KR102603417B1 - 포유동물 세포를 사용한 이종다량체 단백질의 생산 - Google Patents

포유동물 세포를 사용한 이종다량체 단백질의 생산 Download PDF

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Abstract

1종 초과의 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 다른 다량체 단백질 복합체 (본원에서 총괄적으로 이종다량체 단백질로 지칭함)의 효율적 생산 방법이 본원에 기재된다. 표적은, 예를 들어 단일 분자 상에 위치하거나 또는 상이한 분자 상에 위치한 상이한 에피토프일 수 있다.

Description

포유동물 세포를 사용한 이종다량체 단백질의 생산 {PRODUCTION OF HETEROMULTIMERIC PROTEINS USING MAMMALIAN CELLS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 5월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/989,509의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 이종다량체 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
IgG 유형의 모노클로날 항체는 2개의 동일한 항원-결합 아암 및 불변 도메인 (Fc)을 함유한다. 그의 결합 아암에서 다양한 특이성을 갖는 항체는 통상적으로 자연에서 발생하지 않으며, 따라서 화학 공학 (예를 들어, 화학적 가교 등), 재조합 DNA 및/또는 세포-융합 기술의 도움으로 정교하게 만들어져야 한다.
이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있다. 이러한 특성은 통상적인 모노클로날 항체로는 가능하지 않은 치료 전략의 개발을 가능하게 한다. 개발된 창의적인 이중특이적 항체 포맷의 큰 패널은 이들 분자에 대한 강한 관심을 반영한다. 문헌 [Berg J, Lotscher E, Steimer KS, et al., "Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain," Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88(11): 4723-4727 및 Fischer N and Leger O., "Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies," Pathobiology (2007) 74:3-14]을 참조한다.
다중특이적 분자의 또 다른 부류는 재조합 융합 단백질이다. 면역조절 단백질의 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 (Ig)의 불변 (Fc) 도메인으로 이루어진 재조합 융합 단백질은 성장하고 있는 인간 치료제의 부류를 나타낸다. 이뮤노어드헤신은 단백질 서열의 결합 영역을 항체의 이펙터 도메인과 목적하는 특이성으로 조합한다. 이뮤노어드헤신은 치료제로서의 그의 잠재력에 유의한 2가지 중요한 특성을 갖는다: 표적 특이성 및 약동학적 안정성 (항체와 대등한 생체내 반감기). 이뮤노어드헤신은 해로운 상호작용을 억제하거나 차단하기 위한 길항제로서, 또는 생리학적 반응을 모방하거나 증진시키기 위한 효능제로서 사용될 수 있다. 문헌 [Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, et al., "A humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells," J Hematother 1995; 4(5): 439-446]을 참조한다.
다른 다중특이적 분자가 다른 곳에서 논의된 바 있다. 그 예는 문헌 [Fisher et al., Pathobiology (2007) 74:3-14] (다양한 이중특이적 포맷의 검토); 2003년 12월 9일에 허여된 미국 특허 번호 6,660,843 (Feige et al.) (펩티바디); 2002년 1월 10일에 공개된 미국 특허 공개 번호 2002-004587 (다중특이적 항체); 2009년 11월 3일에 허여된 미국 특허 번호 7612181 (Wu et al.) (이중 가변 도메인 포맷); 미국 특허 번호 6,534,628, 문헌 [Nord K et al., Prot Eng (1995) 8:601-608, Nord K et al., Nat Biotech (1997) 15:772-777, 및 Groenwall et al., Biotechnol Appl Biochem. (2008) Jun;50(Pt 2):97-112] (아피바디); 문헌 [Martens et al., Clin Cancer Res (2006), 12: 6144-6152 및 Jin et al., Cancer Res (2008) 68(11):4360-4368] (1개 아암 항체); 문헌 [Bostrom et al., Science (2009) 323:1610-1614] (이중 작용 Fab, 일명 혼합 원자가 항체)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 포맷이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
임상 등급 물질의 제조는 상기 기재된 다중특이적 분자에 대한 과제로 남아 있다. 상기 기재된 바와 같이, 혼합 결합 아암, 즉 서로 동일하지 않은 결합 아암을 갖는 분자의 생산을 위한 많은 경로가 존재한다. 이들 방법은 각각 그의 결점을 갖는다.
화학적 가교는, 관련 종이 동종이량체 및 다른 목적하지 않은 부산물로부터 여전히 정제될 필요가 있을 수 있기 때문에 노동 집약적이다. 또한, 화학적 변형 단계는 단백질의 완전성을 변경시켜 불량한 안정성으로 이어질 수 있다. 따라서, 이 방법은 종종 비효율적이고, 항체 활성의 손실로 이어질 수 있다.
세포-융합 기술 (예를 들어, 하이브리드 하이브리도마)은 무작위로 어셈블리되는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 발현하고, 이는 10가지의 항체 조합의 생성으로 이어진다. 목적하는 이종다량체 항체는 단지 이에 따라 생산된 항체의 작은 분획이다. 목적하는 이종다량체 단백질의 정제는 생산 수율을 상당히 감소시키고, 제조 비용을 증가시킨다.
재조합 DNA 기술은 Fc 도메인을 포함하지 않는 다양한 이종다량체 포맷, 예를 들어 단일 쇄 Fv, 디아바디 등을 생성하는데 사용되어 왔다. 이러한 유형의 항체 분자에 대한 주요 결점은 Fc 도메인의 결여, 및 이에 따른 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 활성화, Fc-수용체 결합 등)을 촉발하는 항체의 능력의 결여이다. 따라서, 기능적 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체가 바람직하다.
재조합 DNA 기술은 또한 '노브 인투 홀' 이중특이적 항체를 생성하는데 사용되어 왔다. 미국 특허 출원 20030078385 (Arathoon et al. - 제넨테크(Genentech))를 참조한다. 이 전략의 한가지 제약은 2개의 모 항체의 경쇄가, 동일한 세포에서의 발현으로 인한 쌍형성오류 및 목적하지 않고/거나 불활성인 분자의 형성을 방지하기 위해 동일해야 한다는 것이다.
따라서, 이종다량체 단백질을 생산하는 대안적 방법에 대한 필요성이 남아있다. 본원에 기재된 본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 본 발명의 이들 및 다른 측면 및 이점은 본원에 제공된 발명의 설명으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 관련 기술분야에 공지된 방법을 넘어서는, 포유동물 세포에서 다중특이적 이뮤노글로불린 복합체 (예를 들어, 다중특이적 항체) 및 다른 다량체 단백질 (총괄적으로 본원에서 이종다량체 단백질로 지칭함)을 생산하는 효율적이고 신규한 방법을 제공한다. WO2013/055958 및 WO2011/133886을 참조한다.
따라서, 제1 측면에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; 및,
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하고, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 수득된다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
또한, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 배합된 배양 배지를 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(e) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 힌지 함유 폴리펩티드는 제1 및 제2 중쇄를 구성한다. 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄는 제1 절반 항체를 구성한다. 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄는 제2 절반 항체를 구성한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지를 수득하는 단계는
(1) 제1 숙주 세포 배양에 대한 제1 배양 배지를 수거하는 단계;
(2) 제2 숙주 세포 배양에 대한 제2 배양 배지를 수거하는 단계; 및,
(3) 제1 배양 배지 및 제2 배양 배지를 배합하여 배합된 배양 배지를 수득하는 단계
를 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지를 수득하는 단계는 제1 숙주 세포 및 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 수득된다.
본 발명의 방법에서 제1 및 제2 숙주 세포는 관심 폴리펩티드의 발현 및 단리를 허용하는 임의의 설정으로 배양될 수 있다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 배합된 세포 배양물로의 배합 전에 개별적으로 배양된다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 세포 배양물을 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 배합된 배양 배지를 수득한 후 약 24시간 내지 약 7일 동안 인큐베이션된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 약 4℃ 내지 약 8℃에서 인큐베이션된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 교반된다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지로부터 이종다량체 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 단백질 A 칼럼을 사용하여 단리된다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 추가로 정제된다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 방법은 제1 및 제2 세포 배양 배지를 수거하기 전 또는 후에 제1 세포 배양 배지 및/또는 제2 세포 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하기 전에 배합된 세포 배양물의 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 수거 단계의 약 4 내지 약 24, 약 5 내지 약 20, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 15, 또는 약 15 내지 약 18시간 전에 첨가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 수거 단계의 약 15시간 전에 첨가된다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 세포 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제를 함유하는 배합된 배양 배지는 약 4시간 내지 약 7일 동안 추가로 인큐베이션된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제를 함유하는 배합된 배양 배지는 약 15시간 동안 추가로 인큐베이션된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 배합된 배양 배지로부터 이종다량체 단백질을 단리하기 전에 배합된 배양 배지에 첨가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제를 함유하는 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 단리하기 전 적어도 약 24시간 동안 인큐베이션된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제를 함유하는 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 단리하기 전 적어도 약 48시간 동안 인큐베이션된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 단백질 A 칼럼을 사용하여 단리된다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 글루타티온, 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토에틸아민, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 시스테인, 시스테인, 디티오트레이톨, 시스테인디티오트레이톨, 디티올부틸아민 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 글루타티온이고, 글루타티온은 약 5 mM 내지 약 20 mM 이하의 농도로 첨가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 글루타티온이고, 글루타티온은 약 2 mM 내지 약 10 mM의 농도로 첨가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 글루타티온이고, 글루타티온은 약 5mM 내지 약 20mM 미만의 농도로 첨가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 글루타티온이고, 글루타티온은 약 15 mM의 농도로 첨가된다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 안정한 세포주이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제2 숙주 세포는 안정한 세포주이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 CHO 세포이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제2 숙주 세포는 CHO 세포이다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포의 비는, 제1 숙주 세포 배양물 및 제2 숙주 세포 배양물을 배합하여 배합된 배양물을 형성한 경우에, 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 몰비가 약 1:10 내지 약 10:1이 되도록 조정된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포에 의해 발현된 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 숙주 세포에 의해 발현된 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 몰비는, 숙주 세포 배양물 및 제2 숙주 세포 배양물을 배합하여 배합된 배양물을 형성한 경우에, 1:1이다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 Fc 영역 또는 그의 변이체를 구성한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 항체 중쇄를 구성한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 이종이량체화 도메인은 계면에서 노브 변형을 포함하고, 제2 이종이량체화 도메인은 계면에서 홀 변형을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 노브 변형은 제1 이종이량체화 도메인으로부터의 원래 아미노산 잔기를 원래 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 치환 아미노산 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 홀 변형은 제2 이종이량체화 도메인으로부터의 원래 아미노산 잔기를 원래 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 치환 아미노산 잔기는 세린, 트레오닌, 발린 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 노브 변형은 T366W 치환 (EU 넘버링)을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 홀 변형은 T366S, L368A 및 Y407V (EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 상기 쇄간 디술피드 결합은 힌지 영역 사이에 있다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 항체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 이중특이적 항체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 상기 항체는 인간화 또는 인간 항체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 항체는 인간 CH2 및/또는 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함하는 항체 단편이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 항체는 IgG, IgA 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 항체는 IgG이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 상이한 가변 도메인 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
a) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포의 배합된 배양물을 배양하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포는 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 제2 숙주 세포는 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계;
(b) 배합된 배양물에 환원제를 첨가하는 단계; 및
(c) 세포 막을 파괴하지 않으면서 배합된 배양물로부터 배합된 배양 배지를 수거하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하는 것인 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체를 분비하고, 제2 숙주 세포는 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체를 분비하고, 배합된 배양물은 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양물에 환원제를 첨가하는 것은 이종다량체 단백질의 형성을 가능하게 한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 환원제는 배합된 배양물이 약 18일 이하 동안 배양된 후에 첨가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 환원제가 첨가되고 4시간 내지 24시간 후에 수거된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지를 수거하는 단계는 배합된 배양 배지로부터 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 4시간 내지 7일 동안 인큐베이션된다.
특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양물 내의 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포의 세포:세포 비를 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포:세포 비는 배합된 배양물 내 제1 숙주 세포로부터 발현된 제1 힌지 함유 폴리펩티드 (회합된 경쇄 포함) 대 제2 숙주 세포로부터 발현된 제2 힌지-함유 폴리펩티드 (회합된 경쇄 포함)의 몰비가 목적하는 몰비에 이르도록 조정된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 안정한 세포주이다. 특정 실시양태에서, 안정한 세포주는 힌지-함유 폴리펩티드 및 경쇄를 발현할 수 있는 핵산 분자(들)에 의해 안정적으로 형질감염된다.
본 발명의 방법이 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 포괄되는 과정을 개시하고/거나 완료하는데 명백한 상용 단계인 다른 단계를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)에 앞서 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제1 숙주 세포에 도입하고 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제2 숙주 세포에 도입하는 단계가 선행한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 2종의 별개의 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 이종다량체 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄 (또는 그의 회합된 경쇄)는 제1 표적에 대한 제1 결합 도메인을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄 (또는 그의 회합된 경쇄)는 제2 표적에 대한 제2 결합 도메인을 포함한다. 제1 및 제2 표적은 단일 분자 상에 위치하거나 또는 상이한 분자 상에 위치한 상이한 에피토프일 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 이종다량체 단백질이 제공된다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 이중특이적 항체이다. 또한, 상기 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 이종다량체 단백질 (예컨대 이중특이적 항체) 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 이종다량체 단백질은 일반적으로 항원에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 항원은 예를 들어 종양 항원, 세포 생존 조절 인자, 세포 증식 조절 인자, 조직 발생 또는 분화와 연관된 (예를 들어, 그에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되어 있거나 추측되는) 분자, 세포 표면 분자, 림포카인, 시토카인, 세포 주기 조절에 관여하는 분자, 혈관생성에 관여하는 분자 및 혈관신생과 연관된 (예를 들어, 그에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되어 있거나 추측되는) 분자를 포함한다. 본 발명의 이종다량체 단백질이 결합할 수 있는 항원은 상기 언급된 카테고리 중 하나의 하위세트의 구성원일 수 있으며, 여기서 상기 카테고리의 다른 하위세트(들)는 (관심 항원에 관하여) 별개의 특성을 갖는 다른 분자/항원을 포함한다. 관심 항원은 또한 2종 이상의 카테고리에 속하는 것으로 여겨질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 세포 표면 분자가 아닌 종양 항원에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 이종다량체 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 종양 항원은 세포 표면 분자, 예컨대 수용체 폴리펩티드이다. 또 다른 예에서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 클러스터 분화 인자가 아닌 종양 항원에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 클러스터 분화 인자에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있고, 일부 실시양태에서 이는 예를 들어 CD3 또는 CD4가 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 항-VEGF 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 IL-1알파/IL-1베타, IL-12/IL-18; IL-13/IL-9; IL-13/IL-4; IL-13/IL-5; IL-5/IL-4; IL-13/IL-l베타; IL-13/IL-25; IL-13/TARC; IL-13/MDC; IL-13/MEF; IL-13/TGF-β; IL-13/LHR 효능제; IL-12/TWEAK, IL-13/CL25; IL-13/SPRR2a; IL-13/SPRR2b; IL-13/ADAM8, IL-13/PED2, IL17A/IL17F, CD3/CD19, CD138/CD20; CD138/CD40; CD19/CD20; CD20/CD3; CD38/CD138; CD38/CD20; CD38/CD40; CD40/CD20; CD-8/IL-6; CD20/BR3, TNF알파/TGF-베타, TNF알파/IL-1베타; TNF알파/IL-2, TNF 알파/IL-3, TNF알파/IL-4, TNF알파/IL-5, TNF알파/IL6, TNF알파/IL8, TNF알파/IL-9, TNF알파/IL-10, TNF알파/IL-11, TNF알파/IL-12, TNF알파/IL-13, TNF알파/IL-14, TNF알파/IL-15, TNF알파/IL-16, TNF알파/IL-17, TNF알파/IL-18, TNF알파/IL-19, TNF알파/IL-20, TNF알파/IL-23, TNF알파/IFN알파, TNF알파/CD4, TNF알파/VEGF, TNF알파/MIF, TNF알파/ICAM-1, TNF알파/PGE4, TNF알파/PEG2, TNF알파/RANK 리간드, TNF알파/Te38; TNF알파/BAFF; TNF알파/CD22; TNF알파/CTLA-4; TNF알파/GP130; TNFα/IL-12p40; VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, HER2/DR5,VEGF/IL-8, VEGF/MET, VEGFR/MET 수용체, VEGFR/EGFR, HER2/CD64, HER2/CD3, HER2/CD16, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R, TNFR1/IL-18R, EpCAM/CD3, MAPG/CD28, EGFR/CD64, CSPGs/RGM A; CTLA-4/BTNO2; IGF1/IGF2; IGF1/2/Erb2B; MAG/RGM A; NgR/RGM A; NogoA/RGM A; OMGp/RGM A; PDL-I/CTLA-4; 및 RGM A/RGM B, IL1β/IL18, NRP1/VEGFA, VEGFA/NRP2, cMET/EGFR, ALK1/BMP9, VEGFA/α5β1, HER1/HER3-BU, 및 CMV로 이루어진 군으로부터 선택된 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 α5β1, ALK1, BMP9, IL-1알파, IL-1베타, TARC, MDC, MEF, TGF-β, LHR 효능제, TWEAK, CL25, SPRR2a, SPRR2b, ADAM8, PED2, CD3, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD28, CD40, CD38, CD64, CD138, CD-8, BR3, TNF알파, TGF-베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-23, IL-25, IFN알파, MIF, ICAM-1, PGE4, PEG2, RANK 리간드, Te38, BAFF, CTLA-4, GP130, IL-12p40, VEGF, VEGF-A, PDGF, HER1, HER2, HER3, HER3-BU, HER4, VEGF-C, VEGF-D, DR5, cMET, MET, MET 수용체, VEGFR, EGFR, CD40L, TNFR1, IL-1R, IL-6R, IL-18R, EpCAM, MAPG, CSPGs, BTNO2, IGF1, IGF2, IGF1/2, Erb2B, MAG, NgR, NogoA, NRP1, NRP2, OMGp, PDL-I, RGM A 및 RGM B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 표적 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 CD3, 및 BLR1, BR3, CD19, CD20, CD22, CD72, CD79A, CD79B, CD180 (RP105), CR2, FcRH1, FcRH2, FcRH5, FCER2, FCRL4, HLA-DOB, 및 NAG14로부터 선택된 적어도 1개의 추가의 표적 분자에 결합한다.
이종다량체 단백질은 추가의 목적하는 특징을 증진시키고/거나 부가하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 특징은 생물학적 기능, 예컨대 면역 이펙터 기능, 바람직한 생체내 반감기/클리어런스, 생체이용률, 생체분포 또는 다른 약동학적 특징을 포함한다. 이러한 변형은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 또한 실험적으로 결정될 수 있고, 펩티드-기반일 수 있거나 아닐 수 있는 모이어티에 의한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는, 일반적으로 적어도 부분적으로는 숙주 세포의 속성에 따라, 글리코실화 또는 비-글리코실화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 비-글리코실화된다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 비-글리코실화 항체는, 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 시험관내 글리코실화 방법을 사용하여 후속적으로 글리코실화될 수 있다. 상기 및 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 이종다량체 단백질은 원핵 세포, 예컨대 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)에서 생산될 수 있다. 이. 콜라이-생산 이종다량체 단백질은 일반적으로 비-글리코실화되고, 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO) 생산 이종다량체 단백질에서 발견되는 글리코실화 프로파일과 정상적으로 연관된 생물학적 기능이 결여된다.
