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que puede expresar y secretar un primer polipéptido que contiene bisagra y una primera cadena ligera,
(b) cultivar una segunda célula huésped que puede expresar y secretar un segundo polipéptido que contiene bisagra y una segunda cadena ligera; y
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica, y en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero.
En determinado aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que puede expresar un primer polipéptido que contiene bisagra y una primera cadena ligera, en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped que puede expresar un segundo polipéptido que contiene bisagra y una segunda cadena ligera, en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(d) incubar el medio de cultivo combinado en condiciones reductoras; y
(e) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero.
En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado se obtiene sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor. En determinados modos de realización, las condiciones reductoras son suficientes para permitir la formación de la proteína heteromultimérica.
En determinados modos de realización, el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera comprenden un primer semianticuerpo. En determinados modos de realización, el segundo polipéptido que contiene bisagra y segunda cadena ligera comprenden un segundo semianticuerpo.
En determinados modos de realización, aproximadamente un 99 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 5 % (tal como aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 1 %) del primer polipéptido que contiene bisagra y primera cadena ligera (por ejemplo, el primer semianticuerpo) presente en el medio de cultivo combinado está en forma de un primer homodímero antes de la incubación en condiciones reductoras o antes de añadir un agente reductor, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En determinados modos de realización, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 75 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 65 %, o de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 55 % del primer polipéptido que contiene bisagra y primera cadena ligera (por ejemplo, el primer semianticuerpo) presente en el medio de cultivo combinado está en forma de un primer homodímero antes de la incubación en condiciones reductoras o antes de añadir un agente reductor.
En determinados modos de realización, aproximadamente un 99 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 5 % (tal como aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 1 %) del segundo polipéptido que contiene bisagra y segunda cadena ligera (por ejemplo, el segundo semianticuerpo) presente en el medio de cultivo combinado está en forma de un segundo homodímero antes de la incubación en condiciones reductoras o antes de añadir un agente reductor, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En determinados modos de realización, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 75 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 65 %, o de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 55 % del segundo polipéptido que contiene bisagra y segunda cadena ligera (por ejemplo, el segundo semianticuerpo) presente en el medio de cultivo combinado está en forma de un segundo homodímero antes de la incubación en condiciones reductoras o antes de añadir un agente reductor.
En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado comprende menos de aproximadamente un 75 %, menos de aproximadamente un 70 %, menos de aproximadamente un 65 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 55 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 45 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 35 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 19 %, menos de aproximadamente un 18 %, menos de aproximadamente un 17 %, menos de aproximadamente un 16 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 14 %, menos de aproximadamente un 13 %, menos de aproximadamente un 12 %, menos de aproximadamente un 11 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 3 %, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % del primer homodímero después de la incubación en condiciones reductoras o después de añadir un agente reductor, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado comprende menos de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 % o menos de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 15 % del primer homodímero después de la incubación en condiciones reductoras o después de añadir un agente reductor.
En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado comprende menos de aproximadamente un 75 %, menos de aproximadamente un 70 %, menos de aproximadamente un 65 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 55 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 45 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 35 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 19 %, menos de aproximadamente un 18 %, menos de aproximadamente un 17 %, menos de aproximadamente un 16 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 14 %, menos de aproximadamente un 13 %, menos de aproximadamente un 12 %, menos de aproximadamente un 11 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 %, menos de aproximadamente un 8 %, menos de aproximadamente un 7 %, menos de aproximadamente un 6 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 3 %, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % del segundo homodímero después de la incubación en condiciones reductoras o después de añadir un agente reductor, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado comprende menos de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 % o menos de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 15 % del segundo homodímero después de la incubación en condiciones reductoras o después de añadir un agente reductor.
En determinado aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera;
(b) cultivar una segunda célula huésped que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera; y
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica, y en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, el primer y segundo ácidos nucleicos son una molécula de ácido nucleico; mientras que en determinados otros modos de realización, el primer y segundo ácidos nucleicos son moléculas de ácido nucleico diferentes. En determinados modos de realización, el tercer y cuarto ácidos nucleicos son una molécula de ácido nucleico; mientras que en determinados otros modos de realización, el tercer y cuarto ácidos nucleicos son moléculas de ácido nucleico diferentes.
En determinado aspecto de la divulgación, la invención proporciona procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera, en el que la primera célula huésped puede expresar el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera, y en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera, en el que la segunda célula huésped puede expresar el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera, y en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(d) incubar el medio de cultivo combinado en condiciones reductoras suficientes para permitir la proteína heteromultimérica; y
(e) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, el primer y segundo ácidos nucleicos son una molécula de ácido nucleico; mientras que en determinados otros modos de realización, el primer y segundo ácidos nucleicos son moléculas de ácido nucleico diferentes. En determinados modos de realización, el tercer y cuarto ácidos nucleicos son una molécula de ácido nucleico; mientras que en determinados otros modos de realización, el tercer y cuarto ácidos nucleicos son moléculas de ácido nucleico diferentes. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En determinado aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer semianticuerpo que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo semianticuerpo que comprende un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera;
(b) cultivar una segunda célula huésped que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera; y
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica, y en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En determinado aspecto de la divulgación, la invención proporciona procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer semianticuerpo que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo semianticuerpo que comprende un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera, en el que la primera célula huésped puede expresar el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera, y en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera, en el que la segunda célula huésped puede expresar el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera, y en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped y la segunda célula huésped sin romper la membrana celular de la primera y segunda células huésped, en el que el medio de cultivo combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(d) incubar el medio de cultivo combinado en condiciones reductoras suficientes para permitir la formación de la proteína heteromultimérica; y
(e) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En determinado aspecto de la divulgación, la invención proporciona procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped de mamífero que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera en un primer cultivo celular;
(b) cultivar una segunda célula huésped de mamífero que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera en un segundo cultivo celular;
(c) obtener un primer medio de cultivo de la primera célula huésped de mamífero;
(d) obtener un segundo medio de cultivo de la segunda célula huésped de mamífero;
(e) combinar el primer medio de cultivo y el segundo medio de cultivo para obtener el medio de cultivo combinado, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica. En determinados modos de realización, obtener el primer medio de cultivo comprende retirar la primera célula huésped del primer cultivo celular. En determinados modos de realización, obtener el segundo medio de cultivo comprende retirar la segunda célula huésped del segundo cultivo celular. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En determinado aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera en un primer cultivo celular en el que la primera célula huésped puede expresar el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera, y en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera en un segundo cultivo celular, en el que la segunda célula huésped puede expresar el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera, y en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un primer medio de cultivo de la primera célula huésped de mamífero, en el que el primer medio de cultivo comprende el primer homodímero;
(d) obtener un segundo medio de cultivo de la segunda célula huésped de mamífero, en el que el segundo medio de cultivo comprende el segundo homodímero;
(e) combinar el primer medio de cultivo y el segundo medio de cultivo para obtener el medio de cultivo combinado, en el que el medio de cultivo combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(f) incubar el medio de cultivo combinado en condiciones reductoras suficientes para permitir la formación de la proteína heteromultimérica; y
(g) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, obtener el primer medio de cultivo comprende retirar la primera célula huésped del primer cultivo celular. En determinados modos de realización, obtener el segundo medio de cultivo comprende retirar la segunda célula huésped del segundo cultivo celular. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En determinado aspecto de la divulgación, la invención proporciona procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer semianticuerpo que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo semianticuerpo que comprende un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo semianticuerpos se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped de mamífero que comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica una primera cadena ligera en un primer cultivo celular;
(b) cultivar una segunda célula huésped de mamífero que comprende un tercer ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica una segunda cadena ligera en un segundo cultivo celular;
(c) obtener un primer medio de cultivo de la primera célula huésped de mamífero;
(d) obtener un segundo medio de cultivo de la segunda célula huésped de mamífero;
(e) combinar el primer medio de cultivo y el segundo medio de cultivo para obtener el medio de cultivo combinado, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica. En determinados modos de realización, obtener el primer medio de cultivo comprende retirar la primera célula huésped del primer cultivo celular. En determinados modos de realización, obtener el segundo medio de cultivo comprende retirar la segunda célula huésped del segundo cultivo celular.
En determinado aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer semianticuerpo que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo semianticuerpo que comprende un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera en un primer cultivo celular, en el que la primera célula huésped puede expresar el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera, y en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera en un segundo cultivo celular, en el que la segunda célula huésped puede expresar el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera, y en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un primer medio de cultivo de la primera célula huésped de mamífero, en el que el primer medio de cultivo comprende un primer homodímero;
(d) obtener un segundo medio de cultivo de la segunda célula huésped de mamífero, en el que el segundo medio de cultivo comprende el segundo homodímero;
(e) combinar el primer medio de cultivo y el segundo medio de cultivo para obtener un medio de cultivo combinado, en el que el medio de cultivo combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(f) incubar el medio de cultivo combinado en condiciones reductoras suficientes para permitir la formación de la proteína heteromultimérica; y
(g) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, obtener el primer medio de cultivo comprende retirar la primera célula huésped del primer cultivo celular. En determinados modos de realización, obtener el segundo medio de cultivo comprende retirar la segunda célula huésped del segundo cultivo celular. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En el presente documento se divulgan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped de mamífero que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera;
(b) cultivar una segunda célula huésped de mamífero que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera; y
(c) obtener un medio de cultivo de un cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la segunda célula huésped para obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped de mamífero y la segunda célula huésped de mamífero, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica.
En determinado aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped de mamífero que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera, en el que la primera célula huésped puede expresar el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera, y en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped de mamífero que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera, en el que la segunda célula huésped puede expresar el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera, y en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un medio de cultivo de un cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la segunda célula huésped para obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped de mamífero y la segunda célula huésped de mamífero, en el que el medio de cultivo del cultivo celular combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(d) incubar el medio de cultivo en condiciones reductoras suficientes para permitir la formación de la proteína heteromultimérica; y
(e) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En el presente documento se divulgan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) un primer semianticuerpo que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo semianticuerpo que comprende un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped de mamífero que comprende un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica una primera cadena ligera;
(b) cultivar una segunda célula huésped de mamífero que comprende un tercer ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica una segunda cadena ligera; y
(c) obtener un medio de cultivo de un cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la segunda célula huésped para obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped de mamífero y la segunda célula huésped de mamífero, en el que el medio de cultivo combinado comprende la proteína heteromultimérica.
En determinado aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de preparación de una proteína heteromultimérica que comprende i) primer semianticuerpo que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización, en la que el primer polipéptido que contiene bisagra se asocia con una primera cadena ligera, y ii) un segundo semianticuerpo que comprende un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en la que el segundo polipéptido que contiene bisagra se asocia con una segunda cadena ligera, en la que el segundo dominio de heterodimerización interactúa con el primer dominio de heterodimerización en una interfase, y en la que el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar una primera célula huésped de mamífero que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra y un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera, en el que la primera célula huésped puede expresar el primer polipéptido que contiene bisagra y la primera cadena ligera, y en el que se secreta un primer homodímero que comprende dos primeros polipéptidos que contienen bisagra y dos primeras cadenas ligeras;
(b) cultivar una segunda célula huésped de mamífero que comprende un tercer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra y un cuarto ácido nucleico que codifica la segunda cadena ligera, en el que la segunda célula huésped puede expresar el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera, y en el que se secreta un segundo homodímero que comprende dos segundos polipéptidos que contienen bisagra y dos segundas cadenas ligeras;
(c) obtener un medio de cultivo de un cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la segunda célula huésped para obtener un medio de cultivo combinado para la primera célula huésped de mamífero y la segunda célula huésped de mamífero, en el que el medio de cultivo del cultivo celular combinado comprende el primer homodímero y el segundo homodímero;
(d) incubar el medio de cultivo en condiciones reductoras suficientes para permitir la formación de la proteína heteromultimérica; y
(e) obtener la proteína heteromultimérica, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además añadir un agente reductor al medio de cultivo combinado.
