MXPA04009998A - Modulacion de la diferenciacion de celulas madre y progenitoras, ensayos y usos de las mismas. - Google Patents

Modulacion de la diferenciacion de celulas madre y progenitoras, ensayos y usos de las mismas.

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MXPA04009998A
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Abstract

La presente invencion se refiere a metodos de modulacion de la diferenciacion de celulas madre y celulas progenitoras de mamiferos. Los metodos de la invencion se pueden emplear para regular y controlar la diferenciacion y la maduracion de las celulas madre de mamiferos, particularmente de humanos, junto con linajes especificos de celulas y de tejidos. Los metodos de la invencion se refieren al uso de ciertas moleculas organicas pequenas para modular la diferenciacion de las poblaciones de celulas madre o progenitoras junto con linajes especificos de celulas y de tejidos, y en particular, para la diferenciacion de celulas madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta post-parto o para la diferenciacion de celulas progenitoras tempranas para un linaje de granulocitos. Finalmente, la invencion se refiere al uso de tales celulas madre o progenitoras diferenciadas en los transplantes y otros tratamientos medicos.

Description

MODULACIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS, ENSAYOS Y USOS DE LAS MISMAS 1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a métodos de modulación de la diferenciación de células madre y/o progenitoras de mamíferos. Los métodos de la invención se pueden emplear para regular y controlar la diferenciación y la maduración de las células progenitoras y madre de mamíferos, particularmente de humanos, junto con linajes específicos de células y de tejidos. Los métodos de la invención se refieren al uso de ciertas moléculas orgánicas pequeñas para modular la diferenciación de las poblaciones de células madre junto con linajes específicos de células y de tejidos, y en particular, a la diferenciación de células madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta post-parto o la modulación de células progenitoras, hematopoyéticas , tempranas, junto con una ruta específica de diferenciación, particularmente una ruta de diferenciación de granulocitos. La invención también se refiere al uso de estas moléculas orgánicas para modular la diferenciación de linajes particulares de células progenitoras, tales como CD34+, CD45+ y CD133+. La invención también se refiere a los aspectos temporales del desarrollo de células progenitoras, y modelos in vi tro basados en estos aspectos temporales. La invención además se refiere al uso de estas células moduladas en métodos profilácticos y terapéuticos, que se incluyen composiciones farmacéuticas de tales compuestos orgánicos células y/o pequeños. Finalmente, la invención se refiere al uso de tales células madre o progenitoras diferenciadas en transplantes y otros tratamientos médicos. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe un considerable interés en la identificación, aislamiento y generación de células madre y progenitoras de humanos. Las células madre son células precursoras totipotenciales o pluri-potenciales capaces de generar una variedad de linajes de células maduras, y las células precursoras son células capaces de generar células de linajes de células específicas. Estas habilidades sirven como la base para la diferenciación y especialización celular necesarias para el desarrollo de órganos y tejidos. El reciente éxito en el transplante de células madre y progenitoras ha proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o suplementar la médula ósea después de la mieloablación debido a un padecimiento, exposición a químicos tóxicos y/o radiación. Además existe evidencia que demuestra que se pueden emplear células madre para repoblar muchos, sino es que todos, los tejidos y para restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. También se ha avanzado rápidamente en la aplicación de células madre en la ingeniería de tejidos, suministro de terapia génica y terapéutica celular. Se ha caracterizado una gran cantidad de diferentes tipos de células madre progenitoras y de mamíferos. Por ejemplo, son conocidas las células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre de adultos o células madre consignadas o células progenitoras. No solamente se han aislado y caracterizado ciertas células madre, también se han cultivado bajo condiciones que permiten la diferenciación hasta un punto limitado. Sin embargo, permanece un problema básico; es decir, que ha sido difícil controlar o regular la diferenciación de células madre y células progenitoras, tal como las células progenitoras hematopoyéticas . Actualmente, los métodos existentes para modular la diferenciación de estas células son burdos y no regulables, tal que las células se diferencian en tipos de células indeseadas, en tiempos indeseados . Además, el campo de las células del producto es típicamente bajo. Además, es problemático obtener un suficiente número de células madre de humanos para propósitos terapéuticos y de investigación. El aislamiento de poblaciones normalmente presentes de células madre o progenitoras en tejidos de adultos, ha sido difícil técnicamente y costoso, debido, en parte, a la cantidad limitada de células madre o progenitoras encontradas en la sangre o los tejidos, y la incomodidad significativa implicada al obtener aspirantes de médula ósea. En general, la cosecha de células madre o progenitoras de fuentes alternativas en cantidades adecuadas para propósitos terapéuticos y de investigación generalmente es laboriosa, que involucra, por ejemplo, la cosecha de células o te idos de un sujeto donador o paciente, el cultivo y/o propagación de células in vi tro, disección, etc. Con respecto a las células madre en particular, la obtención de estas células de embriones o tejidos fetales, que incluye los abortos, ha planteado inquietudes religiosas y éticas. La creencia ampliamente aceptada de que el embrión humano y el feto constituyen una vida independiente, ha motivado restricciones gubernamentales en el uso de tales fuentes para todos los propósitos, incluyendo la investigación médica. Por lo tanto son deseadas fuentes alternativas que no requieran el uso de células adquiridas de tejido embrionario o fetal para un avance adicional en el uso de células madre clínicamente. Existen, sin embargo, pocas fuentes alternativas viables de células madre o progenitoras, particularmente células madre o progenitoras de humanos, y por consiguiente el abastecimiento está limitado.
Hu et al. ( O 00/73421 titulada "Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells," publicada el 7 de Diciembre del 2000) describe células epiteliales amnioticas, de humanos, derivadas de la placenta en el suministro que se aislan, cultivan, criopreservan para su uso futuro, o que se inducen para diferenciarse. De conformidad con Hu et al., se cosecha inmediatamente una placenta después de la administración y la membrana amniótica separada del corion, por ejemplo mediante disección. Las células epiteliales amnioticas se aislan de la membrana amniótica de conformidad con las técnicas estándar del asilamiento de células. Las células descritas se pueden cultivar en varios medios, expandir en cultivos, criopresevar, o inducir para diferenciarlas. Hu et al. describe que las células epiteliales amnioticas son multi-potenciales (y posiblemente pluripotenciales) , y se pueden diferenciar en tejidos epiteliales tales como el epitelio de la superficie de la córnea o el epitelio vaginal. Sin embargo, el inconveniente de tales métodos, es que los mismos requieren mano de obra intensiva y el rendimiento de células madre es muy bajo. Los métodos disponibles actualmente para la expansión ex vivo de poblaciones celulares, también requieren mano de obra intensiva. Por ejemplo, Emerson et al., (Emerson et al., Patente Norteamericana No. 6,326,198 titulada "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells", publicada el 4 de Diciembre del 2001) ; describe métodos, y condiciones de medios de cultivo para el cultivo ex vivo de la división y/o la optimización de células madre de humanos de células madre progenitoras, hematopoyéticas, de humanos. De acuerdo con los métodos descritos, las células madre de humanos o las células progenitoras derivadas de la médula ósea, se cultivan en un medio de cultivo líquido es decir se reemplazan, preferiblemente se perfusionan, ya sea continua o periódicamente, en una relación de 1 mi de medio por mi de cultivo por un periodo de aproximadamente 24 hasta aproximadamente 48 horas. Se remueven los productos metabólicos y los nutrientes agotados se reponen mientras que se mantiene el cultivo bajo condiciones fisiológicamente aceptables . Kraus et al. (Kraus et al., Patente Norteamericana No. 6,338,942, titulada "Selective expansión of target cell populations" , expedida el 15 de Enero del 2002) describe que una población objetivo predeterminada de células se puede expandir selectivamente introduciendo una muestra de partida de células de sangre de cordón umbilical o sangre periférica en un medio de crecimiento, provocando que las células de la población celular objetivo se dividan, y pongan en contacto con las células en el medio de crecimiento con un elemento de selección que comprende moléculas de enlace con afinidad específica (tal como un anticuerpo monoclonal para CD34) para una población predeterminada de células (tal como células CD34) , para seleccionar células de la población objetivo predeterminada de otras células en el medio de crecimiento. Rodgers et al. (Patente Norteamericana No. 6,335,195 titulada "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation, " expedida el 1 de Enero del 2002) describe métodos para el cultivo ex vivo de células madre hematopoyéticas y mesenquimales y la inducción de la proliferación y diferenciación de células de linaje específico mediante el crecimiento en la presencia de angiotensinógeno, angiotensina I (AI), análogos AI, fragmentos AI y análogos de los mismos, angiotensina II (AII) , fragmentos AII o análogos de los mismos o agonistas del receptor tipo 2 AII AT2, ya sea solos o en combinación con otros factores de crecimiento y citoCinas. Las células madre se derivan de la médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón umbilical. Sin embargo, la desventaja de tales métodos, es que tales métodos ex vivo para inducir la proliferación y diferenciación de células madre es que consume tiempo, como se describió anteriormente, y también el resultado en bajos rendimientos de células madre. Las células madre y progenitoras tienen el potencial de ser utilizadas en el tratamiento de una variedad de padecimientos, que incluyen malignidades, errores congénitos de metabolismo, hemoglobinopatías, e inmunodeficiencias . Una mayor área de uso e investigación que involucra las células madre de sangre de cordón umbilical o placenta, ha sido el uso de tales células para generar pequeñas cantidades de células para la médula ósea y otros transplantes relacionados. Sin embargo, hasta la fecha, ninguno ha descrito un método para producir cifras sustanciales de células madre o progenitoras, tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+. Grandes números de las últimas células, en particular, podrían facilitar métodos de tratamiento utilizando células progenitoras. Los métodos de la invención descritos aquí atienden esta necesidad . Los retinoides, tales como la vitamina A y el ácido retinóico (RA) , han sido conocidos por afectar la diferenciación de las células madre. Por ejemplo, el ácido retinóico ha demostrado inhibir la proliferación de células madre hematopoyéticas consignadas anormalmente (leucemia mielógena crónica) (Nadkarni et al. 1984, Tumori 70:503-505) e inducir la diferenciación y pérdida del potencial de auto-renovación en las células de leucemia promioelocítica ( elchner et al., 1985, Blood 66(6):, 1469-1472). El ácido retinóico también ha demostrado inducir la diferenciación de las neuronas de las células madre embrionarias y reprimir la diferenciación mesodérmica espontánea (Slager et al., Dev. Genet. 1993; 14 (3) :212-24, Ray et al., 1997, J. Biol . Chem. 272(30): 18702-18708). El ácido retinóico además ha demostrado inducir la diferenciación de precursores de células germinales transformadas (Damjanov et al., 1993, Labor. Investig. 68 (2) :220-232) , precursores de células de placenta (Yan et al., 2001, Devel . Biol. 235: 422-432), y precursores de células endoteliales (Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468). El efecto de los retinoides en la diferenciación, sin embargo, todavía tiene que ser entendido completamente de tal forma que el mismo se pueda utilizar como un medio regulable para controlar la diferenciación de las células madre. Se han estudiado los efectos de los análogos de ácido fólico, tales como la aminopterina y ametopterina (metotrexato) , sobre la diferenciación de las células madre hematopoyéticas . Los análogos de ácido fólico se utilizan como agentes quimioterapéuticos en anemias linfoblásticas agudas y otros padecimientos y cánceres de proliferación sanguínea, y ha demostrado efectuar la diferenciación de las células madre exterminando ciertas poblaciones de células madre (DeLoia et al., 1998, Human Reproduction 13 (4) : 1063-1069) , y por consiguiente, podría ser una herramienta efectiva para regular la diferenciación de grandes cantidades de células madre para su administración a un paciente. Varias citocinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL7, IL-11, así como proteínas tales como la eritropoyetina, ligando Kit, M-CSF y G -CSF han demostrado dirigir la diferenciación de las células madre en tipos específicos de células en el linaje hematopoyético (Dushnik-Levinson et al., 1995, Biol . Neonate 67:77-83), sin embargo, estos procesos no son bien entendidos y aún siguen siendo demasiado burdos e imprecisos para permitir un medio regulable para controlar la diferenciación de las células madre. Hasta la fecha, ninguno ha descrito el uso de compuestos, tales como los compuestos inmunomoduladores descritos posteriormente, en la diferenciación de células madre o células precursoras. En particular, ninguno ha demostrado el uso de tales compuestos para modular la diferenciación de células progenitoras , tales como células progenitoras CD34+, lejos de un linaje celular dendrítico, una capacidad útil para estimular la tolerancia inmune en los trasplantes. Asimismo, ninguno ha descrito el uso de los compuestos descritos aquí para expandir las poblaciones de células progenitoras para producir una composición farmacéutica que contenga tales células. Tales cultivos de células progenitoras expandidas podrían ser útiles en el tratamiento del padecimiento inj erto-versus-huésped y el desarrollo de tolerancia inmune. Debido a que el control sobre la diferenciación de las células madre y precursoras puede producir poblaciones de células que sean útiles terapéuticamente, existe la necesidad de la capacidad de controlar y regular la diferenciación de células de linaje celular dendrítico, mieloide, o células progenitoras tempranas, tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+, para la producción controlada de células dendríticas y/o granulocitos . 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células progenitoras o células madre de mamíferos, particularmente de humanos. En particular, los métodos de la invención se pueden emplear para regular y controlar la diferenciación y la maduración de las células madre de humanos junto con linajes específicos de células y de tejidos. La invención abarca el uso de pequeños compuestos orgánicos, inmunomoduladores , más preferiblemente isoindolinas sustituidas con amino, particularmente los compuestos Actimid™ ó Revimid™, para efectuar tal regulación y control. La invención además contempló la administración de estos compuestos a células progenitoras en tiempos específicos para modular su diferenciación en formas específicas. Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de una célula madre o célula progenitora en un linaje celular específico, que incluye, pero no está limitado a, un linaje mesenquimal, hematopoyetico, adipogénico, hepatogénico, neurogénico, gliogénico, condrogénico, vasogénico, miogénico, condrogénico, u osteogénico. En una modalidad particular, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre con respecto a una célula de un linaje hematopoyético . La invención también abarca la modulación de una célula consignada a un tipo específico de célula, por ejemplo, célula mesenquimal, célula hematopoyética, adipocito, hepatocito, neuroblasto, gliobasto, condrocito, progenitor de células endoteliales (EC) , miocito, condrocito, u osteoblasto. En modalidades específicas, la invención abarca la modulación de una célula progenitora hematopoyética, consignada, a un eritrocito, un trombocito, o un leucocito (célula sanguínea blanca) tal como un neutrófilo, monocito, macrófago, eosinófilo, basófilo, mastocitos, célula B, célula T, o célula de plasma.
