CN106471117A - 使用哺乳动物细胞产生异多聚体蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了用于高效产生能够与多于一种靶特异性结合的抗体和其他多聚体蛋白复合物(在本文统称为异多聚体蛋白)的方法。靶可以例如是位于单个分子上或位于不同分子上的不同表位。

Description

使用哺乳动物细胞产生异多聚体蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月6日提交的美国临时申请号61/989,509的优先权益，所述文献因而通过引用的方式完整并入。
技术领域
本发明涉及用于产生异多聚体蛋白的方法。
背景技术
IgG型单克隆抗体含有两个相同的抗原结合臂和恒定结构域(Fc)。在其结合臂中具有不同特异性的抗体通常在自然界中不存在并且因此不得不借助化学工程(例如，化学的交联等)、重组DNA和/或细胞融合技术创造。
双特异性抗体可以同时结合两种不同的抗原。这种性质使得能够开发采用常规单克隆抗体时不可能的治疗策略。已经开发的一大类构想的双特异性抗体样式反映了对这类分子的强烈兴趣。参见Berg J,Lotscher E,Steimer KS等人,“Bispecific antibodiesthat mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus ofany strain,”Proc Natl Acad Sci USA(1991)88(11):4723-4727和Fischer N and LegerO.,“Biospecific Antibodies:Molecules That Enable Novel TherapeuticStrategies,”Pathobiology(2007)74:3-14。
另一个类别的多特异性分子是重组融合蛋白。由免疫调节蛋白的胞外结构域和免疫球蛋白(Ig)的恒定(Fc)结构域组成的重组融合蛋白代表一个日益增长的人用治疗药类别。免疫黏附素将具有所需特异性的蛋白质序列的结合区与抗体的效应子结构域组合。免疫黏附素具有对其作为治疗药的潜力有意义的两个重要特性：靶特异性和药代动力学稳定性(与抗体可比较的体内半寿期)。免疫黏附素可以作为拮抗剂用于抑制或阻断有害相互作用或作为激动剂用于模拟或增强生理学反应。参见Chamow SM,Zhang DZ,Tan XY等人,“Ahumanized,bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+effectors tokill HIV-1-infected cells,”J Hematother 1995；4(5):439-446。
已经在其他地方讨论其他多特异性分子。例子包括但不限于：Fisher等人,Pathobiology(2007)74:3-14(多种双特异性样式的综述)；2003年12月9日授予Feige等人的美国专利号6,660,843(肽体(peptibody))；2002年1月10日公开的美国专利公开号2002-004587(多特异性抗体)；2009年11月3日授予Wu等人的美国专利号7612181(双重可变结构域样式)；美国专利号6,534,628；Nord K等人,Prot Eng(1995)8:601-608；Nord K等人,NatBiotech(1997)15:772-777和等人,Biotechnol Appl Biochem.(2008)Jun；50(Pt 2):97-112(亲和体(Affibodies))；Martens等人,Clin Cancer Res(2006),12:6144-6152以及Jin等人,Cancer Res(2008)68(11):4360-4368(单臂抗体)；Bostrom等人,Science(2009)323:1610-1614(双重作用Fab,aka混合价态抗体)。其他样式是本领域技术人员已知的。
对于上文描述的多特异性分子，临床级材料的生产仍有挑战性。如上文所示，存在许多途径以产生具有混合型结合臂(即，彼此不相同的结合臂)的分子。这些方法各自具有其缺点。
化学交联法耗费人力，因为仍可能需要从同型二聚体和其他不想要的副产物中纯化出相关种类。此外，化学修饰步骤可能改变蛋白质的完整性，因此导致低劣稳定性。因此，这种方法经常无效并且可能导致抗体活性丧失。
细胞-融合技术(例如，杂交瘤)表达随机装配的两条重链和两条轻链，从而导致产生10种抗体组合。所需的异多聚体抗体仅是如此产生的抗体的小部分。纯化所需的异多聚体蛋白大幅度降低产率并增加生产成本。
重组DNA技术已经用来产生不包含Fc结构域的多种异多聚体样式，例如，单链Fv、双体抗体等。这种类型的抗体分子的重大缺陷是缺少Fc结构域并且因此缺少抗体触发效应子功能(例如，补体激活、Fc-受体结合等)的能力。因此，需要包含有功能的Fc结构域的双特异性抗体。
重组DNA技术也已经用来产生‘结入孔’双特异性抗体。参见美国专利申请20030078385(Arathoon等人,-Genentech)。这种策略的一个局限是因在相同的细胞中表达，两种亲本抗体的轻链不得不相同以防止错误配对及形成非预期和/或无活性的分子。
因此，仍需要产生异多聚体蛋白的备选方法。本文所述的发明提供这类方法。本发明的这些和其他方面和优点将从本文中提供的发明描述显而易见。
发明简述
本发明提供胜过本领域已知方法的在哺乳动物细胞中产生多特异性免疫球蛋白复合物(例如，多特异性抗体)和其他多聚体蛋白(在本文统称为异多聚体蛋白)的高效和新颖方法。参见WO 2013/055958和WO 2011/133886。
因此，在第一方面，提供了制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链的第一宿主细胞；
(b)培养能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链的第二宿主细胞；并且，
(c)获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白，并且其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，合并的培养基在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养物。
还提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链的第一宿主细胞，其中包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体分泌；
(b)培养能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链的第二宿主细胞，其中包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体分泌；
(c)在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并培养基，其中合并的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(d)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(e)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养物。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一含有铰链的多肽和第二含有铰链的多肽包含第一和第二重链。在根据(或如适用于)本文所述任何实施方案的某些实施方案中，第一含有铰链的多肽和第一轻链包含第一半抗体。在根据(或如适用于)本文所述任何实施方案的某些实施方案中，第二含有铰链的多肽和第二轻链包含第二半抗体。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，获得合并的培养基包括：(1)收获第一宿主细胞培养物的第一培养基；
(2)收获第二宿主细胞培养物的第二培养基；并且
(3)合并第一培养基和第二培养基以获得合并的培养基。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，获得合并的培养基包括收获合并细胞培养物的培养基，所述合并细胞培养物包含第一宿主细胞和宿主细胞。在某些实施方案中，合并的培养基在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得。
在本发明方法中的第一和第二宿主细胞可以在允许表达和分离目的多肽的任何环境下培养。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一宿主细胞和第二宿主细胞在合并入合并的细胞培养物之前分别培养。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括步骤：在约25℃至约40℃的温度培养合并的细胞培养物。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，在获得合并的培养基后，孵育合并的培养基约24小时至约7天。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，合并的培养基在约4℃至约8℃孵育。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，搅拌合并的培养基。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括从合并的培养基分离异多聚体蛋白。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，使用蛋白A柱分离异多聚体蛋白。在某些实施方案中，使用本领域已知的方法进一步纯化异多聚体蛋白。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括在收获第一和第二细胞培养基之前或之后，添加还原剂至第一细胞培养基和/或至第二细胞培养基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括在收获合并细胞培养物的培养基之前添加还原剂至合并细胞培养物的培养基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂在收获步骤之前约4至约24小时、约5至约20小时、约10至约20小时、约10至约15小时、或约15至约18小时添加。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将还原剂在收获步骤之前约15小时添加。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的细胞培养基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将含有还原剂的合并培养基进一步孵育约4小时至约7天。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将含有还原剂的合并培养基进一步孵育约15小时。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，从合并的培养基分离异多聚体蛋白之前添加还原剂至合并的培养基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将含有还原剂的合并培养基在分离异多聚体蛋白之前孵育至少约24小时。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将含有还原剂的合并培养基在分离异多聚体蛋白之前孵育至少约48小时。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，使用蛋白A柱分离异多聚体蛋白。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂选自谷胱甘肽、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、半胱氨酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇、半胱氨酸二硫苏糖醇、二硫丁胺或其组合。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约5mM至不多于约20mM的浓度添加。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约2mM至约10mM的浓度添加。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约5mM至少于约20mM的浓度添加。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约15mM的浓度添加。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一宿主细胞是稳定细胞系。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第二宿主细胞是稳定细胞系。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一宿主细胞是CHO细胞。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第二宿主细胞是CHO细胞。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，调整第一宿主细胞和第二宿主细胞的比率，从而当第一宿主细胞培养物和第二宿主细胞培养物合并以形成合并的培养物时，第一含有铰链的多肽和第二含有铰链的多肽的摩尔比是约1:10至约10:1。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，当第一宿主细胞培养物和第二宿主细胞培养物合并以形成合并的培养物时，第一宿主细胞表达的第一含有铰链的多肽和第二宿主细胞表达的第二含有铰链的多肽的摩尔比是1:1。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，含有铰链的多肽包含Fc区或其变体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一和/或第二含有铰链的多肽包含抗体重链。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一异二聚化结构域在界面处包含结修饰并且第二异二聚化结构域在界面处包含孔修饰。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，结修饰包括来自第一异二聚化结构域的原始氨基酸残基置换为侧链比原始氨基酸残基更大的氨基酸残基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，置换用氨基酸残基选自色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和精氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，孔修饰包括来自第二异二聚化结构域的原始氨基酸残基置换为侧链比原始氨基酸残基更小的氨基酸残基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，置换用氨基酸残基选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，结修饰包括T366W置换(EU编号)。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，孔修饰包括选自T366S、L368A和Y407V(EU编号)的两个或更多个氨基酸置换。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，所述链间二硫键在铰链区之间。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，异多聚体蛋白是抗体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，异多聚体蛋白是双特异性抗体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体或人抗体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，抗体是全长抗体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，抗体是包含人CH2和/或CH3结构域的至少一部分的抗体片段。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，抗体选自IgG、IgA和IgD。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，抗体是IgG。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2或IgG4。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一轻链和第二轻链包含不同的可变结构域序列。
在另一个方面，提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并培养物，其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞；
(b)添加还原剂至合并的培养物；并且
(c)在不破坏细胞膜的情况下从合并的培养物收获合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白。
在某些实施方案中，第一宿主细胞分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体，其中第二宿主细胞分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体，其中合并的培养物包含第一同型二聚体和第二同型二聚体。在某些实施方案中，添加还原剂至合并的培养物允许形成异多聚体蛋白。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，在合并的培养物已经培养不多于约18天后添加还原剂。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，在添加还原剂后4小时至24小时收获合并的培养基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，收获合并的培养基的步骤包括从合并的培养基移除第一宿主细胞和第二宿主细胞。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，孵育合并的培养基4小时至7天。
在某些实施方案中，该方法还包括步骤：调节合并的培养物中第一宿主细胞和第二宿主细胞的细胞:细胞比率。在某些实施方案中，调节细胞:细胞比率，从而在合并的培养基中表达自第一宿主细胞的第一含有铰链的多肽(具有缔合的轻链)对表达自第二宿主细胞表达的第二含有铰链的多肽(具有缔合的轻链)第二含有铰链的多肽的摩尔比达到所需的摩尔比。在某些实施方案中，宿主细胞是稳定细胞系。在某些实施方案中，稳定细胞系用能够表达含有铰链的多肽和轻链的核酸分子稳定转染。
应当理解，本发明的方法可以包括其他步骤，所述其他步骤通常是对于启动和/或完成如本文所述的本发明方法所涵盖的过程而言显而易见的例行步骤。例如，在一个实施方案中，本发明方法的步骤(a)前置有一个步骤，其中将编码第一含有铰链的多肽的核酸引入第一宿主细胞并且将编码第二含有铰链的多肽的核酸引入第二宿主细胞。在一个实施方案中，本发明的方法还包括步骤：纯化具有针对至少两个不同靶的结合特异性的异多聚体蛋白。
在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第一含有铰链的多肽和第一轻链(或其缔合的轻链)包含针对第一靶的第一结合结构域。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，第二含有铰链的多肽和第二轻链(或其缔合的轻链)包含针对第二靶的第二结合结构域。第一和第二靶可以是位于单个分子上或位于不同分子上的不同表位。
在另一个方面，提供了采用上述任何方法产生的异多聚体蛋白。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，异多聚体蛋白是双特异性抗体。还提供是包含采用上述任何方法产生的异多聚体蛋白(如双特异性抗体)和可药用载体的组合物。
本发明的异多聚体蛋白通常能够结合、优选地特异性结合至抗原。此类抗原例如包括肿瘤抗原、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与(例如，已知或疑似在功能上有助于)组织发育或分化相关的分子、细胞表面分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、参与血管发生的分子和与(例如，已知或疑似在功能上有助于)血管生成相关的分子。能够与本发明异多聚体蛋白结合的抗原可以是上述分类之一的子类中的成员，其中所述分类的其他子类包含(相对于目的抗原)具有不同特征的其他分子/抗原。目的抗原也可以视为属于两个或更多个类别。在一个实施方案中，本发明提供结合、优选地特异性结合并非细胞表面分子的肿瘤抗原的异多聚体蛋白。在一个实施方案中，肿瘤抗原是细胞表面分子，如受体多肽。在另一个例子中，在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白结合、优选地特异性结合并非簇分化因子的肿瘤抗原。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白能够结合、优选地特异性结合至簇分化因子，所述簇分化因子在一些实施方案中不是例如CD3或CD4。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白是抗VEGF抗体。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白是选自以下者的双特异性抗体：IL-1α/IL-1β、IL-12/IL-18；IL-13/IL-9；IL-13/IL-4；IL-13/IL-5；IL-5/IL-4；IL-13/IL-lβ；IL-13/IL-25；IL-13/TARC；IL-13/MDC；IL-13/MEF；IL-13/TGF-β；IL-13/LHR激动剂；IL-12/TWEAK、IL-13/CL25；IL-13/SPRR2a；IL-13/SPRR2b；IL-13/ADAM8、IL-13/PED2、IL17A/IL17F、CD3/CD19、CD138/CD20；CD138/CD40；CD19/CD20；CD20/CD3；CD38/CD138；CD38/CD20；CD38/CD40；CD40/CD20；CD-8/IL-6；CD20/BR3、TNFα/TGF-β、TNFα/IL-1β；TNFα/IL-2、TNFα/IL-3、TNFα/IL-4、TNFα/IL-5、TNFα/IL6、TNFα/IL8、TNFα/IL-9、TNFα/IL-10、TNFα/IL-11、TNFα/IL-12、TNFα/IL-13、TNFα/IL-14、TNFα/IL-15、TNFα/IL-16、TNFα/IL-17、TNFα/IL-18、TNFα/IL-19、TNFα/IL-2、TNFα/IL-2、TNFα/IFNα、TNFα/CD4、TNFα/VEGF、TNFα/MIF、TNFα/ICAM-1、TNFα/PGE4、TNFα/PEG2、TNFα/RANK配体、TNFα/Te38；TNFα/BAFF；TNFα/CD22；TNFα/CTLA-4；TNFα/GP130；TNFα/IL-12p40；VEGF/HER2、VEGF-A/HER2、VEGF-A/PDGF、HER1/HER2、VEGF-A/VEGF-C、VEGF-C/VEGF-D、HER2/DR5、VEGF/IL-8、VEGF/MET、VEGFR/MET受体、VEGFR/EGFR、HER2/CD64、HER2/CD3、HER2/CD16、HER2/HER3；EGFR/HER2、EGFR/HER3、EGFR/HER4、IL-13/CD40L、IL4/CD40L、TNFR1/IL-1R、TNFR1/IL-6R、TNFR1/IL-18R、EpCAM/CD3、MAPG/CD28、EGFR/CD64、CSPGs/RGM A；CTLA-4/BTNO2；IGF1/IGF2；IGF1/2/Erb2B；MAG/RGM A；NgR/RGM A；NogoA/RGM A；OMGp/RGM A；PDL-I/CTLA-4；和RGM A/RGM B、IL1β/IL18、NRP1/VEGFA、VEGFA/NRP2、cMET/EGFR、ALK1/BMP9、VEGFA/α5β1、HER1/HER3-BU和CMV。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白与选自以下的至少两种靶分子结合：α5β1、ALK1、BMP9、IL-1α、IL-1β、TARC、MDC、MEF、TGF-β、LHR激动剂、TWEAK、CL25、SPRR2a、SPRR2b、ADAM8、PED2、CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD40、CD38、CD64、CD138、CD-8、BR3、TNFα、TGF-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17A、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-23、IL-25、IFNα、MIF、ICAM-1、PGE4、PEG2、RANK配体、Te38、BAFF、CTLA-4、GP130、IL-12p40、VEGF、VEGF-A、PDGF、HER1、HER2、HER3、HER3-BU、HER4、VEGF-C、VEGF-D、DR5、cMET、MET、MET受体、VEGFR、EGFR、CD40L、TNFR1、IL-1R、IL-6R、IL-18R、EpCAM、MAPG、CSPGs、BTNO2、IGF1、IGF2、IGF1/2、Erb2B、MAG、NgR、NogoA、NRP1、NRP2、OMGp、PDL-I、RGM A和RGM B。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白与CD3和选自以下的至少一种额外靶分子结合：BLR1、BR3、CD19、CD20、CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180(RP105)、CR2、FcRH1、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-DOB和NAG14。
可以修饰异多聚体蛋白以增强和/或添加额外的所需特征。这类特征包括生物学功能如免疫效应子功能、合乎需要的体内半寿期/清除率、生物利用率、生物分布或其他药代动力学特征。这类修饰是本领域熟知的并且也可以经验地确定，并且可以包括借助可以基于或可以不基于肽的部分进行修饰。例如，抗体可以是糖基化或无糖基化的，通常至少部分地取决于宿主细胞的性质。优选地，本发明的抗体是无糖基化的。通过本发明方法产生的无糖基化抗体可以随后例如通过使用本领域熟知的体外糖基化方法糖基化。如上文和本文中所述，可以在原核细胞(如，大肠杆菌)中产生本发明的异多聚体蛋白。大肠杆菌产生的异多聚体蛋白通常是无糖基化的并且缺少正常情况下与哺乳动物宿主细胞(例如，CHO)产生的异多聚体蛋白中存在的糖基化特征相关的生物学功能。
本发明也提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与异源部分缀合的本发明异多聚体蛋白。任何异源部分将是合适的，只要其与抗体的缀合不实质降低抗体的所需功能和/或特征。例如，在一些实施方案中，免疫缀合物包含作为细胞毒性药物的异源部分。在一些实施方案中，所述细胞毒药物选自放射性同位素、化疗药和毒素。在一些实施方案中，所述毒素选自卡奇霉素、美坦生和单端孢霉烯。在一些实施方案中，免疫缀合物包含作为可检测标记物的异源部分。在一些实施方案中，所述可检测标记物选自放射性同位素、配体-受体对的成员、酶-底物对的成员和荧光共振能量转移对的成员。
在另一个方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含多核苷酸或重组载体，所述多核苷酸或重组载体编码上文描述的异多聚体蛋白的第一含有铰链的多肽，其中宿主细胞不表达异多聚体蛋白的第二含有铰链的多肽。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，含有铰链的多肽是抗体重链。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，含有铰链的多肽与抗体轻链配对。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，宿主细胞是稳定细胞系。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。
本发明的其他目的，特征和优点将从以下详述变得显而易见。然而，应当理解尽管详细描述和具体实施例表示本发明的优选实施方案，然而它们仅以说明的方式给出，因为处于本发明精神范围内部的各种变化和修改将是本领域技术人员从这种详述显而易见的。
本文援引的全部参考文献均通过引用的方式完整并入。
附图简述
图1A显示完全氧化的半抗体。未显示“结”或“孔”或其他异二聚化结构域。本图中所述的半抗体是IgG1同种型。本领域技术人员将理解，可以将其他免疫球蛋白同种型构思为具有相应链间和链内键的半抗体。在完整的Ab中，铰链半胱氨酸将形成链间二硫键。
图1B显示全长双特异性抗体。未描述铰链区中的重链间二硫键。
图2显示可以用来确定半抗体％和共价双特异性抗体％的两种测定法的流程图
图3显示在收获合并的培养基之前4小时、15小时或24小时添加还原剂至合并的细胞培养物时形成的双特异性抗体％，所述合并的细胞培养物包含表达抗靶A(结)的第一哺乳动物宿主细胞和表达抗靶B(孔)的第二哺乳动物宿主细胞。
图4显示在4％-20％Tris-甘氨酸SDS PAGE上运行的结捕获汇集物和孔捕获汇集物。
图5A显示抗靶G的基于疏水性分离的样品的色谱图，其中同型二聚体和半抗体共同洗脱入一个宽峰。图5B显示抗靶H的基于疏水性分离的样品的色谱图。
图6显示抗靶G/抗靶H双特异性抗体的质谱结果。
图7A显示对未处理的和GSH处理的合并培养基进行的电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF MS)的实验结果，其中抗靶A半抗体和抗靶B半抗体分泌入所述合并的培养基。图7B显示双特异性抗体峰的m/z范围的放大图。图7C显示半抗体峰的m/z范围的放大图。
