CN1810832B - 与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽 - Google Patents

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Abstract

与MP1受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽本发明涉及化合物领域，特别是具有血小板生成活性的肽或多肽。本发明的肽或多肽可用于哺乳动物，升高血小板或血小板前体(如巨核细胞)的数量。

Description

与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
本申请是申请日为1999年10月22日的中国专利申请99812517.2“与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽”的分案申请。
本申请要求1998年10月23日提交的、美国临时申请06/105 348的优先权.
技术领域
基本上，本发明涉及化合物领域，特别是具有血小板生成活性的肽或多肽。本发明的肽或多肽可用于哺乳动物，增加血小板或血小板前体(如巨核细胞)的产量。
背景技术
本发明涉及化合物领域，特别是具有体外和体内刺激血小板及其前体细胞如巨核细胞产生能力的肽。在探讨本发明化合物的性质之前，下面将提供两种具有血小板生成活性的蛋白质：血小板生成素(TPO)和巨核细胞生长发育因子(MGDF)作为背景资料。
内源性血小板生成素(TPO)的克隆(Lok等，自然，369：568-571(1994)；Bartley等，细胞，77：1117-1124(1994)；Kuter等，美国科学院院刊，91：11104-11104(1994)；de Sauvage等，自然，369：533-538(1994)；Kato等，生物化学杂志，119：229-236(1995)；Chang等，生物化学杂志，270：511-514(1995))迅速加深了我们对巨核细胞生成(巨核细胞的产生)和血小板生成(血小板的产生)的理解。
人内源性TPO是一种60-70kDa的糖基化蛋白，主要在肝脏和肾脏产生，包括332个氨基酸(Bartley等，细胞，77：1117-1124(1994)；Chang等，生物化学杂志，270：511-514(1995))。该蛋白在不同物种间高度保守，与人促红细胞生成素在氨基末端(第1到172氨基酸)(Bartley等，细胞，77：1117-1124(1994))有23％的同源性(Gurney等，血液，85：981-988(1995))。业已显示，内源性TPO拥有血小板生成的关键生物调节子的所有特性。其体外作用包括，特异性诱导纯化鼠骨髓造血干细胞(Zeigler等，血液，84：4045-4052(1994))和人CD34+细胞(Lok等，自然，369：568-571(1994)；Rasko等，干细胞，15：33-42(1997))，巨核细胞集落形成，巨核细胞的产生呈倍性增加(Broudy等，血液，85：402-413(1995))，并诱导巨核细胞的终末成熟和血小板产生(Zeigler等，血液，84：4045-4052(1994)；Choi等，血液，85：402-413(1995))。相反，针对TPO受体(c-Mpl)的合成反义寡脱氧核苷酸可以显著抑制巨核细胞祖细胞的集落形成能力(Methia等，血液，82：1395-1401(1993))。此外，敲除c-Mpl基因的小鼠患有严重的血小板缺乏症，并缺乏巨核细胞(Alexander等，血液，87：2162-2170(1996))。
重组人MGDF(rHuMGDF，Amgen Inc.，Thousand Oaks，加利福尼亚)是另一种与TPO相关的血小板生成多肽。该物质是通过应用质粒转化的大肠杆菌生产的，所述质粒含有编码包括人TPO氨基末端受体结合域的截断蛋白的cDNA(Ulich等，血液，86：971-976(1995))。该多肽被提取、再包装、纯化，并在其氨基末端与聚(乙烯二醇)(PEG)部分共价连接。获得的分子这里称为PEG-rHuMGDF或简称为MGDF。
应用动物模型的很多试验(Ulich，T.R.等，血液，86：971-976(1995)；Hokom，M.M.等，血液，86：4486-4492(1995))业已明确显示TPO和MGDF在骨髓移植和血小板缺乏症治疗中的疗效，而后一种情况通常由于化疗或放疗所致。在人类获得的初步资料已证实应用MGDF可以在多数情况下提高血小板计数(Basser等，柳叶刀，348：1279-81(1996)；Kato等，生物化学杂志，119：229-236(1995)；Ulich等，血液，86：971-976(1995))。MGDF还可用于增强血小板捐供，因为给健康血小板供者应用MGDF，可以将循环血小板数量提高到大约原始数值的3倍。
TPO和MGDF通过与c-Mpl受体结合发挥作用，该受体主要在某些造血细胞表面表达，如巨核细胞，血小板，CD34+细胞和原始祖细胞(Debili，N.等，血液，85：391-401(1995)；de Sauvage，F.J.等，自然，369：533-538(1994)；Bartley，T.D.等，细胞，77：1117-1124(1994)；Lok，S.等，自然，369：565-8(1994))。与白细胞介素和蛋白质激素的绝大多数受体类似，c-Mpl属于I类细胞因子超家族(Vigon，I.等，美国科学院院刊，89：5640-5644(1992))。这类受体的激活包括配体结合诱导的受体同二聚体化，并依次引发一系列的信号转导事件。
一般说来，一种蛋白质配体与其受体的相互作用通常发生在一个相对较大的界面。但是，人生长激素与其受体结合的例证却显示，界面上只有几个关键基团真正参与了绝大部分的结合活动(Clackson，T.等，科学，267：383-386(1995))。这一点和大量剩余蛋白质配体仅仅起到在正确的拓扑结构下显示结合表位的事实，使寻找小型活性配体成为可能。
一种向此方向迈进的努力，噬菌体肽文库显示系统作为一种鉴定大型蛋白配体的模拟小型肽的强有力技术，业已浮出(Scott，J.K.等，科学，249：386(1990)；Devlin，J.J.等，科学，249：404(1990))。通过应用这种技术，发现了作为c-Mpl受体激动剂的小型肽分子(Cwirla，S.E.等，科学，276：1696-1699(1997))。
在这样一项研究中，作为与丝状噬菌体衣壳蛋白融合的随机小型肽序列用抗体固定化的c-Mpl细胞外功能域亲和洗脱，剩余的噬菌体经第二轮亲和纯化富集。这一结合选择和再增殖过程重复多次，以增加紧密结合者的库。这样，首次鉴定了两个c-Mpl结合肽家族，其序列彼此不相关。然后创建诱变文库以进一步优选最佳结合者，最终分离获得一种极高活性肽，其IC50＝2nM，EC50＝400nM(Cwirla，S.E.等，科学，276：1696-1699(1997))。这一命名为TMP(TPO模拟肽)的含有14个基团的肽，与TPO或MGDF没有明显的序列同源性。这一TMP化合物的结构如下：
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
序列1
或
IEGPTLRQWLAARA
以氨基酸缩写的单个字母表示。
以前，在一项关于EPO模拟肽的相似研究中，应用相同的技术发现了EPO模拟肽(EMP)(Wrighton，N.C.等，科学，273：458-463(1996))，并发现其以二聚体的形式与EPO受体(EPOR)结合。根据X线晶体照相术资料，形成的(配体)2/(受体)2复合物C2对称(Livnah，O.等，科学，273：464-471(1996))。基于这一结构资料，一种共价结合的EMP二聚体设计产生，该二聚体是将两个EMP单体的C末端与一个可变间隔区交联，并发现该二聚体无论体内/体外，结合生物活性均大大加强(Wrighton，N.C.等，自然生物技术，15：1261-1265(1997))。
一种相似的C末端二聚体化策略被用于TPO模拟肽(TMP)(Cwirla，S.E.等，科学，276：1696-1699(1997))。结果发现，在细胞增殖试验中，TMP的C末端连接的二聚体(C-C连接)结合亲和力改善，为0.5nM，体外活性显著增强(EC50＝0.1nM)(Cwirla，S.E.等，科学，276：1696-1699(1997))。该TMP C-C二聚体的结构显示如下：
(序列2)
本发明的另一方面，该串联二聚体可以进一步与来自免疫球蛋白的一个或更多部分连接，通常是指免疫球蛋白的Fc段。获得的化合物称之为Fc融合的TMP串联二聚体。
下面是有关用于与某些本化合物连接的抗体Fc段的简要背景部分。
抗体包括两个独立的功能部分，一个是被称之为“Fab”的可变区，与抗原结合，以及另一个被称之为“Fc”的稳定区，提供与效应器功能如补体固定或吞噬作用的连接。免疫球蛋白的Fc部分血浆半衰期长，而Fab则短。
业已有多种应用Fc段构建的治疗性蛋白产品，期望能够提供较长的半衰期，或整合一些存在于免疫球蛋白Fc段的功能，如与Fc受体结合，与蛋白A结合，补体固定，以及胎盘转移(Capon等，自然，337：525-531(1989))。例如，IgG1抗体的Fc段业已与CD30-L融合，后者是一种可以与CD30受体结合的分子，该受体在霍奇金病肿瘤细胞、退行性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞和其他恶性细胞类型表面均有表达。见美国专利号5 480 981。为了延长其短暂的循环半衰期，IL-10，一种抗炎抗排斥制剂，也已与鼠Fcγ2a融合(Zheng，X.等，免疫学杂志，154：5590-5600(1995))。研究还评价了将肿瘤坏死因子受体与人IgG1的Fc段连接，治疗感染性休克患者的应用(Fisher，C.等，新英格兰医学杂志，334：1697-1702(1996)；Van Zee，K.等，免疫学杂志，156：2221-2230(1996))。Fc段还与CD4受体融合，产生的治疗蛋白被用于艾滋病的治疗。见Capon等，自然，337：525-531(1989)。此外，白细胞介素2业已与IgG1或IgG3的Fc段融合，以克服白细胞介素2的短暂半衰期及其系统毒性。见Harvill等，免疫技术，1：95-105(1995)。
尽管已经可以通过商业途径得到TPO和MGDF，但提供具有刺激血小板产生(血小板生成活性)和/或血小板前体细胞，特别是巨核细胞产生(巨核细胞生成活性)的生物活性的其他化合物，仍然存在需求。本发明提供具有这些活性及相关方面的新型化合物。
发明内容
本发明提供一组化合物，这些化合物可以结合并通过，即激活c-Mpl受体引发跨膜信号，所述c-Mpl受体与介导内源性血小板生成素(TPO)的受体相同。因此，本发明的化合物具有血小板生成活性，即在体内外刺激血小板产生的能力，和/或巨核细胞生成活性，即在体内外刺激血小板前体产生的能力。
在第一个优选实施方案中，本发明化合物包括以下常见结构：
TMP1-(L1)n-TMP2
其中TMP1和TMP2分别独立选自包括以下核心结构的一组化合物：
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
其中，
X2选自谷氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸和缬氨酸；
X3选自甘氨酸和丙氨酸；
X4选自脯氨酸；
X5选自苏氨酸和丝氨酸；
X6选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸；
X7选自精氨酸和赖氨酸；
X8选自谷氨酰胺、天门冬酰胺和谷氨酸；
X9选自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；
X10选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和赖氨酸；
L1为本文所述接头；并且
n是0或1；
及其生理学可以接受的盐类。
在一个实施方案中，L1包括(甘氨酸)n，其中n为1-20，并且当n大于1时，高达一半的甘氨酸残基可以用选自其他19种天然氨基酸或其立体异构体的氨基酸所取代。
TMP1和TMP2的核心结构除了上述公开的X2-X10外，还有其他相关结构的可能，其中一个或多个下述基团可以添加到TMP1和/或TMP2的核心结构上：X1被连接到N末端和/或X11，X12，X13，和/或X14被连接到C末端，其中X1，X12，X13和X14如下所述：
X1选自异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸和精氨酸；
X11选自丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、组氨酸和谷氨酸；
X12选自丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺；
X13选自精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天门冬酰胺、和甘氨酸；并且
X14选自丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸和甘氨酸。
在第二个优选实施方案中，本发明化合物具有以下通式：
(Fc)m-(L2)q-TMP1-(L1)n-TMP2-(L3)r-(Fc)p
其中TMP1，TMP2和n分别与上述相同；L1，L2和L3是分别独立选自这里描述的接头基团的接头基团；Fc是免疫球蛋白(将在下面给出定义)的Fc段；m，p，q和r是分别独立选自0和1的数字，其中m或p至少有一个是1，而且，如果m为0则q为0，如果p为0则r为0；及其生理学可以接受的盐类。在一个实施方案中，L1，L2和L3独立包括(甘氨酸)n，其中n为1-20，并且当n大于1时，高达一半的甘氨酸残基可以用选自其他19种天然氨基酸或其立体异构体的氨基酸所取代。
上述化合物(下面有详述)的衍生物也包括在本发明中。
本发明的化合物优选肽，所述肽可以通过标准合成法或其他任何肽制备法制备。包含非肽部分的本发明化合物除了可通过标准肽化学反应外，在适宜的情况下，可通过标准有机化学反应合成。
本发明化合物可通过与适宜的药物载体物质整合，并给予目标受体如人(或其他哺乳动物)有效剂量，用于治疗或预防目的。其他相关方面也包含在本发明中。
附图说明
本发明的大量其他方面和优势将在考虑下面的详细描述并参考附图后变得清晰，其中：
图1举例显示了人IgG1的Fc多核苷酸和蛋白序列(序列3是编码链，阅读方向为5’→3’，序列4是互补链，阅读方向是3’→5’；序列5是编码氨基酸的序列)，该序列可用于本发明的Fc融合化合物。
图2显示了制备聚乙二醇化肽19(序列17)的一种合成方案。
图3显示了制备聚乙二醇化肽20(序列18)的一种合成方案。
图4显示了给正常BDF1雌性小鼠弹丸注射一次100μg/kg化合物后体内血小板产生的计数，注射的各种化合物如下：PEG-MGDF表示将平均分子量为20kD的PEG通过还原氨基化连接于人天然TPO的1-163氨基酸的氨基基团N末端，所述TPO在大肠杆菌中表达(因此不是糖基化的)(见题为“刺激巨核细胞生长发育的组合物和方法”的WO 95/26746)；TMP表示序列1的化合物；TMP-TMP表示序列21的化合物；PEG-TMP-TMP表示序列18的化合物，其中PEG基团是平均分子量为5kD的PEG如图3所示连接；TMP-TMP-Fc将在下面给出定义，Fc-TMP-TMP除了Fc基团是连接于TMP-TMP肽的N末端而非C末端外，与TMP-TMP-Fc完全一致。
图5显示了通过埋植渗透泵连续7天给予正常BDF1雌性小鼠各种化合物后体内血小板产生的计数。化合物的定义与上述图4给出的完全一致。
图6A，6B和6C显示了本发明优选化合物的设计图。图6A显示了一种Fc融合化合物，其中Fc部分融合于TMP二聚体的N末端，而且Fc部分是单体(单链)形式。图6B显示了一种Fc融合化合物，其中Fc段融合于TMP二聚体的N末端，而且Fc部分为二聚体，其中一个Fc单体连接于TMP二聚体。图6C显示了一种Fc融合化合物，其中Fc部分与TMP二聚体的N末端连接，而且Fc部分为二聚体，每一Fc单体与一个TMP二聚体连接。
具体实施方式
在寻求小型结构作为引导化合物以发展拥有更多期望特征的治疗性制剂的努力下，一种不同类型的TMP二聚体及相关结构设计出台，其中一个TMP肽的C末端直接或通过一个接头与第二个TMP肽的N末端相连，并随之评价这种二聚体策略对获得的二聚体分子的生物活性的影响。在一些情况下，这些被称之为串联的二聚体(C-N连接)在两个单体之间被设计加入接头，所述接头优选包括天然氨基酸，因此其合成可以应用重组技术。
本发明基于一组具有血小板生成活性的化合物的发现，这些化合物通过与内源性TPO受体c-Mpl连接以发挥作用。
化合物及衍生物
在第一个优选实施方案中，本发明化合物包括以下一般结构：
TMP1-(L1)n-TMP2
其中TMP1和TMP2分别独立选自包括以下核心结构的一组化合物：
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
其中，
X2选自谷氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸和缬氨酸；
X3选自甘氨酸和丙氨酸；
X4选自脯氨酸；
X5选自苏氨酸和丝氨酸；