En otra modalidad, los métodos de la invención se refieren a la modulación de la diferenciación de células madre con respecto a las células de un linaje hetnatopoyético, en particular, linajes hematopoyéticos CD34+, CD133+, y CD45+, y métodos para producir composiciones farmacéuticas benéficas profiláctica y terapéuticamente que contienen tales células. En otra modalidad específica, los métodos de la invención se refieren a la modulación de la diferenciación de células progenitoras tempranas de un linaje celular dendrítico o un linaje de granulocitos , linaje endotelial, o linaje de cardiomiocitos . En otra modalidad, la invención proporciona métodos para regular la diferenciación de una célula progenitora en un linaje hematopoyético, particularmente una célula dendrítica o linaje granulocítico, linaje endotelial, linaje neural o linaje cardiomiocito . En una modalidad específica, dicha célula progenitora es una célula CD34+ ó CD133+. Tal regulación se logra poniendo en contacto las células progenitoras durante el cultivo con un compuesto de la invención. En una modalidad, dicho compuesto en un inhibidor de actividad TNF- . En una modalidad más específica, dicho compuesto es un compuesto inmunomodulador como se describe aquí, o talidomida o, más preferiblemente, una isoindolina sustituida con amino . En una modalidad aún más específica, dicho compuesto es Actimid™ ó Revimid™. En otra modalidad específica, los métodos de la invención abarcan la supresión de la diferenciación de células progenitoras en una célula dendrítica. En otra modalidad específica, la invención proporciona un método para modular la diferenciación de células progenitoras durante los primeros seis días del cultivo para producir un cultivo expandido de tales células progenitoras. En otra modalidad, los métodos de la invención abarcan la promoción del desarrollo de células progenitoras tempranas en un granulocito, el cual puede ser útil para combatir infecciones. El incremento de progenitores asignados de linaje de granulocitos (células CD15+) , puede ser de uso potencial en la reducción de la neutropenia y sus subsecuentes complicaciones infecciosas que representan la toxicidad más común limitante de dosis de quimioterapia para el cáncer. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir la diferenciación de células dendríticas, la cual es útil para mitigar los efectos del padecimiento injerto-versus-huésped. Las células progenitoras de la invención, cuando se modulan mediante un compuesto de la invención, son útiles para un transplante (es decir, reconstitución hematopoyética) , y se pueden utilizar en la medicina regenerativa como una fuente renovable de células y tejidos de reemplazo (tales como células pancreáticas, cardiacas, hepáticas, del riñon, hígado, cerebro, pulmón, vejiga, intestinales o de músculos) para tratar la senectud normal, daños o padecimientos tales como padecimiento cardiaco, apoplejía, padecimiento de Parkinson, y padecimiento de Alzheimer. Las células también serán útiles en la determinación de las rutas bioquímicas intracelulares que median la acción de los compuestos de la invención. Estas células también pueden ser útiles para la selección de nuevos fármacos y toxinas, por ejemplo, para determinar potenciales fármacos anti-cancerígenos , para entender los orígenes de defectos congénitos, etc. Los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , mientras que aumentan tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-G ) y mejoran la producción total de la unidad formadora de colonias. Los métodos de la invención se pueden utilizar no solamente para regular la diferenciación de las células madre, y células progenitoras tales como las células progenitoras CD34+, sino que también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias, proporcionando un beneficio significativo al transplante de células progenitoras hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea. Se puede utilizar cualquier célula madre de mamífero de acuerdo con los métodos de la invención, que incluyen pero no están limitados a, células madre aisladas de la sangre de cordón umbilical, placenta y otras fuentes. Las células madre se pueden aislar de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, ratón, rata, conejo, conejillo de indias, perro, gato, cerdo, oveja, vaca, caballo, mono, etc., más preferiblemente, un humano. Las células madre pueden incluir células pluripotentes , es decir, células que tengan una versatilidad completa de diferenciación, que sean auto-renovables, y que puedan permanecer letárgicas o inmóviles dentro del tejido. Las células madre también pueden incluir células multipotentes o células progenitoras consignadas. En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son células madre viables, inmóviles y pluripotentes que existen dentro, o que son producidas después por, la placenta de término completo, es decir, tales células se pueden recuperar después de un nacimiento exitoso y de la expulsión de la placenta, desangramiento y perfusión de la placenta, dando como resultado la producción y recuperación de tantas como un billón de células que poseen un núcleo, las cuales dan 50 a 100 millones de células madre multipotentes y pluripotentes . Tales células se mencionan aquí como células madre de placenta humana o células madre similares a las embrionarias . En una modalidad particular de la invención, las células, por ejemplo las células endógenas a la médula ósea o a una placenta perfusionada post-parto, que incluyen, pero que no están limitadas a, células madre similares a las embrionarias, células progenitoras tales como células CD34+ ó CD133+, células pluripotentes y células muítipotentes, se exponen a los compuestos -de la invención y se inducen para diferenciarse. Las células endógenas se pueden propagar in vitro. En otra modalidad, las células endógenas se pueden recolectar de la placenta y del medio de cultivo y se cultivan in vitro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación con respecto al tipo o linaje de célula deseada. En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras se derivan de otras fuentes tales como sangre de cordón umbilical, sangre periférica o sangre de adulto, y se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse. En una modalidad preferida, la diferenciación se realiza in vitro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación en el linaje deseado o tipo de célula. Los compuestos de la invención se utilizan en la diferenciación/medio de cultivo mediante la adición, generación in situ, o de cualquier otra manera que permita el contacto de las células madre o progenitoras con los compuestos de la invención. Se ha descubierto que la gestión del momento oportuno de la administración de los compuestos de la invención, tiene un profundo impacto en la diferenciación de las células progenitoras CD34+. Por consiguiente, en una modalidad de la invención, la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células dendríticas se retrasa o suprime mediante un método que comprende poner en contacto la célula progenitora en el primer día del cultivo con un compuesto de la invención. En otra modalidad, se reduce o previene el desarrollo de las células CDla+ de las células progenitoras CD34+ mediante un método que comprende poner en contacto dichas células progenitoras con un compuestos de la invención en el primer día del cultivo. En otra modalidad, se incrementa la persistencia de una población de células CDla+ derivada de las células progenitoras CD34+ poniendo en contacto dichas células progenitoras con un compuesto de la invención después de cultivar dichas células progenitoras durante seis días en la ausencia de dicho compuesto. La presente invención también abarca métodos de modulación de la diferenciación de células progenitoras tempranas, tales como células CD34+ y CD133+, que comprenden poner en contacto las células progenitoras en diversos tiempos durante las fases de proliferación y diferenciación con uno o más del (los) compuesto(s) de la invención. Por consiguiente, en una modalidad, la invención abarca un método de la modulación de la diferenciación de las células progenitoras que comprenden poner en contacto dichas células con uno o más compuesto (s) de la invención solamente en el primer día del cultivo. En otra modalidad, dichas células se ponen en contacto con dicho (s) compuesto (s) en una dosis en cualquier día entre el primer día y el doceavo día del cultivo. En otra modalidad, dichas células se ponen en contacto al menos dos veces con dicho(s) compuesto (s) , inclusive en diferentes días, entre los días 0-12. Aún en otra modalidad, dichas células se ponen en contacto con uno o más compuesto (s) dos veces al día, una vez al día, o una vez cada tercer día durante las fases de proliferación y/o diferenciación. En otra modalidad, dicho contacto se realiza in vitro. Aún en otra modalidad, dicho contacto se realiza in vivo en un sujeto. En una modalidad más específica, dicho sujeto es un humano, un mamífero no humano, un ave o un reptil . En resumen, una exposición de células progenitoras o madre endógenas o exógenas las cuales se pueden cultivar en una placenta perfusionada post-parto, a compuestos de la invención puede ocurrir mientras que las células se cultivan en la placenta, o preferiblemente, puede ocurrir in vi tro después de que se han recuperado y removido las células de la placenta. La invención abarca el uso de compuestos que tienen una actividad TNF- como moduladores del desarrollo de células madre y/o progenitoras . En modalidades específicas, los compuestos son compuestos inmunomoduladores tales como clases de compuestos conocidos como IMIDs™, que incluyen pero que no están limitados a análogos de talidomida, Actimid™ (Celgene Corp., Warren, NJ) , y Revimid™ (Celgene Corp., Warren, NJ) . La invención también abarca el transplante de células madre o progenitoras pretratadas para tratar o prevenir un padecimiento. En una modalidad, también se administra un compuesto de la invención a un paciente en necesidad de un transplante antes, durante y/o después del transplante. La invención además abarca el uso de una célula progenitora o tipo específico de célula producida a partir de un método de la invención. En otras palabras, la invención abarca el uso de leucocitos, granulocitos , o células dendríticas hechas a partir de la diferenciación de un progenitor hematopoyético donde quiera que dicha diferenciación del progenitor se module o regule utilizando un compuesto de la invención.
En otras modalidades, la invención abarca el control o regulación de las células madre in vivo mediante la administración tanto de una célula madre como de un compuesto de molécula pequeña de la invención a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende células progenitoras CD34+ ó CD133+ que se han puesto en contacto con un compuesto de la invención, particularmente una que inhibe la actividad TNF-a, en los primeros seis días del cultivo, bajo condiciones que promueven la proliferación y diferenciación de dichas células progenitoras, y un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad específica, la composición farmacéutica incluye células que se han recolectado y criopreservado después de seis días del cultivo. En otra modalidad específica, las células de la composición farmacéutica son células CD34+CD38~CD34~ ó CD34+CD38~CD34+. En otra modalidad específica, el compuesto con el cual las células se ponen en contacto es un compuesto inmunomodulador de la invención, o un análogo de talidomida. En otra modalidad específica, el compuesto con el cual las células se ponen en contacto es Actimid™ ó Revimid™. En otra modalidad, la invención también proporciona un método para elaborar una composición farmacéutica, que comprende poner en contacto células progenitoras CD34+ ó CD133+ con un compuesto que inhiba la actividad TNF-a, en donde dichas células progenitoras se cultivan durante seis días en un medio de cultivo bajo condiciones de cultivo que permiten la proliferación y diferenciación de dichas células progenitoras; recolectar dichas células después de seis días de cultivo; y combinar dichas células con un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad específica de este método, dicho contacto se realiza en el primer día del cultivo. En otra modalidad específica de este método, dicho contacto se realiza al menos dos veces durante dichos seis días del cultivo. En otra modalidad específica de este método, dicho compuesto es un compuesto inmunomodulador pequeño de la invención. En otra modalidad específica de este método, dicho compuesto es Actimid™ ó Revimid™. Aún en otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se han aislado de otras células sanguíneas antes de dicho cultivo. En otra modalidad específica de este método, dicho medio de cultivo contiene adicionalmente GM-CSF y TNF-OÍ. En una modalidad más específica de este método, dicho Actimid™ ó Revimid™ está presente en una concentración de entre 0.1 µ? y 10.0 µ?. En otra modalidad más específica de este método, dicho Actimid™ ó Revimid™ está presente en una concentración de 1.0 µ?. En otra modalidad específica de este método, dichas células se criopreservan después de dicha recolección. La invención además proporciona un método para expandir una población de células progenitoras en un sujeto mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de células progenitoras CD34+ ó CD133+ y ya sea Actimid™ ó Revimid™ a dicho sujeto mamífero receptor. En una modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se diferencian en el sujeto mamífero receptor. En otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se administran a dicho sujeto en una preparación de células que está sustancialmente libre de células de glóbulos rojos. En otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se administran al sujeto mamífero receptor en una preparación de células que comprende células de médula ósea, células de placenta, células de cordón umbilical o PBMCs . En otra modalidad específica de este método, dichas células progenitoras se administran al sujeto mamífero receptor en conjunción con un portador. En otra modalidad específica de este método, dicha célula progenitora es una célula progenitora CD34+CD133+. En otra modalidad específica de este método, las células progenitoras expresan material genético incorporado de interés.
La presente invención también proporciona las células que se producen mediante los métodos anteriores que son útiles como composiciones farmacéuticas. Aún en otras modalidades, la invención abarca métodos para acondicionar células madre o células progenitoras, por ejemplo, células progenitoras CD34+, después de la criopreservación y el deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la criopreservación y la exposición a los crioconservadores de las células madre. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para acondicionar las células madre después de la criopreservación y deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la exposición a lo crioconservadores (por ejemplo, DMSO) en la capacidad de proliferación y migratoria de las células madre. 3.1 DEFINICIONES Cuando se utiliza aquí, el término "bioreactor o termentador" se refiere a un sistema ex vivo para propagar células; producir o expresar materiales biológicos y desarrollar o cultivar células de tejidos, organoides, virus, proteínas, polinucleotidos y microorganismos. Cuando se utiliza aquí, "células DC" se refiere a células dendríticas.
Cuando se utiliza aquí, "célula progenitora temprana" significa una célula progenitora CD34+, una célula progenitora CD133+, o el equivalente ya sea de mamífero, ave o reptil. Cuando se utiliza aquí, el término "célula madre embrionaria" se refiere a una célula que se deriva de la masa celular interna de un blastocisto (por ejemplo, un embrión humano de 4 a 5 días de edad) y que es pluripotente . Cuando se utiliza aquí, el término "célula madre similar a una embrionaria" se refiere a una célula que no se deriva de la masa celular interna de un blastocisto. Cuando se utiliza aquí, una "célula madre similar a una embrionaria" también se puede mencionar como una "célula madre de placenta" . Una célula madre similar a una embrionaria preferiblemente es pluripotente. Sin embargo, las células madre las cuales se pueden obtener de la placenta incluyen células madre similares a las embrionarias, células multipotentes , y células progenitoras consignadas. De acuerdo con los métodos de la invención, las células madre similares a las embrionarias derivadas de la placenta, se pueden recolectar de la placenta aislada un vez que se ha desangrado y perfusionado durante un periodo de tiempo suficiente para remover las células residuales. Preferiblemente, las células similares a las embrionarias son humanas, aunque las mismas se pueden derivar de cualquier mamífero.
Cuando se utiliza aquí, el término "desangrado" o "desangramiento" cuando se utiliza con respecto a la placenta, se refiere a la remoción y/o drenado de sustancialmente toda la sangre del cordón umbilical de la placenta. De acuerdo con la presente invención, el desangramiento de la placenta se puede lograr mediante, por ejemplo, pero no a manera de limitación, drenado, emanación inducida con gravedad, masaje, estrujamiento, bombeo, etc. En una modalidad preferida, el desangramiento de la placenta se puede lograr además perfusionando, enjuagando o llenando la placenta con un fluido que puede o no puede contener agentes, tales como anticoagulantes, para ayudar en el desangramiento de la placenta . Cuando se utiliza aquí, el término "perfusar" o "perfusión" se refiere al acto de verter o pasar un fluido sobre o a través de un órgano o tejido, preferiblemente el paso de fluido a través de un órgano o tejido con suficiente fuerza o presión para remover cualquier célula residual, por ejemplo, células no adheridas del órgano o tejido. Cuando se utiliza aquí, el término "perfusado" se refiere al fluido recolectado después de su paso a través de un órgano o tejido. En una modalidad preferida, el perfusado contiene uno o más anticoagulantes .
Cuando se utiliza aquí, el término "célula endógena" se refiere a una célula "no extraña", es decir, una célula "propia" o autóloga que se deriva de la placenta. Cuando se utiliza aquí, el término "célula exógena" se refiere a una célula "extraña" , es decir, una célula heteróloga (es decir, una célula "no-propia" derivada de una fuente diferente del donador de placenta) o célula autóloga (es decir, una célula "propia" derivada del donador de placenta) que se deriva de un órgano o tejido diferente de la placenta. Cuando se utiliza aquí, el término "compuesto inmunomodulador" se refiere a los compuestos descritos en la Sección 5.3, posterior. Cuando se utiliza aquí, el término "organoide" se refiere a una agregación de uno o más tipos de células ensambladas en apariencia superficial o de estructura real como cualquier órgano o glándula del cuerpo de un mamífero, preferiblemente el cuerpo humano. Cuando se utiliza aquí, el término "célula multipotente" se refiere a una célula que tiene la capacidad de crecer en cualquier subconjunto de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de un mamífero. A diferencia de una célula pluripotente, una célula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos de células.
Cuando se utiliza aquí, el término "célula pluripotente" se refiere a una célula que tiene una versatilidad completa de diferenciación, es decir, la capacidad de crecer en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de un mamífero. Una célula pluripotente se puede auto-renovar, y puede permanecer inactiva o inmóvil dentro de un tejido. A diferencia de una célula totipotente (por ejemplo, una célula de un huevo diploide, fertilizado) , una célula madre embrionaria usualmente no puede formar un nuevo blastocisto. Cuando se utiliza aquí, el término "célula progenitora" se refiere a una célula que está consignada para diferenciarse en un tipo específico de célula o para formar un tipo específico de tejido. Cuando se utiliza aquí, el término "célula madre" se refiere a una célula maestra que se puede reproducir indefinidamente para formar las células especializadas de tejidos y órganos. Una célula madre es una célula desarrolladamente pluripotente o multipotente . Una célula madre se puede dividir para producir dos células madre hijas, o una célula madre hija y una célula progenitora (de "tránsito"), que luego prolifera en las células completamente formadas, maduras, del tejido.
