JP5543778B2 - 細胞集団を産生する方法 - Google Patents
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Description
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;及び
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、低い酸化ストレス条件下で、細胞が、培養培地の表面を介する酸素移動が静的状態で前駆細胞及び/又はその子孫の生育に対して不十分である細胞密度である時には培養培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;及び
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、細胞が培養培地の表面を介する酸素移動が静的状態で前駆細胞及び/又はその子孫の生育に対して不十分である細胞密度になる時点まで静的条件下で、次いでその後培養培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、細胞の集団を培養すること(ここにおいて、総細胞密度が約100,000〜200,000細胞/ml未満である時は、低い酸化ストレスの条件下で細胞を培養する);及び
(c)総細胞密度が少なくとも約100,000〜200,000細胞/mlになったら培地を撹拌して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、細胞集団を培養すること(ここにおいて、総細胞密度が約100,000〜200,000細胞/ml未満である時は、細胞を静的条件下で培養し、総細胞密度が少なくとも約100,000〜200,000細胞/mlになったら培地を撹拌する);そして
(c)総細胞密度が少なくとも約100,000〜200,000細胞/mlになったら培地を撹拌して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること;
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞の集団を供給すること;
(b)約20,000好中球前駆細胞/ml未満の初期細胞密度で、(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、低い酸化ストレス条件下で、前駆細胞を培養して、培地1ml当たり少なくとも約100,000細胞の密度で子孫細胞の集団を産生すること;及び
(c)工程(b)で得られた子孫細胞の集団を(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該子孫細胞を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、培地を撹拌して、培養して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞の集団を供給すること;
(b)約20,000好中球前駆細胞/ml未満の初期細胞密度で、(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、静的条件下で、前駆細胞を培養して、培地1ml当たり少なくとも約100,000細胞の密度で、子孫細胞の集団を産生すること;及び
(c)工程(b)で得られた子孫細胞の集団を(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該子孫細胞を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、培地を撹拌して、培養して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;
(b)少なくとも約100,000細胞/mlの総初期細胞密度で、(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること:
を含有してなる。
細胞集団中の少なくとも約70%の細胞が好中球系統の分裂終了細胞であることが好ましい。
細胞集団中の少なくとも約40%が成熟棹状及び分葉好中球からなっていることが好ましい。
約20%未満の細胞が活性化されていることが好ましい。
本発明は更に、少なくとも50億個のエキソビボで増殖した好中球系統の分裂終了細胞の集団を、薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に含有している医薬組成物を提供する。細胞の約30又は20%未満が活性化されていることが好ましい。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;及び
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、低い酸化ストレス条件下で、細胞が培養培地の表面を介する酸素移動が静的状態で前駆細胞及び/又はその子孫の生育に対して不十分である細胞密度である時に培養培地を撹拌して、細胞集団を培養して好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;及び
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、低い酸化ストレス条件下で、細胞が培養培地の表面を介する酸素移動が静的状態で前駆細胞及び/又はその子孫の生育に対して不十分である細胞密度になる時点まで静的条件下で、次いでその後培養培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、細胞の集団を培養すること(ここにおいて、総細胞密度が約100,000〜200,000細胞/ml未満である時は、低い酸化ストレスの条件下で細胞を培養する);及び
(c)総細胞密度が少なくとも約100,000〜200,000細胞/mlになったら培地を撹拌して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、細胞の集団を培養すること(ここにおいて、総細胞密度が約100,000〜200,000細胞/ml未満である時は、細胞を静的条件下で培養し、総細胞密度が少なくとも約100,000〜200,000細胞/mlになったら培地を撹拌する);そして
(c)総細胞密度が少なくとも約100,000〜200,000細胞/mlになったら培地を撹拌して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生することを含有してなる。
(a)好中球前駆細胞の集団を供給すること;
(b)約20,000好中球前駆細胞/ml未満の初期細胞密度で、(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)前駆細胞又はその子孫細胞を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中、低い酸化ストレス条件下で、前駆細胞を培養して、培地1ml当たり少なくとも約100,000細胞の密度で前駆細胞の集団を産生すること;及び