X6选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸；
X7选自精氨酸和赖氨酸；
X8选自谷氨酰胺、天门冬酰胺和谷氨酸；
X9选自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；
X10选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和赖氨酸；
L1为本文所述接头；并且
n是0或1；
及其生理学可以接受的盐类。
在一个实施方案中，L1包括(甘氨酸)n，其中n为1-20，并且当n大于1时，高达一半的甘氨酸残基可以用选自其他19种天然氨基酸或其立体异构体的氨基酸所取代。
TMP1和TMP2的核心结构除了上述公开的X2-X10外，还有其他相关结构的可能，其中一个或多个下述基团可以添加到TMP1和/或TMP2的核心结构上：X1被连接到N末端和/或X11，X12，X13，和/或X14被连接到C末端，其中X1，X11，X12，X13和X14如下所述：
X1选自异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸和精氨酸；
X11选自丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、组氨酸和谷氨酸；
X12选自丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺；
X13选自精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天门冬酰胺、和甘氨酸；并且
X14选自丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸和甘氨酸。
术语“TMP”用来表示由，即包括至少9个亚单位(X2-X10)组成的部分，其中X2-X10组成核心结构。X2-X14的亚单位优选独立选自20个天然氨基酸的氨基酸，但是，本发明也包括X2-X14独立选自本领域熟知的非典型、非天然氨基酸的化合物。每一位置特别优选的氨基酸已经鉴定。例如，X2可以是谷氨酸，天门冬氨酸，赖氨酸或缬氨酸。三个字母和单个字母的氨基酸缩写形式这里均予沿用；每种情况下，缩写都是20种天然氨基酸或大家熟知的其变异物的标准缩写形式。这些氨基酸在立体化学上可以是L型或D型(除了甘氨酸，既没有L型，也没有D型)，TMPs可以包括立体化学的组合。但在TMP链中优选所有氨基酸的立体化学L型。本发明还提供反向TMP分子，其中羧基末端的氨基酸序列是反向的。例如，具有正常序列X1-X2-X3分子的反向序列为X3-X2-X1。本发明还提供逆向-反向TMP分子，其中，与反向TMP一样，羧基末端的氨基酸序列是反向的，而且TMP中通常情况下是“L”镜像体的残基改变为“D”立体异构体形式。
此外，TMPs的生理学可以接受的盐类也包括在内。“生理学可以接受的盐类”表示任何已知或后来发现的可以药用的盐类。一些特别优选的实例如：乙酸盐、三氟乙酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、羟乙酸盐、草酸盐。
还可考虑应用TMPs的“衍生物”来取代上述TMPs。这些TMPs的衍生物包括经一个或多个下述方法修饰的部分：
一个或多个肽[-C(O)NR-]连接(键)被非肽连接如-CH2-氨甲酸酯连接[-CH2-OC(O)NR-]所取代；一个膦酸酯连接；一个-CH2-磺胺[-CH2-S(O)2NR-]连接；一个脲[-NHC(O)NH-]连接；一个-CH2-仲胺连接；或者一个烷基化的肽连接[-C(O)NR6-其中R6是低级烷基]；
以下肽，其中N末端衍生为一个-NRR1基团；为一个-NRC(O)R基团；为一个-NRC(O)OR基团；为一个-NRS(O)2R基团；为一个-NHC(O)NHR基团，其中R和R1是氢原子或低级烷基，但条件是R和R1不能同时为氢原子；为一个琥珀酰亚胺基团；为一个苄氧羰基-NH-(CBZ-NH-)基团；或一个苄氧羰基-NH-基团，其中苯环有1-3个取代物，分别选自低级烷基、低级烷氧基、氯和溴；并且
以下肽，其中游离C末端衍生为-C(O)R2，其中R2选自低级烷氧基，以及-NR3R4，其中R3和R4独立选自氢原子和低级烷基。“低级”的意思是含有1-6个碳原子的基团。
此外，各个氨基酸也可修饰后引入TMP分子，方法是通过将肽的靶向氨基酸残基与一种有机衍生剂反应，该衍生剂能够与所选支链和末端残基发生反应。下面是实例：
赖氨酸和氨基末端残基可以与琥珀酸或其他羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生反应的效果就是可以逆转赖氨酸残基的电荷。其他可以使含有α-氨基的残基发生衍生反应的适宜试剂包括：亚氨酸酯如甲基甲基砒啶亚氨酸酯(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸发生的反应。
精氨酸残基可以通过与一个或几个常规试剂发生反应得到修饰，所述试剂包括苯乙醛、2，3-丁二酮，1，2-环己二酮，和茚三酮。精氨酸残基的衍生反应需要在碱性条件下进行，因为胍官能团的pKa很高。而且，这些试剂可与赖氨酸和精氨酸的胍基团均发生反应。
酪氨酸残基的特异性修饰业已经过深入研究，特别引人关注的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应，将光谱标记引入酪氨酸残基。最常见的是，氮-乙酰咪唑和四硝基甲烷可被分别用来构建氧-乙酰酪氨酸类和3-硝基衍生物。
羧基侧基(天门冬氨酸或谷氨酸)可以通过与碳二亚胺(R’-N＝C＝N-R’)如1-环乙基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应而被选择性修饰。进一步，天门冬氨酸和谷氨酸残基还可通过与铵离子反应转变为天门冬酰胺和谷氨酰胺残基。
谷氨酰胺和天门冬酰胺残基经常脱氨基转变为相应的谷氨酸和天门冬氨酸残基。或者，这些残基可在微酸性条件下脱氨基。这些残基的任一形式都包括在本发明范围内。
用双功能试剂衍生对于将肽或其功能衍生物交联到不溶于水的支持基质或其他大分子载体上是有用的。常用的交联试剂包括，例如，1，1-双(重氮基乙酰)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，4-叠氮水杨酸酯，同双功能的亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺基酯如3，3-二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸盐)，和双功能的马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。衍生试剂如甲基-3-[(对叠氮苯)二硫]丙酰亚氨酸酯(propioimidate)可以产生光激活中间物，在有光存在的情况下可以形成交联。此外，反应性不溶于水的基质如在美国专利号为3 969 287；3 691 016；4 195 128；4 247 642；4 229 537和4 330 440中描述的溴化氰激活的碳水化物和反应性底物可用于蛋白质固定化。
其他可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸或苏氨酸残基羟基基团的磷酸化，半胱氨酸中硫原子的氧化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基基团的甲基化(Creighton，T.E.等，蛋白质：结构和分子特性，W.H.Freeman & Co.有限公司，旧金山，79-86页(1983))，N末端氨基的乙酰化，并且，在一些情况下，是C末端羧基基团的酰胺化。
本发明化合物的这些衍生部分优选改善一个或多个特征，包括血小板生成活性，溶解性，吸收，生物半衰期等。另外，衍生部分获得的化合物要与没有衍生的化合物具有相同，或大致相同的特征和/或特性。所述部分应可根除或减弱化合物的不利副反应等。
除了上述的核心结构X2-X10，还具体考虑的其他结构包括有一个或多个X基团与核心结构相连的结构。因此，X1，和/或X11，X12，X13和X14可以连接到核心结构。下面给出一些其他示范结构：
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11；
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12；
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13；
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14；
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10；
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11；
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12；
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13；
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14，
其中X1-X14如上述。每个TMP1和TMP2在序列和/或长度上可以一致，也可以不同。在一些优选实施方案中，TMP1和TMP2相同。
一个特别优选的TMP如下：
Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala
(序列1)
这里所用的“包括”的意思是，除了其他事物外，一个化合物可以包含在给定序列的-或C末端同时或在任一端添加氨基酸。但是，只要如X2-X10，X1-X14，或其他示例结构存在，余下的化学结构就相对不重要了。当然，核心结构X2-X10，或X1-X14以外的任何结构，都不应显著影响化合物的血小板生成活性。例如，一个N末端蛋氨酸残基就被视为属于本发明。此外，尽管本发明的多种优选化合物为串联二聚体，这种二聚体拥有两个TMP部分，但本发明的其他化合物为串联多聚体TMPs，即拥有下述示例结构的化合物：
TMP1-L-TMP2-L-TMP3
TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4
TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5；
其中，TMP1，TMP2，TMP3，TMP4和TMP5的结构可以相同也可以不同，并且每个TMP和L如在此所定义的，每个接头都是可选的。本发明化合物优选2-5个TMP部分，特别优选2-3个，最优选2个。本发明第一个实施方案的化合物优选总数少于大约60个氨基酸，更优选少于大约40个氨基酸(即，他们是肽)。
如上所述，本发明第一个实施方案的化合物优选或者直接连接或者与一个接头基团相连的TMP二聚体。单体TMP部分的显示方式从左向右阅读是常规的从N末端到C末端的定向。据此，我们可以看到，本发明化合物全部是有方向定位的，因此TMP1的C末端或者直接或者通过一个接头与TMP2的N末端相连。这种定向被称之为串联定向，并且本发明化合物通常被称之为“串联二聚体”。即使TMP1和TMP2的结构是不同的，这些化合物仍被称为二聚体。也就是说，这里包括同二聚体和异二聚体。
“接头”基团(“L1”)是可选的。当其存在时，对其化学结构并无严格要求，因为它的主要作用是作为间隔区。接头应有所选择，以致不会影响最终化合物的生物活性，也不会显著增强最终化合物的免疫原性。接头优选由肽键连接在一起的氨基酸组成。因此，在优选实施方案中，接头包括Yn，其中Y是天然氨基酸或其立体异构体，“n”是1-20的任意一个数字。因此接头由通过肽键连接的1-20个氨基酸组成，其中氨基酸选自20种天然氨基酸。在一个更优选的实施方案中，所述1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和赖氨酸。更加优选的是，接头由空间结构没有位阻的氨基酸为主体组成，例如甘氨酸，甘氨酸-甘氨酸[(甘氨酸)2]，甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸[(甘氨酸)3]，……(甘氨酸)20，丙氨酸，甘氨酸-丙氨酸，丙氨酸-甘氨酸，丙氨酸-丙氨酸，等。接头的其他具体实例为：
(甘氨酸)3赖氨酸(甘氨酸)4(序列6)；
(甘氨酸)3天门冬酰胺甘氨酸丝氨酸(甘氨酸)2(序列7)
(当其在能够糖基化这种位点的哺乳动物细胞系统中重组生产时，该结构提供了一个糖基化位点)；
(甘氨酸)3半胱氨酸(甘氨酸)4(序列8)；以及
甘氨酸脯氨酸天门冬酰胺甘氨酸(序列9)。
为了解释上述命名系统，举例来说，(甘氨酸)3赖氨酸(甘氨酸)4的意思是甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。还优选甘氨酸和丙氨酸的组合。
也可应用非肽接头。例如，烷基接头如-HN-(CH2)m-CO-，其中s-2-20。这些烷基接头还可进一步被任意非空间结构位阻的基团如低级烷基(如C1-C6)，低级醛基，卤素(如氯，溴)，氰，氨基，苯基，等取代。
另一种非肽接头为聚乙二醇基团，如
-HN-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-CO-其中，n的取值使接头总分子量范围大约是101-5000，优选101-500。
在本发明第一个实施方案的血小板生成化合物中，业已发现，接头的长度一般优选大约0-14个亚基(如氨基酸)。
肽接头可以改变，以构建与上述TMPs相同方式的衍生物。
第一组化合物还可进一步是线形或环状的。“环状”意味着分子至少有两个分离，即不连续的部分彼此连接。例如，分子的氨基末端和羧基末端可以共价连接以形成一个环状分子。另外，分子可能含有两个或多个半胱氨酸残基(如，在接头中)，这些残基可以通过形成二硫键而环化。进一步予以考虑的是，一个以上的串联肽二聚体可以连接以形成二聚体的二聚体。例如，一个含有半胱氨酸的串联二聚体可以与另一个这样的二聚体中的半胱氨酸形成分子内二硫键。见，例如下面给出的序列20的化合物。
本发明化合物还可与载体分子共价或非共价连接，如一个线形聚合物(例如，聚乙二醇，聚赖氨酸，葡聚糖等)，支链聚合物(见，例如1981年9月15日授予Denkenwalter等的美国专利4 289 872；1993年7月20日授予Tam的美国专利5 229 490；1993年10月28日公开的Frechet等的WO93/21259)；脂质；胆固醇基团(如类固醇)；或者碳水化合物或寡糖。其他可能的载体包括一个或多个水溶性聚合物接头，如美国专利4 640 835，4 496 689，4 301 144，4 670 417，4 791192和4 179 337所述的聚乙二醇，或聚丙二醇。以及本领域熟知的其他有用聚合物，包括单甲氧基-聚乙二醇，葡聚糖，纤维素，或其他基于碳水化合物的聚合物，聚-(N-乙烯吡咯烷)-聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物，聚氧乙烯的多羟基化合物(如甘油)和聚乙烯醇，以及这些聚合物的混合物。
一种优选载体为聚乙二醇(PEG)。该PEG基团可以是任意方便的分子量，可以是直链，也可以有支链。优选的PEG平均分子量范围为大约2kDa-100kDa，更优选5kDa-50kDa，最优选5kDa-10kDa。
PEG基团通常通过酰化作用、还原烷基化、Michael添加、硫羟烷基化或其他化学选择结合/连接方法与本发明化合物相连，通过将PEG部分的反应基团(例如，醛基、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰，马来酰亚胺或肼基)与靶化合物的反应基团(如，醛基、氨基、酯、巯基、α-盐乙酰，马来酰亚胺或肼基)连接达到。
碳水化合物(寡糖)基团可以方便地连接到公认的蛋白质糖基化位点。通常，当丝氨酸/苏氨酸和天门冬酰胺的排列顺序如天门冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸时，O-连接的寡糖可与丝氨酸或苏氨酸残基相连，而N-连接的寡糖则与天门冬酰胺残基相连，其中，X可以是除了脯氨酸以外的任意氨基酸。X优选不包括脯氨酸在内的19种天然氨基酸中的-种。发现的每种类型的N-连接和O-连接寡糖以及糖残基结构都是不同的。一种通常在两者都能发现的糖类型为N-乙酰神经氨酸(即唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接寡糖的末端残基，并且由于其携带负电荷的特性，可以赋予糖基化化合物酸性特征。这些位点可以整合到本发明的化合物接头上，并优选在多肽化合物通过细胞重组生产时糖基化(例如，在哺乳动物细胞中，如CHO，BHK，COS)。当然，这些位点也可以在本领域熟知的合成或半合成过程中糖基化。
本发明的一些示例肽结构显示如下。其中应用的是氨基酸单个字母缩写形式，并且为清晰起见，接头用横线分开表示。其他缩写：BrAc为溴乙酰(BrCH2C(O))，PEG为聚乙二醇。
IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA              (序列10)