본 발명은 또한 이종 모이어티와 접합된 본 발명의 이종다량체 단백질을 포함하는 면역접합체를 제공한다. 임의의 이종 모이어티가, 항체에 대한 그의 접합이 항체의 목적하는 기능 및/또는 특징을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 적합할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 면역접합체는 세포독성제인 이종 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포독성제는 방사성 동위원소, 화학요법제 및 독소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 독소는 칼리케미신, 메이탄신 및 트리코텐으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 검출가능한 마커인 이종 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 검출가능한 마커는 방사성 동위원소, 리간드-수용체 쌍의 구성원, 효소-기질 쌍의 구성원 및 형광 공명 에너지 전달 쌍의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 이종다량체 단백질의 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 이종다량체 단백질의 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 발현하지 않는다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 항체 중쇄이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 항체 경쇄와 쌍형성한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 안정한 세포주이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 (또는 그에 적용되는 바와 같은) 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 다른 목적, 특색 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명과 구체적 예가 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 단지 예시적으로 주어지는 것으로 이해되어야 하며, 이는 본 발명의 범주 및 취지 내의 다양한 변화 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이기 때문이다.
본원에 인용되는 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
도 1a는 완전히 산화된 절반 항체를 예시한다. "노브" 또는 "홀" 또는 다른 이종이량체화 도메인은 나타내지 않았다. 본 도면에 도시된 절반 항체는 IgG1 이소형이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 이뮤노글로불린 이소형이 상응하는 쇄간 및 쇄내 결합을 갖는 절반 항체로서 고려될 수 있음을 인식할 것이다. 무손상 Ab에서, 힌지 시스테인은 쇄간 디술피드 결합을 형성할 것이다.
도 1b는 전장 이중특이적 항체를 예시한다. 힌지 영역의 중쇄간 디술피드 결합은 도시하지 않았다.
도 2는 % 절반 항체 및 % 공유 이중특이적 항체를 결정하는데 사용될 수 있는 2개의 검정에 대한 흐름도를 보여준다.
도 3은 항-표적 A (노브)를 발현하는 제1 포유동물 숙주 세포 및 항-표적 B (홀)를 발현하는 제2 포유동물 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물에 배합된 배양 배지 수거의 4시간, 15시간, 또는 24시간 전에 환원제를 첨가한 경우에, 형성된 % 이중특이적 항체를 보여준다.
도 4는 4-20% 트리스-글리신 SDS PAGE 상에서 전개시킨 노브 및 홀 포획 풀을 보여준다.
도 5a는 항-표적 G에 대한 소수성에 기초하여 분리된 샘플의 크로마토그램을 보여주며, 여기서 동종이량체 및 절반 항체는 1개의 넓은 피크로 공동-용리된다. 도 5b는 항-표적 H에 대한 소수성에 기초하여 분리된 샘플의 크로마토그램을 보여준다.
도 6은 항-표적 G/항-표적 H 이중특이적 항체에 대한 질량 분광측정법의 결과를 보여준다.
도 7a는 항-표적 A 및 항-표적 B 절반 항체가 분비된 비처리 및 GSH-처리 배합된 배양 배지에 대해 수행된 전기분무 이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (ESI-TOF MS) 실험의 결과를 보여준다. 도 7b는 이중특이적 항체 피크의 m/z 범위의 확대를 보여준다. 도 7c는 절반 항체 피크의 m/z 범위의 확대를 보여준다.
약어
ADCC = 항체-의존성 세포-매개 세포독성
API = 항-병원체 이뮤노어드헤신
BPI = 살박테리아/투과성-증가 단백질
C1q = 보체 인자 1q
CD = 분화 클러스터
CDC = 보체-의존성 세포독성
CH1 또는 CH1 = 중쇄 제1 불변 도메인
CH2 또는 CH2 = 중쇄 제2 불변 도메인
CH3 또는 CH3 = 중쇄 제3 불변 도메인
CH4 또는 CH4 = 중쇄 제4 불변 도메인
CL 또는 CL = 경쇄 불변 도메인
CTLA = 세포독성 T 림프구-연관 분자
Fc = 결정화가능 단편
FcγR = IgG의 Fc 부분에 대한 수용체 감마
HIV = 인간 면역결핍 바이러스
ICAM = 세포간 부착 분자
BsAb = 이중특이적 항체
BsDb = 이중특이적 디아바디
dsFv = 디술피드-안정화 Fv
Fc = 항체의 불변 단편
Fd = 항체의 VH+CH1
FcR = Fc 수용체
Fv = 항체의 가변 단편
IgG = 이뮤노글로불린 G
mAb = 모노클로날 항체
PBL = 말초 혈액 림프구
scDb = 단일-쇄 디아바디
scFv = 단일-쇄 Fv
(scFv)2 = scFv-scFv 탠덤
Tandab = 탠덤 디아바디
VH 또는 VH= 항체의 중쇄의 가변 도메인
VL 또는 VL = 항체의 경쇄의 가변 도메인
상세한 설명
본 발명을 이제 단지 참조로 하기 정의 및 예를 사용하여 상세하게 기재할 것이다. 본원에 언급된 모든 특허 및 공개 (이러한 특허 및 공개에 개시되어 있는 모든 서열 포함)는 명백하게 참조로 포함된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)]은 통상의 기술자에게 본 발명에서 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 제공한다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 각각, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재되고; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 기재된다. 진료의는 관련 기술분야의 정의 및 용어에 대해 특히 문헌 [Sambrook et al., 1989, 및 Ausubel FM et al., 1993]에 집중한다. 본 발명이 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지는 않으며, 이는 이들이 달라질 수 있기 때문인 것으로 이해되어야 한다.
수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 각각, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재되고; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 기재된다.
본원에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서를 참조할 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태를 제한하지 않는다. 따라서, 바로 다음에 정의되는 용어들은 전체로서 본 명세서를 참조하여 보다 상세하게 정의된다.
I. 정의
"이종다량체", "이종다량체 복합체", 또는 "이종다량체 단백질"은 제1 이종이량체화 도메인을 갖고 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 제2 이종이량체화 도메인을 갖고 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭하며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결된다. 이종다량체는 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 제1 경쇄, 제2 힌지-함유 폴리펩티드, 및 제2 경쇄에 의해 형성된 "이종이량체"를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종다량체는 예를 들어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 이종다량체의 폴리펩티드는 비-펩티드성 공유 결합 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 비-공유 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘 및/또는 소수성 상호작용)에 의해 서로 상호작용할 수 있다.
본원에 사용된 "이종다량체화 도메인"은 이종다량체 형성을 촉진하고 동종다량체 형성을 방해하기 위한, 생물학적 분자에 대한 변경 또는 부가를 지칭한다. 동종이량체보다 이종이량체를 형성하는 것에 대해 강한 선호도를 갖는 임의의 이종이량체화 도메인은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 예시적인 예는, 예를 들어 미국 특허 출원 20030078385 (Arathoon et al. - 제넨테크; 노브 인투 홀을 기재함); WO2007147901 (Kjaergaard et al. - 노보 노르디스크(Novo Nordisk): 이온 상호작용을 기재함); WO 2009089004 (Kannan et al. - 암젠(Amgen): 정전기적 스티어링 효과를 기재함); WO2011/034605 (Christensen et al. - 제넨테크; 코일드 코일을 기재함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 예를 들어 류신 지퍼를 기재하는 문헌 [Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)] 또는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 기재하는 문헌 [Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993)]을 참조한다. 어구 "이종다량체화 도메인" 및 "이종이량체화 도메인"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 어구 "힌지-함유 폴리펩티드"는 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같은 이뮤노글로불린의 힌지 영역, 예를 들어 중쇄의 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역에 상응하는 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 사용된 "힌지 영역," "힌지 서열", 및 그의 변형은 관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 문헌 [Janeway's Immunobiology, (Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, NY) (7th ed., 2008); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202]에 예시된 의미를 포함한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985) 및 Papadea, C. and I. J. Check (1989) "Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses: biochemical, genetic, and clinical aspects." Crit Rev Clin Lab Sci 27(1): 27-58]을 참조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 쇄간 디술피드 결합 형성에 이용가능한 아미노산의 수 뿐만 아니라 시스테인 잔기의 수가 이뮤노글로불린의 부류 및 이소형 사이에 달라진다는 것을 인식할 것이다. 모든 이러한 힌지 영역은 힌지-함유 폴리펩티드에 존재할 수 있고, 본 발명의 범주 내에 포함된다. 특정 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 제1 항체 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 중쇄는 제1 경쇄와 회합되어 제1 절반 항체를 형성한다. 본원의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 임의의 이뮤노글로불린 (Ig) 분자, 및 목적하는 생물학적 활성 (예를 들어, 에피토프 결합 활성)을 나타내는 한 그의 임의의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다. 항체의 예는 본원에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
참조 프레임으로서 본원에 사용된 항체는 이뮤노글로불린 G (IgG)의 구조를 지칭할 것이다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 이뮤노글로불린 부류의 항체가 본원에 기재된 본 발명의 방법에 사용될 수 있음을 이해/인지할 것이다. 명료성을 위해, IgG 분자는 동일한 중쇄 (HC)의 쌍 및 동일한 경쇄 (LC)의 쌍을 함유한다. 각각의 LC는 1개의 가변 도메인 (VL) 및 1개의 불변 도메인 (CL)을 갖는 한편, 각각의 HC는 1개의 가변 (VH) 및 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. CH1 및 CH2 도메인은 힌지 영역에 의해 연결된다. 이 구조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 도 1b를 참조한다.
본원에 사용된, "절반 항체"는 1개의 이뮤노글로불린 경쇄와 회합된 1개의 이뮤노글로불린 중쇄를 지칭한다. 예시적인 절반 항체는 도 1a에 도시된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 절반 항체가 또한 단일 가변 도메인으로 이루어진 항원 결합 도메인을 가질 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
용어 "맥시바디"는 Fc 폴리펩티드에 융합된 scFv를 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. WO 2009089004의 도 8a를 참조한다. 이중특이적 맥시바디에 대해서는 WO 2009089004의 도 2를 참조한다.
용어 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 EU 넘버링 시스템에 따라 통상적으로 IgG의 약 잔기 231로부터 약 340까지 연장된다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 근접하게 쌍형성하지 않는다는 점에서 고유하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대안을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추측되어 왔다. 문헌 [Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)].
용어 "CH3 도메인"은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 스트레치 (즉, EU 넘버링 시스템에 따라 IgG의 약 아미노산 잔기 341로부터 약 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 폴리펩티드 서열을 포함하는 이량체 복합체를 지칭하며, 여기서 C-말단 폴리펩티드 서열은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 수득가능한 것이다. Fc 영역은 천연 또는 변이체 Fc 서열을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 서열의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 서열은 통상적으로 약 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 약 위치 Pro230으로부터 Fc 서열의 카르복실 말단까지의 스트레치로 정의된다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 이뮤노글로불린의 Fc 서열은 일반적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 2개의 불변 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 본원에서 "Fc 폴리펩티드"는 Fc 영역, 예를 들어 단량체 Fc를 구성하는 폴리펩티드 중 하나를 의미한다. Fc 폴리펩티드는 임의의 적합한 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. Fc 영역은 디술피드에 의해 함께 유지되는 H 쇄 둘 다의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고; 이 영역은 또한 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다. 일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 야생형 힌지 서열의 일부 또는 전부를 (일반적으로 그의 N 말단에서) 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 기능적 또는 야생형 힌지 서열을 포함하지 않는다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원의 정의에서 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형, 바람직하게는 1개 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 그것과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성을 보유할 것이고, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 상동성을 보유할 것이다.
본원에 사용된 "Fc 성분"은 Fc 영역의 힌지 영역, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는, 바람직하게는 야생형 인간 IgG Fc 영역으로부터 유래된, IgG Fc 영역을 포함한다. "야생형" 인간 IgG Fc는 인간 집단 내에서 자연적으로 발생하는 아미노산의 서열을 의미한다. 물론, Fc 서열이 개체 사이에서 약간 달라질 수 있듯이, 야생형 서열에 대해 1개 이상의 변경이 이루어질 수 있고, 이는 여전히 본 발명의 범주 내에 남아있다. 예를 들어, Fc 영역은 본 발명과 관련되지 않은 추가의 변경, 예컨대 글리코실화 부위의 돌연변이 또는 비천연 아미노산의 포함을 함유할 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "Fab"는 항체의 항원-결합 단편을 지칭한다. 상기 기재된 바와 같이, 파파인은 무손상 항체를 소화시키는데 사용될 수 있다. 항체의 파파인 소화는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 즉 "Fab" 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (즉, 상기 Fc 영역)을 생산한다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (VH) 및 1개의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다.
본원에 사용된 어구 "항원 결합 아암", "표적 분자 결합 아암", "표적 결합 아암" 및 그의 변형은 관심 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 본 발명의 이종다량체 단백질의 구성 부분을 지칭한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 항원 결합 아암은 이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열, 예를 들어 CDR 및/또는 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 서열의 복합체이다.
"표적" 또는 "표적 분자"는 이종다량체 단백질의 결합 아암에 의해 인식되는 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 이종다량체 단백질이 항체인 경우에, 표적은 문맥에 따라 단일 분자 상의 또는 상이한 분자 상의 에피토프, 또는 병원체 또는 종양 세포일 수 있다. 유사하게, 이종다량체 단백질이 수용체-Fc 융합 단백질인 경우에, 표적은 수용체에 대한 동족 결합 파트너일 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 표적이 표적 결합 아암의 결합 특이성에 의해 결정되고, 상이한 표적 결합 아암이 상이한 표적을 인식할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 표적은 바람직하게는 (스캐차드 분석에 따라) 1uM Kd보다 높은 친화도로 본 발명의 이종다량체 단백질에 결합한다. 표적 분자의 예는 혈청 가용성 단백질 및/또는 그의 수용체, 예컨대 시토카인 및/또는 시토카인 수용체, 어드헤신, 성장 인자 및/또는 그의 수용체, 호르몬, 바이러스 입자 (예를 들어, RSV F 단백질, CMV, StaphA, 인플루엔자, C형 간염 바이러스), 미생물 (예를 들어, 박테리아 세포 단백질, 진균 세포), 어드헤신, CD 단백질 및 그의 수용체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"무손상" 또는 "전장" 항체의 한 예는 항원-결합 아암 뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "커플링"은 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 서로 연결시키는데, 예를 들어 공유 결합의 형성에 필요한 단계를 지칭한다. 이러한 단계는 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 시스테인 잔기를 환원, 어닐링 및/또는 산화시켜 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 것을 포함한다. 커플링은 화학적 가교에 의해, 또는 산화환원 시스템의 사용에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1998) 217:1-10 및 Zhu et al., Cancer Lett., (1994) 86: 127-134]을 참조한다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포괄한다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 단위가 폴리에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디, 공유 또는 비공유 연결된 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 단지 1개의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다. 이중특이적 항체의 예시적 도면이 도 1b에 제공된다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디 (Db); 탠덤 디아바디 (taDb); 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]); 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3 및 (scFV)4-Fc를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함한다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 다시 말해서, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없다. 단일 도메인 항체는 각각의 항원 결합 아암 상의 단일 단량체 가변 항체 도메인 (VH 또는 VL)으로 이루어진다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로부터 유래된 것을 포함한다 (문헌 [Ward et al., Nature (1989) 341:544-546; Dooley and Flajnik, Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Muyldermans et al., Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Holt et al., Trends Biotechnol (2003):21:484-490]; WO 2005/035572; WO 03/035694; 문헌 [Davies and Riechmann, Febs Lett (1994) 339:285-290]; WO00/29004; WO 02/051870). 단일 가변 도메인 항체는 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 항원 결합 아암 (예를 들어, 동종- 또는 이종-다량체)에 존재할 수 있고, 그러한 경우에 이는 단일 도메인 항체가 아니다.
표현 "선형 항체"는 일반적으로 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에 언급된 용어 "노브-인투-홀" 또는 "KnH" 기술은 돌출부 (노브)를 하나의 폴리펩티드 내로 및 함몰부 (홀)를 다른 폴리펩티드 내로 이들이 상호작용하는 계면에서 도입함으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 함께 2개의 폴리펩티드의 쌍형성을 지시하는 기술을 지칭한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 계면, CL:CH1 계면 또는 VH/VL 계면에 도입된다 (예를 들어, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 및 문헌 [Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788]). 이는 다중특이적 항체의 제조 동안 2개의 상이한 중쇄를 함께 쌍형성하도록 유도하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 그의 Fc 영역에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각각의 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 유사하거나 상이한 경쇄 가변 도메인과 쌍형성하는 상이한 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. KnH 기술은 또한 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인이 함께, 또는 상이한 표적 인식 서열을 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 아피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합체 포함)이 쌍형성하도록 하는데 사용될 수 있다.
"Fv"는 치밀한 비-공유 회합 상태의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인의 폴딩으로부터 6개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 발생하고, 이는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에게 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 종종 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이기는 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일-쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성하게 하는 폴리펩티드 링커를 VH 및 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 쇄내 쌍형성이 아닌 쇄간 쌍형성을 달성하여 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록 VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)를 갖는 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 구축함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용어 "1-아암 항체" 또는 "1-아암 항체들"은 (1) CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 펩티드 결합에 의해 연결된 가변 도메인 및 (2) 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 항체를 지칭하고, 여기서 가변 도메인은 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 펩티드 결합에 의해 연결되지 않는다. 한 실시양태에서, 1-아암 항체는 3개의 폴리펩티드, (1) 가변 도메인 (예를 들어, VH), CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드, (2) 가변 도메인 (예를 들어, VL) 및 CL 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및 (3) CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 1-아암 항체는 불변 중쇄를 연결하는 디술피드 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 부분 힌지 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 1 아암 항체의 가변 도메인은 항원 결합 영역을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 1 아암 항체의 가변 도메인은 단일 가변 도메인이고, 여기서 각각의 단일 가변 도메인은 항원 결합 영역이다. 한 실시양태에서, 1-아암 항체는 단일 가변 도메인 항체이다.