Cuando se utiliza aquí, el término "célula totipotente" se refiere a una célula que es capaz de formar un embrión completo (por ejemplo, un blastocisto) . 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1. La gráfica de barras indica los resultados del cultivo de las células CD34+ de sangre de cordón umbilical en la presencia de Talidomida (THD) , Actimid™, y Revimid™ en concentraciones de 1 g/ml y 10 /¿g/ml. Se utilizó un volumen igual de DMSO como un control negativo. Las colonias hematopoyéticas de unidades formadoras de brotes de eritroides (BFU-E) , unidades formadoras de colonias de eritroides (CFU-E) , unidades formadoras de colonias de macrófagos de granulocitos (CFU-GM) y el número total de colonias (CFU-colonias. Para detalles ver la Sección 6.1. FIGS. 2 (A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ y Revimid™, inhibe la eritropoyesis y la expansión de las células CD34+CD38-. Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3 , IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 g/ml) . D. Talidomida ("Thal") (5 µg/ml) . E. Actimid™ (5 µ / l) . F. Revimid™ (5 µg/ l) . Eje X: intensidad relativa del teñido con Gly-A (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD34 (F 2-H) . Para detalles ver la Sección 6.1. FIGS . 3 (A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ ó Revimid™, inhibe la expresión del CXCR4 en las células CD34+ de sangre de cordón umbilical de humano en 14 días de cultivo con las citocinas IL3 , KL, y G-CSF. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, células CD45+. C. DMSO (0.3 g/ml) . D. Thal (0.3 g/ml) . E. Actimid™ (0.3 g/ml) . F. Revimid™ (0.3 µ /ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CXCR4 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.2. FIGS. 4 (A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ ó Revimid™, estimula la expansión de las poblaciones de células CD34+ y/o CD34+CD38-. Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores.
A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (0.3 g ml) . D. Thal (0.3 g/ml) . E.
Actimid™ (0.3 9/?t?1) . F. Revimid™ (0.3 9/??1) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CD 38 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.2. FIGS. 5(A-F). Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ ó Revimid™, produce una preservación significativa de células progenitoras de sangre de cordón umbilical de humano.
Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3 , IL6, G-CSF, Epo y KL.
Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 g/ml) . D. Thal (5 µg/ml) . E. Actimid™ (5 g/ml) . F. Revimid™ (5 µg/ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CD 38 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.2. FIGS. 6 (A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ y Revimid™, inhibe la expresión del CXCR4 y expande la población de las células CD45+. Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 g ml) . D. Thal (5 g/ml) . E. Actimid™ (5 /g/ml) . F. Revimid™ (5 g/ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CD45 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CXCR4 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.2. FIGS . 7 (A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ y Revimid™, produce una expansión en el número de células progenitoras CD34+ e incrementa la producción de granulocitos y monocitos. Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 µg/ml) . D. Thal (5 µg/ml) . E. Actimid™ (5 µ9 p?1) . F. Revimid™ (5 µ9/t?1) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CDllb (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.2. FIGS. 8 (A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ y Revimid™, expande las células progenitoras CD34+ y contrarresta la represión mediada con DMSO de la producción de monocitos. Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3 , IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 ig/ml) . D. Thal (5 /xg/ml) . E. Actimid™ (5 . F. Revimid™ (5 µg/ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido de la expresión del CD14 (FL1-H) . Eje M: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.3. FIGS. 9(A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ muestra efectos supresores menores en la diferenciación de las células B. Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3, IL6, G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglob lina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 µg/ml) . D. Thal (5 µg/ml) . E. Actimid™ (5 µg/ml) . F. Revimid™ (5 g/ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CD38 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD19 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.3. FIGS. 10 (A-F) . Citogramas de flujo. La exposición de las células CD45+ de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ y Revimid™, supera la represión del CXCR5 producido por la exposición al DMSO. Las células CD45+ de sangre de cordón umbilical se cultivaron durante 14 días con las citocinas IL3 , IL6 , G-CSF, Epo y KL. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 µg/ml) . D. Thal (5 µg/ml) . E. Actimid™ (5 µg/ml) . F. Revimid™ (5 µg/ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CXCR5 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.3. FIGS. 11 (A-E) . Citogramas de flujo. La exposición de las células mononucleadas (MNCs) de sangre de cordón umbilical de humano al Actimid™ y Revimid™, incrementa la población de células CD34+CD38+. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 g/ml) . D. Actimid™ (5 µg/ml) . E. Revimid™ (5 g/ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CD38 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.3. FIGS. 12 (A-E) . Citogramas de flujo. La exposición de las M Cs al Actimid™ y Revimid™, sub-regula la población de células CXCR34+CD45+, aunque incrementa la población de células CXCR34+CD45+ . Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de la población de células que expresan una combinación particular de marcadores. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. Control, no se agrega ningún compuesto. C. DMSO (5 ^g/ml) . D. Actimid™ (5 g/ml) . E. Revimid™ (5 g/ml) . Eje X: intensidad relativa del teñido con CXCR4 (FL1-H) . Eje Y: intensidad relativa del teñido con CD34 (FL2-H) . Para detalles ver la Sección 6.3. FIGS. 13 (A-E) . Citogramas de flujo. El efecto de la Talomida, Actimid™ y Revimid™ en la consignación de linajes de la diferenciación del linaje de progenitores hematopoyéticos en la fracción de células nucleadas de sangre de cordón umbilical. Los citogramas de flujo muestran que el Actimid™ y el Revimid™ incrementan el porcentaje de células de linaje de monocitos comparado con el control, indican que existe una modulación de la diferenciación la cual se cambia hacia los linajes que dan origen a las células linfoides y mieloides. A. Control, inmnumoglobulina (Ig) . B. DMSO (5 µg/ml) . C. Thal (5 /xg/ml) D. Actimid™ (5 µg/ml) . E. Revimid™ (5 /xg/ml) . Para detalles ver la Sección 6.4. FIG. 14. Descripción del estudio del efecto del Actimid™ en la diferenciación de las células CD34+ y la maduración en las células DC. Las células CD34+ se cultivaron en la presencia o ausencia de 1.0 µ? de Actimid™ y DMSO (dimetilsulfóxido) durante ya sea la fase de expansión o maduración (día 1 a día 12) o durante la fase de maduración (día 6 a día 12). anticuerpos monoclonales conjugados. Para detalles ver la Sección 6.6. FIGS . 15(A-D). Los citogramas de flujo muestran las características fenotípicas de las células CD34+ del día 6, expuestas al Actimid™ desde el día 1. El Actimid™ casi suprimió completamente el desarrollo de células CD86+CDla+. Las células se etiquetaron doblemente con CDla FITC y CD14 PE ó CDla FITC y CD86 PE. A: células CD86+CD1+ generadas a partir de las células CD34+ tratadas con DMSO (control) . B: células CD14+CD1+ generadas a partir de las células CD34+ tratadas con DMSO (control) . C: células CD86+CD1+ generadas a partir de las células CD34* tratadas con Actimid™. D: células CD14+CD1+ generadas a partir de las células CD34+ tratadas con Actimid™. Los porcentajes en cada citograma, indican el porcentaje de las células que expresan una combinación particular de marcadores. Para detalles ver la Sección 6.6. FIGS. 16 (A-D) . Los citogramas de flujo muestran el efecto en el día 6 de la exposición del Actimid™ durante la fase de expansión (día 1 a día 6) en las células CD34+. Las células CD34+CD38- expuestas al Actimid™ se diferenciaron en las células CD34+CD38~CD33+ después de 6 días. Las células se etiquetaron doblemente con CD33 FITC y CD83 PE ó CD38 PE y CD34 PE. A: células tratadas con DMSO y etiquetadas para CD34 y CD38. B: células tratadas con DMSO y etiquetadas para CD83 y CD33. C: células tratadas con Actimid™ y etiquetadas para CD34 y CD38. D: células tratadas con los porcentajes en cada citograma, indican el porcentaje de las células que expresan una combinación particular de marcadores. Para detalles ver la Sección 6.6. FIG. 17. El Actimid™ induce un cambio en las poblaciones de células derivadas de las células CD34+ desde el día 0 hasta el día 6 del cultivo. Las células se cultivaron desde el día 0 hasta el día 6 en la presencia de diferentes concentraciones de Actimid™, luego se etiquetaron doblemente con CD34 y CD38 ó CDla y CD14. El Actimid™ provoca un incremento marcado en las células CD34+CD38- y se disminuyó en las células CDla+CD1 - . Para detalles ver la Sección 6.6. FIG. 18. Modificaciones fenotípicas en el día 6 de las células CD34+ tratadas varias veces con Actimid™. Las células se colocaron en placas y se cultivaron durante 6 días. Las células se trataron con Actimid™ desde el día 0 hasta el día 1 solamente, del día 0 hasta el día 2 solamente, del día 0 hasta el día 3 solamente, del día 0 hasta el 4 solamente, del día 0 hasta el 5 solamente, ó del día 0 hasta el 6. Para incubaciones menores a 6 días, el Actimid™ se lavó en el día indicado y las células se resuspendieron en DIVISO . En 6 días, las células se etiquetaron con CD34 y CD38 ó CDla y CD14. Para detalles ver la Sección 6.6. FIGS . 19(A-B). Modificaciones fenotípicas en el día 6 de las células progenitoras CD34+ tratadas con dosis individuales o múltiples de Actimid™. FIG. 19A: Condición 1: dosis individual de Actimid™ en el día 0; condición 2: Actimid™ administrado en el día 0 y día 4; condición 3: Actimid™ administrado en el día 0, día 2, y día 4. El eje Y indica el porcentaje de células que expresan el marcador particular o combinación de marcadores. FIG. 19B: Condición 1: dosis individual de Actimid™ en el día 0; condición 2: Actimid™ administrado en el día 0 y día 8; condición 3: Actimid™ administrado en el día 0, día 2, día 4, día 6 y día 8. Las células se evaluaron para la expresión del CD11 y CD15, un marcador granulocítico . El eje Y indica el porcentaje de células CDllc+CD15- y CDllc-CD15+ puestas en contacto con el Actimid™ ó el DMSO (control) . Para detalles ver la Sección 6.6. FIGS. 20(A-F). Citogramas de flujo de células dendríticas en el día 12, generados a partir de las células CD34+ expuestas al Actimid™ (1 µ?) desde el día 1 hasta el día 12. El Actimid™ provoca la disminución de las moléculas co-estimuladoras CD86 y CD80 en el día 12 cuando se compara con el control. Las células se etiquetaron doblemente con anticuerpos CDla FITC y CD86 PE, anticuerpos CDla FITC y CD80 PE, ó anticuerpos CDla FITC y CD14 PE. A: Células tratadas con DMSO y teñidas en el día 12 por CD86 y CDla. B: Células tratadas con DMSO y teñidas en el día 12 por CD80 y CDla. C: Células tratadas con DMSO y teñidas en el día 12 por CD 14 y CDla. D: Células tratadas con Actimid™ y teñidas en el día 12 por CD86 y CDla. E: Células tratadas con Actimid™ y teñidas en el día 12 por CD80 y CDla. F: Células tratadas con Actimid™ y teñidas en el día 12 por CD14 y CDla. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de células que expresan una combinación particular de marcadores. Para detalles ver la Sección 6.6.
FIGS. 21 (A-D) . Citogramas de flujo de células dendríticas en el día 12, generados a partir de las células CD34+ expuestas al Actimid™ (1 µ?) desde el día 1 hasta el día 12. La exposición al Actimid™ da como resultado una modulación de la expresión del CD54 de las moléculas de adhesión, que provoca una disminución en la expresión del CD54bri9ht y un incremento en la expresión del CD54dim en relación al control (comparar los subpaneles E y F en la FIG. 21D) . A: Células tratadas con DMSO y teñidas por HLA-DR y con IgGl . B: Células tratadas con DMSO y teñidas por CD54 y CD40. C: Células tratadas con Actimid™ y teñidas por HLA-DR y con IgGl. D: Células tratadas con Actimid™ y teñidas por CD54 y CD40. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de células que expresan una combinación particular de marcadores. Para detalles ver la Sección 6.6. FIGS. 22(A-B). El Actimid™ promueve la diferenciación granulocítica de las células progenitoras CD34+. Citogramas de flujo de las células CD34+ cultivadas durante 12 días en la presencia de DMSO (FIG. 22A) ó Actimid™ (FIG. 22B) , luego etiquetadas con un anticuerpo al marcador CD15 de granulocitos . Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de células que expresan una combinación particular de marcadores. Para detalles ver la Sección 6.6.
FIGS. 23 (A-D) . El Actimid™ no induce la apoptosis de los precursores CDla+ ó CD14+. Citogramas de flujo de las células aisladas CDla+CD14" y CDla"CD14+ (progenitores DC) . Las células progenitoras CD34+ se cultivaron durante un periodo de 6 días en la presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF- . En el día 6, las células CDla+CD14- y CDla-CD14+ se aislaron mediante se cultivaron durante unos 2 días adicionales en la presencia de GM-CSF y TNF-a con o sin Actimid™ (1 µ?) . Las células apoptóticas se monitorearon entonces utilizando el teñido Annexin V-FITC, un marcador para apoptosis, en combinación con yoduro de propidio (PI) , una sonda de viabilidad. Los porcentajes indicados en cada citograma, indican el porcentaje de células positivas al teñido de Annexin V-FITC y/o yoduro de propidio. El número de células positivas al Annexin V-FITC fue comparable con las células tratadas con Actimid™ y con el control (comparar particularmente B3 y B4 en cada citograma) . A: Células CDla+CD14- tratadas con DMSO. B: Células CDla+CD14-tratadas con Actimid™. C: Células CDla"CD14+ tratadas con DMSO. D: células CDla~CD14+ tratadas con Actimid™. Para detalles ver la Sección 6.6. FIGS. 24(A-D). Citogramas de flujo de las células CD34+ cultivadas durante 12 días en la presencia o ausencia del Actimid™. El Actimid™ provoca una disminución en la endocitosis mediada con un receptor de mañosa, como se demostró por la absorción disminuida de dextrano etiquetado con FITC en relación al control DMSO. A: DMSO y 4°C. B. Actimid™ y 4°C. C: DMSO y 37°C. B. Actimid™ y 37°C. El porcentaje en cada citograma indica la fracción de células que exhiben endocitosis. Para detalles ver la Sección 6.6. FIGS. 25(A-D). Citogramas de flujo de las células CD34+ cultivadas durante 12 días, y cultivadas en la presencia o ausencia del Actimid™ de los días 6-12. El cultivo en la presencia de Actimid™ en los días 6-12, después del cultivo de los días 1-5 en la ausencia del Actimid™, da como resultado una endocitosis mediada con un receptor de mañosa comparable con el del control de DMSO. El porcentaje en cada citograma indica la fracción de células que exhiben endocitosis. A: DMSO y 4°C. B. Actimid™ y 4°C. C: DMSO y 37°C. B. Actimid™ y 37°C. Para detalles ver la Sección 6.6. FIG. 26. El Actimid™ reduce la capacidad de presentar antígenos de las células CD34+ cultivadas durante 12 días. Las células CD34+ se cultivaron durante 12 días en la presencia o ausencia del Actimid™; células tratadas con Actimid™, en el día 12, muestran un índice de estimulación disminuido sustancialmente cuando se compara con el control de DMSO. Para detalles ver la Sección 6.6. FIG. 27. El Actimid™ tiene poca actividad de reducción APC en las células CD34+ cultivadas en Actimid™ desde el día 6 hasta el día 12. Las células CD34+ se cultivaron durante cinco días, las cultivadas en la presencia o ausencia del Actimid™. La capacidad de presentar antígenos de las células tratadas con es comparable con aquella del control, células tratadas con DMSO. Para detalles ver la Sección 6.6. FIG. 28. Ruta de diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, cultivadas en la presencia de GM-CSF y TNF-cx . FIG. 29. Ruta de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, cultivadas en la presencia de GM-CSF y TNF-a. Para detalles ver la Sección 6.6. FIG. 30. Diagrama que muestra las condiciones de maduración para las células progenitoras hematopoyéticas Sca+Lin- de murino. Las células se cultivaron durante 9 días en la presencia del factor de células madre (SCF) , Flt-3L, del factor estimulador de colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF) y factor estimulador de colonias de macrofagos (MCSF) en la presencia de DMSO al 0.1% (control), 10 µ? de Actimid™ ó 10 µ? de ácido retinóico todo-trans (ATRA) para conducir las células a un fenotipo precursor DC. Las células se cultivaron entonces desde el día 9 hasta el día 12 en la presencia de GM-CSF y TNF-OÍ, más DMSO, Actimid™ ó ATRA, para conducir la diferenciación de las células de murino a células dendríticas inmaduras. Para detalles ver la Sección 6.8.