Figure S06104451820060224D000161
IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA          (线性)
                                                (序列12)
IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLAARA              (序列13)
IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-LEGPTLRQWLAARA          (序列14)
IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA
                                                (序列15)
IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA          (序列16)
IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA
                                                 (序列17)
IEGPTLRQWLAARA-GGGG(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA
                                                 (序列18)
IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA
                                                 (序列19)
Figure S06104451820060224D000162
IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA           (序列21)
上述每一种化合物中。N末端蛋氨酸(或M残基，用单个字母表示)也在考虑之列。上述化舍物的聚合物(例如，串联或非串联，共价键连接或非共价键连接)也在考虑之列。
在本发明的第二个实施方案中，上述化合物还可进一步与一个或多个Fc基团直接或通过接头基团融合。通常，这个第二组化合物的结构式为：
(Fc)m-(L2)q-TMP1-(L1)n-TMP2-(L3)r-(Fc)。
其中和TMP1，TMP2和n分别与上述相同；L1，L2和L3是分别独立选自上述接头基团的接头基团；Fc是免疫球蛋白的Fc段；m，p，q和r是分别独立选自0和1的数字，其中m或p至少有一个是1，而且，如果m为0则q为0，如果p为0则r为0；及其生理学可以接受的盐类。
据此，这个第二组的化合物具有上述第一组化合物定义的结构，但是，该化合物进一步与至少一个Fc基团直接或通过一个或多个接头融合。
上述化合物的Fc序列可选自人免疫球蛋白IgG-1的重链，见Ellison，J.W.等，核酸研究， 10：4071-4079(1982)，或本领域熟知的任意Fc序列(例如，其他IgG类型，包括但不限于IgG-2，IgG-3和IgG-4，或其他免疫球蛋白)。
众所周知，抗体的Fc段由单体多肽片段组成，这些单体多肽片段可以通过二硫键或非共价键连接构成二聚体或多聚体形式。在天然Fc分子的单体亚单位间形成的分子内二硫键数量从1-4不等，有赖于参与抗体的类型(如IgG，IgA，IgE)或亚型(如IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgA-1，IgA-2)。这里所用的术语“Fc”可以代表Fc分子的单体，二聚体和多聚体形式。应当注意，当适宜的半胱氨酸残基存在时，Fc单体会自动形成二聚体，除非存在阻止二硫键形成从而阻止二聚体产生的特定条件。即使在Fc二聚体中可以正常形成二硫键的半胱氨酸被去除或被其他残基取代，单体链通常也可通过非共价作用二聚体化。这里的术语“Fc”用来表示下述任一形式：天然单体，天然二聚体(二硫键连接)，修饰二聚体(二硫键和/或非共价连接)，和修饰单体(即衍生物)。
Fc部分的变异体、类似物或衍生物可以通过，例如进行残基或序列的多种取代来构建。
变异体(或类似物)多肽包括插入变异，其中一个或多个氨基酸残基增补到Fc氨基酸序列中。插入位置可以是蛋白质的任一末端或双末端，也可以是Fc氨基酸序列的内部区域。在任一末端或双末端添加残基得到的插入变异体可以包括，如融合蛋白和包括氨基酸标志或标记的蛋白质。例如，Fc分子可以可选地包括一个N末端蛋氨酸，特别是当分子在细菌体如大肠杆菌中重组表达时。
在Fc缺失变异体中，Fc多肽中的一个或多个氨基酸残基被去除。缺失可以在Fc多肽的一端或两端发生，也可在Fc氨基酸序列内除去一个或多个残基。因此，缺失变异体包括Fc多肽序列的所有片段。
在Fc取代变异体中，Fc多肽的一个或多个氨基酸残基被去除并被其他残基所取代。一方面，自然发生的取代是保守的，但本发明也包括非保守取代。
例如，为了阻止在Fc序列中形成一些或全部二硫键交联，可以去除半胱氨酸残基或用其他氨基酸取代。特别是，在序列5中，第7和第10位氨基酸是半胱氨酸残基。可以将这些半胱氨酸残基各个去除，也可以用其他氨基酸，如丙氨酸或丝氨酸取代这些半胱氨酸残基中的一个或多个。如另一实例所示，修饰还可以通过引入氨基酸取代(1)去除Fc受体结合位点；(2)去除补体(C1q)结合位点；和/或(3)去除抗体依赖型细胞介导的细胞毒作用(ADCC)位点。这些位点在本领域是众所周知的，而且Fc范围内任何熟知的取代都可采用。例如，见分子免疫学，29卷，第5期，633-639(1992)，就是IgG1上的ADCC位点。
同样，一个或多个酪氨酸残基也可由苯丙氨酸残基取代。此外，其他氨基酸插入、缺失(例如从1-25氨基酸)和/或取代变异体也在考虑之列，包括在本发明范围之内。通常优选保守的氨基酸取代。另外，改变可以是氨基酸形式的改变，如模拟肽或D-氨基酸。
TMP化合物的Fc序列也可以衍生，即修饰不仅限于氨基酸残基的插入、缺失或取代。优选的修饰是天然存在的共价连接，包括如与聚合物、脂质、其他有机和无机部分的化学连接。本发明的衍生物可制备成延长循环半衰期，或设计成改善多肽对期望细胞、组织或器官的靶向定位能力。
还可应用完整Fc分子的救援受体结合域作为本发明化合物的Fc部分，如在题为“具有延长半衰期的改变多肽”的专利WO96/32478中所述。在这里命名为Fc分子类型的其他成员是在题为“具有延长半衰期的免疫球蛋白样域”的专利WO97/34631中所述的分子。本段中引用的两个公开发表的PCT申请，在此引入，作为参考。
Fc融合可以发生在TMP1或TMP2的N末端或C末端，或者发生在TMPs的N和C两端。令人惊异的发现是，Fc部分连接于TMP基团N末端的肽较其他可能性具有更高的生物活性，因此优选在TMP1N末端拥有Fc功能域的融合体(即在通式中，r和p同时为0，而m和q同时为1)。当Fc链与TMP或接头的N末端融合时，这种融合通常发生在Fc链的C末端，反之亦然。
同样优选的化合物是上述通式公布的化合物二聚体(例如，串联和非串联)。在这些情况下，每个Fc链都与一个串联TMP肽二聚体相连。这样一种化合物的图例在图6C中显示。这种类型化合物的优选实例基于图6C，其中，Fc是序列5化合物的二聚体，L2是(甘氨酸)5，TMP1和TMP2是序列1的化合物，L1是(甘氨酸)8。这种化合物在这里也称之为“Fc-TMP1-L-TMP2”。它也可以序列34的二聚体(通过Fc部分)形式表现。在图6C中所示，Fc基团通过接头与TMP2基团的C末端连接的化合物类似物，也在考虑之列，并在这里称之为“TMP1-L-TMP2-Fc”。
第二组的一些特例化合物在下面给出：
Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA                (序列22)
Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc             (序列23)
IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc            (序列24)
Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA             (序列25)
Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA            (序列26)
Figure S06104451820060224D000191
Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA(线性)
                                                     (序列28)
Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA            (序列29)
Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA            (序列30)
Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA            (序列31)
Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA             (序列32)
Figure S06104451820060224D000192
Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA
                                                     (序列34)
上述每一种化合物中，添加N末端蛋氨酸(或M残基，用单个字母表示)也在考虑之列。在这些情况下，蛋氨酸残基可以与Fc基团的N末端连接，其中，Fc基团与TMP的N末端相连。在另一些情况下，Fc基团与TMP的C末端相连，蛋氨酸残基可以与TMP基团的N末端连接。
在每种上述情况下，Fc优选人免疫球蛋白IgG1重链的Fc段，或其生物活性片段、衍生物或二聚体，见Ellison，J.W.等，核酸研究，10：4071-4079(1982)。序列5所示的Fc序列是上述化合物最优选的Fc段。同样优选的化合物是，Fc为序列5的二聚体形式，并且每一Fc链与一个TMP串联二聚体相连的化合物。
此外，尽管第二个实施方案的很多优选化合物包括一个或多个拥有两个相连的TMP部分的串联二聚体，本发明的其他化合物还包括串联TMPs多聚体，即如下示例结构的化合物：
Fc-TMP1-L-TMP2-L-TMP3；
Fc-TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4；
Fc-TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5；-
TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-Fc；
TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-Fc；
TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP-5-L-Fc；
其中，TMP1，TMP2，TMP3，TMP4和TMP5的结构可以相同，也可以不同，并且Fc，TMP和L的定义如上所述，接头是可选的。在上述每种情况下，Fc基团可以是单体，或二聚体，并且当Fc是二聚体时，一个或多个TMP多聚体可与每条Fc链相连。其他实例也在考虑之列，其中TMP二聚体或多聚体与一条或两条Fc链的N与C末端同时相连，包括TMP二聚体或多聚体与两条Fc链的所有四个末端相连的情况。
优选，本发明第二个实施方案的优选化合物总共有大约200-400个氨基酸(即，他们是多肽)。
制备方法
本发明的化合物可通过多种方式制备。因为很多化合物是肽，或包括肽，因此肽合成方法在这里尤其重要。例如，可能用到固相合成技术。适宜的技术在本领域是熟知的，并包括以下文献描述的方法，包括Merrifield，化学肽，335-61页(Katsoyannis和Panayotis编辑，1973)；Merrifield，美国化学学会杂志，85：2149(1963)；Davis等，国际生物化学杂志，10：394-414(1985)；Stewart和Young，固相肽合成(1969)；美国专利3 941 763；Finn等，蛋白质，第三版，第二卷，105-253页(1976)；以及Erickson等，蛋白质，第三版，第二卷，257-527页(1976)。固相合成法是制备各种肽的优选技术，因为这种方法是制备小型肽最经济有效的方法。
所述肽还可通过重组DNA技术在转化宿主细胞中制备。为达成此目的，需要制备编码该蛋白的重组DNA分子。制备这种DNA和/或RNA的方法在本领域是熟知的。例如，编码所述肽的序列可应用合适的限制性酶从DNA中切除。相关序列可应用包括有用限制性位点的聚合酶链反应(PCR)扩增创建，以备后续克隆。此外，DNA/RNA分子还可通过化学合成技术合成，例如亚磷酰胺法。而且，还可将这些技术组合使用。
本发明还包括一种在适宜宿主中编码肽的载体。载体包括可操作性连接于适宜表达调控序列的编码肽DNA分子。无论在肽编码DNA分子插入载体之前或之后，影响这一操作性连接的方法众所周知。表达调控序列包括启动子，激活物，增强子，操纵子，核糖体结合位点，起始信号，终止信号，戴帽信号，聚腺苷化信号，以及其他在转录或翻译过程中起调控作用的信号。
用得到的包含肽编码DNA分子的载体转化适宜宿主。该转化过程可用本领域熟知的方法进行。
在大量可以通过商业途径得到和众所周知的宿主细胞中，任何一种都可用于本发明实践。选择一种特定宿主有赖于本领域业已认定的多种因素。这些因素包括，例如，与所选表达载体的兼容性，DNA分子编码的肽对宿主细胞的毒性，转化率，回收肽的容易程度，表达特性，生物安全性和花费。必须平衡这些因素，而且应该理解，对于一个特定DNA序列的表达，并非所有宿主都有相等的效力。
在这些一般原则的指导下，有用的微生物宿主包括细菌(如大肠杆菌)，酵母菌(如酵母类，巴斯德毕赤酵母)和其他真菌，昆虫，植物，培养的哺乳动物(包括人类)细胞，或其他本领域熟知的宿主。
然后，转化宿主在常规发酵条件下培养，使所需肽表达。这些发酵条件在本领域是众所周知的。
最后，从表达所述肽的发酵培养基或宿主细胞中纯化所述肽。这些纯化方法在本领域也是众所周知的。
含有衍生肽或非肽基团的化合物可通过众所周知的有机化学技术合成。
化合物的应用
本发明化合物具有与c-Mpl受体结合并激活它的功能，和/或具有刺激(无论体内和体外)血小板产生(血小板生成活性)和血小板前体产生(巨核细胞生成活性)的能力。可应用标准方法，如在题为“刺激巨核细胞生长分化的组合物和方法”的WO95/26746中描述的方法，来评价这些化合物的功能。体内试验将在实施例部分给予进一步描述。
应用本发明组合物和方法治疗的病况通常是已经存在的巨核细胞/血小板减少，或在未来预期或期望的巨核细胞/血小板减少(如由于计划进行的手术或捐献血小板)。这些病况可能是由于体内活性Mpl(暂时性或永久性)缺乏导致。描述血小板减少的术语为血小板缺乏症，本发明的组合物和方法通常可用来预防或治疗有需要的血小板缺乏症患者。
世界卫生组织根据个体循环血小板的数量对血小板缺乏症进行了分类(Miller等，癌症，47：210-211(1981))。例如，没有血小板缺乏症体征的个体(0级)血小板计数通常至少为100 000/mm3。轻度血小板缺乏症(1级)表示循环血小板水平为79 000-99 000/mm3。中度血小板缺乏症(2级)血小板水平为50 000-74 000/mm3，重度血小板缺乏症的特征是血小板计数为25 000-49 000/mm3。致死性或无力性血小板缺乏症的特征为循环血小板浓度低于25 000/mm3。
血小板缺乏症(血小板减少)可以由多种原因导致，包括化疗和其他应用多种药物的治疗，放疗，手术，意外失血，和其他具体疾病。包括血小板缺乏症并可依据本发明进行治疗的具体疾病的示例为：再生障碍性贫血；特发性或免疫性血小板减少性紫癜(ITP)；HIV相关性ITP和HIV相关性血栓形成性血小板减少性紫癜；导致血小板缺乏症的转移性肿瘤；系统性红斑狼疮；包括新生儿狼疮综合征的脾大；范可尼综合征；维生素B12缺乏症，叶酸缺乏症；May-Hegglin异常；Wiskott-Aldrich综合征；慢性肝病；与血小板缺乏症相关的骨髓增生异常综合征；阵发性睡眠性血红蛋白尿；C7E3 Fab(Abciximab)治疗后的急性重症血小板缺乏症；同种异体免疫性血小板缺乏症，包括母体同种异体免疫性血小板缺乏症；与抗磷脂抗体和血栓形成相关的血小板缺乏症；自身免疫性血小板缺乏症；药物诱导的免疫性血小板缺乏症，包括卡铂诱导的血小板缺乏症，肝素诱导的血小板缺乏症；胎儿血小板缺乏症；妊娠性血小板缺乏症；Hughes综合征；狼疮样血小板缺乏症；意外和/或大量失血；骨髓增生障碍；患有恶性疾病的血小板缺乏症患者；血栓形成性血小板减少性紫癜，包括在肿瘤患者中表现为血栓形成性血小板减少性紫癜/溶血性尿毒症综合征的血栓形成性微血管病；自身免疫性溶血性贫血；隐性空肠憩室穿孔；纯红再障；自身免疫性血小板缺乏症；流行性肾病；利福平相关性急性肾衰竭；Paris-Trousseau血小板缺乏症；新生儿同种异体免疫性血小板缺乏症；阵发性睡眠性血红蛋白尿；胃癌的血液学改变；儿童期溶血性尿毒症综合征；病毒感染相关性血液学表现，包括甲型肝炎病毒和CMV相关性血小板缺乏症。此外，艾滋病的一些治疗也可导致血小板缺乏症(如AZT)。某些皮损愈合障碍也可受益于血小板数量的增加。