缩写
ADCC＝抗体依赖的细胞介导的细胞毒性
API＝抗病原体免疫黏附素
BP＝杀菌/通透性增加蛋白
C1q＝补体因子1q
CD＝分化簇
CDC＝补体依赖的细胞毒性
CH1或CH1＝重链第一恒定结构域
CH2或CH2＝重链第二恒定结构域
CH3或CH3＝重链第三恒定结构域
CH4或CH4＝重链第四恒定结构域
CL或CL＝轻链恒定结构域
CT＝细胞毒T淋巴细胞相关分子
Fc＝可结晶片段
FcR＝IgG Fc部分的受体γ
HIV＝人类免疫缺陷病毒
ICAM＝胞间黏附分子
BsAb＝双特异性抗体
BsDb＝双特异性双体抗体
dsFv＝二硫键稳定的Fv
Fc＝抗体的恒定片段
Fd＝抗体的VH+CH1
FcR＝Fc受体
Fv＝抗体的可变片段
IgG＝免疫球蛋白G
mAb＝单克隆抗体
PBL＝外周血淋巴细胞
scDb＝单链双体抗体
scFv＝单链Fv
(scFv)2＝scFv-scFv串联
Tandab＝串联双体抗体
VH或VH＝抗体重链的可变结构域
VL或VL＝抗体轻链的可变结构域
发明详述
仅使用以下定义和例子，本发明现在将以参考方式详述。本文提到的全部专利和出版物，包括这些专利和出版物内公开的所有序列在内，均明确地通过引用的方式并入。
除非本文中另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology,第2版,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale与Markham,Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料可以用于实施或检验本发明中，然而描述优选的方法和材料。数值范围包括界定该范围的数值。除非另外说明，核酸从左至右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左至由以氨基至羧基方向书写。关于本领域的定义和术语，尤其指导实施者参考Sambrook等人,1989、和Ausubel FM等人,1993。应当理解本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为它们可以变动。
数值范围包括界定该范围的数值。
除非另外说明，核酸从左至右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左至由以氨基至羧基方向书写。
本文提供的小标题不是本发明的各个方面或实施方式的限制，其中可以通过参考作为一个整体的本说明书来获得本发明。因此，通过整体地参考本说明书更完整地描述下文立即定义的术语。
I.定义
“异多聚体”、“异多聚体复合物”或“异多聚体蛋白”指一种分子，所述分子包含具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接。异多聚体可以包含由第一含有铰链的多肽、第一轻链、第二含有铰链的多肽和第二轻链形成的“异二聚体”。备选地，异多聚体可以例如形成双特异性抗体。异多聚体的多肽可以通过非肽的共价键(例如，二硫键)和/或非共价相互作用(例如，氢键、离子键、范德瓦尔斯力和/或疏水相互作用)彼此相互作用。
如本文所用，“异多聚化结构域”指对生物分子的如此改变或添加，从而促进异多聚体形成并阻碍同型多聚体形成。具有形成异二聚体超越形成同型二聚体的强烈偏好的任何异二聚化结构域处于本发明范围。示意性例子包括但不限于，例如，美国专利申请20030078385(Arathoon等人,–Genentech；描述结入孔法(knob-into-hole))；WO2007147901(等人,–Novo Nordisk：描述离子相互作用)；WO 2009089004(Kannan等人,–Amgen：描述静电转向效应)；WO 2011/034605(Christensen等人,-Genentech；描述卷曲螺旋)。还见，例如，描述亮氨酸拉链的Pack,P.和Plueckthun,A.，Biochemistry 31,1579-1584(1992)或描述螺旋-转角-螺旋基序的Pack等人，Bio/Technology 11,1271-1277(1993)。短语“异多聚化结构域”和“异二聚化结构域”在本文中互换地使用。
如本文所用的短语“含有铰链的多肽”指包含与如本领域所理解的免疫球蛋白铰链区相对应的区域(例如，在重链的CH1结构域和CH2结构域之间的区域)的多肽。“铰链区”、“铰链序列”和其变种，如本文所用，包括本领域已知的含义，所述含义例如在以下文献中说明：Janeway’s Immunobiology,(Garland Science,Taylor&Francis Group,LLC,NY)(第7版,2008)；Bloom等人,Protein Science(1997),6:407-415；Humphreys等人,J.Immunol.Methods(1997),209:193-202。还参见，例如，Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)以及Papadea,C.和I.J.Check(1989)“Human immunoglobulin G andimmunoglobulin G subclasses:biochemical,genetic,and clinical aspects."CritRev Clin Lab Sci 27(1):27-58。本领域技术人员将领会，可用于链间二硫键形成的氨基酸数目以及半胱氨酸残基数目在免疫球蛋白的各类别和同种型之间变动。全部这类铰链区均可以在含有铰链的多肽内并处于本发明的范围内。在某些实施方案中，第一含有铰链的多肽包含第一抗体重链。在某些实施方案中，第一重链与第一轻链缔合以形成第一半抗体。术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且指包含两条重链和两条轻链的任何免疫球蛋白(Ig)分子及其任何片段、突变变体或衍生物，只要它们显示出合乎需要的生物活性(例如，表位结合活性)。抗体的例子包括如本文所述的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
作为参考系，如本文所用，抗体将指免疫球蛋白G(IgG)的结构。然而，本领域技术人员将理解/认识到，任何免疫球蛋白类别的抗体可以用于本文所述的本发明方法中。为了清晰，IgG分子含有一对相同的重链(HC)和一对相同的轻链(LC)。每条LC具有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，而每条HC具有一个可变的(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2、和CH3)。CH1结构域和CH2结构域由铰链区连接。这种结构是本领域熟知的。参考图1B。
如本文所用，“半抗体”指与一条免疫球蛋白轻链缔合的一条免疫球蛋白重链。图1A中描述了示例性半抗体。本领域技术人员将轻易地理解，半抗体还可以具有由单一可变域组成的抗原结合结构域。
术语“最大抗体(maxibody)”指包含与Fc多肽融合的scFv的融合蛋白。参考WO2009089004的图8a。关于双特异性最大抗体，参考WO2009089004的图2。
根据EU编号体系，术语人IgG/Fc区的“CH2结构域”通常从IgG约残基231延伸至约残基340。CH2结构域的独特性在于它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N联分枝糖链间插在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。已经推测所述糖可以提供结构域-结构域配对作用的替代并且有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”包含在Fc区中CH2结构域C末端的一段残基(即根据EU编号体系，从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
术语“Fc区”，如本文所用，通常指包含免疫球蛋白重链的C末端多肽序列的二聚体复合物，其中C末端多肽序列是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体可获得的那种多肽序列。Fc区可以包含天然或变体Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的界限可能变动，但是人IgG重链Fc序列通常由Fc序列的从约位置Cys226处或从约位置Pro230处的氨基酸残基至其羧基末端的片段限定。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU index。免疫球蛋白的Fc序列总体上包含2个恒定结构域：CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。“Fc多肽”在本文中意指构成Fc区的多肽之一，例如，单体Fc。Fc多肽可以从任何合适的免疫球蛋白获得，如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区包含由二硫键结合在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定；该区域还是由某些类型细胞上存在的Fc受体(FcR)识别的部分。在一些实施方案中，Fc多肽包含野生型铰链序列的部分或全部(通常在其N末端处)。在一些实施方案中，Fc多肽不包含有功能的或野生型的铰链序列。
“有功能的Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合作用；ADCC；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)等。这类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合并且可以使用例如在本文的定义中公开的各种测定法评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A同种型和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区，以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰、优选地一个或多个氨基酸置换而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸置换，例如，约1个至约10个氨基酸置换，和优选地约1个至约5个氨基酸置换。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并最优选地与之具有至少约90％同源性，更优选地与之具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源性。
如本文所用的“Fc组分”指Fc区的铰链区、CH2结构域或CH3结构域。
在某些实施方案中，含有铰链的多肽包含IgG/Fc区、优选地衍生自野生型人IgG/Fc区。对于“野生型”人IgG/Fc，其意指在人群内部天然出现的氨基酸序列。当然，正如Fc序列可以在个体之间略微变动，可以对野生型序列进行一或多个改变并且仍然处于本发明的范围内。例如，Fc区可以含有与本发明不相关的额外改变，如糖基化位点中的突变或纳入非天然氨基酸。
术语“可变区”或“可变结构域”指参与抗体结合至抗原的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“Fab”指抗体的抗原结合片段。如上文所示，木瓜蛋白酶可以用来消化完整抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段，即，“Fab片段和残余“Fc片段(即，上文的Fc区)。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。
如本文所用的短语“抗原结合臂”、“靶分子结合臂”、“靶结合臂”及其变型指本发明异多聚体蛋白的组分部分，所述组分部分具有特异性结合目的靶的能力。通常并且优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列的复合物(例如，免疫球蛋白轻链和重链的CDR和/或可变结构域序列)。
“靶”或“靶分子”指由异多聚体蛋白的结合臂识别的部分。例如，如果异多聚体蛋白是抗体，则靶可以是在单个分子上或在不同分子上的表位、或病原体或肿瘤细胞，这取决于上下文。类似地，如果异多聚体蛋白是受体-Fc融合蛋白，则靶将是受体的同族结合配偶体。本领域技术人员将理解，靶由靶结合臂的结合特异性确定并且不同的靶结合臂可以识别不同的靶。靶优选地以高于1uM Kd的亲和力与本发明的异多聚体蛋白结合(根据斯卡查德分析)。靶分子的例子包括，但不限于血清可溶性蛋白和/或其受体，如细胞因子和/或细胞因子受体、黏附素、生长因子和/或其受体、激素、病毒粒子(例如，RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感病毒、丙型肝炎病毒)、微生物(例如，细菌细胞蛋白、真菌细胞)、黏附素、CD蛋白和其受体。
“完整”或“全长”抗体的一个例子是一种包含抗原结合臂以及CL和至少重链恒定结构域、CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
如本文所用的术语“偶联”指为了彼此连接第一和第二含有铰链的多肽(例如，形成共价键)而必需的步骤。这类步骤包括使第一和第二含有铰链的多肽中半胱氨酸残基还原、复性和/或氧化以形成链间二硫键。偶联可以通过化学交联或使用氧化还原系统实现。参见，例如Humphreys等人,J.Immunol.Methods(1998)217:1-10和Zhu等人,Cancer Lett.,(1994)86:127-134。
术语“多特异性抗体”以最广意义使用并且特别地涵盖具有多表位特异性的抗体。这类多特异性抗体包括，但不限于包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中所述VHVL单位具有多表位特异性；具有两个或更多个VL结构域和VH结构域的其中每个VHVL单位与不同表位结合的抗体、具有两个或更多个单一可变结构域的其中每个单一可变结构域与不同表位结合的抗体；全长抗体；抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性双体抗体和三体抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指与相同靶或不同靶上两个或更多个不同表位特异性结合的能力。“单特异性”指仅结合一个表位的能力。根据一个实施方案，所述多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力与每个表位结合的IgG抗体。图1B中提供双特异性抗体的示意图。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包含Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体(Db)；串联双体抗体(taDb)、线性抗体(例如，美国专利号5 641 870；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；一臂抗体、单一可变结构域抗体、微型抗体、单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3和(scFV)4-Fc)。
表示“单一结构域抗体”(sdAb)或“单一可变结构域(SVD)抗体”通常指其中单一可变结构域(VH或VL)可以赋予抗原结合作用的抗体。换而言之，单一可变结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体由每条抗原结合臂上的单一单体可变抗体结构域(VH或VL)组成。单一结构域抗体的例子包括源自驼类(camelid)(羊驼和骆驼)和软骨鱼(例如，护士鲨)的那些和源自重组方法来自人和小鼠抗体(Ward等人,Nature(1989)341:544-546；Dooley和Flajnik,Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Muyldermans等人,Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；Holt等人,Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；Davies和Riechmann,Febs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)的那些。单一可变域抗体可以在具有其他可变区或可变结构域的抗原结合臂(例如，同型多聚体或异多聚体)中存在，在这种情况下，它不是单结构域抗体。
表述“线性抗体”通常指在Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简而言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异或单特异的。
如本文中提到的术语“结入孔”或“KnH”技术指通过在两条多肽相互作用的界面处将隆起(结)引入一个多肽中并将腔体(孔)引入另一个多肽在体外或在体内指导这两种多肽配对在一起的技术。例如，已经在抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面中引入KnH(例如，US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人，(1997)ProteinScience 6:781-788)。这种特别可用于制造多特异性抗体期间驱动两条不同的重链配对在一起。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体还可以包含与每个Fc区连接的单一可变结构域或还包含与相似或不同轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。KnH技术也可以用来使两个不同的受体胞外结构域配对在一起或包含不同靶识别序列的任何其他多肽序列(例如，包括亲和体、肽体(peptibody)和其他Fc融合物)配对在一起。
“Fv”由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。贡献用于抗原结合的氨基酸残基并向该抗体赋予抗原结合特异性的6个高变环(分别来自H和L链的3个环)源自这两个结构域的折叠。然而，甚至单一可变结构域(或仅包含3个抗原特异性CDR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然经常以小于完整结合部位的亲和力进行。
还缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接成为单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头能够使scFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；Malmborg等人,J.Immunol.Methods 183:7-13,1995。
术语“双体抗体”指通过以下方式制备的小抗体片段(参见前述段落)：构建在VH和VL结构域之间具有短接头(约5-10个残基)的sFv片段，从而实现V结构域的链间而非链内配对，产生双价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中这两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。在例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中更充分地描述双体抗体。
术语“一臂抗体”指这样的抗体，其包含(1)由肽键连接至多肽的可变结构域，所述多肽包含CH2结构域、CH3结构域或CH2-CH3结构域，和(2)第二CH2、CH3或CH2-CH3结构域，其中可变结构域不借助肽键连接至包含第二CH2、CH3或CH2-CH3结构域的多肽。在一个实施方案中，一臂抗体包含3种多肽：(1)包含可变结构域(例如，VH)、CH1、CH2和CH3的第一多肽，(2)包含可变结构域(例如，VL)和CL结构域的第二多肽，和(3)包含CH2和CH3结构域的第三多肽。在另一个实施方案中，一臂抗体具有含有两个半胱氨酸残基的部分铰链区，所述半胱氨酸残基形成连接恒定重链的二硫键。在一个实施方案中，一臂抗体的可变结构域形成抗原结合区。在另一个实施方案中，一臂抗体的可变结构域是单一可变结构域，其中每个单一可变结构域是抗原结合区。在一个实施方案中，单臂抗体是单一可变结构域抗体。
本发明的抗体可以是“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们展示想要的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。目的嵌合抗体在本文中包括灵长类化抗体，所述灵长类化抗体包含源自非人灵长类(例如，旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
非人(例如，啮齿类)抗体的“人源化”形式是含有源自非人抗体中最少序列的嵌合抗体。对大部分情况而言，人源化抗体是具有所需特异性、亲和力和能力的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自所述受体的高变区中的残基由来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区中的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由相应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。作出这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的那些高变环对应并且全部或基本上全部的FR区是具有人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白恒定区的部分。对于进一步细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“肽体(peptibody)”指随机生成的肽与Fc结构域的融合物。参见2003年12月9日授予Feige等人的美国专利号6,660,843(所述文献通过引用的方式完整并入)。它们包括与N末端、C末端、氨基酸侧链连接或与这些位点中多于一者连接的一个或多个肽。肽体技术令设计出并入靶向一种或多种配体或受体的肽、肿瘤归巢肽、膜转运肽等的治疗药成为可能。已经证明肽体技术可用于设计众多这类分子，包括线性及二硫键约束的肽，“串联肽多聚体”(即，在Fc结构域的单链上多于一种肽)。参见例如美国专利号6,660,843；2003年10月16日公布的美国专利申请号2003/0195156(对应于2002年11月21日公布的WO 02/092620)；2003年9月18日公布的美国专利申请号2003/0176352(对应于2003年4月17日公布的WO03/031589)；美国专利号6,835,809(对应于2000年5月4日公布的WO00/24770)；2003年12月11日公布的美国专利申请号2003/0229023；2003年7月17日公布的WO 03/057134；2003年12月25日公布的美国专利申请号2003/0236193(对应于2004年4月8日提交的PCT/US04/010989)；2003年9月18日提交的美国专利号6,919,426(对应于2004年4月1日公布的WO 04/026329)，所述每篇文献因而通过引用方式完整地并入。
“亲和体”指使用由肽键连接至Fc区的蛋白质，其中使用该蛋白质作为支架以向靶分子提供结合表面。该蛋白质经常是天然存在的蛋白质如葡萄球菌蛋白A或结合IgG的B结构域或从中衍生的Z蛋白(参见Nilsson等人(1987),Prot Eng 1,107-133，和美国专利号5,143,844)或其片段或衍生物。例如，亲和体可以从具有改变的靶分子结合亲和力的Z蛋白变体产生，其中Z蛋白的一个区段已经通过随机诱变法突变以产生能够结合靶分子的变体的文库。亲和体的例子包括美国专利号6,534,628；Nord K等人,Prot Eng 8:601-608(1995)和Nord K等人,Nat Biotech 15:772-777(1997)；Biotechnol Appl Biochem.2008Jun；50(Pt 2):97-112。
如本文所用，术语“免疫黏附素”指这样的分子，所述分子将异源蛋白(“黏附蛋白”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能合并。在结构上，免疫黏附素包括具有所需结合特异性的氨基酸序列，所述氨基酸序列不是抗体的抗原识别和结合位点(即与抗体的恒定区相比，是“异源”的)与免疫球蛋白恒定结构域序列(例如，IgG的CH2和/或CH3序列)的融合物。示例性黏附蛋白序列包含连续氨基酸序列，所述连续氨基酸序列包含受体或配体中与目的蛋白结合的部分。黏附蛋白序列也可以是结合目的蛋白的序列，但不是受体序列或配体序列(例如，肽体中的黏附蛋白序列)。可以通过各种方法(包括噬菌体展示技术和高通量分选方法)选择或鉴定这类多肽序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白获得，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。
如本文中所用的“复合”或“复合的”指借助键和/或不是肽键的力(例如，范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力)彼此相互作用的两个或更多个分子的缔合。在一个实施方案中，复合物是异多聚体。应当理解，如本文所用的术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括具有与蛋白质复合物中蛋白质缀合的非蛋白质实体的复合物(例如，包括，但不限于，化学分子如毒素或检测剂)。
“结合”目的抗原的本发明异多聚体蛋白是这样的异多聚体蛋白，所述异多聚体蛋白以足够亲和力结合该靶，从而所述异多聚体蛋白可以作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向蛋白质或表达该靶的细胞或组织，并且与其他蛋白质不明显交叉反应。在这类实施方案中，异多聚体蛋白与“非靶”蛋白结合的程度将小于该抗体与其特定靶蛋白的结合作用的约10％，如荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA)所测定。就异多聚体蛋白与靶分子的结合而言，术语“特异性结合”或“特异性结合至”特定多肽或特定多肽靶上表位或是“对其特异的”意指可度量地与非特异性相互作用不同的结合(例如，非特异性相互作用可以是与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)。可以测量特异性结合作用，例如，通过与对照分子的结合作用相比确定分子的结合作用来测量。例如，可以通过与类似于靶的对照分子(例如过量的未标记靶)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果标记的靶与探针的结合受过量未标记的靶竞争性抑制，则证实特异性结合。如本文所用的术语“特异性结合”或“特异性结合于”或者是“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位，可以例如通过对靶具有至少约200nM、备选地至少约150nM、备选地至少约100nM、备选地至少约60nM、备选地至少约50nM、备选地至少约40nM、备选地至少约30nM、备选地至少约20nM、备选地至少约10nM、备选地至少约8nM、备选地至少约6nM、备选地至少约4nM、备选地至少约2nM、备选地至少约1nM或更大Kd的分子显示。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中某异多聚体蛋白与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
“结合亲和力”通常指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶物(例如，抗原)之间总非共价相互作用之和的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。例如，Kd可以是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更强。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于轻易解离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原并且倾向于更长地保持结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任一个可以用于本发明的目的。
在一个实施方案中，通过使用表面等离子体共振测定法，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃采用固定靶(例如，抗原)CM5芯片以约10个响应单位(RU)，测量本发明“Kd”或“Kd值。简而言之，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)。抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μl/分钟的流速注入含0.05％Tween 20(PBST)的PBS(PBST)中Fab的2倍连续稀释物(例如，0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1S-1，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述荧光猝灭技术在25℃测量在PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。
除非另外说明，否则就本发明的异多聚体蛋白(如抗体、片段、或其衍生物)而言“生物学活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”意指具有与生物分子结合的能力。
当用来描述各种异多聚体多肽时，“分离的”意指已经从自其中表达它的细胞或细胞培养物分出和/或回收的异多聚体。其自然环境的杂质组分是将干扰异多聚体的诊断性或治疗性用途的物质并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在某些实施方案中，将该异多聚体纯化(1)至按照蛋白质的重量计大于95％，如通过Lowry法测定，并且最优选地按照重量计大于99％、纯化(2)至足以通过转杯测序仪(spinning cupsequenator)获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度或纯化(3)至通过还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染SDS-PAGE所确定的均一性。然而，一般将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