FIGS. 31 (A-E). Células de murino presentes en el día 9 bajo condiciones normales de cultivo (ver el Ejemplo 1, Materiales & Métodos; descripción de la FIG. 30) . Las células se etiquetaron con anticuerpos como CD80 (FIG. 31A) , CD11 (FIG. 31B) , CD32/16 (FIG. 31C) , MHC II ((I-Ab) (FIG. 31 D) , CD14 (FIG. 31E) ó Gr-1 (FIG. 31F) . Las células en el día 9 exhibieron un etiquetado con los marcadores CD88, CD11 y CD32/16, pocos etiquetados con anticuerpos como el marcador I-Ab, y ninguno con CD14 ó Gr-1. Para detalles ver la Sección 6.8. FIGS. 32(A-I) . Citogramas de flujo de las células de murino del día 12 tratadas con DMSO, Actimid™ ó ATRA. Las células se etiquetaron con los anticuerpos como CD86 y CDllb. FIGS. 32A-32C (hilera superior): citogramas que muestran los porcentajes de células que expresan el CD86 (eje Y) cuando se tratan con DMSO (control) , Actimid™ ó ácido retinóico todo-trans (ATRA) . FIGS . 32D-32F (hilera intermedia) : porcentaje de las células que expresan el marcador de mayor histocompatibilidad II (MHC II) ; el tratamiento es como el de la hilera superior. FIGS. 32G-32I (línea inferior): porcentaje de células que expresan el CDllb; tratamiento como en la hilera superior. Para detalles ver la Sección 6.8. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento inesperado de que la exposición de células madre o células progenitoras a los compuestos de la invención, da como resultado un medio regulable para controlar la diferenciación de las células madre o progenitoras en poblaciones específicas de células progenitoras o la diferenciación de células progenitoras en tipos específicos de células, tales como células dendríticas, granulocitos , células endoteliales o células neurales. En particular, la exposición de las células madre o progenitoras a los compuestos de- la invención, da como resultado la diferenciación regulable y la expansión de poblaciones específicas de células hematopoyéticas, que incluyen las células CD34+, CD38+ y CD133+. Tal regulación de la diferenciación se logra sin una pérdida significativa del rendimiento debido a que la muerte de las células o la diferenciación con respecto los tipos de células no deseadas o linajes celulares, en otras palabras, los compuestos de la invención no provocan la apoptosis de una o más poblaciones de células. Además, la exposición de células progenitoras a los compuestos de la invención, da como resultado la diferenciación regulable y la expansión de tipos específicos de células.
Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células madre de humanos, específicamente la célula progenitora hematopoyética CD34+, y la diferenciación de la célula progenitora CD133+. En particular, la presente invención proporciona métodos que emplean pequeñas moléculas orgánicas que inhiben la actividad TNF-a para modular la diferenciación de las poblaciones de células progenitoras junto con los linajes específicos de células y tejidos. Además, la invención abarca métodos para expandir células progenitoras tempranas, tales como CD133+ ó CD34+ de humanos, particularmente células CD34+CD38~, para su transplante en mamíferos, aves y reptiles, que comprende exponer las células progenitoras hematopoyéticas a un inhibidor o antagonista TNF- , en donde el inhibidor o antagonista es una pequeña molécula. La invención también proporciona métodos para producir otros tipos de células de estas células progenitoras tempranas, que incluyen, pero no están limitadas, células del cerebro, riñon, tracto intestinal y músculos. Los compuestos de la invención también actúan para suprimir la diferenciación de las células dendríticas, y para promover la diferenciación de las células granulocíticas , a partir de las células progenitoras tempranas, tales como las células progenitoras CD34+ de humanos.
Los ejemplos de los compuestos de moléculas pequeñas que se pueden utilizar en relación con la invención, incluyen, pero no están limitados a, compuestos que inhiben la actividad TNF-OÍ. Los compuestos que se pueden utilizar en los métodos de la invención se describen con detalle en la Sección 5.3. En una modalidad particularmente preferida, los compuestos son análogos de talidomida, aunque también se pueden utilizar los productos de hidrólisis de la talidomida, metabolitos, derivados y precursores de talidomida. En modalidades particularmente preferidas, los compuestos son IMIDS™ (Celgene) tales como Actimid™ ó Revimid™. Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de una célula madre o progenitora en un linaje específico de células, que incluyen, pero que no están limitados a, un linaje mesenquimal, hematopoyético, adipogénico, hepatogénico, neurogénico, gliogénico, condrogénico, vasogénico, miogénico, condrogénico, u osteogénico que comprende incubar la célula madre o progenitora con un compuesto de la invención, preferiblemente in vitro, durante un periodo suficiente de tiempo para dar como resultado la diferenciación de la célula en una célula de un linaje deseado de células. En una modalidad específica, se modula la diferenciación de una célula madre o progenitora en una célula del linaje hematopoyético. En particular, los métodos de la invención se pueden utilizar para modular la generación de una generación de colonias de células en la sangre de células progenitoras hematopoyéticas CD34+, CD133+ y CD45+ de una manera sensible a la dosis. Los métodos de la invención también abarcan la regulación de la diferenciación de una célula progenitora CD34+ en células dendríticas que comprende incubar la célula progenitora con un compuesto de la invención, preferiblemente in vitro, durante un periodo de tiempo suficiente para dar como resultado la diferenciación de la célula en una célula de un linaje deseado de células. En una modalidad específica, se modula la diferenciación de tal célula progenitora en una célula del linaje de células dendríticas a través del contacto de dicha célula con Actimid™ ó Revimid™, o un análogo o profármaco de cualquiera de los mismos. En otra modalidad específica, se modula la diferenciación de una célula progenitora CD34+ para suprimir la diferenciación junto con un linaje mieloide y para estimular la diferenciación junto con un linaje granulocítico . En una modalidad más específica, se modula la diferenciación de una célula progenitora CD34+ en una célula de un linaje de células granulocíticas mediante un método que comprende poner en contacto una célula progenitora CD34+ con un compuesto de la invención en el primer día se cultivan dichas células progenitoras.
Se puede utilizar cualquier célula madre o progenitora de mamífero de acuerdo con los métodos de la invención, que incluye pero no está limitado a, células madre aisladas de la sangre del cordón umbilical (células "CB" ) , placenta y otras fuentes. Las células madre pueden incluir células pluripotentes , es decir, células que tengan una versatilidad completa de diferenciación, que se auto-renuevan, y que pueden permanecer inactivas o inmóviles dentro del tejido. Las células madre también pueden incluir células multipotentes o células progenitoras consignadas. En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son viables e inmóviles, las células madre pluripotentes que existen dentro de la placenta de término completo se pueden recuperar después de un nacimiento exitoso y de la expulsión, desangramiento y perfusión de la placenta, dando como resultado la recuperación de células madre multipotentes y pluripotentes. En otra modalidad preferida, las células progenitoras son células progenitoras tempranas, particularmente células CD34+ ó CD133+. Preferiblemente, las células progenitoras CD34+ ó CD133+ se derivan de la médula ósea, placenta, o sangre de cordón umbilical de humanos. También se pueden utilizar equivalentes de estas células de otros mamíferos. En los ratones, por ejemplo, se pueden utilizar células progenitoras Sea* en los métodos de la invención. También se pueden utilizar células progenitoras tempranas equivalentes de aves o reptiles . En una modalidad particular de la invención, las células endógenas a la placenta, o producidas por una placenta perfusionada post-parto, que incluyen, pero que no están limitadas a, células madre similares a las embrionarias, células progenitoras, células pluripotentes y células multipotentes , se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse mientras que se cultivan en una placenta aislada y perfusionada. Las células endógenas propagadas en la placenta perfusionada post-parto se pueden recolectar, y/o recuperar las moléculas bioactivas del perfusato, medio de cultivo o de las células mismas de la placenta . En otra modalidad de la invención, se exponen las células madre o progenitoras que se derivan de fuentes que no sean de la placenta post-parto, a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse mientras que se cultivan in vitro. Por consiguiente, la invención abarca métodos para diferenciar las células madre de mamíferos en células progenitoras específicas que comprenden diferenciar las células madre bajo condiciones y/o medio adecuado para la diferenciación deseada y en la presencia de un compuesto de la invención .
Además, la invención abarca métodos para modular o regular la diferenciación de una población de una célula progenitora específica en tipos específicos de células que comprenden diferenciar dicha célula progenitora bajo condiciones adecuadas para dicha diferenciación y en la presencia de uno o más de los compuestos de la invención. En forma alternativa, la célula madre o progenitora se puede exponer a un compuesto de la invención y subsecuentemente diferenciar utilizando condiciones adecuadas. Los ejemplos de condiciones adecuadas incluyen formulaciones de medios de nutrientes suplementados con suero humano y matrices de cultivo celular, tales como MATRIGEL suplementado con factores de crecimiento. El método de la invención también contempla que se puedan producir diferentes poblaciones de células poniendo en contacto la(s) célula (s) progenitora (s) con un compuesto de la invención en diferentes momentos durante el cultivo, ya sea en la etapa de proliferación o diferenciación. Ver la Sección 5.4, particularmente la Sección 5.4.2, posterior. En una modalidad específica, la presente invención proporciona métodos que emplean moléculas pequeñas de amidas e imida, particularmente conjugados amino de talidomida, para modular y regular la hematopoyesis en el contexto del acondicionamiento para el pre-transplante de los progenitores hematopoyeticos . La presente invención también proporciona métodos que emplean las moléculas pequeñas de la invención para modular y regular la hematopoyesis en el contexto del acondicionamiento ex vivo de los progenitores hematopoyéticos . Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre o progenitoras in vi tro, que comprende incubar las células madre o progenitoras con el compuesto in vi tro, después del transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. La invención también abarca el control o regulación de células madre o progenitoras in vivo mediante la administración tanto de una célula madre o progenitora y un compuesto de la invención a un paciente en necesidad del mismo . La invención además abarca el transplante de células madre o progenitoras pretratadas para tratar o prevenir un padecimiento. En una modalidad, también se administra un compuesto de la invención antes, durante y/o después del transplante a un paciente en necesidad de un transplante. En otra modalidad, también se administran células madre o progenitoras no tratadas a un paciente en necesidad del transplante, por ejemplo, células de la sangre del cordón umbilical, células de la sangre de un adulto, células de sangre periférica, o células de médula ósea. En otra modalidad, los métodos de la invención incluyen la administración de los compuestos a un sujeto que es el receptor de células madre o progenitoras no acondicionadas o células progenitoras con el propósito de suscitar un efecto modulador en las células madre que ya se han transplantado. En ciertas modalidades, la invención abarca el transplante de médula ósea que comprende transplantar sangre del cordón umbilical (o células madre obtenidas de la sangre del cordón umbilical) , sangre periférica (es decir, de adulto) (o células madre de sangre periférica) , en donde dicha sangre del cordón umbilical o células madre se han pretratado con un compuesto de la invención. Además, la invención abarca el uso de células de glóbulos blancos elaboradas a partir de células progenitoras hematopoyéticas que se han diferenciado en la presencia de un compuesto de la invención. Por ejemplo, se pueden utilizar células blancas de la sangre o glóbulos blancos producidas diferenciando el progenitor hematopoyético en el transplante o se pueden mezclar con la sangre del cordón umbilical o con células madre de la sangre del cordón umbilical antes del transplante. En otras modalidades, la invención abarca el transplante de médula ósea que comprende transplantar células progenitoras tempranas, tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+, obtenidas de acuerdo con los métodos de la invención, en donde dichas células progenitoras se han pretratado con un compuesto de la invención. En una modalidad de la invención, dichos precursores de células dendríticas son las células precursoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38~CD33~ . Además, la invención abarca el uso de células elaboradas a partir de células progenitoras CD34+ que se han diferenciado en la presencia de un compuesto de la invención. Por ejemplo, las células precursoras CD34+CD38"CD33+, las células precursoras CD34+CD38"CD33" , los granulocitos , etc., producidos mediante la diferenciación de las células progenitoras CD34+ utilizando los compuestos de la invención se pueden utilizar en el transplante. Las células diferenciadas de las células CD133+, utilizando los compuestos de la invención, también se abarcan por la presente invención.
La invención además abarca métodos para acondicionar las células madre después de la criopreservación y el deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la criopreservación y exposición a los crioconservadores en las células madre. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para acondicionar las células madre después de la criopreservación y el deshielo, para contrarrestar los efectos nocivos de la exposición a los crioconservadores (por ejemplo, DMSO) en la capacidad de proliferación y migración de las células madre. 5.1. MODULACIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE Y CÉLULAS PROGENITORAS CD34+ Ó CD133+ 5.1.1. Células Madre La presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células madre de humanos. En ciertas modalidades, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre o progenitoras in vitro, que comprenden incubar las células madre con el compuesto in vitro, seguido por el transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En otras modalidades, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre o progenitoras in vivo, que comprende administrar los compuestos a un sujeto que es el receptor de las células madre no acondicionadas, seguido por la administración directa del compuesto al sujeto. Las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención se pueden inducir para diferenciarse junto con linajes específicos de células, que incluyen, aunque no están limitados a un linaje mesenquimal, hematopoyético, adipogénico, hepatogénico, neurogénico, gliogénico, condrogénico, vasogénico, miogénico, condrogénico, u osteogénico. En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias obtenidas de acuerdo con los métodos de la invención, se inducen para diferenciarse para su uso en el transplante y en los protocolos de tratamiento ex vivo. En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención, se inducen para diferenciarse en un tipo de célula particular y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. En una modalidad específica, las células madre similares a las embrionarias obtenidas mediante los métodos de la invención, se incuban con un compuesto, tal como una pequeña molécula orgánica, in vi tro, que se induce para diferenciarse, seguido por el transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, los compuestos que se utilizan para controlar o regular la diferenciación de las células madre no son polipéptidos , péptidos, proteínas, hormonas, citocinas, oligonucleótidos o ácidos nucleicos. Las células madre que se pueden utilizar de conformidad con la invención incluyen, pero no están limitadas a, células de cordón umbilical (CB) , células de placenta, células madre embrionarias (ES) , células madre similares a las embrionarias, células madre de trofoblastos , células progenitoras , células madre de médula ósea y células multipotentes , pluripotentes y totipotentes .
En particular, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las poblaciones de células madre, además de las células madre mesequinales , en linajes de tejidos específicos. Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden emplear para regular la diferenciación de una célula madre multipotente en células de linaje condrogénico, vasogénico, miogénico, y osteogénico promoviendo la regeneración y reparación músculo-esquelética específica, neoangiogénesis , y la repoblación de tejidos musculares específicos, tales como el miocardio y el músculo esquelético, y la revascularización de una variedad de órganos y tejidos que incluyen, pero no están limitados al cerebro, espina dorsal, hígado, pulmón, riñon y páncreas. Los métodos de la invención se pueden emplear para regular la diferenciación de una célula madre multipotente en una célula de linaje adipogénico, condrogénico, osteogénico, neurogénico o hepatogénico . El agente utilizado para modular la diferenciación se puede introducir en la placenta perfusionada post-parto para inducir la diferenciación de las células que se cultivan en la placenta. En forma alternativa, el agente se puede utilizar para modular la diferenciación in vi tro después de que las células se han recolectado o removido de la placenta.
Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de las células madre progenitoras con respecto a una célula del linaje hematopoyético, que comprende incubar las células madre progenitoras con el compuesto in vi tro durante un periodo suficiente de tiempo para dar como resultado la diferenciación de estas células con respecto a un linaje hematopoyético . En particular, los métodos de la invención se pueden utilizar para modular la generación de la generación de colonias de células sanguíneas de las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, CD133+, y CD45+ de una manera sensible a la dosis (para la descripción de la dosificación, ver la Sección 5.7). Preferiblemente, los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E. y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Los métodos de la invención se pueden utilizar no solamente para regular la diferenciación de las células madre, sino que también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias, proporcionando beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción de plaquetas. En otras modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de por ejemplo, una célula precursora neuronal o neuroblasto en un tipo específico de célula neuronal tal como una neurona sensorial (por ejemplo, una célula de la retina, una célula olfativa, una neurona mecanosensorial , una neurona quimiosensorial , etc.), una neurona motora, o neurona cortical, o una interneurona . En otras modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de los tipos de células que incluyen, pero no están limitadas a, neuronas colinérgicas, neuronas dopaminérgicas , neuronas GABA-érgicas, células gliales (que incluyen oligodendrocitos , las cuales producen mielina) , y células ependimales (que alinean el sistema ventricular del cerebro) . Aún en otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células que están constituidas de órganos, que incluyen, pero que no están limitados a, células purkinje (una especie de fibra muscular) , del corazón, epitelio biliar del hígado, células isleta beta del páncreas, células corticales o medulares del riñon, y células fotorreceptoras de la retina del ojo.