对于预期的血小板减少，如由于将来的手术，可在血小板需要前几天或几小时给予本发明化合物。对于紧急情况，如意外和大量失血，本发明化合物可与全血或纯化血小板一同给予。
本发明化合物还可用于刺激巨核细胞以外的特定细胞类型，如果发现这些细胞表达Mpl受体的话。与这些表达Mpl受体细胞相关的病况，所述细胞对Mpl配体刺激有反应，也属于本发明范畴。
本发明化合物还可用于以下任何情况，包括希望产生血小板或血小板前体细胞，或希望刺激c-Mpl受体。因此，例如，本发明化合物可用于哺乳动物需要血小板、巨核细胞等治疗的任何病况。这些病况在下述示例资料中有详细描述：WO95/26746；WO95/21919；WO95/18858和WO95/21920，在此引入。
本发明化合物对维持储藏期血小板和/或巨核细胞以及相关细胞的活性，也非常有益。因此，在含有这些细胞的组合物中包括一种或多种这种有效剂量的化合物，是很有用的。
“哺乳动物”的意思是任何一种哺乳动物，包括人类，居家豢养的动物包括狗和猫；野外和/或动物园豢养的动物包括猴子；实验室的实验动物包括小鼠，大鼠和荷兰猪；农场养殖动物如马，牛，绵羊，山羊和猪等。优选哺乳动物是人类。
药用组合物
本发明还提供应用本发明化合物构成药用组合物的方法。这些药用组合物可通过注射给药，或口服给药，鼻腔给药，经皮给药，或其他方式给药，包括，例如静脉给药，皮内给药，肌内给药，乳腺内给药，腹膜内给药，鞘内给药，眼内给药，球后给药，肺内给药(如雾化药物)，或皮下注射给药(包括皮下埋植长期释放给药)；通过舌下，肛门，阴道，或外科手术埋植，如在脾囊、脑、或角膜内植入给药。治疗包括单剂给药或在一段时期内重复给药。通常，本发明需要理解的是药用组合物包括有效剂量的一种本发明化合物与可药用的稀释剂，防腐剂，增溶剂，乳化剂，佐剂和/或载体。这些组合物包括多种缓冲液(如Tris-HCL，乙酸盐，磷酸盐)，pH值和离子强度的稀释剂；添加剂如去污剂和增溶剂(如Tween 80，聚山梨醇酯80)，抗氧化剂(如抗坏血酸，偏二亚硫酸钠)，防腐剂(如硫柳汞，苯乙醇)和膨胀剂(如乳糖，甘露醇)；将所述物质整合到聚合物化合物的特定制剂中，如聚乳酸，聚乙醇酸等，或整合到脂质体中。还可应用透明质酸，此点对于提高循环维持时间可能有效。药用组合物还可可选地包括其他药物学可以接受的用作药物媒介物、赋形剂、或媒体的流体，半固体，或固体稀释剂，包括但不限于聚乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，硬脂酸镁，甲基-和丙基羟苯甲酸酯，淀粉，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯胶，磷酸钙，矿物油，可可粉白脱，和可可油。这些组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态，稳定性，体内释放率和体内清除率。见，如雷明顿药理学，第18版(1990，Mack出版有限公司，Easton，巴拿马18042)，1435-1712页，在此引入，作为参考。制备的组合物可以是液态形式，也可以是干粉形式，如冻干形式。植入式持续释放剂型也在考虑之列，如经皮剂型。
这里考虑的应用剂型是口服固体剂量形式，在雷明顿药理学，第18版(Mack出版有限公司，Easton，巴拿马18042)第89章中有描述，该书在此引入，作为参考。固体剂型包括片剂，胶囊，丸剂，锭剂或糖锭剂，扁胶囊剂或小糖丸。同样，脂质体或蛋白质样胶囊也可用于构建本发明组合物(例如，在美国专利4 925 673中报道的蛋白质样小丸)。脂质体胶囊也可应用，并且脂质体可通过多种聚合物衍生获得(如美国专利5 013 556)。药物可能的固体剂型在1979年出版的由G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑的现代药理学第10章中由Marshall，K.给出描述，在此引入，作为参考。通常，制剂包括本发明化合物以及惰性成分，这些成分可以抵御胃酸环境，并在小肠内释放生物活性物质。
同样给予考虑的是上述本发明化合物的口服剂型。如有需要，化合物可进行化学修饰使口服有效。通常，考虑的化学修饰是在化合物分子上连接至少一个部分，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解；以及(b)从胃和肠壁摄取进入血流。同样需要的是增加化合物的整体稳定性并延长体内循环时间。这些部分的示例包括：聚乙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡萄糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷和聚脯氨酸(Abuchowski和Davis，可溶性聚合物酶加合物，药物酶，Hocenberg和Roberts编辑，Wiley-Interscience，纽约，纽约州，(1981)，367-383页；Newmark等，实用生物化学杂志，4：185-189(1982))。其他可用的聚合物是聚-1，3-diaxolane和聚-1，3，6-tioxocane.如上所示，优选的药用部分是聚乙二醇。
作为口服剂型，还可应用修饰脂肪族氨基酸的盐，如N-(8-[2-羟苯]氨)辛酸钠(SNAC)，作为增加本发明治疗性化合物吸收的载体。应用SNAC肝素剂型的临床有效性业已由Emisphere Technologies进行的II期临床试验显示。见美国专利5 792 451，“口服药物的给药组合物和方法”。
治疗药物剂型还可包括由颗粒大小约为1mm的颗粒或小糖丸形式构成的细小多颗粒。以胶囊形式给药的剂型还可做成粉剂，轻度压缩的栓剂甚或片剂。治疗药物可通过压缩技术制备。
色素和调味料也可都包含在内。例如，蛋白质(或衍生物)可以配制在内(如通过脂质体或微球胶囊)，然后再添加可食性产品，如包括色素和调味料的冷冻液体。
还可应用情性物质稀释或增加治疗药物的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，特别是甘露醇，α-乳糖，无水乳糖，纤维素，蔗糖，修饰的葡萄糖和淀粉。某些无机盐类也可用于填充剂，包括三磷酸钙，碳酸镁和氯化钠。一些可通过商业渠道获得的稀释剂包括Fast-Flo，Emdex，STA-Rx 1500，Emcompress和Avicell。
治疗性药物制剂中还应包括崩解剂以构成固体剂型。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业性崩解剂Explotab。淀粉羟乙酸钠，安伯莱特，羧甲基纤维素钠，ultramylopectin，藻酸钠，白明胶，桔皮，酸性羧甲基纤维素，天然海绵和斑脱土也都可以应用。崩解剂的另一种形式是不溶性阳离子交换树脂。粉状树脂也可用作崩解剂和粘合剂，包括粉状树脂如琼脂，刺梧桐树胶或黄芪胶。褐藻酸及其钠盐也可作为崩解剂。
粘合剂可以将治疗制剂结合在一起，形成坚硬的片剂。粘合剂包括来自天然产物的物质，如阿拉伯胶，黄芪胶，淀粉和白明胶。其他包括甲基纤维素(MC)，乙基纤维素(EC)，以及羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷(PVP)和羟丙甲基纤维素(HPMC)均可用于乙醇溶液以形成治疗性药物颗粒。
治疗性药物制剂中还可包括一种抗摩擦剂以防止在制备过程中的粘连。在治疗性药物和死壁之间可以应用润滑剂作为分层，这些润滑剂包括但不限于硬脂酸，其中包括其镁盐和钠盐，聚四氟乙烯(PTFE)，液体石蜡，植物油和蜡。可溶性润滑剂也可应用，如月桂基硫酸钠，月桂基硫酸镁，多种分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可以添加在制备过程中能够改善药物流体特性、在压缩过程中能够帮助再排列的glidants。Glidants可以包括淀粉，滑石，火成硅，水合硅铝酸盐。
为了帮助治疗性药物在液体环境中解散，可以添加表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可包括阴离子去污剂，如月桂基硫酸钠，二辛基磺基琥珀酸钠和二辛磺酸钠。阳离子去污剂也可应用，包括氯苄烷铵或氯苄乙铵。在制备过程中可作为表面活性剂的潜在非离子去污剂为lauromacrogol 400，聚乙二醇40硬脂酸酯，聚氧乙烯加氢蓖麻油10，50和60，甘油单硬脂酸酯，聚山梨醇酯40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或以不同比例以混合物的形式存在于蛋白或衍生物制剂中。
具有增加化合物摄取潜力的添加剂如脂肪酸十八烯酸，亚油酸和亚麻酸。
控释制剂是备受期待的。药物可以与惰性基质整合，该惰性基质允许以扩散或滤过的机制，如树胶释放。缓慢降解的基质如藻酸盐，多糖也可整合入制剂。该治疗性药物的另一种可控释放是通过基于Oros治疗系统(Alza股份有限公司)的方法，即将药物密封在半透膜中，该半透膜允许水分子进入，并在渗透效应作用下将药物通过唯一一个小型开口挤出。一些肠衣制剂也有缓释效应。
其他包膜也可用于制剂。这些包膜包括各种可以制成糖衣的糖类。治疗性制剂还可以薄膜封衣的片剂给出，用于该情况的物质可分为2类。第一类是非肠衣物质，包括甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，甲羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，providone和聚乙二醇。第二类包括常见的邻苯二甲酸酯的肠衣类物质。
可用混合物提供最适封衣包膜。封衣包膜可在平锅式封衣机或流化床或通过压缩封衣的方式实施。
本发明蛋白质(或其衍生物)通过肺给药也在考虑之列。所述蛋白质(或衍生物)通过吸入进入哺乳动物的肺脏，并穿过肺上皮细胞层进入血液。(有关于此的其他报道包括Adjei等，药理学研究，7：565-569(1990)；Adjei等，药理学国际杂志，63：135-144(1990)(醋酸leuprolide)；Braquet等，心血管药理学杂志，13(Suppl.5)：s.143-146(1989)(内皮素-1)；Hubbard等，内科学纪事，3：206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，临床研究杂志，84：1145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等，“蛋白质的气雾化”，呼吸系统药物给药研讨会II，Keystone，美国科罗拉多州，1990年3月(重组人生长激素)；Debs等，免疫学杂志，140：3482-3488(1988)(γ-干扰素和α-肿瘤坏死因子)；以及Platz等，美国专利5 284 656(粒细胞集落刺激因子))。
本发明的实际应用可考虑为治疗性产品肺部给药而设计的范围宽泛的器械装置，包括但不限于喷雾器，定量吸入器，和干粉式吸入器，本领域技术人员对所有这些装置都是熟悉的。
一些适用于本发明实际应用并可通过商业途径获得的特定装置实例如Ultravent喷雾器，由位于密苏里州圣路易斯的Mallinckrodt有限公司生产；Acorn II喷雾器，由位于科罗拉多州Englewood的Marquest医学产品公司生产；Ventolin定量吸入器，由位于北卡罗来纳州研究三角公园的葛兰素股份有限公司生产；以及Spinhaler干粉式吸入器，由位于马赛诸塞州Bedford的Fiscons有限公司生产。
所有这些装置都要求制剂配方的应用要适宜于本发明化合物的喷发。典型的，每种制剂配方特定于一种使用的装置，并在稀释剂、佐剂和/或载体外，包括应用一种在治疗中非常有用的适宜的推进剂。
最具优势的本发明化合物是制备成平均颗粒大小小于10μm(或微米)的特定形式，最优选0.5-5μm，因为可以最有效的到达肺脏末梢。
载体包括碳水化合物，如海藻糖，甘露醇，木糖醇，蔗糖，乳糖和山梨醇。其他配方中应用的成分可包括DPPC，DOPE，DSPC和DOPC。天然或合成的表面活性剂也可应用。还可应用聚乙二醇(甚或除了应用于衍生蛋白质或类似物)。葡聚糖，如环化葡聚糖也可应用。胆酸盐和其他的相关增强剂也可应用。纤维素和纤维素衍生物也可应用。氨基酸也可应用，如用于缓冲配方。
同样，应用脂质体，微胶囊，微球，复杂联合体或其他类型的载体也在考虑之列。
适用于喷雾器，无论喷射器或超声喷雾器，的典型配方制剂包括将本发明化合物以大约每毫升溶液含0.1-0.25mg生物活性蛋白的浓度溶于水。配方还可包括一种缓冲液和单糖(如为蛋白质稳定性和渗透压调节)。喷雾器配方还可包括一种表面活性剂，以减少或防止在气雾形成过程中溶液气化导致的表面诱导性蛋白聚合。
用于定量吸入器装置的配方通常包括借助于表面活性剂而悬浮于推进剂中的含有本发明化合物的细小粉粒。推进剂可以是适用于该目的的任一常规物质，如含氯氟烃，氢氯氟烃，烃氟烃，或烃，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，以及1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合物。适宜的表面活性剂包括山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。十八烯酸也可作为表面活性剂应用。
从干粉式吸入器装置中喷发的配方制剂应包括含有本发明化合物的细小干粉颗粒，还可包括一定量的膨胀剂，如乳糖，山梨醇，蔗糖，甘露醇，海藻糖或木糖醇，如50-90％配方重量，这些膨胀剂使干粉从装置中的喷发更加容易。
本发明化合物的鼻腔给药也在考虑之列。鼻腔给药允许鼻腔给予治疗性药物后，蛋白质直接进入血液，产品无需在肺部沉积。鼻腔给药的配方包括含有葡聚糖或环状葡聚糖的药物。通过其他粘膜运输给药的方式也在考虑之列。
剂量
治疗上述病况方法的剂量方案需由主治医师综合考虑多种影响药物作用的因素后决定，影响因素如患者的年龄、病情、体重、性别和饮食情况，任何感染的严重性，给药时间和其他临床因素。通常剂量范围为每公斤体重每天0.1μg-100mg本发明化合物，优选0.1-1000μg/kg；更优选0.1-150μg/kg，以每天剂量给予，或以相当剂量以更长或更短的间隔给予，如隔天给药，每周两次给药，每周一次给药，或每日两次或三次给药。
本发明化合物可通过首剂弹丸注射后持续输注来维持循环中药物的治疗水平。如另一例所示，本发明化合物也可以一次剂量给药。这些本领域常规技术应通过优良的医学实践结合患者个体的临床情况，决定最优化有效剂量和给药方案。给药频率有赖于药物的药代动力学参数和给药途径。最佳药物配方应由本领域技术人员根据给药途径和期望剂量决定。见，例如，雷明顿药理学，第18版(1990，Mack出版有限公司，Easton，巴拿马，18042)，1435-1712页，此书在此引入，作为参考。这些配方会影响药物的物理特性，稳定性，体内释放率和体内清除率。根据给药途径，适宜的剂量可以根据体重，体表面积或器官大小计算得出。为决定包括每一种上述配方的治疗适宜剂量而必须进行的进一步精细计算通常是由本领域技术人员在适宜的试验条件下给出的，特别是根据这里公开发表的剂量信息和试验方法，以及上述在人类临床试验中观察到的药代动力学数据。适宜的剂量可以通过应用业已建立的测定血液剂量水平方法结合适宜的剂量-反应资料而得到确认。最终剂量方案应由主治医师综合考虑多种可能影响药物作用的因素决定，如药物的具体活性，损伤的严重程度和患者的反应情况，患者的年龄，病情，体重，性别和饮食情况，任何感染的严重性，给药时间以及其他临床因素。随着研究的进行，针对多种疾病和病况的有关适宜剂量水平和治疗时间的进一步信息将不断产生。
