JP2010533486A - 幹細胞の生体外増殖培地 - Google Patents

Abstract

本発明は、成長培地およびｉ）インターロイキン−６（ＩＬ６）；ｉｉ）ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬＴ３）；ｉｉｉ）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｉｖ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）からなるサイトカインの組合せを含む培地に関する。生体外幹細胞および／または親細胞およびそれらの細胞から分化した細胞の増殖への該培地の使用、および前記増殖により得られる前記細胞の使用。
【選択図】 なし

Description

本発明は、増殖培地およびｉ）インターロイキン−６（ＩＬ６）；ｉｉ）ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬＴ３）；ｉｉｉ）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｉｖ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）からなるサイトカイン組成物を含む培地、幹細胞および／または親細胞およびそれらの細胞から分化した細胞の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）増殖へのその培地の使用、および前記増殖により得られる前記細胞の使用に関する。

幹細胞および／または親細胞には、再生医療分野および他の医学・生物学分野において潜在的に画期的な有用性があることが知られている。変性関節における間葉性幹細胞の移植のように他の治療法があるとしても、当該技術分野で周知のアプリケーション例のなかで、臨床レベルで最も研究・規定されているのは、骨髄移植である。

幹細胞および／または親細胞の利用に関する問題としては、適用時の利用可能な細胞の減少が代表的である。前記幹細胞および／または親細胞の数を増やすための公知のプロトコルは、いくつか存在する。幹細胞および／または親細胞は、母幹細胞の少なくとも２つの娘細胞への分裂により増加する。幹細胞数を増加させる周知のプロトコルの一例に、支持細胞層（ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒ）の使用がある。しかしながら、前記プロトコルには、母幹細胞の成熟状態と娘幹細胞の成熟状態とを同じように維持することができないという第２の問題がある。本発明の範囲において成熟状態とは、細胞の遺伝子型および／または表現型の状態の総称である。

本アプリケーションにおいて、１以上の分裂工程により得られる細胞の成熟度を測定するために使用されるパラメータは、自己保持率（またはＰｓｍ）である。Ｐｓｍ値は、下記式１により表される：

Ｐｓｍは、０〜１間において変化し、その値は、娘細胞の数、分裂の種類および分裂工程数等の複数の因子によって決まる。

たとえば、１分裂工程において、娘細胞のうちの１つのみが母幹細胞の成熟状態を維持している場合、この１分裂工程あたりのＰｓｍは０．５である。本発明の範囲において、Ｐｓｍ値は、単一細胞の分裂に対して、または複数の細胞の分裂の平均として利用できる。ただし、この場合、幹細胞および／または親細胞のみを考慮し、たとえば、それらの細胞から得られるより分化し再生力を欠く細胞は考慮しない。

幹細胞および／または親細胞の増殖には、増殖以外にも、分化細胞内での幹細胞の分化が含まれることが知られている。本発明の範囲において、分化とは、母細胞に対して、娘細胞が異なる遺伝子型および表現型の特性を有し、その結果Ｐｓｍ値を低減させることを意味する。

本発明の範囲において、細胞の成熟度を定量化する方法としては、公知のすべての方法を適用できる。適用する方法は、主に、増殖の対象となる幹細胞の種類による。好適な方法は、たとえばベクトン・ディッキンソン社のＦＡＣＳなどによるフローサイトメトリー法である。前記方法の一例として、造血幹細胞の成熟状態を測定するものがあるが、この場合は、マーカータンパク質ＣＤ３４^＋ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５^＋／−で細胞に標識して測定する。

本分野において、いくつかのプロトコルが提案されており、それらのプロトコルには、Ｐｓｍが０．５となる、母細胞の成長または分裂工程における幹細胞の増殖について記載されている。これは、幹細胞の各分裂工程において、娘細胞の１つは母幹細胞と同一の成熟状態を維持するが、他方は分化したことを意味する。しかしながら、前記プロトコルでは、Ｐｓｍが０．５となる幹細胞を１または２世代の間でしか増殖させることができないため、所望の条件を満たさない。１回目または第２回目の分裂工程後、Ｐｓｍ値は極端に低減してしまう。本発明の範囲において、「世代」とは少なくとも１つの母幹細胞の分裂回数を示す。したがって、前記プロトコルでは、満足できる結果は得られず、第２世代以降にＰｓｍが下がるのみである。このため、幹細胞および／または母細胞の増加数の合計は、比較的低く、全体の成長も指数関数的ではない。