本发明的异多聚体通常纯化至基本上均一。短语“基本上均一的”、“基本上均一形式”和“基本均一性”是用来表示，该产物基本上没有源自不希望的多肽组合中的副产物(例如，同型多聚体)。
以纯度表述时，基本上均一性意指副产物的量不超过以重量计10％、9％、8％、7％、6％、4％、3％、2％或1％或是小于以重量计1％。在一个实施方案中，副产物低于5％。
“生物分子”指核酸、蛋白质、糖、脂质及其组合。在一个实施方案中，生物分子存在于自然界中。
如本文所用的“连接的”或“连接意指第一和第二氨基酸序列之间的直接肽键连接或涉及第三氨基酸序列的键，所述第三氨基酸序列是与第一和第二氨基酸序列结合并在其之间的肽。例如，接头肽与一个氨基酸序列的C末端结合并且与另一个其他氨基酸序列的N末端结合。
如本文所用的“接头”意指两个或更多个氨基酸长度的氨基酸序列。接头可以由中性、极性或非极性氨基酸组成。接头可以例如是2至100个氨基酸长度，如在2和50个氨基酸长度之间，例如，3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长度。接头可以是“可切割的”，例如，借助自我切割过程或酶促切割过程或化学切割过程可切割。氨基酸序列和酶中的切割位点和在这类位点处切割的化学物是本领域熟知的并且还在本文描述。
如本文所用的“系索”意指接合两个其他氨基酸序列的氨基酸接头。如本文所述的系索可以将免疫球蛋白重链可变结构域的N末端与免疫球蛋白轻链恒定结构域的C末端连接。在具体的实施方案中，系索长度在约15和50个氨基酸长度之间，例如，在20和26个氨基酸长度(例如，20、21、22、23、24、25或26个氨基酸长度)之间。接头可以系索可以是“可切割的，例如，使用本领域标准的方法和试剂借助自我切割过程或酶促切割过程或化学切割过程“可切割。
“接头”或“系索”的酶促切割可以涉及使用内肽酶如，例如，Lys-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、因子Xa、TEV(烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶)、肠激酶、HRV C3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原、以及枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶(例如，弗林蛋白酶(PC1)、PC2或PC3)或N-精氨酸双碱性转化酶。化学切割可以包括例如羟胺、N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺或溴化氰的使用。
如本文所用的“Lys-C内肽酶切割位点”是在氨基酸序列中可以由Lys-C内肽酶在C端侧切割的赖氨酸残基。Lys-C内肽酶在赖氨酸残基的C端侧切割。
“离液剂”意指通过干扰稳定分子内相互作用(例如，氢键、范德瓦尔斯力、或疏水性效应)破坏蛋白质(例如，抗体)的三维结构的水溶性物质。示例性离液剂包括但不限于尿素、胍-HCl、高氯酸锂、组氨酸和精氨酸。
“温和去垢剂”意指水溶性物质，所述水溶性物质通过干扰稳定分子内相互作用(例如，氢键、范德瓦尔斯力、或疏水性效应)破坏蛋白质(例如，抗体)的三维结构，但是不永久破坏蛋白质结构以至于造成生物学活性丧失(即，不使蛋白质变性)。示例性温和去垢剂包括但不限于Tween(例如，Tween-20)、Triton(例如，Triton X-100)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和十二烷基硫酸钠(SDS)。
抗体“效应子功能”指归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性性，并随抗体同种型而变动。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
“抗体依赖的细胞介导细胞毒性”或“ADCC”指一种形式的细胞毒性，其中与某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcRs)结合的分泌型Ig使得这些细胞毒效应细胞与携带抗原的靶细胞特异性结合并随后用细胞毒药物杀伤靶细胞成为可能。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这类杀伤作用绝对需要的。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的那种测定法。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是人FcR。另外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的一种受体并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有主要在其胞质域内不同的相似氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见MAnnu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中的综述)。FcR在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-492(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来待鉴定的那些。该术语还包括负责转移母体IgG至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源(例如，从血液)分离。
“补体依赖细胞毒性”或“ADDC”指在补体存在下靶细胞的溶解。经典补体途径的活化因补体系统(C1q)第一组分与(适宜亚类的)结合至其同族抗原的抗体结合而启动。为评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。
“治疗有效量”指抗体、抗体片段或或衍生物治疗受试者中疾病或病症的量。在肿瘤(例如，癌性肿瘤)的情况下，抗体或抗体片段(例如，多特异性抗体或抗体片段)的治疗有效量可以减少癌细胞的数目；缩减原发肿瘤大小；抑制(即，某种程度减缓并且优选地终止)癌细胞浸润至外周器官中；抑制(即，某种程度减缓并且优选地终止)肿瘤转移；某种程度抑制肿瘤生长和/或某种程度减轻一种或多种与该病症相关的症状。到抗体或抗体片段可以阻止生长和/或杀死现存癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞的和/或细胞毒的。对于癌症疗法，体内功效可以例如通过评估存活持续期、至病情进展时间(TTP)、缓解率(RR)、缓解的持续期和/或生活质量来度量。
“减少或抑制”意指引起总体减少优选地20％或更多、更优选地50％或更多、并且最优选地75％、85％、90％、95％或更多的能力。缩减或抑制可以指正在治疗的病症的症状、转移的存在或大小、原发肿瘤的大小或生血管性病症中血管的大小或数目。
术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中一般以失调的细胞生长/增殖为特征的生理状况。这个定义中包括良癌和恶性癌。癌症的例子包括，但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更多的特定的例子这类癌症包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、肝癌、前列腺癌症、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌。“早期癌症”意指即未侵润或未转移性或划归为0、I、或II期癌的癌症。术语“癌前期”指一般先于癌或形成癌的状况或生长。“非转移性”意指一种癌，所述癌为良性或留在原发性部位并且尚未穿透入淋巴系统或血管系统或穿透至原发性部位之外的组织。通常，非转移性癌症是作为0期、I期或II期癌及偶尔作为III期癌的任何癌症。
本文中的“过敏性或炎性疾病”是过度激活个体的免疫系统的疾病或病症。示例的过敏性或炎性病症包括，但不限于哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、异位性皮炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、湿疹、器官移植、年龄相关性黄斑变性、Crohn病、溃疡性结肠炎、嗜酸性粒细胞食管炎和与炎症相关的自身免疫免疫病。
本文中的“自身免疫病”是源自并且针对个体自身组织或共分离的疾病或病症或其表现或从其中所致的病状。自身免疫疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、变性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、椎骨关节炎和幼年发作型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发多发性关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性过度增生性皮肤病、银屑病如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和趾甲银屑病、皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特异性皮炎、X连锁的IgM过多综合征、荨麻疹如慢性应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹、多发性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化如系统性硬化病、多发性硬化(MS)如脊髓-视神经MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)、进行性系统性硬化病、动脉粥样硬化、动脉硬化、散播性硬化和共济失调性硬化、炎性肠病(IBD)(例如，Crohn病、自身免疫介导的胃肠病、结肠炎如溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎与自身免疫炎性肠病)、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化胆管炎、表层巩膜炎)、呼吸窘迫综合症、包括成人或急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、脑膜炎、全部或部分葡萄膜的炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫血液病、类风湿性脊椎炎、突发性听力丧失、IgE-介导的疾病如过敏反应和过敏性鼻炎和特应性鼻炎、脑炎如Rasmussen脑炎和边缘性和/或脑干脑炎、葡萄膜炎、如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎,或自身免疫性葡萄膜炎、伴发和不伴发肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，如慢性或急性肾小球肾炎如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性(membrano)或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和快速进展性GN、过敏性疾病、变态反应、湿疹，包括变应性或特发性湿疹、哮喘，如支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病状、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞黏附作用缺损、系统性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematodes)如皮肤SLE、亚急性皮肤型红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎、脑炎、儿科、非肾、肾外、盘状、秃顶性狼疮)、幼年发作型(I型)糖尿病，包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人发作型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症、与细胞因子及T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应、结核病、结节病、肉芽肿，包括淋巴瘤样肉芽肿、韦格纳肉芽肿、粒细胞缺乏症、血管炎类，包括血管炎(包括大血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu)动脉炎)、中等血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、显微镜下多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤型或超敏性血管炎、全身性坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎，如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS))、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、Diamond-Blackfan贫血、溶血性贫血或免疫溶血性贫血，包括自身免疫溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(anemia perniciosa)、Addison病、纯红细胞贫血或纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、因子VIII缺乏症、血友病A、自身免疫中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、CNS炎性疾病、多器官损伤综合征，如继发于败血症、创伤或出血的那些多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、Bechet病或Behcet病、Castleman综合征、Goodpasture综合征、Reynaud综合征、Sjogren综合征、Stevens-Johnson综合征、类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常性天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮(pemphigus mucus-membrane pemphigoid)和红斑性天疱疮)、自身免疫多内分泌病、莱特尔病或综合征、免疫复合物肾炎、抗体介导的肾炎、视神经脊髓炎、多发性神经病、慢性神经病如IgM多发性神经病或IgM介导的神经病、血小板减少症(如由心肌梗死患者形成)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)(包括慢性或急性ITP)、睾丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、甲状旁腺功能减退症、自身免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、自身免疫甲状腺病、特发性甲状腺功能减退症、Grave病、多内分泌腺综合征，如自身免疫多内分泌腺综合征(或多内分泌腺内分泌病综合征)、副肿瘤综合征，包括神经系统副肿瘤综合征如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征、僵人或僵者综合征、脑脊髓炎如变应性脑脊髓炎或过敏性脑脊髓炎和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力如胸腺肿瘤相关性重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病、多灶性运动神经病、Sheehan综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮性肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫慢性活动性肝炎、淋巴细胞间质性肺炎、闭塞性细支气管炎(非移植物)与NSIP、Guillain-Barré综合征、Berger病(IgA神经病)、特发性IgA神经病、线状IgA皮肤病(linear IgA dermatosis)、原发性胆汁性肝硬化、肺硬变、自身免疫性肠病综合征、小肠吸收不良(Celiac disease)、脂泻病(Coeliac disease)、乳糜泻(谷蛋白肠病)、难治性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS；Lou Gehrig病)、冠状动脉病、自身免疫性耳病如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫听力损失、视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎如难治性或复发性多软骨炎、肺泡蛋白沉积症、淀粉样变性、巩膜炎、非癌性淋巴细胞增多、原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆免疫球蛋白病和意义不确定性单克隆免疫球蛋白病，MGUS)、外周神经病、副肿瘤性综合征、离子通道病，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉病(muscular disorder)、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS离子通道病、孤独症、炎性肌病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝病、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭、Schmidt综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病、糖尿病性神经病、Dressler综合征、斑秃、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象、食管运动功能失常、指端硬化和毛细血管扩张症)、男性和女性自身免疫性不育、混合型结缔组织病、Chaga病、风湿热、反复流产、霉尘肺(farmer's lung)、多形红斑、心脏切开术后综合征、库欣综合征、养鸟人肺(bird-fancier's lung)、变应性肉芽肿性血管炎、良性淋巴细胞血管炎、Alport综合征、肺泡炎如过敏性肺泡炎和纤维化肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、kypanosomiasis、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter综合征、Caplan综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性间质性肺纤维化、间质性肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、胎儿幼红细胞增多症、嗜酸性筋膜炎、Shulman综合征、Felty综合征、丝虫病(filariasis)、睫状体炎如慢性睫状体炎、异色性睫状体炎(heterochronic cyclitis)、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎、Henoch-Schonlein紫癜、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾柯病毒感染、心肌病、阿尔茨海默病、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征、先天性风疹感染、Epstein-Barr病毒感染、腮腺炎、Evan综合征、自身免疫性腺衰竭、Sydenham舞蹈病、链球菌感染后肾炎、闭塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺毒症、脊髓痨(tabes dorsalis)、脉络膜炎、巨细胞多肌痛、内分泌眼病、慢性过敏性肺炎、燥性角结膜炎、流行性角结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变肾病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、视网膜自体免疫(retinalautoimmunity)、关节发炎、支气管炎、慢性阻塞性气道病、矽肺、口疮、口疮性口炎、动脉硬化病、无精子发生症(aspermiogenese)、自身免疫性溶血、Boeck病、冷球蛋白血症、Dupuytren挛缩、晶状体蛋白过敏性眼内炎、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面瘫、慢性疲劳综合征、风湿热(febris rheumatica)、Hamman-Rich病、感觉神经性听力损失、阵发性血红蛋白尿、性腺功能减退、局限性回肠炎、白细胞减少症、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发特发性粘液性水肿、肾病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多神经根炎、坏疽性脓皮病、奎汶氏甲状腺炎、获得性脾萎缩、因抗精子抗体所致的不育、非恶性胸腺肿瘤、白斑症、SCID和Epstein-Barr病毒相关疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、寄生虫病如利什曼原虫病、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的病状、白细胞黏附缺陷、与细胞因子及T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应、涉及白细胞渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、变应性神经炎、自身免疫多内分泌病s、卵巢炎、原发粘液性水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿病、混合型结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌衰竭(polyendocrine failure)、周围神经病、自身免疫多内分泌腺综合征I型、成人发作型特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)、全秃、扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita)(EBA)、血色素沉着症、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性窦炎、急性或慢性窦炎、筛窦炎、额窦炎、上颌窦炎或蝶窦炎、嗜酸细胞相关性病症如嗜酸粒细胞增多症、肺嗜酸细胞增多性浸润、嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征、Loffler综合征、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸粒细胞增多症、支气管肺曲霉病、曲霉肿或含有嗜酸性细胞的肉芽肿、过敏反应、血清阴性脊椎关节炎、多内分泌腺自身免疫病、硬化性胆管炎、巩膜念珠菌病、巩膜外层念珠菌病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、Bruton综合征、婴儿期暂时性低丙球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张症、与胶原病相关的自身免疫病、风湿病、神经疾病、缺血性再灌注病、血压反应下降、血管功能障碍、脉管扩张(angiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血症和伴血管化疾病、变应性超敏病(allergic hypersensitivity disorder)、肾小球肾炎、再灌注损伤、心肌组织或其他组织的再灌注损伤、具有急性炎症组分的皮肤病、急性紫癜性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病、眼和眼眶炎性病症、粒细胞输血相关合征、细胞因子引起的中毒、急性严重炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、肺硬变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病的大动脉病症、动脉内增生、消化性溃疡、心瓣炎和子宫内膜异位症。
如本文所用的术语“细胞毒性药物”指抑制或阻碍细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。本术语意在包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32和Lu的放射性同位素)；化疗药(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；酶及其片段如溶核酶；抗生素；和毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和本文公开的各种抗肿瘤药、抗癌药和化疗药。本文中描述了其他的细胞毒药物。杀肿瘤药造成肿瘤细胞毁灭。
“化疗药”是用于治疗癌症中的化学化合物。化疗药的例子包括烷基化剂如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类如白消安、英丙舒凡和泊舒凡；氮丙啶如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；环乙亚胺和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺；乙酸原类(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；白桦脂酸；喜树碱(camptothecin)(包括合成性类似物拓扑替康CPT-11(伊立替康，)、乙酰喜树碱、scopolectin和9-氨基喜树碱)；草苔虫内酯；海绵多烯酮类化合物(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡泽来新和比折来新合成性类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素类(尤其隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成性类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇A(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、罗莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类如烯二炔抗生素(例如，刺孢霉素、尤其刺孢霉素γ1(参见，例如Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；双膦酸盐类如氯曲膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素D、安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、佐柔比星、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨酮戊酸；嗯尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素如美坦辛和安斯菌素(ansamitocin)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基肼；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；丙亚胺；rhizoxin；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉醇类化合物，例如，紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ))、ABRAXANETM无Cremophor、白蛋白工程化纳米粒子紫杉醇制剂(AmericanPharmaceutical Partners,Schaumberg,IL)和多西他赛(doxetaxel)(Rorer、Antony、法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱奥沙利铂；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨米托蒽醌；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇如视黄酸(维A酸)；卡培他滨(希罗达)；以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种药物的组合如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(采用奥沙利铂(ELOXATINTM)联用5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