本发明的治疗方法、组合物和化合物可单独或与其他细胞因子、可溶性Mpl受体、造血因子、白细胞介素、生长因子或抗体联合，在以其他症状合并血小板减少为特征的疾病状态的治疗中使用。预计本发明化合物在与一般造血刺激因子如IL-3或GM-CSF联合使用，治疗某些类型的血小板缺乏症时，将显示疗效。其他巨核细胞刺激因子，如meg-CSF，干细胞因子(SCF)，白血病抑制因子(LIF)，制瘤素M(OSM)，或其他具有巨核细胞刺激活性的分子也可与Mpl配体合用。其他可以如此联合给药的细胞因子或造血因子的实例包括，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-11，集落刺激因子-1(CSF-1)，M-CSF，SCF，GM-CSF，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，EPO，α-干扰素(IFN-α)，同型干扰素，IFN-β，IFN-γ，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，血小板生成素(TPO)，血管生成素(angiopoietins)，例如Ang-1，Ang-2，Ang-4，Ang-Y，人血管生成素样蛋白，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素(angiogenin)，骨形态发生蛋白-1，骨形态发生蛋白-2，骨形态发生蛋白-3，骨形态发生蛋白-4，骨形态发生蛋白-5，骨形态发生蛋白-6，骨形态发生蛋白-7，骨形态发生蛋白-8，骨形态发生蛋白-9，骨形态发生蛋白-10，骨形态发生蛋白-11，骨形态发生蛋白-12，骨形态发生蛋白-13，骨形态发生蛋白-14，骨形态发生蛋白-15，骨形态发生蛋白受体IA，骨形态发生蛋白受体IB，脑衍生神经营养因子，纤毛神经营养因子，纤毛神经营养因子受体α，细胞因子诱导的神经营养趋化因子1，细胞因子诱导的神经营养趋化因子2α，细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1，细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α，细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β，β内皮细胞生长因子，内皮素1，内皮生长因子，内皮衍生嗜中性粒细胞趋化剂(attractant)，成纤维细胞生长因子4，成纤维细胞生长因子5，成纤维细胞生长因子6，成纤维细胞生长因子7，成纤维细胞生长因子8，成纤维细胞生长因子8b，成纤维细胞生长因子8c，成纤维细胞生长因子9，成纤维细胞生长因子10，酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，神经胶质细胞系衍生神经营养因子受体α1，神经胶质细胞系衍生神经营养因子受体α2，生长相关性蛋白，生长相关性蛋白α，生长相关性蛋白β，生长相关性蛋白γ，肝素结合性上皮生长因子，肝细胞生长因子，肝细胞生长因子受体，胰岛素样生长因子I，胰岛素样生长因子受体，胰岛素样生长因子II，胰岛素样生长因子结合蛋白，角化细胞生长因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受体α，神经生长因子，神经生长因子受体，神经营养素-3，神经营养素-4，胎盘生长因子，胎盘生长因子2，血小板衍生内皮细胞生长因子，血小板衍生生长因子，血小板衍生生长因子A链，血小板衍生生长因子AA，血小板衍生生长因子AB，血小板衍生生长因子B链，血小板衍生生长因子BB，血小板衍生生长因子受体α，血小板衍生生长因子受体β，前B细胞生长刺激因子，干细胞因子受体，TNF，包括TNF0，TNF1，TNF2，转化生长因子α，转化生长因子β，转化生长因子β1，转化生长因子β1.2，转化生长因子β2，转化生长因子β3，转化生长因子β5，潜在转化生长因子β1，转化生长因子β结合蛋白I，转化生长因子β结合蛋白II，转化生长因子β结合蛋白III，I型肿瘤坏死因子受体，II型肿瘤坏死因子受体，尿激酶型血浆纤维蛋白溶酶原激活物受体，血管内皮生长因子，以及嵌合蛋白及其具有生物学或免疫学活性的部分。同时或依次给予有效剂量的可溶性哺乳动物Mpl受体对给药者来说也是有用的，该受体具有巨核细胞一旦成熟，就使巨核细胞分裂为血小板的效用。因此，给予本发明化合物(增加成熟巨核细胞数量)后，再给予可溶性Mpl受体(灭活配体并允许成熟巨核细胞产生血小板)，对于刺激血小板产生是一个具有特别预期效果的方法。上述剂量可以调整以补偿在治疗性组合物中添加的成分。患者的治疗进展可通过常规方法进行监控。
在将本发明化合物加入血小板和/或巨核细胞以及相关细胞组合物中时，包括的数量通常可用本领域熟知的技术和方法试验确认。示例数量范围是每106个细胞加入本发明化合物0.1μg-1mg。
应当理解，将本发明的教导应用于特定的问题或情况时，应根据这里给出的教导，并在本领域技术人员的能力范围内。下面将给出本发明产品及其代表性分离、应用及生产方法。
实施例
I.下面将介绍这里公开的一些第一组化合物的制备方法示例。
A.材料与方法
所有用于肽合成的氨基酸衍生物(全部是L构型)和树脂均购于Novabiochem公司。肽合成试剂(DCC，HOBt等)以溶液形式购于应用生物系统股份有限公司。两种PEG衍生物购于Shearwater Polymers股份有限公司。所有的溶剂(二氯甲烷，N-甲基吡咯烷酮，甲醇，乙腈)购于EM Sciences公司。在Beckman系统的Vydac柱(0.46cm×25cm，C18反相，5mm)上进行HPLC分析，洗脱流速为1ml/分，并在220和280nm处进行双重UV探测。在所有HPLC操作中应用线形梯度的两个移动相，缓冲液A-水(0.1％TFA)和缓冲液B-乙腈(0.1％TFA)。这里引用的编号肽，如17b，18，19和20，可参考表1的数字命名，其中一些在图2和3中有进一步的图示。
肽含成。所有的肽都通过已经建立的成熟的分步式固相合成法制备。运用Fmoc化学的固相合成法在ABI肽合成仪上进行。典型的，肽合成的开始是预装载0.1mmol的Wang树脂。Fmoc去保护按标准哌啶法进行。用DCC/HOBt实施偶联。侧链保护基团是：Glu(O-t-Bu)，Thr(t-Bu)，Arg(Pbf)，Gln(Trt)，Trp(t-Boc)和Cys(Trt)。第一个肽前体聚乙二醇化时，Dde用来侧链保护接头上的赖氨酸，Boc-Ile-OH用作最后一个偶联。通过应用无水肼(2％溶于NMP，3×2min)去除Dde，然后在DCC的作用下用溴乙酸酐进行偶联。对肽18来说，位于接头上的半胱氨酸侧链通过三苯甲基进行保护。最后的去保护和所有肽-树脂的断裂在RT(室温)下实施4小时，应用含2.5％水，5％苯酚，2.5％三异丙基硅烷和2.5％巯基苯甲醚的三氟乙酸(TFA)。去除TFA后，断裂肽用冷的无水乙醚沉淀。应用原材料在溶于水的15％DMSO(pH 7.5)中直接进行环状肽二硫键的构建。所有的原始肽都通过制备性反向HPLC纯化，并通过ESI-MS和氨基酸分析确认肽结构。
另外，上述所有肽还可以应用t-Boc化学法制备。在这种情况下，起始树脂是经典的Merrifield或Pam树脂，侧链保护基团是：Glu(0Bzl)，Thr(Bzl)，Arg(Tos)，Trp(CHO)，Cys(p-MeBzl)。可应用氢氟酸(HF)最后断裂肽树脂。
本研究所述所有含有天然氨基酸接头的串联二聚体肽也可通过重组DNA技术制备。
聚乙二醇化。业已发展的一种合成肽聚乙二醇化的新型聚汇策略包括通过在溶液中形成结合连接，使肽和聚乙二醇(PEG)部分结合，所述肽和PEG各携带一个可以相互反应的具体官能团。前体肽可容易地通过上述常规的固相合成法制备。如下所述，这些肽在特定位点携带适宜官能团，并处于“预激活”状态。这些前体在与PEG部分反应前经过纯化并进行充分的鉴定。肽和PEG的连接通常在液相发生，并可通过反向分析性HPLC容易地监控。聚乙二醇化的肽可通过制备性HPLC容易地得到纯化，并通过分析性HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱法确认。
肽19的制备。将肽17b(12mg)和MeO-PEG-SH 5000(30mg，2等份)溶解于1ml含水缓冲液中(pH 8)。混合物室温下孵育30分钟，应用分析性HPLC检测反应，并显示反应完成80％以上。聚乙二醇化的物质通过制备性HPLC分离。
肽20的制备。将肽18(14mg)和MeO-PEG-马来酰亚胺(25mg)溶解于1.5ml缓冲液中(pH 8)。混合物室温下孵育30分钟，此时，通过将一部分样本加到HPLC柱上，用分析性HPLC监控发现，完成~70％的转化。聚乙二醇化的物质通过制备性HPLC分离。
生物活性检测法。TPO的体外生物活性检测是通过有丝分裂法检测的，该方法应用转染了人mpl受体的IL-3依赖型鼠32D克隆细胞。这一方法在WO95/26746中有详尽描述。细胞在含有10％胎克隆II和1ng/ml mIL-3的MEM培养基中维持。在加入样本前，细胞用缺乏mIL-3的生长培养基洗脱两次。准备延伸十二点的TPO标准曲线，范围为3333-39pg/ml。每种样品制备四种预计位于标准曲线线性部分(1000-125pg/ml)的稀释液，并做三个重复。在每孔含有10000个细胞的96孔板的适宜孔中加入100μl每种稀释度的样品或标准品。在37C，10％CO2条件下孵育44小时后，每孔加入MTS(一种可被细胞生物还原为甲
Figure S06104451820060224D000331
的四唑化合物)。大约6小时后，在490nm下读取每孔的光密度。剂量反应曲线(TPO浓度的对数值比背景光密度值)产生，并可对位于标准曲线线性部分的点进行线性回归分析。未知测试样品的浓度可通过获得的线性方程式和校正稀释因子而得到。
缩略语。HPLC：高效液相层析；ESI-MS：电子束离子化质谱测定法；MALDI-MS：基质协助的激光解吸离子化质谱测定法；PEG：聚(乙二醇)。所有的氨基酸都以标准3个字母或1个字母编码表示。T-Boc：叔丁氧羰基；tBu：叔丁基；Bzl：苯甲基；DDC：二环己基碳二亚胺；HOBt：1-羟苯三唑；NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮；Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰；Trt：三苯甲基；Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-双氧-亚环己基)乙烷。
B.结果
以聚甘氨酸为接头的串联TMP二聚体。相互连接的TMP二聚体的设计是基于TMP二聚体形式是与c-Mpl(TPO受体)有效相互作用的需要这一假设，并且根据在受体存在的条件下，它们相互连接的形式，两个TMP分子被设计成在C和N-末端紧密相连，这样就不会影响整个二聚体分子的构型。很清楚，串联样连接的二聚体的活性还有赖于适宜的长度和接头成分的选择，该接头将两个TMP单体C和N-末端连接在一起。由于没有TMP与c-Mpl受体结合的结构资料，因此合成了接头含有0-10个和14个甘氨酸残基(表1)的一系列二聚体肽。之所以选择甘氨酸，是由于它的简单性和灵活性。灵活的聚甘氨酸肽链可以允许两个连接在一起的TMP分子自由折叠以形成需要构型，而空间位阻型氨基酸序列则可能形成不需要的二级结构，而其阻滞性则可能干扰二聚体肽与受体的正常结合。
可以通过Fmoc或t-Boc化学的常规固相肽合成法(Merrifiled，R.B.，美国化学协会杂志，85：2149(1963))得到合成的肽。与合成C末端连接的平行二聚体(序列2)不同，该平行二聚体需要应用直角保护的赖氨酸残基作为起始支点来构建两条假对称肽链(Cwirla，S.E.等，科学，276：1696-1699(1997))，合成我们的串联二聚体是一个从C末端到N末端的简单、逐步完成的连续肽链合成过程。由于二聚体化的TMP较C末端二聚体具有非常显著的增殖活性，而非结合亲和力(Cwirla，S.E.等，科学，276：1696-1699(1997))，合成的肽直接用TPO依赖性细胞增殖法检测生物学活性，该方法使用一种转染了全长c-Mpl(Palacios，R.等，细胞，41：727(1985))的IL-3依赖型鼠32D克隆细胞。如试验结果所示(见下表1)，应用这种细胞增殖法，所有聚甘氨酸连接的串联二聚体都较单体显示了1000倍以上的(刺激增殖)潜力，甚至较C末端二聚体也有显著增加。在我们的方法中，C末端二聚体的绝对活性低于天然TPO，这与以前C末端二聚体与天然配体活性一致的报道发现相左(Cwirla，S.E.等，科学，276：1696-1699(1997))。这也许是由于在两种方法中所用条件不同导致的。但是，在同一试验中，串联二聚体(第一个单体的C末端与第二个单体的N末端相连)与平行二聚体(第一个单体的C末端与第二个单体的C末端相连)活性的差异清楚的显示了串联二聚体产品较平行二聚体产品的优越性。我们有兴趣的注意到，接头宽范围的长度变化均可耐受。选定TMP单体的最佳接头(序列1)明显是由8个甘氨酸组成。
其他串联二聚体。在这第一系列串联TMP二聚体之后，又设计了几个其他分子，它们或者是接头不同，或者是在单体中含有修饰。肽13是这些分子中的第一个，拥有含GPNG的接头，GPNG是一个已知具有形成β-折叠型二级结构的高倾向性的序列。尽管所述肽较单体(刺激增殖)潜力提高大约100倍，但较GGGG-连接类似物的活性低10倍以上。因此，在接头区引入相对僵硬的β-折叠似乎可导致这种短接头形式最佳激动剂构型的轻微破坏。
在随机肽文库中分离的活性肽中，色氨酸9是TMP序列的一个高度保守残基。在EPO模拟肽同型序列中也存在一个高度保守的色氨酸，并发现这个色氨酸残基参与了两个EPO模拟肽(EMPs)间疏水核心的形成，并与EPO受体的疏水相互作用有关(Livnah，O.等，科学，273：464-471(1996))。通过推理，考虑TMP中的色氨酸9残基可能在肽配体二聚体化过程中具有相似功能，为了调整并评估两个吲哚环之间存在的非共价疏水力效应，构建了几个在色氨酸位点发生了突变的类似物。因此在肽14中，两个TMP单体中的色氨酸均被半胱氨酸取代，并通过氧化作用在两个半胱氨酸残基间形成分子内二硫键，这是为了模仿在肽二聚体化过程中在两个色氨酸间形成的疏水作用。肽15是肽14的还原形式。在肽16中，两个色氨酸残基被丙氨酸取代。如试验资料所示，所有这三种类似物都是没有活性的。这些资料进一步显示，色氨酸不仅对二聚体形成很重要，对保持TPO模拟肽的活性也至关重要。
下面两个肽(肽17a和18)在它们接头的第8个氨基酸上含有赖氨酸或半胱氨酸残基。这两个化合物是两个聚乙二醇化的肽(肽19和20)的前体，其中，赖氨酸或半胱氨酸侧链被聚乙二醇(PEG)部分修饰。决定将PEG部分引入一个相对较长的接头的中间部分，这样，这一巨大的PEG组分(5kDa)就可以远离肽分子重要的结合位点。PEG是一种已知的生物兼容性聚合物，作为一种共价修饰物广为应用，可以改善基于肽和蛋白质的药品的药代动力学特征。
为了更方便的使合成或重组肽聚乙二醇化，设计了一种基于液相的模式方法。该方法基于目前已成熟建立的化学选择配基策略，该策略使一对可以相互发生反应的功能基发生特定反应。因此，对肽19来说，先给肽17b的赖氨酸侧链应用溴乙酰基团预激活，以适应与巯基衍生的PEG发生反应。为了达到这一目的，应用一个直角保护基团Dde来保护赖氨酸□-氨基。一旦整个肽链聚合，就要应用t-Boc对N端氨基进行再保护。然后除去Dde以允许溴乙酰化。这一策略可以生产出高质量的原始肽，该肽可通过常规的反向HPLC容易的得到纯化。肽与巯基修饰的PEG的连接发生在pH 8的缓冲液中，反应在30分钟内完成。应用MALDI-MS分析聚乙二醇化的纯化物质，出现一个特征性钟型光谱，在两个邻近峰之间有一个44Da的增量。对PEG-肽20来说，在接头区有一个半胱氨酸残基，其侧链上的巯基可以作为含有马来酰亚胺的PEG的连接位点。可以应用相同的条件聚乙二醇化该肽。如试验资料显示，这两种聚乙二醇化的肽，体外生物活性甚至较它们未聚乙二醇化的肽高。
肽21在其具有8个氨基酸的接头上存在一个潜在糖基化功能区，NGS。由于示例串联二聚体是由天然氨基酸通过肽键连接组成的，因此在真核细胞系统中表达这样一个分子，可以产生在天门冬酰胺羧胺侧链上添加有碳水化合物部分的糖蛋白。糖基化是一个常见的翻译后修饰方法，可以通过增加蛋白质的水溶性和体内稳定性，对一个既定蛋白质的生物活性产生很多积极影响。如试验资料所示，将糖基化功能区整合进入接头，依然可以维持高生物活性。合成的潜在糖蛋白前体与-(甘氨酸)8-连接的类似物具有相当的活性。一旦糖基化，这种肽将与聚乙二醇化的肽具有相同的活性，因为PEG和碳水化合物部分显示了相似的理化特性。
最后一种肽是二聚体的二聚体。它通过氧化肽18获得，这一方法可以使位于接头上的两个半胱氨酸残基形成分子内二硫键。这种肽是为了表明TMP四聚体也具有活性的可能性而设计的。试验资料显示这种肽在调整摩尔的基础上，并不比平均串联二聚体更具活性，这一结果间接支持了TMP的活性形式其实是二聚体的想法，否则将串联二聚体再二聚体化会对生物活性产生进一步影响。
下表1总结了应用上述体外试验方法得出的上述化合物的相对活性(相对潜力)。
表1
化合物                                              相对(增殖刺激)潜力
(EC50)
TPO                                                 4.0
TMP单体(序列1)                                      1.0
TMP C-C二聚体(序列2)                                3.5
TMP-(Gly)s-TMP：
1    n＝0                                           4.5
2    n＝1                                           4.0
3    n＝2                                           4.0
4    n＝3                                           4.0
5    n＝4                                           4.0
6    n＝5                                           4.0
7    n＝6                                           4.0
8    n＝7                                           4.0