En determinados modos de realización, cultivar el cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la segunda célula huésped se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 25 °C y 40 °C. En determinados modos de realización, cultivar el cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la segunda célula huésped se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C y 37 °C. En determinados modos de realización, cultivar el cultivo celular combinado que comprende la primera célula huésped y la segunda célula huésped se lleva a cabo a un pH de entre aproximadamente 7,2 y 8,7.
En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado se incuba a una temperatura de entre aproximadamente 4 °C y 40 °C. En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado se incuba a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C y 37 °C. En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado se incuba a una temperatura de entre aproximadamente 4 °C y 8 °C.
En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado se agita. En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado se agita durante aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días o más de 8 días después de que se obtiene el medio de cultivo combinado. En algunos modos de realización, el cultivo combinado se agita de forma intermitente.
En determinado aspecto de la divulgación, los procedimientos comprenden además aislar la proteína heteromultimérica, por ejemplo, anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención del medio de cultivo combinado. En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención, se aísla usando una columna de proteína A.
Los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen añadir un agente reductor durante la producción de la proteína heteromultimérica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención. En determinados aspectos de la divulgación, los procedimientos proporcionados en el presente documento, el agente reductor usado es glutatión, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), cisteína, cisteína, ditiotreitol, cisteinditiotreitol, ditiolbutilamina o combinaciones de los mismos. De acuerdo con la invención, el agente reductor es glutatión reducido. En determinados modos de realización, el agente reductor no es 2-mercaptoetanol. En determinados modos de realización, el agente reductor no es ditiotreitol.
En determinados modos de realización en los que la primera y segunda células huésped de mamífero se cultivan por separado, es decir, crecen en cultivos separados, el agente reductor se añade al primer medio de cultivo celular y al segundo medio de cultivo celular antes de que se obtengan el primer y segundo medios de cultivo celular y se combinen para obtener el medio de cultivo combinado. En determinados modos de realización en los que la primera y segunda células huésped de mamífero crecen en el mismo cultivo, el agente reductor se añade al medio de cultivo del cultivo celular combinado antes de que se obtenga el cultivo celular combinado para obtener el medio de cultivo combinado.
En determinados modos de realización, el agente reductor como se define en las reivindicaciones se añade aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas o aproximadamente 30 horas antes de la etapa de obtención, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.
En determinados modos de realización, el agente reductor como se define en las reivindicaciones se añade al medio de cultivo combinado. En determinados modos de realización, el medio de cultivo combinado que contiene el agente reductor se incuba durante aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.
En determinados modos de realización, el agente reductor como se define en las reivindicaciones se añade al cultivo celular combinado para lograr una concentración final de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En determinados aspectos de la divulgación, el agente reductor (tal como glutatión) se añade al cultivo celular combinado para lograr una concentración final de menos de 20 mM. En determinados aspectos de la divulgación, el agente reductor (tal como glutatión) se añade al cultivo celular combinado para lograr una concentración final de no más de 20 mM.
En determinados aspectos de la divulgación, el agente reductor se añade al medio de cultivo combinado antes de aislar la proteína heteromultimérica, por ejemplo, anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, del medio de cultivo combinado. En determinados aspectos de la divulgación, el medio de cultivo combinado que contiene el agente reductor se incuba durante aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días antes de aislar la proteína heteromultimérica, por ejemplo, anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, del medio de cultivo combinado que contiene el agente reductor, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En algunos modos de realización, la proteína heteromultimérica se aísla usando una columna de proteína A.
En determinados modos de realización, el agente reductor como se define en las reivindicaciones se añade al medio de cultivo combinado para lograr la concentración final de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 26 mM, aproximadamente 27 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 29 mM o aproximadamente 30 mM. En determinados modos de realización, el agente reductor (tal como glutatión) se añade al medio de cultivo combinado para lograr una concentración final de menos de 20 mM. En determinados modos de realización, el agente reductor (tal como glutatión) se añade al medio de cultivo combinado para lograr una concentración final de no más de 20 mM.
En determinados modos de realización de los procedimientos, la primera célula huésped es una línea celular estable. En determinados modos de realización, la segunda célula huésped es una línea celular estable. En determinados modos de realización, la primera célula huésped es una célula CHO. En determinados modos de realización, la segunda célula huésped es una célula CHO. En determinados modos de realización en los que la primera célula huésped y la segunda célula huésped crecen en el mismo cultivo, la proporción de la primera célula huésped y la segunda célula huésped en el momento de partida del cultivo combinado es de aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:9, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1 o aproximadamente 10:1.
Como se usa en el presente documento, "proporción molar" se refiere a la proporción del primer polipéptido que contiene bisagra asociado con la primera cadena ligera (tal como un primer semianticuerpo) que se ha expresado y/o secretado con respecto al segundo polipéptido que contiene bisagra asociado con la segunda cadena ligera (tal como un segundo semianticuerpo) que se ha expresado y/o secretado. En algunos modos de realización, la proporción molar del primer polipéptido que contiene bisagra asociado con la primera cadena ligera y el segundo polipéptido que contiene bisagra asociado con la segunda cadena ligera está entre aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1 o aproximadamente 5:1, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En algunos modos de realización, la proporción molar del primer polipéptido que contiene bisagra asociado con la primera cadena ligera y el segundo polipéptido que contiene bisagra asociado con la segunda cadena ligera es de aproximadamente 1:1. En algunos modos de realización, la proporción molar del primer semianticuerpo y el segundo semianticuerpo está entre aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1 o aproximadamente 5:1, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En algunos modos de realización, la proporción molar del primer semianticuerpo y el segundo semianticuerpo es de aproximadamente 1 :1.
III. Proteínas heteromultiméricas
Además, se proporcionan por la invención proteínas heteromultiméricas producidas por uno cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica comprende una región Fc de anticuerpo o una variante de la misma (tal como una variante con función ADCC alterada). En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica comprende una porción significativa de una región Fc de anticuerpo o una variante de la misma (por ejemplo, una variante con función ADCC alterada). En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica comprende una cadena pesada que comprende solo una porción de los dominios Ch1, Ch2 y/o Ch3. En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica es un fragmento de anticuerpo que comprende solo una porción de los dominios Ch1, Ch2 y/o Ch3. En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica es un anticuerpo. En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica es un anticuerpo biespecífico. En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica es un anticuerpo humanizado. En determinados modos de realización, la proteína heteromultimérica es un anticuerpo humano. En determinados modos de realización, el anticuerpo es una IgG (tal como una IgG1, IgG2 o IgG-4), una IgA o una IgD. En determinados modos de realización, la primera cadena ligera y la segunda cadena ligera de la proteína heteromultimérica comprenden diferentes secuencias de dominio variable. En determinados modos de realización, el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra de la proteína heteromultimérica producida por los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden una región Fc o una variante de la misma. En determinados modos de realización, el primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra de la proteína heteromultimérica comprenden una cadena pesada de anticuerpo.
Dominios de heteromultimerización
Las proteínas heteromultiméricas comprenden un dominio de heteromultimerización. Para generar una población sustancialmente homogénea de molécula heterodimérica, el dominio de heterodimerización debe tener una preferencia fuerte para formar heterodímeros sobre homodímeros. Aunque las proteínas heteromultiméricas ejemplificadas en el presente documento usan tecnología de botón en ojal para facilitar la heteromultimerización, los expertos en la técnica apreciarán otros dominios de heteromultimerización útiles en la presente invención.
Botones en ojales
El uso de botones en ojales como procedimiento de producción de anticuerpos multiespecíficos es bien conocido en la técnica. Véanse la patente de EE. UU. n.° 5.731.168 concedida el 24 de marzo de 1998 cedida a Genentech, publicación PCT n.° W02009089004, publicada el 16 de julio de 2009 y cedida a Amgen, y publicación de patente de EE. UU. n.° 20090182127, publicada el 16 de julio de 2009 y cedida a Novo Nordisk A/S. Véanse también Marvin y Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658 y Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1-9. Aquí se proporciona un breve análisis.
Una "protuberancia" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que sobresale de la interfase de un primer polipéptido y es, por lo tanto, posicionable en una cavidad compensatoria en la interfase contigua (es decir, la interfase de un segundo polipéptido) para estabilizar el heteromultímero y, de este modo, favorecer la formación de heteromultímeros sobre la formación de homomultímeros, por ejemplo. La protuberancia puede existir en la interfase original o se puede introducir sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfase). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfase del primer polipéptido se altera para codificar la protuberancia. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo aminoacídico "original" en la interfase del primer polipéptido se reemplaza por el ácido nucleico que codifica al menos un residuo aminoacídico "de importación" que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el residuo aminoacídico original. Se apreciará que puede existir más de un residuo original y correspondiente residuo de importación. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfase del primer polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diversos residuos amino se muestran en la tabla 1 a continuación:
Tabla 1
Propiedades de residuos aminoacídicos
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a Peso molecular del aminoácido menos el del agua. Valores de Handbook of Chemistry and Phvsics, 43.a ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.
b Valores de A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972.
c Valores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975. El área de superficie accesible se define en las figuras 6-20 de esta referencia.10*52
Los residuos de importación preferentes para la formación de una protuberancia, en general, son residuos aminoacídicos naturales y se seleccionan preferentemente de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Los más preferentes son triptófano y tirosina. En un modo de realización, el residuo original para la formación de la protuberancia tiene un volumen de cadena lateral pequeño, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina.
Una "cavidad" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácidos que se retrae de la interfase de un segundo polipéptido y por lo tanto aloja una correspondiente protuberancia en la interfase contigua de un primer polipéptido. La cavidad puede existir en la interfase original o se puede introducir sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfase). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfase del segundo polipéptido se altera para codificar la cavidad. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo aminoacídico "original" en la interfase del segundo polipéptido se reemplaza por el ADN que codifica al menos un residuo aminoacídico "de importación" que tiene un volumen de cadena lateral menor que el residuo aminoacídico original. Se apreciará que puede existir más de un residuo original y correspondiente residuo de importación. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfase del segundo polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diversos residuos amino se muestran en la tabla 1 anterior. Los residuos de importación preferentes para la formación de una cavidad normalmente son residuos aminoacídicos naturales y se seleccionan preferentemente de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). Los más preferentes son serina, alanina o treonina. En un modo de realización, el residuo original para la formación de la cavidad tiene un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano.
Un residuo aminoacídico "original" es uno que se reemplaza por un residuo "de importación" que puede tener un volumen de cadena lateral más pequeño o más grande que el residuo original. El residuo aminoacídico de importación puede ser un residuo aminoacídico natural o no natural, pero preferentemente es el primero. Los residuos aminoacídicos "naturales" son los residuos codificados por el código genético y enumerados en la tabla 1 anterior. Por residuo aminoacídico "no natural" se quiere decir un residuo que no se codifica por el código genético, pero que puede unir de forma covalente residuo(s) aminoacídico(s) contiguo(s) en la cadena polipeptídica. Los ejemplos de residuos aminoacídicos no naturales son norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos aminoacídicos, tales como los descritos en Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991), por ejemplo. Para generar dichos residuos aminoacídicos no naturales, se pueden usar los procedimientos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) y Ellman et al., supra. En resumen, esto implica activar químicamente un ARNt supresor con un residuo aminoacídico no natural seguido de transcripción y traducción in vitro del ARN. El procedimiento de la presente invención implica reemplazar al menos un residuo aminoacídico original, pero se puede reemplazar más de un residuo original. Normalmente, no más de los residuos totales en la interfase del primer o segundo polipéptido comprenderán residuos aminoacídicos originales que se reemplazan. Típicamente, los residuos originales para reemplazo están "enterrados". Por "enterrado" se quiere decir que el residuo es esencialmente inaccesible para el disolvente. En general, el residuo de importación no es cisteína para evitar la posible oxidación o emparejamiento incorrecto de enlaces disulfuro.