La valoración del estado de diferenciación de las células madre obtenidas de conformidad con los métodos de la invención, se pueden identificar mediante la presencia de marcadores de superficie celular. Las células madre similares a las embrionarias de la invención, por ejemplo, se pueden distinguir por los siguientes marcadores de superficie celular: 0CT-4+ y ABC-pt. Además, la invención abarca las células madre similares a las embrionarias que tienen los siguientes marcadores: CD10, CD29, CD44, CD54 , CD90, SH2 , SH3 , SH4, OCT-4 y ABC-p, o que carecen de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, CD38, CD45, SSEA3 y SSEA4, como se describe aquí anteriormente. Tales marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante citometría de flujo, seguida por el lavado y teñido con un anticuerpo del marcador de superficie anti-celular . Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 ó CD38, las células se pueden lavar en PBS y luego teñirse doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . 5.1.2. Células Progenitoras Tempranas CD34+ y CD133+ La presente invención también proporciona métodos de modulación de la diferenciación de las células CD34+ ó CD133+ de humano. En ciertas modalidades, los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de células madre o progenitoras in vi tro, que comprenden incubar las células madre con el compuesto in vi tro, seguido por el transplante de las células diferenciadas a un sujeto. Las células progenitoras obtenidas mediante los métodos de la invención, se pueden inducir para diferenciarse a lo largo de linajes específicos de células, que incluyen, pero no están limitados a, células progenitoras CD34+, un linaje mieloide o granulocítico, y para las células CD133+, un linaje de células neurales o endoteliales . En ciertas modalidades, las células progenitoras se inducen para diferenciarse para su uso en un transplante y protocolos de tratamiento ex vivo. En ciertas modalidades, las células progenitoras se inducen para diferenciarse en un tipo particular de célula y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético, terapéutico. En una modalidad específica, las células progenitoras se incuban con un compuesto, tal como una pequeña molécula orgánica, in vitro, que induce la misma a diferenciarse, seguido por el transplante de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, los compuestos que se utilizan para controlar o regular la diferenciación de las células madre no son polipéptidos, péptidos, proteínas, hormonas, citocinas, oligonucleótidos o ácidos nucleicos. En otra modalidad preferida, se provoca que la célula progenitora se diferencie en una célula progenitora CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38"CD33" . Preferiblemente, los métodos de la invención se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Los métodos de la invención se pueden utilizar no solamente para regular la diferenciación de las células madre, sino que también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias, proporcionando beneficios significativos al transplante de las células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de la médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción de plaquetas . En otras modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células CDla+, particularmente las células CD86+CDla+. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir o prevenir la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células CD14+CDla- . Las células CD14+CDla- son una célula dendrítica dérmica o células progenitoras de monolitos/macrófagos . En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir la expresión en la proliferación de célulás progenitoras CD34+ de moléculas co-estimuladoras CD80 y CD86. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para reducir la diferenciación de la proliferación de las células progenitoras CD34+ en células CD34bri9ht , y para estimular la diferenciación en células CD34dim. En otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para incrementar el número de células CD133+, las cuales son células progenitoras de una célula endotelial. Aún en otra modalidad, los métodos de la invención se pueden utilizar para disminuir la diferenciación de la proliferación de las células CD34+ en células CDllc-CD15+, y para incrementar la diferenciación en las células CDllc+CD15-, cambiando así la diferenciación de un linaje mieloide de células dendríticas a un linaje granulocítico . La valoración del estado de diferenciación de las células madre obtenidas de conformidad con los métodos de la invención, se pueden identificar mediante la presencia de los marcadores de superficie celular. Las células progenitoras de la invención, por ejemplo, se pueden distinguir mediante los marcadores de superficie celular CD34+ ó CD133+. Además, la invención abarca la proliferación de células progenitoras que poseen, o muestra una expresión incrementada con relación a un control, de uno o más de los siguientes marcadores: CD15, CD34, CD33, CD133 ó CD54dim, como se describe aquí anteriormente. La invención abarca además la proliferación de células progenitoras que carecen, o que muestran una expresión reducida con relación a un control, de uno o más de los siguientes marcadores: HLA-DR, CDla, CDllc, CD38, CD80, CD86, CD54bri9ht ó CD14. En una modalidad preferida, la proliferación de las células progenitoras de la invención, exhibe CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38+CD33" . Tales marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo lavando y tiñendo con un anticuerpo de marcador de superficie anti-celular, seguida por citometría de flujo. Por ejemplo, para determinar la presencia de células CD34 ó CD38, se pueden lavar en PBS y luego teñir doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . En cierta modalidad, las células diferenciadas se pueden determinar caracterizando la capacidad fagocítica de las células diferenciadas. Se pueden valorar la capacidad de diferenciar, o que diferencia, las células con respecto a la fagocitosis, por ejemplo, etiquetando dextrano con FITC y determinando la cantidad de absorción mediante métodos bien conocidos. La capacidad de diferenciar, o que diferencia, las células para que sea posible estimular las células T, se puede valorar en una reacción de leucocitos mezclados (MLR) , en la cual las células presumiblemente cargadas con antígenos se mezclan con células T, y se determina el nivel de activación de las células T. 5.1.3. Identificación y Caracterización de Células En ciertas modalidades, las células diferenciadas se pueden identificar caracterizando los genes expresados diferencialmente (por ejemplo, caracterizando un conjunto de genes de una célula (s) progenitora (s) no diferenciada (s) de interés contra un conjunto de genes de una célula diferenciada derivada de la célula progenitora) . Por ejemplo, los métodos de amplificación con ácido nucleico tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o, los métodos de amplificación basados en una trascripción (por ejemplo, trascripción in vitro (IVT) ) , se pueden utilizar para perfilar la expresión genética en diferentes poblaciones de células, por ejemplo, mediante el uso de un microarreglo de polinucleótidos . Tales métodos para perfilar la expresión genética diferencial, son bien conocidos en la técnica (ver; por ejemplo, Wieland et al., Proc. Nati. Acad: Sci. USA 87: 2720-2724 (1990; Lisitsyn et al., Science 259: 946-951 (1993); Lisitsyn et al., Meth. Enzymology 254: 291-304 (1995); Patente Norteamericana No. 5,436,142; Patente Norteamericana No. 5,501,964; Lisitsyn et al., Nature Genetics 6: 57-63 (1994); Hubank y Schatz, 1994, Nucleic Acids Research 22: 5640-5648; Zeng et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385; Patente Norteamericana No. 5,525,471; Linsley et al., Patente Norteamericana No. 6,271,002, titulada "RNA amplification method," expedida el 7 de Agosto del 2001; Van Gelder et al., Patente Norteamericana No. 5,716,785, titulada "Processes for genetic manipulations using promoters," expedida el 10 de Febrero de 1998; Stoflet et al., 1988, Science 239:491-494, 1988; Sarkar y Sommer, 1989, Science 244: 331-334; Mullís et al., Patente Norteamericana No. 4,683,195; Malek et al., Patente Norteamericana No. 5,130,238; Kacian y Fultz, Patente Norteamericana No. 5,399,491; Burg et al., Patente Norteamericana No. 5,437,990; R. N Van Gelder et al. (1990), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1663; D. J. Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol . 14, 1675; Shannon, Patente Norteamericana No. 6,132,997; Lindemann et al., Patente Norteamericana No. 6,235,503, titulada "Procedure for subtractive hybridization and difference analysis," expedida el 22 de Mayo de 2001) . Los equipos disponibles comercialmente están disponibles para el perfil genético, por ejemplo, la serie displayPROFILE™ de equipos (Qbiogene, Carlsbad, CA, la cual utiliza una metodología con base en gel para perfilar la expresión genética) . Los equipos utilizan la Muestra PCR Diferencial de Fragmento de Restricción (RFDD-PCR) para comparar los patrones de expresión genética en las células eucarióticas . También se puede utilizar un Equipo de Substracción con Selección por PCR (Clontech) y un Equipo de Substracción por Selección con PCR (Clontech) , el cual permita la identificación de clones expresados diferencialmente en una biblioteca o genoteca substraída. Después de generar conjuntos de genes expresados diferencialmente con el equipo de Substracción de PCR Selectiva, se utiliza el Equipo de Substracción por Selección de PCR. La biblioteca substraída se hibridiza con sondas sintetizadas directamente del analizador y poblaciones de conducción, una sonda hecha del ADNc substraído, y una sonda hecha del ADNc substraído inverso (una segunda substracción realizada a la inversa) . Los clones que se hibridizan paira las sondas analizadoras pero no para las sondas de conducción se expresan diferencialmente ; sin embargo, las sondas no sustraídas no son lo suficientemente sensibles para detectar mensajes extraños. Las sondas substraídas enriquecen en gran medida los ADNcs expresados diferencialmente , aunque pueden dar resultados positivos falsos. Utilizando sondas tanto substraídas como no substraídas de conformidad con las instrucciones del fabricante (Clontech) se identifican los genes expresados diferencialmente .
En otra modalidad, las células madre o progenitoras diferenciadas se identifican y caracterizan mediante un ensayo de la unidad formadora de colonias, el cual es comúnmente conocido en la técnica, tal como un medio Mesen Cult™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia) . La determinación de que una célula madre o progenitora se ha diferenciado en un tipo particular de célula, se puede lograr mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de superficie celular utilizando técnicas tales como la citometría de flujo o inmunocitoquímica (por ejemplo, células de teñido con anticuerpos específicos de marcadores celulares o de tejidos específicos), mediante el examen de la morfología de las células utilizando microscopía de luz o confocal , o midiendo los cambios en la expresión genética utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, tal como el PCR y el perfil de expresión genética. 5.2. POBLACIONES DE CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS La presente invención proporciona métodos de modulación de la diferenciación de células madre de humanos. Cualquier célula madre de mamífero se puede utilizar dentro de los métodos de la invención, que incluye, pero no están limitados a, células madre aisladas de la sangre del cordón umbilical (células CB) , sangre periférica, sangre de adulto, médula ósea, placenta, células madre mesenquimales y otras fuentes. En una modalidad no preferida, las células madre son células madre embrionarias ó células que se han aislado de fuentes diferentes de la placenta. Las fuentes de células madre mesenquimales incluyen la médula ósea, saco vitelino embrionario, placenta, cordón umbilical, piel fetal y adolescente, y sangre. Se pueden obtener células de médula ósea, por ejemplo, de cresta iliaca, fémur, tibia, espina, costilla u otros espacios medulares. Las células madre que se utilizan de conformidad con los métodos de la presente invención, pueden incluir células pluripotentes , es decir, células que tengan una versatilidad completa de diferenciación, que son auto-renovables , y que puedan permanecer letárgicas o inmóviles dentro del tejido. Las células madre también pueden incluir células multipotentes, células progenitoras consignadas, y células de fibroblastoides . En una modalidad preferida, la invención utiliza células madre que son viables, letárgicas, células madre pluripotentes aisladas de una placenta de término completo, perfusionada, desangrada. Las poblaciones de células madre pueden consistir de células madre de placenta, obtenidas a través de un servicio comercial, por ejemplo LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ) , ViaCord (Boston MA) , Cord Blood Registry (San Bruno, CA) y Cryocell (Clearwater, FL) . Las poblaciones de células madre también pueden consistir de células madre de placenta, recolectadas de conformidad con los métodos descritos en la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20020123141, publicada el 5 de Septiembre del 2002, titulada "Method of Collecting Placental Stem Cells" y la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20030032179, publicada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom" (ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia en sus totalidades) . En una modalidad, se pueden utilizar células madre de sangre de cordón umbilical. La primera recolección de sangre de la placenta se menciona como sangre del cordón umbilical, la cual contiene predominantemente células progenitoras hematopoyéticas CD34* y CD38+. Dentro de las primeras veinticuatro horas de la perfusión posparto, se pueden aislar altas concentraciones de células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD38" de la placenta. Después de alrededor de veinticuatro horas de la perfusión, se pueden aislar altas concentraciones de células CD34"CD38" de la placenta junto con las células antes mencionadas. La placenta perfusionada aislada de la invención proporciona una fuente de grandes cantidades de células madre enriquecidas para las células madre CD34+CD38~ y células madre CD34~CD38+: La placenta aislada que se ha perfusionado durante veinticuatro horas o más, proporciona una fuente de grandes cantidades de células madre enriquecidas para las células madre CD34" y CD38". Las células preferidas que se pueden utilizar de conformidad con la presente invención, son células madre similares a las embrionarias que se originan de una placenta perfusionada desangrada, o células que se derivan de células madre de placenta similares a las embrionarias. Las células madre similares a las embrionarias de la invención se pueden caracterizar midiendo los cambios en la morfología y en los marcadores de superficie celular utilizando técnicas tales como citometría de flujo e inmunocitoquímica , y midiendo los cambios en la expresión genética utilizando técnicas, tales como PCR. En una modalidad de la invención, tales células madre similares a las embrionarias se pueden caracterizar por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD29, CD44, CD54 , CD90, SH2 , SH3 , SH4 , OCT-4 y ABC-p, ó la ausencia de los siguientes los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, CD38, CD45, SSEA3 y SSEA4. En una modalidad preferida, tales células madre similares a las embrionarias se pueden caracterizar por la presencia de marcadores de superficie celular OCT-4 y APC-p. Tales marcadores de superficie celular se determinan rutinariamente de conformidad con métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante citometría de flujo, seguido por el lavado y teñido con un anticuerpo de marcador de superficie anti-celular. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 ó CD38, se pueden lavar las células en PBS y luego se tiñen doblemente con ficoeritrina anti-CD34 e isotiocianato de fluoresceína anti-CD38 (Becton Dickinson, ountain View, CA) .
Las células madre similares a las embrionarias que se originan de la placenta tienen características de células madre embrionarias aunque no se deriven del embrión. En otras palabras, la invención abarca el uso de células OCT-4+ y ABC-p+ que son células madre no diferenciadas que se aislan de una placenta perfusionada post-parto. Tales células son tan versátiles (por ejemplo, pluripotentes) como las células madre embrionarias de humanos. Como se mencionó anteriormente, se puede aislar un cierto número de diferentes células madre pluripotentes o multipotentes de la placenta perfusiona en diferentes puntos de tiempo, por ejemplo, células hematopoyéticas CD34+ CD38+, CD34+ CD38-, y CD34-CD38-. De conformidad con los métodos de la invención, se utiliza la placenta humana posterior al nacimiento como la fuente de células madre similares a las embrionarias.