9    n＝8                                           4.5
10   n＝9                   -                       4.0
11   n＝10                                          4.0
12   n＝14                                          4.0
13  TMP-GPNG-TMP(序列10)                            3.0
15  IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA          0.5
             (序列12)
16  IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA          0.5
             (序列13)
17a TMP-GGGKGGGG-TMP        (序列14)                4.0
17b TMP-GGGK(BrAc)GGGG-TMP  (序列15)                ND
18  TMP-GGGCGGGG-TMP        (序列16)                4.0
19  TMP-GGGK(PEG)GGGG-TMP   (序列17)                5.0
20  TMP-GGGC(PEG)GGGG-TMP   (序列18)                5.0
21  TMP-GGGNGSGG-TMP        (序列19)                4.0
Figure S06104451820060224D000372
备注：表1中的数字大约表示活性的对数，因此活性“1”和“4”之间的差异大约是1000倍。0.5的增量是中间点，因此活性“1”和“3.5”之间的差异大约是500倍。“ND”的意思是没有检测。
II.下面将介绍这里公开的一些第二组化合物的制备方法示例。
A.如图6C所示Fc融合化合物的制备
编码人IgG1 Fc段的DNA序列与TPO模拟肽二聚体(序列34)框内融合，置于如下所示表达载体质粒pAMG21中的luxPR启动子控制下。
融合基因通过标准PCR技术构建。PCR反应的模板是含有Fc序列和编码序列34化合物剩余物的合成基因的融合载体。该合成基因通过下面显示的4个重叠寡核苷酸构建：
1830-52    AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG
           ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT
                                        -     (序列35)
1830-53    ACC TCC ACC ACC AGC ACG AGC AGC CAG
           CCA CTG ACG CAG AGT CGG ACC        (序列36)
1830-54    GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC
           CCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA CGC GCA
                                           (序列37)
1830-55    AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG
           CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC
           CTC CGC CGC C                   (序列38)
这4个寡核苷酸经过退火形成下面所示的双链结构。
R  A  *
序列39[线性对称寡核苷酸1830-52和1830-54]
序列40[线性对称寡核苷酸1830-53和1830-55]
以及序列41[编码氨基酸序列]
这一双链结构应用PCR反应扩增，以1830-52和1830-55作为正义和反义引物。
分子的Fc部分通过PCR反应应用引物扩增Fc DNA产生。
1216-52    AAC ATA AGT ACC TGT AGG ATC G        (序列42)
1830-51    TTCGATACCACCACCTCCACCTTTACCCGGAG-
                  ACAGGGAGAGGCTCTTCTGC          (序列43)
寡核苷酸1830-51和1830-52含有重叠的24个核苷酸，允许通过应用另外的引物1216-52和1830-55，在第三个反应中将上述PCR产物结合，从而将两个基因以正确的阅读框融合在一起。
最终的PCR基因产物(全长融合基因)用限制性内切酶XbaI和BamHI消化，然后与同样经过XbaI和BamHI消化的载体Pamg21(见下)连接。用连接DNA转化宿主细胞大肠杆菌2596株(GM221，见下述)。筛选具有产生重组蛋白产品能力并拥有正确核苷酸序列的融合基因的克隆。蛋白表达水平应用50ml摇瓶研究检测。全菌体溶菌液用考马斯染色的PAGE凝胶分析融合基因的表达。
融合蛋白的氨基酸序列及相应的核苷酸序列如下所示：
XbaI
Figure S06104451820060224D000391
序列44[上示单链，阅读方向5’→3’]
序列45[上示单链，阅读方向3’→5’]以及
序列46[编码的氨基酸序列]
pAMG21
表达质粒pAMG21可通过ATCC获得，其保藏号为98113，保藏日期为1996年7月24日。
GM221(Amgen宿主株#2596)
Amgen宿主株#2596是一种业已经过修饰的大肠杆菌K-12株，含有位于早ebg区的温度敏感λ抑制子cI857s7和位于晚ebg区的lacIQ抑制子(68分钟)。这两个抑制子基因的存在使这种宿主可以广泛应用于表达系统，但这两种抑制子与luxPR的表达无关。未转化的宿主无抗生素耐药性。
cI857s7基因的核糖体结合位点经过修饰，包括一个增强的RBS。它被插入ebg操纵子中，该操纵子位于核苷酸位点1170和1411之间，其计数与去除了插入ebg序列的基因文库编号为M64441Gb_Ba的一致。
通过被称之为MMebg-cI857s7增强RBS#4的重组噬菌体将构建体导入F’tet/393染色体中。经重组和分离后，只有上述染色体插入遗留在菌体中。将之重新命名为F’tet/GM101。
然后，F’tet/GM101通过导入lacIQ构建体进行修饰，该构建体被插入ebg操纵子中，该操纵子位于核苷酸位点2493和2937之间，其计数与去除了插入ebg序列的基因文库编号为M64441Gb_Ba的一致。
通过被称之为AGebg-LacIQ#5的重组噬菌体将构建体导入F’tet/GM101染色体中。经重组和分离后，只有上述染色体插入遗留在菌体中。将之重新命名为F’tet/GM221。然后用溶于LB浓度为25μg/ml的吖啶橙将F’tet附加体从菌株中去除。去除F’tet附加体的菌株经鉴定为四环素敏感，并以GM221命名保藏。
质粒pAMG21含有Fc融合构建体(在这里称之为pAGM21-Fc-TMP-TMP)，含有该质粒的宿主株GM221保藏于ATCC，保藏号为98957，保藏时间为1998年10月22日。
表达。在含有50μg/ml卡那霉素的Luria Broth培养基中培养的含pAGM21-Fc-TMP-TMP的大肠杆菌GM221，诱导前37℃孵育。在向培养基中添加合成自动诱导剂N-(3-氧己酰)-DL-同型丝氨酸内酯至终浓度为20ng/ml后，在luxPR启动子的作用下，诱导Fc-TMP-TMP基因产物表达开始，培养基在37℃进一步孵育3小时。3小时后，显微镜检查细菌培养基中内含体的存在，并离心收集。在诱导培养基中现察到有折射能力的内含体表示，在大肠杆菌中产生的Fc-TMP-TMP最有可能是不溶性的片段。将菌体颗粒再悬浮于含10％β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中直接溶解，然后通过SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE凝胶上，可以观察到大约30kDa的考马斯加强染色带。预期的基因产物长度为269个氨基酸，预期分子量大约为29.5kDa。在标准10L规模的批量条件下进行发酵，获得的Fc-TMP-TMP的表达水平与在小规模下相似。
Fc-TMP-TMP的纯化
通过高压匀浆(14000PSI通过2次)将菌体在水中(1/10)碎裂，并通过离心(在J-6B离心机中以4200转/分离心1小时)收获内含体。以1/10的比例将内含体溶解于pH 8.7的6M胍，50mM Tris，8mM DDT中1小时。溶解混合物用pH 8.5的2M尿素，50mM Tris，160mM精氨酸，3mM半胱氨酸稀释20倍。混合物在冷环境下搅拌过夜。在整个过程的这一点，Fc-TMP-TMP单体亚单位二聚体化，形成具有如图6C所示结构的二硫键连接的化合物。然后通过超滤作用浓缩大约10倍。之后，再用pH 9的10mM Tris，1.5M尿素稀释3倍。然后用乙酸调节混合物pH至5。离心去除沉淀物，将上清装载到用pH 5的20mM NaAc，100mMNaCl平衡的SP-Sepharose快流柱上(蛋白负载浓度为10mg/ml，室温)。用溶解于相同缓冲液的100mM-500mM的NaCl以20倍柱容积梯度洗脱蛋白质。洗脱液稀释3倍后，装载到pH 5的20mM NaAc，150mM NaCl平衡的SP-Sepharose HP柱上(蛋白负载浓度为10mg/ml，室温)。用溶解于相同缓冲液的150mM-400mM的NaCl以20倍柱容积梯度洗脱蛋白质。收集过滤高峰洗脱液。
III。下面总结了多种本发明化合物在小鼠体内试验的资料。
小鼠。大约10-12周龄的正常雌性BDF1小鼠。
放血方案。每组的其中10只小鼠在第0天接受处理，2组在4天后开始，每组总共20只小鼠。5只小鼠在每一时间点放血，每周至少放血3次。小鼠用异氟烷麻醉，并通过针刺眼窦放血，放血总量为140-160μl。鼠血在运行鼠血软件的Technicon H1E全血分析仪上计数。检测的参数有白细胞，红细胞，红细胞压积，血红蛋白，血小板和中性粒细胞。
治疗。小鼠或者接受皮下弹丸注射治疗，或者通过埋植的微渗透泵接受连续7天给药治疗。皮下注射给药量为0.2ml。渗透泵插入位于麻醉小鼠肩胛骨之间皮肤上的皮下切口。化合物用含0.1％BSA的PBS稀释。所有的试验都包括一个对照组，标记为“载体”，只用稀释液处理。泵中试验样品的浓度经过调整，因此泵中给药的校正流速可以通过图形显示。
化合物。一个剂量滴定的化合物通过微渗透泵在7天内给予小鼠。多种化合物以单剂量为100μg/kg的量通过微渗透泵在7天内给予小鼠。一些相同的化合物以单次弹丸注射的方式给予小鼠。
活性试验结果。活性试验的结果在图4和5中显示。在应用7天微渗透泵给药的剂量反应试验中(试验数据未给出)，序列18化合物的最大效果出现在100μg/kg/天；10μg/kg/天的剂量大约是最大活性的50％，1μg/kg/天是最低剂量，在该试验受体中仍可观察到活性。在同一试验中，该化合物10μg/kg/天的剂量大约与100μg/kg/天未聚乙二醇化的rHu-MGDF活性相当。
IV.讨论
MGDF与人生长激素(hGH)以相似的方式发挥作用已广为接受，即一分子蛋白配体与两分子受体结合以激活受体(Wells，J.A.等，生物化学评论纪事，65：609-634(1996))。比之甚小的TMP肽也通过模仿这种相互作用方式发挥作用。但是本研究显示，这种模仿需要两个TMP分子共同作用，即TMP以C-C平行或C-N依次共价二聚体的方式，可以较原始单体体外生物活性潜能增加103以上。单体相对低下的生物潜能可能是由于没有有效的形成非共价二聚体。预先形成的共价二聚体可以消除形成非共价二聚体的熵阻障，该非共价二聚体是在两个14残基肽小分子间形成的唯一较弱的非共价相互作用。
我们饶有兴趣的注意到，绝大部分串联二聚体较C末端平行二聚体更具(生物)潜能。串联二聚体化似乎较C-C平行二聚体化赋予分子更好的适应构型。串联二聚体看起来不对称的特征可能使它更接近天然配体，作为一种非对称分子，天然配体可能用两个不同的位点与两个相同的受体分子结合。
引入PEG部分应该得到正视，因为它通过保护蛋白分子避免蛋白水解，延缓通过肾滤过的清除，而增强了修饰肽的体内活性。在基于细胞的增殖试验中，聚乙二醇化可以进一步增加串联二聚体TMP肽的体外生物活性是一个意外收获。
V.下面总结了多种本发明化合物在猴体内试验的资料。
为了评价皮下给予TMP对雌性恒河猴血液学参数的影响，设计并实施了以下方案。试验共设5组，每组3只恒河猴。组1为对照组，给予不含TMP或聚乙二醇化的重组人MGDF(PEG-rHuMGDF)的醋酸盐缓冲液(20mM醋酸钠，0.25mM氯化钠，pH 5)；组2以下述间隔给予一剂或多剂TMP；组3以下述间隔给予1000μg/kg的TMP；组4以下述间隔给予5000μg/kg的TMP；组5以下述间隔给予100μg/kg的PEG-rHuMGDF。
首次单剂量给药时间被定义为第1周期第0天。在第2周期中，给药时间为第21，2 3，25，28，30和32天。在第3周期，第84天单剂量给药一次，在第4周期，第123天单剂量给药一次。观察试验动物临床体征，在适应环境期每天1次，在给药日每天3次(给药前，给药30分钟后，给药2-3小时后)，在非给药日，每天1次。从试验开始前7天到恢复期结束，通过给予每个试验动物的食物片数和剩余食物片数计算每天食量。每个试验动物在开始给药方案前测量体重两次，给药期间和恢复期再测量两次。在开始给药前和试验第1，3，5，7，9，11，13，15，20，22，24，26，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，55，62，69，76，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，111，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，150天分别采集血样1次备用。药代动力学分析。在给药前和给药后1，4和24小时分别采集0.5ml血清样本。样本在第0，21，32，84和123天采集，并储存于大约-70℃，直到分析。为分析抗体，在单剂给药前1周和第0(给药前)，6，13，20，27，34，41，48，55，62，69，76，83，90，97，104，111，118，129，136，143和150天分别采集血样2ml。样品储存于大约-70℃，直到分析。
结果显示，所有治疗组均有血小板计数的升高，最大增值见于PEG-rHuMGDF和高剂量TMP组。在第1周期，与对照组平均血小板计数相比，血小板计数峰值在PEG-rHuMGDF组大约增加3.3倍(第9天)，在5000μg/kgTMP组大约增加3.1倍(第9天)。在低剂量TMP组，在相同的特定研究时间，血小板计数较对照组增加约1.5倍。在所有其他周期中，可观察到相似反应。
但是在第4周期，PEG-rHuMGDF组没有显示与前几个周期一样的血小板增量。在这一周期给药后9天，PEG-rHuMGDF组血小板计数较对照组增加约2倍。相对的，最高剂量TMP组在第4周期平均血小板计数比对照组增加约3.3倍。另外，PEG-rHuMGDF组试验动物在第4周期开始时(每剂量)，平均血小板计数较对照组平均血小板计数低53％，在第4周期结束时*(给药后27天)，该组平均血小板计数较对照组低79％。而对所有TMP试验动物而言，第4周期开始和结束时，其平均血小板计数是对照组的±15％。
在第1和第2周期，所有治疗组对比对照组显示了红细胞(RBC)计数的下降趋势。下降在第41-43天最为显著，RBC最大的下降出现在PEG-rHuMGDF组。早在第47天，计数开始回复到正常水平(与对照组相比)。白细胞(WBC)水平在第1和第2周期与对照组相比在第35天显著升高(2.6倍)。在第33天，5000μg/kg TMP组显示了轻度升高。从第37天开始，白细胞计数趋于正常(对照组)水平。在第3周期观察到了相似的反应，而在第4周期，所有治疗组都没有明显变化。
在第3周期，除了500μg/kg TMP组，所有治疗组在第13天(在第3周期单一剂量给药后)都显示了RBC计数的轻度下降。RBC计数在第17天开始回复正常水平(与对照组相比)。
在第4周期，除了500μg/kg TMP组，所有治疗组较对照组都显示了RBC下降。但与其他用期不同，在本周期中存在多个最低点。这些下降从给药后1-9天开始显现，并在11天开始恢复。
结果显示，在所有试验周期和所有试验动物中，给药7-9天后，可以检测到血小板计数较对照动物的升高。重复给药较之单剂给药可以显示更高的血小板产生反应。在第4周期，PEG-rHuMGDF组诱导的血小板反应较之前几个周期要低，而且较高剂量TMP的反应也低。在绝大多数治疗组和第1，2，3和4周期，在研究的每个周期的某些时间点，都现察到了RBC计数的下降，但是，在停药后，所有血液学参数都回复到正常水平(与对照组比较)。