La protuberancia es "posicionable" en la cavidad, lo que quiere decir que la localización espacial de la protuberancia y la cavidad en la interfase de un primer polipéptido y segundo polipéptido respectivamente y los tamaños de la protuberancia y la cavidad son de modo que la protuberancia se puede localizar en la cavidad sin perturbar significativamente la asociación normal del primer y segundo polipéptidos en la interfase. Puesto que las protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp típicamente no se extienden perpendicularmente del eje de la interfase y tienen conformaciones preferentes, la alineación de una protuberancia con una correspondiente cavidad se basa en modelar el par protuberancia/cavidad en base a una estructura tridimensional, tal como la obtenida por cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (RMN). Esto se puede lograr usando técnicas ampliamente aceptadas en la técnica. Por "ácido nucleico original o molde" se quiere decir el ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés que se puede "alterar" (es decir, genomanipular o mutar) para codificar una protuberancia o cavidad. El ácido nucleico original o de partida puede ser un ácido nucleico natural o puede comprender un ácido nucleico que se ha sometido a alteración previa (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el ácido nucleico se quiere decir que el ácido nucleico original se muta insertando, delecionando o reemplazando al menos un codón que codifica un residuo aminoacídico de interés. Normalmente, un codón que codifica un residuo original se reemplaza por un codón que codifica un residuo de importación. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta manera se han revisado en Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido. (1991), e incluyen mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis con casete y mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo. Al mutar un ácido nucleico original/molde, se altera por tanto de forma correspondiente un polipéptido original/molde codificado por el ácido nucleico original/molde.
La protuberancia o cavidad se puede "introducir" en la interfase de un primer o segundo polipéptido por medios sintéticos, por ejemplo, por técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, las técnicas para introducir residuos aminoacídicos no naturales previamente descritos, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas. En consecuencia, la protuberancia o cavidad que se "introduce" es "no natural", lo que quiere decir que no existe en la naturaleza o en el polipéptido original (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado).
En general, el residuo aminoacídico de importación para formar la protuberancia tiene un número relativamente pequeño de "rotámeros" (por ejemplo, aproximadamente 3-6). Un "rotámero" es una conformación energéticamente favorable de una cadena lateral de aminoácidos. El número de rotámeros de los diversos residuos aminoacídicos se revisa en Ponders y Richards, J. Mol. Biol. 193:775-791 (1987).
En algunos modos de realización de los procedimientos proporcionados en el presente documento, el primer dominio de heterodimerización de la proteína heteromultimérica comprende una modificación de botón en la interfase, y el segundo dominio de heterodimerización comprende una modificación de ojal. En determinados modos de realización, la modificación de botón comprende sustituir un residuo aminoacídico original del primer dominio de heterodimerización con un residuo aminoacídico con una cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original. En determinados modos de realización, el residuo aminoacídico de sustitución con la cadena lateral más grande es un triptófano, una fenilalanina, una tirosina o una arginina. En determinados modos de realización, la modificación de botón comprende la sustitución T366W (numeración EU). En determinados modos de realización, la modificación de ojal comprende sustituir un residuo aminoacídico del segundo dominio de heteromultimerización con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral más pequeña. En determinados modos de realización, el aminoácido de sustitución que tiene la cadena lateral más pequeña es una serina, treonina, valina o alanina. En algunos modos de realización, la modificación de ojal comprende dos o más sustituciones aminoacídicas que comprenden T366S, L368A y/o Y407V (numeración EU).
IV. Vectores, células huésped y procedimientos recombinantes
Para la producción recombinante de una proteína heteromultimérica (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención, el ácido nucleico que la codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. La elección del vector depende en parte de la célula huésped que se va a usar. En general, las células huésped son de origen mamífero. Se apreciará que se pueden usar regiones constantes de cualquier isotipo para este propósito, incluyendo las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener a partir de cualquier especie humana o animal.
a. Generación de proteínas heteromultiméricas usando células huésped de mamífero:
Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia finalizadora de la transcripción.
i. Componente de secuencia señal
Un vector para su uso en una célula huésped de mamífero también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y se procesa (es decir, se escinde por una peptidasa señal) por la célula huésped. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como secuencias líder secretoras víricas, por ejemplo, la señal gD del herpes simple. El ADN para dicha región precursora se fija en el marco de lectura al ADN que codifica la(s) proteína(s) heteromultimérica(s) deseada(s) (por ejemplo, anticuerpos).
ii. Origen de replicación
En general, no es necesario un componente de origen de replicación para vectores de expresión de mamífero. Por ejemplo, típicamente se puede usar el origen SV40, pero solo porque contiene el promotor temprano.
iii. Componente de gen de selección
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan carencias auxotróficas, cuando sea pertinente, o (c) administran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para aceptar el ácido nucleico del anticuerpo, tales como DHFr , timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferentemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.
Por ejemplo, en primer lugar se identifican células transformadas con el gen de selección de DHFR cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) carente de actividad DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).
De forma alternativa, se pueden seleccionar células huésped (en particular huéspedes naturales que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteína DHFR natural y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.965.199.
iv. Componente de promotor
Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza de forma funcional al ácido nucleico de polipéptido(s) que contiene(n) bisagra(s) deseado(s). Las secuencias promotoras son conocidas para células de mamífero. Prácticamente todos los genes de mamífero tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases hacia 5' del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en dirección 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes de mamífero hay una secuencia AATAAA que puede ser la secuencia señal para la adición de la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión de mamífero.
La transcripción de polipéptido(s) que contiene(n) bisagra(s) deseado(s) y transcripción de cadena(s) ligera(s) de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de genomas de virus tales como, por ejemplo, poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2 ), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector se divulga en la patente de EE. UU. n.° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.601.978. Véase también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc de p-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. De forma alternativa, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede usar como promotor.
v. Componente de elemento potenciador
La transcripción de ADN que codifica el/los polipéptido(s) que contiene(n) bisagra(s) deseado(s) y cadena(s) ligera(s) por células huésped de mamífero se puede incrementar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Ahora son conocidas muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (por ejemplo, genes de globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Además, se puede usar un potenciador de un virus de célula de mamífero. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) para una descripción de los elementos para potenciar la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica el polipéptido de anticuerpo, siempre que se logre la potenciación, pero en general se localiza en un sitio 5' del promotor.
vi. Componente finalizador de la transcripción
Los vectores de expresión usados en células huésped de mamífero también contendrán típicamente las secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o ADNc de mamífero o víricos. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente finalizador de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en el mismo.
vii. Selección y transformación de células huésped
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores en el presente documento incluyen células de mamífero descritas en el presente documento, incluyendo células huésped de vertebrado. La propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (Co S-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, At CC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, At CC CCL51); linfocitos TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de polipéptido(s) que contiene(n) bisagra(s) deseado(s) y cadena(s) ligera(s) y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican la secuencias deseadas. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped transfectada de forma estable. En determinados modos de realización, la célula huésped es una línea celular estable.
viii. Cultivo de las células huésped
Las células huésped usadas para producir un polipéptido(s) que contiene(n) bisagra(s) deseado(s) y cadena(s) ligera(s) de la presente invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes de EE. UU. n.os 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de EE. UU. Re. 30.985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas para los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.
ix. Purificación de proteínas heteromultiméricas
Cuando se usan técnicas recombinantes, los polipéptidos que contienen bisagra asociados con polipéptidos de cadena ligera se pueden producir intracelularmente, o secretarse directamente en el medio. Si el polipéptido que contiene bisagra y el polipéptido de cadena ligera se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, células huésped o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el polipéptido que contiene bisagra asociado con el polipéptido de cadena ligera se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.
La composición heteromultimérica preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferente. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede usar proteína A para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio Ch3, la resina Bakerbond ABXTM (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna con poli(ácido aspártico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.
Después de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo usando un tampón de elución a un pH de entre aproximadamente 2,5-4,5, realizada preferentemente a concentraciones de sal bajas (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M). La producción de las proteínas heteromultiméricas puede comprender de forma alternativa o adicional (para cualquiera de los procedimientos particulares anteriores) dializar una solución que comprende una mezcla de los polipéptidos.
V. Formación/ensamblaje de proteínas heteromultiméricas
La formación de la proteína heteromultimérica completa implica el reensamblaje del primer polipéptido que contiene bisagra, la primera cadena ligera, el segundo polipéptido que contiene bisagra y la segunda cadena ligera por formación de enlace disulfuro lo que en la presente invención se denomina replegamiento. El replegamiento incluye la asociación del primer polipéptido que contiene bisagra con el segundo polipéptido que contiene bisagra y la formación de enlaces disulfuro intercatenarios, por ejemplo, para formar un anticuerpo biespecífico. Por tanto, en algunos modos de realización de los procedimientos proporcionados en el presente documento, el enlace disulfuro intercatenario de la proteína heteromultimérica está entre las regiones bisagra del primer y segundo polipéptidos que contienen bisagra. El replegamiento, también denominado renaturalización, en la presente invención se realiza in vitro.
Una vez que los polipéptidos que contienen bisagra y cadenas ligeras asociadas se secretan por la célula, los dominios de heteromultimerización impulsarán la asociación de las proteínas heteromultiméricas. La formación de disulfuro intercatenario de los polipéptidos que contienen bisagra asociados avanza. A continuación, se purifica la proteína heteromultimérica enlazada por disulfuro resultante. Opcionalmente, se puede formular para propósitos de investigación, diagnóstico, terapéuticos u otros.
VI. Moléculas diana
Los ejemplos de moléculas que se pueden seleccionar por una proteína heteromultimérica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas séricas solubles y sus receptores y otras proteínas unidas a la membrana (por ejemplo, adhesinas).
Las proteínas heteromultiméricas pueden unir una, dos o más citocinas, proteínas relacionadas con citocina y receptores de citocinas seleccionados del grupo que consiste en BMPI, b Mp2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6 , BMP8 , CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6 , IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FELI (EPSELON), FELI (ZETA), IL1 A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6 , IL7, IL8 , IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (ligando OX40), TNFSF5 (ligando CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando CD27), TNFSF8 (ligando CD30), TNFSF9 (ligando 4-1BB), TNFSFI0 (TRAIL), TNFSF1I (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, IL1R2, IL1RL1, LL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6 R, IL7R, IL8 RA, IL8 RB, IL9R, ILI0RA, ILI0RB, IL1IRA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6 ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFI, HGF, LEP (leptina), PTN y THPO.
En otro ejemplo, una molécula diana es una quimiocina, receptor de quimiocina o una proteína relacionada con quimiocina seleccionada del grupo que consiste en CCLI (I- 309), CCL2 (MCP -1 / MCAF), CCL3 (MIP-la), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP- 3), CCL8 (mcp-2), CCLH (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / exodus-2), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK/ ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (l-TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-lb), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCRI (CKRI / HM145), CCR2 (mcp-IRB / RA), CCR3 (CKR3 / CMκΒR3), CCR4, CCR5 (CMκΒR5 / ChemR13), CCR6 (CMκΒR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6 ), CCR7 (CKR7 / EBII), CCR8 (CMκΒR8 / TERI / CKR-LI), CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L-CCR), XCRI (GPR5 / CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8 RA (IL8 Ra), IL8 RB (IL8 Rb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6 , CKLFSF7, CKLFSF8 , BDNF, C5R1, CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8 , PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMI, TREM2 y VHL.