幹細胞および／または母細胞の利用に関する上述の問題を明示する一例が、臍帯血からの造血幹細胞および／または母細胞の移植にある。臍帯血には、同種異系または自己移植系があり、造血幹細胞が豊富に含まれる。造血幹細胞は、病状または何らかの病状に対応する治療のために、除去されたり低減した造血系を有するヒトの「骨髄移植」に用いられる。使用可能な造血幹細胞数および／または母細胞数の減少は、有効性の低減という必然的な問題を生ずる。これは公知であり、臍帯血からの骨髄移植が、主として体重が減少した患者に対して行われるという事実によっても証明される。第二の問題は、細胞の成熟状態に関する。すなわち、造血幹／親細胞は、臍帯血においては未発達な状態であり、このことが、移植後の骨髄内への定着を可能にしている。骨髄中での前記定着がない場合、望ましくない免疫の脆弱性が患者に生ずる。問題は、定着に望ましい成熟度を有する幹細胞数が、患者にとって必要な数に対して低すぎることである。したがって、増殖した造血幹／親細胞において、前記増殖した細胞を、骨髄内に迅速に定着させ、短時間で防御の役割を果たせるように、同じ成熟状態を維持することが必要である。

出願人は、上述の課題に対する解決法として、増殖培地を含有する培地中に含まれるサイトカインの組合せ使用があることについて、予期せず見出した。

本発明の目的は、増殖培地を含有する培地中に存在するサイトカインの組合せである。前記サイトカインの組合せは、以下から構成される：
ｉ）インターロイキン−６（ＩＬ６）、
ｉｉ）ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬＴ３）、
ｉｉｉ）幹細胞因子（ＳＣＦ）
ｉｖ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）。

生幹細胞および／または親細胞を成長または維持させるためのサイトカインの組合せと成長培地とを含む、前記培地の定義には、工業スケールのバイオリアクターが含まれる。

本発明の範囲において、「幹細胞」とは、以下の特徴を有する細胞を意味する。
すなわち、幹細胞とは、
・極めて未発達または分化しておらず、
・増殖能があると同時に自己保持能または自己再生能をもち、
・同種または異種の娘細胞を生成することができる
細胞である。

幹細胞は、公知の哺乳類の分化全能性、分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または分化多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞である。分化全能性幹細胞とは、複製能をもち、３つの胚葉（内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｓ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍｉｓ）および外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍｉｓ）の３つ）の細胞に分化し、最終的に新たな生命体１個体を形成することが可能な細胞である。分化万能性幹細胞は、分化全能細胞から分化し、分化全能細胞の能力のほぼすべてを保持するが、分化万能性細胞のみから完全な生命体を形成することはできない。分化多能性幹細胞とは、たとえば、すべての造血系細胞を形成可能な造血幹細胞や、骨組織および／または脂肪組織に属する間質細胞を形成可能な間葉性幹細胞など、共通または類似の系統発生（ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ）の細胞を生成可能な幹細胞である。

任意には、本発明の幹細胞には、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）胎児由来の分化全能性幹細胞は含まれない。

任意には、本発明の幹細胞には、ヒト胎児由来の幹細胞は含まれない。

幹細胞の定義には、自己複製能を保持する親細胞、すなわち、リンパ細胞およびプラズマ細胞または内皮細胞などのような単一種の細胞または近縁種の細胞において成長可能な細胞、も含まれる。親細胞の一例としては、融解して筋組織系の細胞総量を増加させることができる衛星細胞が挙げられる。

本発明に係わる培地に含まれる成長培地は、細胞が増殖するうえで不可欠な栄養素を供給できるものであれば、公知のどの培地でも使用可能である。好ましくは、成長培地は、幹細胞の成長に活性効果を有することが知られている、上述し下記表１に示す因子以外の他の因子を含まない。

本発明に係わる増殖培地を含む培地にサイトカインの組合せが存在する利点はその容易さと、成熟状態の変化に係わる可能性のある他の因子が存在しないこととにある。前記利点は、たとえば、他の「外来」細胞による汚染がある支持細胞層などの公知の成長培地と比較すると顕著になる。公知の成長培地においては、再現性がないため、増殖が標準化プロセスとはならず、幹細胞が活性化して骨髄細胞に分化する。

好適な実施形態においては、成長培地は液体である。公知の成長培地の一例として、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏ ＳＣＧＭ（ドイツ、フライブルクのセルジェニックス（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）社）やその派生物が挙げられる。好適な実施形態においては、表１に示す濃度のサイトカインが、前記成長培地中に存在する。