본 발명의 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편일 수 있다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원의 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"펩티바디" 또는 "펩티바디들"은 무작위로 생성된 펩티드와 Fc 도메인의 융합체를 지칭한다. 2003년 12월 9일에 허여된 미국 특허 번호 6,660,843 (Feige et al.) (그의 전문은 참조로 포함됨)을 참조한다. 이는 N-말단, C-말단, 아미노산 측쇄, 또는 1개 초과의 이들 부위에 연결된 1개 이상의 펩티드를 포함한다. 펩티바디 기술은 1종 이상의 리간드 또는 수용체, 종양-귀소 펩티드, 막-수송 펩티드 등을 표적화하는 펩티드를 혼입시키는 치료제의 설계를 가능하게 한다. 펩티바디 기술은 선형 및 디술피드-구속성 펩티드, "탠덤 펩티드 다량체" (즉, Fc 도메인의 단일 쇄 상의 1개 초과의 펩티드)를 비롯한 다수의 이러한 분자의 설계에 유용한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,660,843; 2003년 10월 16일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0195156 (2002년 11월 21일에 공개된 WO 02/092620에 상응함); 2003년 9월 18일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0176352 (2003년 4월 17일에 공개된 WO 03/031589에 상응함); 미국 특허 번호 6,835,809 (2000년 5월 4일에 공개된 WO 00/24770에 상응함); 2003년 12월 11일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0229023; 2003년 7월 17일에 공개된 WO 03/057134; 2003년 12월 25일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0236193 (2004년 4월 8일에 출원된 PCT/US04/010989에 상응함); 2003년 9월 18일에 출원된 미국 특허 번호 6,919,426 (2004년 4월 1일에 공개된 WO 04/026329에 상응함)을 참조하고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
"아피바디들" 또는 "아피바디"는 Fc 영역에 펩티드 결합에 의해 연결된 단백질의 사용을 지칭하고, 여기서 단백질은 표적 분자에 대한 결합 표면을 제공하는 스캐폴드로서 사용된다. 단백질은 종종 자연 발생 단백질, 예컨대 스타필로코쿠스(staphylococcal) 단백질 A 또는 IgG-결합 B 도메인, 또는 그로부터 유래된 Z 단백질 (문헌 [Nilsson et al. (1987), Prot Eng 1, 107-133] 및 미국 특허 번호 5,143,844 참조) 또는 그의 단편 또는 유도체이다. 예를 들어, 아피바디는 표적 분자(들)에 대해 변경된 결합 친화도를 갖는 Z 단백질 변이체로부터 생성될 수 있고, 여기서 Z 단백질의 절편은 표적 분자에 결합할 수 있는 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 무작위 돌연변이유발에 의해 돌연변이된다. 아피바디의 예는 미국 특허 번호 6,534,628, 문헌 [Nord K et al., Prot Eng 8:601-608 (1995) 및 Nord K et al., Nat Biotech 15:772-777 (1997). Biotechnol Appl Biochem. 2008 Jun;50(Pt 2):97-112]을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합한 분자를 나타낸다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 아미노산 서열이 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 것인 (즉, 항체의 불변 영역과 비교하여 "이종"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열 (예를 들어, IgG의 CH2 및/또는 CH3 서열)의 융합체를 포함한다. 예시적인 어드헤신 서열은 관심 단백질에 결합하는 수용체 또는 리간드의 부분을 포함하는 인접 아미노산 서열을 포함한다. 어드헤신 서열은 또한 관심 단백질에 결합하는 서열일 수 있지만, 수용체 또는 리간드 서열이 아니다 (예를 들어, 펩티바디 내의 어드헤신 서열). 이러한 폴리펩티드 서열은 파지 디스플레이 기술 및 고처리량 분류 방법을 비롯한 다양한 방법에 의해 선택 또는 확인될 수 있다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형, IgA (IgA1 및 IgA2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
본원에 사용된 "복합체" 또는 "복합체화된"은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘 (예를 들어, 반 데르 발스, 소수성, 친수성 힘)을 통해 서로 상호작용하는 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 한 실시양태에서, 복합체는 이종다량체이다. 본원에 사용된 용어 "단백질 복합체" 또는 "폴리펩티드 복합체"는 단백질 복합체 내의 단백질에 접합된 비-단백질 엔티티 (예를 들어, 화학 분자, 예컨대 독소 또는 검출 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 갖는 복합체를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
관심 항원에 결합하는 본 발명의 이종다량체 단백질은 이종 다량체 단백질이 단백질 또는 표적을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 표적에 결합하고, 다른 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않는 것이다. 이러한 실시양태에서, "비-표적" 단백질에 대한 이종다량체 단백질의 결합의 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전 (RIA) 또는 ELISA에 의해 결정 시 그의 특정한 표적 단백질에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 것이다. 표적 분자에 대한 이종다량체 단백질의 결합과 관련하여, 용어 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다 (예를 들어, 비-특이적 상호작용은 소 혈청 알부민 또는 카세인에 대한 결합일 수 있음). 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 표적과의 경쟁에 의해 결정할 수 있다. 이러한 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다. 본원에 사용된 용어 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은, 예를 들어 표적에 대해 적어도 약 200 nM, 대안적으로 적어도 약 150 nM, 대안적으로 적어도 약 100 nM, 대안적으로 적어도 약 60 nM, 대안적으로 적어도 약 50 nM, 대안적으로 적어도 약 40 nM, 대안적으로 적어도 약 30 nM, 대안적으로 적어도 약 20 nM, 대안적으로 적어도 약 10 nM, 대안적으로 적어도 약 8 nM, 대안적으로 적어도 약 6 nM, 대안적으로 적어도 약 4 nM, 대안적으로 적어도 약 2 nM, 대안적으로 적어도 약 1 nM, 또는 그 초과의 Kd를 갖는 분자에 의해 나타내어질 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 이종다량체 단백질이 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 지칭한다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 예를 들어, Kd는 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 그 초과일 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 비롯하여, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫동안 결합된 채로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 표적 (예를 들어, 항원) CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIAcore)™-2000 또는 비아코어™-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2-배 연속 희석물 (예를 들어, 0.78 nM에서 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시 핏팅함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 S-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-Aminco) 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정된 바와 같은, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 이종다량체 단백질, 예컨대 항체, 그의 단편 또는 유도체와 관련하여 "생물학적으로 활성인" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은, 달리 명시된 경우를 제외하고는, 생물학적 분자에 결합하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다.
다양한 이종다량체 폴리펩티드를 기재하는데 사용된 경우의 "단리된"은 발현되는 세포 또는 세포 배양으로부터 분리 및/또는 회수된 이종다량체를 의미한다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 이종다량체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종다량체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정 시 단백질의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하는데 충분한 정도로 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제될 것이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 발명의 이종다량체는 일반적으로 실질적 균질성까지 정제된다. 어구 "실질적으로 균질한", "실질적으로 균질한 형태" 및 "실질적 균질성"은 생성물에 목적하지 않는 폴리펩티드 조합으로부터 유래하는 부산물 (예를 들어, 동종다량체)이 실질적으로 없음을 나타내기 위해 사용된다.
순도와 관련하여 표현된 실질적 균질성은 부산물의 양이 10 중량%, 9 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량% 또는 1 중량%를 초과하지 않거나, 1 중량% 미만인 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 부산물은 5% 미만이다.
"생물학적 분자"는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 및 그의 조합을 지칭한다. 한 실시양태에서, 생물학적 분자는 자연에 존재한다.
본원에 사용된 "연결된" 또는 "연결"은 제1 및 제2 아미노산 서열 사이의 직접적인 펩티드 결합 연결, 또는 제1 및 제2 아미노산 서열에 및 이들 사이에 결합된 펩티드인 제3 아미노산 서열을 수반하는 연결을 의미한다. 예를 들어, 링커 펩티드는 1개의 아미노산 서열의 C-말단 및 다른 아미노산 서열의 N-말단에 결합된다.
본원에 사용된 "링커"는 길이가 2개 이상의 아미노산인 아미노산 서열을 의미한다. 링커는 중성 극성 또는 비극성 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커는 예를 들어 2 내지 100개 아미노산 길이, 예컨대 2 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 링커는 예를 들어 자가-절단, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 "절단가능"할 수 있다. 아미노산 서열 내의 절단 부위 및 이러한 부위에서 절단하는 효소 및 화학물질은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 또한 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 "테더"는 2개의 다른 아미노산 서열을 연결하는 아미노산 링커를 의미한다. 본원에 기재된 테더는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인의 N-말단을 이뮤노글로불린 경쇄 불변 도메인의 C-말단과 연결할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 테더는 약 15 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어 20 내지 26개 아미노산 길이 (예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개 아미노산 길이)이다. 테더는 예를 들어 관련 기술분야의 표준 방법 및 시약을 사용하여 자가-절단, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 "절단가능"할 수 있다.
"링커" 또는 "테더"의 효소적 절단은 엔도펩티다제, 예컨대 예를 들어 Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, 키모트립신, 트립신, 펩신, 파파인, 트롬빈, 제네나제, 인자 Xa, TEV (담배 식각 바이러스 시스테인 프로테아제), 엔테로키나제, HRV C3 (인간 리노바이러스 C3 프로테아제), 키니노게나제, 뿐만 아니라 서브틸리신-유사 전구단백질 컨버타제 (예를 들어, 푸린 (PC1), PC2 또는 PC3) 또는 N-아르기닌 이염기성 컨버타제의 사용을 수반할 수 있다. 화학적 절단은 예를 들어 히드록실아민, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드 또는 브로민화시아노겐의 사용을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 "Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위"는 Lys-C 엔도펩티다제에 의해 C-말단 측에서 절단될 수 있는 아미노산 서열의 리신 잔기이다. Lys-C 엔도펩티다제는 리신 잔기의 C-말단 측에서 절단된다.
"카오트로픽제"는 분자내 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 또는 소수성 효과)을 안정화하는 것을 방해함으로써 단백질 (예를 들어, 항체)의 3차원 구조를 파괴하는 수용성 물질을 의미한다. 예시적인 카오트로픽제는 우레아, 구아니딘-HCl, 과염소산리튬, 히스티딘 및 아르기닌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"온화한 세제"는 분자내 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 또는 소수성 효과)을 안정화하는 것을 방해함으로써 단백질 (예를 들어, 항체)의 3차원 구조를 파괴하지만, 생물학적 활성의 상실이 유발되도록 단백질 구조를 영구적으로 파괴하지는 않는 (즉, 단백질을 변성시키지 않는) 수용성 물질을 의미한다. 예시적인 온화한 세제는 트윈 (예를 들어, 트윈-20), 트리톤 (예를 들어, 트리톤 X-100), NP-40 (노닐 페녹실폴리에톡실에탄올), 노니데트(Nonidet) P-40 (옥틸 페녹실폴리에톡실에탄올), 및 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비형 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하게 하고 이어서 표적 세포를 세포독성제로 사멸시킬 수 있게 하는, 세포독성의 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포의 "아암"이고 이러한 사멸에 반드시 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것이고 (감마 수용체), FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (종설논문 [M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)) 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후 확인될 것을 비롯하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 이 용어는 또한 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"인간 이펙터 세포"는 1종 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는 보체계의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위부류의 항체)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
용어 "치료 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 항체, 항체 단편, 또는 유도체의 양을 지칭한다. 종양 (예를 들어, 암성 종양)의 경우에, 치료 유효량의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 다중특이적 항체 또는 항체 단편)은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/거나; 원발성 종양 크기를 감소시킬 수 있고/거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제 (즉, 어느 정도까지 늦춤, 바람직하게는 정지)할 수 있고/거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도까지 늦춤, 바람직하게는 정지)할 수 있고/거나; 종양 성장을 어느 정도까지 억제할 수 있고/거나; 장애와 연관된 증상 중 1종 이상을 어느 정도까지 완화시킬 수 있다. 항체 또는 항체 단편이 암 세포의 성장을 방지하고/거나 존재하는 암 세포를 사멸시키는 정도까지, 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우에, 생체내 효능은 예를 들어 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응률 (RR), 반응 지속기간 및/또는 삶의 질을 평가하는 것에 의해 측정될 수 있다.
"감소 또는 억제"는 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 전반적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 감소 또는 억제는 치료할 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 또는 혈관신생 장애에서 혈관의 크기 또는 수를 지칭할 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은, 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 이 정의에는 양성 및 악성 암이 포함된다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위암 또는 위장암, 예를 들어 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 (예를 들어, 신세포 암종), 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. "초기 단계 암"은 침습성 또는 전이성이 아니거나 또는 0, I, 또는 II기 암으로서 분류되는 암을 의미한다. 용어 "전암성"은 전형적으로 암에 선행하거나 암으로 발전하는 상태 또는 성장을 지칭한다. "비-전이성"은, 양성이거나, 또는 원발성 부위에 남아있고 림프계 또는 혈관계 내로, 또는 원발성 부위 외의 조직으로 침투되지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 0, I 또는 II기의 암 및 때때로 III기 암인 임의의 암이다.
본원에서 "알레르기성 또는 염증성 장애"는 개체의 면역계의 과다활성화로부터 발생하는 질환 또는 장애이다. 예시적인 알레르기성 또는 염증성 장애는 천식, 건선, 류마티스 관절염, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 습진, 기관 이식, 연령-관련 황반 변성, 크론병, 궤양성 결장염, 호산구성 식도염, 및 염증과 연관된 자가면역 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 "자가면역 질환"은 개체의 자기 조직 또는 공동-분리물로부터 발생하거나 이에 대해 지시된 질환 또는 장애 또는 그의 증상 또는 그로부터 발생한 상태이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예는 관절염 (류마티스 관절염, 예컨대 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 소아-발병 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형성 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직성 척추염), 염증성 과다증식성 피부 질환, 건선, 예컨대 판상 건선, 적상 건선, 농포성 건선, 및 손발톱 건선, 피부염, 예를 들어 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 포진성 피부염, 및 아토피성 피부염, x-연관 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예컨대 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 다발근염/피부근염, 소아 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 경피증 (전신 경피증 포함), 경화증, 예컨대 전신 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예컨대 척수-시신경 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신 경화증, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 및 운동실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 자가면역-매개 위장 질환, 결장염, 예컨대 궤양성 결장염, 궤양성 결장염, 현미경적 결장염, 콜라겐성 결장염, 폴립성 결장염, 괴사성 소장결장염, 및 경벽성 결장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 괴저성 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액 장애, 류마티스 척추염, 돌발성 난청, IgE-매개 질환, 예컨대 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예컨대 라스무센 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예컨대 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아종성 포도막염, 비육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 후방 포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신증후군을 동반하거나 동반하지 않는 사구체신염 (GN), 예컨대 만성 또는 급성 사구체신염, 예컨대 원발성 GN, 면역-매개 GN, 막성 GN (막성 신병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신병증, 막- 또는 막성 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 제I형 및 제II형, 및 급속 진행성 GN, 알레르기성 상태, 알레르기 반응, 습진, 예를 들어 알레르기성 또는 아토피성 습진, 천식, 예컨대 기관지 천식, 기관지 천식, 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 상태, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신 홍반성 루푸스, 예컨대 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (신염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원판상, 탈모증 포함), 소아 발병 (제I형) 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 성인 발병 당뇨병 (제II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종성 육아종증, 베게너 육아종증, 무과립구증, 혈관염, 예를 들어 혈관염 (대혈관 혈관염 (류마티스성 다발근육통 및 거대 세포 (다카야스) 동맥염 포함), 중혈관 혈관염 (가와사키병 및 결절성 다발동맥염 포함), 현미경적 다발동맥염, CNS 혈관염, 괴사성, 피부, 또는 과민성 혈관염, 전신 괴사성 혈관염, 및 ANCA-연관 혈관염, 예컨대 처그-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS) 포함), 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (빈혈 악성), 애디슨병, 순수 적혈구 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍, A형 혈우병, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 수반하는 질환, CNS 염증성 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 예컨대 패혈증, 외상 또는 출혈에 속발성인 것, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 항인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트(Bechet) 또는 베체트(Behcet)병, 캐슬만 증후군, 굿패스쳐 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 유천포창, 예컨대 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 천포창 점액-막 유천포창, 및 홍반성 천포창 포함), 자가면역 다발내분비병증, 라이터병 또는 증후군, 면역 복합체 신염, 항체-매개 신염, 시신경척수염, 다발신경병증, 만성 신경병증, 예컨대 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 혈소판감소증 (예를 들어, 심근경색 환자에 의해 발생되는 바와 같음), 예를 들어 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증, 예컨대 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 고환 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예컨대 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브스병, 다선성 증후군, 예컨대 자가면역 다선성 증후군 (또는 다선성 내분비병증 증후군), 부신생물성 증후군, 예를 들어 신경계 부신생물성 증후군, 예컨대 램버트-이튼 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 강직-인간 또는 강직-사람 증후군, 뇌척수염, 예컨대 알레르기성 뇌척수염 또는 뇌척수염 알레르기 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예컨대 흉선종-연관 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근긴장증, 안진전 또는 안진전 근간대성경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 쉬한 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프성 간질성 폐장염, 폐쇄성 세기관지염 (비-이식) vs NSIP, 길랑-바레 증후군, 베르게르병 (IgA 신병증), 특발성 IgA 신병증, 선상 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변증, 폐경변증, 자가면역 장병증 증후군, 복강 질환, 복강 질환, 복강 스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예컨대 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청각 상실, 안진전 근간대성경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예컨대 불응성 또는 재발성 다발연골염, 폐 폐포 단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증, 예를 들어 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 의미 불명 모노클로날 감마글로불린병증, MGUS), 말초 신경병증, 부신생물성 증후군, 채널병증, 예컨대 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근병증, 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비 안병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역 간 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축, 초로기 치매, 탈수초성 질환, 예컨대 자가면역 탈수초성 질환, 당뇨병성 신병증, 드레슬러 증후군, 원형 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 수지경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합 결합 조직 질환, 샤가스병, 류마티스성 열, 반복 유산, 농부 폐, 다형성 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱 증후군, 조류 사육자 폐, 알레르기성 육아종성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예컨대 알레르기성 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈마니아증, 키파노소마증, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘프터 증후군, 카플란 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 미만성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 안내염, 장기 융기성 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 사상충증, 모양체염, 예컨대 만성 모양체염, 이색성 모양체염, 홍채모양체염, 또는 푸크스 모양체염, 헤노흐-쉔라인 자반증, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병, 파르보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 볼거리, 에반 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시데남 무도병, 스트렙토코쿠스 감염후 신염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수로, 맥락막염, 거대 세포 다발근육통, 내분비 안병증, 만성 과민성 폐장염, 건성 각결막염, 유행성 각결막염, 특발성 신염성 증후군, 미세 변화 신병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애, 무정액증, 자가면역 용혈, 뵈크병, 한랭글로불린혈증, 듀피트렌 구축, 수정체과민성 안내염, 알레르기성 장염, 나병성 결절성 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 함만-리치병, 감각신경성 청각 상실, 발작성 혈색소뇨, 생식선기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구감소증, 감염성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액수종, 신증, 교감신경성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저성 농피증, 퀘르뱅 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항정자 항체로 인한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바르 바이러스- 연관 질환, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 기생충성 질환, 예컨대 리슈마니아, 독성-충격 증후군, 식중독, T 세포의 침윤을 수반하는 상태, 백혈구-부착 결핍, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역 다발내분비병증, 난소염, 원발성 점액수종, 자가면역 위축성 위염, 교감신경성 안염, 류마티스성 질환, 혼합 결합 조직 질환, 신증후군, 췌도염, 다발내분비 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다선성 증후군 제I형, 성인-발병 특발성 부갑상선기능저하증 (AOIH), 전두 탈모증, 확장성 심근병증, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골, 전두, 상악, 또는 접형 부비동염, 호산구-관련 장애, 예컨대 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가증-근육통 증후군, 뢰플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구 함유 육아종, 아나필락시스, 혈청음성 척추관절염, 다발내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 영아기 일과성 저감마글로불린혈증, 비스코트-알드리치 증후군, 모세혈관확장성 운동실조, 콜라겐 질환과 연관된 자가면역 장애, 류마티즘, 신경계 질환, 허혈성 재관류 장애, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능장애, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 뇌 허혈, 및 혈관화 동반 질환, 알레르기성 과민성 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증 요인을 갖는 피부염, 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추 신경계 염증성 장애, 안구 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-연관 증후군, 시토카인-유발 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경변증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 대-동맥 장애, 동맥내막 증식증, 소화성 궤양, 판막염, 및 자궁내막증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)의 효소적 활성 독소, 및 본원에 개시된 다양한 항종양제, 항암제 및 화학요법제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성제는 본원에 기재되어 있다. 종양사멸제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마 1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네미신, 예를 들어 디네미신 A; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오리건주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴), 아브락산(ABRAXANE)™ 파클리탁셀의 크레모포르-무함유, 알부민-조작 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샤움버그), 및 탁소테레(TAXOTERE)® 도세탁셀 (롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 임의의 상기의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
또한, 이러한 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 온몸 치료의 형태인 항호르몬제도 포함된다. 이는 호르몬 그 자체일 수 있다. 예는, 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 에비스타(EVISTA)® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)® 토레미펜; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 억제하거나 또는 차단하는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 디드로칼(DIDROCAL)® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사맥스(FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디아(AREDIA)® 파미드로네이트, 스켈리드(SKELID)® 틸루드로네이트 또는 악토넬(ACTONEL)® 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로도 공지된, ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
"성장 억제제"가 본원에 사용되는 경우에, 이것은 세포의 성장을 시험관내 또는 생체내에서 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 (S 기 이외의 다른 곳에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 전형적 M-기 차단제는 빈카 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 또한 S-기 정지로 이어진다. 추가 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)], 특히 13페이지에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 롱-프랑 로러)은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스큅)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜, 세포에서의 유사분열 억제를 발생시킨다.