Las proteínas heteromultiméricas también se pueden unir a una o más dianas seleccionadas del grupo que consiste en ABCFI; ACVRI; ACVRIB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; AD0RA2A; agrecano; AGR2; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (cinc-a-glucoproteína); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGI; BAII; BCL2; BCL6 ; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6 ; BMP8 ; BMPRIA; BMPRIB; BMPR2; BPAGI (plectina); BRCAI; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTI; CASP1; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6/JAB61); CCLI (1-309); CCLII (eotaxina); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-Id); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; exodus-2; CCL22 (MDC/STC-I); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina-3); CCL27 (CTACK/ ILC); CCL28; CCL3 (MTP-la); CCL4 (MDP-lb); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAI; CCNA2; CCNDI; CCNEI; CCNE2; CCRI (CKRI/HM145); CCR2 (mcp-IRB/RA);CCR3 (CKR3/CMκΒR3); CCR4; CCR5 (CMκΒR5/ChemR13); CCR6 (CMκΒR6/CKR-L3/STRL22/DRY6); CCR7 (CKR7/EBII); CCR8 (CMκΒR8 /TERI/CKR-LI); CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8 ; CD80; CD81; CD83; CD86 ; CDHI (E-cadherina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8 ; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6 ; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21Waμl/Ciμl); CDKNIB (p27Kiμl); CDKNIC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; quitinasa; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6 ; CKLFSF7; CKLFSF8 ; CLDN3;CLDN7 (claudina-7); CLN3; CLU (clusterina); CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1; COLIAI; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF);CTLA4; CTNNBI (b-catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCLI (GROI); CXCL10 (IP-10); CXCLII (l-TAC/IP-9); CXCL12 (SDFI); CXCL13; CXCL14;CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33/Bonzo); CYB5; CYCI; CYSLTRI; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E2F1; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8 ; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8 ; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLTI; FOS; FOSLI (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (geIsolina); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; histamina y receptores de histamina; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAI; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6 ; IFNA7; IFNB1; IFNgamma; DFNWI; IGBPI; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6 ; IL-I; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HYI; IL1RI; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6 ; IL6 R; IL6 ST (glucoproteína 130); EL7; EL7R; EL8 ; IL8 RA; DL8 RB; IL8 RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAI; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (integrina a6 ); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (integrina b4); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6 HF; KAII; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6 ; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6 ; KLK9; KRT1; KRT19 (queratina 19); KRT2A; KHTHB6 (queratina de tipo H específica de cabello); LAMAS; LEP (leptina); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG o Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBI; midkina; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (metalotionectina-III); MTSSI; MUCI (mucina); MYC; MYD88 ; NCK2; neurocano; NFκΒI; NFκΒ2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); N0X5; NPPB; NROBI; NR0B2; NRIDI; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPI; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacano; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mamaglobina2); SCGB2A2 (mamaglobina 1); SCYEI (citocina activadora de monocitos endoteliales); SDF2; SERPINAI; SERPINA3; SERPINB5 (maspina); SERPINEI (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6 ; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondina-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; factor tisular; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6 ; TLR7; TLR8 ; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8 ; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL); TNFSFI 1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligando OX40); TNFSF5 (ligando CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligando CD27); TNFSF8 (ligando CD30); TNFSF9 (ligando 4-1BB); TOLLIP; receptores de tipo Toll; TOP2A (topoisomerasa Ea); TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6 ; TREMI; TREM2; TRPC6 ; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versicano; VHL C5; VLA-4; XCLI (linfotactina); XCL2 (SCM-lb); XCRI(GPR5/CCXCRI); YYI; y ZFPM2.
Las moléculas diana moleculares preferentes para anticuerpos englobados por la presente invención incluyen proteínas CD tales como los miembros CD3, CD4, CD8 , CD16 , CD19, CD20, CD34; CD64, CD200 de la familia del receptor ErbB tales como el receptor de EGF, receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, v Ca M, integrina alfa4/beta7 e integrina alfav/beta3 incluyendo subunidades alfa o bien beta de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento tales como VEGF-A, VEGF-C; factor tisular (TF); interferón alfa (alfalFN); TNFalfa, una interleucina, tal como IL-1 beta, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8 , IL-9, IL-13, IL17A/F, IL-18, IL-13Ralfa1, IL13Ralfa2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mμl; CTLA-4; RANKL, RANK, proteína F de VRS, proteína C, etc.
Las proteínas heteromultiméricas se pueden unir a proteína relacionada con receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP)-1 o LRP- 8 o receptor de transferrina, y al menos una diana seleccionada del grupo que consiste en 1) beta-secretasa (BACE1 o BACE2), 2) alfa-secretasa, 3) gamma-secretasa, 4) tau-secretasa, 5) proteína precursora amiloide (APP), 6 ) receptor de muerte 6 (DR6 ), 7) péptido beta-amiloide, 8 ) alfa-sinucleína, 9) Parkin, 10) Huntingtin, 11) p75 n Tr y 12) caspasa-6.
En un modo de realización, las proteínas heteromultiméricas de la presente invención se unen a al menos dos moléculas diana seleccionadas del grupo que consiste en: IL-1 alfa e IL-1 beta, IL-12 e IL-18; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-1 beta; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MEF; IL-13 y TGF-P; IL-13 y agonista de LHR; IL-12 y TWEAK, IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; IL-13 y ADAM8 , IL-13 y PED2, IL17A e IL17F, CD3 y CD19, CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD19 y CD20; CD20 y CD3; CD38 y CD138; CD38 y CD20; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD- 8 e IL-6 ; CD20 y BR3, TNFalfa y TGF-beta, TNFalfa y IL-1 beta; TNFalfa y IL-2, TNF alfa y IL-3, TNFalfa e IL-4, TNFalfa e IL-5, TNFalfa e IL6 , TNFalfa e IL8 , TNFalfa e IL-9, TNFalfa e IL-10, TNFalfa e IL-11, TNFalfa e IL-12, TNFalfa e IL-13, TNFalfa e IL-14, TNFalfa e IL-15, TNFalfa e IL-16, TNFalfa e IL-17, TNFalfa e IL-18, TNFalfa e IL-19, TNFalfa e IL-20, TNFalfa e IL-23, TNFalfa e IFNalfa, TNFalfa y CD4, TNFalfa y VEGF, TNFalfa y MIF, TNFalfa e ICAM-1, TNFalfa y PGE4, TNFalfa y PEG2, TNFalfa y ligando RANK, TNFalfa y Te38; TNFalfa y BAFF; TNFalfa y CD22; TNFalfa y CTLA-4; TNFalfa y GP130; TNFa e IL-12p40; VEGF y HER2, VEGF-A y HER2, VEGF-A y PDGF, HER1 y HER2, VEGF-A y VEGF-C, VEGF-C y VEGF-D, HER2 y DR5, VEGF e IL-8 , VEGF y MET, VEGFR y receptor MET, VEGFR y EGFR, HER2 y CD64, HER2 y CD3, HER2 y CD16, HER2 y HER3; EGFR(HER1) y HER2, EGFR y HER3, EGFR y HER4, IL-13 y CD40L, IL4 y CD40L, TNFR1 e IL-1 R, TNFR1 e IL-6 R y TNFR1 e IL-18R, EpCAM y CD3, MAPG y CD28, EGFR y CD64, CSPGs y RGM A; CTLA-4 y BTNO2; IGF1 e IGF2; IGF1/2 y Erb2B; MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL-I y CTLA-4; y RGM A y RGM B.
Se pueden usar antígenos o fragmentos de los mismos solubles, opcionalmente conjugados a otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembranarias, tales como receptores, se pueden usar fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. De forma alternativa, se pueden usar células que expresan la molécula transmembranaria como inmunógeno. Se pueden derivar dichas células de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado por técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranaria. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.
VII. Ensayos de actividad
Las proteínas heteromultiméricas se pueden caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y funciones biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.
Las proteínas heteromultiméricas purificadas se pueden caracterizar además por una serie de ensayos que incluyen, pero sin limitarse a, secuenciación N terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) por exclusión de tamaño no desnaturalizante, espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.
En algunos ejemplos, las inmunoglobulinas producidas en el presente documento se analizan para determinar su actividad biológica. Las inmunoglobulinas también se pueden someter a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno. Los ensayos de unión a antígeno que son conocidos en la técnica y se pueden usar en el presente documento incluyen, sin limitación, cualquier ensayo de unión competitiva o directa usando técnicas tales como inmunoelectrotransferencias, radioinmunoensayos, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), inmunoanálisis de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. Un ensayo de unión a antígeno ilustrativo se proporciona a continuación en la sección de ejemplos.
Un anticuerpo alterado posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseado para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. En determinados ejemplos, las actividades Fc de la proteína heteromultimérica producida se miden para garantizar que solo se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCc . Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que la proteína heteromultimérica carece de unión a FcyR (de ahí que probablemente carece de actividad de ADCC), pero conserva su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y de ahí que carece de actividad de CDC. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). También se pueden realizar la unión a FcRn y determinaciones del aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica.
VIII. Proteínas conjugadas
También se proporcionan proteínas conjugadas tales como anticuerpos conjugados o inmunoconjugados (por ejemplo, "conjugados anticuerpo-fármaco" o "ADC"), que comprenden cualquiera de las proteínas heteromultiméricas descritas en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento) donde una de las regiones constantes de la cadena ligera o la cadena pesada se conjuga a una molécula química tal como un tinte o agente citotóxico tal como un agente quimioterápico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo ( es decir, un radioconjugado). En particular, como se describe en el presente documento, el uso de dominios de heteromultimerización permite la construcción de anticuerpos que contienen dos cadenas pesadas diferentes (HC1 y HC2) así como dos cadenas ligeras diferentes (LC1 y LC2). Un inmunoconjugado construido usando los procedimientos descritos en el presente documento puede contener el agente citotóxico conjugado a una región constante de solo una de las cadenas pesadas (HC1 o HC2) o solo una de las cadenas ligeras (LC1 o LC2). Además, debido a que el inmunoconjugado puede tener el agente citotóxico unido a solo una cadena pesada o ligera, la cantidad del agente citotóxico que se administra a un sujeto se reduce en relación con la administración de un anticuerpo que tiene el agente citotóxico unido a ambas cadenas pesadas o ligeras. Reducir la cantidad de agente citotóxico que se administra a un sujeto limita los efectos secundarios adversos asociados con el agente citotóxico.
El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos para destruir o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999); Niculescu-Duvaz y Springer, Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172 (1997); patente de EE. UU. n.° 4.975.278) permite el suministro dirigido del resto de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos agentes de fármacos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales así como para las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., Lancet (mar. 15 de 1986):603-605 (1986); Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). De este modo se busca la eficacia máxima con la mínima toxicidad. Se ha informado de que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187 (1986)). Los fármacos usados en estos procedimientos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra). Las toxinas usadas en conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de difteria, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Mandler et al., Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)) y calicheamicina (Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)). Las toxinas pueden ejercer su efecto citotóxico y citostático por mecanismos que incluyen la unión a tubulina, la unión a ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a ligandos de receptores de proteínas o anticuerpos grandes.
Los agentes quimioterápicos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen en el presente documento (por ejemplo, anteriormente). Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bisacido (tales como bis(p-acidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2 ,6 -diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase, por ejemplo, el documento WO94/11026.
Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como una calicheamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en el presente documento. Los detalles con respecto a dichas toxinas de moléculas pequeñas se proporcionan en el documento WO2008/021290.
i. Maitansina y maitansinoides
En algunos ejemplos, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) de la invención conjugado a una o más moléculas de maitansinoide.
Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez a partir del arbusto del África oriental Maytenus serrata (patente de EE. UU. n.° 3896111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres C-3 de maitansinol (patente de EE. UU. n.° 4.151.042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se divulgan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
Los restos de fármaco maitansinoides son restos de fármaco atractivos en los conjugados anticuerpo-fármaco debido a que son: (i) relativamente accesibles de preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) susceptibles de derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de los conectores distintos de disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en el plasma y (iv) eficaces contra una variedad de líneas celulares tumorales.
Se divulgan inmunoconjugados que contienen maitansinoides, procedimientos de preparación de los mismos y su uso terapéutico, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 5.208.020, 5.416.064 y en la patente europea Ep 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células del cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugó por medio de un conector de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansinoide se sometió a prueba in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al del fármaco maitansinoide libre, lo que se podría incrementar incrementando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.
Los conjugados anticuerpo-maitansinoide se preparan enlazando químicamente un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o bien de la molécula de maitansinoide. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.208.020. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia en potenciar la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo potencie la citotoxicidad con respecto al uso de anticuerpo no marcado. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y se pueden sintetizar por técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se divulgan, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.208.020 y en las otras publicaciones de patentes y distintas de patente mencionadas anteriormente en el presente documento. Los maitansinoides preferentes son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como diversos ésteres de maitansinol.
Existen muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para preparar conjugados anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los divulgados en la patente de EE. Uu . n.° 5.208.020 o patente EP 0425235 B1, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) y publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2005/0169933. Los conjugados anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente conector SMCC se pueden preparar como se divulga en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2005/0169933. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles en ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles en peptidasa o grupos lábiles en esterasa, como se divulga en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferentes los grupos disulfuro y tioéter. Se describen y ejemplifican grupos de enlace adicionales en el presente documento.
Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-acido (tales como bis-(p-acidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-din¡trobenceno). Los agentes de acoplamiento en particular preferentes incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPp) para proporcionar un enlace disulfuro.
El conector se puede unir a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, se puede formar un enlace éster por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En un modo de realización preferente, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
ii. Auristatinas y dolastatinas
En algunos ejemplos, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado a dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolostatina, las auristatinas (patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinámica de microtúbulos, hidrólisis de GTP y división nuclear y celular (Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584 (2001)) y tienen actividad antineoplásica (patente de EE. UU. n.° 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965 (1998)). El resto de fármaco de dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo a través del extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) del resto de fármaco peptídico (documento WO 02/088172).
Los compuestos de auristatina ejemplares incluyen los restos de fármaco de monometilauristatina enlazados al extremo N DE y DF, divulgados en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", publicación de solicitud de EE. UU. n.° 2005/0238649.
Típicamente, se pueden preparar restos de fármaco a base de péptido formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química peptídica. Los restos de fármaco de auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos de: las patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588; Pettit et al., J. Nat. Prod. 44:482-485 (1981); Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 13:47-66 (1998); Poncet, Curr. Pharm. Des. 5:139-162 (1999); y Pettit, Fortschr. Chem. Org. Naturst.
70:1-79 (1997). Véanse también Doronina, Nat. Biotechnol. 21(7)778-784 (2003); y "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", publicación de solicitud de EE. UU. n.° 2005/0238649 (que divulga, por ejemplo, conectores y procedimientos de preparación de compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAf conjugados a conectores).
iii. Calicheamicina
En otros ejemplos, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de calicheamicina pueden producir roturas de ADN bicatenario en concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de calicheamicinas, véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de calicheamicina que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, Y11, 02 ', as', N-acetil-Y-11, PSAG y Oh (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses anteriormente mencionadas de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral con el que el anticuerpo se puede conjugar es QFA, que es un antifolato. Tanto calicheamicina como QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpos potencia en gran medida sus efectos citotóxicos.
iv. Otros agentes citotóxicos
Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar a los anticuerpos de la invención o preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos conjuntamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes de EE. UU. n.os 5.053.394 y 5.770.710, así como esperamicinas (patente de EE. UU. n.° 5.877.296).
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos (véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993).
Se puede formar un inmunoconjugado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desoxirribonucleasa; DNasa).
Para la destrucción selectiva de un tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el conjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los radiomarcadores u otros se pueden incorporar en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar por síntesis química de aminoácidos usando precursores aminoacídicos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores tales como Tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 se pueden unir por medio de un residuo cisteína en el péptido. El itrio-90 se puede unir por medio de un residuo lisina. El procedimiento IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
80:49-57 (1978)) se puede usar para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros procedimientos en detalle.
Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-acido (tales como bis-(p-acidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase, por ejemplo, el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).
El ADC se puede preparar con reactivos de reticulación: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.). Véanse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
v. Preparación de anticuerpos conjugados
En los anticuerpos conjugados, un anticuerpo se conjuga a uno o más restos (por ejemplo, restos de fármaco), por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos por anticuerpo, opcionalmente a través de un conector. Los anticuerpos conjugados se pueden preparar por varias vías, empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo: (1 ) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo conector bivalente por medio de un enlace covalente, seguido de reacción con un resto de interés; y (2 ) reacción de un grupo nucleófilo de un resto con un reactivo conector bivalente por medio de un enlace covalente, seguido de reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo. En el presente documento se describen procedimientos adicionales para preparar anticuerpos conjugados.
El reactivo conector puede estar compuesto de uno o más componentes conectores. Los componentes conectores ejemplares incluyen 6 -maleimidocaproílo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo ("SPP"), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo ("SMCC") y (4-yodo-acetil)aminobenzoato de N-succinimidilo ("SIAB"). Los componentes conectores adicionales son conocidos en la técnica y algunos se describen en el presente documento. Véase también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", publicación de solicitud de EE. UU. n.° 2005/0238649.
En algunos casos, el conector puede comprender residuos aminoacídicos. Los componentes conectores aminoacídicos ejemplares incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe). Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Los residuos aminoacídicos que comprenden un componente conector aminoacídico incluyen los que se producen de forma natural, así como aminoácidos menores y análogos aminoacídicos que no se producen de forma natural, tales como citrulina. Los componentes conectores aminoacídicos se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.
Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (I) grupos amina N terminales, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amino glucídicos cuando el anticuerpo es glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos conectores y reactivos conectores incluyendo: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimido. Determinados anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden volver reactivos para la conjugación con reactivos conectores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Por tanto, cada puente de cisteína formará, teóricamente, dos nucleófilos tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos se pueden introducir en el anticuerpo (o fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos aminoacídicos cisteína no naturales).
Los anticuerpos conjugados también se pueden producir por modificación del anticuerpo para introducir restos electrófilos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo conector o resto de fármaco u otro resto. Los glúcidos de anticuerpos glucosilados se pueden oxidar, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos conectores o restos de fármaco u otros restos. Los grupos de base de Schiff imina resultantes pueden formar un enlace estable, o se pueden reducir, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En un ejemplo, la reacción de la porción carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o bien con metaperyodato de sodio puede proporcionar grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco u otro resto (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otro ejemplo, las proteínas que contienen residuos serina o treonina N terminales pueden reaccionar con metaperyodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138-146 (1992); patente de EE. UU. n.° 5362852). Dicho aldehído se puede hacer reaccionar con un resto de fármaco o un nucleófilo conector.
Asimismo, los grupos nucleófilos en un resto (tal como un resto de fármaco) incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidracida que pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos conectores y reactivos conectores incluyendo: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; y (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimido.
De forma alternativa, se puede preparar una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis peptídica. La longitud del ADN puede comprender respectivas regiones que codifican las dos porciones del conjugado contiguas entre sí o bien separadas por una región que codifica un péptido conector que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Aún en otro modo de realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en la preselección tumoral en el que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al individuo, seguido de la retirada del conjugado no unido de la circulación usando un agente de aclaramiento y a continuación la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).
IX. Utilidad
Los presentes procedimientos proporcionados en el presente documento encuentran aplicabilidad industrial en la producción de proteínas heteromultiméricas. Los procedimientos según la invención reducen la cantidad de trabajo implicado en dos fermentaciones y aislamientos separados, ya que son dificultades técnicas inherentes a dos fermentaciones separadas. Además, la eliminación de las etapas de hibridación y redox de los procedimientos previos puede incrementar los rendimientos y disminuir la complejidad y los costes de procesamiento.
Las proteínas heteromultiméricas descritas en el presente documento encuentran uso, por ejemplo, en procedimientos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. La divulgación proporciona diversos procedimientos basados en el uso de una o más de estas moléculas. En determinadas condiciones patológicas, es necesario y/o deseable utilizar proteínas heteromultiméricas, por ejemplo, anticuerpos multiespecíficos. Estas proteínas heteromultiméricas se pueden usar para una variedad de propósitos, por ejemplo, como profilácticos y diagnósticos terapéuticos. Por ejemplo, la invención proporciona procedimientos para tratar una enfermedad, comprendiendo dichos procedimientos administrar a un sujeto que necesita tratamiento una proteína heteromultimérica, con lo que se trata la enfermedad. Cualquiera de las proteínas heteromultiméricas descritas en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos (o profilácticos o de diagnóstico) descritos en el presente documento.
Por ejemplo, cuando la proteína heteromultimérica es multivalente, un beneficio valioso es la avidez potenciada que poseen por su antígeno. Además de tener una alta afinidad intrínseca en una unidad de unión (es decir, un Fab) a la base de antígeno, los anticuerpos IgG normales también aprovechan el efecto de avidez para incrementar su asociación con antígenos como resultado de su unión bivalente hacia las dianas.
Una proteína heteromultimérica dirigida contra dos epítopos separados en la misma molécula de antígeno no solo puede proporcionar el beneficio de una avidez de unión potenciada (debido a la unión bivalente), sino que también puede adquirir propiedades novedosas que no se asocian con ninguno de los anticuerpos originales. Por tanto, las proteínas heteromultiméricas encuentran uso, por ejemplo, en el bloqueo de interacciones receptor-ligando.
Las proteínas heteromultiméricas descritas en el presente documento también encuentran uso en la aplicación de bloqueo simultáneo de las vías de señalización de dos dianas con una molécula.
X. Usos terapéuticos
Las proteínas heteromultiméricas tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo y/o fragmento del mismo preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento) se pueden usar para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, dichas proteínas heteromultiméricas se pueden usar para el tratamiento de tumores, incluyendo tumores precancerosos, no metastásicos, metastásicos y cancerosos (por ejemplo, cáncer en fase precoz), para el tratamiento de trastornos alérgicos o inflamatorios, o para el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, o para el tratamiento de un sujeto con riesgo de desarrollar cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, glioma o cáncer de ovario), un trastorno alérgico o inflamatorio, o una enfermedad autoinmunitaria.
El término cáncer abarca un grupo de trastornos proliferativos, incluyendo pero sin limitarse a neoplasias precancerosas, tumores benignos y tumores malignos. Los tumores benignos permanecen localizados en el sitio de origen y no tienen la capacidad para infiltrarse, invadir o metastatizar en sitios distantes. Los tumores malignos invadirán y dañarán otros tejidos a su alrededor. También pueden adquirir la capacidad de desprenderse de donde se iniciaron y propagarse a otras partes del cuerpo (metastatizar), normalmente a través de la circulación sanguínea o a través del sistema linfático donde se localizan los ganglios linfáticos. Los tumores primarios se clasifican por el tipo de tejido del que surgen; los tumores metastásicos se clasifican por el tipo de tejido del que se derivan las células cancerosas. Con el tiempo, las células de un tumor maligno se vuelven más anómalas y se parecen menos a células normales. Este cambio en la apariencia de las células cancerosas se denomina grado del tumor y las células cancerosas se describen como bien diferenciadas, moderadamente diferenciadas, poco diferenciadas o indiferenciadas. Las células bien diferenciadas tienen una apariencia bastante normal y se asemejan a las células normales a partir de las que se originaron. Las células indiferenciadas son células que se han vuelto tan anómalas que ya no es posible determinar el origen de las células.