好適な実施形態において、本発明に係わる成長培地には、血清が含まれない。無血清培地の場合、汚染（増殖中の幹細胞の成熟状態に影響を与える因子による汚染）の可能性を低減でき、かつ／または培地内での感染の可能性を低減できるため、その使用には利点がある。

本発明の第二の態様は、少なくとも上述の本発明の培地に幹細胞を接触させる工程を含む、幹細胞を増殖するための方法であり、好ましくは、幹細胞は該培地中で混合される。前記方法は、生体外で行われ、培地中で細胞集団を調製するための公知の器具を使用して行われる。

好ましくは、本発明に係わる前記細胞の増殖工程のＰｓｍ値は、少なくとも３世代；好ましくは少なくとも５世代；より好ましくは８世代；より好ましくは１０世代；より好ましくは１２世代；より好ましくは１５世代；より好ましくは１８世代；さらにより好ましくは２０世代；の幹細胞について、０．４以上であり、好ましくは０．５以上である。好ましくは、Ｐｓｍは０．４以上であり、５０世代について好ましくは０．５以上である。

あるいは、前記細胞増殖は、増殖パラメータの倍数（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）で定義することもできる。好ましくは、この方法では幹細胞を２週間で、増殖前の細胞数の少なくとも５倍；好ましくは少なくとも１０倍；より好ましくは少なくとも１５倍；およびさらにより好ましくは２０倍；に増殖できる。細胞は２週間で、増殖前の細胞数の６０倍まで自己増殖することができる。分化した細胞も含めると、前記方法によれば、分化の結果生じる再生能力の有無にかかわらず、細胞を２週間で初期細胞数の１８０〜６５０倍に増殖することができ、好ましくは初期細胞数の２００〜６５０倍に増殖可能である。生成される細胞集団の分析は、血球計算盤（Ｂｕｒｋｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）または好ましくは上述のフローサイトメトリーを用いた細胞数測定など、公知の方法にて行われる。増殖の倍数については、初期集団に対する増殖後の集団の乗数を測定する。

好適な場合、一般に「母」細胞からの造血および内皮細胞である、造血・血管系（ｈａｅｍａｔｏ−ａｎｇｉｏ ｃｈａｉｎ）により細胞は増殖する。好ましくは、前記実施形態に係わる増殖細胞は、ＣＤ３４^＋１３３^＋４５^＋（造血細胞）およびＣＤ３４^＋１３３^＋４５⁻（内皮細胞）である。前記細胞は、たとえばドイツ、ベルギッシュグラートバハのミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムなどによる公知の細胞選定方法により、選定可能である。

本発明に係わる方法の実施形態においては、本発明に係わる培地を用いた細胞増殖は、世代数に限定されることなく、無限に続けられる。前記方法の実施形態には、たとえば細胞が密集し、培地およびサイトカインの回復を行う際の細胞継代（ｃｅｌｌ ｐａｓｓａｇｅ）の工程など当業者に公知の変更であって、本方法をより持続的なものとする明らかな変更も含まれる。前記方法では、世代数によらず、好ましくはＰｓｍが０．４以上、より好ましくは０．５以上となる幹細胞を増殖することができる。

本発明に係わる本方法のさらにより好適な実施形態では、前記継代において、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏ ＳＣＧＭ（ドイツ、フライブルクのセルジェニックス（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）社）またはその派生物等の成長培養液中、より好ましくは無血清培地中の初期濃度が１０００細胞／ｍｌ〜１００００細胞／ｍｌ、好ましくは３５００細胞／ｍｌ〜６５００細胞／ｍｌで、本発明に係わる培地に幹細胞が播種される。

前記増殖には、制限時間の上限はなく、その長さは、当業者が本方法をどう適用するかにより異なる。好ましくは、本方法は、１０日〜６０日間、より好ましくは１２〜３０日間、さらにより好ましくは１３〜２４日間続けられる。前記方法を行う間、本発明に係わる培地に存在するサイトカインの濃度は、少なくとも２週間に１回、好ましくは表１に示す初期濃度に戻される。

好ましくは、前記方法は、２週間に少なくとも２０世代、好ましくは２６〜６０世代について、好ましくはＰｓｍが０．４以上であり、より好ましくは０．５以上である幹細胞を増殖することができる。あるいは、２週間で倍数増殖（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）により少なくとも２０倍、好ましくは２６〜６０倍に細胞が増殖する。増殖の結果得られる分化した細胞を含めると、好ましくは、前記方法は、２週間で初期細胞数の少なくとも５０倍、好ましくは初期細胞数の１８０〜６５０倍に細胞を増殖する