본원에 사용된 "항암 요법"은 대상체에서 암을 감소시키거나 억제하는 치료를 지칭한다. 항암 요법의 예는 세포독성 방사선요법 뿐만 아니라 대상체에게 치료 유효량의 세포독성제, 화학요법제, 성장 억제제, 암 백신, 혈관신생 억제제, 전구약물, 시토카인, 시토카인 길항제, 코르티코스테로이드, 면역억제제, 항구토제, 항체 또는 항체 단편, 또는 진통제를 투여하는 것을 포함한다.
본 출원에 사용된 용어 "전구약물"은 모 약물과 비교하여 종양 세포에 덜 세포독성이고, 보다 활성의 모 형태로 효소에 의해 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조한다. 전구약물은 보다 활성의 세포독성의 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, 베타-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기 기재된 화학요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "시토카인"은 세포간 매개체로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토카인에는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 (HGH), N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체형성 호르몬 (LH); 표피 성장 인자 (EGF); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자 (FGF); 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-알파; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-1베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-18; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원으로부터의 또는 재배합된 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
"시토카인 길항제"는 적어도 1종의 시토카인의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 분자를 의미한다. 예를 들어, 시토카인 길항제는 시토카인 발현 및/또는 분비의 억제에 의해, 또는 시토카인 또는 시토카인 수용체에의 결합에 의해 시토카인 활성을 억제할 수 있다. 시토카인 길항제는, 항체, 합성 또는 천연-서열 펩티드, 이뮤노어드헤신, 및 시토카인 또는 시토카인 수용체에 결합하는 소분자 길항제를 포함한다. 시토카인 길항제는 임의로 세포독성제와 접합 또는 융합된다. 예시적인 TNF 길항제는 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)®), 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)®) 및 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)™)이다.
본원에 사용된 용어 "면역억제제"는 치료되는 대상체의 면역계를 억제 또는 차폐하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이는 시토카인 생산을 억제하거나, 자기-항원 발현을 하향조절 또는 억제하거나, 또는 MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 면역억제제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 번호 4,665,077 참조); 미코페놀레이트 모페틸, 예컨대 셀셉트(CELLCEPT)®; 아자티오프린 (이뮤란(IMURAN)®, 아자산(AZASAN)®/6-메르캅토퓨린; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (미국 특허 번호 4,120,649에 기재된 바와 같이 MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린 A; 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드 및 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 프레드니솔론, 예컨대 페디아프레드(PEDIAPRED)® (프레드니솔론 인산나트륨) 또는 오라프레드(ORAPRED)® (프레드니솔론 인산나트륨 경구 용액), 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 메토트렉세이트 (경구 또는 피하) (류마트렉스(RHEUMATREX)®, 트렉살(TREXALL)™); 히드록시클로로퀸/클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 시토카인 또는 시토카인 수용체 길항제, 예를 들어 항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체, 항-종양 괴사 인자-α 항체 (인플릭시맙 또는 아달리무맙), 항-TNFα 이뮤노어드헤신 (엔브렐®, 에타네르셉트), 항종양 괴사 인자-β 항체, 항-인터류킨-2 항체, 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-LFA-1 항체, 예를 들어 항-CD11a 및 항-CD18 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항림프구 글로불린; 폴리클로날 또는 범-T 항체, 또는 모노클로날 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (WO 90/08187); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 번호 5,114,721 (Cohen et al.)); T-세포 수용체 단편 (Offner et al. Science 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature 341:482 (1989); 및 WO 91/01133); T 세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예컨대 T10B9; 시클로포스파미드 (시톡산®); 답손; 페니실라민 (큐프리민(CUPRIMINE)®); 혈장 교환; 또는 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)을 포함한다. 이들은 단독으로 또는 서로 조합되어, 특히 스테로이드 및 또 다른 면역억제제와 조합되어 사용될 수 있거나, 또는 이러한 조합물에 이어서 스테로이드에 대한 필요를 감소시키기 위한 비-스테로이드 작용제를 함유하는 유지 용량으로 사용될 수 있다.
"진통제"는 대상체에서 통증을 억제 또는 저해하는 작용을 하는 약물을 지칭한다. 예시적인 진통제는 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 예를 들어 이부프로펜 (모트린(MOTRIN)®), 나프록센 (나프로신(NAPROSYN)®), 아세틸살리실산, 인도메타신, 술린닥 및 톨메틴 (그의 염 및 유도체 포함), 뿐만 아니라 발생할 수 있는 자통을 감소시키는데 사용되는 다양한 다른 의약, 예를 들어 항경련제 (가바펜틴, 페닐로인, 카르바마제핀) 또는 삼환계 항우울제를 포함한다. 구체적 예는 아세트아미노펜, 아스피린, 아미트립틸린 (엘라빌(ELAVIL)®), 카르바마제핀 (테그레톨(TEGRETOL)®), 페닐토인 (딜란틴(DILANTIN)®), 가바펜틴 (뉴론틴(NEURONTIN)®), (E)-N-바닐릴-8-메틸-6-논아미드 (캡사이신(CAPSAICIN)®) 또는 신경 차단제를 포함한다.
"코르티코스테로이드"는 자연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 증대시키는, 스테로이드의 일반적 화학 구조를 갖는 여러 합성 또는 자연 발생 물질 중 어느 하나를 지칭한다. 합성 코르티코스테로이드의 예는 프레드니손, 프레드니솔론 (메틸프레드니솔론 포함), 덱사메타손, 트리암시놀론 및 베타메타손을 포함한다.
본원에 사용된 "암 백신"은 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 자극하는 조성물이다. 전형적으로, 암 백신은 항원에 대한 면역 반응을 추가로 자극 및 부스팅하기 위한 다른 성분 (예를 들어, 아주반트)과 함께, 대상체에 대해 자가 (자신으로부터) 또는 동종 (다른 것으로부터)일 수 있는 암-연관 물질 또는 세포 (항원)의 공급원으로 이루어진다. 암 백신은 대상체의 면역계의 자극을 발생시켜 1종 또는 여러 특정 항원에 대한 항체를 생산하고/거나 이들 항원을 갖는 암 세포를 공격하기 위한 킬러 T 세포를 생산할 수 있다.
본원에 사용된 "세포독성 방사선요법"은 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 방사선 요법을 지칭한다. 방사선 요법은, 예를 들어 외부 빔 조사, 또는 방사성 표지된 작용제, 예컨대 항체로의 요법을 포함할 수 있다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소)의 사용을 포함하는 것으로 의도된다.
"대상체"는 척추동물, 예컨대 포유동물, 예를 들어 인간이다. 포유동물은 가축 (예컨대, 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예컨대, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스, 및 래트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
문맥에 의해 달리 제시되는 경우를 제외하고, 용어 "제1" 힌지-함유 폴리펩티드 및 "제2" 힌지-함유 폴리펩티드, 및 그의 변형은 단지 일반적 식별자이고, 본 발명의 항체의 특이적 또는 특정한 폴리펩티드 또는 성분을 식별하는 것으로서 간주되지 않는다.
달리 나타내지 않는 한, 실시예에서 언급되는 상업적으로 입수가능한 시약은, 존재하는 경우에, 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 존재하는 경우에, 하기 실시예에서 및 명세서 전체에 걸쳐 ATCC 수탁 번호에 의해 확인되는 세포의 공급원은 버지니아주 마나사스의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)이다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명은 재조합 DNA 기술의 표준 절차, 예컨대 본원의 상기 및 하기 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., NY, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991]에 기재된 것을 사용한다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급한 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 값 또는 파라미터 그 자체에 대해 지시되는 변동을 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 본원에 기재된 본 발명의 측면 및 변경은 측면 및 변경으로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
II. 포유동물 숙주 세포에서 이종다량체 단백질을 제조하는 방법
현행 기술을 사용하여 이종다량체 단백질, 예를 들어 다중특이적 항체를 생산하는 것은 특히, 생성물의 혼합물의 생산, 수율의 감소 및 이펙터 기능의 감소/제거를 비롯한 결점을 갖는다. 따라서, 효율적이고 높은 수준으로 이종다량체 단백질을 생산하는 것이 바람직하다.
다양한 수단에 의해 항체 분자를 생산하는 것은 일반적으로 널리 이해되어 있다. 미국 특허 6331415 (Cabilly et al.)는, 예를 들어 중쇄 및 경쇄가 단일 벡터로부터 또는 단일 세포에서 2개의 개별 벡터로부터 동시에 발현되는 이뮤노글로불린의 재조합 생산 방법을 기재한다. 문헌 [Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191 -202) 및 Lee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101: 189-198)]은 이. 콜라이(E. coli)의 개별 배양에서 발현된 플라스미드를 사용하여, 개별적으로 생산된 중쇄 및 경쇄로부터 모노클로날 항체를 생산하는 것을 기재한다. 항체의 생산과 관련된 다양한 다른 기술이, 예를 들어 문헌 [Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)] 및 WO2006028936에 기재되어 있다. 그러나 이들 각각은 저수율, 화학물질의 사용과 같은 결점을 갖는다.
본원에 제공된 방법은 제1 포유동물 숙주 세포로부터 발현 및 분비된 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄 및 제2 포유동물 숙주 세포에 의해 발현 및 분비된 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄가 배합된 배양 배지에서 어셈블리되어 이종다량체 단백질을 형성한다는 놀라운 발견을 기초로 한다. 하기에서 추가로 상세하게 논의되는 바와 같이, 배합된 배양 배지는 제1 세포 배양에서 제1 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계, 제2 세포 배양에서 제2 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계, 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 제1 및 제2 배양 배지를 수거하는 단계, 및 수거된 제1 및 제2 배양 배지를 배합하여 이종다량체 단백질을 포함하는 배합된 배양 배지를 수득하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 배합된 배양 배지는 배합된 세포 배양물에서 제1 및 제2 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계, 배합된 배양물로부터 이종다량체 단백질을 포함하는 배합된 세포 배양 배지를 수거하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, 수거하는 단계는 세포 막을 파괴하지 않으면서 제1 및/또는 제2 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 방법은, 일반적으로 진핵 세포 (예컨대 포유동물 세포)의 단백질 품질 관리 시스템이 불완전 항체를 효율적으로 생산할 수 없다고 여겨졌기 때문에 놀라운 것이다. 예를 들어, 문헌 [Spiess et al. (2013) Nature, 31(8): 753-758]을 참조한다.
출원인은 또한 놀랍게도, 제1 숙주 세포에 의해 분비된 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체 및 제2 숙주 세포에 의해 그로부터 분비된 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체를 포함하는 배합된 배양 배지에서 이종다량체 단백질이 환원 조건 하에 고수율로 형성될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현 및 분비할 수 있는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현 및 분비할 수 있는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; 및,
(c) 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하고, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 배합된 배양 배지를 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(e) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 수득된다. 특정 실시양태에서, 방법은 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 환원 조건은 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분하다.
특정 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄는 제1 절반 항체를 구성한다. 특정 실시양태에서, 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄는 제2 절반 항체를 구성한다.
특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지에 존재하는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄 (예를 들어, 제1 절반 항체)의 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 또는 약 5% 미만 (예컨대 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%) (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)은 환원 조건 하에서의 인큐베이션 전 또는 환원제를 첨가하기 전에 제1 동종이량체의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지에 존재하는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄 (예를 들어, 제1 절반 항체)의 약 10% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 65%, 또는 약 30% 내지 약 55%는 환원 조건 하에서의 인큐베이션 전 또는 환원제를 첨가하기 전에 제1 동종이량체의 형태로 존재한다.
특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지에 존재하는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄 (예를 들어, 제2 절반 항체)의 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 또는 약 5% 미만 (예컨대 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%) (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)은 환원 조건 하에서의 인큐베이션 전 또는 환원제를 첨가하기 전에 제2 동종이량체의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지에 존재하는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄 (예를 들어, 제2 절반 항체)의 약 10% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 65%, 또는 약 30% 내지 약 55%는 환원 조건 하에서의 인큐베이션 전 또는 환원제를 첨가하기 전에 제2 동종이량체의 형태로 존재한다.
특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 환원 조건 하에서의 인큐베이션 후 또는 환원제를 첨가한 후에 제1 동종이량체를 약 75% 미만, 약 70% 미만, 약 65% 미만, 약 60% 미만, 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 환원 조건 하에서의 인큐베이션 후 또는 환원제를 첨가한 후에 제1 동종이량체를 약 2% 미만 내지 약 20%, 약 5% 미만 내지 약 15%, 또는 약 10% 미만 내지 약 15%로 포함한다.
특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 환원 조건 하에서의 인큐베이션 후 또는 환원제를 첨가한 후에 제2 동종이량체를 약 75% 미만, 약 70% 미만, 약 65% 미만, 약 60% 미만, 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 환원 조건 하에서의 인큐베이션 후 또는 환원제를 첨가한 후에 제2 동종이량체를 약 2% 미만 내지 약 20%, 약 5% 미만 내지 약 15%, 또는 약 10% 미만 내지 약 15%로 포함한다.
특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; 및,
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하고, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 핵산은 1개의 핵산 분자이거나; 특정의 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 핵산은 상이한 핵산 분자이다. 특정 실시양태에서, 제3 및 제4 핵산은 1개의 핵산 분자이거나; 특정의 다른 실시양태에서, 제3 및 제4 핵산은 상이한 핵산 분자이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제2 숙주 세포는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 배합된 배양 배지를 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(e) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 핵산은 1개의 핵산 분자이거나; 특정의 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 핵산은 상이한 핵산 분자이다. 특정 실시양태에서, 제3 및 제4 핵산은 1개의 핵산 분자이거나; 특정의 다른 실시양태에서, 제3 및 제4 핵산은 상이한 핵산 분자이다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제1 절반 항체, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제2 절반 항체를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; 및,
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하고, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제1 절반 항체, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제2 절반 항체를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제2 숙주 세포는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 배합된 배양 배지를 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(e) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 포유동물 숙주 세포를 제1 세포 배양에서 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 포유동물 숙주 세포를 제2 세포 배양에서 배양하는 단계;
(c) 제1 포유동물 숙주 세포로부터 제1 배양 배지를 수거하는 단계;
(d) 제2 포유동물 숙주 세포로부터 제2 배양 배지를 수거하는 단계;
(e) 제1 배양 배지 및 제2 배양 배지를 배합하여 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하는 것인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 배양 배지를 수거하는 단계는 제1 세포 배양으로부터 제1 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 배양 배지를 수거하는 단계는 제2 세포 배양으로부터 제2 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 제1 세포 배양에서 배양하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 제2 세포 배양에서 배양하는 단계이며, 여기서 제2 숙주 세포는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있고, 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 포유동물 숙주 세포로부터 제1 배양 배지를 수거하는 단계이며, 여기서 제1 배양 배지는 제1 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 제2 포유동물 숙주 세포로부터 제2 배양 배지를 수거하는 단계이며, 여기서 제2 배양 배지는 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(e) 제1 배양 배지 및 제2 배양 배지를 배합하여 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(f) 배합된 배양 배지를 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(g) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 배양 배지를 수거하는 단계는 제1 세포 배양으로부터 제1 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 배양 배지를 수거하는 단계는 제2 세포 배양으로부터 제2 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제1 절반 항체, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖는 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제2 절반 항체를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 절반 항체는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 포유동물 숙주 세포를 제1 세포 배양에서 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 포유동물 숙주 세포를 제2 세포 배양에서 배양하는 단계;
(c) 제1 포유동물 숙주 세포로부터 제1 배양 배지를 수거하는 단계;
(d) 제2 포유동물 숙주 세포로부터 제2 배양 배지를 수거하는 단계;
(e) 제1 배양 배지 및 제2 배양 배지를 배합하여 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하는 것인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 배양 배지를 수득하는 단계는 제1 세포 배양으로부터 제1 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 배양 배지를 수득하는 단계는 제2 세포 배양으로부터 제2 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제1 절반 항체, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제2 절반 항체를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포를 제1 세포 배양에서 배양하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 제2 세포 배양에서 배양하는 단계이며, 여기서 제2 숙주 세포는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있고, 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 포유동물 숙주 세포로부터 제1 배양 배지를 수거하는 단계이며, 여기서 제1 배양 배지는 제1 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 제2 포유동물 숙주 세포로부터 제2 배양 배지를 수거하는 단계이며, 여기서 제2 배양 배지는 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(e) 제1 배양 배지 및 제2 배양 배지를 배합하여 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(f) 배합된 배양 배지를 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(g) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 배양 배지를 수거하는 단계는 제1 세포 배양으로부터 제1 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 배양 배지를 수거하는 단계는 제2 세포 배양으로부터 제2 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하여 제1 포유동물 숙주 세포 및 제2 포유동물 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하는 것인 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제2 숙주 세포는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하여 제1 포유동물 숙주 세포 및 제2 포유동물 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 세포 배양물의 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 배양 배지를 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(e) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제1 절반 항체, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖는 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제2 절반 항체를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하여 제1 포유동물 숙주 세포 및 제2 포유동물 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 이종다량체 단백질을 포함하는 것인 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제1 절반 항체, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 제2 절반 항체를 포함하는 이종다량체 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고, 상기 방법은
(a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제1 경쇄를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제1 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포는 제1 힌지 함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 및 제2 경쇄를 코딩하는 제4 핵산을 포함하는 제2 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제2 숙주 세포는 제2 힌지 함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있고, 여기서 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
(c) 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하여 제1 포유동물 숙주 세포 및 제2 포유동물 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 세포 배양물의 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
(d) 배양 배지를 이종다량체 단백질의 형성을 허용하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및;
(e) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물을 배양하는 단계는 약 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물을 배양하는 단계는 약 30℃ 내지 37℃의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물을 배양하는 단계는 약 7.2 내지 8.7의 pH에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 약 4℃ 내지 40℃의 온도에서 인큐베이션된다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 약 30℃ 내지 37℃의 온도에서 인큐베이션된다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 약 4℃ 내지 8℃의 온도에서 인큐베이션된다.
특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 교반된다. 특정 실시양태에서, 배합된 배양 배지는 배합된 배양 배지가 수득된 후 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 또는 8일 초과 동안 교반된다. 일부 실시양태에서, 배합된 배양물은 간헐적으로 교반된다.
특정 실시양태에서, 방법은 배합된 배양 배지로부터 이종다량체 단백질 (예컨대 이중특이적 항체)을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질 (예컨대 이중특이적 항체)은 단백질 A 칼럼을 사용하여 단리된다.
특정 실시양태에서, 방법은 이종다량체 단백질 (예컨대 이중특이적 항체)의 생산 동안 환원제를 첨가하는 단계를 포함한다. 본원에 제공된 방법의 특정 실시양태에서, 사용되는 환원제는 글루타티온, 2-메르캅토에탄올, 2-메르캅토에틸아민, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 시스테인, 시스테인, 디티오트레이톨, 시스테인디티오트레이톨, 디티올부틸아민 또는 그의 조합이다. 특정 실시양태에서, 환원제는 환원 글루타티온이다. 특정 실시양태에서, 환원제는 2-메르캅토에탄올이 아니다. 특정 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨이 아니다.