El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor no sólido o de tejido blando. Los ejemplos de tumores de tejido blando incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica aguda en adultos, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica aguda de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica, leucemia prolinfocítica o tricoleucemia) o linfoma (por ejemplo, linfoma no hodgkiniano, linfoma cutáneo de linfocitos T o enfermedad de Hodgkin). Un tumor sólido incluye cualquier cáncer de tejidos corporales distintos de sangre, médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos se pueden separar además en los de origen en células epiteliales y los de origen en células no epiteliales. Los ejemplos de tumores sólidos de células epiteliales incluyen tumores del tubo gastrointestinal, colon, mama, próstata, pulmón, riñón, hígado, páncreas, ovario, cabeza y cuello, cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesícula biliar, labio, nasofaringe, piel, útero, órgano genital masculino, órganos urinarios, vejiga y piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores cerebrales y tumores óseos.
Los cánceres epiteliales en general evolucionan de un tumor benigno a una fase preinvasiva (por ejemplo, carcinoma in situ), a un cáncer maligno, que ha penetrado en la membrana basal e invadido el estroma subepitelial.
También se pueden usar complejos de proteínas multiespecíficas en estas aplicaciones terapéuticas, y en particular se pueden usar anticuerpos que se unen a HER2 para tratar cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, glioma o cáncer de ovario.
Otros sujetos que son candidatos para recibir las composiciones de la presente invención tienen, o están en riesgo de desarrollar, proliferación anómala de tejido fibrovascular, acné rosácea, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, oclusión arterial, queratitis atópica, úlceras bacterianas, enfermedad de Behpet, tumores de transmisión hemática, enfermedad obstructiva carotídea, neovascularización coroidea, inflamación crónica, desprendimiento de retina crónico, uveítis crónica, vitritis crónica, exceso de uso de lentillas, rechazo de injerto corneal, neovascularización corneal, neovascularización de injerto corneal, enfermedad de Crohn, enfermedad de Eales, queratoconjuntivitis epidémica, úlceras fúngicas, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zóster, síndromes de hiperviscosidad, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneración lipídica, enfermedad de Lyme, queratólisis marginal, úlcera de Mooren, infecciones por micobacterias distintas de lepra, miopía, enfermedad neovascular ocular, fosetas ópticas, síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu), osteoartritis, enfermedad de Paget, pars planitis, penfigoide, flictenulosis, poliarteritis, complicaciones posláser, infecciones por protozoos, pseudoxantoma elástico, queratitis seca por terigio, queratotomía radial, neovascularización retiniana, retinopatía de la prematuridad, fibroplasias retrolentales, sarcoidosis, escleritis, anemia drepanocítica, síndrome de Sogren, tumores sólidos, enfermedad de Stargart, enfermedad de Stevens-Johnson, queratitis límbica superior, sífilis, lupus sistémico, degeneración marginal de Terrien, toxoplasmosis, tumores de sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerosa, oclusión venosa, insuficiencia de vitamina A, sarcoidosis de Wegener, angiogénesis indeseada asociada con diabetes, enfermedades parasitarias, cicatrización de heridas anómala, hipertrofia tras cirugía, lesión o traumatismo (por ejemplo, lesión pulmonar aguda/SDRA), inhibición del crecimiento de cabello, inhibición de la ovulación y formación de cuerpo lúteo, inhibición de implante, e inhibición del desarrollo embrionario en el útero.
Los ejemplos de trastornos alérgicos o inflamatorios o enfermedades o trastornos autoinmunitarios que se pueden tratar usando un anticuerpo preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a artritis (artritis reumatoide tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, borreliosis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, artritis vertebral y artritis reumatoide de inicio juvenil, artrosis, artritis crónica progresiva, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades cutáneas hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis tal como psoriasis en placas, psoriasis en gotas, psoriasis pustular y psoriasis ungueal, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiforme y dermatitis atópica, síndrome de hiper-IgM ligado al cromosoma X, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmunitaria crónica, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistémica), esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (EM) tal como EM espino-óptica, EM progresiva primaria (EMPP) y EM en recidiva/remisión (EMRR), esclerosis sistémica progresiva, ateroesclerosis, arteriesclerosis, esclerosis múltiple y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales autoinmunitarias, colitis tal como colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagénica, colitis poliposa, enterocolitis necrosante y colitis transparietal, y enfermedad inflamatoria intestinal autoinmunitaria), piodermia gangrenosa, eritema nudoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hemático autoinmunitario, espondilitis reumatoide, hipoacusia repentina, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxia y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o del tronco encefálico, uveítis, tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior o uveítis autoinmunitaria, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN inmunitaria, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN membranoproliferativa o membranosa proliferativa (GNMP), incluyendo de tipo I y de tipo II, y GN de rápida progresión, afecciones alérgicas, reacción alérgica, eccema incluyendo eccema alérgico o atópico, asma tal como asma bronquial y asma autoinmunitario, afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adherencia de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus sistémico eritematoso tal como LES cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus eritematoso neonatal (LEN), lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrico, no renal, extrarrenal, discoide, alopecia), diabetes mellitus de tipo 1, incluyendo diabetes mellitus insulinoide pediátrica (IDDM), diabetes mellitus de tipo 2), diabetes autoinmunitaria, diabetes insípida idiopática, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y panarteritis nudosa), poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vasculitis necrosante, cutánea o por hipersensibilidad, vasculitis necrosante sistémica y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (SCS)), arteritis de células gigantes, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmunitaria, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmunitaria incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de la serie roja (APSR), insuficiencia del factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión multiorgánica tal como los posteriores a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpo antifosfolipídico, neuritis alérgica, enfermedad de Behqet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso y penfigoide cutáneo, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo de membrana mucosa y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis de inmunocomplejo, nefritis mediada por anticuerpo, neuromielitis óptica, polineuropatías, neuropatía crónica tal como polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (como se desarrolla por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y trombocitopenia autoinmunitaria o inmunitaria tal como púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) incluyendo PTI crónica o aguda, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovarios incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitarias, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o de la persona rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave asociada a timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonia, opsoclonía o síndrome de opsoclonía y mioclonía (SOM), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis crónica, hepatitis lúpica, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfática, bronquiolitis obliterante (distinta de trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía de IgA), nefropatía de IgA idiopática, dermatosis con depósitos lineales de IgA, cirrosis biliar primaria, neumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmunitario, celiaquía, enfermedad celíaca (enteropatía por gluten), esprúe resistente a tratamiento, esprúe idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), arteriopatía coronaria, enfermedad autoinmunitaria del αdo tal como enfermedad autoinmunitaria del αdo interno (EAOI), hipoacusia autoinmunitaria, síndrome de opsoclonía y mioclonía (SOM), policondritis tal como policondritis resistente a tratamiento o recidivada, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de linfocitos B monoclonales (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significado incierto, GMSI), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis segmentaria y focal (GESF), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno hepatológico autoinmunitario, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, disfunción esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infecundidad autoinmunitaria masculina y femenina, enfermedad del tejido conjuntivo mixto, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto habitual, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome poscardiotomía, síndrome de Cushing, neumopatía de los avicultores, angitis granulomatosa alérgica, angitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción por transfusión, lepra, malaria, leishmaniosis, tripanosomiasis, esquistosomosis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis cística, endoftalmia, eritema elevado persistente, eritroblastosis fetal, facitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariosis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis, o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infección por virus ECHO, miocardiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus de la rubéola, síndromes posvacunación, infección por rubéola congénita, infección por virus de Epstein-Barr, parotiditis, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmunitaria, corea de Sydenham, nefritis posestreptocócica, tromboangeítis obliterante, hipertiroidismo, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de células gigantes, oftamopatía endocrina, neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión por reperfusión e isquemia hereditaria benigna, autoinmunidad retiniana, inflamación de articulaciones, bronquitis, enfermedad de las vías respiratorias obstructiva crónica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioescleróticos, aspermiogenese, hemólisis autoinmunitaria, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, hipoacusia sensoneuronal, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmia simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, piodermia gangrenosa, tiroiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, infecundidad debida a anticuerpos anti-espermatozoides, timoma no maligno, vitiligo, enfermedades asociadas con el virus de Epstein-Barr e IDCG, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), parasitosis tales como leishmania, síndrome del choque tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que implican infiltración de linfocitos T, deficiencia de adherencia de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunitarias, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmunitaria, oftalmia simpática, enfermedades reumáticas, enfermedades del tejido conjuntivo mixto, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio adulto (AOIH), alopecia total, miocardiopatía dilatada, epidermólisis ampollosa adquirida (EAA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoide, frontal, maxilar o esfenoide, un trastorno eosinofílico tal como eosinofilia, eosinofilia con infiltración pulmonar, síndrome miálgico eosinofílico, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis-bronconeumonía, aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritis seronegativa, enfermedad autoinmunitaria poliendocrina, colangitis esclerosante, candidiasis mucocutánea crónica, esclerótica, epiesclerótica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia-telangiectasia, trastornos autoinmunitarios asociados con conjuntivopatía, reumatismo, enfermedad neurológica, trastorno por isquemia-reperfusión, reducción en la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, angiectasia, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y enfermedad concomitante con vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de tejidos miocárdicos u otros, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados con transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, inflamación grave aguda, inflamación intratable crónica, pielitis, neumonocirrosis, retinopatía diabética, trastorno diabético en arterias de gran tamaño, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis.
Además de los usos terapéuticos, los anticuerpos se pueden usar para otros propósitos, incluyendo procedimientos de diagnóstico, tales como procedimientos de diagnóstico para las enfermedades y afecciones descritas en el presente documento.
XI. Dosificaciones, formulaciones y duración
Las proteínas se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con buenas prácticas médicas. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" de las proteínas que se van a administrar estará condicionada por dichas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para evitar, mejorar o tratar un trastorno particular (por ejemplo, un cáncer, trastorno alérgico o inflamatorio o trastorno autoinmunitario). Las proteínas no lo necesitan, pero opcionalmente se formulan con uno o más agentes usados actualmente para evitar o tratar el trastorno. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de proteínas presentes en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y con vías de administración que las usadas anteriormente en el presente documento o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones empleadas hasta ahora. En general, el alivio o tratamiento de un cáncer implica la reducción de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con el cáncer. La cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede lograr uno o una combinación de lo siguiente: reducir (en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más) el número de células cancerosas; reducir o inhibir el tamaño tumoral o carga tumoral; inhibir (es decir, disminuir hasta cierto punto y/o detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; reducir la secreción hormonal en el caso de adenomas; reducir la densidad de vasos; inhibir la metástasis tumoral; reducir o inhibir el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En algunos ejemplos, las proteínas se usan para evitar la aparición o reaparición de cáncer o un trastorno autoinmunitario en el sujeto.
En algunos casos, las proteínas se pueden usar para incrementar la duración de la supervivencia de un sujeto humano susceptible de o diagnosticado con un cáncer o trastorno autoinmunitario. La duración de la supervivencia se define como el tiempo desde la primera administración del fármaco hasta la muerte. La duración de la supervivencia también se puede medir por el cociente de riesgos instantáneos (CRI) estratificado del grupo de tratamiento frente al grupo de control, que representa el riesgo de muerte para un sujeto durante el tratamiento.