前記方法の好適な実施形態において、たとえば無菌フード等により無菌状態で作業が行われる。前記実施形態により得られる細胞の集団に含まれるエンドトキシン濃度は、０．０５ＩＵ／ＭＬ（ヨーロッパ薬局方）の制限未満であり、マイコプラズマまたは細菌・真菌汚染はみられない。

本発明に係わる培地または上述の方法の使用による他の利点として、連続して移植されても、得られる細胞に核型の変化はなく、腫瘍を引き起こすこともない点がある。

本方法の一実施形態では、得られる細胞は増殖工程後に凍結される。前記工程では、たとえば、１０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド、７０％ｖ／ｖの自己血漿（好ましくは２５００ラドにて照射されたもの）および２０％ｖ／ｖの市販の培地を含む溶液への増殖細胞の導入により得られる溶液を凍結する等、幹細胞凍結方法として公知のものを使用できる。

本発明に係わる方法の他の好適な実施形態においては、幹細胞の増殖方法を、後述する薬剤の調製方法に組み込むことが可能である。薬剤調製は、細胞の増殖工程の後、好ましくはその直後に行われる。あるいは、前記薬剤は、上述のように凍結された細胞のアリコートを解凍した後に製造される。薬剤を調製する場合、予防的にサイトカインから分離されていた細胞を使用することが好ましい。サイトカインを分離する方法としては、たとえば、サイトカインが上清に、細胞がペレット中に残る遠心分離法等公知のあらゆる方法が考えられる。

他の態様によれば、本発明は、本発明に係わる方法により得られる細胞およびその使用に関する。得られる細胞には、親細胞と遺伝子型および／または表現型プロファイルが同一の多数の幹細胞が含まれる。前記細胞は、増殖した世代数によらず、Ｐｓｍ値が０．４以上、好ましくは０．５以上となり、しかも、得られる細胞において核型の変更や腫瘍がないことを特徴とするプロセスにより得られる。好適な実施形態においては、前記細胞は、該細胞から分化した細胞と複合的に存在し、後述の治療過程におけるアプリケーションを可能にするのに十分な量が存在する。

本発明の前記態様の一実施形態において、細胞は凍結アリコート中に存在する。前記アリコートには、上述の本発明の方法により得られる前記細胞および凍結されても細胞が生存状態を維持するための公知の組成、好ましくは５〜２０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシドを含む組成が含まれる。公知の組成としては、たとえば１０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド、７０％ｖ／ｖの自己血漿（好ましくは２５００ラドにて照射したもの）および２０％ｖ／ｖの市販の培地を含む溶液等が挙げられる。

本発明に係わる増殖方法により直接得られる、幹細胞および該幹細胞から分化した細胞は、薬剤として使用可能である。

前記薬剤には、さらに賦形剤および／またはアジュバント（補助剤）および／または安定剤および／またはビヒクルが含まれ、公知の方法により成形される。

組成物中のこのような賦形剤および／またはアジュバントおよび／または安定剤および／またはビヒクルの選択は、用途によりさまざまであるが、本発明の方法により得られる細胞との適合性を維持する必要がある。薬剤は、公知の投薬形態がいずれも使用でき、好ましくは、薬剤は、注入液中に存在する。薬剤は、公知のどの方法でも投与可能であるが、注射等の非経口投与が好ましい。

好適な実施形態において、前記薬剤としての使用は、好ましくは造血系および／または内皮系の細胞移植のための薬剤の調製のための使用であり、造血系および／または内皮系の細胞集団を再び正常レベルと想定されるレベルまで再成長させるのに使用される。前記アプリケーションでは、造血系の細胞が欠如する患者を想定している。前記欠如は、既存の細胞に関連する病理の治療に起因する場合があり、たとえば白血病患者に対する骨髄またはリンパ切除の放射線治療等に起因する。あるいは、内皮系細胞の場合であれば、前記アプリケーションは、急性または慢性疾患（たとえば心筋梗塞や糖尿病性血管障害）による血管障害患者が意図される。

このような薬剤の調製に前記細胞を使用する利点は、細胞数が非常に大きいために患者の体型によらず治療が可能であり、細胞の骨髄定着率が改善されることである。

他の好適な実施形態において、前記薬剤としての使用は、急性または慢性白血病や骨髄異形成症候群等の悪性病変、重篤な複合性免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群、悪性骨粗しょう症、サラセミア、ファンコニ貧血、ムコ多糖症等の非悪性の先天性病変、および重篤な再生不良性貧血等の後天性非悪性病変の治療のための薬剤の調製のための使用である。前記薬剤には、さらに賦形剤および／またはアジュバントおよび／または安定剤および／またはビヒクルが含まれ、公知の方法により成形される。組成物中のこのような賦形剤および／またはアジュバントおよび／または安定剤および／またはビヒクルの選択は、用途によりさまざまであるが、本発明の方法により得られる細胞との適合性を維持する必要がある。