제1 및 제2 포유동물 숙주 세포가 개별적으로 배양되는, 즉 개별 배양에서 성장되는 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 세포 배양 배지를 수거 및 배합하여 배합된 배양 배지를 수득하기 전에 환원제를 제1 세포 배양 배지 및 제2 세포 배양 배지에 첨가한다. 제1 및 제2 포유동물 숙주 세포가 동일한 배양에서 성장되는 특정 실시양태에서, 배합된 세포 배양물을 수거하여 배합된 배양 배지를 수득하기 전에 환원제를 배합된 세포 배양물의 배양 배지에 첨가한다.
특정 실시양태에서, 환원제는 수거 단계의 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 약 29시간, 또는 약 30시간 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함) 전에 첨가된다.
특정 실시양태에서, 환원제는 배합된 배양 배지에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 환원제를 함유하는 배합된 배양 배지는 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 18시간, 약 21시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함) 동안 인큐베이션된다.
특정 실시양태에서, 환원제 (예컨대 글루타티온)는 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 또는 약 30 mM (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)의 최종 농도를 달성하도록 배합된 세포 배양물에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 환원제 (예컨대 글루타티온)는 20 mM 미만의 최종 농도를 달성하도록 배합된 세포 배양물에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 환원제 (예컨대 글루타티온)는 20 mM 이하의 최종 농도를 달성하도록 배합된 세포 배양물에 첨가된다.
특정 실시양태에서, 환원제는 배합된 배양 배지로부터 이종다량체 단백질 (예컨대 이중특이적 항체)을 단리하기 전에 배합된 배양 배지에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 환원제를 함유하는 배합된 배양 배지는 환원제를 함유하는 배합된 배양 배지로부터 이종다량체 단백질 (예컨대 이중특이적 항체)을 단리하기 전에 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 18시간, 약 21시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함) 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 단백질 A 칼럼을 사용하여 단리된다.
특정 실시양태에서, 환원제 (예컨대 글루타티온)는 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 또는 약 30 mM의 최종 농도를 달성하도록 배합된 배양 배지에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 환원제 (예컨대 글루타티온)는 20 mM 미만의 최종 농도를 달성하도록 배합된 배양 배지에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 환원제 (예컨대 글루타티온)는 20 mM 이하의 최종 농도를 달성하도록 배합된 배양 배지에 첨가된다.
방법의 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 안정한 세포주이다. 특정 실시양태에서, 제2 숙주 세포는 안정한 세포주이다. 특정 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 CHO 세포이다. 특정 실시양태에서, 제2 숙주 세포는 CHO 세포이다. 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 동일한 배양에서 성장되는 특정 실시양태에서, 배합 배양의 시작 시 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포의 비는 약 1:10, 약 1:9, 약 1:8, 약 1:7, 약 1:6, 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 약 9:1 또는 약 10:1이다.
본원에 사용된 "몰비"는 발현 및/또는 분비된 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드 (예컨대 제1 절반 항체) 대 발현 및/또는 분비된 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드 (예컨대 제2 절반 항체)의 비를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 몰비는 약 1.5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 또는 약 5:1 사이 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)이다. 일부 실시양태에서, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 몰비는 약 1:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 절반 항체 및 제2 절반 항체의 몰비는 약 1.5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 또는 약 5:1 사이 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)이다. 일부 실시양태에서, 제1 절반 항체 및 제2 절반 항체의 몰비는 약 1:1이다.
III. 이종다량체 단백질
또한, 본 발명은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 이종다량체 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서 이종다량체 단백질은 항체 Fc 영역 또는 그의 변이체 (예컨대 변경된 ADCC 기능을 갖는 변이체)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 항체 Fc 영역 또는 그의 변이체 (예를 들어, 변경된 ADCC 기능을 갖는 변이체)의 유의한 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 단지 CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인의 부분을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 단지 CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인의 부분을 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 항체이다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG (예컨대 IgG1, IgG2, 또는 IgG4), IgA, 또는 IgD이다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질의 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 상이한 가변 도메인 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 이종다량체 단백질의 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 Fc 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질의 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 항체 중쇄를 포함한다.
이종다량체화 도메인
이종다량체 단백질은 이종다량체화 도메인을 포함한다. 이종이량체 분자의 실질적으로 균질한 집단을 생성하기 위해, 이종이량체화 도메인은 동종이량체보다 이종이량체의 형성에 대해 강한 선호도를 가져야 한다. 본원에 예시된 이종다량체 단백질은 이종다량체화를 용이하게 하기 위해 노브 인투 홀 기술을 사용하지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 유용한 다른 이종다량체화 도메인을 인식할 것이다.
노브 인투 홀
다중특이적 항체를 생산하는 방법으로서 노브 인투 홀의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 1998년 3월 24일에 승인되어 제넨테크에게 양도된 미국 특허 번호 5,731,168, 2009년 7월 16일에 공개되어 암젠(Amgen)에게 양도된 PCT 공개 번호 WO2009089004 및 2009년 7월 16일에 공개되어 노보 노르디스크 A/S에게 양도된 미국 특허 공개 번호 20090182127을 참조한다. 또한, 문헌 [Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658 및 Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1-9]을 참조한다. 간략한 논의가 본원에 제공된다.
"돌출부"는, 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 돌출되어 이종다량체를 안정화하도록 인접한 계면 (즉, 제2 폴리펩티드의 계면)에 있는 상보적 함몰부에 위치가능하고 그에 의해 예를 들어 동종다량체 형성에 비해 이종다량체 형성이 유리한, 적어도 1개의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 돌출부는 원래 계면에 존재할 수 있거나, 또는 합성적으로 (예를 들어, 계면을 코딩하는 핵산을 변경하여) 도입될 수 있다. 통상적으로, 제1 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산을 돌출부를 코딩하도록 변경한다. 이를 달성하기 위해, 제1 폴리펩티드의 계면에 있는 적어도 1개의 "원래" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산을, 원래 아미노산 잔기보다 큰 측쇄 부피를 갖는 적어도 1개의 "유입" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 대체한다. 1개 초과의 원래 및 상응하는 유입 잔기가 존재할 수 있음이 인식될 것이다. 대체되는 원래 잔기의 수에 대한 상한은 제1 폴리펩티드의 계면에 있는 총 잔기의 수이다. 다양한 아미노 잔기의 측쇄 부피가 하기 표 1에 제시되어 있다.
<표 1>
아미노산 잔기의 특성
Figure 112016107007220-pct00001
a 분자량 아미노산 마이너스 물의 분자량. 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 43rd ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961]으로부터의 값.
b 문헌 [A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972]으로부터의 값.
c 문헌 [C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975]으로부터의 값. 접근가능한 표면적은 이러한 참고문헌의 도 6-20에 정의되어 있다.
돌출부의 형성을 위한 바람직한 유입 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 트립토판 및 티로신이다. 한 실시양태에서, 돌출부의 형성을 위한 원래 잔기는 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린과 같이 작은 측쇄 부피를 갖는다.
"함몰부"는 제2 폴리펩티드의 계면으로부터 함요되어 제1 폴리펩티드의 인접한 계면 상의 상응하는 돌출부를 수용하는 적어도 1개의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 함몰부는 원래 계면에 존재할 수 있거나, 또는 합성적으로 (예를 들어, 계면을 코딩하는 핵산을 변경하여) 도입될 수 있다. 통상적으로, 제2 폴리펩티드의 계면을 코딩하는 핵산을 함몰부를 코딩하도록 변경한다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면에 있는 적어도 1개의 "원래" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산을, 원래 아미노산 잔기보다 작은 측쇄 부피를 갖는 적어도 1개의 "유입" 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA로 대체한다. 1개 초과의 원래 및 상응하는 유입 잔기가 존재할 수 있음이 인식될 것이다. 대체되는 원래 잔기의 수에 대한 상한은 제2 폴리펩티드의 계면에 있는 총 잔기의 수이다. 다양한 아미노 잔기의 측쇄 부피가 상기 표 1에 제시되어 있다. 함몰부의 형성을 위한 바람직한 유입 잔기는 통상적으로 자연 발생 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 세린, 알라닌 또는 트레오닌이다. 한 실시양태에서, 함몰부의 형성을 위한 원래 잔기는 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판과 같이 큰 측쇄 부피를 갖는다.
"원래" 아미노산 잔기는 원래 잔기보다 작거나 큰 측쇄 부피를 가질 수 있는 "유입" 잔기에 의해 대체되는 것이다. 유입 아미노산 잔기는 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산 잔기일 수 있으나, 바람직하게는 전자이다. "자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되고 상기 표 1에 열거된 잔기이다. "비-자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되지 않지만 폴리펩티드 쇄 내에서 인접 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비-자연 발생 아미노산 잔기의 예는, 예를 들어 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 문헌 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기재된 것과 같은 다른 아미노산 잔기 유사체이다. 이러한 비-자연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌 [Noren et al. Science 244: 182 (1989)] 및 상기 문헌 [Ellman et al.]의 절차가 사용될 수 있다. 간략하게, 이는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 사용한 억제자 tRNA의 화학적 활성화에 이어, RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다. 본 발명의 방법은 적어도 1개의 원래 아미노산 잔기를 대체하는 것을 수반하지만, 1개 초과의 원래 잔기가 대체될 수 있다. 통상적으로, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면에 있는 총 잔기 이하의 잔기가 대체되는 원래 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 전형적으로, 대체를 위해 원래 잔기는 "매립된다". "매립된"은 잔기가 본질적으로 용매에 접근가능하지 않다는 것을 의미한다. 일반적으로, 유입 잔기는 가능한 산화 또는 디술피드 결합의 쌍형성오류를 방지하기 위해, 시스테인이 아니다.
돌출부는 함몰부에 "위치가능"하며, 이는 각각 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 계면 상의 돌출부 및 함몰부의 공간적 위치 및 돌출부 및 함몰부의 크기가, 돌출부가 계면에서 제1 및 제2 폴리펩티드의 정상적 회합을 유의하게 방해하지 않으면서 함몰부에 위치될 수 있도록 한다는 것을 의미한다. 돌출부, 예컨대 Tyr, Phe 및 Trp는 전형적으로 계면의 축으로부터 수직으로 연장되지 않고 바람직한 입체형태를 갖기 때문에, 돌출부의 상응하는 함몰부와의 정렬은 X선 결정학 또는 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 수득되는 것과 같은 3차원 구조에 기초하여 돌출부/함몰부 쌍을 모델링하는 것에 의존한다. 이는 관련 기술분야에서 널리 허용되는 기술을 사용하여 달성될 수 있다. "원래 또는 주형 핵산"은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 의미하고, 이는 돌출부 또는 함몰부를 코딩하기 위해 "변경" (즉, 유전자 조작 또는 돌연변이)될 수 있다. 원래 또는 출발 핵산은 자연 발생 핵산일 수 있거나, 또는 앞서 변경된 핵산을 포함할 수 있다 (예를 들어, 인간화 항체 단편). 핵산을 "변경하는 것"은 원래 핵산을 관심 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 1개의 코돈의 삽입, 결실 또는 대체에 의해 돌연변이시키는 것을 의미한다. 통상적으로, 원래 잔기를 코딩하는 코돈은 유입 잔기를 코딩하는 코돈에 의해 대체된다. DNA를 이러한 방식으로 유전자 변형하는 기술이 문헌 [Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991))]에서 검토되어 있고, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이유발을 포함한다. 원래/주형 핵산을 돌연변이시킴으로써, 원래/주형 핵산에 의해 코딩된 원래/주형 폴리펩티드가 상응하게 변경된다.
돌출부 또는 함몰부는 합성 수단, 예를 들어 재조합 기술, 시험관내 펩티드 합성, 이전에 기재된 비-자연 발생 아미노산 잔기를 도입하기 위한 기술에 의해, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부 조합에 의해 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면으로 "도입"될 수 있다. 따라서, "도입되는" 돌출부 또는 함몰부는 "비-자연 발생" 또는 "비-천연"이며, 이는 자연에 또는 원래 폴리펩티드에 존재하지 않는다는 것을 의미한다 (예를 들어, 인간화 모노클로날 항체).
일반적으로, 돌출부를 형성하기 위한 유입 아미노산 잔기는 상대적으로 적은 수의 "회전이성질체"를 갖는다 (예를 들어, 약 3-6개). "회전이성질체"는 아미노산 측쇄의 에너지적으로 유리한 입체형태이다. 다양한 아미노산 잔기의 회전이성질체의 수가 문헌 [Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)]에 검토되어 있다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 이종다량체 단백질의 제1 이종이량체화 도메인은 계면에서 노브 변형을 포함하고, 제2 이종이량체화 도메인은 홀 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 노브 변형은 제1 이종이량체화 도메인으로부터의 원래 아미노산 잔기를 원래 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 더 큰 측쇄를 갖는 치환 아미노산 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신 또는 아르기닌이다. 특정 실시양태에서, 노브 변형은 T366W 치환 (EU 넘버링)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 홀 변형은 제2 이종다량체화 도메인으로부터의 아미노산 잔기를 더 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 더 작은 측쇄를 갖는 치환 아미노산은 세린, 트레오닌, 발린 또는 알라닌이다. 일부 실시양태에서, 홀 변형은 T366S, L368A, 및/또는 Y407V (EU 넘버링)를 포함하는 2종 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
IV. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 이종다량체 단백질 (예를 들어, 항체)의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내에 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의해) 용이하게 단리 및 서열분석된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 일반적으로, 숙주 세포는 포유동물 기원이다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있고, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 인지될 것이다.
a. 포유동물 숙주 세포를 사용한 이종다량체 단백질의 생성
벡터 성분은 일반적으로 하기 중 1종 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
i. 신호 서열 성분
포유동물 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 바람직하게는 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 포유동물 세포 발현 시, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 목적하는 이종다량체 단백질(들) (예를 들어, 항체)을 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션된다.
ii. 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점은 그것이 오직 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다
iii. 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 적절한 경우에 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 저항성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체 핵산, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 받아들이는데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 우선 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양하는 것에 의해 확인된다. 야생형 DHFR을 사용하는 경우의 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 마커, 예컨대 아미노글루코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418에 대한 선택제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.
iv. 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 목적하는 힌지-함유 폴리펩티드(들) 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 포유동물 세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 포유동물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역으로, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 포유동물 유전자의 3' 말단에 존재한다. 이들 모든 서열이 포유동물 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
예를 들어 포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 목적하는 힌지-함유 폴리펩티드(들) 전사 및 경쇄(들) 전사는, 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성인 한, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터로부터, 또는 열-쇼크 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부를 프로모터로서 사용할 수 있다.
v. 인핸서 요소 성분
포유동물 숙주 세포에 의한 목적하는 힌지-함유 폴리펩티드(들) 및 경쇄(들)를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린 유전자)로부터 공지되어 있다. 또한, 포유동물 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 수 있다. 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 증진시키기 위한 요소의 설명에 대해서는 또한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 증진이 달성되는 한, 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항체 폴리펩티드-코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
vi. 전사 종결 성분
포유동물 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열 또한 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 포유동물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
vii. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 포유동물 세포를 포함한다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 상용 절차가 된 바 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 목적하는 힌지-함유 폴리펩티드(들) 및 경쇄(들) 생산을 위한 상기-기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 안정하게 형질감염된 숙주 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 안정한 세포주이다.
viii. 숙주 세포의 배양
본 발명의 목적하는 힌지-함유 폴리펩티드(들) 및 경쇄(들)를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), (시그마)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
ix. 이종다량체 단백질의 정제
재조합 기술을 사용할 경우에, 경쇄 폴리펩티드와 회합된 힌지-함유 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 힌지-함유 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드가 세포 내에서 생산되는 경우에, 제1 단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 경쇄 폴리펩티드와 회합된 힌지-함유 폴리펩티드가 배지로 분비되는 경우에, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 상기 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 이종다량체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드 ABX(Bakerbond ABX)™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라, 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술이 또한 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 pH 약 2.5-4.5 사이의 용리 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 이종다량체 단백질의 생산은 (임의의 상기 특정한 방법에) 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 용액을 투석하는 것을 포함할 수 있다.
V. 이종다량체 단백질 형성/어셈블리
완전한 이종다량체 단백질의 형성은, 본 발명에서 재폴딩으로 지칭되는, 디술피드 결합 형성에 의한 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 제1 경쇄, 제2 힌지-함유 폴리펩티드, 및 제2 경쇄의 재어셈블리를 수반한다. 재폴딩은, 예를 들어 이중특이적 항체를 형성하기 위한 제1 힌지-함유 폴리펩티드의 제2 힌지-함유 폴리펩티드와의 회합 및 쇄간 디술피드 결합의 형성을 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 이종다량체 단백질의 쇄간 디술피드 결합은 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 힌지 영역 사이에 있다. 본 발명에서 복원으로도 불리는 재폴딩은 시험관내에서 수행된다.
힌지-함유 폴리펩티드 및 회합된 경쇄가 세포로부터 분비되면, 이종다량체화 도메인은 이종다량체 단백질의 회합을 구동할 것이다. 회합된 힌지-함유 폴리펩티드의 쇄간 디술피드 형성이 진행된다. 이어서, 생성된 디술피드 연결된 이종다량체 단백질이 정제된다. 임의로, 이는 연구, 진단, 치료 또는 다른 목적을 위해 제제화될 수 있다.