El tratamiento incrementa significativamente la tasa de respuesta en un grupo de sujetos humanos susceptibles de o diagnosticados con un cáncer que se tratan con diversos tratamientos antineoplásicos. La tasa de respuesta se define como el porcentaje de sujetos tratados que respondieron al tratamiento. En un aspecto, el tratamiento de combinación de la invención que usa proteínas de la presente invención y cirugía, radioterapia, o uno o más agentes quimioterápicos incrementa significativamente la tasa de respuesta en el grupo de sujetos tratados en comparación con el grupo tratado con cirugía, radioterapia o quimioterapia solo, teniendo el incremento un valor de p de la prueba de la X2 de menos de 0,005. Mediciones adicionales de la eficacia terapéutica en el tratamiento de cánceres se describen en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 20050186208.
También se proporciona una composición que comprende una proteína heteromultimérica producida de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan usando procedimientos estándar conocidos en la técnica mezclando el ingrediente activo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences (20.a edición), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Los vehículos aceptables incluyen solución salina o tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alditoles tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN ™, PLURONICS™ o PEG.
Opcionalmente, pero preferentemente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferentemente cloruro de sodio, y preferentemente a aproximadamente concentraciones fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la concentración de conservante varía de un 0,1 a un 2,0 %, típicamente v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en las técnicas farmacéuticas. Alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno y propilparabeno son conservantes preferentes. Opcionalmente, las formulaciones pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable en una concentración de un 0,005 a un 0,02 %.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se ven afectadas adversamente entre sí. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.
Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína multimérica, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsula. Los ejemplos de matrices de liberación mantenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE. UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de Y-etilo, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando la(s) proteína(s) heteromultimérica(s) encapsulada(s) permanece(n) en el cuerpo durante mucho tiempo, se puede(n) desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que da como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.
Las proteínas descritas en el presente documento (por ejemplo, una proteína heteromultimérica tal como un anticuerpo multiespecífico preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento) se administran a un sujeto humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como una inyección intravenosa rápida o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o de inhalación. La administración local puede ser en particular deseada si los efectos secundarios extensos o la toxicidad se asocian con el antagonismo a la molécula diana reconocida por las proteínas. También se puede usar una estrategia ex vivo para aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo implican transfectar o transducir células obtenidas del sujeto con un polinucleótido que codifica una proteína de la presente invención. Las células transfectadas o transducidas se devuelven a continuación al sujeto. Las células pueden ser cualquiera de una amplia gama de tipos incluyendo, sin limitación, células hematopoyéticas (por ejemplo, células de la médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, linfocitos T o linfocitos B), fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos o células musculares.
En un ejemplo, el complejo de proteína (por ejemplo, una proteína heteromultimérica tal como un anticuerpo multiespecífico preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento) se administra por vía local, por ejemplo, por inyecciones directas, cuando el trastorno o la localización del tumor lo permiten, y las inyecciones se puede repetir periódicamente. El complejo de proteína también se puede suministrar de forma sistémica al sujeto o directamente a las células tumorales, por ejemplo, a un tumor o un lecho tumoral después de la extirpación quirúrgica del tumor, para evitar o reducir la recidiva local o metástasis.
XII. Artículos de fabricación
Otro aspecto de la divulgación es un artículo de fabricación que contiene una o más proteínas heteromultiméricas descritas en el presente documento y materiales útiles para el tratamiento o diagnóstico de un trastorno (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria o cáncer). El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una proteína heteromultimérica (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección particular. La ficha técnica o prospecto del envase comprenderá además instrucciones para administrar la composición de proteína heteromultimérica al sujeto. También se contemplan artículos de fabricación y kits que comprenden tratamientos combinatorios descritos en el presente documento.
Prospecto del envase se refiere a instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos. En determinados aspectos de la divulgación, el prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, glioma o cáncer de ovario.
Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales considerados desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
También se proporcionan kits que son útiles para diversos propósitos, por ejemplo, para purificación o inmunoprecipitación de un antígeno de las células. Para el aislamiento y purificación de un antígeno, el kit puede contener una proteína heteromultimérica acoplada a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Se pueden proporcionar kits que contienen la(s) proteína(s) heteromultimérica(s) para la detección y cuantificación del antígeno in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una inmunoelectrotransferencia. Como con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende al menos una proteína heteromultimérica (por ejemplo, anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo) de la invención. Se pueden incluir recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes y tampones o anticuerpos de control. La ficha técnica o prospecto del envase puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso in vitro o diagnóstico previsto.
En la divulgación experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (molar); μM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); μg (microgramos); l (litros); ml (mililitros); μl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μm (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grados centígrados); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milisegundos); ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos)); BsAb (anticuerpo biespecífico); Cl (dominio constante de la cadena ligera); Ch (dominio constante de la cadena pesada); CMC (citotoxicidad mediada por el complemento); Fab (fragmento de unión a antígeno); Fc (fragmento cristalizado); Fv (fragmento variable (Vl+Vh)); EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico); HC (cadena pesada); IGFR (receptor del factor de crecimiento insulínico); LC (cadena ligera); scFv (fragmento variable monocatenario (Vl y Vh unidos por un conector aminoacídico); VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular); VEGFR2 (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2); Vh (dominio pesado variable); Vl (dominio ligero variable).
Ejemplos
La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos que de ningún modo pretenden limitar el alcance de la invención como se reivindica. Las figuras adjuntas se deben considerar como partes integrales de la memoria descriptiva y la descripción de la invención. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.
Ejemplo 1: la proporción molar de los componentes monoméricos de un anticuerpo biespecífico en un cultivo celular combinado se puede controlar ajustando la proporción célula:célula
El siguiente ejemplo muestra la proporción molar de semianticuerpos de botón y ojal cuando dos líneas celulares de mamífero (células CHO), expresando cada una el semianticuerpo de botón o el semianticuerpo de ojal, crecieron en el mismo cultivo.
Se realizaron estudios de producción para determinar el valor de producción (es decir, la cantidad total de anticuerpo producido por células incluyendo semianticuerpo heterodímero, homodímero y monomérico) para cada línea celular. Las líneas celulares individuales se pasaron cada 3 o 4 días en medio para serie de siembra hasta que estuvieron disponibles los datos de valores de producción en las líneas celulares individuales.
A continuación, las dos líneas celulares crecieron y se indujeron para expresar el semianticuerpo de botón o semianticuerpo de ojal en cultivos separados. Los cultivos de línea celular de botón y de ojal individuales se pasaron en un matraz de agitación en un volumen de 40 ml cada 3 o 4 días en medio para serie de siembra. El día que se iban a combinar los cultivos, se midió el recuento celular por medio de Vicell (Beckman Coulter).
A continuación, los cultivos separados se combinaron en proporciones célula huésped de botón:célula huésped de ojal específicas. Se calculó la proporción célula huésped de botón:célula huésped de ojal en base al valor de producción conocido para las líneas celulares individuales. Para cada producción a pequeña escala, se requirieron aproximadamente 40x106 células. Usando el recuento de Vicell (células/ml), fue posible determinar el volumen de cada línea celular necesario para añadirse al cultivo combinado para lograr la proporción célula huésped de botón:célula huésped de ojal deseada. Se combinó el volumen apropiado de cada una de las líneas celulares de botón y ojal en un matraz de agitación nuevo con un volumen final de 40 ml en medios de producción.
15 horas antes de la obtención, se preparó solución madre de glutatión (GSH) disolviendo GSH en arginina 1 M (pH = 9,0) en ácido succínico 400 mM hasta una concentración de reserva de GSH de 250 mM. Se añadió solución madre de GSH al cultivo de producción de modo que la concentración de final de GSH fue de 15 mM. A continuación, se obtuvieron los medios de cultivo combinados y se determinaron el % de semianticuerpo de botón y % de semianticuerpo de ojal para cada cultivo combinado por medio de fase inversa en condiciones reductoras. El % de anticuerpo biespecífico covalente formado para cada proporción sometida a prueba se determinó como se describe en la figura 2.
Estos experimentos se realizaron con los siguientes pares semianticuerpo de botón/semianticuerpo de ojal:
anti-diana A (botón) / anti-diana B (ojal)
anti-diana C (botón) / anti-diana D (ojal)
anti-diana D (botón) / anti-diana C (ojal)
anti-diana E (botón) / anti-diana F (ojal)
Los resultados de estos experimentos se proporcionan en la tabla 2 a continuación:
Tabla 2
Figure imgf000055_0001
*N/D = no determinado
Como se muestra en la tabla 2, los rendimientos de % de anticuerpo biespecífico covalente se mejoraron cuando la proporción molar semianticuerpo de botón:semianticuerpo de ojal fue aproximadamente o cercana a 1:1. La proporción molar óptima para la formación biespecífica probablemente se determinaría para cada anticuerpo biespecífico específico. La proporción célula huésped de botón:célula huésped de ojal que produce una proporción molar semianticuerpo de botón:semianticuerpo de ojal 1:1 varía con la línea celular y se determina experimentalmente.
Ejemplo 2: variación del momento de adición de un reductor y la concentración de reductor añadido durante la producción del anticuerpo biespecífico en un cultivo celular combinado
El siguiente ejemplo muestra la adición de reductor durante diferentes fases de la producción de un anticuerpo biespecífico que comprende anti-diana A (botón) y anti-diana B (ojal). Dos líneas celulares de mamífero, que expresan anti-diana A (botón) o bien anti-diana B (ojal), inicialmente crecieron y se indujeron para expresar el semianticuerpo de botón o semianticuerpo de ojal en cultivos separados, que a continuación se combinaron en múltiples cultivos de producción separados para lograr una proporción molar 1:1 de anti-diana A (botón):anti-diana B (ojal), como se describe anteriormente. Se añadió solución madre de GSH a los cultivos de producción 24 horas, 15 horas o bien 4 horas antes de la obtención hasta una concentración final de 2 mM, 4 mM o 10 mM o los cultivos se dejaron sin tratar. A continuación, se obtuvieron los medios de cultivo combinados a partir de cada uno de los cultivos de producción y se determinaron el % de semianticuerpo de botón y % de semianticuerpo de ojal para cada cultivo combinado por medio de fase inversa en condiciones reductoras. El % de anticuerpo biespecífico covalente formado para cada proporción sometida a prueba se determinó como se describe en la figura 2.
Como se muestra en la figura 3, el rendimiento del anticuerpo biespecífico covalente en cultivos de producción que tienen una concentración final de GSH de 10 mM se mejoró en comparación con el rendimiento del anticuerpo biespecífico en cultivos de producción con una concentración final de GSH de 2 mM o 4 mM o el grupo de control sin tratar. No se demostró que la fase de producción en la que se añadió el GSH afectara al rendimiento del anticuerpo biespecífico covalente.
En otros experimentos, las líneas celulares, que expresan anti-diana A (botón) o bien anti-diana B (ojal), inicialmente crecieron y se indujeron para expresar el semianticuerpo de botón o semianticuerpo de ojal en cultivos separados, que a continuación se combinaron en múltiples cultivos de producción separados para lograr una proporción molar 0,82:1 o bien una proporción molar 1:1 de anti-diana A (botón):anti-diana B (ojal), como se describe anteriormente. Se añadió solución madre de GSH a los cultivos de producción 15 horas antes de la obtención hasta una concentración final de 5 mM o 10 mM o sin tratar ("0 mM"). Se determinó la viabilidad celular de cada cultivo celular combinado en la obtención y a continuación se determinó el % de anticuerpo biespecífico formado en cada condición sometida a prueba por medio de un ensayo de intercambio iónico como se muestra en la figura 2. Los resultados de los experimentos se muestran en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3
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*El valor se refiere a la cantidad total de anticuerpo producido por las dos líneas celulares en el cultivo combinado, por ejemplo, incluyendo semianticuerpo homodímero, heterodímero y monomérico.