Por ejemplo, después de la expulsión del útero, la placenta se desangra tan rápido como sea posible para prevenir o minimizar la apoptosis. Subsecuentemente, tan pronto como sea posible después del desangramiento la placenta se perfusiona para remover la sangre, células residuales, proteínas, factores, y cualquier otro materia presente en el órgano. También se pueden Los desechos de materiales remover de la placenta. La perfusión normalmente se continúa con un perfusado apropiado durante al menos dos o más de las veinticuatro horas. En varias modalidades adicionales la placenta se perfusiona durante al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, y 22 horas. En otras palabras, esta invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de que las células de una placenta post-parto, se pueden activar mediante el desangramiento y perfusión durante una cantidad suficiente de tiempo. Por lo tanto, la placenta se puede utilizar rápidamente como una fuente rica y abundante de células madre similares a las embrionarias, cuyas células se pueden utilizar para la investigación, incluyendo el descubrimiento de fármacos, el tratamiento y la prevención de padecimientos, en particular cirugías o terapias de transplante, y la generación de células consignadas, tejidos y organoides. Ver la Solicitud co-pendiente No. de Serie 10/004,942, presentada el 5 de Diciembre del 2001 titulada "Method of Collecting Placental Stem Cells" y la Solicitud No. de Serie 10/076,180, presentada el 13 de Febrero del 2002, titulada "Post-Partum ammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom, " ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia en sus totalidades. Las células madre similares a las embrionarias se extraen de una placenta drenada por medio de una técnica de perfusión que utiliza ya sea una o ambas de las arterias umbilicales y la vena umbilical. La placenta preferiblemente se drena mediante el desangramiento y la recolección de sangre residual (por ejemplo, sangre del cordón umbilical residual) . La placenta drenada se procesa entonces de tal manera que para establecer un ambiente de bioreator natural, ex vivo, en el cual las células madre similares a las embrionarias residentes se reclutan dentro de la parénquima y el espacio extravascular . Las células madre similares a las embrionarias migran a la microcirculación vacía, drenada, en donde, de conformidad con los métodos de la invención, los mismos se recolectan, preferiblemente lavándolos en un recipiente recolector mediante perfusión. La modulación de las células progenitoras CD34+ y CD133+ en las células mieloides, particularmente las células dendríticas o granulocíticas , está contemplada específicamente como parte de la invención. Reportes recientes indican que tales células son pluripotentes , por consiguiente, la invención también contempla la modulación del desarrollo de estos progenitores en células del cerebro, riñon, tracto intestinal, hígado o músculos. Se puede utilizar cualquier célula madre o progenitora CD34* ó CD133+ de mamífero, ave o reptil, dentro de los métodos de la invención, que incluyen, pero no están limitados a, células madre aisladas de sangre de cordón umbilical (células CB) , sangre periférica, sangre de adulto, médula ósea,. placenta, incluyendo la placenta perfusionada (ver la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20030032179 presentada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom, " la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad), células madre mesenquimales y otras fuentes. En una modalidad preferida, las células madre son células madre hematopoyéticas o células que se han aislado de la médula ósea. Tales células se pueden obtener de otros órganos o tejidos, aunque tales fuentes son menos preferidas. En una modalidad, se pueden utilizar células progenitoras de sangre de cordón umbilical o de la placenta post-parto. Como se observa aquí, la sangre de cordón umbilical contiene predominantemente células progenitoras hematopoyé icas CD34+ y CD38+. Dentro de las primeras veinticuatro horas de la perfusión post-parto, se pueden aislar altas concentraciones de células progenitores hematopoyéticas CD34+CD38- de una placenta perfusionda, aislada. Después de aproximadamente veinticuatro horas de la perfusión post-parto, se pueden aislar altas concentraciones de células CD34-CD38- de la placenta junto con las células antes mencionadas. En otra modalidad, se pueden obtener poblaciones de células progenitoras a través de un servicio comercial, por ejemplo LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ) , ViaCord (Boston MA) , Cord Blood Registry (San Bruno, CA) y Cryocell (Clearwater, FL) . 5.3. LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN Los compuestos utilizados en la invención se mencionan aquí como "compuestos inmunomoduladores" , e incluyen compuestos inmunomoduladores que son racémicos, enriquecidos estereoméricamente o puros estereoméricamente y sales, solvatos, hidratos, estereoisómeros , clatratos aceptables farmacéuticamente, y profármacos de los mismos. Los compuestos preferidos utilizados en la invención son pequeñas moléculas orgánicas que tienen un peso molecular menor que alrededor de 1000 g/mol, y que no son proteínas, péptidos, oligonucleótidos , oligosacáridos ni otras macromoléculas . Cuando se utiliza aquí y a menos que se indique de otra manera, el término "estereoméricamente puro" significa una composición que comprende un estereoisómero de un compuesto y que está sustancialmente libre de otros estereoisórrteros de aquel compuesto. Por ejemplo, una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral que estará sustancialmente libre del enantiómero opuesto del compuesto. Una composición estereoméricamente pura de un compuesto Cuando se utiliza aquí y a menos que se indique de otra manera, el término "enantioméricamente puro" significa una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. Cuando se utiliza aquí y a menos que se indique de otra manera, el término "estereoméricamente enriquecido" significa una composición que comprende más de alrededor del 60% en peso de un estereoisómero de un compuesto, preferiblemente más de alrededor del 70% en peso, más preferiblemente más de alrededor del 80% en peso de un estereoisómero de un compuesto. Cuando se utiliza aquí, el término "enantioméricamente puro" significa una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. De manera similar, el término "enriquecido enantioméricamente puro" significa una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro qui al .
Cuando se utiliza aquí y a menos que se indique de otra manera, el término "compuestos inmunomoduladores" ó "IMiDs™" (Celgene Corporation) utilizado aquí abarca pequeñas moléculas orgánicas que inhiben marcadamente el TNF-a, el monocito ILi e IL12 inducido con LPS, y que parcialmente inhibe la producción de IL6. Los compuestos inmunomoduladores específicos de la invención, se describen posteriormente. Estos compuestos se pueden obtener comercialmente de, por ejemplo, Celgene, o se pueden preparar de conformidad con los métodos descritos en las patentes o publicaciones listadas aquí . El TNF-a es una citocina inflamatoria producida por los macrófagos y monocitos durante una inflamación aguda. El TNF-a es responsable de un diverso rango de eventos de señalización dentro de las células. El TNF-a puede jugar un papel patológico en el cáncer. Sin que se limite por una teoría en particular, uno de los efectos biológicos ejercidos por los compuestos inmunomoduladores de la invención, es la reducción de la síntesis del TNF-a. Los compuestos inmunomoduladores de la invención mejoran la degradación del ARNm del TNF-a. Además, sin que se limite por una teoría en particular, los compuestos inmunomoduladores utilizados en la invención también pueden ser potentes co-estimuladores de las células T y pueden incrementar dramáticamente la proliferación de células de una manera dependiente de la dosis. Los compuestos inmunomoduladores de la invención también pueden tener un efecto co-estimulador mayor en el subconjunto de células T CD8+ que en el subconjunto de las células T CD4+. Además, los compuestos preferiblemente tienen propiedades anti-inflamatorias , y eficientemente co-estimulan las células T. Los ejemplos específicos de los compuestos inmunomoduladores de la invención, incluyen, pero no están limitados a, derivados de ciano y carboxi de estírenos sustituidos tales como aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,929,117; 1 -oxo-2 - (2 , 6-dioxo-3 -fluoropiperidin-3-il) isoindolinas y 1 , 3 -dioxo-2 - (2 , 6-dioxo-3 -fluoropiperidin-3 - il ) isoindolinas tales como aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,874,448; las 2-(2, 6-dioxopiperdin-3-il) -1-oxoisoindolinas tetra-substituidas descritas en la Patente Norteamericana No. 5,798,368; 1-oxo y 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -isoindolinas (por ejemplo, los derivados de 4-metilo de talidomida y EM-12) , que incluyen pero no están limitados a, aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,635,517; y una clase de amidas cíclicas no polipeptídicas descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,698,579 y 5,877,200. La totalidad de cada una de las patentes identificadas aquí se incorpora en la presente como referencia. Los compuestos inmunomoduladores de la invención no incluyen talidomida. Otros compuestos inmunomoduladores específicos de la invención incluyen, pero no están limitados a, 1-oxo- y 1,3-dioxo-2- (2 , 6-dioxopiperidin-3-il ) isoindolinas sustituidas con amino o amino sustituido en el anillo benzo como se describe en la Patente Norteamericana No. 5, 635,517 la cual se incorpora aquí. Estos compuestos tienen la estructura I: en la cual uno de X y Y es C=0, el otro de X y Y es C=0 ó C¾, y R2 es hidrógeno o alquilo inferior, en particular metilo. Los compuestos inmunomoduladores específicos incluyen, pero no están limitados a: l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -4-aminoisoindolina; l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -5-aminoisoindolina; l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -6-aminoisoindolina; l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il ) -7-aminoisoindolina; 1 , 3-dioxo-2- ( 2 , 6-dioxopiperidin-3-il ) -4-aminoisoindolina; y 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina . Otros compuestos inmunomoduladores específicos de la invención pertenecen a una clase de 2- (2 , 6-dioxopiperidin-3-il ) ftalimidas sustituidas y 2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -1-oxoisoindoles sustituidos, tales como aquéllos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,281,230; 6,316,471; 6,335,349; y 6,476,052, y la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US97/13375 (Publicación Internacional No. O 98/03502), cada una de las cuales se incorpora aqui . Los compuestos representativos de esta clase son de las fórmulas : en donde R1 es hidrógeno o metilo. En una modalidad separada, la invención abarca el uso de formas enantioméricamente puras (por ejemplo enantiómeros (R) ó (S) ópticamente puros) de estos compuestos. Todavía otros compuestos inmunomoduladores específicos de la invención pertenecen a una clase de isoindol-imidas descritas en la solicitudes de patente norteamericana nos. 10/032,286 y 09/972,487, y la Solicitud Internacional No. PCT/US01/50401 (Publicación Internacional No. WO 02/059106), cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia. Los compuestos representativos son de la fórmula II: y sales, hidratos, solvatos, clatratos, enantiómeros, diastereómeros, racematos aceptables farmacéuticamente y mezclas de estereoisómeros de los mismos, en donde: uno de X y Y es C=0 y el otro es CH2 ó C=0; R1 es H, alquilo (Ci-C8) , cicloalquilo (C3-C7) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, alquilo (Co~ C4) -heterocicloalquilo (Ci-C6) , alquilo (C0-C4) -heteroarilo (C2- C5), C(0)R3, C(S)R3, C(0)OR4, alquilo (Ci-Cs) -N (R6) 2 , alquilo (Ci- C8)-OR5, alquilo (Ci-C8) -C (O) OR5, C(0)NHR3, C(S)NHR3, C(0)NR3R3', C(S)NR3R3' ó alquilo (Ci-C8) -0 (CO) R5; R2 es H, F, bencilo, alquilo (Ci-C8) , alquenilo (C2-C8) , ó alquinilo (C2-C8) ; R3 y R3' son independientemente alquilo (Ci-C8) , cicloalquilo (C3-C7) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, alquilo (C0-C4) -heterocicloalquilo (C!-C6) , alquilo (C0-C4) -heteroarilo (C2-C5) , alquilo (C0-C8) -N (R6) 2, alquilo (Ci-C8) -0R5, alquilo (Ci-C8) -C (O) OR5 , alquilo (d-C8) -0(CO)R5, ó C(0)OR5; R4 es alquilo (Ci-C8) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , alquilo (Ci-C ) -OR5, bencilo, arilo, alquilo (C0-C4) -heterocicloalquilo (Ci-C6) , ó alquilo (C0-C4) -heteroarilo (C2-C5) ; R5 es alquilo (Ci-C8) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, o heteroarilo (C2-C5) ; cada caso de R6 es independientemente H, alquilo (Ci-C8) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, heteroarilo (C2-C5) , ó alquilo (C0-C8) -C (O) O-R5 ó el grupo R6 se puede unir para formar un grupo heterocicloalquilo; n es 0 ó 1 ; y * representa un centro de carbón quiral . En compuestos específicos de la fórmula II, cuando n es 0 entonces R1 es cicloalquilo (C3-C7) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, alquilo (C0-C4) -heterocicloalquilo (d-C6) , alquilo (C0-C4) -heteroarilo (C2-C5) , C(0)R3, alquilo (CI-C8)-N(R6) 2, alquilo (Ci-C8 ) -0R5, alquilo (d-Cs) -C (0) OR5, C(S)NHR3, ó alquilo (Cx-Ce) -O (CO) R5; R2 es H ó alquilo (Cx-Cs) ; y R3 es alquilo (Ci-Cg) , cicloalquilo (C3-C7) , alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8) , bencilo, arilo, alquilo (Co-C4) -heterocicloalquilo (CI-CÉ) , alquilo (C0-C4) -heteroarilo (C2-C5) , alquil (C5-C8) -N (R6) 2; alquilo (C0-C8) -NH-C (O) 0-R5; alquilo (Ci-C8) -OR5, alquilo (Ci-C8) -C (O) OR5, alquilo (Ci-C8) -O (CO) R5, ó C(0)0R5; y las otras variables tienen las mismas definiciones. En otros compuestos específicos de la fórmula II, R2 es H ó alquilo (Ci-C ) . En otros compuestos específicos de la fórmula II, R1 es alquilo (Ci-C8) ó bencilo. En otros compuestos específicos de la fórmula II, R1 es H, alquilo (Ci-Cs) , bencilo, CH20CH3, CH2CH2OCH3, ó En otra modalidad de los compuestos de la fórmula II, R1 es en donde Q es O ó S, y cada que aparece R7 es independientemente H, alquilo ( x-CB) , bencilo, CH2OCH3, ó En otros compuestos específicos de la fórmula II, R1 es C(0)R3. En otros compuestos específicos de fórmula II, R3 es alquil (C0-C4) -heteroaril (C2-C5) , alquil (Ci-C8) , arilo, o alquilo (C0-C4) -0R5. En otros compuestos específicos de la fórmula II, heteroarilo es piridilo, furilo, o tienilo. En otros compuestos específicos de la fórmula II, R1 es C (O) OR4. En otros compuestos específicos de la fórmula II, el H de C(0) HC(0) se puede reemplazar con alquilo (C1-C4) , arilo, o bencilo. Todavía otros compuestos inmunomoduladores específicos de la invención pertenecen a una clase de isoindol-imidas descritas en la solicitud de patente norteamericana No. 09/781,179, Publicación Internacional No. O 98/54170, y la Patente Norteamericana No. 6,395,754, cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia. Los compuestos representativos son de la fórmula III: y sales, hidratos, solvatos, clatratos, enantiómeros, diastereómeros , racematos aceptables farmacéuticamente y mezclas de estereoisómeros de los mismos, en donde: uno de X y Y es C=0 y el otro es CH2 ó C=0; R es H ó CH2OCOR' ; (i) cada uno de R1, R2, R3, ó R4, independientemente de los otros, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono ó (ii) uno de R1, R2, R3, ó R4 es nitro ó -NHR5 y el resto de R1, R2, R3, ó R4 son hidrógeno; R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 carbonos R6 es hidrógeno, alquil de 1 a 8 átomos de carbono, benzo, cloro, o fluoro; R' es R-CHR10-N (R8R9) ; R7 es m-fenileno ó p-fenileno ó - (CnH2n) - en el cual n tiene un valor de 0 a 4; cada uno de R8 y R9 tomados independientemente del otro es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, R8 y R9 tomados conjuntamente son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, ó -CH2CH2 [X] XiCH2CH2- en el cual [X]Xi es -0-, -S-, ó -NH-; R10 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o fenilo; y * representa un centro de carbón quiral. Los compuestos inmunomoduladores más preferidos de la invención son 4- (amino) -2- (2, ß-dioxo (3-piperidil) ) -isoindolin-1,3-diona y 3- ( -amino-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il ) -piperidin-2 , 6-diona . Los compuestos se pueden obtener mediante métodos estándar, sintéticos (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,635,517, incorporada aquí como referencia) . Los compuestos están disponibles de Celgene Corporation, Warren, NJ. 4- (amino) -2- (2, 6-dioxo (3-piperidil) ) -isoindolina-1, 3-diona (ACTI ID™) tiene la siguiente estructura química : la 3- (4-amino-l-oxo-l, 3-dihidro-isoindol-2-il) -piperidin-2, 6-diona (REVIMID™) tiene la siguiente estructura química: 5.4. MÉTODOS DE CULTIVO DE CÉLULAS MADRE En ciertas modalidades de la invención, las células madre o progenitoras , incluyen aunque no están limitadas a células madre embrionarias, células madre similares a las embrionarias, células progenitoras, células pluripotentes , células totipotentes , células multipotentes , células endógenas a una placenta perfusionada post-parto, células de sangre del cordón umbilical, células madre o progenitoras derivadas de sangre periférica o sangre de adulto, o células de médula ósea, se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse. Estas células se pueden propagar in vi tro utilizando métodos bien conocidos en la técnica, o en forma alternativa, se pueden propagar en una placenta perfusionada post-parto . En ciertas modalidades, se pueden recolectar células endógenas a una placenta perfusionada post-parto de la placenta y el medio de cultivo y cultivar in vi tro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación con respecto al tipo o linaje de célula deseado. Ver la Publicación de Solicitud Norteamericana No. US 20030032179, publicada el 13 de Febrero del 2003, titulada "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom" la cual se incorpora aquí en su totalidad.