在这个定义中还包括发挥作用以调节、减少、阻断或抑制激素效应的抗激素药，其中所述激素可以促进癌生长并且经常处于全身性或整体治疗形式。它们可以是激素本身。例子包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如包括他莫西芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬；抗孕酮；雌激素受体下调物(ERD)；起到抑制或关闭卵巢的药物，例如，促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂如和醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素药如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂(调节肾上腺中的雌激素产生)，如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、阿诺新依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑、弗隆(femara)来曲唑和阿那曲唑。此外，化疗药的这种定义包括双膦酸盐类如氯曲膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐、阿仑膦酸盐、帕米膦酸盐@、替鲁膦酸盐、或利塞膦酸盐；以及曲他沙滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因(如，PK-α、Raf、H-Ras、和表皮生长因子受体(EGF-R))表达那些；疫苗如疫苗和基因治疗疫苗，例如，疫苗、疫苗、和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂也称作GW572016)；和以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物。
在本文中使用时，“生长抑制剂”指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因而，生长抑制剂可以是一种显著减少处于S期的细胞的百分数的药物。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期进程(在除S期之外的位置)的药物，如诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春碱类(例如，长春新碱和长春碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂如多柔比星、表柔比星、佐柔比星、依托泊苷及博来霉素。使G1停滞的药物还始料未及地导致S期停滞，例如DNA烷基化剂如他莫西芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷(ara-C)。其他信息可以在The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel编著,Murakami等人,第1章，标题“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs(细胞周期调节、癌基因和抗肿瘤药物)”(WBSaunders:Philadelphia,1995),尤其第13页中找到。紫杉烷类(紫杉醇和多西紫杉醇)是均源自紫杉的抗癌药物。源自欧洲紫杉的多西紫杉醇(Rhone-PoulencRorer)是紫杉醇的一种半合成性类似物(紫杉酚，Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西紫杉醇促进微管从微管蛋白二聚体中装配并且通过阻止解聚而稳定微管，这导致细胞中的有丝分裂抑制。
如本文所用的“抗癌疗法”指减少或抑制受试者中癌症的治疗。抗癌疗法的例子包括细胞毒性放疗法以及施用治疗有效量的细胞毒性剂、化疗药、生长抑制剂、癌疫苗、血管生成抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗呕吐药、抗体或抗体片段或者镇痛药至所述受试者。
如本申请中所用的术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式，其中与母药相比，所述前体或衍生物对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性并且能够酶促地被活化或转变成更有活性的母形式。见，例如，Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy(癌症化疗中的前药)”Biochemical Society Transactions,14,第375-382页,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前药：定向药物递送的化学手段)”,Directed Drug Delivery,Borchardt等人(编著),第247-267页,Human Press(1985)。前药包括但不限于含有磷酸酯的前药、含有硫代磷酸酯的前药、含有硫酸酯的前药、含有肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含有β-内酰胺的前药、任选地含有取代型苯氧乙酰胺的前药或任选地取代型苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前药，这些前药可以转变成细胞毒性更强的游离药物。可以衍生成用于本发明中的前药形式的细胞毒药物的例子包括，但不限于上述的那些化疗药。
术语“细胞因子”是用于一个细胞群体所释放的蛋白质的类属术语，所述蛋白质作为细胞间介质作用于另一种细胞。此类细胞因子的例子是淋巴因子类、单核因子类和传统的多肽激素。细胞因子当中包括是生长激素如人生长激素(hGH)、N-甲硫酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、胸腺刺激激素(TSH)、和促黄体激素(LH)；表皮生长因子(EGF)；肝生长因子；纤维母细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-α；血小生长因子；转化生长因子(Tg)如Tg-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-18a；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性性等同物。
“细胞因子拮抗剂”意指部分地或完全阻断、抑制或中和至少一种细胞因子的生物学活性性的分子。例如，细胞因子拮抗剂可以通过抑制细胞因子表达和/或分泌、或通过与细胞因子结合或与细胞因子受体结合，抑制细胞因子活性。细胞因子拮抗剂包括与细胞因子或细胞因子受体结合的抗体、合成肽或天然序列肽、免疫黏附素和小分子拮抗剂。细胞因子拮抗剂任选地与细胞毒性剂缀合或融合。示例性TNF拮抗剂是依那西普英夫单抗(infliximab)和阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRATM)。
如本文所用的术语“免疫抑制剂”指作用在于抑制或掩蔽正在治疗的受试者的免疫系统的物质。这包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。免疫抑制剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5取代的嘧啶(见美国专利号4,665,077)；麦考酚酸酯如硫唑嘌呤(/6-巯基嘌呤；溴隐亭(bromocryptine)；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中描述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇类如皮质类固醇和糖皮质激素类、例如、泼尼松、泼尼松龙如(泼尼松龙磷酸钠)或(泼尼松龙磷酸钠口服溶液剂)、甲泼尼龙和地塞米松；甲氨蝶呤(口服或皮下)(TREXALLTM)；羟氯喹/氯喹；柳氮磺吡啶；来福米特；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(英夫单抗或阿达木单抗)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普)、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a抗体和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；多克隆或泛T抗体或单克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen等人，美国专利号5,114,721)；T-细胞受体片段(Offner等人Science 251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature 341:482(1989)；和WO98/07409)；T细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9；环磷酰胺氨苯砜；青霉胺血浆置换；或静脉内用免疫球蛋白(IVIG)。这些免疫抑制剂可以单独或彼此组合地使用，尤其类固醇与另一种免疫抑制剂的组合或此类组合后，随后采用非类固醇药物维持给药以减少对类固醇的需求。
“镇痛药”指作用在于抑制或压制受试者中疼痛的药物。示例性镇痛药包括非甾体抗炎药(NSAID)，包括布洛芬萘普生乙酰水杨酸、吲哚美辛、舒林酸和托美丁，包括盐及其衍生物、以及用来减少可能出现的刺痛的多种其他药物，包括抗惊厥药(加巴喷丁、苯妥英、卡马西平)或三环类抗抑郁药。具体例子包括对乙酰氨基酚、阿斯匹灵、阿米替林卡马西平苯妥英加巴喷丁(E)-N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺或神经阻滞剂。
“皮质类固醇”指模拟或增进天然存在性皮质类固醇的作用的具有类固醇总体化学结构的几种合成物质或天然存在物质中任一种。合成性皮质类固醇的例子包括泼尼松、泼尼松龙(包括甲泼尼龙)、地塞米松、曲安西龙和倍他米松。
如本文所用，“癌疫苗”是在受试者中刺激针对癌症的免疫应答的组合物。癌疫苗一般由癌相关材料或细胞(抗原)的来源连同进一步刺激和增强针对该抗原的免疫应答的其他组分(例如，佐剂)组成，所述的来源可以是自体的(来自自身)或相对于该受试者是同种异体的(来自其他)。癌疫苗可以导致刺激受试者的免疫系统以产生针对一种或几种特异性抗原的抗体，和/或产生杀伤性T细胞以攻击具有那些抗原的癌细胞。
如本文所用的“细胞毒放疗法”指抑制或组织细胞的功能和/或造成细胞破坏的放射疗法。放射疗法可以包括例如外束照射或采用放射性标记药物(如抗体)的疗法。该术语意在包括使用放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32和Lu的放射性同位素)。
“受试者”是脊椎动物，如哺乳动物，例如，人。哺乳动物包括，但不限于家畜(如牛)、竞赛动物、宠物(如猫、犬和马)、灵长类、小鼠和大鼠。
除外由上下文另外指示，否则术语“第一”含有铰链的多肽和“第二”含有铰链的多肽及其变型仅是类属标示符，并且不得理解为确定本发明抗体的具体或特定多肽或组分。
除非另外说明，否则实施例中提到的市售试剂(如存在的情况下)根据制造商的说明书使用。以下实施例中和遍及本说明书中用ATCC登录号所标识的那些细胞的来源(如存在的情况下)是美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州。除非另外指出，否则本发明使用重组DNA技术的标准方法，如上文和以下教材中所述的那些方法：Sambrook等人,上文；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,NY,1989)；Innis等人,PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(Academic Press,Inc.,NY,1990)；Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford,1984)；Freshney,Animal CellCulture,1987；Coligan等人,Current Protocols in Immunology,1991。
遍及本说明书，词汇“包含”或其变异形式如“包括”或“包含有”应理解为表示纳入所陈述的整数或整数群，但不排除任何其它整数或整数群。
可以理解，本文所述的发明方面和实施方案包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面和实施方案。
本文中对“约”某个值或参数的谈及包括(并且描述)涉及该值或参数本身的变例。例如，提到“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明。可以理解，本文所述发明的多个方面和变型包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面和变型。
II.在哺乳动物宿主细胞中制备异多聚体蛋白的方法
使用现有技术产生异多聚体蛋白(例如，多特异性抗体)具有多个缺点，包括产生产物的混合物、产率降低和效应子功能减低/消除连同其他。因此，需要高效地和以高水平产生异多聚体蛋白。
通过各种手段产生抗体分子通常是充分理解的。例如，美国专利6331415(Cabilly等人)，描述一种重组产生免疫球蛋白的方法，其中重链和轻链在单个细胞中从单个载体或从两个独立载体同时表达。Wibbenmeyer等人(1999,Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)以及Lee和Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了使用独立的大肠杆菌培养物中表达的质粒，从分别产生的重链和轻链中产生单克隆抗体。下述文献中描述了与产生抗体有关的各种其他技术，例如，Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)和WO 2006028936。然而，这些技术的每一项都有缺点，如低产率、使用化工品。
本文中提供的方法基于以下令人惊讶的结果：从第一哺乳动物宿主细胞表达和分泌的第一含有铰链的多肽和第一轻链和从第二哺乳动物宿主细胞表达和分泌的第二含有铰链的多肽和第二轻链装配以在合并的培养基中形成异多聚体蛋白。如下文进一步详细讨论，可以通过以下方式获得合并的培养基：培养第一细胞培养物中的第一哺乳动物宿主细胞、培养第二细胞培养物中的第二哺乳动物宿主细胞、在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜情况下收获第一和第二培养基并且合并收获的第一和第二培养基以获得包含异多聚体蛋白的合并的培养基。备选地，可以通过在合并的细胞培养物中培养第一和第二哺乳动物宿主细胞和从合并的培养物收获包含异多聚体蛋白的合并的细胞培养基，获得合并的培养基。在某些实施方案中，收获步骤包括在不破坏细胞膜的情况下移除第一和/或第二宿主细胞。
本文中提供的方法令人惊讶，因为通常认为，真核细胞(如哺乳动物细胞)的蛋白质质量控制系统可能无法有效地生产不完整抗体。参见，例如Spiess等人(2013)Nature,31(8):753-758。
申请人还已经令人惊讶地发现，异多聚体蛋白可以在还原性条件下在合并的培养基中以高产率形成，所述合并的培养基包含已经由第一宿主细胞分泌的包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体和已经由第二宿主细胞分泌的包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体。
因此，在某些实施方案中，提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养能够表达并分泌第一含有铰链的多肽和第一轻链的第一宿主细胞，
(b)培养能够表达并分泌第二含有铰链的多肽和第二轻链的第二宿主细胞；并且
(c)在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白，并且其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链的第一宿主细胞，其中包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体分泌；
(b)培养能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链的第二宿主细胞，其中包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体分泌；
(c)获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基，其中合并的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(d)在还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(e)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得合并的培养基。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂。在某些实施方案中，还原条件足以允许异多聚体蛋白形成。
在某些实施方案中，第一含有铰链的多肽和第一轻链包含第一半抗体。在某些实施方案中，第二含有铰链的多肽和第二轻链包含第二半抗体。
在某些实施方案中，在还原性条件下孵育之前或在添加还原剂之前，约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、或少于约5％(如约4％、约3％、约2％、或约1％)(包扩这些值之间的任何范围)在合并的培养基中存在的第一含有铰链的多肽和第一轻链(例如，第一半抗体)处于第一同型二聚体形式。在某些实施方案中，在还原性条件下孵育之前或在添加还原剂之前，约10％至约75％、约20％至约65％、或约30％至约55％在合并的培养基中存在的第一含有铰链的多肽和第一轻链(例如，第一半抗体)处于第一同型二聚体形式。
在某些实施方案中，在还原性条件下孵育之前或在添加还原剂之前，约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、或少于约5％(如约4％、约3％、约2％、或约1％)(包扩这些值之间的任何范围)在合并的培养基中存在的第二含有铰链的多肽和第二轻链(例如，第二半抗体)处于第二同型二聚体形式。在某些实施方案中，在还原性条件下孵育之前或在添加还原剂之前，约10％至约75％、约20％至约65％、或约30％至约55％在合并的培养基中存在的第二含有铰链的多肽和第二轻链(例如，第二半抗体)处于第二同型二聚体形式。
在某些实施方案中，在还原性条件下孵育后或在添加还原剂后，合并的培养基包含少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约20％、少于约19％、少于约18％、少于约17％、少于约16％、少于约15％、少于约14％、少于约13％、少于约12％、少于约11％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(包括这些值之间的任何范围)的第一同型二聚体。在某些实施方案中，在还原性条件下孵育后或在添加还原剂后，合并的培养基包含少于约2％至约20％、少于约5％至约15％、或少于约10％至约15％的第一同型二聚体。
在某些实施方案中，在还原性条件下孵育后或在添加还原剂后，合并的培养基包含少于约75％、少于约70％、少于约65％、少于约60％、少于约55％、少于约50％、少于约45％、少于约40％、少于约35％、少于约30％、少于约20％、少于约19％、少于约18％、少于约17％、少于约16％、少于约15％、少于约14％、少于约13％、少于约12％、少于约11％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(包括这些值之间的任何范围)的第二同型二聚体。在某些实施方案中，在还原性条件下孵育后或在添加还原剂后，合并的培养基包含少于约2％至约20％、少于约5％至约15％、或少于约10％至约15％的第二同型二聚体。
在某些实施方案中，提供一种制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；
(b)培养第二宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸；并且
(c)获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白，并且其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，第一和第二核酸是一个核酸分子；而在某些其他实施方案中，第一和第二核酸是不同的核酸分子。在某些实施方案中，第三和第四核酸是一个核酸分子；而在某些其他实施方案中，第三和第四核酸是不同的核酸分子。
在某些实施方案中，本发明提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，并且其中分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体；
(b)培养第二宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体；
(c)在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基，其中合并的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(d)在足以允许异多聚体蛋白的还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(e)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，第一和第二核酸是一个核酸分子；而在某些其他实施方案中，第一和第二核酸是不同的核酸分子。在某些实施方案中，第三和第四核酸是一个核酸分子；而在某些其他实施方案中，第三和第四核酸是不同的核酸分子。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养基。
在某些实施方案中，提供一种制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)第一半抗体，所述第一半抗体包含具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)第二半抗体，所述第二半抗体包含具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；
(b)培养第二宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸；并且
(c)获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白，并且其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养物。
在某些实施方案中，本发明提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)第一半抗体，所述第一半抗体包含具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)第二半抗体，所述第二半抗体包含具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，并且其中分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体；
(b)培养第二宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体；
(c)在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并培养基，其中合并的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(d)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(e)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养基。
在某些实施方案中，本发明提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一细胞培养物中的第一哺乳动物宿主细胞，所述第一哺乳动物宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；
(b)培养第二细胞培养物中的第二哺乳动物宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸；
(c)从第一哺乳动物宿主细胞收获第一培养基；
(d)从第二哺乳动物宿主细胞收获第二培养基；
(e)合并第一培养基和第二培养基以获得合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白。在某些实施方案中，收获第一培养基包括从第一细胞培养物移除第一宿主细胞。在某些实施方案中，收获第二培养基包括从第二细胞培养物移除第二宿主细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养基。
在某些实施方案中，提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一细胞培养物中的第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，并且其中分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体；
(b)培养第二细胞培养物中的第二宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体；
(c)从第一哺乳动物宿主细胞收获第一培养基，其中第一培养基包含第一同型二聚体；
(d)从第二哺乳动物宿主细胞收获第二培养基，其中第二培养基包含第二同型二聚体；
(e)合并第一培养基和第二培养基以获得合并的培养基，其中合并的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(f)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(g)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，收获第一培养基包括从第一细胞培养物移除第一宿主细胞。在某些实施方案中，收获第二培养基包括从第二细胞培养物移除第二宿主细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养基。
在某些实施方案中，本发明提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)第一半抗体，所述第一半抗体包含具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)第二半抗体，所述第二半抗体包含具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二半抗体由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一细胞培养物中的第一哺乳动物宿主细胞，所述第一哺乳动物宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；
(b)培养第二细胞培养物中的第二哺乳动物宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸；
(c)从第一哺乳动物宿主细胞收获第一培养基；
(d)从第二哺乳动物宿主细胞收获第二培养基；
(e)合并第一培养基和第二培养基以获得合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白。在某些实施方案中，收获第一培养基包括移除第一宿主细胞从第一细胞培养物。在某些实施方案中，收获第二培养基包括移除第二宿主细胞从第二细胞培养物。
在某些实施方案中，提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)第一半抗体，所述第一半抗体包含具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)第二半抗体，所述第二半抗体包含具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一细胞培养物中的第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，并且其中分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体；
(b)培养第二细胞培养物中的第二宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体；
(c)从第一哺乳动物宿主细胞收获第一培养基，其中第一培养基包含第一同型二聚体；
(d)从第二哺乳动物宿主细胞收获第二培养基，其中第二培养基包含第二同型二聚体；
(e)合并第一培养基和第二培养基以获得合并的培养基，其中合并的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(f)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(g)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，收获第一培养基包括从第一细胞培养物移除第一宿主细胞。在某些实施方案中，收获第二培养基包括从第二细胞培养物移除第二宿主细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养基。
在某些实施方案中，本发明提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一哺乳动物宿主细胞，所述第一哺乳动物宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；
(b)培养第二哺乳动物宿主细胞，所述第二哺乳动物宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸；并且
(c)收获包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并细胞培养物的培养基以获得第一哺乳动物宿主细胞和第二哺乳动物宿主细胞的合并培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白。
在某些实施方案中，提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一哺乳动物宿主细胞，所述第一哺乳动物宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，并且其中分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体；