Como se muestra en la tabla 3, el rendimiento del anticuerpo biespecífico covalente en cultivos de producción que tienen una concentración final de GSH de 10 mM se mejoró en comparación con el rendimiento del anticuerpo biespecífico en cultivos de producción con una concentración final de GSH de 5 mM o sin tratar. No se encontró que la adición de GSH al cultivo celular combinado hasta una concentración final de hasta 10 mM afectara la viabilidad celular o la producción de anticuerpos global. No se observó formación de disulfuro mixto no deseado o mezcla de proteínas a 10 mM de GSH (datos no mostrados).
Se realizaron experimentos similares con otras dos líneas celulares de mamífero, expresando cada una anti-diana D (botón) o bien anti-diana C (ojal). Las dos líneas celulares inicialmente crecieron y se indujeron para expresar anti-diana D (botón) o bien anti-diana C (ojal) en cultivos separados, que a continuación se combinaron en múltiples cultivos de producción separados para lograr una proporción molar 0,82:1 de anti-diana D (botón):anti-diana C (ojal), como se describe anteriormente. Se añadió solución madre de GSH a los cultivos de producción 15 horas antes de la obtención hasta una concentración final de 10 mM, 15 mM o 20 mM o sin tratar ("0 mM"). Se determinó la viabilidad celular de cada cultivo celular combinado en la obtención y a continuación se determinó el % de anticuerpo biespecífico formado en cada condición sometida a prueba como se muestra en la figura 2. Los resultados de estos experimentos se muestran en la tabla 4 a continuación.
Tabla 4
Figure imgf000057_0001
*El valor se refiere a la cantidad total de anticuerpo producido por las dos líneas celulares en el cultivo combinado, por ejemplo, incluyendo semianticuerpo homodímero, heterodímero y monomérico que se capturaron por una columna de proteína A.
Como se muestra en la tabla 4, el rendimiento del anticuerpo biespecífico covalente en cultivos de producción que tienen una concentración final de GSH de 20 mM se mejoró en comparación con el rendimiento del anticuerpo biespecífico en cultivos de producción con una concentración final de GSH de 10 mM o 15 mM o sin tratar. Se encontró que la adición de GSH al cultivo celular combinado hasta una concentración final de hasta 20 mM no afectó al valor. Sin embargo, cuando se añadió GSH a los cultivos de producción hasta una concentración final de 20 mM, se observó la modificación covalente del semianticuerpo por GSH (datos no mostrados).
Ejemplo 3: rendimiento de anticuerpo biespecífico formado en medio de cultivo combinado en comparación con ensamblaje in vitro
Se realizaron experimentos adicionales usando anti-diana E (botón) y anti-diana F (ojal) para comparar el rendimiento del anticuerpo biespecífico obtenido por un cultivo combinado de células huésped de mamífero (por ejemplo, células CHO) que expresan anti-diana E y células de mamífero (por ejemplo, células CHO) que expresan anti-diana F con el rendimiento del anticuerpo biespecífico obtenido combinando in vitro anti-diana E purificado (botón) y anti-diana F purificado (ojal) usando una columna de proteína A. En resumen, dos líneas celulares de mamífero, expresando cada una anti-diana E (botón) o bien anti-diana F (ojal), inicialmente crecieron y se indujeron para expresar el semianticuerpo de botón o semianticuerpo de ojal en cultivos separados. Los cultivos separados a continuación se combinan y crecen durante un período de tiempo adicional. Se obtuvo el medio de cultivo combinado y a continuación se determinó el % de anticuerpo biespecífico formado por medio de un ensayo de intercambio catiónico como se muestra en la figura 2. En paralelo, se formó un anticuerpo biespecífico combinando anti-diana E (botón) y anti-diana F (ojal) purificados in vitro (véase, por ejemplo, el documento WO2013/055958). El rendimiento final de anticuerpo biespecífico formado en ambas condiciones fue comparable (datos no mostrados).
Ejemplo 4: producción biespecífica
Se realizaron experimentos adicionales usando anti-diana G (botón) y anti-diana H (ojal) para someter a prueba si un anticuerpo anti-diana G/ anti-diana H biespecífico se puede formar a partir de una preparación de semianticuerpo anti-diana G purificado que comprende homodímero anti-diana G/anti-diana G y una preparación de semianticuerpo anti-diana H purificado que comprende homodímero anti-diana H/anti-diana H. Cultivos separados de células huésped de mamífero (por ejemplo, células CHO) que expresan de forma transitoria semianticuerpo anti-diana G (botón) y células huésped de mamífero (por ejemplo, células CHO) que expresan de forma transitoria semianticuerpo anti-diana H (ojal) crecieron y se obtuvieron, como se describe anteriormente.
Se capturó cada semianticuerpo en una columna de proteína A MabSURE SELECT de 5 ml. A continuación se lavó la columna con 10 volúmenes de columna (VC) de los siguientes tampones: un tampón de equilibrio que consistía en TRIS 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,05 %, Triton X-114 al 0,05 %, un tampón de lavado que consistía en citrato de sodio 25 M, pH 6,0. Se eluyó cada brazo en acetato de sodio 0,15 M, pH 2,7. La identidad de cada semianticuerpo se confirmó por EM.
En el caso del biespecífico, cada semianticuerpo se valoró independientemente hasta pH 5,0 usando TRIS-arginina 1 M 1:10, pH 9,0, a continuación se combinó conjuntamente en una proporción de 1:1. A continuación, la mezcla se valoró a pH 8,5 usando TRIS-arginina 1 M 1:10, pH 9,0 y se dejó a temperatura ambiente durante 3 días después de la adición de un exceso de L-glutatión reducido 0,5 M recién preparado (Sigma Aldrich) en una proporción molar de 1:200. La reacción se comprobó por EM para el ID de biespecífico.
Los grupos de captura de botón y ojal se procesaron en SDS PAGE con Tris-glicina al 4-20 %, revelando la presencia de bandas correspondientes al peso molecular del semianticuerpo y homodímero en cada grupo de captura. Véase la figura 4. Además, después de la captura de MabSURE SELECT, se cargaron 0,5 mg de cada uno en una columna de hidrofobia (2,1 x 100 mm). El tampón de migración fue fosfato de potasio 25 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 6,5 y el tampón de elución fue fosfato de potasio 25 mM, pH 6,5, isopropanol al 25 %. Los cromatogramas reflejaron la heterogeneidad observada con el gel y también revelaron diferencias en el tiempo de retención del pico principal. Véanse las figuras 5A y 5B, que muestran los cromatogramas para anti-diana G (botón) y anti-diana H (ojal), respectivamente. Las cantidades de homodímero y semianticuerpo en los grupos de captura pueden variar dependiendo de los anticuerpos específicos.
Después del tratamiento con glutatión, el biespecífico también se cargó en la columna de hidrofobia. El cromatograma reveló un único pico principal (>90 %), con un tiempo de retención entre los de cada semianticuerpo. Véase la figura 6. EM confirmó que el pico principal era biespecífico. Estos resultados sugieren que existe un homodímero covalente presente en los grupos de captura de semianticuerpo, y que el homodímero se puede romper usando las condiciones de ensamblaje citadas anteriormente y está disponible para la formación biespecífica.
Las condiciones de ensamblaje biespecífico se examinaron además comparando el ensamblaje de anti-diana A (botón) y anti-diana B (ojal) en medio de cultivo combinado en ausencia de GSH frente a en presencia de GSH 10 mM.
Se transfectaron células CHO usando lipofectamina 2000 de acuerdo con la recomendación del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células transfectadas se seleccionaron a diversas concentraciones de MSX (metionina sulfoximina, 25 y 50 uM). Se evaluaron las colonias seleccionadas para determinar la producción de anticuerpo muestreando el sobrenadante de las colonias y analizando por ELISA. Para preparar un grupo estable, sobre la base de los valores de ELISA, se combinaron y ampliaron a escala los 48 clones superiores. Los clones individuales también se expandieron y ampliaron a escala para la evaluación de la productividad de anticuerpo para determinar los clones superiores.
Después, se usaron 40 l de cultivo y las células se sembraron a 1,2x106 células/ml en 2,8 l de medio de cultivo. El cultivo se dividió regularmente y se agitó a 90 rpm y se mantuvo en un punto de ajuste de pH de 7,0 ± 0,03 y oxígeno disuelto al 30 % (dO2). Se añadió GSH 15 mM el día 11, seguido de la obtención de células el día 12.
El medio de cultivo libre de células tratado con GSH y sin tratar se procesaron cada uno con MabSURE SELECT y los grupos de captura se analizaron usando ESI-TOF. Véase la figura 7A. La figura 7B muestra una ampliación del intervalo m/z del pico de anticuerpo biespecífico (pico derecho como se muestra en 7A). La figura 7C muestra una ampliación del intervalo m/z del pico de semianticuerpo (pico izquierdo como se muestra en 7A).
Las figuras 7A-C muestran que las abundancias de pico de homodímero y semianticuerpo se reducen visiblemente cuando se añade GSH 10 mM al cultivo, lo que demuestra que la formación biespecífica está impulsada por el contenido tanto del semianticuerpo como del homodímero presentes en el cocultivo. La medida en que cada homodímero participa en la formación del anticuerpo biespecífico depende del semianticuerpo particular.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de preparación de un anticuerpo biespecífico que comprende i) una primera cadena pesada de anticuerpo que comprende una modificación de botón, que comprende una sustitución T366W (numeración EU), en el que la primera cadena pesada de anticuerpo se asocia con una primera cadena ligera y ii) una segunda cadena pesada de anticuerpo que comprende una modificación de ojal, que comprende dos o más sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo que consiste en T366S, L368A e Y407V (numeración EU), en el que la segunda cadena pesada de anticuerpo se asocia con una segunda cadena ligera, en el que la modificación de ojal interactúa con la modificación de botón en una interfase, y en el que la primera y segunda cadena pesada de anticuerpo se enlazan por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) cultivar un cultivo combinado de una primera célula huésped y una segunda célula huésped, en el que la primera célula huésped expresa la primera cadena pesada de anticuerpo y la primera cadena ligera, en el que la segunda célula huésped expresa la segunda cadena pesada de anticuerpo y la segunda cadena ligera, y en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped son cada una una célula de mamífero;
(b) añadir glutatión reducido (GSH) al cultivo combinado para lograr una concentración final de 5 mM a 20 mM; y (c) obtener un medio de cultivo combinado del cultivo combinado sin romper la membrana celular de 4 a 24 horas después de añadir el GSH al cultivo combinado, en el que obtener comprende retirar la primera célula huésped y la segunda célula huésped del medio de cultivo combinado, en el que el medio de cultivo combinado comprende el anticuerpo biespecífico, y en el que el anticuerpo biespecífico es humano o humanizado.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo combinado se obtiene 15 horas después de que se añade el GSH.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el medio de cultivo combinado se incuba durante de 4 horas a 7 días.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera célula huésped y la segunda célula huésped se cultivan por separado antes de combinarse en un cultivo combinado.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el GSH se añade al cultivo celular combinado para lograr una concentración final de una cualquiera de 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM o 20 mM; preferentemente en el que la concentración final es 15 mM.6
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera y/o la segunda célula huésped es
a) una célula CHO; y/o
b) una línea celular estable.
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