他の好適な実施形態において、本発明の方法により増殖した細胞は、遺伝子治療プロトコルに使用される。ここで「遺伝子治療」とは、生体外での遺伝子治療の方法を意味し、以下の工程を含む：
・対象者から体細胞を抽出し、
・前記細胞を培養し、
・培養中に、適切なベクター（ウィルスベクター等）を介して、細胞を目的遺伝子で形質転換（トランスフェクト）し、
・必要に応じて、培地にて、形質転換細胞のみを単離・成長させ、
・形質転換細胞を対象者の体内へ再導入する。

前記工程は、一般的な公知技術を利用して行う。

この遺伝子治療は、野生型遺伝子で置換または補完することにより、少なくとも１つの異常な遺伝子を治療したり、細胞内でタンパク質や対応遺伝子に結合して望ましい活動を取り入れるために人工遺伝子を導入するのに利用される。

培養トランスフェクション前または中または後の細胞増殖への本発明に係わる培地の使用は、上述のとおり、全体的な治療効果を改善できる。さらにより好適な実施形態においては、形質転換される遺伝子は、本発明の方法または本発明に係わる培地による、有用で望ましい細胞のみが増殖する増殖工程の前に細胞内に導入される。

任意には、前記トランスフェクションにより得られる細胞は、その後生体外で遺伝子治療の特定のプロトコルで使用される薬剤の調製に使用される。他の実施形態においては、ヒトの体内に再導入されたときに、正常細胞にとっては有害な可能性もある治療に対して耐性のある幹細胞（および子孫細胞）となる遺伝子を、トランスフェクションにより導入する。公知の例として、「多剤耐性」（ＭＤＲ）遺伝子があるが、この遺伝子は、有毒物質または有害物質による、細胞の処理を特定方法に規定できない特定の疾患の治療を可能にする。

本発明の他の実施形態において、本発明に係わる方法により得られる細胞は、生体外で自己細胞群または自己移植の成分を調製するために使用される。たとえば、本発明に係わる細胞が、血小板成分の調製に使われる可能性がある。前記調製には、本発明に係わる方法による得られる細胞を、トロンボポエチン、インターロイキン−１１、インターロイキン−６およびヘパリンを含む溶液と、混合等により接触させることが含まれる。このようにして、ＣＤ４１^＋およびＣＤ６１^＋細胞を増殖する。なお、ＣＤ４１^＋およびＣＤ６１^＋細胞は、その後血小板成分を生成することになる、巨核球の未成熟な親細胞である。

本発明に係わる方法により得られる細胞は、化学物質や環境因子による影響を評価するインビトロ診断分析に使用可能である。これらの化学物質には、タンパク質やその他の生物由来の分子が含まれる。環境因子には、たとえば、最適な方法で細胞を成長・維持する用途の培地、および前記培地の調製に使用される流体が含まれる。前記診断分析は、臨床試験の開始前に、増殖した細胞の培地上で新薬の無害性を評価するのにも使用できる。

実施例１ 幹細胞ＣＤ３４ ^＋ の増殖実験プロトコル
ｉ）実験０日目：
・加熱不活性化した同種異系の血漿（ＨＩＡＰ）が入った袋をフードの下に置き、室温で解凍させる。
・臍帯血のアリコートを解凍し、ＣＤ３４^＋細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（ドイツ、ベルギッシュグラートバハのミルテニーバイオテク社）を用いて選択する。前記選択により、選択された細胞集団全体の８８％に相等する０．３６×１０^６個のＣＤ３４^＋細胞の集団が得られた。
・培地（Ｍｅｄｉｕｍ ＣｅｌｌＧｒｏ、ＨＩＡＰおよびサイトカイン含有）の量は該培地中の細胞濃度が５×１０^３細胞／ｍＬとなるように計算した。
・計算した量（７２ｍＬ）に、コントロールチューブに必要な１０ｍｌを添加した。
・ＨＩＡＰ量は、培地の終濃度の１０％（ｖ／ｖ）となるように計算した）。
・Ｍｅｄｉｕｍ ＣｅｌｌＧｒｏの量は、用いたＨＩＡＰ量とサイトカインの各溶液とを差し引いて計算した。サイトカインは、終濃度がＩＬ６およびＴＰＯについては１０ｎｇ／ｍＬ、ＳＣＦおよびＦＬＴ−３については５０ｎｇ／ｍＬとならなければならない。
・上記のように計算された培地の量に基づき、必要数の１０ｍＬチューブを用意し、目視にて、完全性を確認した。
・フードの下で、以下の順で下記材料を分注して移した。最初に、所定量のＭｅｄｉｕｍ ＣｅｌｌＧｒｏ、次に所定量のＨＩＡＰおよび所定量のサイトカインの順である。なお、各所定量は、一混合液中の量として計算した。前記混合液から１０ｍｌを採取し、コントロールチューブ（試薬のみで細胞は含まれない）に加えて、インキュベーター内に置いた。
・細胞を含有する別のチューブに、調製用の各チューブあたり１ｍｌの完全培地を加えた。
・９ｍＬの完全培地を調製用チューブ内に分注し、続いて、前工程において調製した細胞含有チューブから１ｍｌの細胞懸濁液を回収して加えた。
・各チューブについて、異常の発生の有無を顕微鏡（倒立顕微鏡）で観察し、その後チューブを３７℃、ＣＯ_２濃度５％のインキュベーター内に置いた。