(b)培养第二哺乳动物宿主细胞，所述第二哺乳动物宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体；
(c)收获包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并细胞培养物的培养基以获得第一哺乳动物宿主细胞和第二哺乳动物宿主细胞的合并培养基，其中合并细胞培养物的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(d)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育培养基，并且；
(e)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养基。
在某些实施方案中，本发明提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)第一半抗体，所述第一半抗体包含具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)第二半抗体，所述第二半抗体包含具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一哺乳动物宿主细胞，所述第一哺乳动物宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；
(b)培养第二哺乳动物宿主细胞，所述第二宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸；并且
(c)收获包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并细胞培养物的培养基以获得第一哺乳动物宿主细胞和第二哺乳动物宿主细胞的合并培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白。
在某些实施方案中，提供制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)第一半抗体，所述第一半抗体包含具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)第二半抗体，所述第二半抗体包含具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一哺乳动物宿主细胞，所述第一哺乳动物宿主细胞包含编码第一含有铰链的多肽的第一核酸和编码第一轻链的第二核酸；其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，并且其中分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体；
(b)培养第二哺乳动物宿主细胞，所述第二哺乳动物宿主细胞包含编码第二含有铰链的多肽的第三核酸和编码第二轻链的第四核酸，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体；
(c)收获包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并细胞培养物的培养基以获得第一哺乳动物宿主细胞和第二哺乳动物宿主细胞的合并培养基，其中合并细胞培养物的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(d)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育培养基，并且；
(e)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该方法还包括添加还原剂至合并的培养基。
在某些实施方案中，培养包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并细胞培养物在约25℃和40℃之间的温度实施。在某些实施方案中，培养包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并细胞培养物在约30℃和37℃之间的温度实施。在某些实施方案中，培养包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并细胞培养物在约7.2和8.7之间的pH实施。
在某些实施方案中，将合并的培养基在约4℃和40℃之间的温度孵育。在某些实施方案中，将合并的培养基在约30℃和37℃之间的温度孵育。在某些实施方案中，将合并的培养基在约4℃和8℃之间的温度孵育。
在某些实施方案中，搅拌合并的培养基。在某些实施方案中，在获得合并的培养基后，搅拌合并的培养基约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约1日、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天或多于8天。在一些实施方案中，间歇搅拌合并的培养基。
在某些实施方案中，该方法还包括从合并的培养基分离异多聚体蛋白(如双特异性抗体)。在某些实施方案中，使用蛋白A柱分离异多聚体蛋白(如双特异性抗体)。
在某些实施方案中，该方法包括在产生异多聚体蛋白(如双特异性抗体)期间添加还原剂。在本文提供的方法的某些实施方案中，所用的还原剂是谷胱甘肽、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺、三(2-羧乙基)膦)(TCEP)、半胱氨酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇、半胱氨酸二硫苏糖醇、二硫丁胺或其组合。在某些实施方案中，还原剂是还原型谷胱甘肽。在某些实施方案中，还原剂不是2-巯基乙醇。在某些实施方案中，还原剂不是二硫苏糖醇。
在其中分别培养(即，在独立的培养物中培养)第一和第二哺乳动物宿主细胞的某些实施方案中，将还原剂在收获第一和第二细胞培养基并且合并以获得合并的培养基之前添加至第一细胞培养基和添加至第二细胞培养基。在第一和第二哺乳动物宿主细胞在相同培养物中培养的某些实施方案中，将还原剂在收获合并的细胞培养物以获得合并的培养基之前添加至合并的细胞培养物的培养基。
在某些实施方案中，在收获步骤之前约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、或约30小时(包括这些值之间的任何范围)添加还原剂。
在某些实施方案中，添加还原剂至合并的培养基。在某些实施方案中，将含有还原剂的合并的培养基孵育约4小时、约5小时、约6小时、7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约15小时、约18小时、约21小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天(包括这些值之间的任何范围)。
在某些实施方案中，将还原剂(如谷胱甘肽)添加至合并的细胞培养物以实现终浓度约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、或约30mM(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施方案中，将还原剂(如谷胱甘肽)添加至合并的细胞培养物以实现少于20mM的终浓度。在某些实施方案中，将还原剂(如谷胱甘肽)添加至合并的细胞培养物以实现不多于20mM的终浓度。
在某些实施方案中，在从合并的培养基分离异多聚体蛋白(如双特异性抗体)之前添加还原剂至合并的培养基。在某些实施方案中，在从含有还原剂的合并培养基分离异多聚体蛋白(如双特异性抗体)之前，将含有还原剂的合并的培养基孵育约4小时、约5小时、约6小时、7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约15小时、约18小时、约21小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天(包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，使用蛋白A柱分离异多聚体蛋白。
在某些实施方案中，将还原剂(如谷胱甘肽)添加至合并的培养基以实现终浓度约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、或约30mM。在某些实施方案中，将还原剂(如谷胱甘肽)添加至合并的培养基以实现少于20mM的终浓度。在某些实施方案中，将还原剂(如谷胱甘肽)添加至合并的培养基以实现不多于20mM的终浓度。
在方法的某些实施方案中，第一宿主细胞是稳定细胞系。在某些实施方案中，第二宿主细胞是稳定细胞系。在某些实施方案中，第一宿主细胞是CHO细胞。在某些实施方案中，第二宿主细胞是CHO细胞。在第一宿主细胞和第二宿主细胞在相同培养物中培养的某些实施方案中，第一宿主细胞和第二宿主细胞的比率在合并的培养物的起始时间是约1:10、约1：9、约1：8、约1：7、约1：6、约1：5、约1：4、约1：3、约1：2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。
如本文所用，“摩尔比”指已经表达和/或分泌的与第一轻链缔合的第一含有铰链的多肽(如第一半抗体)对已经表达和/或分泌的与第二轻链缔合的第二含有铰链的多肽(如第二半抗体)的比率。在一些实施方案中，与第一轻链缔合的第一含有铰链的多肽和与第二轻链缔合的第二含有铰链的多肽的摩尔比在约1.5、约1：4、约1：3、约1：2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、或约5:1之间，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，与第一轻链缔合的第一含有铰链的多肽和与第二轻链缔合的第二含有铰链的多肽的摩尔比是约1:1。在一些实施方案中，第一半抗体和第二半抗体的摩尔比在约1.5、约1：4、约1：3、约1：2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、或约5:1之间，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，第一半抗体和第二半抗体的摩尔比是约1:1。
III.异多聚体蛋白
本发明还提供通过本文所述的任一方法产生的异多聚体蛋白。在某些实施方案中，异多聚体蛋白包含抗体Fc区或其变体(如ADCC功能改变的变体)。在某些实施方案中，异多聚体蛋白包含抗体Fc区或其变体(例如，ADCC功能改变的变体)的明显部分。在某些实施方案中，异多聚体蛋白包含重链，所述重链仅包含CH1结构域、CH2结构域和/或CH3结构域的一部分。在某些实施方案中，异多聚体蛋白是抗体片段，所述抗体片段仅包含CH1结构域、CH2结构域和/或CH3结构域的一部分。在某些实施方案中，异多聚体蛋白是抗体。在某些实施方案中，异多聚体蛋白是双特异性抗体。在某些实施方案中，异多聚体蛋白是人源化抗体。在某些实施方案中，异多聚体蛋白是人抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG(如IgG1、IgG2或IgG4)、IgA或IgD。在某些实施方案中，异多聚体蛋白的第一轻链和第二轻链包含不同的可变结构域序列。在某些实施方案中，通过本文中提供的方法产生的异多聚体蛋白的第一和第二含有铰链的多肽包含Fc区或其变体。在某些实施方案中，异多聚体蛋白的第一和第二含有铰链的多肽包含抗体重链。
异多聚化结构域
异多聚体蛋白包含异多聚化结构域。为了产生基本上同质的异二聚体分子群体，异二聚化结构域必须相对于同型二聚体而具有形成异二聚体的强烈偏好性。尽管本文中例举的异多聚体蛋白使用结入孔技术以促进异多聚化，但本领域技术人员将领会，其他异多聚化结构域可用于本发明中。
结入孔
使用结入孔作为产生多特异性抗体的方法是本领域熟知的。参见1998年3月24日授予Genentech的美国专利号5,731,1680、2009年7月16日公开并授予Amgen的PCT公开号WO2009089004和2009年7月16日公开并授予Novo Nordisk A/S的美国专利公开号20090182127。还参见Marvin和Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649-658和Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。本文提供简要讨论。
“突出”指至少一个氨基酸侧链，所述氨基酸侧链从第一多肽的界面伸出并且因此可布置在毗邻界面(即第二多肽的界面)的补偿性空穴中，从而使异多聚体稳定化并且因而例如有利于异多聚体形成胜过同型多聚体形成。突出可以存在于原始界面中或可以合成地引入(例如通过改变编码该界面的核酸)。正常情况下，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码突出。为了实现这个目的，将编码第一多肽的界面中至少一个“原始氨基酸残基的核酸替换为编码具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的至少一个“输入”氨基酸残基的核酸。将可以理解可能存在多于一个原始残基和相应的输入残基。被替换的原始残基的数目上限是第一多肽的界面中残基的总数。下表1中显示多种氨基残基的侧链体积：
表1
氨基酸残基的特性
a氨基酸分子量扣减水的分子量。值来自Handbookof Chemistry and Physics,第43版,Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961.
b值来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。
c值来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975。可及表面区域在该参考文献的图6-20中定义。
用于形成突出的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成突出的原始残基具有小侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“空穴”指至少一个氨基酸侧链，所述氨基酸侧链从第二多肽的界面凹陷并且因此容纳毗邻的第一多肽界面上相应的突出。空穴可以存在于原始界面中或可以合成地引入(例如通过改变编码该界面的核酸)。正常情况下，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码空穴。为了实现这个目的，将编码第二多肽的界面中至少一个“原始氨基酸残基的DNA替换为编码具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的至少一个“输入”氨基酸残基的核酸。将可以理解可能存在多于一个原始残基和相应的输入残基。被替换的原始残基的数目上限是第二多肽的界面中残基的总数。上表1中显示多种氨基残基的侧链体积：用于形成空穴的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，用于形成空穴的原始残基具有大侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
“原始”氨基酸残基是由可以具有比原始残基更小或更大侧链体积的“输入”残基替换的氨基酸残基。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选地是前者。“天然存在”的氨基酸残基是由遗传密码编码并在上表1中列出的那些残基。“非天然存在”的氨基酸残基意指由不遗传密码编码、但能够共价结合多肽链中相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的例子是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，例如，在Ellman等人,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中描述的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人Science 244:182(1989)和上文Ellman等人的方法。简而言之，这涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化激活阻抑tRNA，随后体外转录并翻译RNA。本发明的方法涉及替换至少一个原始氨基酸残基，但是可以替换多于一个原始残基。正常情况下，不多于第一或第二多肽的界面中的总残基将构成替换的原始氨基酸残基。一般，用于替换的原始残基“埋入”。“埋入”意指残基实质上是溶剂不可及的。通常，输入残基不是半胱氨酸以防止二硫键的可能氧化或错误配对。
突出“可布置”在空穴中，这意指分别在第一多肽界面和第二多肽界面上的突出和空穴的空间位置和突出和空穴的尺寸是这样的，从而突出可以在不明显扰动第一多肽和第二多肽在界面处正常缔合情况下位于空穴中。由于突出如Tyr；Phe和Trp一般不从界面的轴垂直延伸并且具有优选的构象，所以在一些情况下，突出与相应空穴的对齐依赖于根据三维结构(如通过X射线结晶学或核磁共振(NMR)获得的那种)，对突出/空穴对建模。这可以使用本领域广泛接受的技术实现。“原始核酸或模板核酸”意指编码目的多肽的核酸，所述核酸可以“改变”(即基因工程化或突变)以编码突出或空穴。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸或可以包含已经经受事先改变的核酸(例如人源化抗体片段)。“改变”核酸意指原始核酸因插入、缺失或替换至少一个编码目的氨基酸残基的密码子而突变。正常情况下，编码原始残基的密码子由编码输入残基的密码子替换。按照这种方式遗传修饰DNA的技术已经在Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson编著(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中综述，并且例如包括位点定向诱变、盒诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。通过突变原始/模板核酸，原始/模板核酸编码的原始/模板多肽因此相应地改变。
可以通过合成的手段，例如通过重组技术、体外肽合成法、用于引入前述非天然存在氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术一些组合，将突出或空穴引入第一或第二多肽的界面。因此，“引入”的突出或空穴是“非天然存在的”或“非天然的”，这意指它在自然界中或在原始多肽中不存在(例如人源化单克隆抗体)。
通常，用于形成突出的输入氨基酸残基具有数目相对少(例如约3-6种)的“旋转异构体”。“旋转异构体”是氨基酸侧链的能量有利构象。各种氨基酸残基的旋转异构体的数目在Ponders和Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中综述。
在本文提供的方法的一些实施方案中，异多聚体蛋白第一异二聚化结构域在界面处包含结修饰，并且第二异二聚化结构域包含孔修饰。在某些实施方案中，结修饰包括来自第一异二聚化结构域的原始氨基酸残基置换为侧链比原始氨基酸残基更大的氨基酸残基。在某些实施方案中，具有较大侧链的置换用氨基酸残基是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，结修饰包括T366W置换(EU编号)。在某些实施方案中，孔修饰包括来自第二异二聚化结构域的氨基酸残基置换为具有更少侧链的氨基酸残基。在某些实施方案中，具有较小侧链的置换用氨基酸残基是丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，孔修饰包括两个或更多个氨基酸置换，所述氨基酸置换包括T366S、L368A和/或Y407V(EU编号)。
IV.载体、宿主细胞和重组方法
为了重组产生本发明的异多聚体蛋白(例如，抗体)，将编码它的核酸分离并插入复制型载体以进一步克隆(DNA扩增)或表达。使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离出编码抗体的DNA。许多载体是可获用的。载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物来源的。将可以理解，任何同种型的恒定区可以用于这个目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这类恒定区可以从任何人类或动物物种获得。
a.使用哺乳动物宿主细胞产生异多聚体蛋白：
载体组件通常包括但不限于以下一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
i.信号序列组件
用于哺乳动物宿主细胞的载体还可以含有在成熟蛋白或目的多肽的N末端具有特定切割位点的信号序列或其他多肽。选择的异源信号序列优选地是宿主细胞识别并加工(即，由信号肽酶切割)的一个异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如，单纯疱疹gD信号，是可用的。这种前体区域的DNA符合可读框地连接至编码所需异多聚体蛋白)(例如，抗体)的DNA。
ii.复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件。例如，一般可以使用SV40复制起点，但是仅因为它含有早期启动子。
iii.选择基因组件
表达和克隆载体可以含有选择基因，也称作选择标记。常见的选择基因编码这样的蛋白质，这些蛋白质(a)赋予针对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，(b)互补性营养缺陷型，在有意义的情况下，或(c)供应从复杂培养基不可获得的关键养分。
选择方案的一个例子利用使宿主细胞生长停滞的药物。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予耐药性的蛋白质并且因此实现选择方案。这种显性选择的例子使用药物新霉素、麦考酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的另一个合适选择标记例子是这些选择标记，它们能够确定有能力摄取抗体的细胞，如DHF、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II、优选地灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过在含有氨甲喋呤(Mtx)(DHF的竞争性拮抗剂)培养基中培养全部转化体，鉴定用DHF选择基因转化的细胞。当使用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺损的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
备选地，可以通过在含有针对选择标记的选择剂如氨基糖甙类抗生素(例如，卡那霉素、新霉素、或G418)的培养基中生长细胞，选择用编码抗体、野生型DHF蛋白和另一个选择标记如氨基糖苷类抗生素3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(尤其含有内源DHF的野生型宿主)。参见，例如，美国专利号4,965,199。
iv.启动子组件
表达载体和克隆载体通常含有由宿主生物识别并且与编码含有铰链的所需多肽的核酸有效连接的启动子。哺乳动物细胞的启动子序列是已知的。实际上，全部哺乳动物基因均具有一个距其中启动转录的位点上游大约25个至30个碱基存在的AT丰富区。另一个距许多基因的转录起点上游70个至80个碱基存在的序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大部分哺乳动物基因的3'末端是AATAAA序列，该序列可以是添加多聚腺苷酸尾至编码序列3’末端的信号。全部这些序均适当地插入哺乳动物表达载体中。
哺乳动物宿主细胞中来自载体的所需含有铰链的多肽转录和轻链转录例如下述启动子控制，所述启动子从病毒(例如，多瘤病毒、禽痘病毒)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40))的基因组获得、从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子获得，或从热休克启动子获得，条件是这类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期启动子和晚期启动子作为还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段便利地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIII E限制性片段便利地获得。美国专利号4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中描述了这个系统的修改形式。关于小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下表达人干扰素cDNA，还参见Reyes等人,Nature 297:598-601(1982)。备选地，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可以用作启动子。
v.增强子元件组件
可以通过将增强子序列插入载体，增加通过哺乳动物宿主细胞转录所需的含有铰链的多肽和轻链的DNA。现在已知来自哺乳动物基因(例如，珠蛋白基因、弹性蛋白酶基因、白蛋白基因、α-胎蛋白基因和胰岛素基因)的许多增强子序列。另外，可以使用来自哺乳动物细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点晚期侧(bp 100-270)的SV40增强子、细胞巨化病毒早期启动子增强子、在复制起点晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于增强真核启动子激活的元件的描述，还参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可以在编码抗体多肽的序列5'或3'的位置被剪接入载体，前提是实现增强作用，但通常距启动子5'的位点处存在。
vi.转录终止组件
哺乳动物宿主细中所用的表达载体一般还将含有为终止mRNA转录和稳定mRNA必需的序列。这类序列常从哺乳动物DNA或cDNA或者病毒DNA或cDNA的5'非翻译区和偶尔从其3'非翻译区可获得。这些区域含有转录为编码抗体的mRNA的非翻译部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一个可用的转录终止组件是牛生长激素多聚腺苷化区。参见WO94/11026并且本文中公开了表达载体。
vii.宿主细胞的选择和转化
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞包括本文所述的细胞哺乳动物，包括脊椎动物宿主细胞。培养物(组织培养)中增殖脊椎动物细胞已经变成一项例行程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的例子是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚肾系(经亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHF(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺瘤(MM060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(HepG2)。
将宿主细胞用上述用于含有铰链的所需多肽和轻链的表达载体或克隆载体转染或转化并且在常规营养培养基中培养，如果适宜，调整所述常规营养培养基以诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在一些实施方案中，宿主细胞是稳定转染的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是稳定细胞系。
viii.培养宿主细胞
用来产生本发明的含有铰链的所需多肽和轻链的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售培养基如Ham F10(Sigma)、极限基本培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)、Sigma)适于培养宿主细胞。此外，在Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985中描述的任何培养基可以作为宿主细胞的培养基使用。这些培养基的任一者可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素TM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或同等能量源。也可以按本领域技术人员已知的适宜浓度包括任何其他的必需补充物。培养条件如温度、pH等是先前随被选择用于表达的宿主细胞所用的那些培养条件，并且将对普通技术人员是显而易见的。
ix.异多聚体蛋白的纯化
当使用重组技术时，含有铰链的多肽与缔合的轻链多肽可以在胞内产生或直接分泌入培养基。如果含有铰链的多肽和轻链多肽以胞内方式产生，则作为第一步骤，移除颗粒状残片(宿主细胞或裂解的片段)，例如，通过离心或超滤移除。在与轻链多肽缔合的含有铰链的多肽分泌入培养基的情况下，首先通常使用市售的蛋白质浓缩滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，浓缩来自这类表达系统的上清液。可以在前述任意步骤中包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，并且可以包含抗生素以防止外来污染物增长。
例如，使用羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱，可以纯化从细胞制备的异多聚体组合物，亲和色谱是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.,62:1-13(1983))。推荐蛋白G用于全部小鼠同种型和用于人γ3(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和力配体与之连接的基质最经常是琼脂糖，但是其他矩阵是可用的。力学稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允许比可以用琼脂糖所实现的更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker；Phillipsburg,NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体，用于蛋白纯化的其他技术如在离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶上色谱、肝素SEPHAROSETM上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上色谱、聚焦色谱，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀法也可用的。