(c)工程(b)で得られた子孫細胞の集団を(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該子孫細胞を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、培地を撹拌して、培養して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞の集団を供給すること;
(b)約20,000好中球前駆細胞/ml未満の初期細胞密度で、(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、静的条件下で、前駆細胞を培養して、培地1ml当たり少なくとも約100,000細胞の密度で、子孫細胞の集団を産生すること;及び
(c)工程(b)で得られた子孫細胞の集団を(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該子孫細胞を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、培地を撹拌して、培養して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;
(b)少なくとも約100,000細胞/mlの総初期細胞密度で、(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞又はその子孫を好中球特異的系統へ分化する、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:
を含有してなる。
別段定義がない限り、本明細書で用いられている技術及び科学用語は当業者(例えば、細胞培養、化学及び分子生物学)によって通常理解されているような意味と同じ意味を有している。
上記の好中球前駆細胞は、適切な生育因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の存在下で、生育して好中球系統の細胞、例えば後顆粒球、棹状及び成熟好中球へ分化する細胞である。好中球前駆細胞は幹細胞及び用途が決まっている前駆細胞の両方を包含している。特定の例は、CD34+幹細胞のような造血幹細胞、骨髄性前駆細胞(例えば、CFU−混合物、CFU−GEMM)及び顆粒球/マクロファージ前駆細胞(例えばCFU−GM)を包含する。好ましい前駆細胞はCD34+である。
好中球前駆細胞は一般に、動物細胞、特に造血細胞の生育に適している、Stemline II Haematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma Aldrich) 又はウシ胎仔血清を補完したイスコーブ改変ダルベッコ培地(IMDM)のような、培養培地中に再懸濁される。
好中球前駆細胞の集団を所望の出発密度で培養容器に蒔種する。一態様では、好中球前駆細胞の初期密度は、培養培地1ml当たり約20,000細胞未満、例えば培養培地1ml当たり約15,000又は12,500細胞未満である。
1つ以上の早期作用性サイトカインがSCFを含有していることが好ましい。
一態様では、培養容器は使い捨て又は単回使用の(再使用できない)ものである。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;及び
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞の増殖に必要な1つ以上のサイトカインを含有している、動物細胞培養培地中で、低い酸化ストレス条件下で、細胞が、培養培地の表面を介する酸素移動が静的状態で前駆細胞及びその子孫の生育に対して不十分である細胞密度である時に、培養培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:
を含有してなる。
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;及び
(b)(i)1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞の増殖に必要な1つ以上のサイトカインを含有している、動物細胞培養培地中で、細胞が、培養培地の表面を介する酸素移動が静的状態で前駆細胞及び/又はその子孫の生育に対して不十分である細胞密度になる時点まで静的条件下で、次いでその後培養培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:
を含有してなる。
本発明の方法は、好中球減少症又は感染症のような疾患の治療又は予防に用いるための、好中球系統の分裂終了細胞の臨床用量を提供するために用いることができる。従って本発明は、少なくとも約10億個の好中球系統の分裂終了細胞、より好ましくは少なくとも約20、50、100、150又は200億個の好中球系統の分裂終了細胞を含有する単離した細胞の集団を、薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に含有している医薬組成物を提供する。通常、細胞は本発明の方法によって産生されている。
材料及び方法
臍帯血の採取
満期出産からのヒト臍帯血(UCB)を母親の同位を得て、Royal Brisbane Hospital (Brisbane, Australia)から得た。約30〜50mlの臍帯血を常法で回収して250IUのヘパリンナトリウム(DBL)を含有する50mlチューブに集めた。臍帯血試料を常温で採取24時間以内に処理した。
Ficll-Paque Plus (Amersham)を用いて密度勾配遠心分離によって単核細胞(MNC)を分離して、Midi and Mini-NACS カラム及び Direct CD34+ Progenitor Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech)を用い製造会社の提言に従って、ポジティブ選択を2回行ってCD34+細胞を富化した。
すなわち、臍帯血を、カルシウム及びマグネシウムを含まない、2mMのEDTAを含有するリン酸緩衝食塩水(PBS)中に希釈(1:4)し、Ficoll-Paque Plus 濃度勾配に載せて、常温で30分間450gで遠心分離して、単核細胞を分離した。軟膜を採取し、洗浄して、夾雑している赤血球(RBC)を塩化アンモニウム溶解法によって除去した。
幹細胞因子(rhSCF)及び顆粒球コロニー刺激因子(rhG−CSF)は Amgen から入手した。組み換えヒトトロンボポエチン(rhTPO)は Chemicon から入手した。TPOペプチド模倣薬は Auspep から入手した。
上記のような精製及び選択に引き続き、臍帯血由来のCD34+細胞を1mlの Stemline II Haematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma aldrich) に再懸濁して、1ml当たり2,000細胞又は1ml当たり10,000細胞の何れかの密度でT型フラスコ中に蒔種した。