ｉｉ）３、７、１０日目：サイトカインの添加
・３日目に、チューブをインキュベーターから出した。
・４００μＬあたり、１００ｎｇのＴＰＯ、１００ｎｇのＩＬ６，５００ｎｇのｆｌｔ−３および５００ｎｇのＳＣＦを含む溶液を用意した。４００μＬずつ、コントロールチューブを含む各チューブに加えた。
・チューブを再び３７℃、ＣＯ_２濃度５％のインキュベーター内に置いた。
・７日目に、同じ作業を繰り返した。
・１０日目に、同じ作業を繰り返した。

ｉｉｉ）１４日目：増殖した細胞の回収
・無菌条件下、フードの下で、再輸液バッファーで構成され、２％ｗ／ｖのヒトアルブミンｅ．ｖを含有する生理溶液を用意した。
・１４日目に、増殖細胞を含有する全チューブをインキュベーターから出した。
・各チューブについて、巨視的（膨張）および微視的（倒立顕微鏡による）確認（ｃｏｎｔｒｏｌ）を行った。
・この確認後に、各チューブの内容物をそれぞれ５０ｍＬチューブに注ぎ入れてから、各チューブを合計５ｍＬの再輸液バッファーで洗浄して、この洗浄液を、細胞懸濁液の入った５０ｍＬチューブに加えた。
・１４００ＲＰＭで、１０分間、室温にて遠心分離した。
・遠心分離後に、上清を、符号（ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ）と「１°洗浄上清」という説明とを付した５０ｍＬチューブに分注し、フードの下で静置した。
・ペレットに５０ｍｌの再輸液バッファーを加えて再懸濁し、再び１４００ＲＰＭで、１０分間室温にて遠心分離した。
・遠心分離後に、上清を、符号と「２°洗浄上清」という説明とを付した５０ｍＬチューブに分注し、フードの下で静置した。
・得られたペレットを再懸濁して５０ｍｌの再輸液バッファーを加え、最終チューブとした。
・前記最終チューブから８００μＬの細胞懸濁液を取り、有核細胞の総数を血球計算盤にて計測した。平均１２４．６×１０^６個の有核細胞があった。
・最終チューブ中の平均濃度に基づき、最終チューブから２５０，０００個の細胞を取り、細胞蛍光測定（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）法にて分析した。

１°洗浄上清、２°洗浄上清について、以下の試験を行った。
・Ｅｕ．Ｐｈ．２．６．１に準拠した無菌テスト、
・Ｅｕ．Ｐｈ．２．６．７に準拠したマイコプラズマ培養試験、および
・ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製の試薬（Ｐｌｕｓ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ^＊およびＰｌｕｓ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ^＊ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｉａｌｓ Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅ ｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ）を用いたＢＡＣＴＥＣテスト。前記試薬キットにより、ＧＭＰに準拠して、細胞回収前に細胞上清から細胞の微生物汚染を迅速に評価できる。
・Ｅｕ．Ｐｈ．２．６．１４に準拠したＬＡＬ発色試験。

０日目に、０．３６×１０^６個のＣＤ３４^＋細胞（純度８８％）を増殖のために選択した。

増殖後、細胞蛍光測定（ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法により、有核細胞の総数が１２４．６×１０^６個と測定され、うちＣＤ３４^＋細胞が９．９７×１０^６個、ＣＤ１３３^＋細胞が９．０６×１０^６個、ＣＤ１９^＋細胞が０．００７×１０^６個、ＮＫ細胞が０．００７×１０^６個、ＣＤ３^＋細胞が０．０１７×１０^６個、ＣＤ６１^＋細胞が１．４×１０^６個であった。