在任何初步纯化步骤后，包含目的抗体和杂质的混合物可以经历低pH疏水相互作用色谱，所述低pH疏水相互作用色谱使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选地以低盐浓度(例如，从约0-0.25M盐起)进行。异多聚体蛋白的产生可以备选地或额外地(除前述任何特定方法外)包括透析包含多肽混合物的溶液。
V.异多聚体蛋白形成/装配
完整异多聚体蛋白的形成涉及通过二硫键的形成装配第一含有铰链的多肽、第一轻链、第二含有铰链的多肽和第二轻链，这在本发明中称作再折叠。再折叠包括第一含有铰链的多肽与第二含有铰链的多肽缔合及链间二硫键的形成，例如，以形成双特异性抗体。因此，在本文提供方法的一些实施方案中，异多聚体蛋白的链间二硫键在第一和第二含有铰链的多肽的铰链区之间。本发明中在体外进行再折叠，也称作复性。
一旦含有铰链的多肽和缔合的轻链从细胞分泌，则异源多聚化结构域将驱动异多聚体蛋白的缔合。缔合的含有铰链的多肽的链间二硫键形成继续进行。所得到的二硫键连接的异多聚体蛋白随后纯化。任选地，可以将它配制用于研究目的、诊断目的、治疗目的或其他目的。
VI.靶分子
可以由本发明的异多聚体蛋白靶向的分子的例子包括，但不限于可溶性血清蛋白和它们的受体及其他的膜结合蛋白(例如，黏附素)。
在另一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白能够结合一种、两种或更多种选自以下的细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNBl、IFNG、IFNWl、FELl、FELl(EPSELON)、FELl(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、LL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN和THPO。
在另一个实施方案中，靶分子是选自以下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子蛋白：CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCLH(嗜酸细胞趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/次级非淋巴组织趋化因子-2)、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCLIl(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Ib)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHKl)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCRlO)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCPlO、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCClO(ClO)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDFlA、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在另一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白能够结合一种或多种选自以下的靶：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；AD0RA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF(BLys)；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF1O)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCLI1(嗜酸性粒细胞趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP-Id)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3a)；CCL21(MTP-2)；SLC；次级非淋巴组织趋化因子-2；CCL22(MDC/STC-I)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Ia)；CCL4(MDP-Ib)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(e-钙黏着蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21Wap1/Cip1)；CDKN1B(p27Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(密蛋白-7)；CLN3；CLU(簇集蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-联蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYD1)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCLI1(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FEL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-I)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCR1O)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCC1O(C1O)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HDP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-I；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2,IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAKI；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整联蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整联蛋白)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GCBoxBP)；KLF6；KLK1O；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(发特异性H型角蛋白)；LAMAS；LEP(瘦蛋白)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(metallothionectin-III)；MTSS1；MUC1(黏蛋白)；MYC；MYD88；NCK2；神经聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；N0X5；NPPB；NROB1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸聚糖(phosphacan)；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；Proc；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNFI1O(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳球蛋白2)；SCGB2A2(乳球蛋白1)；SCYE1(内皮单核细胞-活化细胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(乳腺丝抑蛋白)；SERPINE1(PAI-I)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT；SPP1；SPRR1B(Spr1)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBS1(血小板反应蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFI1A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(APO3L)；TNFSF13(4月)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSF8(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；To11样受体；TOP拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多能聚糖；VHLC5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-Ib)；XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；和ZFPM2。
由本发明涵盖的抗体的优选分子靶分子包含CD蛋白质如CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD20、CD34；ErbB受体家族的CD64、CD200成员如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α/β7整联蛋白和α/β3整联蛋白(包括其α或β组分)(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰(αIFN)；TNFα、白介素如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、IL17A/F、IL-18、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、C蛋白等。
在一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白结合低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体以及至少一种选自以下的靶：1)β-分泌酶(BACE1或BACE2)、2)α-分泌酶、3)γ-分泌酶、4)τ-分泌酶、5)淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、6)死亡受体6(DR6)、7)淀粉样蛋白β肽、8)α-突触核蛋白、9)Parkin、10)亨廷顿蛋白、11)p75NTR、和12)胱天蛋白酶-6。
在一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白与选自以下的至少两种靶分子结合：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-18；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-2；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和Tg-β；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8、IL-13和PED2、IL17A和IL17F、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-2、TNFα和IL-2、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体、TNFα和Te38；TNFα和BAFF；TNFα和CD22；TNFα和CTLA-4；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PD、HER1和HER2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF).和MET、VEGFR和MET受体、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6和TNFR1和IL-18R、EPCAM和CD3、MAP和CD28、EGFR和CD64、CSPG和RGM A；CTLA-4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；ng和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；PDL-I和CTLA-4；和RGM A和RGM B。
其可溶性抗原或片段，任选地与其他分子缀合，可以用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子如受体，这些分子的片段(例如，受体的胞外结构域)可以用作免疫原。备选地，表达所述跨膜分子的细胞可以用作免疫原。此类细胞可以源自天然来源(例如，癌细胞系)或可以是已经通过重组技术转化以表达所述跨膜分子的细胞。其他抗原及其用于制备抗体的形式对本领域技术人员是显而易见的。
VII.活性测定法
本发明的异多聚体蛋白可以通过本领域已知的各种测定法表征其物理/化学特性和生物学功能。
纯化的异多聚体蛋白可以进一步通过一系列测定法表征，所述测定法包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相色谱(HPLC)、质谱、离子交换色谱和木瓜蛋白酶消化。
在本发明的某些实施方案中，对本文中产生的免疫球蛋白分析就其生物学活性。在一些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试其抗原结合活性。本领域已知并且可以在本文中使用的抗原结合测定法包括而不限于使用多种技术如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定的任何直接结合测定法或竞争性结合测定法。下文在实施例部分中提供示意性抗原结合测定法。
在一个实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的改变的抗体，这使得所述抗体成为下述许多应用的有利候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。在某些实施方案中，测量产生的异多聚体蛋白的Fc活性以确保仅维持所需的特性。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保异多聚体蛋白缺少Fc R结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞-NK细胞仅表达而单核细胞表达和Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利号5,500,362或5,821,337中描述了评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的例子。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或另外，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,PNAS(USA)95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。为评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期。
VIII.缀合的蛋白质
本发明也提供缀合的蛋白质如缀合的抗体或免疫缀合物(例如，“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，包括本文所述的任何异多聚体蛋白(例如，根据本文所述方法产生的抗体)，其中轻链或重链的恒定区之一缀合至化学分子如染料或细胞毒药物如化疗药、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的酶活性毒素或其片段)、或放射性同位素(即，放射缀合物)。具体地说，如本文所述，异源多聚化结构域的使用使得构建含有两条不同重链(HC1和HC2)以及两条不同轻链(LC1和LC2)的抗体成为可能。使用本文所述方法构建的免疫缀合物可以含有与仅一条重链(HC1或HC2)或仅一条轻链(LC1或LC2)的恒定区缀合的细胞毒药物。另外，因为免疫缀合物可以具有与仅一条重链或轻链连接的细胞毒药物，正在向受试者施用的细胞毒药物的量相对于施用具有与两条重链或轻链连接的细胞毒药物抗体减少。减少正在向受试者施用的细胞毒药物的量限制了与细胞毒药物相关的不良副作用。
使用抗体-药物缀合物局部递送细胞毒药物或细胞抑制药物(即，治疗癌症时杀伤或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos和Epenetos,Anticancer Research 19:605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer,Adv.Drg.Del.Rev。26:151-172(1997)；美国专利号4,975,278))允许定向递送药物部分至肿瘤并在其中胞内蓄积，其中全身性施用这些未缀合的药物可能导致对正常细胞以及力图消除的肿瘤细胞而言不可接受的毒性水平(Baldwin等人,Lancet(Mar.15,1986):603-605(1986)；Thorpe,(1985)“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”in Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(编著)，第475-506页))。因而在毒性最小的情况下寻求最大功效。多克隆抗体和单克隆抗体均已经报道为可用于这些策略中(Rowland等人,Cancer Immunol.Immunother.21:183-187(1986))。这些方法中使用的药物包括柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、和长春地辛(Rowland等人(1986)上文)。抗体-毒素缀合物中使用的毒素包括细菌毒素如白喉毒素、植物毒素如蓖麻毒蛋白、小分子毒素如格尔德霉素(Mandler等人,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002))、类美登素(EP 1391213；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996))和刺孢霉素(Lode等人,Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993))。毒素可以通过多种机制(包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制)发挥其细胞毒作用和细胞抑制作用。与大抗体或蛋白质受体配体缀合时，一些细胞毒药物倾向于无活性或活性更小。
本文中描述了可用于产生免疫缀合物的化疗药(例如，上文)。可以使用的酶活性毒素或其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯类。参见，例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。多种放射性核素可用于产生放射缀合的抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。使用以下多种双官能蛋白质偶联剂，产生抗体和细胞毒药物的缀合物：如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那样制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见，例如，WO 94/11026。
本文中还构思了抗体和一种或多种小分子毒素如刺孢霉素、类美登素、海兔毒素(dolastatin)、aurostatin、单端孢霉烯和CC1065和这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。WO 2008/021290中提供关于这类小分子毒素的详情。
i.美坦生和类美登素
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与一种或多种类美登素分子缀合的本发明抗体(全长或片段)。
类美登素是通过抑制微管蛋白聚合发挥作用的有丝分裂抑制剂。美坦辛首次从分离非洲灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)(美国专利号3,896,111)。随后随后，发现某些微生物也产生类美登素，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成性美登醇和其衍生物和类似物例如在美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中公开。
类美登素药物部分是抗体-药物缀合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)通过发酵或化学修饰、衍生化发酵产物相对容易制备，(ii)适合于采用适合经非二硫键接头与抗体缀合的官能团衍生化，(iii)在血浆中稳定，和(iv)有效对抗多个肿瘤细胞系。
含有类美登素的免疫缀合物、产生前者的方法及其治疗性用途例如在美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1中公开，所述文献的公开内容因而通过引用的方式明确并入。Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述了包含命名为DM1的类美登素的免疫缀合物，所述类美登素与针对人结直肠癌的单克隆抗体C242连接。发现该缀合物对培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性并且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)描述免疫缀合物，其中类美登素借助二硫键接头缀合至结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7、或缀合至结合HER-2/neu癌基因的另一个鼠单克隆抗体TA.1。在体外在每个细胞表达3x 105个HER-2表面抗原的人乳腺癌细胞株系SK-BR-3测试TA.1-类美登素缀合物的细胞毒性。该药物缀合物实现与游离类美登素药物相似的细胞毒性程度，其中可以通过增加类美登素分子数目/抗体分子增加所述细胞毒性程度。A7-类美登素缀合物显示在小鼠中全身性细胞毒性低。
在不显著地削弱抗体或类美登素分子的生物学活性的情况下，通过化学连接抗体至类美登素分子，制备抗体-类美登素缀合物。参见，例如，美国专利号5,208,020(所述文献的公开内容因而通过引用的方式明确并入)。已经显示在并未不利抗体影响功能或溶解度的情况下，每个抗体分子平均缀合的3-4类美登素分子有效增强对靶细胞的细胞毒性，尽管甚至本来预计相对于使用裸抗体，一摩尔毒素/抗体将增强细胞毒性。类美登素是本领域熟知的并且可以通过已知技术或从天然来源分离合成。合适的类美登素例如在美国专利号5,208,020和在上文提及的其他专利和非专利出版物中中公开。优选的类美登素是美登醇和在芳环中或在美登醇分子的其他位置修饰的美登醇类似物，如多种美登醇酯。
存在本领域已知用于产生抗体-类美登素缀合物的多种连接基团，例如包括，在美国专利号5,208,020或EP专利0,425,235B1；Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)和美国专利申请公开号2005/0169933中公开的那些，所述文献的公开内容因而通过引用的方式明确并入。包含接头组件SMCC的抗体-类美登素缀合物可以如美国专利申请公开号2005/0169933中公开那样制备。连接基团包括如以上确定的专利中公开的二硫基、硫醚基、酸不稳定基、光不稳定基、肽酶不稳定基或酯酶不稳定基，优选二硫基和硫醚基。本文中描述并例举了额外的连接基。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和类美登素的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括提供a二硫键的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人,Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)。
取决于连接的类型，接头可以在多个位置与美坦生类分子连接。例如，酯连接可以通过使用常规偶联技术与羟基反应而形成。该反应可以在具有羟基的C-3位置、羟甲基修饰的C-14位置、羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置处发生。在优选的实施方案中，该连接在美登醇或美登醇类似物的C-3位置处形成。
ii.澳瑞司他汀和海兔毒素
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与海兔毒素或海兔毒素肽类似物和衍生物、澳瑞司他汀缀合的本发明抗体(美国专利号5,635,483和5,780,588)。已经显示多拉司他汀和澳瑞司他汀干扰微管动力学、GTP水解和胞核即细胞分裂(Woyke等人,Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584(2001))并且具有抗癌活性(美国专利号5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等人,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965(1998))。多拉司他汀或澳瑞司他汀药物部分可以经肽状药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端与抗体连接(WO 02/088172)。
示例性澳瑞司他汀实施方案包括美国申请公开号2005/0238649“能够与配体缀合的单甲基缬氨酸化合物”的N末端连接的单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF，所述文献的公开内容明确地通过引用的方式完整并入。
一般，基于肽的药物部分可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。此类肽键可以例如根据肽化学领域熟知的液相合成方法制备(参见E.和K.Lübke，“The Peptides”，第1卷，第76-136页，1965，Academic Press)。澳瑞司他汀/海兔毒素药物部分可以根据以下文献的方法制备：美国专利号5,635,483和5,780,588；Pettit等人,J.Nat.Prod.44:482-485(1981)；Pettit等人,Anti-Cancer Drug Design13:47-66(1998)；Poncet,Curr.Pharm.Des.5:139-162(1999)；和Pettit,Fortschr.Chem.Org.Naturst.70:1-79(1997)。还参见Doronina,Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003)；和因而通过引用方式完整并入的美国申请公开号2005/0238649“能够与配体缀合的单甲基缬氨酸化合物”(例如公开了接头和制备与接头缀合的单甲基缬氨酸化合物如MMA和MMA的方法)。
iii.刺孢霉素
在其他实施方案中，免疫缀合物包含与一种或多种刺孢霉素分子缀合的本发明抗体。抗生素的刺孢霉素家族能够以亚皮摩尔浓度引起DNA断裂。关于制备刺孢霉素家族的缀合物，参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296(均授予American Cyanamid Company)。可以使用的刺孢霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θ1I(Hinman等人,Cancer Research 53:3336-3342(1993)；Lode等人,Cancer Research 58:2925-2928(1998)和授予American Cyanamid的前述美国申请)。另一个可以与抗体缀合的抗肿瘤药物是作为抗叶酸的QFA。刺孢霉素和QFA具有胞内作用位点并不轻易地跨过质膜。因此，细胞借助抗体介导的内化过程摄取这些药物大大提高其细胞毒效应。
iv.其他细胞毒药物
可以与本发明抗体或根据本发明方法产生的抗体缀合的其他抗肿瘤药物包括BCNU、链脲佐菌素、长春新碱和5-氟尿嘧啶、美国专利号5,053,394和5,770,710中所述的统称为LL-E33288复合物的药物家族以及埃斯波霉素(美国专利号5,877,296)。
可以使用的酶活性毒素或其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯类(参见，例如，WO93/21232、1993年10月28日公开)。