VI. 표적 분자
본 발명의 이종다량체 단백질에 의해 표적화될 수 있는 분자의 예는 가용성 혈청 단백질 및 그의 수용체 및 다른 막 결합 단백질 (예를 들어, 어드헤신)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 BMPl, BMP2, BMP3B (GDFlO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFl (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFl (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNAl, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBl, IFNG, IFNWl, FELl, FELl (EPSELON), FELl (제타), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TNFSFl0 (TRAIL), TNFSF1l (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILlR1, IL1R2, IL1RL1, LL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILl0RA, ILl0RB, IL1lRA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFl, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2종 또는 그 초과의 시토카인, 시토카인-관련 단백질, 및 시토카인 수용체에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 표적 분자는 CCLl (I- 309), CCL2 (MCP -1 / MCAF), CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP- 3), CCL8 (mcp-2), CCLH (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / 엑소두스-2), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신- 3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLl (GROl), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDFl), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDl), SCYEl, XCLl (림포탁틴), XCL2 (SCM-Ib), BLRl (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCRl (CKRl / HM145), CCR2 (mcp-lRB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBIl), CCR8 (CMKBR8 / TERl / CKR- Ll), CCR9 (GPR-9-6), CCRLl (VSHKl), CCRL2 (L-CCR), XCRl (GPR5 / CCXCRl), CMKLRl, CMKORl (RDCl), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRlO), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / 본조), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPlO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCClO (ClO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFlA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMl, TREM2, 및 VHL로 이루어진 군으로부터 선택된 케모카인, 케모카인 수용체, 또는 케모카인-관련 단백질이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 ABCFl; ACVRl; ACVRlB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLl; AD0RA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AIFl; AIGl; AKAPl; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTl; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCl; AR; AZGPl (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGl; BAIl; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRl (MDR15); BMPl; BMP2; BMP3B (GDFlO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRlA; BMPRlB; BMPR2; BPAGl (플렉틴); BRCAl; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTl; CASP1; CASP4; CAVl; CCBP2 (D6 / JAB61); CCLl (1-309); CCLIl (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-Id); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소두스-2; CCL22 (MDC / STC-I); CCL23 (MPIF- 1); CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Ia); CCL4 (MDP-Ib); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAl; CCNA2; CCNDl; CCNEl; CCNE2; CCRl (CKRl / HM145); CCR2 (mcp-lRB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBIl); CCR8 (CMKBR8 / TERl / CKR-Ll); CCR9 (GPR-9-6); CCRLl (VSHKl); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDlC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDHl (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNlA (p21Wapl/Cipl); CDKNlB (p27Kipl); CDKNlC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERl; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (클라우딘-7); CLN3; CLU (클루스테린); CMKLRl; CMKORl (RDCl); CNRl; COL18A1; COLlAl; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFl (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF);CTLA4; CTNNBl (b-카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYDl); CX3CR1 (V28); CXCLl (GROl); CXCL10 (IP-10); CXCLIl (I-TAC / IP-9); CXCL12 (SDFl); CXCL13; CXCL14;CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 /본조); CYB5; CYCl; CYSLTRl; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLl; DPP4; E2F1; ECGFl; EDGl; EFNAl; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRl; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERlA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFl (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELl (엡실론); FILl (제타); FLJ12584; FLJ25530; FLRTl (피브로넥틴); FLTl; FOS; FOSLl (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBl; GAGECl; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASl; GNRHl; GPR2 (CCRlO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCClO (ClO); GRP; GSN (겔솔린); GSTPl; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFlA; HDPl; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXl ; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAl; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNWl; IGBPl; IGFl; IGFlR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-I; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILlF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HYl; IL1Rl; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILlRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAl; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 인테그린); JAGl; JAKl; JAK3; JUN; K6HF; KAIl; KDR; KITLG; KLF5 (GC 박스 BP); KLF6; KLKlO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (모발-특이적 유형 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); 링고-p75; 링고-트로이; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp ; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBl; 미드카인; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-III); MTSSl; MUCl (뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKBl; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-링고; NgR- Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-트로이; NMEl (NM23A); N0X5; NPPB; NROBl; NR0B2; NRlDl; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPl; NRP2; NT5E; NTN4; ODZl; OPRDl; P2RX7; PAP; PARTl; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMl; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCl; PPBP (CXCL7); PPID; PRl; PRKCQ; PRKDl; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGSl; RGS13; RGS3; RNFIlO (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYEl (내피 단핵구-활성화 시토카인); SDF2; SERPINAl; SERPINA3; SERP1NB5 (마스핀); SERPINEl (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPl; SPRRlB (Sprl); ST6GAL1; STABl; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPlO; TDGFl; TEK; TGFA; TGFBl; TGFBlIl; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRl; TGFBR2; TGFBR3; THlL; THBSl (트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; 조직 인자; TLRlO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIlA; TNFRSFlA; TNFRSFlB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFlO (TRAIL); TNFSFl 1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1BB 리간드); TOLLIP; 톨-유사 수용체; TOP2A (토포이소머라제 Ea); TP53; TPMl; TPM2; TRADD; TRAFl; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMl; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCLl (림포탁틴); XCL2 (SCM-Ib); XCRl(GPR5 / CCXCRl); YYl; 및 ZFPM2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 표적에 결합할 수 있다.
본 발명에 포괄되는 항체의 바람직한 분자 표적 분자는 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, ErbB 수용체 패밀리의 CD200 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 알파v/베타3 인테그린, 예를 들어 그의 알파 또는 베타 서브유닛 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예컨대 VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파IFN); TNF알파, 인터류킨, 예컨대 IL-1베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8, IL-9, IL-13, IL17A/F, IL-18, IL-13R알파1, IL13R알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 (LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체, 및 1) 베타-세크레타제 (BACE1 또는 BACE2), 2) 알파-세크레타제, 3) 감마-세크레타제, 4) 타우-세크레타제, 5) 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 6) 사멸 수용체 6 (DR6), 7) 아밀로이드 베타 펩티드, 8) 알파-시뉴클레인, 9) 파킨, 10) 헌팅틴, 11) p75 NTR, 및 12) 카스파제-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 표적에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 IL-1알파 및 IL-1베타, IL-12 및 IL-18; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL- 25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 효능제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAM8, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-8 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF알파 및 TGF-베타, TNF알파 및 IL-1베타; TNF알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF알파 및 IL-4, TNF알파 및 IL-5, TNF알파 및 IL6, TNF알파 및 IL8, TNF알파 및 IL-9, TNF알파 및 IL-10, TNF알파 및 IL-11, TNF알파 및 IL-12, TNF알파 및 IL-13, TNF알파 및 IL-14, TNF알파 및 IL-15, TNF알파 및 IL-16, TNF알파 및 IL-17, TNF알파 및 IL-18, TNF알파 및 IL-19, TNF알파 및 IL-20, TNF알파 및 IL-23, TNF알파 및 IFN알파, TNF알파 및 CD4, TNF알파 및 VEGF, TNF알파 및 MIF, TNF알파 및 ICAM-1, TNF알파 및 PGE4, TNF알파 및 PEG2, TNF알파 및 RANK 리간드, TNF알파 및 Te38; TNF알파 및 BAFF; TNF알파 및 CD22; TNF알파 및 CTLA-4; TNF알파 및 GP130; TNFα 및 IL-12p40; VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5, VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR(HER1) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTNO2; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; PDL-I 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 표적 분자에 결합한다.
임의로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 그의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체의 경우에, 이들의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수도 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
VII. 활성 검정
본 발명의 이종다량체 단백질은 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능에 대해 특징화될 수 있다.
정제된 이종다량체 단백질은 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광측정법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특징화될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 생산된 이뮤노글로불린은 그의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이뮤노글로불린은 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 관련 기술분야에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 비제한적으로 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA (효소 연결 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용한 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 검정을 포함한다. 예시적인 항원 결합 검정은 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 전부는 아니지만 일부의 이펙터 기능을 보유하는 변경된 항체를 고려하고, 이는 항체의 생체내 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 많은 적용을 위한 목적하는 후보가 되게 한다. 특정 실시양태에서, 생산된 이종다량체 단백질의 Fc 활성을 측정하여 목적하는 특성만이 유지되는 것을 확실하게 한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 이종다량체 단백질에 FcγR 결합이 결여되어 있으나 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결여될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있음을 확실하게 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 예가 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재되어 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 또한, FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
VIII. 접합 단백질
본 발명은 또한 경쇄 또는 중쇄의 불변 영역 중 1개가 화학 분자, 예컨대 염료 또는 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 본원에 기재된 임의의 이종다량체 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체)을 포함하는 접합 단백질, 예컨대 접합 항체 또는 면역접합체 (예를 들어, "항체-약물 접합체", 또는 "ADC")를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 바와 같이, 이종다량체화 도메인을 사용하면 2개의 상이한 중쇄 (HC1 및 HC2) 뿐만 아니라 2개의 상이한 경쇄 (LC1 및 LC2)를 함유하는 항체를 구축할 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 구축된 면역접합체는 중쇄 중 단지 1개 (HC1 또는 HC2) 또는 경쇄 중 단지 1개 (LC1 또는 LC2)의 불변 영역에 접합된 세포독성제를 함유할 수 있다. 또한, 면역접합체는 단지 1개의 중쇄 또는 경쇄에만 부착된 세포독성제를 가질 수 있기 때문에, 대상체에게 투여되는 세포독성제의 양은 중쇄 또는 경쇄 둘 다에 부착된 세포독성제를 갖는 항체의 투여에 비해 감소된다. 대상체에게 투여되는 세포독성제의 양의 감소는 세포독성제와 연관된 유해 부작용을 제한한다.
세포독성제 또는 세포증식억제제, 즉 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 억제하기 위한 약물의 국부 전달을 위한 항체-약물 접합체의 사용 (Syrigos and Epenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999); Niculescu-Duvaz and Springer, Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172 (1997); 미국 특허 번호 4,975,278)은 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 내부의 세포내 축적을 허용하고, 여기서 이들 비접합된 약물 물질의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 야기할 수 있다 (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986):603-605 (1986); Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). 따라서, 최소 독성을 가지면서 최대 효능인 것이 모색된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다가 이들 전략에 유용한 것으로 보고된 바 있다 (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187 (1986)). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986), 상기 문헌). 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신 (Mandler et al., Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)), 및 칼리케아미신 (Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993))을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의해 세포독성 및 세포증식억제성 효과에 영향을 미칠 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성이거나 활성이 작은 경향이 있다.
면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 본원에 (예를 들어, 상기에) 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232를 참조한다. 방사성접합 항체의 생산을 위해 다양한 방사성핵종이 이용가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 예를 들어, WO94/11026을 참조한다.
항체 및 1종 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다. 이러한 소분자 독소에 관한 세부사항은 WO2008/021290에서 제공된다.
i. 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시양태에서, 면역접합체는 1개 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 번호 3,896,111). 이후에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 (i) 발효 또는 화학적 변형 또는 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 비교적 접근가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합시키기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하고, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 그의 치료 용도는 예를 들어 그의 개시내용이 본원에 참조로 명백하게 포함되는 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]은 인간 결장직장암에 대해 지시된 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체를 기재하였다. 상기 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타냈다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]은 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 또 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 기재한다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 세포당 3 x 105개의 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관내에서 시험되었다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시키는 것에 의해 증가될 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시키는 것에 의해 제조된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020 (그의 개시내용은 명백하게 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 항체 분자당 평균 3-4개로 접합된 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 증진시키는 효능을 나타냈지만, 1개 분자의 독소/항체도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증진시킬 것으로 예상된다. 메이탄시노이드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 공지된 기술에 의해 합성될 수 있거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 공개 문헌에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어 그의 개시내용이 명백하게 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,208,020 또는 EP 특허 0 425 235 B1, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)], 및 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0169933에 개시된 것을 비롯한, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한 관련 기술분야에 공지된 많은 연결기가 존재한다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0169933에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 연결기는 상기-확인된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다. 추가의 연결기는 본원에 기재되고 예시되어 있다.
항체 및 마이탄시노이드의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 디술피드 연결을 제공하기 위해 특히 바람직한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 사용한 히드록실 기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
ii. 아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세관 동역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584 (2001)), 항암 (미국 특허 번호 5,663,149) 및 항진균 활성 (Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965 (1998))을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N- (아미노) 말단 또는 C- (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 그 개시내용의 전문이 명백하게 본원에 참조로 포함되는 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," 미국 출원 공개 번호 2005/0238649에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액체 상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides," volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588; 문헌 [Pettit et al., J. Nat. Prod. 44:482-485 (1981); Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 13:47-66 (1998); Poncet, Curr. Pharm. Des. 5:139-162 (1999); 및 Pettit, Fortschr. Chem. Org. Naturst. 70:1-79 (1997)]의 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Doronina, Nat. Biotechnol. 21(7):778-784 (2003)]; 및 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," 미국 출원 공개 번호 2005/0238649 (예를 들어, 링커 및 링커에 접합된 모노메틸발린 화합물, 예컨대 MMAE 및 MMAF의 제조 방법을 개시함)를 참조한다.
iii. 칼리케아미신
다른 실시양태에서, 면역접합체는 1개 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중-가닥 DNA 파괴를 생산할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해, 미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 캄파니(American Cyanamid Company))을 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) 및 아메리칸 시아나미드의 상기 언급된 미국 특허)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항종양 약물은 항폴레이트제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 다 세포내 작용 부위를 갖고, 형질 막을 용이하게 통과하지 않는다. 따라서, 항체 매개 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 그의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.
iv. 다른 세포독성제
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 번호 5,053,394 및 5,770,710에 기재된, 총괄적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 작용제의 패밀리, 뿐만 아니라 에스페라미신 (미국 특허 번호 5,877,296)을 포함한다.
사용할 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다 (예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232 참조).
본 발명은 추가로 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 고려한다.
종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체가 검출을 위해 사용되는 경우에, 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 마찬가지로 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 접합체에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 또는 예를 들어 수소 대신 플루오린-19를 수반하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 아이오도겐 (IODOGEN) 방법 (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))을 사용하여 아이오딘-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]은 다른 방법을 상세하게 기재한다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 예를 들어, WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.) (미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 사용하여 제조된 ADC를 명백하게 고려하나, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 467-498 페이지를 참조한다.
v. 접합 항체의 제조
본 발명의 접합 항체에서, 항체는 임의로 링커를 통해 1개 이상의 모이어티 (예를 들어, 약물 모이어티), 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개의 모이어티에 접합된다. 접합 항체는 (1) 항체의 친핵성 기를 공유 결합을 통해 2가 링커 시약과 반응시킨 후, 관심 모이어티와 반응시키는 것; 및 (2) 모이어티의 친핵성 기를 공유 결합을 통해 2가 링커 시약과 반응시킨 후, 항체의 친핵성 기와 반응시키는 것을 비롯하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용하여 여러 경로로 제조될 수 있다. 접합 항체의 제조를 위한 추가의 방법이 본원에 기재된다.
링커 시약은 1개 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC") 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸)아미노벤조에이트 ("SIAB")를 포함한다. 추가의 링커 성분이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 일부는 본원에 기재된다. 또한, 그의 내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," 미국 출원 공개 번호 2005/0238649를 참조한다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 자연 발생한 것 뿐만 아니라 소수의 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정한 효소, 예를 들어 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 그의 선택성에서 설계되고 최적화될 수 있다.
항체 상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 리신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노 기 (여기서 항체는 글리코실화됨)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실 기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기를 비롯한 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 가교를 갖는다. 환원제, 예컨대 DTT (디티오트레이톨)에 의한 처리에 의해 항체를 링커 시약과의 접합에 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 가교는 이론적으로 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민의 티올로의 전환을 발생시키는, 리신과 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통해 추가의 친핵성 기를 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올 기는 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 1개 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편)에 도입할 수 있다.
본 발명의 접합 항체는 또한 링커 시약 또는 약물 또는 다른 모이어티 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위해 항체의 변형에 의해 생산될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당은 예를 들어 퍼아이오데이트 산화 시약에 의해 산화되어, 링커 시약 또는 약물 또는 다른 모이어티의 아민 기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 보로히드라이드 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 소듐 메타-퍼아이오데이트와 반응시켜, 약물 또는 다른 모이어티 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기를 단백질 내에 생성할 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 소듐 메타-퍼아이오데이트와 반응시켜, 제1 아미노산 대신 알데히드의 생산을 발생시킬 수 있다 (Geoghegan and Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138-146 (1992); 미국 특허 번호 5,362,852). 이러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 모이어티 (예컨대 약물 모이어티) 상의 친핵성 기는 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; 및 (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기를 비롯한 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된, 접합체의 2개 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는, 항체-수용체 접합체를 개체에게 투여한 후 미결합 접합체를 제거제를 사용하여 순환으로부터 제거하고 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)와 접합되는 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여하는 종양 예비-표적화에 사용하기 위해, "수용체" (예컨대, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다.
IX. 유용성
본원에 제공된 본 발명의 방법은 이종다량체 단백질의 생산에서 산업적 적용성이 발견된다. 본 발명의 방법은 2종의 개별 발효에 고유한 기술적 곤란을 감소시킴으로써 2종의 개별 발효 및 단리에 수반되는 작업의 양을 감소시킨다. 또한, 상기 방법 절차의 어닐링 및 산화환원 단계의 제거는 수율을 증가시키고, 처리의 복잡성 및 비용을 감소시킬 수 있다.
본원에 기재된 이종다량체 단백질은, 예를 들어 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 용도가 발견된다. 본 발명은 이들 분자 중 1종 이상을 사용하는 것을 기반으로 하는 다양한 방법을 제공한다. 특정 병리학적 상태에서, 이종다량체 단백질, 예를 들어 다중특이적 항체를 사용하는 것이 필요하고/거나 바람직하다. 본 발명은 다양한 목적을 위해, 예를 들어 치료제, 예방제 및 진단제로서 사용될 수 있는 이들 이종다량체 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 이종다량체 단백질을 투여하여 질환을 치료하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법을 제공한다. 본원에 기재된 본 발명의 임의의 이종다량체 단백질은 본원에 기재된 치료 (또는 예방 또는 진단) 방법에 사용될 수 있다.
예를 들어, 이종다량체 단백질이 다가인 경우에, 가치있는 이익은 그들이 그의 항원에 대해 취하는 증진된 결합력이다. 항원 기준 결합 단위 (즉, Fab)에 대해 내재적 고친화도를 갖는 것에 더하여, 통상의 IgG 항체는 또한 표적에 대한 2가 결합의 결과로서 항원과의 회합을 증가시키는 결합력 효과를 활용한다.
동일한 항원 분자 상의 2개의 개별 에피토프에 대해 지시된 이종다량체 단백질은 (2가 결합으로 인해) 증진된 결합력의 이익을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 모 항체 중 어느 것과도 회합되지 않는 신규 특성을 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이종다량체 단백질은, 예를 들어 수용체-리간드 상호작용을 차단하는데 용도가 발견된다.
본원에 기재된 이종다량체 단백질은 또한 1개의 분자로 2개의 표적의 신호전달 경로를 동시에 차단하는 적용에서 용도가 발견된다.
X. 치료 용도
본원에 기재된 이종다량체 단백질, 예컨대 항체 및 항체 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체 및/또는 그의 단편)은 치료 용도를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 이종다량체 단백질은 전암성, 비-전이성, 전이성, 및 암성 종양 (예를 들어, 초기 단계 암)을 비롯한 종양의 치료, 알레르기성 또는 염증성 장애의 치료, 또는 자가면역 질환의 치료, 또는 암 (예를 들어, 유방암, 결장직장암, 폐암, 신세포 암종, 신경교종, 또는 난소암), 알레르기성 또는 염증성 장애, 또는 자가면역 질환이 발생할 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있다.
용어 암은 전암성 성장, 양성 종양 및 악성 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 증식성 장애의 집합을 포괄한다. 양성 종양은 기원 부위에 국한되어 유지되고, 원위 부위로 침윤, 침습, 또는 전이하는 능력을 갖지 않는다. 악성 종양은 그 주변의 다른 조직에 침습하여 손상시킬 것이다. 이들은 또한 통상적으로는 혈류를 통해 또는 림프절이 위치한 림프계를 통해 이들이 시작된 곳으로부터 분리되어 신체의 다른 부분으로 확산하는 (전이하는) 능력을 획득할 수 있다. 원발성 종양은 이들이 발생한 조직의 유형에 의해 분류되고; 전이성 종양은 암 세포가 유래된 조직 유형에 의해 분류된다. 시간의 경과에 따라, 악성 종양 세포는 더욱 비정상적으로 되고 정상 세포와 달라진다. 암 세포의 외양에 있어서의 이러한 변화를 종양 등급이라 부르고, 암 세포는 고-분화, 중간-분화, 저-분화 또는 미분화로 기재된다. 고-분화 세포는 매우 정상으로 보이고, 그들이 유래된 정상 세포와 유사하다. 미분화 세포는 세포의 기원을 더이상 결정할 수 없을 정도로 비정상적이 된 세포이다.
종양은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연부 조직 종양일 수 있다. 연부 조직 종양의 예는 백혈병 (예를 들어, 만성 골수 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성인 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성숙 B-세포 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전림프구성 백혈병 또는 모발상 세포 백혈병), 또는 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종 또는 호지킨병)을 포함한다. 고형 종양은 혈액, 골수 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암을 포함한다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 것 및 비-상피 세포 기원의 것으로 추가로 분리될 수 있다. 상피 세포 고형 종양의 예는 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식 기관, 비뇨 기관, 방광, 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피 기원의 고형 종양은 육종, 뇌 종양 및 골 종양을 포함한다.
상피암은 일반적으로 양성 종양에서 침습전 단계 (예를 들어, 상피내 암종)로, 기저막을 침투하고 상피하 기질을 침습하는 악성 암으로 진화한다.