En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras que no se derivan de una placenta perfusionada post-parto sino que por el contrario, se aislan de otras fuentes tales como la sangre del cordón umbilical, médula ósea, sangre periférica o sangre de adulto, se exponen a los compuestos de la invención y se inducen para diferenciarse. En una modalidad preferida, la diferenciación se realiza in vi tro bajo condiciones apropiadas, y durante un tiempo suficiente, para inducir la diferenciación en el linaje deseado o tipo de célula. Los compuestos de la invención se utilizan en la diferenciación/medio de cultivo mediante adición, generación in situ, o de cualquier otra manera que permita el contacto de las células madre o progenitoras con los compuestos de la invención. En otra modalidad, las células madre cultivadas, por ejemplo, células madre cultivadas in vi tro o en una placenta perfusionada post-parto, se estimulan para proliferar en un cultivo, por ejemplo, mediante la administración de eritropoyetina, citocinas, linfoquinas, interferonas , factores para la estimulación de colonias (CSFs) , interferonas, quimiocinas, interleucinas , factores de crecimiento hematopoyéticos, humanos, recombinantes , que incluyen ligandos, factores de células madre, trombopoyetina (Tpo) , interleucinas , y el factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento. Después de la recolección y/o aislamiento de las células cultivadas, las mismas se pueden identificar y caracterizar mediante un ensayo de la unidad de formación de colonias, el cual es conocido comúnmente en la técnica, tal como medio Mesen Cult™ (células madre de Technologies, Inc., Vancouver British Columbia) . Los métodos para cultivar células madre o progenitoras in vitro son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ver, Thomson et al., 1998, Science 282:1145-47 (células madre embrionarias); Hirashima et al., 1999, Blood 93(4) : 1253-63, y Hatzopoulos et al., 1998, Development 125:1457-1468 (células progenitoras endoteliales) ; Slager et al., 1993, Dev. Gene . 14(3):212-24 (progenitores de neuronas o músculos); Genbachev et al., 1995, Reprod. Toxicol . 9(3):245-55 (citotrofoblastos , es decir, progenitores de las células epiteliales de la placenta); Nadkarni et al. 1984, Tumori 70:503-505, Melchner et al., 1985, Blood 66(6): 1469-1472, publicación PCT internacional WO 00/27999 publicada el 18 de Mayo de 2000, Himori et al., 1984, Intl. J. Cell Cloning 2:254-262, y Douay et al., 1995, Bone Marrow Transplantation 15:769-775 (células progenitoras hematopoyéticas) ; Shamblott et al., 1998, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 95:13726-31 (células germinales primordiales); Yan et al., 2001, Devel . Biol . 235:422-432 (células madre de trofoblastos) . Tales métodos se pueden adaptar fácilmente para su uso en los métodos de la invención, siempre y cuando el cultivo de las células progenitoras , incluya un paso o pasos para cultivar las células con un compuesto de la invención, en los momentos indicados, para producir la(s) población (s) deseada (s) de células diferenciadas . 5.4.1. Cultivo de Células Madre in vLt.ro Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación de células madre o progenitoras in vi tro, que comprende incubar las células con un compuesto, tal como una molécula orgánica pequeña de la presente invención, in vi tro, que induce las mismas para diferenciarse en células de un linaje particular de células deseadas, después del transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, las células se inducen para diferenciarse en un linaje de células hematopoyéticas . En ciertas modalidades, las células madre cultivadas de interés se exponen in vitro a una concentración de 0.1 zg/ml , 0.2 /¿g/ml, 0.3 µ?/p?, 0.4 g/ml, 0.5 /g/ml , 1 µg/ml, 5 /jg ó 10 /xg/ml de un compuesto de la invención. Preferiblemente, las células de interés se exponen a una concentración de Talidomida desde alrededor de 0.005 ^g/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml; una concentración de Actimid™ desde alrededor de 0.005 Mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, (Celgene Corp., Warren, NJ) , una concentración de Revimid™ (Celgene Corp., Warren, NJ) , de alrededor de 0.005 Mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, una concentración de Actimid™ (Celgene Corp., Warren, NJ) , de alrededor de 0.005 µg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml o una concentración de Revimid™ (Celgene Corp., Warren, NJ) , de alrededor de 0.005 g/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml (ver también la Sección 5.7, "Composiciones Farmacéuticas") . En ciertas modalidades, las células madre similares a las embrionarias se inducen para propagarse en el bioreactor de la placenta mediante la introducción de nutrientes, hormonas, vitaminas, factores de crecimiento, o cualquier combinación de los mismos, en la solución de perfusión. Se pueden agregar suero y otros factores de crecimiento a la solución o medio de perfusión de propagación. Los factores de crecimiento usualmente son proteínas e incluyen, pero no están limitados a: citocinas, linfoquinas, interferones , factores para la estimulación de colonias (CSFs) , interferones , quimiocinas, e interleucinas . Otros factores de crecimiento que se pueden utilizar incluyen factores de crecimiento hematopoyéticos, humanos, recombinantes, que incluyen ligandos, factores de células madre, trombopoyetina (Tpo) , factor de estimulación de las colonias de granulocitos (G-CSF) , factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento de fibroblastos básicos, placenta derivada del factor de crecimiento y del factor de crecimiento epidérmico. Los factores de crecimiento introducidos en la solución de perfusión pueden estimular la propagación de células madre similares a las embrionarias no diferenciadas, células progenitoras consignadas, o células diferenciadas (por ejemplo, células hematopoyéticas diferenciadas) . Los factores de crecimiento pueden estimular la producción de materiales biológicos y moléculas bioactivas que incluyen, aunque no están limitadas a, inmunoglobulinas, hormonas, enzimas, o factores de crecimiento como se describió previamente. La placenta cultivada se debe "alimentar" periódicamente para remover el medio consumido, para despoblar las células liberadas, y para agregar un medio fresco. La placenta cultivada se debe almacenar bajo condiciones estériles para reducir la posibilidad de contaminación, y mantener bajo presurización intermitente y periódica para crear condiciones que mantengan un suministro adecuado de nutrientes a las células de la placenta. Se debe reconocer que la perfusión y el cultivo de la placenta pueden ser tanto automatizados como computarizados para una eficiencia y capacidad incrementada. 5.4.2. Cultivo de Células Progenitoras in vitro Los métodos de la invención también abarcan la regulación y modulación del desarrollo de células progenitoras, particularmente células progenitoras CD34+ y CD133+. En una modalidad de la invención, se inducen células progenitoras para diferenciarse en un linaje de células hematopoyéticas . En una modalidad específica, el linaje es un linaje granulocítico. En una modalidad alternativa, se inducen células CD133+ para diferenciarse en células endoteliales , células del cerebro, células del riñon o células del tracto intestinal . Se pueden cultivar células progenitoras mediante métodos estándar, como se observa anteriormente. Adicionalmente , el cultivo de las células progenitoras puede comprender poner en contacto las células en diferentes momentos o períodos de tiempo durante el cultivo, para impulsar la diferenciación de células las progenitoras a lo largo de diferentes linajes de células . Por consiguiente, en un método para cultivar las células progenitoras CD34+ ó CD133+, las células se colocan en placas en el día 0 en un medio que contiene el factor de las células madre (SCF) , Flt-3L, GM-CSF y TNF-OÍ y se cultivan durante seis días. En el sexto día, las células se vuelven a colocar en placas en un medio que contiene GM-CSF y TNF-a, y el cultivo se continúa durante unos seis días adicionales. Este método da como resultado la generación de células dendríticas. En una variación de este método, las células inicialmente se colocan en placas en un medio que contiene GM-CSF e IL-4, luego se cambian en el sexto día a un medio acondicionado con monocitos (ver Steinman et al., Publicación Internacional No. O 97/29182) . Para producir una población de células progenitoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38~CD33~, las células progenitoras se ponen en contacto con un compuesto de la invención en el día 0, y se recolectan las células progenitoras CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38"CD33" en el día 6. Los inventores han descubierto que la gestión del momento oportuno de la adición del (los) compuesto (s) de la invención, particularmente Actimid™ ó Revimid™, tenga un efecto sustancial en la ruta de diferenciación de las células CD34+ en células de linajes particulares, y en la diferenciación de células CD133+. Las células progenitoras CD34+, se cultivan bajo condiciones estándar, detrás de una ruta o linaje de desarrollo mieloide, es decir, se vuelven células dendríticas dentro de los 12 días después de la colocación en placas inicial (es decir, después del cultivo inicial) . Sin embargo, la adición de un compuesto de la invención en uno de los diversos momentos particulares durante los primeros seis días del cultivo, substancialmente altera esta ruta. Por ejemplo, si las células CD34+, particularmente las CD34+ derivadas de la médula ósea, se exponen a un compuesto de la invención, particularmente Actimid™ ó Revimid™ en el primer día del cultivo, se podría suprimir la diferenciación a lo largo del linaje mieloide, como se pone en evidencia por el incremento en el número de células CD34+CD38+ y la disminución en el número de células CDla+CD14- en el día 6 del cultivo, en relación a un control no expuesto a un compuesto de la invención (es decir, expuesto a DMSO) . Además, la exposición a un compuesto de la invención podría conducir a la supresión del desarrollo de células que expresan los marcadores de superficie expresados por las células en un linaje de células dendríticas, tales como CD80 y CD86. El contacto en el día inicial del cultivo, o en cualquier momento hasta por tres días después del día inicial del cultivo, con un compuesto de la invención, podría conducir a tal modulación del desarrollo de células progenitoras CD34+. El incremento en el número de células CD34+ se intensificará si las dosis múltiples de un compuesto de la invención se dan entre el día 0 y el día 6, por ejemplo, las dosis en el día 0 y el día 2, el día 0 y el día 4, las dosis en el día 3 y el día 6, ó las dosis en el día 2, el día , y el día 6. En un aspecto particularmente útil de la invención, la adición de un compuesto de la invención en el primer día del cultivo de las células progenitoras CD34+, y la continuación de la exposición a través del día 12, conduce al desarrollo de una célula progenitora única que expresa una combinación única de marcadores de superficie celular: CD34+CD38"CD33* ó CD34+CD38~CD33~ . La población de células CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38"CD33~ representa una etapa intermediaria en la diferenciación. Esta población es útil como una población expandible de células progenitoras que se pueden transplantar fácilmente a un paciente en necesidad de una población de desarrollo rápido de células de linaje hematopoyético, por ejemplo, células granulociticas . En otra modalidad, se pueden colocar en placas las células CD34+ y se cultivan durante la fase de proliferación (aproximadamente 6 días) en un medio estándar (es decir, no expuesto a Actimid™, Revimid™ o similares) , luego se cambian al mismo o a un medio similar que contenga Actimid™ o similar, y se continua el cultivo hasta el día 12. En esta modalidad, las células de diferenciación típicamente muestran una expresión disminuida de CD80, CD86 y CD14 , aunque da como resultado una persistencia incrementada de una población de células CDla+ con relación a los controles. Tales células de diferenciación no se bloquean a partir de las células dendríticas procedentes. En otra modalidad, las células CD34+ se tratan durante la fase de proliferación (días 1-6 posteriores a la colocación en placas) durante al menos tres días consecutivos con un Actimid™, Revimid™, u otro compuesto de la invención. En aún otra modalidad, las células progenitoras CD34+ ó CD133+ se tratan dos o más veces con Actimid™, Revimid™, u otro compuesto de la invención, durante los primeros seis días después de la colocación en placas. Tales tratamientos múltiples darán como resultado un incremento en la proliferación tanto de las poblaciones CD34+ como CD133+. Los tratamientos múltiples con Actimid™, u otro compuesto de la invención, provocarán un cambio en la diferenciación de las células progenitoras CD34+ alejadas de un linaje CDllc+CD15~ y hacia un linaje CDllc" CD15+, es decir, lejos de un linaje mieloide de células dendríticas y hacia un linaje granulocítico (FIG. 6B) . El tratamiento de las células progenitoras del día 0 del cultivo, particularmente las dosis múltiples entre el día 0 y el día 6, también da como resultado un incremento en el número de células progenitoras CD133+, particularmente un incremento en la población progenitora CD34+CD133+. El CD133+ es un marcador hematopoyético que es una alternativa al aislamiento CD34, como las células CD133+ se puede expandir de la misma manera que el subconjunto CD34+ y conservar su capacidad de linajes múltiples (ver see Kobari et al., J. Hematother. Stem Cell Res. 10 (2) .-273-81 (2001)). Se han reportado que el CD133+ está presente en las células CD34" del tejido de cerebro de un 9 feto humano, y muestran un potente injerto, proliferación, migración, y diferenciación neural cuando se inyectan en ratones neonatales (ver Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 19 : 97 (26) : 14720-5 (2000)). Se ha mostrado que las células madre hematopoyéticas CD133+ enriquecerán su actividad progenitora con una capacidad clonogénica aumentada y un injerto superior en los ratones NOD-SCID. No obstante lo anterior, si un compuesto de la invención se pone en contacto con las células progenitoras CD34+ proliferantes después de tres días de cultivo (es decir, en cualquier momento entre los 3-6 días después del cultivo inicial) , las células progenitoras proliferantes, que ya han comenzado a expresar el marcador de superficie celular CDla, muestran una persistencia substancialmente incrementada de la expresión de este marcador en relación con los controles tratados con DMSO. Es importante notar que la citotoxicidad no está asociada con la persistencia incrementada. En otras palabras, el tratamiento con Actimid™ no provoca la apoptosis de otras poblaciones de células. El efecto final es un mantenimiento de la capacidad inmune existente y el desarrollo de una nueva capacidad inmune. Por consiguiente, en una modalidad del método de la invención, se modula (es decir, se suprime) la diferenciación de las células CD34+ en células dendríticas poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención en el día 0 del cultivo (es decir, el primer día del cultivo) . En otra modalidad, se mejora la diferenciación de las células CD34+ en células granulocíticas poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención en el día 0 del cultivo (es decir, el primer día del cultivo. En otra modalidad, se mejora la diferenciación de las células CD34+ en una población de células progenitoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38~CD33" poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención durante los primeros tres días del cultivo. En otra modalidad, se mejora o incrementa una población CD34+CD133+ poniendo en contacto las células progenitoras con un compuesto de la invención en dosis múltiples desde el 0 hasta el día 6 del cultivo. En otra modalidad, se mejora o incrementa la persistencia de una población de células CDla* poniendo en contacto las células progenitoras CD34+ con un compuesto de la invención en el día 6 del cultivo, en donde dichas células CD34+ se diferencian en células que exhiben el marcador superficial CDla, y en donde dicho cultivo incluye no ponerlas en contacto con dicho compuesto hasta por seis días. En las modalidades anteriores, se entenderá que tales variaciones en la administración de Actimid™, Revimid™, o compuestos relacionados, se pueden elaborar para las células progenitoras in vivo, por ejemplo, tal como en un paciente en quien se han transplantado o injertado tales células, así como a las células progenitoras in vitro. Los métodos de la invención abarcan la regulación de la diferenciación in vi tro de células madre o células progenitoras, que comprende incubar las células con un compuesto, tal como una pequeña molécula orgánica de la presente invención, in vitro, que induce las mismas para diferenciarse en células de un linaje particular de células deseadas, seguido por un transplante directo de las células diferenciadas a un sujeto. En una modalidad preferida, las células se inducen para diferenciarse en un linaje hematopoyético de células. En una modalidad alternativa, se inducen las células CD133+ para diferenciarse en células endoteliales , células del cerebro, células del riñon, células de hígado, o células del tracto intestinal. Se debe notar que los métodos descritos aquí se contemplan para su uso con células progenitoras CD34+ ó CD133+ derivadas de mamíferos, preferiblemente humanos, pero también contempla su uso con células progenitoras de ave o de reptil. Sin embargo, los compuestos de la invención son potencialmente poderosos en forma variable dependiendo de la especie a partir de la cual se derivan las células progenitoras. Por lo tanto también se contempla tal variación en los métodos de cultivo, particularmente con respecto a la concentración del (los) compuesto (s) administrado (s) . Por ejemplo, las células progenitores de origen murino son menos sensibles a los compuestos de la invención, por ejemplo Actimid™, y podrían requerir concentraciones superiores para lograr los efectos obtenibles en 1 µ? con células progenitoras de origen humano. Las personas expertas en la técnica podrán entender que tales optimizaciones son rutinarias. 5.5. INGENIERÍA GENÉTICA DE LAS CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS En otra modalidad de la invención, las células madre o progenitoras que se diferencian de conformidad con los métodos de la invención se diseñan genéticamente ya sea antes a, o después de la exposición a los compuestos de la invención, utilizando, por ejemplo, un vector viral tal como un vector adenoviral o retroviral, o utilizando medios mecánicos tales como la absorción mediada con liposomas o sustancias químicas del ADN. En modalidades específicas, se diseñan genéticamente las células progenitoras CD34+, luego se tratan con un compuesto de la invención, en modalidades más especificas, dicho compuesto es Actimid™, Revimid™, o un análogo de cualquiera de los mismos. En otra modalidad, dichas células se tratan con un compuesto de la invención, luego se diseñan genéticamente .