总之，这些结果显示，恒河猴可以很好地耐受TMP治疗，而且TMP在多周期治疗后，都可增加血小板计数。基于血小板计数结果，没有显示针对TMP的显著生物免疫介导反应。相反，应用PEG-rHuMGDF治疗多个周期，在第4周期却显示了对血小板反应的抑制，提示机体产生了针对PEG-rHuMGDF的抗体，这些抗-MGDF抗体可能会与恒河猴内源性TPO发生交叉反应。
本发明现已充分描述，对于本领域的一般技术人员而言，在不背离这里公开的本发明的精神和范畴的情况下，可以做很多改变与修饰。
序列表
<110>Liu，Chuan-Fa
Feige，Ulrich
Cheetham，Janet C.
<120>与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
<130>01017/36263
<140>
<141>
<150>60/105,348
<151>1998-10-23
<160>46
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>1
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
 1               5                  10
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<220>
<223>肽是同型二聚体的亚单位：在每个二聚体亚单位的羧基末端都通过肽键与
NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(CONH2)-NH-CO-CH2-CH2-NH2共价连接。
<400>2
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
 1               5                  10
<210>3
<211>684
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
     寡核苷酸
<400>3
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgt ccagctccgg aactcctggg gggaccgtca 60
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaa                                        684
<210>4
<211>684
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
寡核苷酸
<400>4
tacctgtttt gagtgtgtac aggtggaaca ggtcgaggcc ttgaggaccc ccctggcagt 60
cagaaggaga aggggggttt tgggttcctg tgggagtact agagggcctg gggactccag 120
tgtacgcacc accacctgca ctcggtgctt ctgggactcc agttcaagtt gaccatgcac 180
ctgccgcacc tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcat gttgtcgtgc 240
atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttacc gttcctcatg 300
ttcacgttcc agaggttgtt tcgggagggt cgggggtagc tcttttggta gaggtttcgg 360
tttcccgtcg gggctcttgg tgtccacatg tgggacgggg gtagggccct actcgactgg 420
ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag tttccgaaga tagggtcgct gtagcggcac 480
ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg 540
aggctgccga ggaagaagga gatgtcgttc gagtggcacc tgttctcgtc caccgtcgtc 600
cccttgcaga agagtacgag gcactacgta ctccgagacg tgttggtgat gtgcgtcttc 660
tcggagaggg acagaggccc attt                                        684
<210>5
<211>228
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>5
Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            20                  25                  30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        35                  40                  45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    50                  55                  60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                85                  90                  95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        115                 120                 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145                 150                 155                 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Val Leu Asp Sar Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            180                 185                 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        195                 200                 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>6
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly
 1               5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>7
Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly
 1               5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>8
Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly
 1               5
<210>9
<211>4
 <212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>9
Gly Pro Asn Gly
 1
<210>10
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>10
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro
 1               5                  10                  15
Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
             20                  25                  30
<210>11
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<220>
<223>环状肽：通过位于9和31位点的半胱氨酸残基间的分子内二硫键来维持二级结构。
<400>11
 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
  1               5                  10                  15
 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu
              20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
         35
<210>12
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>12
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Arg Leu Gln Cys Leu
             20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>13
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>13
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Ala Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
1                5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Ala Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>14
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>14
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>15
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>位于18位点的赖氨酸残基溴乙酰化。
<220>
<223>人工序列描述：衍生肽
<400>15
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>16
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>16
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
  1               5                  10                  15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
             20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>17
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>位于18位点的赖氨酸聚乙烯二醇化。
<220>
<223>人工序列描述：衍生肽
<400>17
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
  1               5                  10                  15
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
             20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>18
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>位于18位点的半胱氨酸聚乙烯二醇化。
<220>
<223>人工序列描述：衍生肽
<400>18
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>19
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>19
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Asn Gly Ser Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
             20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>20
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>同型二聚体的单体亚单位；同型二聚体中的亚单位通过位于每个亚单位18位点的半胱氨酸残基间二硫键连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>20
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>21
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>21
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
35
<210>22
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>通过在肽氨基末端共价连接免疫球蛋白Fc段来衍生肽。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>22
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro
 1               5                  10                  15
Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
            20                  25              30
<210>23
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的氨基和羧基末端均与一个免疫球蛋白Fc段共价连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>23
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro
 1               5                  10                  15
Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
             20                  25                  30
<210>24
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的羧基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>24
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>25
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>25
Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
 1               5                  10                  15
Gly Pro Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala
             20                  25                 30
Arg Ala