다중특이적 단백질 복합체는 또한 이들 치료 용도에 사용될 수 있고, HER2에 결합하는 항체는 특히 유방암, 결장직장암, 폐암, 신세포 암종, 신경교종, 또는 난소암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 제공받을 후보인 다른 대상체는 섬유혈관 조직의 비정상적 증식, 여드름 장미증, 후천성 면역결핍 증후군, 동맥 폐쇄, 아토피성 각막염, 박테리아성 궤양, 베체트병, 혈액계 종양, 경동맥 폐쇄성 질환, 맥락막 신생혈관화, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 콘택트 렌즈 과도착용, 각막 이식편 거부, 각막 신생혈관화, 각막 이식 신생혈관화, 크론병, 일스병, 유행성 각결막염, 진균 궤양, 단순 포진 감염, 대상 포진 감염, 고점도 증후군, 카포시 육종, 백혈병, 지질 변성, 라임병, 변연 각질용해, 무렌 궤양, 나병 이외의 미코박테리움 감염, 근시, 안구 신생혈관 질환, 시신경 유두소와, 오슬러-웨버 증후군 (오슬러-웨버-랑뒤), 골관절염, 파제트병, 주변부 포도막염, 유천포창, 플릭텐증, 다발동맥염, 레이저후 합병증, 원충 감염, 탄성섬유 가성황색종, 건성 익상편 각막염, 방사상 각막절개술, 망막 신생혈관화, 미숙아 망막병증, 수정체후 섬유증식증, 사르코이드, 공막염, 겸상 적혈구성 빈혈, 쇼그렌 증후군, 고형 종양, 스타가르트병, 스티븐 존슨병, 상윤부 각막염, 매독, 전신 루푸스, 테리엔 변연 각막변성, 톡소플라스마증, 유잉 육종의 종양, 신경모세포종의 종양, 골육종의 종양, 망막모세포종의 종양, 횡문근육종의 종양, 궤양성 결장염, 정맥 폐쇄, 비타민 A 결핍, 베게너 사르코이드증, 당뇨병과 연관된 목적하지 않는 혈관신생, 기생충성 질환, 비정상적 상처 치유, 수술, 손상 또는 외상 (예를 들어, 급성 폐 손상/ARDS) 후 비대, 모발 성장의 억제, 자궁에서의 배란 및 황체 형성의 억제, 착상의 억제 및 배아 발생의 억제를 갖거나, 또는 이것으로 발전할 위험이 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체를 사용하여 치료될 수 있는 알레르기성 또는 염증성 장애 또는 자가면역 질환 또는 장애의 예는 관절염 (류마티스 관절염, 예컨대 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 소아-발병 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형성 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직성 척추염), 염증성 과다증식성 피부 질환, 건선, 예컨대 판상 건선, 적상 건선, 농포성 건선, 및 손발톱 건선, 피부염, 예를 들어 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 포진성 피부염, 및 아토피성 피부염, x-연관 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예컨대 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 다발근염/피부근염, 소아 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 경피증 (전신 경피증 포함), 경화증, 예컨대 전신 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예컨대 척수-시신경 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신 경화증, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 및 운동실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 자가면역-매개 위장 질환, 결장염, 예컨대 궤양성 결장염, 궤양성 결장염, 현미경적 결장염, 콜라겐성 결장염, 폴립성 결장염, 괴사성 소장결장염, 및 경벽성 결장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 괴저성 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액 장애, 류마티스 척추염, 돌발성 난청, IgE-매개 질환, 예컨대 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예컨대 라스무센 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예컨대 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아종성 포도막염, 비육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 후방 포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신증후군을 동반하거나 동반하지 않는 사구체신염 (GN), 예컨대 만성 또는 급성 사구체신염, 예컨대 원발성 GN, 면역-매개 GN, 막성 GN (막성 신병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신병증, 막- 또는 막성 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 제I형 및 제II형, 및 급속 진행성 GN, 알레르기성 상태, 알레르기 반응, 습진, 예를 들어 알레르기성 또는 아토피성 습진, 천식, 예컨대 기관지 천식, 기관지 천식, 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 상태, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신 홍반성 루푸스, 예컨대 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (신염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원판상, 탈모증 포함), 소아 발병 (제I형) 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 성인 발병 당뇨병 (제II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종성 육아종증, 베게너 육아종증, 무과립구증, 혈관염, 예를 들어 혈관염 (대혈관 혈관염 (류마티스성 다발근육통 및 거대 세포 (다카야스) 동맥염 포함), 중혈관 혈관염 (가와사키병 및 결절성 다발동맥염 포함), 현미경적 다발동맥염, CNS 혈관염, 괴사성, 피부, 또는 과민성 혈관염, 전신 괴사성 혈관염, 및 ANCA-연관 혈관염, 예컨대 처그-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS) 포함), 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (빈혈 악성), 애디슨병, 순수 적혈구 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍, A형 혈우병, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 수반하는 질환, CNS 염증성 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 예컨대 패혈증, 외상 또는 출혈에 속발성인 것, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 항인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트(Bechet) 또는 베체트(Behcet)병, 캐슬만 증후군, 굿패스쳐 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 유천포창, 예컨대 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 천포창 점액-막 유천포창, 및 홍반성 천포창 포함), 자가면역 다발내분비병증, 라이터병 또는 증후군, 면역 복합체 신염, 항체-매개 신염, 시신경척수염, 다발신경병증, 만성 신경병증, 예컨대 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 혈소판감소증 (예를 들어, 심근경색 환자에 의해 발생되는 바와 같음), 예를 들어 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증, 예컨대 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 고환 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예컨대 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브스병, 다선성 증후군, 예컨대 자가면역 다선성 증후군 (또는 다선성 내분비병증 증후군), 부신생물성 증후군, 예를 들어 신경계 부신생물성 증후군, 예컨대 램버트-이튼 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 강직-인간 또는 강직-사람 증후군, 뇌척수염, 예컨대 알레르기성 뇌척수염 또는 뇌척수염 알레르기 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예컨대 흉선종-연관 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근긴장증, 안진전 또는 안진전 근간대성경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 쉬한 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프성 간질성 폐장염, 폐쇄성 세기관지염 (비-이식) vs NSIP, 길랑-바레 증후군, 베르게르병 (IgA 신병증), 특발성 IgA 신병증, 선상 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변증, 폐경변증, 자가면역 장병증 증후군, 복강 질환, 복강 질환, 복강 스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예컨대 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청각 상실, 안진전 근간대성경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예컨대 불응성 또는 재발성 다발연골염, 폐 폐포 단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증, 예를 들어 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 의미 불명 모노클로날 감마글로불린병증, MGUS), 말초 신경병증, 부신생물성 증후군, 채널병증, 예컨대 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근병증, 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비 안병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역 간 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축, 초로기 치매, 탈수초성 질환, 예컨대 자가면역 탈수초성 질환, 당뇨병성 신병증, 드레슬러 증후군, 원형 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 수지경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합 결합 조직 질환, 샤가스병, 류마티스성 열, 반복 유산, 농부 폐, 다형성 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱 증후군, 조류 사육자 폐, 알레르기성 육아종성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예컨대 알레르기성 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈마니아증, 키파노소마증, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘프터 증후군, 카플란 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 미만성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 안내염, 장기 융기성 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 사상충증, 모양체염, 예컨대 만성 모양체염, 이색성 모양체염, 홍채모양체염, 또는 푸크스 모양체염, 헤노흐-쉔라인 자반증, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병, 파르보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 볼거리, 에반 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시데남 무도병, 스트렙토코쿠스 감염후 신염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수로, 맥락막염, 거대 세포 다발근육통, 내분비 안병증, 만성 과민성 폐장염, 건성 각결막염, 유행성 각결막염, 특발성 신염성 증후군, 미세 변화 신병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애, 무정액증, 자가면역 용혈, 뵈크병, 한랭글로불린혈증, 듀피트렌 구축, 수정체과민성 안내염, 알레르기성 장염, 나병성 결절성 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 함만-리치병, 감각신경성 청각 상실, 발작성 혈색소뇨, 생식선기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구감소증, 감염성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액수종, 신증, 교감신경성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저성 농피증, 퀘르뱅 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항정자 항체로 인한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바르 바이러스- 연관 질환, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 기생충성 질환, 예컨대 리슈마니아, 독성-충격 증후군, 식중독, T 세포의 침윤을 수반하는 상태, 백혈구-부착 결핍, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역 다발내분비병증, 난소염, 원발성 점액수종, 자가면역 위축성 위염, 교감신경성 안염, 류마티스성 질환, 혼합 결합 조직 질환, 신증후군, 췌도염, 다발내분비 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다선성 증후군 제I형, 성인-발병 특발성 부갑상선기능저하증 (AOIH), 전두 탈모증, 확장성 심근병증, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골, 전두, 상악, 또는 접형 부비동염, 호산구-관련 장애, 예컨대 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가증-근육통 증후군, 뢰플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구 함유 육아종, 아나필락시스, 혈청음성 척추관절염, 다발내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 영아기 일과성 저감마글로불린혈증, 비스코트-알드리치 증후군, 모세혈관확장성 운동실조, 콜라겐 질환과 연관된 자가면역 장애, 류마티즘, 신경계 질환, 허혈성 재관류 장애, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능장애, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 뇌 허혈, 및 혈관화 동반 질환, 알레르기성 과민성 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증 요인을 갖는 피부염, 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추 신경계 염증성 장애, 안구 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-연관 증후군, 시토카인-유발 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경변증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 대-동맥 장애, 동맥내막 증식증, 소화성 궤양, 판막염, 및 자궁내막증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 용도에 더하여, 본 발명의 항체는 진단 방법, 예컨대 본원에 기재된 질환 및 상태의 진단 방법을 비롯한 다른 목적에 사용될 수 있다.
XI. 투여량, 제제 및 지속시간
본 발명의 단백질은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 대상체의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 의료 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여되는 단백질의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이고, 특정한 장애 (예를 들어, 암, 알레르기성 또는 염증성 장애, 또는 자가면역 장애)의 예방, 개선 또는 치료를 위해 필요한 최소량이다. 단백질은 그러할 필요는 없지만, 임의로는 장애의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 단백질의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 상기 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 이전에 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다. 일반적으로, 암의 완화 또는 치료는 암과 연관된 1종 이상의 증상 또는 의료 문제를 감소시키는 것을 수반한다. 치료 유효량의 약물은 암 세포의 수를 (적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 초과만큼) 감소시키고/거나; 종양 크기 또는 종양 부담을 감소 또는 억제하고/거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제하고/거나 (즉, 어느 정도까지 감소시키고/거나 중지시킴); 선종의 경우에 호르몬 분비를 감소시키고/거나; 혈관 밀도를 감소시키고/거나; 종양 전이를 억제하고/하거나; 종양 성장을 감소 또는 억제하고/거나; 암과 연관된 증상 중 1종 이상을 어느 정도까지 경감시키는 것 중 하나 또는 그의 조합을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 대상체에서 암 또는 자가면역 장애의 발생 또는 재발을 예방하기 위해 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 암 또는 자가면역 장애에 감수성이거나 이 장애로 진단된 인간 대상체의 생존 기간을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 생존 기간은 약물의 제1 투여에서 사망까지의 시간으로 정의된다. 생존 기간은 또한 치료 동안 대상체의 사망 위험을 나타내는 치료군 대 대조군의 계층화된 위험 비 (HR)에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 치료는 다양한 항암 요법으로 치료되는, 암에 감수성이거나 암으로 진단된 인간 대상체의 군에서 반응률을 유의하게 증가시킨다. 반응률은 치료에 반응한 치료된 대상체의 백분율로서 정의된다. 한 측면에서, 본 발명의 단백질, 및 수술, 방사선 요법 또는 1종 이상의 화학요법제를 사용한 본 발명의 조합 치료는 수술, 방사선 요법, 또는 화학요법 단독으로 치료된 군과 비교하여 치료된 대상체 군에서 반응률을 유의하게 증가시키고, 증가는 0.005 미만의 카이-제곱 p-값을 갖는다. 암 치료에서 치료 효능의 추가의 측정은 미국 특허 출원 공개 번호 20050186208에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 생상된 이종다량체 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 치료 제제는 목적하는 순도를 갖는 활성 성분을 임의적인 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 관련 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조한다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 허용되는 담체는 염수, 또는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 PEG를 포함한다.
임의로, 그러나 바람직하게는, 제제는 제약상 허용되는 염, 바람직하게는 염화나트륨을, 바람직하게는 약 생리학적 농도로 함유한다. 임의로, 본 발명의 제제는 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존제 농도는 0.1 내지 2.0%, 전형적으로 v/v의 범위이다. 적합한 보존제는 제약 기술분야에 공지된 것을 포함한다. 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤 및 프로필파라벤이 바람직한 보존제이다. 임의로, 본 발명의 제제는 제약상 허용되는 계면활성제를 0.005 내지 0.02%의 농도로 포함할 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 1종 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 이종다량체 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 반면에, 특정 히드로겔은 단백질을 보다 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 이종다량체 단백질(들)이 장시간 동안 신체에 남아 있는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로서 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변화가 야기될 수 있다. 수반되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 이종다량체 단백질, 예컨대 다중특이적 항체)은 공지된 방법, 예컨대 정맥내 투여에 따라 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 인간 대상체에게 투여된다. 광범위한 부작용 또는 독성이 단백질에 의해 인식되는 표적 분자에 대한 길항작용과 연관되는 경우에, 국부 투여가 특히 바람직할 수 있다. 치료 용도를 위해 생체외 전략을 또한 사용할 수 있다. 생체외 전략은 대상체로부터 수득한 세포를 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염 또는 형질도입시키는 것을 수반한다. 이어서, 형질감염 또는 형질도입된 세포를 대상체에게 되돌린다. 세포는 비제한적으로 조혈 세포 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포 또는 B 세포), 섬유모세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포 또는 근육 세포를 비롯한 임의의 광범위한 유형일 수 있다.
한 예에서, 장애 또는 종양의 위치가 허용하는 경우에 단백질 복합체는 (예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 이종다량체 단백질, 예컨대 다중특이적 항체)는 예를 들어 직접 주사에 의해 국부로 투여되고, 주사는 주기적으로 반복될 수 있다. 또한 국부 재발 또는 전이를 예방 또는 감소시키기 위해 단백질 복합체는 대상체에게 전신 전달될 수 있거나 또는 종양 세포에, 예를 들어 종양에 또는 종양의 외과적 절제 후 종양 층에 직접 전달될 수 있다.
XII. 제조 물품
본 발명의 또 다른 실시양태는 본원에 기재된 1종 이상의 이종다량체 단백질, 및 장애 (예를 들어, 자가면역 질환 또는 암)의 치료 또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 상태를 치료하는데 효과적인 조성물을 수용하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 이종다량체 단백질 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용됨을 표시한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 대상체에게 이종다량체 단백질 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 조합 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
패키지 삽입물은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 담긴 이러한 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함된 지침서를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 패키지 삽입물은 조성물이 유방암, 결장직장암, 폐암, 신세포 암종, 신경교종, 또는 난소암을 치료하기 위해 사용됨을 나타낸다.
추가적으로, 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 및 사용자 관점에서 고려되는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 다양한 목적, 예를 들어 세포로부터 항원의 정제 또는 면역침전에 유용한 키트가 제공된다. 항원의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 이종다량체 단백질을 함유할 수 있다. 시험관내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 항원의 검출 및 정량화를 위한 이종다량체 단백질(들)을 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조 물품과 마찬가지로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 적어도 1개의 이종다량체 단백질 (예를 들어, 다중특이적 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 조성물을 수용한다. 예를 들어 희석제 및 완충제 또는 대조군 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물의 설명 뿐만 아니라 의도되는 시험관내 또는 진단 용도에 대한 지침을 제공할 수 있다.
상기 기재된 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있을 만큼 충분한 것으로 간주된다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이고, 첨부된 청구범위 내에 속할 것이다.
하기 실험 개시내용에서, 하기 약어가 적용된다: eq (당량); M (몰); μM (마이크로몰); N (노르말); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); kg (킬로그램); μg (마이크로그램); L (리터); ml (밀리리터); μl (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); μm (마이크로미터); nm (나노미터); ℃. (섭씨 온도); h (시간); min (분); sec (초); msec (밀리초); ADCC (항체-의존성 세포성 세포독성)); BsAb (이중특이적 항체); CL (경쇄의 불변 도메인); CH (중쇄의 불변 도메인); CMC (보체-매개 세포독성); Fab (항원 결합 단편); Fc (결정화 단편); Fv (가변 단편 (VL+VH)); EGFR (표피 성장 인자 수용체); HC (중쇄); IGFR (인슐린-유사 성장 인자 수용체); LC (경쇄); scFv (단일쇄 가변 단편 (아미노산 링커에 의해 테더링된 VL 및 VH); VEGF (혈관 내피 성장 인자); VEGFR2 (혈관 내피 성장 인자 수용체 2); VH (가변 중쇄 도메인); VL (가변 경쇄 도메인).
실시예
본 발명은 하기 실시예에 추가로 상세하게 기재되며, 이는 청구된 바와 같은 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 첨부된 도면은 본 발명의 명세서 및 설명의 필수 부분으로서 간주되어야 한다는 것을 의미한다. 인용된 모든 참고문헌은 그에 기재된 모든 것이 구체적으로 본원에 참조로 포함된다. 하기 실시예는 예시하기 위해 제공되며, 청구된 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: 배합된 세포 배양물에서 이중특이적 항체의 단량체 성분의 몰비는 세포:세포 비를 조정하는 것에 의해 제어될 수 있다
하기 실시예는 각각 노브 절반 항체 또는 홀 절반 항체를 발현하는 2종의 포유동물 세포주 (CHO 세포)를 동일한 배양에서 성장시킨 경우의 노브 및 홀 절반 항체의 몰비를 보여준다.
생산 연구를 수행하여 각각의 세포주에 대해 생산 역가 (즉, 이종이량체, 동종이량체 및 단량체 절반 항체를 비롯한 세포에 의해 생산된 항체의 총량)를 결정하였다. 개별 세포주에 대한 생산 역가 데이터가 이용가능해질 때까지 개별 세포주를 시드 트레인 배지에서 3 또는 4일마다 계대배양하였다.
이어서 2종의 세포주를 성장시키고, 개별 배양에서 노브 절반 항체 또는 홀 절반 항체를 발현하도록 유도하였다. 개별 노브 및 홀 세포주 배양을 40mL 부피의 진탕 플라스크 내에서 시드 트레인 배지에서 3 또는 4일마다 계대배양하였다. 배양물을 배합한 날, 바이셀(Vicell) (베크만 쿨터(Beckman Coulter))을 통해 세포 카운트를 측정하였다.
이어서 개별 배양물을 특정 노브 숙주 세포:홀 숙주 세포 비로 배합하였다. 노브 숙주 세포:홀 숙주 세포 비는 개별 세포주에 대해 공지된 생산 역가에 기초하여 계산하였다. 각각의 소규모 생산의 경우에, 약 40x106개의 세포가 필요하였다. 바이셀 카운트 (세포/mL)를 사용하여, 목적하는 노브 숙주 세포:홀 숙주 세포 비를 달성하기 위해 배합된 배양물에 첨가될 필요가 있는 각각의 세포주의 부피를 결정할 수 있었다. 각각의 노브 및 홀 세포주의 적절한 부피를 새로운 진탕 플라스크에서 생산 배지 중 40mL의 최종 부피로 배합하였다.