本发明进一步构思在多肽和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间行程单免疫缀合物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可以包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射缀合的抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当该缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，mri)，如再次碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以将放射标记物或其他标记物以已知方式掺入缀合物。例如，肽可以生物合成或可以使用合适的氨基酸前体(包括例如替换氢的氟-19)通过化学氨基酸合成法合成。可以通过肽中的半胱氨酸残基连接标记物如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。生碘法(Iodogen method)(Fraker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))可以用来掺入碘-123。“MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒药物的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那样制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见，例如，WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本发明的化合物明确地构思、但不限用以下交联剂试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和可商业获得的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。参见2003-2004年使用手册及目录第467-498页。
v.缀合抗体的制备
在本发明的缀合抗体中，抗体与一个或多个部分(例如，药物部分)(例如，约1至约20个部分/抗体)、任选地通过接头缀合。缀合的抗体可以使用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，通过几个途径制备，所述途径包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与双价接头试剂反应，随后与与目的部分反应；和(2)某部分的亲核基团经共价键与双价接头试剂反应，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备缀合的抗体的额外方法。
接头试剂可以由一个或多个接头组件组成。示例性接头组件包括6-马来酰亚胺己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对-氨基苯甲氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧化物(“SMCC’)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。额外的接头组分是本领域已知的并且一些在本文中描述。还参见美国申请公开号2005/0238649“能够与配体缀合的单甲基缬氨酸化合物”的N末端连接的单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF，所述文献的内容因而通过引用的方式完整并入。
在一些实施方案中，接头可以包含氨基酸残基。示例性氨基酸接头组件包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头组件的氨基酸残基包括天然存在的那些以及稀少氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。氨基酸接头组件可以在它们受特定酶(例如，肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶蛋白酶)酶促裂解的选择性方面设计和优化。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基、(ii)侧链胺基，例如，赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如，半胱氨酸，和(iv)其中抗体糖基化的情况下糖羟基或氨基。胺、巯基、和羟基是亲核的，并且通过硫化物交换，能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即，半胱氨酸桥。可以通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理，令抗体对缀合至接头试剂有反应性。每种半胱氨酸桥将因此理论上形成两个反应性巯基亲核体。可以通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut试剂)反应，导致胺转变成硫醇，向抗体引入额外的亲核基团。可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变体抗体)，向抗体或其片段引入反应性硫醇基。
本发明的缀合抗体也可以通过修饰抗体以引入亲电部分来产生，所述的亲电部分可以与接头试剂或药物或其他部分上的亲核性取代基反应。糖基化抗体的糖可以是氧化，例如，用高碘酸盐氧化试剂氧化，以形成可以与接头试剂或药物或其他部分的胺基反应的醛基或酮基。所产生的亚胺西夫碱基团可以形成稳定键，或可以还原，例如，通过硼氢化物试剂还原，以形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的糖部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白质中产生可以与药物或其他部分上适当基团反应的羰基(醛基和酮基)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可以与偏高碘酸钠反应，导致产生醛，替代第一氨基酸(Geoghegan和Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-146(1992)；美国专利号5,362,852)。这种醛可以与药物部分或接头亲核体反应。
同样地，部分(如药物部分)上的亲核基团包括但不限于：胺基、巯基、羟基、酰肼基、肟基、肼基、硫代半卡巴腙基、羧化肼基和芳酰肼基，前述基团能够反应以与接头部分和接头试剂上的亲电基团形成共价键，所述亲电基团包括：(i)活泼酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤如卤乙酰胺；和(iii)醛、酮类、羧基和马来酰亚胺基。
可选地，例如，通过重组技术或肽合成，可以产生包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含编码该缀合物的两个部分的各自区域，所述两个部分毗邻彼此或由编码不破坏该缀合物所需特性的接头肽的区域分隔。在又一个实施方案中，抗体可以与用于肿瘤预导引(tumor pretargeting)的“受体”(如，链霉亲和素)缀合，其中将抗体-受体缀合物施用至个体，随后使用清除剂从循环中移除未结合的缀合物并且随后施用与细胞毒药物(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
IX.实用性
本文提供的本发明方法具有产生异多聚体蛋白的工业适用性。本发明方法减少涉及两次独立发酵和分离的工作量，也减少两次独立发酵固有的技术难题。另外，消除先前方法程序的复性步骤和氧化还原步骤可以增加产率并降低加工复杂性和成本。
本文所述的异多聚体蛋白例如用于体外、离体和体内治疗方法。本发明提供基于使用这些分子中一种或多种分子的多种方法。在某些病理状况下，需要和/或想要利用异多聚体蛋白，例如，多特异性抗体。本发明提供这些异多聚体蛋白，所述异多聚体蛋白可以用于多种目的，例如用作治疗药、预防药和诊断药。例如，本发明提供治疗疾病的方法，所述方法包含向需要治疗的受试者施用本发明的异多聚体蛋白，因而治疗该疾病。本文所述的本发明任何异多聚体蛋白可以用于本文所述的治疗(或预防或诊断)方法中。
例如，当异多聚体蛋白是多价时，宝贵益处是它们针对其抗原赋予的亲合力增强。除了在结合单元(即，Fab)上具有针对抗原基础的内在高亲和之外、正常IgG抗体还利用亲合效应以增加它们与抗原的缔合，原因在于它们与靶双价结合。
针对相同抗原分子上两个独立表位的异多聚体蛋白不仅可以提供增结合亲合力增强的益处(因为双价结合)，还可以获得不与任一种亲本抗体缔合的新特性。因此，本发明的异多聚体蛋白用于例如阻断受体-配体相互作用。
本文所述的异多聚体蛋白还用于采用一种分子同时阻断两种靶的信号传导途径的应用中。
X.治疗性用途
本文所述的异多聚体蛋白如抗体和抗体片段(例如，根据本发明方法产生的抗体和/或其片段)可以用于治疗性应用。例如，此类异多聚体蛋白可以用于治疗肿瘤，包括癌前、非转移性、转移性和癌性肿瘤(例如，早期阶段癌症)，用于治疗过敏性或炎性病症，或用于治疗自身免疫免疫病，或用于治疗存在形成癌症例如，乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌)、过敏性或炎性病症或自身免疫免疫病的风险的受试者。
术语癌症包括增生性病症的总称，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤和恶性肿瘤。良性肿瘤在发源部位保持局限并且不具有浸润、侵入或转移至远处部位的能力。恶性肿瘤将侵入并损伤在它们周围的其他组织。它们也可以赢得突破其起源部位并且扩展(转移)至身体其他部的能力，这通常经血流或经其中存在淋巴结的淋巴系统进行。原发肿瘤根据原发肿瘤起源的组织类型分类；转移性肿瘤根据从中衍生癌细胞的组织类型分类。随时间推移，恶性肿瘤细胞变得更为异常并且显得更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤分级，并且将癌细胞描述为良好分化的、中等分化的、不良分化的或未分化的。良好分化的细胞在外观上相当正常并且与它们从中起源的正常细胞相似。未分化的细胞是这样的细胞，它们已经变得如此异常，从而不再可能确细胞的起源。
肿瘤可以是实体肿瘤或非实体或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病(例如、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、成人急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、成熟B-细胞急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、或毛细胞白血病)或淋巴瘤(例如、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤或霍奇金病)。实体肿瘤包括除血液、骨髓或淋巴系统之外的身体组织的任何癌。实体肿瘤可以进一步分成上皮细胞来源的那些实体肿瘤和非上皮细胞来源的那些实体肿瘤。上皮细胞实体肿瘤的例子包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝脏、胰、卵巢、头与颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、唇、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体肿瘤包括肉瘤、脑肿瘤和骨肿瘤。
上皮癌症通常从良性肿瘤演进至侵入前期(例如，原位癌)，演进至恶性癌，其已经渗透基底膜并且侵入上皮下间质。
多特异性蛋白质复合物也可以用于这些治疗性应用中，并且结合HER2的抗体特别可以用来治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌。
作为接受本发明组合物的候选人的其他受试者患有以下病症或棉铃形成所述病症的风险：纤维血管组织异常增生、酒渣鼻性痤疮、获得性免疫缺陷综合征、动脉闭塞、异位性角膜炎、细菌性溃疡、Bechet病、血源肿瘤、颈动脉阻塞病、脉络膜血管新生、慢性炎症、慢性视网膜脱离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、隐形眼镜过度磨损、角膜移植排异、角膜血管新生、角膜移植物血管新生、Crohn病、Eale病、流行性角结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西肉瘤、白血病、脂质变性、莱姆病、边缘角质层分离、Mooren溃疡、除麻风病之外的分枝杆菌感染、近视、眼新生血管性疾病、视盘先天性小凹(optic pit)、Osler-Weber综合征(Osler-Weber-Rendu)、骨关节炎、Paget病、睫状体平坦部炎(pars planitis)、类天疱疮、小水疱病、多动脉炎、激光后并发症、原虫感染、弹性假黄瘤、翼状胬肉、干性角膜炎、放射状角膜切开术、视网膜血管新生、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、类肉瘤(sarcoid)、巩膜炎、镰状细胞性贫血、Sogren综合征、实体瘤、Stargart病、Steven-Johnson病、上部角膜缘角膜炎、梅毒、系统性狼疮、Terrien角膜边缘性变性、弓形体病、尤文氏肉瘤的肿瘤、成神经细胞瘤的肿瘤、骨肉瘤的肿瘤、视网膜母细胞瘤的肿瘤、横纹肌肉瘤的肿瘤、溃疡性结肠炎、静脉闭塞、维生素A缺乏症、Wegener肉样瘤病、与糖尿病相关的不利血管生成、寄生虫病、伤口愈合异常、术后肥大、损伤或创伤(例如，急性肺损伤/ARDS)、抑制毛发生长、抑制排卵与黄体形成、抑制植入、和抑制子宫内胚发育。
可以使用根据本文所述方法产生的抗体治疗过敏性或炎性病症或者自身免疫疾病或病症的实例包括，但是不限于关节炎(类风湿性关节炎如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、变性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、椎骨关节炎，和幼年发作型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发多发性关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性过度增生性皮肤病、银屑病如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和趾甲银屑病、皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎，和特异性皮炎、X连锁的IgM过多综合征、荨麻疹如慢性应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹、多发性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化如系统性硬化病、多发性硬化(MS)如脊髓-视神经MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)、进行性系统性硬化病、动脉粥样硬化、动脉硬化、散播性硬化和共济失调性硬化、炎性肠病(IBD)(例如，Crohn病、自身免疫介导的胃肠病、结肠炎如溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎与自身免疫炎性肠病)、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化胆管炎、表层巩膜炎)、呼吸窘迫综合症、包括成人或急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、脑膜炎、全部或部分葡萄膜的炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫血液病、类风湿性脊椎炎、突发性听力丧失、IgE-介导的疾病如过敏反应和过敏性与特应性鼻炎、脑炎如Rasmussen脑炎和边缘性和/或脑干脑炎、葡萄膜炎、如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎,或自身免疫性葡萄膜炎、伴有和不伴有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，如慢性或急性肾小球肾炎如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性(membrano)或膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，和快速进行性GN、过敏性体质、变态反应、湿疹，包括变应性或特发性湿疹、哮喘，如支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病状、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞黏附性缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematodes)如皮肤SLE、亚急性皮肤型红斑狼疮、新生儿期狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎、脑炎、儿科、非肾、肾外、盘状、秃顶性狼疮)、幼年发作型(I型)糖尿病，包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人发作型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症、与细胞因子及T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应、结核病、结节病、肉芽肿，包括淋巴瘤样肉芽肿、韦格纳肉芽肿病、粒细胞缺乏症、血管炎类，包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu's)动脉炎)、中等血管血管炎(包括Kawasaki病和结节性多动脉炎)、显微镜下多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤型或超敏性血管炎、系统性坏死性血管炎，和ANCA相关的血管炎，如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS))、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、先天性再生障碍性贫、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(anemia perniciosa)、Addison病、纯红细胞贫血或发育不良(PRCA)、因子VIII缺乏症、血友病A、自身免疫性嗜中性白血球减少症、泛白细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、CNS炎性病症、多器官损伤综合征，如继发于败血症、创伤或出血的那些多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、Bechet或Behcet病、Castleman综合征、Goodpasture综合征、Reynaud综合征、Sjogren综合征、Stevens-Johnson综合征、类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常性天疱疮、落叶状天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮(pemphigus mucus-membrane pemphigoid)和红斑性天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺病、Reiter病或综合征、免疫复合物肾炎、抗体-介导的肾炎、视神经脊髓炎、多发性神经病、慢性神经病如IgM多发性神经病或IgM-介导的神经病、血小板减少症(如由心肌梗死患者发展)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)(包括慢性或急性ITP)、睾丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、甲状旁腺功能减退症、自身免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、Grave病、多内分泌腺综合征，如自身免疫性多内分泌腺综合征(或多内分泌腺内分泌病综合征)、副肿瘤性综合征，包括神经系统副肿瘤综合征如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征、僵人或僵者综合征(stiff-man or stiff-person syndrome)、脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎或过敏性脑脊髓炎和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力如胸腺肿瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病、多灶性运动神经病、Sheehan综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴细胞间质性肺炎、闭塞性细支气管炎(非移植物)vsNSIP、Guillain-Barre综合征、Berger病(IgA神经病)、特发性IgA神经病、线状IgA皮肤病(linear IgA dermatosis)、原发性胆汁性肝硬化、肺硬变、自身免疫性肠病综合征、腹腔疾病、腹腔疾病、乳糜泻(谷蛋白肠病)、难治性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS；Lou Gehrig病)、冠状动脉病、自身免疫性耳病如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力丧失、视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎如难治性或复发性多软骨炎、肺泡蛋白沉着症、淀粉样变性病、巩膜炎、非癌性淋巴细胞增多、原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆免疫球蛋白病和意义不确定性单克隆免疫球蛋白病，MGUS)、外周神经病、副肿瘤性综合征、离子通道病，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉病(muscular disorder)、耳聋、失明、周期性麻痹，和CNS的离子通道病、自闭症、炎性肌病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝病(autoimmune hepatological disorder)、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭(multiple endocrine failure)、Schmidt综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病、糖尿病性肾病、Dressler综合征、斑秃、CREST综合征(钙化、雷诺现象、食管运动功能失常、指端硬化和毛细血管扩张症)、男性和女性自身免疫性不育、混合型结缔组织病、Chaga病、风湿热、反复流产、霉尘肺(farmer's lung)、多形红斑、心脏切开术后综合征、库欣综合征、养鸟人肺(bird-fancier's lung)、变应性肉芽肿性血管炎、良性淋巴细胞血管炎、Alport综合征、肺泡炎，如过敏性肺泡炎和纤维化肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、kypanosomiasis、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter综合征、Caplan综合征、登革热、心内膜炎、心肌内膜纤维化、弥漫性间质性肺纤维化、间质性肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythemaelevatum et diutinum)、胎儿幼红细胞增多症、嗜酸性细胞增多性肌膜炎、Shulman综合征、Felty综合征、丝虫病(fiariasis)、睫状体炎,如慢性睫状体炎、异色性睫状体炎(heterochronic cyclitis)、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎、Henoch-Schonlein紫癜、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾柯病毒感染、心肌病、阿尔茨海默病、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征、先天性风疹感染、Epstein-Barr病毒感染、腮腺炎、Evan综合征、自身免疫性性腺衰竭、Sydenham舞蹈病、链球菌感染后肾炎、闭塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、甲状腺毒症、脊髓痨(tabes dorsalis)、脉络膜炎、巨细胞多肌痛、内分泌眼病、慢性超敏性肺炎、干燥性角膜结膜炎、流行性角膜结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变性肾病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、视网膜自体免疫(retinal autoimmunity)、关节炎、支气管炎、慢性阻塞性气道疾病、矽肺病、口疮、口疮性口炎、动脉硬化性疾病、aspermiogenese、自身免疫性溶血、Boeck病、冷球蛋白血症、Dupuytren挛缩、晶状体蛋白过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)、过敏性肠炎、麻风结节性红斑e、特发性面瘫、慢性疲劳综合征、风湿热(febris rheumatica)、Hamman-Rich病、感觉神经性听力丧失、阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺功能减退症、局限性回肠炎、白细胞减少症、传染性单核细胞增多症,横贯性脊髓炎、原发性特发性粘液性水肿、肾变病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多发性神经根炎、坏疽性脓皮病、奎汶氏甲状腺炎、获得性脾萎缩(acquired spenic atrophy)、因抗精子抗体所致的不育、非恶性胸腺肿瘤、白癜风、SCID和Epstein-Barr病毒相关性疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、寄生虫病如利什曼原虫、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的病状、白细胞黏附性缺陷、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答、涉及白细胞渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物-介导的疾病、抗肾小球基底膜病、变应性神经炎、自身免疫性多内分泌腺病、卵巢炎、原发性粘液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合型结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌腺衰竭、外周神经病、自身免疫性多内分泌腺综合征I型、成年发作型特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、全秃、扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、血色素沉着症、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化胆管炎、化脓性或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦炎、额窦炎、上颌窦炎或蝶窦炎、嗜酸细胞相关病症如嗜酸粒细胞增多症、嗜酸细胞增多性肺浸润、嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征、Loffler综合征、慢性嗜酸细胞性肺炎、热带肺嗜酸粒细胞增多症、支气管肺曲霉病、曲霉肿,或含有嗜酸性细胞的曲霉肿、过敏反应、血清阴性脊椎关节炎、多内分泌腺自身免疫病、硬化胆管炎、巩膜念珠菌病、巩膜外层念珠菌病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、Bruton综合征、婴儿期暂时性低γ球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张症、与胶原病相关的自身免疫功能紊乱、风湿病、神经学疾病、缺血性再灌注病、血压下降反应、血管功能障碍、脉管扩张(angiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血，和伴血管化疾病、变应性超敏病(allergichypersensitivity disorder)、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、再灌注损伤、心肌或其他组织的再灌注损伤、具有急性炎症组分的皮肤病、急性紫癜性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性病症、眼和眼眶炎性病症、粒细胞输血相关合征、细胞因子诱导的中毒、急性严重炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、肺硬变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性大动脉病、动脉内增生、消化性溃疡、心瓣炎和子宫内膜异位。
除治疗性用途之外还，本发明的抗体可以用于其他目的，包括诊断方法，如用于本文所述疾病和病状的诊断方法。
XI.用药、制剂和持续时间
本发明的蛋白质将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体受试者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法，施用计划和医疗执业者已知的其他因素。“待施用的蛋白质的治疗有效量将受此类考虑事项支配，并且是为了预防、改善或治疗特定病症(，癌症、变应性或炎性疾病、或自身免疫疾病)必需的最小量。该蛋白质不必要、但是任选地，与目前用来预防或治疗该病症的一种或多种药物一起配制，此类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的蛋白质的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以相同的剂量并且以如前文所用的施用途径或以约从1％至99％的前述所用剂量使用。通常，减轻或治疗癌症包括减弱与癌症相关的一种或多种症状或医学问题。药物的治疗有效量可以实现以下一种情况或其组合：减少癌细胞数目(至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)；减少或抑制肿瘤尺寸或肿瘤负荷；抑制(即，降低到某个程度和/或制止)癌细胞向外周器官浸润；；在腺瘤情况下减少激素分泌；降低血管密度；抑制肿瘤转移；减少或抑制肿瘤生长；和/或缓解一个或多个与癌症相关的症状到某个程度。在一些实施方案中，蛋白质用来阻止癌症或自身免疫疾病在受试者中出现或复现。