<210>26
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>26
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>27
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<220>
<223>环状肽：通过位于9和31位点的半胱氨酸残基间的分子内二硫键来维持二级结构。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>27
 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>28
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>28
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu Ala Ala Ara Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>29
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<400>29
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Ala Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Ala Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>30
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>30
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>31
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>31
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>32
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<400>32
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Ash Gly Ser Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>33
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<220>
<223>肽是同型二聚体的亚单位；同型二聚体中的亚单位通过位于每个亚单位18位点的半胱氨酸残基间二硫键连接。
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<400>33
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
             20                  25                  30
Ala Ala Arg Ala
        35
<210>34
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<220>
<223>肽的氨基末端与免疫球蛋白的Fc段共价连接。
<400>34
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala
 1               5                  10                  15
Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
        35                  40
<210>35
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
寡核苷酸
<400>35
aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60
<210>36
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
寡核苷酸
<400>36
acctccacca ccagcacgag cagccagcca ctgacgcaga gtcggacc               48
<210>37
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
     寡核苷酸
<400>37
ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca  60
cgcgca                                                             66
<210>38
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
寡核苷酸
<400>38
aaaaaaagga tcctcgagat tatgcgcgtg ctgcaagcca ttggcgaagg gttgggccct        60
caatacctcc gccgcc                                                        76
<210>39
<211>126
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
寡核苷酸
<400>39
aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct        60
ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca        120
cgcgca                                                                   126
<210>40
<211>124
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
     寡核苷酸
<400>40
ccaggctgag acgcagtcac cgaccgacga gcacgaccac cacctccacc gccgcctcca     60
taactcccgg gttgggaagc ggttaccgaa cgtcgtgcgc gtattagagc tcctaggaaa     120
aaaa                                                                  124
<210>41
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>41
Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
 1               5                  10                  15
Ala Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro
             20                  25                  30
Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
         35                  40
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
     寡核苷酸
<400>42
aacataagta cctgtaggat cg                                                  22
<210>43
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
     寡核苷酸
<400>43
ttcgatacca ccacctccac ctttacccgg agacagggag aggctcttct gc     52
<210>44
<211>861
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
寡核苷酸
<400>44
tctagatttg ttttaactaa ttaaaggagg aataacatat ggacaaaact cacacatgtc 60
caccttgtcc agctccggaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 120
ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 180
gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 240
ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 300
ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 360
ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 420
aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 480
gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 540
cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 600
acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 660
tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 720
aaggtggagg tggtggtatc gaaggtccga ctctgcgtca gtggctggct gctcgtgctg 780
gtggtggagg tggcggcgga ggtattgagg gcccaaccct tcgccaatgg cttgcagcac 840
gcgcataatc tcgaggatcc g                                           861
<210>45
<211>861
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：
     寡核苷酸
<400>45
agatctaaac aaaattgatt aatttcctcc ttattgtata cctgttttga gtgtgtacag 60
gtggaacagg tcgaggcctt gaggaccccc ctggcagtca gaaggagaag gggggttttg 120
ggttcctgtg ggagtactag agggcctggg gactccagtg tacgcaccac cacctgcact 180
cggtgcttct gggactccag ttcaagttga ccatgcacct gccgcacctc cacgtattac 240
ggttctgttt cggcgccctc ctcgtcatgt tgtcgtgcat ggcacaccag tcgcaggagt 300
ggcaggacgt ggtcctgacc gacttaccgt tcctcatgtt cacgttccag aggttgtttc 360
gggagggtcg ggggtagctc ttttggtaga ggtttcggtt tcccgtcggg gctcttggtg 420
tccacatgtg ggacgggggt agggccctac tcgactggtt cttggtccag tcggactgga 480
cggaccagtt tccgaagata gggtcgctgt agcggcacct caccctctcg ttacccgtcg 540
gcctcttgtt gatgttctgg tgcggagggc acgacctgag gctgccgagg aagaaggaga 600
tgtcgttcga gtggcacctg ttctcgtcca ccgtcgtccc cttgcagaag agtacgaggc 660
actacgtact ccgagacgtg ttggtgatgt gcgtcttctc ggagagggac agaggcccat 720
ttccacctcc accaccatag cttccaggct gagacgcagt caccgaccga cgagcacgac 780
caccacctcc accgccgcct ccataactcc cgggttggga agcggttacc gaacgtcgtg 840
cgcgtattag agctcctagg c                                           861
<210>46
<211>269
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽
<400>46
Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            20                  25                  30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        35                  40                  45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    50                  55                  60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
 65                  70                  75                  80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                 85                  90                  95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        115                 120                 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145                 150                 155                 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            180                 185                 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        195                 200                 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg
225                 230                 235                 240
Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile
                245                 250                     255
Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
            260                 265

Claims (4)

1.与mpl受体结合的化合物的二聚体，其中所述化合物由SEQ IDNO：46的氨基酸序列组成，并且所述化合物通过Fc区之间的两个二硫键连接形成二聚体。
2.权利要求1的二聚体在制备用于增加有需要的患者中的血小板的药物中的用途。
3.权利要求2的用途，其中所述二聚体的剂量是1μg/kg-100mg/kg。
4.一种药物组合物，含有权利要求1的二聚体和与其混合的可药用载体。
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