수거 15시간 전에, 글루타티온 (GSH)을 400mM 숙신산 중 1M 아르기닌 (pH=9.0)으로 250mM의 최종 GSH 스톡 농도로 용해시킴으로써 GSH 스톡 용액을 제조하였다. GSH의 최종 농도가 15mM이 되도록 GSH 스톡 용액을 생산 배양에 첨가하였다. 이어서 배합된 배양 배지를 수거하고, 각각의 배합된 배양물에 대한 % 노브 절반 항체 및 % 홀 절반 항체를 환원 조건 하에서 역상을 통해 결정하였다. 시험된 각각의 비에 대해 형성된 % 공유 이중특이적 항체를 도 2에 기재된 바와 같이 결정하였다.
이들 실험을 하기 노브 절반 항체/홀 절반 항체 쌍을 사용하여 수행하였다:
항-표적 A (노브) / 항-표적 B (홀)
항-표적 C (노브) / 항-표적 D (홀)
항-표적 D (노브) / 항-표적 C (홀)
항-표적 E (노브) / 항-표적 F (홀)
이들 실험의 결과를 하기 표 2에 제공한다:
<표 2>
Figure 112016107007220-pct00003
*N/D = 결정되지 않음.
표 2에 제시된 바와 같이, % 공유 이중특이적 항체의 수율은 노브 절반 항체:홀 절반 항체의 몰비가 약 1:1이거나 그에 가까운 경우에 개선되었다. 이중특이체 형성을 위한 최적의 몰비는 각각의 특이적 이중특이적 항체에 대해 결정될 수 있을 것이다. 1:1 노브 절반 항체:홀 절반 항체 몰비를 생산하는 노브 숙주 세포:홀 숙주 세포 비는 세포주에 따라 달라지고, 실험적으로 결정된다.
실시예 2: 배합된 세포 배양물에서 이중특이적 항체를 생산하는 동안 환원제의 첨가 시간 및 첨가되는 환원제의 농도를 달리함
하기 실시예는 항-표적 A (노브) 및 항-표적 B (홀)를 포함하는 이중특이적 항체의 생산의 상이한 단계 동안의 환원제의 첨가를 보여준다. 항-표적 A (노브) 또는 항-표적 B (홀)를 발현하는 2종의 포유동물 세포주를 초기에 성장시키고, 개별 배양에서 노브 절반 항체 또는 홀 절반 항체를 발현하도록 유도한 다음, 상기 기재된 바와 같이 항-표적 A (노브):항-표적 B (홀)의 1:1 몰비를 달성하도록 다중 개별 생산 배양으로 배합하였다. GSH 스톡 용액을 수거 24시간, 15시간, 또는 4시간 전에 2mM, 4mM, 또는 10mM의 최종 농도로 생산 배양에 첨가하거나, 배양을 비처리로 두었다. 이어서 각각의 생산 배양으로부터 배합된 배양 배지를 수거하고, 각각의 배합된 배양물에 대한 % 노브 절반 항체 및 % 홀 절반 항체를 환원 조건 하에서 역상을 통해 결정하였다. 시험된 각각의 비에 대해 형성된 % 공유 이중특이적 항체를 도 2에 기재된 바와 같이 결정하였다.
도 3에 제시된 바와 같이, 10mM의 최종 GSH 농도를 갖는 생산 배양에서의 공유 이중특이적 항체의 수율은 2 mM 또는 4 mM의 최종 GSH 농도를 갖는 생산 배양 또는 비처리 대조군에서의 이중특이적 항체의 수율과 비교하여 개선되었다. GSH를 첨가하는 생산 단계는 공유 이중특이적 항체의 수율에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다.
추가 실험에서, 항-표적 A (노브) 또는 항-표적 B (홀)를 발현하는 세포주를 초기에 성장시키고, 개별 배양에서 노브 절반 항체 또는 홀 절반 항체를 발현하도록 유도한 다음, 상기 기재된 바와 같이 항-표적 A (노브):항-표적 B (홀)의 0.82:1 몰비 또는 1:1 몰비를 달성하도록 다중 개별 생산 배양물로 배합하였다. GSH 스톡 용액을 수거 15시간 전에 5mM 또는 10mM의 최종 농도로 생산 배양에 첨가하거나 또는 비처리하였다 ("0 mM"). 각각의 배합된 세포 배양물의 세포 생존율을 수거 시 결정한 다음, 도 2에 제시된 바와 같은 이온 교환 검정을 통해 시험된 각각의 조건 하에 형성된 % 이중특이적 항체를 결정하였다. 실험의 결과를 하기 표 3에 제시한다.
<표 3>
*역가는, 예를 들어 동종이량체, 이종이량체, 및 단량체 절반 항체를 비롯하여, 배합된 배양물에서 2종의 세포주에 의해 생산된 항체의 총량을 지칭한다.
표 3에 제시된 바와 같이, 10mM의 최종 GSH 농도를 갖는 생산 배양에서의 공유 이중특이적 항체의 수율은 5 mM의 최종 GSH 농도를 갖거나 또는 비처리된 생산 배양에서의 이중특이적 항체의 수율과 비교하여 개선되었다. 10 mM까지의 최종 농도로의 배합된 세포 배양물에의 GSH의 첨가는 세포 생존율 또는 전체 항체 생산에 영향을 미치는 것으로 관찰되지 않았다. 원치않는 혼합 디술피드 형성 또는 단백질 스크램블링은 10 mM의 GSH에서 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
각각 항-표적 D (노브) 또는 항-표적 C (홀)를 발현하는 2종의 다른 포유동물 세포주를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 2종의 세포주를 초기에 성장시키고, 개별 배양에서 항-표적 D (노브) 또는 항-표적 C (홀)를 발현하도록 유도한 다음, 상기 기재된 바와 같이 항-표적 D (노브):항-표적 C (홀)의 0.82:1 몰비를 달성하도록 다중 개별 생산 배양물로 배합하였다. GSH 스톡 용액을 수거 15시간 전에 10mM, 15mM, 또는 20mM의 최종 농도로 생산 배양에 첨가하거나 또는 비처리하였다 ("0 mM"). 각각의 배합된 세포 배양물의 세포 생존율을 수거 시 결정한 다음, 도 2에 제시된 바와 같이 시험된 각각의 조건 하에 형성된 % 이중특이적 항체를 결정하였다. 이들 실험의 결과를 하기 표 4에 제시한다.
<표 4>
*역가는 단백질 A 칼럼에 의해 포획된, 예를 들어 동종이량체, 이종이량체, 및 단량체 절반 항체를 비롯한, 배합된 배양물에서 2종의 세포주에 의해 생산된 항체의 총량을 지칭한다.
표 4에 제시된 바와 같이, 20mM의 최종 GSH 농도를 갖는 생산 배양에서의 공유 이중특이적 항체의 수율은 10 mM 또는 15 mM의 최종 GSH 농도를 갖거나 또는 비처리된 생산 배양에서의 이중특이적 항체의 수율과 비교하여 개선되었다. 20 mM까지의 최종 농도로의 배합된 세포 배양물에의 GSH의 첨가는 역가에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. 그러나 GSH를 20mM의 최종 농도로 생산 배양에 첨가한 경우에, GSH에 의한 절반 항체의 공유 변형이 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 3: 시험관내 어셈블리와 비교하여 배합된 배양 배지에서 형성된 이중특이적 항체의 수율
항-표적 E (노브) 및 항-표적 F (홀)를 사용하여 추가의 실험을 수행하여, 항-표적 E를 발현하는 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포) 및 항-표적 F를 발현하는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 배합된 배양물에 의해 수득되는 이중특이적 항체의 수율을 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제된 항-표적 E (노브)와 정제된 항-표적 F (홀)를 시험관내에서 배합하는 것에 의해 수득되는 이중특이적 항체의 수율과 비교하였다. 간략하게, 각각 항-표적 E (노브) 또는 항-표적 F (홀)를 발현하는 2종의 포유동물 세포주를 초기에 성장시키고, 개별 배양에서 노브 절반 항체 또는 홀 절반 항체를 발현하도록 유도하였다. 이어서 개별 배양을 합하고, 추가의 시간 동안 성장시켰다. 배합된 배양 배지를 수거한 다음, 형성된 % 이중특이적 항체를 도 2에 제시된 바와 같은 양이온 교환 검정을 통해 결정하였다. 병행하여 시험관내에서 정제된 항-표적 E (노브) 및 항-표적 F (홀)를 배합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다 (예를 들어, WO2013/055958 참조). 둘 다의 조건 하에 형성된 이중특이적 항체의 최종 수율은 대등하였다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 4: 이중특이체 생산
항-표적 G (노브) 및 항-표적 H (홀)를 사용하여 추가의 실험을 수행하여, 항-표적 G를 포함하는 정제된 항-표적 G 절반 항체/항-표적 G 동종이량체의 제제 및 항-표적 H를 포함하는 정제된 항-표적 H 절반 항체/항-표적 H 동종이량체의 제제로부터 이중특이적 항-표적 G/항-표적 H 항체가 형성될 수 있는지 여부를 시험하였다. 상기 기재된 바와 같이, 절반 항체 항-표적 G (노브)를 일시적으로 발현하는 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포) 및 절반 항체 항-표적 H (홀)를 일시적으로 발현하는 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 개별 배양을 성장시키고, 수거하였다.
각각의 절반 항체를 5mL 맙슈어(MabSURE) 셀렉트 단백질 A 칼럼 상에서 포획하였다. 이어서 칼럼을 10 칼럼 부피 (CV)의 하기 완충제: 50 mM 트리스 pH 8.0, 150mM NaCl, 0.05% 트리톤 X-100, 0.05% 트리톤 X-114로 이루어진 평형 완충제, 25mM 시트르산나트륨 pH 6.0으로 이루어진 세척 완충제로 세척하였다. 각각의 아암을 0.15 M 아세트산나트륨 pH 2.7로 용리시켰다. 각각의 절반 항체의 정체는 MS에 의해 확인하였다.
이중특이체의 경우에, 각각의 절반 항체를 1:10 1M 트리스 아르기닌 pH 9.0을 사용하여 pH 5.0까지 독립적으로 적정한 다음, 1:1의 비로 함께 합하였다. 이어서 혼합물을 1:10 1M 트리스 아르기닌 pH 9.0을 사용하여 pH 8.5로 적정하고, 과량의 새롭게 제조한 0.5M 환원 L-글루타티온 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich))을 1:200의 몰비로 첨가한 후 3일 동안 실온에 두었다. 반응을 이중특이적 ID에 대해 MS에 의해 체크하였다.
노브 및 홀 포획 풀을 4-20% 트리스-글리신 SDS PAGE 상에서 전개시켜, 각각의 포획 풀에서의 절반 항체 및 동종이량체의 분자량에 상응하는 밴드의 존재를 밝혀내었다. 도 4를 참조한다. 맙슈어 셀렉트 포획 후 그에 더하여, 각각의 0.5mg을 소수성 칼럼 (2.1 x 100mm) 상에 로딩하였다. 구동 완충제는 25mM 인산칼륨, 1M 황산암모늄 pH 6.5였고, 용리 완충제는 25mM 인산칼륨 pH 6.5, 25% 이소프로판올이었다. 크로마토그램은 겔에 의해 관찰되는 이질성을 반영하였고, 또한 주요 피크의 체류 시간에서의 차이를 밝혀내었다. 각각 항-표적 G (노브) 및 항-표적 H (홀)에 대한 크로마토그램을 보여주는 도 5a 및 5b를 참조한다. 포획 풀 내 동종이량체 및 절반 항체의 양은 특이적 항체에 따라 달라질 수 있다.
글루타티온 처리 후, 이중특이체를 또한 소수성 칼럼 상에 로딩하였다. 크로마토그램은 단일 주요 피크 (>90%)를, 각각의 절반 항체의 단일 주요 피크 사이의 체류 시간과 함께 밝혀내었다. 도 6을 참조한다. MS는 주요 피크가 이중특이체임을 확인시켜주었다. 이들 결과는 절반 항체 포획 풀 내에 존재하는 공유 동종이량체가 있고, 동종이량체는 상기 언급된 어셈블리 조건을 사용하여 파괴될 수 있고, 이중특이체 형성을 위해 이용가능함을 시사한다.
GSH의 부재 하 vs. 10mM GSH의 존재 하의 배합된 배양 배지에서의 항-표적 A (노브) 및 항-표적 B (홀)의 어셈블리를 비교함으로써 이중특이체 어셈블리 조건을 추가로 검사하였다.
리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 제조업체의 권고 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)에 따라 사용하여 CHO 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 MSX의 다양한 농도 (메티오닌 술폭시민, 25 및 50 uM)에서 선택하였다. 골라낸 콜로니를 콜로니로부터의 상청액을 샘플링함으로써 항체 생산에 대해 평가하고, ELISA에 의해 분석하였다. 안정한 풀을 제조하기 위해, ELISA 역가에 기초하여, 상위 48개의 클론을 합하고 스케일 업하였다. 또한 개별 클론을 확장시키고, 항체 생산성 평가를 위해 스케일 업하여 상위 클론을 결정하였다.
다음으로, 40 L 배양을 사용하고, 세포를 2.8L의 배양 배지 중에 1.2x106개 세포/mL로 시딩하였다. 배양을 정기적으로 분할하고, 90 rpm에서 교반하고, pH 설정점 7.0±0.03 및 30% 용존 산소 (dO2)에서 유지시켰다. 15mM GSH를 제11일에 첨가한 후, 제12일에 세포를 수거하였다.
비처리 및 GSH 처리된 세포-무함유 배양 배지를 각각 맙슈어 셀렉트 상에서 가공하고, 포획 풀을 ESI-TOF를 사용하여 분석하였다. 도 7a를 참조한다. 도 7b는 이중특이적 항체 피크 (7a에 제시된 바와 같은 우측 피크)의 m/z 범위의 확대를 보여준다. 도 7c는 절반 항체 피크 (7a에 제시된 바와 같은 좌측 피크)의 m/z 범위의 확대를 보여준다.
도 7a-c는 동종이량체 및 절반 항체 피크 존재비가 10mM GSH를 배양에 첨가한 경우에 가시적으로 감소됨을 보여주고, 이는 이중특이체 형성이 공동-배양에 존재하는 절반 항체 및 동종이량체 내용물 둘 다에 의해 유도됨을 입증한다. 각각의 동종이량체가 이중특이적 항체 형성에 참여한 정도는 특정한 절반 항체에 따라 달라진다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 여러 실시양태가 본 발명의 범주 및 취지 내에서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 본 발명은 이제 하기 비제한적 예를 참조하여 보다 상세하게 기재될 것이다. 하기 실시예는 추가로 본 발명을 예시하지만, 물론 그의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (64)

  1. i) 제1 이종이량체화 도메인을 갖고, 제1 경쇄와 회합된 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 및 ii) 제2 이종이량체화 도메인을 갖고, 제2 경쇄와 회합된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질이며, 여기서 제2 이종이량체화 도메인은 제1 이종이량체화 도메인과 계면에서 상호작용하고, 여기서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 적어도 1개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결되고,
    제1 이종이량체화 도메인은 계면에서 노브 변형을 포함하고, 제2 이종이량체화 도메인은 계면에서 홀 변형을 포함하고, 노브 변형은 제1 이종이량체화 도메인 중 하나 이상의 원래 아미노산 잔기를 원래 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄를 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함하고, 홀 변형은 제2 이종이량체화 도메인 중 하나 이상의 원래 아미노산 잔기를 원래 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄를 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함하고, 이종다량체 단백질은 항체인 것인, 이종다량체 단백질의 제조 방법이며,
    (a) 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제1 경쇄를 발현할 수 있는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 2개의 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제1 경쇄를 포함하는 제1 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
    (b) 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 경쇄를 발현할 수 있는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 2개의 제2 힌지-함유 폴리펩티드 및 2개의 제2 경쇄를 포함하는 제2 동종이량체가 분비되는 것인 단계;
    (c) 제1 및 제2 숙주 세포의 세포 막을 파괴하지 않으면서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포가 배합된 배양 배지를 수득하는 단계이며, 여기서 배합된 배양 배지는 제1 동종이량체 및 제2 동종이량체를 포함하는 것인 단계;
    (d) 환원 글루타티온(GSH)을 배합된 배양 배지에 첨가하여 최종 농도 5mM 내지 20mM을 달성하는 단계; 및
    (e) 이종다량체 단백질을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 각각 포유동물 세포인 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배합된 배양 배지를 수득하는 단계가
    (1) 제1 숙주 세포에 대한 제1 배양 배지를 수거하는 단계;
    (2) 제2 숙주 세포에 대한 제2 배양 배지를 수거하는 단계; 및,
    (3) 제1 배양 배지 및 제2 배양 배지를 배합하여 배합된 배양 배지를 수득하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 배합된 배양 배지를 수득하는 단계가 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 포함하는 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포를 배합된 세포 배양물로 배합하기 전에 개별적으로 배양하는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 배합된 세포 배양물을 25℃ 내지 40℃의 온도에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (d) 이후에 배합된 배양 배지를 교반하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (e) 이후에 배합된 배양 배지로부터 이종다량체 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 이종다량체 단백질을 단백질 A 칼럼을 사용하여 단리하는 것인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 배합된 세포 배양물의 배양 배지를 수거하기 전에 배합된 세포 배양물의 배양 배지에 GSH를 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, GSH를 수거 단계의 4 내지 24시간 전에 첨가하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, GSH를 수거 단계의 15시간 전에 첨가하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, GSH를 함유하는 배합된 배양 배지를 추가로 4시간 내지 7일 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, GSH를 함유하는 배합된 배양 배지를 추가로 15시간 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, GSH를 함유하는 배합된 배양 배지를 이종다량체 단백질을 단리하기 전 적어도 24시간 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 이종다량체 단백질을 단백질 A 칼럼을 사용하여 단리하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, GSH가 5mM 내지 20mM 미만의 농도로 첨가되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, GSH가 15 mM의 농도로 첨가되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 제1 숙주 세포가 안정한 세포주이고, 여기서 안정한 세포주가 힌지-함유 폴리펩타이드 및 경쇄를 발현할 수 있는 핵산 분자에 의해 안정적으로 형질감염되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 제2 숙주 세포가 안정한 세포주이고, 여기서 안정한 세포주가 힌지-함유 폴리펩타이드 및 경쇄를 발현할 수 있는 핵산 분자에 의해 안정적으로 형질감염되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 제1 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 제2 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포의 비를, 제1 숙주 세포 배양물 및 제2 숙주 세포 배양물을 배합하여 배합된 배양물을 형성한 경우에 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 몰비가 1:10 내지 10:1이 되도록 조정하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제1 숙주 세포에 의해 발현된 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 숙주 세포에 의해 발현된 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 몰비가, 숙주 세포 배양물 및 제2 숙주 세포 배양물을 배합하여 배합된 배양물을 형성한 경우에 1:1인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 항체 중쇄를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 노브 변형에서 치환 아미노산 잔기가 트립토판, 페닐알라닌, 티로신 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 홀 변형에서 치환 아미노산 잔기가 세린, 트레오닌, 발린 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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  28. 제1항에 있어서, 노브 변형이 T366W 치환 (EU 넘버링)을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 홀 변형이 T366S, L368A 및 Y407V (EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 쇄간 디술피드 결합이 힌지 영역 사이에 있는 것인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 이종다량체 단백질이 이중특이적 항체인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 항체가 인간화 또는 인간 항체인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 항체가 전장 항체인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 항체가 인간 CH2 및/또는 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함하는 항체 단편인 방법.
  35. 제1항에 있어서, 항체가 IgG, IgA 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 항체가 IgG인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2 또는 IgG4인 방법.
  38. 제1항에 있어서, 제1 경쇄 및 제2 경쇄가 상이한 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
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