上記のような精製及び選択に引き続き、臍帯血由来のCD34+細胞を1mlの Stemline II Haematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma Aldrich) に再懸濁して、T型フラスコ中の好中球完全培地に1ml当たり2,000細胞又は1ml当たり10,000細胞の何れかの密度で蒔種した。
上記のような精製及び選択に引き続き、臍帯血由来のCD34+細胞を1mlの Stemline II Haematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma Aldrich) に再懸濁して、1ml当たり2,000細胞の密度でT型フラスコ中に蒔種した。
細胞を静的条件下で、37℃、5%CO2のインキュベーター中で12日間培養した。
材料及び方法
上記のような精製及び選択に引き続き、臍帯血由来のCD34+細胞を1mlの Stemline II Haematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma Aldrich) に再懸濁した。血球計数器を用いて細胞を計数して、Wave Bioreactor System (Wave Biotech) の一部として2LのFELセルバッグ中で以下に記述するようにして、最長17日間エキソビボで培養した。
細胞を200,000細胞/20ml総容量で、好中球完全培地(TPO供給源は100ng/mlのTPOペプチド模倣薬であった)に蒔種した。
7日目に、セルバッグ中の培地に、等容量、すなわち40mlの新鮮培地を加えて希釈した(半希釈)。
9日目及びその後1日おきに(11、13、15日目)、セルバッグを新鮮な培地で、約500,000細胞/mlに戻すように希釈した。更に、残りの培養期間中、セルバッグを連続給気(0.1L/分)で膨らませて、培養物を穏やかに揺動した(5回揺動/分、7度の角度)。
16日目に、最終希釈の後の最終培養容量は約100mlで、1ml当たり約1,000,000細胞の細胞密度であり、100mlの容量当たり総計10億細胞をもたらした。初期の培養液が20ml中に200,000細胞を含有していたので、最終細胞/初期細胞によって判定した増殖増大倍率は約5000倍であった。これは、他の技術を用いて以前に得られていたものよりも有意に大きい程度の増大である。
臍帯血をFicoll-Paque Plus 濃度勾配で精製した後に得られた単核細胞をCD34+非富化工程に直接用いた以外は、実施例4に記載されている方法を繰り返した。細胞を1ml当たり2000のCD34+細胞の初期密度で15〜20mlの培養培地に蒔種した。総細胞密度は、用いた特定の臍帯によって決まり(1ml当たり150,000〜500,000細胞の範囲)、残りの細胞は他の型の血液細胞であった。
Claims (12)
- 方法が、工程:
(a)動物細胞培養培地中に初期細胞密度で好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;
(b)細胞の集団を、(i)10%未満である培養液の溶存酸素含量、(ii)静的条件、及び(iii)グルタチオン、2−メルカプトメタノール及び他のチオール化合物、ピルビン酸塩、アスコルビン酸塩、カタラーゼ、血清アルブミン、及びプルロニックF68からなる群より選択される反応性酸素種を中和する薬剤の添加、からなる群より選択される細胞が1個当たりに受ける酸化ストレスが低い条件下で培養すること、
ここで動物細胞培養培地は、(i)c−kitリガンド、幹細胞因子、Flt−3リガンド、インターロイキン1〜12、トロンボポエチン及び腫瘍壊死因子アルファからなる群より選択される1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)G−CSF及びGM−CSFからなる群より選択される1つ以上の当該前駆細胞を好中球特異的系統へ分化するサイトカインを含有している;
(c)その後培養物を撹拌する時点で、細胞密度を測定すること;及び
(d)細胞が工程(c)で測定した細胞密度に到達してから細胞の培養を続けている間中、培養培地を撹拌して、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生すること:
を含有してなる、好中球系統の分裂終了細胞の集団を産生するインビトロ又はエキソビボによる方法。 - 工程(b)の条件が、10%未満である培養液の溶存酸素含量を含有してなる、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)の細胞の集団の培養が、静的条件で集団を培養することを含有してなる、請求項1に記載の方法。
- 好中球前駆細胞の初期細胞密度が1ml当たり20,000細胞未満である、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の培養培地が、総初期細胞密度が培地1ml当たり少なくとも100,000細胞になるように、好中球前駆細胞以外の細胞を更に含有してなる、請求項4に記載の方法。
- 好中球前駆細胞以外の細胞が血液由来の単核細胞である、請求項5に記載の方法。
- 工程(c)の細胞密度が、培養培地の表面を介する酸素移動が静的条件下で前駆細胞及びその子孫の生育に不十分である時点の細胞密度である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)の細胞密度が、1ml当たり少なくとも100,000〜200,000細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)の細胞密度が、工程(b)の初期細胞密度である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 好中球前駆細胞の集団が富化されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 好中球前駆細胞の集団が、富化されていない単核細胞の集団として供給される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 方法が、工程:
(a)好中球前駆細胞を含有している細胞の集団を供給すること;及び
(b)(i)c−kitリガンド、幹細胞因子、Flt−3リガンド、インターロイキン1〜12、トロンボポエチン及び腫瘍壊死因子アルファからなる群より選択される1つ以上の早期作用性サイトカイン及び(ii)当該前駆細胞の増殖に必要な、1つ以上のサイトカインを含有している動物細胞培養培地中で、細胞が、培養培地の表面を介する酸素移動が静的状態で前駆細胞及び/又はその子孫の生育に対して不十分である細胞密度になる時点まで静的条件下で、次いでその後培養培地を撹拌して、細胞の集団を培養して、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生すること:
を含有してなる、好中球前駆体及び/又は好中球前駆細胞の増殖した集団を産生するインビトロ又はエキソビボによる方法。
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