実施例２ サラセミア、鎌状赤血球貧血、および難治性貧血の小児患者への本発明により増殖された細胞の移植
サラセミア（ＰＴｌ）；鎌状赤血球貧血（ＰＴ２）および難治性貧血（ＰＴ３）の小児患者３名に対して、実施例１に記載のとおり細胞の増殖を行った解凍臍帯血から回収した血液を輸血した。

表２に、前記細胞の増殖結果を示す。増殖前に、上述のように、ＣＤ３４^＋細胞が選択された。

３患者すべてにおいて、ＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ抗原に対する低分解性の血清または類別およびＨＬＡ−ＤＲＢｌ遺伝子に対する高分解性の類別により組織適合性が判定された。移植前の４〜２日目までの間、１日当たり３ｍｇ／ｋｇの用量とは別にドナーから、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）を毎日移植した。

移植片対宿主拒絶反応（ＧＶＨＤ）は、公知の方法（Ｇｌｕｃｋｓｂｅｒｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｒｏｍ ＨＬＡ−ｍａｔｃｈｅｄ ｓｉｂｌｉｎｇ ｄｏｎｏｒｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９７４；１８；２９５−３０４および１９、並びにＳｔｏｒｂ Ｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｐｌａｓｔｉｃ ａｎｅｍｉａ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＨＬＡ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｉｂｌｉｎｇｓ、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９８３；９８：４６１−４６６）により分類した。条件付け療法およびＧＶＨＤの予防のために、家族ドナーまたは非血縁ドナーから得られた未処理の胎盤血移植に現在使用されているものと同一の薬剤を使用した。条件付けの方法では、通常、移植の約３週間前から投与を開始する以下の薬剤について、異なる組合せ・異なる投与設計での投与を予測した：ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎｅ）、チオテパ（Ｔｈｉｏｔｅｐａ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｍｅｌｆａｌａｎ）。すぐに、ＧＶＨＤ予防法として、シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ−Ａ）、ステロイドおよび抗リンパ球血清の使用が示された。

３日間連続して好中球の濃度が０．５×１０^９／Ｌを上回るとき、骨髄の定着が良好に行われたとし、血小板の定着については、９日間連続して３０×１０^９／Ｌ以上の濃度が観察されたときとした。

３患者はいずれも、それぞれＰＴｌ、ＰＴ２およびＰＴ３の移植から２９ヶ月、２２ヶ月および１９ヶ月経過後も何ら合併症もなく、生存した。相対的な臨床転帰の結果を表３に示した。

増殖細胞を、ｅ．ｖ．用の生理食塩水およびヒトアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎａ）中の無菌性・無発熱原性の細胞懸濁液の形状で、無菌状態かつフードの下で、注射器にて取り出した。その細胞は、通常、治療に使用される中心静脈法を介して投与された。

なお、本発明に係わる培地を用いて本方法の本発明により臍帯血を増殖しなかった場合に、３人の小児にとって臍帯血が十分ではなかった場合を想定すると、上記の非常に良好な結果は実現しえない。これら３例においては、臍帯血中の有核細胞数が、患者の体重１ｋｇあたり３．７×１０^７未満であった。グラックマン（Ｇｌｕｃｋｍａｎ）ら（Ｇｌｕｃｋｍａｎ Ｅ ｅｔ ａｌ． ｆｏｒ Ｅｕｒｏｃｏｒｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｇｒｏｕｐ （ＥＢＭＴ）． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｆｒｏｍ ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９７；３３７：３７３−３８１）が示すように、臍帯血からの移植において良好な結果を得るには、患者の体重１ｋｇあたり少なくとも３．７×１０^７個の有核細胞が必要である。

前記の例では、短期〜中期間における良好な結果が示されているが、周知のように、この結果は長期間でも同様に応用できる。なお、このことは、Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ Ｆら（Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｅｄ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、 Ｂｌｏｏｄ、 ２００３；１０１：２１３７−４３）によっても示されている。

実施例３ 増殖後の細胞における染色体異常の確認
実施例１に示すように、１４日間増殖させた培養細胞の染色体調製では、数量（トリソミー、モノソミーなど）および構造（転座、欠失および逆位など）の双方について構造異常を確認する目的で、ＱＦバンドおよび色の変化により染色体を蛍光分析した。