在一个实施方案中，本发明可以用于增加易患或经诊断患有癌症或自身免疫疾病的人类受试者的存活持续时。存活持续时间定义为从首次施用药物至死亡的时间。存活持续时间也可以由治疗组相对于对照组的分层风险比(HR)度量，所述的分层风险比代表治疗期间受试者死亡的风险。
在又一个实施方案中，本发明的治疗在易患或经诊断患有用多种抗癌疗法治疗过的癌症的人类受试者群体中显著地增加缓解率。缓解率定义为接受治疗的对疗法有反应的受试者的百分比。在一个方面，与采用单一手术、放射疗法或化疗治疗的群体相比，使用本发明蛋白质和手术、放射疗法或一种或多种化疗药的本发明联合治疗在接受治疗的受试者组中显著地增加缓解率，这种增加具有小于0.005的卡方p-值。美国专利申请公开号20050186208中描述了治疗癌症的治疗功效的额外量度。
在某些实施方案中，提供一种组合物，所述组合物包含根据本文所述任何方法产生的异多聚体蛋白和可药用载体。使用本领域已知的标准方法，通过具有所需纯度的活性成分与任选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合，制备治疗性制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences(第20版).A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN、PLURONICS或PEG。
任选的，但是优选地，制剂含有可药用盐、优选地氯化钠，并且优选地以约生理学浓度含有。任选地，本发明的制剂可以含有可药用的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度是从0.1至2.0％，一般按v/v计。合适的防腐剂包括制药领域已知的那些。苄醇、苯酚、间甲酚、尼泊金甲酯和羟苯丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可以按0.005％至0.02％的浓度包含可药用的表面活性剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种活性化合物，优选地是具有并未不利相互影响的互补活性的那些活性化合物。此类分子适当地以有效用于预期目的的量存在。
有效成分也可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。这类技术在上文的Remington's Pharmaceutical Sciences中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有异多聚体蛋白的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-谷氨酸酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林乙酸酯组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100日，但是某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间。当包囊化的异多聚体蛋白长时间留在体内时，它们可能因在37℃暴露于水分而变性或聚集，导致生物学活性丧失和免疫原性可能改变。可以根据所涉及的机制构思用于稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是因巯基-二硫键互换所致的分子间S-S键，可以通过修饰硫氢基残基、从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适宜的添加物和开发专特定聚合物母体组合物实现稳定作用。
根据已知的方法，如作为大丸剂的静脉内施用或通过经一段时间连续输注，通过肌内、腹内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径，将本文所述的蛋白质(例如，根据本文所述方法产生的异多聚体蛋白如多特异性抗体)施用至受试者，例如，人类受试者。如果广泛副作用或毒性与拮抗由蛋白质识别的靶分子相关，则可能特别需要局部施用。离体策略也可以用于治疗性应用。离体策略包括用编码本发明蛋白质的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。随后将转染或转导的细胞返回这位受试者。细胞可以是广泛类型细胞的任一种，包括而不限于造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树枝状细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌肉细胞。
在一个例子中，当病症或肿瘤位置允许时，局部施用蛋白质复合物(例如，根据本文所述方法产生的异多聚体蛋白如多特异性抗体)，例如，通过直接注射，并且注射可以定期地重复。可以将蛋白质复合物全身性递送至受试者或直接递送至肿瘤细胞，例如，在手术摘除肿瘤后递送至肿瘤或肿瘤床，目的是防止或减少局部复发或转移。
XII.制造品
本发明的另一个实施方案是一种制造品，所述制造品含有本文所述的一种或多种异多聚体蛋白和可用于治疗或诊断病症(例如，自身免疫疾病或癌症)的材料。该制造物包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了有效治疗所述病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的异多聚体蛋白(例如，抗体或抗体片段)。标签或包装插页说明该组合物用于治疗特定的病状。该标签或包装插页会进一步包含用于施用该异多聚体蛋白至受试者的说明书。还构思了包含本文所述的组合性治疗药的制造品和试剂盒。
包装插页指治疗产品的商业包装中习惯性包含的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。在某些实施方案中，包装插页说明，该组合物用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌。
额外地，制造品还可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点所认定的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
还提供可用于多种目的(例如，从细胞纯化或免疫沉淀抗原)的试剂盒。为了分离和纯化抗原，试剂盒可以含有与珠(例如，琼脂糖珠)偶联的异多聚体蛋白。可以提供含有异多聚体蛋白用于体外(例如在ELISA或蛋白质印迹法中)检测和定量抗原的试剂盒。与制造品一样，该试剂盒包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。容器容纳了包含本发明的至少一种异多聚体蛋白(例如，多特异性抗体片段或抗体片段)的组合物。可以包括含有例如稀释剂和缓冲液或对照抗体的额外容器。标签或包装物插页可以提供对组合物的描述以及预期体外或诊断用途的说明。
认为前面的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明成为可能。以下的实施例仅出于说明目的而提供并且不意在以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文显示和描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前面的描述而对本领域技术人员是显而易见的并且落于所附权利要求书的范围内。
在以下的实验公开中，以下缩略语适用：eq(当量)；M(摩尔)；μM(微摩尔)；N(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；℃(摄氏度)；hr(小时)；min(分钟)；sec(秒)；msec(毫秒)；ADCC(抗体依赖的细胞毒性))；BsAb(双特异性抗体)；CL(轻链恒定结构域；CH(重链恒定结构域)；CMC(补体介导的细胞毒性)；Fab(抗原结合片段)；Fc(可结晶片段)；Fv(可变片段(VL+VH))；EGFR(表皮生长因子受体)；HC(重链)；IGFR(胰岛素样生长因子受体)；LC(轻链)；scFv(单链可变片段(由氨基酸接头系留的VL和VH)；VEGF(血管内皮生长因子)；VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)；VH(可变重链结构域)；VL(可变轻链结构域)。
实施例
本发明在后续实例中以进一步细节描述，其中所述实例不意图以任何方式限制如要求授权的本发明范围。附图意在视为本发明说明书和描述内容的不可分割部分。所援引的全部参考文献通过参考其中所述全部内容，通过引用方式结合在此。提供以下实施例旨在说明，但不限制要求保护的本发明。
实施例1：合并的细胞培养物中双特异性抗体的单体组分的摩尔比可以通过调节细胞:细胞比率进行控制
以下例子显示在相同培养物中培养各自表达结半抗体或孔半抗体的两个哺乳动物细胞系(CHO细胞)时结半抗体和孔半抗体的摩尔比。
进行生产研究以确定每个细胞系的生产滴度(即，由细胞产生的抗体的总量，所述抗体包括异二聚体、同型二聚体和单体半抗体)。各细胞系每3天或4天在种子训练培养基中传代直至各细胞系的生产滴度数据变得可获得的。
随后培养并诱导两个细胞系以在独立的培养物中表达结半抗体或孔半抗体。每3天或4天将单独的结细胞系培养物和孔细胞系培养物以40mL体积在摇瓶中在种子训练培养基内传代。在培养物待合并的当日，借助Vicell(Beckman Coulter)测量细胞计数。
独立的培养物随后按特定结宿主细胞:孔宿主细胞比率合并。基于针对各个细胞系已知的生产滴度，计算结宿主细胞:孔宿主细胞比率。对于每种小规模生产，需要约40x106个细胞。使用Vicell计数(细胞/mL)，可以确定需要添加至合并的培养物以实现所需结宿主细胞:孔宿主细胞比率的每个细胞系体积。将适当体积的每个结细胞系和孔细胞系在新摇瓶的生产培养基中以终体积40mL合并。
在收获之前15小时，通过将GSH溶解入400mM琥珀酸中的1M精氨酸(pH＝9.0)至GSH储液终浓度250mM，制备谷胱甘肽(GSH)储液。将GSH储液添加至生产培养物，从而GSH终浓度是15mM。随后收获合并的培养基并且在还原性条件下借助反相测量每种合并的培养物的结半抗体％和孔半抗体％。确定针对每个受检比率所形成的共价双特异性抗体％，如图2中所述。
这些实验用以下结半抗体/孔半抗体对进行：
抗靶A(结)/抗靶B(孔)
抗靶C(结)/抗靶D(孔)
抗靶D(结)/抗靶C(孔)
抗靶E(结)/抗靶F(孔)
下表2中提供这些实验的结果：
*N/D＝未测定
如表2中所示，当结半抗体:孔半抗体摩尔比是约或接近于1:1时，共价双特异性抗体产率％改进。将可能对每种特定双特异性抗体确定双特异性形成的最佳摩尔比。产生1:1结半抗体:孔半抗体摩尔比的结宿主细胞:孔宿主细胞比率随细胞系变动并且实验地确定。
实施例2：在生产双特异性抗体期间变动合并的细胞培养物中添加还原剂的时间和添加的还原剂的浓度
以下实施例显示在生产包含抗靶A(结)和抗靶B(孔)的双特异性抗体的不同阶段期间还原剂的添加。最初培养并诱导表达抗靶A(结)或抗靶B(孔)的两个哺乳动物细胞系以在独立的培养物中表达结半抗体或孔半抗体，所述独立的培养物随后在多个独立的生产培养物中合并以实现抗靶A(结):抗靶B(孔)的1:1摩尔比，如上文所述。将GSH储液在收获之前24小时、15小时、或4小时添加到生产培养物至终浓度2mM、4mM或10mM，或者留下培养物未处理。随后从每种生产培养物收获合并的培养基并且在还原性条件下借助反相测量每种合并的培养物的结半抗体％和孔半抗体％。确定针对每个受检比率所形成的共价双特异性抗体％，如图2中所述。
如图3中所示，与GSH终浓度为2mM或4mM的生产培养物或未处理的对照组中双特异性抗体的产率相比，在具有GSH终浓度10mM的生产培养物中共价双特异性抗体的产率提高。添加GSH的生产阶段未显示影响共价双特异性抗体的产率。
在进一步实验中、最初培养并诱导表达抗靶A(结)或抗靶B(孔)的细胞系以在独立的培养物中表达结半抗体或孔半抗体，所述独立的培养物随后在多个独立的生产培养物中合并以实现抗靶A(结):抗靶B(孔)的0.82:1摩尔比或1:1摩尔比，如上文所述。将GSH储液在收获之前15小时添加到生产培养物至终浓度5mM或10mM，或者未处理(“0mM”)。在收获时测定每种合并的细胞培养物的细胞活力并且随后借助如图2中所示的离子交换测定法测定每种测试的情况下形成的双特异性抗体％。下表3中显示实验结果。
表3
*滴度指合并的培养物中两个细胞系产生的抗体总量，例如，包括同型二聚体、异二聚体和单体半抗体。
如图表3中所示，与GSH终浓度为5mM的生产培养物或未处理的对照组中双特异性抗体的产率相比，在具有GSH终浓度10mM的生产培养物中共价双特异性抗体的产率提高。发现向合并的细胞培养物添加GSH到高达10mM的终浓度不影响细胞活力或抗体总产量。在10mM的GSH未观察到不想要的混合型二硫键形成或蛋白质杂乱(数据未显示)。
相似的实验用各自表达抗靶D(结)或抗靶C(孔)的两个其他哺乳动物细胞系进行。最初培养并诱导这两个细胞系以在独立的培养物中表达抗靶D(结)或抗靶C(孔)，所述独立的培养物随后在多个独立的生产培养物中合并以实现抗靶D(结):抗靶C(孔)的0.82:1摩尔比，如上文所述。将GSH储液在收获之前15小时添加到生产培养物至终浓度10mM、15mM或20mM，或者未处理(“0mM”)。在收获时测定每种合并的细胞培养物的细胞活力，并且随后如图2中所示那样测定每种测试的情况下形成的双特异性抗体％。下表4中显示这些实验的结果。
表4
*滴度指合并的培养物中两个细胞系产生的抗体总量，例如，包括蛋白A柱捕获的同型二聚体、异二聚体和单体半抗体。
如图表4中所示，与GSH终浓度为10mM或15mM的生产培养物或未处理的对照组中双特异性抗体的产率相比，在具有GSH终浓度20mM的生产培养物中共价双特异性抗体的产率提高。发现向合并的细胞培养物添加GSH到高达20mM的终浓度不影响滴度。然而，向生产培养物添加GSH至终浓度20mM时，观察到半抗体受GSH共价修饰(数据未显示)。
实施例3：与体外装配相比，在合并的培养基中形成的双特异性抗体的产率
使用抗靶E(结)和抗靶F(孔)进行额外的实验，以比较通过表达抗靶E的哺乳动物宿主细胞(例如，CHO细胞)和表达抗靶F的哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)的合并培养物所获得的双特异性抗体的产率与通过体外合并使用蛋白A柱纯化的抗靶E(结)和纯化的抗靶F(孔)所获得的双特异性抗体的产率。简而言之，最初培养并诱导各自表达抗靶E(结)或抗靶F(孔)的两个哺乳动物细胞系，以在独立的培养物中表达结半抗体或孔半抗体。随后将独立的培养物合并并培养额外的时间长度。收获合并的培养基，并且随后借助如图2中所示的阳离子交换测定法测定形成的双特异性抗体％。同时，通过体外合并纯化的抗靶E(结)和抗靶F(孔)形成特异性抗体(参见，例如，WO 2013/055958)。两种条件下形成的双特异性抗体的最终产率是可比较的(数据未显示)。
实施例4：双特异性产生
使用抗靶G(结)和抗靶H(孔)进行额外的实验，以检验是否可以从包含抗靶G/抗靶G同型二聚体的纯化的抗靶G半抗体的制品和包含抗靶H/抗靶H同型二聚体的纯化的抗靶H半抗体的制品中形成双特异性抗靶G/抗靶H抗体。如上文所述，培养并收获瞬时表达半抗体抗靶G(结)的哺乳动物宿主细胞(例如，CHO细胞)和瞬时表达半抗体抗靶H(孔)的哺乳动物宿主细胞(例如，CHO细胞)的单独的培养物。
随后在5mL MabSURE SELECT蛋白A柱上捕获每种半抗体。将柱随后用10个柱体积(CV)的以下缓冲洗涤：由50mM TRIS pH 8.0、150mM NaCl、0.05％Triton X-100、0.05％Triton X-114组成的平衡缓冲液，由25mM柠檬酸钠pH 6.0组成的洗涤缓冲液。将每条臂洗脱入0.15M乙酸钠pH 2.7中。通过MS证实每种半抗体的身份。
在双特异性的情况下，随后使用1:10 1M精氨酸pH 9.0独立滴定每种半抗体直至pH 5.0，并且随后按比率1:1合并在一起。随后使用1:10 1M TRIS精氨酸pH 9.0，将混合物滴定至pH 8.5并且置于室温3天，之后按照1:200摩尔比添加新鲜制备的过量0.5M还原型L-谷胱甘肽(Sigma Aldrich)。通过用于双特异性ID的质谱检查反应。
在4％-20％Tris-甘氨酸SDS PAGE上运行结捕获汇集物和孔捕获汇集物，显示在每种捕获汇集物中存在与半抗体和同型二聚体的分子量相对应的条带。参见图4。另外，在MabSURE SELECT捕获后，将0.5mg每种捕获汇集物加载于疏水性柱(2.1x 100mm)上。运行缓冲液是25mM磷酸钾、1M硫酸铵pH 6.5并且洗脱缓冲液是25mM磷酸钾pH 6.5、25％异丙醇。色谱图反映随凝胶所见的异质性，并且还揭示出主峰保留时间的差异。参见图5A和图5B，所述图分别显示抗靶G(结)和抗靶H(孔)的色谱图。捕获汇集物中同型二聚体和半抗体的量可以根据具体的抗体变动。
在谷胱甘肽处理后，还将双特异性加载于疏水性柱上。色谱图揭示了保留时间在那些半抗体各自之间的单个主峰(>90％)。参见图6。质谱证实主峰是双特异性的。这些结果表明，半抗体捕获汇集物中存在共价同型二聚体、并且利用上文所述的装配条件能够破坏同型二聚体并且这些同型二聚体可用于双特异性抗体形成。
通过比较合并的培养基中在GSH不存在与存在10mM GSH的情况下抗靶A(结)和抗靶B(孔)的装配，进一步检验双特异性装配条件。
根据制造商的推荐(Invitrogen,Carlsbad,CA)，使用脂质转染胺2000，转染CHO细胞。在多种浓度的MSX(氨基亚砜蛋氨酸)，25μM和50μM)选择已转染的细胞。通过采样来自集落的上清液并借助ELISA分析，对挑取的集落评价抗体产量。为了产生稳定的汇集物，基于ELISA滴度，将前48个克隆合并比例放大。还扩充并比例放大各个克隆以评价抗体生产力以确定最佳克隆。
接着，使用40L培养物并将细胞按1.2x 106个细胞/mL接种在2.8L培养基中。将培养物定期分割并在90转/分钟搅拌以及维持处于pH设定点7.0±0.03和30％溶解氧(dO2)。在第11天，添加15mM GSH，随后在第12天收获细胞。
未处理的和GSH处理的无细胞培养基各自经MabSURE SELECT加工并且使用ESI-TOF分析捕获汇集物。参见图7A。图7B显示双特异性抗体峰的m/z范围的放大图(如7A中显示的右峰)。图7C显示半抗体峰的m/z范围的放大图(如7A中显示的左峰)。
图7A-C显示当10mM GSH加入培养物时，同型二聚体峰丰度和半抗体峰丰度明显降低，证明双特异性形成受共培养物中半抗体和同型二聚体含量驱动。每种同型二聚体参与双特异性抗体形成的程度取决于特别的半抗体。
本领域技术人员会认识到，几种实施方案能处于本发明的范围和精神内。现在将通过参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。以下实施例进一步说明本发明，不过当然不应当解释为以任何方式限制其范围。

Claims (64)

1.制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链的第一宿主细胞；
(b)培养能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链的第二宿主细胞；并且，
(c)在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白，并且其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。
2.制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链的第一宿主细胞，其中包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体分泌；
(b)培养能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链的第二宿主细胞，其中包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体分泌；
(c)在不破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜的情况下获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基，其中合并的培养基包含第一同型二聚体和第二同型二聚体；
(d)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(e)获得异多聚体蛋白，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中获得合并的培养基包括：
(1)收获第一宿主细胞的第一培养基；
(2)收获第二宿主细胞的第二培养基；并且，
(3)合并第一培养基和第二培养基以获得合并的培养基。
4.权利要求1或权利要求2的方法，其中获得合并的培养基包括收获包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的细胞培养物的培养基。
5.权利要求4的方法，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞在合并入合并的细胞培养物前分别培养。
6.权利要求4-5中任一项的方法，还包括步骤在约25℃至约40℃的温度培养合并的细胞培养物。
7.权利要求1-6中任一项的方法，还包括搅动合并的培养基。
8.权利要求1-7中任一项的方法，还包括从合并的培养基分离异多聚体蛋白。
9.权利要求8的方法，其中使用蛋白A柱分离异多聚体蛋白。
10.权利要求3的方法，包括在收获第一和第二细胞培养基之前或之后，添加还原剂至第一细胞培养基和/或至第二细胞培养基。
11.权利要求4-10中任一项的方法，包括在收获合并的细胞培养物的培养基之前添加还原剂至合并的细胞培养物的培养基。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中在收获步骤之前约4至约24小时添加还原剂。
13.权利要求12的方法，其中在收获步骤之前约15小时添加还原剂。
14.权利要求1-13中任一项的方法，还包含添加还原剂至合并的细胞培养基。
15.权利要求14的方法，其中将含有还原剂的合并的培养基进一步孵育约4小时至约7天。
16.权利要求15的方法，其中将含有还原剂的合并的培养基进一步孵育约15小时。
17.权利要求16的方法，其中从合并的培养基分离异多聚体蛋白之前添加还原剂至合并的培养基。
18.权利要求17的方法，其中将含有还原剂的合并的培养基在分离异多聚体蛋白之前孵育至少约24小时。
19.权利要求18的方法，其中使用蛋白A柱分离异多聚体蛋白。
20.制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养能够表达第一同型二聚体的第一宿主细胞，其中第一同型二聚体包含两个第一含有铰链的多肽及其缔合的轻链；
(b)培养能够表达第二同型二聚体的第二宿主细胞，其中第二同型二聚体包含两个第二含有铰链的多肽及其缔合的轻链；
(c)获得第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养基；
(c)在足以允许异多聚体蛋白形成的还原性条件下孵育合并的培养基，并且；
(d)获得异多聚体蛋白。
21.权利要求14-20中任一项的方法，其中还原剂选自谷胱甘肽、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、半胱氨酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇、半胱氨酸二硫苏糖醇、二硫丁胺或其组合
22.权利要求21的方法，其中还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约5mM至不多于约20mM的浓度添加。
23.权利要求22的方法，其中还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约2mM至约10mM的浓度添加。
24.权利要求22的方法，其中还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约5mM至少于约20mM的浓度添加。
25.权利要求24的方法，其中还原剂是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以约15mM的浓度添加。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中第一宿主细胞是稳定细胞系。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中第二宿主细胞是稳定细胞系。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中第一宿主细胞是CHO细胞。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中第二宿主细胞是CHO细胞。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中调整第一宿主细胞和第二宿主细胞的比率，从而当第一宿主细胞培养物和第二宿主细胞培养物合并以形成合并的培养物时，第一含有铰链的多肽和第二含有铰链的多肽的摩尔比是约1:10至约10:1。
31.权利要求30的方法，其中当第一宿主细胞培养物和第二宿主细胞培养物合并以形成合并的培养物时，第一宿主细胞表达的第一含有铰链的多肽和第二宿主细胞表达的第二含有铰链的多肽的摩尔比是约1:1。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中含有铰链的多肽包含Fc区或其变体。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中第一和/或第二含有铰链的多肽包含抗体重链。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中第一异二聚化结构域在界面处包含结修饰并且第二异二聚化结构域在界面处包含孔修饰。
35.权利要求34的方法，其中结修饰包括将来自第一异二聚化结构域的原始氨基酸残基置换为侧链比原始氨基酸残基更大的氨基酸残基。
36.权利要求35的方法，其中置换用氨基酸残基选自色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和精氨酸。
37.权利要求36的方法，其中孔修饰包括将来自第二异二聚化结构域的原始氨基酸残基置换为侧链比原始氨基酸残基更小的氨基酸残基。
38.权利要求37的方法，其中置换用氨基酸残基选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。
39.权利要求34-38中任一项的方法，其中结修饰包括T366W置换(EU编号)。
40.权利要求34-39中任一项的方法，其中孔修饰包括选自T366S、L368A和Y407V(EU编号)的两个或更多个氨基酸置换。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述链间二硫键在铰链区之间。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中异多聚体蛋白是抗体。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中异多聚体蛋白是双特异性抗体。
44.权利要求43的方法，其中所述抗体是人源化抗体或人抗体。
45.权利要求44的方法，其中抗体是全长抗体。
46.权利要求45的方法，其中抗体是包含人CH2和/或CH3结构域的至少一部分的抗体片段。
47.权利要求42-46中任一项的方法，其中抗体选自IgG、IgA和IgD。
48.权利要求47的方法，其中抗体是IgG。
49.权利要求48的方法，其中抗体是IgG1、IgG2或IgG4。
50.权利要求1-49中任一项的方法，其中第一轻链和第二轻链包含不同的可变结构域序列。
51.制备异多聚体蛋白的方法，所述异多聚体蛋白包含i)具有第一异二聚化结构域的第一含有铰链的多肽，其中第一含有铰链的多肽与第一轻链缔合，和ii)具有第二异二聚化结构域的第二含有铰链的多肽，其中第二含有铰链的多肽与第二轻链缔合，其中第二异二聚化结构域在界面处与第一异二聚化结构域相互作用，并且其中第一和第二含有铰链的多肽由至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤：
(a)培养第一宿主细胞和第二宿主细胞的合并的培养物，其中第一宿主细胞能够表达第一含有铰链的多肽和第一轻链，其中第二宿主细胞能够表达第二含有铰链的多肽和第二轻链，并且其中第一宿主细胞和第二宿主细胞各自是哺乳动物细胞；
(b)添加还原剂至合并的培养物；并且
(c)在不破坏细胞膜的情况下从合并的培养物收获合并的培养基，其中合并的培养基包含异多聚体蛋白。
52.权利要求51的方法，其中第一宿主细胞分泌包含两个第一含有铰链的多肽和两条第一轻链的第一同型二聚体，其中第二宿主细胞分泌包含两个第二含有铰链的多肽和两条第二轻链的第二同型二聚体。
53.权利要求51或权利要求52的方法，其中在添加还原剂后4小时至24小时收获合并的培养基。
54.权利要求51-53中任一项的方法，其中收获合并的培养基的步骤包括从合并的培养基移除第一宿主细胞和第二宿主细胞。
55.权利要求51-54中任一项的方法，其中将合并的培养基孵育4小时至7天。
56.异多聚体蛋白，其通过权利要求1-55中任一项的方法产生。
57.权利要求56的异多聚体蛋白，其中异多聚体蛋白是双特异性抗体。
58.组合物，包含权利要求56或权利要求57的异多聚体蛋白和可药用载体。
59.宿主细胞，包含多核苷酸或重组载体，所述多核苷酸或重组载体编码权利要求56或57的异多聚体蛋白的第一含有铰链的多肽，其中宿主细胞不表达异多聚体蛋白的第二含有铰链的多肽。
60.权利要求59的宿主细胞，其中含有铰链的多肽是抗体重链。
61.权利要求59或60的宿主细胞，其中含有铰链的多肽与抗体轻链配对。
62.权利要求59-61中任一项的宿主细胞，其中宿主细胞是稳定细胞系。
63.权利要求59-62中任一项的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。
64.权利要求59-63的宿主细胞，其中宿主细胞是CHO细胞。
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