増殖した細胞中、染色体異常は見られなかった。

実施例４ 分化万能性幹細胞での増殖
「胚様体」（ＥＢ）細胞は、「懸垂液滴（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ）」法により、２ｍＭのグルタミンを添加した低濃度ブドウ糖培地ＤＭＥＭ／Ｆ１０（１：１）と、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、７５μｇ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１％ｗ／ｖの非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ、インビトロジェン社、イタリア）、１％ｗ／ｖのヌクレオシド・ミックス、１０％ｖ／ｖのノックアウト血清リプレーサー（ＧＩＢＣＯ、インビトロジェン社、イタリア）および５％ｖ／ｖのＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、インビトロジェン社、イタリア）とを含む培地にて、９日間、単為生殖細胞を増殖させ、調製した。なお、毎日、培地の含有物は、増殖開始時の濃度に戻された。

ＥＢは、無菌環境にて解離され、実施例１と同様の方法により、本発明の増殖培地にて調製された。ただし、２週間ではなく３週間とした点が実施例１の場合と異なる。したがって、この培地は、１４日目および１７日目にサイトカイン混合物により回復させられ、この増殖産物は、２１日目にリリースされた。増殖前には細胞数８４００個だったＥＢ細胞から、３週間後には、細胞蛍光分析法により２１９０００個のＥＢ細胞が計測された。

Claims (23)

1. 増殖培地と、ｉ） インターロイキン−６（ＩＬ６）；ｉｉ）ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬＴ３）；ｉｉｉ）幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｉｖ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）からなるサイトカイン組成物とを含む培地。
2. 前記培地が液体である請求項１に記載の培地。
3. サイトカインである前記ＩＬ６の濃度が１〜２０ｎｇ／ｍｌの間であり、好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは９〜１１ｎｇ／ｍｌである請求項２に記載の培地。
4. サイトカインである前記ＦＬＴ３の濃度が２０〜８０ｎｇ／ｍｌの間であり、好ましくは３５〜６５ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは４９〜５１ｎｇ／ｍｌである請求項２または３に記載の培地。
5. サイトカインである前記ＳＣＦの濃度が２０〜８０ｎｇ／ｍｌの間であり、好ましくは３５〜６５ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは４９〜５１ｎｇ／ｍｌである請求項２〜４のいずれかに記載の培地。
6. サイトカインである前記ＴＰＯの濃度が１〜２０ｎｇ／ｍｌの間であり、好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは９〜１１ｎｇ／ｍｌである請求項２〜５のいずれかに記載の培地。
7. 前記増殖培地が無血清培地である請求項１〜６のいずれかに記載の培地。
8. 幹細胞を、請求項１〜７のいずれかに記載の培地に接触させる工程を少なくとも含む幹細胞の増殖方法。
9. 幹細胞から分化した細胞における幹細胞の分化をさらに含む請求項８に記載の方法。
10. 前記工程における細胞の初期濃度は、１０００細胞／ｍｌ〜１００００細胞／ｍｌの間であり、好ましくは３５００細胞／ｍｌ〜６５００細胞／ｍｌの間である請求項８または９に記載の方法。
11. 前記工程を１０日〜３０日間、好ましくは１２〜２０日間、さらにより好ましくは１３〜１６日間続ける請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記サイトカインを１週間に２回初期濃度に戻す請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
13. ２週間増殖させた前記幹細胞が、初期細胞数の少なくとも２０倍であり、好ましく初期細胞数の２６〜６０倍の間である請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
14. ２週間培養させた前記幹細胞および子孫細胞が、初期細胞数の少なくとも５０倍であり、好ましくは初期細胞数の１２０〜６５０倍の間である請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 請求項８〜１４のいずれかに記載の方法により得られる幹細胞。
16. 請求項９〜１４のいずれかに記載の方法により得られる幹細胞および幹細胞から分化した細胞。
17. 凍結アリコート中の請求項１５または１６に記載の細胞。
18. 薬剤として使用される請求項１５または１６に記載の細胞。
19. 細胞移植および／または、造血系および／または内皮系に属する細胞の再増殖に用いられる薬剤調製への請求項１５または１６に記載の細胞の使用。
20. 悪性病変および先天性非悪性病変および後天性非悪性病変の治療薬剤調製への請求項１５または１６に記載の細胞の使用。
21. 遺伝子治療の特定のプロトコルにおいて使用される薬剤の調製への請求項１５または１６に記載の細胞の使用。
22. 自己細胞群またはより小型の成分のインビトロ調製への請求項１５または１６に記載の細胞の使用。
23. インビトロの診断分析への請求項１５または１６に記載の細胞の使用。