Se puede introducir un vector que contiene un transgen en una célula de interés mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, transformación, transducción, electroporación, infección, microinyección, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación con fosfato de calcio, liposomas, LIPOFECTIN™, fusión con lisosomas, lípidos catiónicos sintéticos, el uso de una pistola genética o un transportador de vector de ADN, de tal manera que el transgen se transmita a las células hijas, por ejemplo, las células hijas de las células madre similares a las embrionarias o células progenitoras producidas mediante la división de una célula madre similar a la embrionaria. Para las diversas técnicas de transformación o transfección de células de mamífero, ver Keown et al., 1990, Methods Enzymol . 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Preferiblemente, se introduce el transgen utilizando cualquier técnica, en tanto que el mismo no sea destructivo para la membrana nuclear de la célula u otros constructos genéticas o celulares existentes. En ciertas modalidades, se inserta el transgen en el material genético nucleico mediante microinyección. La microinyección de células y estructuras celulares es comúnmente conocida y practicada en la técnica.
Para una transfección estable de células cultivadas de mamífero, tales como el cultivo de células en una placenta, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. La eficiencia de la integración depende del vector y de la técnica de transfección utilizada. Con el fin de identificar y seleccionar integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a los antibióticos) en la célula madre similar a las embrionaria junto con la secuencia genética de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Se pueden identificar las células transíectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante la selección de fármacos (por ejemplo, las células que tengan incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán) . Tales métodos son particularmente útiles en los métodos que involucran la recombinación homologa en las células de mamíferos (por ejemplo, en células madre similares a las embrionarias) antes de la introducción o transplante de las células recombinantes en un sujeto o paciente. Se puede utilizar un cierto número de sistemas de selección para seleccionar células madre hospederas, transformadas, tales como células similares a las embrionarias, o células progenitoras , tales como células progenitoras CD34+ ó CD133+. En particular, el vector puede contener ciertos marcadores detectables o seleccionables . Otros métodos de selección incluyen pero no están limitados a seleccionar otro marcador tal como: los genes de timidina cinasa del virus herpes simple (Wigler et al, 1977, Cell 11: 223) , hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc . Nati. Acad. Sci.: USA 48: 2026), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) que se pueden emplear en las células tk, hgprt ó aprt, respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia a los antimetabolitos como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, el cual confieren resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 3567; 01 Haré et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, el cual confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, el cual confiere resistencia a la aminoglicosida G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol . 150: 1); e hygro, el cual confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). El transgen se puede integrar en el genoma de la célula de interés, preferiblemente mediante integración aleatoria. En otras modalidades el transgen se puede integrar mediante un método dirigido, por ejemplo, mediante recombinación homologa dirigida (es decir, el "inclusión" o "expulsión" de un gen de interés en el genoma de la célula de interés), Chappel , Patente Norteamericana No. 5,272,071; y publicación PCT No. WO 91/06667, publicada el 16 de Mayo de 1991; Patente Norteamericana 5,464,764; Capecchi et al., expedida el 7 de Noviembre de 1995; Patente Norteamericana 5,627,059, Capecchi et al. expedida el 6 de Mayo de 1997; Patente Norteamericana 5,487,992, Capecchi et al., expedida el 30 de Enero de 1996) .
Son conocidos en la técnica métodos para generar células que tengan modificaciones genéticas objetivo a través de una recombinación homologa. El constructo comprenderá al menos una porción de un gen de interés con una modificación genética deseada, e incluirá regiones de homología con el lugar objetivo, es decir, la copia endógena del gen objetivo en el genoma del huésped. Los constructos de ADN para la integración aleatoria, en contraste con aquéllas utilizadas para la recombinación homologa, no necesitan incluir regiones de homología para mediar la recombinación. Se pueden utilizar marcadores en el constructo objetivo o constructo aleatorio para realizar una selección positiva y negativa para la inserción del transgen.
Para crear una célula recombinante homologa, por ejemplo, una células madre similar a una embrionaria, recombinante, homologa, célula endógena de placenta o célula exógena cultivada en la placenta, se prepara un vector homólogo de recombinación en el cual se flanquea un gen de interés en sus extremos 5' y 3' mediante secuencias genéticas que son endógenas al genoma de la célula objetivo, para permitir que ocurra una recombinación homologa entre el gen de interés portado por el vector y el gen endógeno en el genoma de la célula objetivo. Las secuencias adicionales de ácido nucleico flanqueante son de longitud suficiente para la recombinación homologa exitosa con el gen endógeno en el genoma de la célula objetivo. Típicamente, se incluyen varias kilobases del ADN flanqueante (tanto en los extremos 5' como 3') en el vector. Los métodos para construir vectores de recombinación homologa y animales recombinantes homólogos de células madre recombinantes son comúnmente conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51: 503; Bradley, 1991, Curr. Opin. Bio/Technol . 2: 823-29; y la Publicación PCT Nos. WO 90/11354, WO 91/01140, y WO 93/04169. En una modalidad específica, los métodos de Bonadio et al. (Patente Norteamericana No. 5,942,496, titulada Methods and compositions for múltiple gene transfer into bone cells, expedida el 24 Agosto de 1999; y la PCT W095/22611, titulada Methods and compositions for stimulating bone cells, publicada el 24 de Agosto de 1995) se utilizan para introducir ácidos nucleicos en una célula de interés, tal como una célula madre, célula progenitora o célula exógena cultivada en la placenta, por ejemplo, células progenitoras de huesos. 5.6. USOS DE CÉLULAS MADRE Y CÉLULAS PROGENITORAS ACONDICIONADAS PARA DIFERENCIACIÓN 5.6.1. Usos Generales Las células madre y el progenitor CD34+ y CD133+ de la invención se pueden inducir para diferenciar su uso en protocolos de transplante y tratamiento ex vivo. En una modalidad, las poblaciones de células madre se diferencian para un tipo particular de célula y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. En otra modalidad, las poblaciones de células progenitoras se expanden hacia las células progenitoras tempranas y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. En otra modalidad, las poblaciones de células progenitoras se diferencian para un tipo particular de célula, y se diseñan genéticamente para proporcionar un producto genético terapéutico. Los compuestos de la invención también tienen utilidad en situaciones clínicas en las cuales el transplante tiene el principal objetivo de restaurar la producción de las células de glóbulos blancos de la médula ósea, tal como la revocación de la neutropenia y leucopenia, lo cual resulta de un padecimiento y/o mieloablación clínica. Los compuestos también tienen utilidad en la restauración de la producción de células progenitoras tempranas o granulocitos , lo cual resulta de un padecimiento, diversos efectos secundarios terapéuticos conocidos, o mieloablación. Los compuestos de la invención también tienen utilidad en los casos en los cuales se prefiere la supresión de la generación de las células de glóbulos rojos, sin la supresión de la médula ósea. En ciertas modalidades, se administran células madre que se han tratado con los compuestos de la invención junto con células madre no tratadas, tales como células madre de la sangre del cordón umbilical o sangre periférica, a un paciente en necesidad del mismo. En otras modalidades, se administran células CD34+ ó CD133+ que se han tratado con los compuestos de la invención junto con células no tratadas de la sangre del cordón umbilical o sangre periférica, a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad, se administran células progenitoras CD34+, tratadas desde el primer día del cultivo con un compuesto de la invención, con células no tratadas a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad más específica, la célula progenitora transferida es una célula progenitora CD34+CD38+CD33+ ó CD34+CD38"CD33" .
Las células madre, por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias o hematopoyéticas , o células progenitoras, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden formular como un inyectable (ver PCT WO 96/39101, incorporada aquí como referencia en su totalidad) . En una modalidad alternativa, las células y tejidos, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden formular utilizando hidrogeles polimerizables o reticulados como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,709,854; 5,516,532; ó 5,654,381, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad. Se pueden utilizar células madre similares a las embrionarias en lugar de clases específicas de células progenitoras (por ejemplo, condorcitos, hepatocitos, células hematopoyéticas, células parenquimales del páncreas, neuroblastos , células progenitoras de músculos, etc.) en protocolos terapéuticos y de investigación en los cuales se podrían utilizar típicamente células progenitoras. 5.6.2. Reemplazo o Alimento de Tej idos Las células madre, particularmente las células madre similares a las embrionarias, y las células progenitoras, de la invención, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar para una amplia variedad de protocolos terapéuticos dirigidos al transplante o infusión de una población deseada de células, tal como una población de células madres o células progenitoras. Las células madre o progenitoras se pueden utilizar para reemplazar o aumentar tejidos existentes, para introducir tejidos nuevos o alterados, o para unir conjuntamente tejidos o estructuras biológicas. En una modalidad preferida de la invención, las células madre, tales como las células madre similares a las embrionarias de la placenta, o las células progenitoras tales como las células progenitoras hematopoyéticas, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar como transplantes hematopoyéticos autólogos y alogénicos, incluyendo el tipo HLA acoplado y desacoplado. De conformidad con el uso de células madre similares a las embrionarias como transplantes hematopoyéticos alogénicos, puede ser preferible tratar el hospedero para reducir el rechazo inmunológico de las células donadoras, tales como aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,800,539, expedida el 1 de Septiembre de 1998; y la Patente Norteamericana No. 5,806,529 expedida el 15 de Septiembre de 1998, ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia.
Por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar en protocolos terapéuticos de transplante, por ejemplo, para aumentar o reemplazar las células madre o progenitoras del hígado, páncreas, riñon, pulmón, sistema nervioso, sistema muscular, huesos, médula ósea, timo, bazo, tejido mucoso, gónadas, o cabello. Asimismo, las células progenitoras hematopoyéticas, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar en lugar de las células progenitoras endoteliales y de la médula ósea. Las células madre, por ejemplo, las células madre similares a las embrionarias, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar para el aumento, reparación o reemplazo del cartílago, tendones o ligamentos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se recubren las prótesis (por ejemplo, prótesis de la cadera) con las estructuras de tejido de cartílago de reemplazo, desarrolladas a partir de células madre similares a las embrionarias de la invención. En otras modalidades, se reconstruyen articulaciones (por ejemplo, rodilla) con estructuras de tejido de cartílago desarrolladas a partir de las células madre similares a las embrionarias. Las estructuras de tejido de cartílago también se pueden emplear en cirugía mayor reconstructiva para diferentes tipos de articulaciones (para protocolos, ver por ejemplo, Resnick, D. , y Niwayama, G. , eels., 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d ed. , W. B. Saunders Co.) . Las células madre y las células progenitoras tratadas de conformidad con los métodos de la invención, se pueden utilizar para reparar el daño de tejidos y órganos resultantes de un padecimiento. En tal modalidad, se pueden administrar células madre similares a las embrionarias a un paciente para regenerar o restaurar tejidos u órganos los cuales hayan sido dañados como consecuencia de un padecimiento, por ejemplo, para mejorar el sistema inmune después de una quimioterapia o radiación, para reparar el tejido cardiaco después de un infarto del miocardio. Las células madre y/o progenitoras tratadas de conformidad con los métodos, y con los compuestos inmunomoduladores, de la invención, o administradas en conjunción con los compuestos inmunomoduladores de la invención, se pueden transplantar en un individuo en necesidad de las mismas para reparar y/o reemplazar el tejido hepático, pancreático o cardiaco. Las células madre y las células progenitoras tratadas de conformidad con los métodos de la invención, también se pueden utilizar para aumentar o reemplazar las células de la médula ósea en el transplante de médula ósea. Actualmente se utiliza el transplante autólogo y alogénico de la médula ósea humana como una terapia padecimientos tales como la leucemia, linfoma, y otros padecimientos con peligro de muerte. La desventaja de estos procedimientos, sin embargo, es que una gran cantidad de la médula ósea del donador se debe remover para asegurar que existan suficientes células para el injerto.
Las células madre similares a las embrionarias recolectadas de conformidad con los métodos de la invención, pueden proporcionar células madre y células progenitoras que podrían reducir la necesidad de una gran donación de médula ósea. También podrían, de conformidad con los métodos de la invención, obtener una pequeña donación de médula y luego expandir el número de células madre y células progenitoras cultivarlas y expandirlas en la placenta antes de la infusión o transplante en un receptor. Las grandes cifras de células madre similares a las embrionarias y/o progenitoras obtenidas utilizando los métodos de la invención podrían, en ciertas modalidades, reducir la necesidad de grandes donaciones de médula ósea. Aproximadamente 1 x 108 hasta 2 x 108 células mononucleares de médula ósea por kilogramo del peso del paciente, se deben infundir para el injerto en un transplante de médula ósea (es decir, alrededor de 70 mi de médula para un donador de 70 kg) .
Para obtener 70 mi se requiere una donación intensiva y una pérdida significativa de sangre en el proceso de la donación. En una modalidad específica, las células de una pequeña donación de médula ósea (por ejemplo, 7-10 mi) se podrían expandir mediante propagación, por ejemplo en un termentador de placenta, antes de su infusión en un receptor. Las células madre, y las células progenitoras , particularmente las células progenitoras CD34+ ó CD133+, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, pueden proporcionar así células madre y/o progenitoras que podrían reducir o eliminar la necesidad de una gran donación de médula ósea. Las células madre similares a las embrionarias aisladas de la placenta se pueden utilizar, en modalidades específicas, en la terapia de reemplazo de enzimas antologas o heterólogas para tratar padecimientos o condiciones específicas, que incluyen, aunque no están limitados, a padecimientos por almacenamiento de lisosomas, tales como los síndromes de Tay-Sachs, Niemarm-Pick, Fabry, Gaucher, Hunter, Hurler, así como otros gangliosidosos , mucopolsacaridosos , y glicogenosos . En otras modalidades, las células se pueden utilizar como portadores de transgenes autólogos y heterólogos en la terapia genética para corregir errores congénitos de metabolismo tales como adrenoleucodistrofia, fibrosis quística, padecimiento del almacenamiento de glicógenos, hipotiroidismo, anemia por células falciformes, síndrome de Pearson, padecimiento de Pompe, fenilcetonuria (PKU) , y padecimiento de Tay-Sachs, porfirias, alergia urinaria por jarabe de arce, homocistinuria, mucopolisacaridenosis, padecimiento crónico granulomatoso, y tirosinemia, o para tratar el cáncer, tumores u otras condiciones patológicas. En otras modalidades, las células se pueden utilizar en terapias o protocolos autólogo o heterólogo de regeneración o reemplazo de tejidos, que incluyen, pero que no están limitados al tratamiento de defectos epiteliales de la córnea, reparación del cartílago, dermoabrasión facial, membranas mucosas, membranas timpánicas, recubrimientos intestinales, estructuras neurológicas (por ejemplo, retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo) , reparación de quemaduras y heridas por lesiones traumáticas de la piel, transplante de cuero (de cabello) , o para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos . Además, un pequeño número de células madre y células progenitoras normalmente circula en la corriente sanguínea. En otra modalidad, se recolectan tales células madre exógenas o células progenitoras exógenas mediante aféresis, un procedimiento en el cual se extrae sangre, se remueven selectivamente uno o más componentes, y el resto de la sangre se re-infunde en el donador. Las células exógenas recuperadas mediante aféresis se expanden mediante los métodos de la invención, eliminando así por completo la necesidad de una donación de médula ósea. En otra modalidad, se utiliza la expansión de células progenitoras hematopoyéticas de conformidad con los métodos de la invención como un tratamiento suplementario además de la quimioterapia. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos utilizados para tener como objetivo y destruir las células cancerígenas actúan exterminando todas las células proliferantes, es decir, las células que atraviesan la división celular. Puesto que la médula ósea es uno de los tejidos más activamente proliferantes, las células madre hematopoyéticas frecuentemente se dañan o destruyen por los agentes quimioterapéuticos y en consecuencia, disminuye o cesa la producción de células sanguíneas. La quimioterapia se debe terminar a intervalos para permitir al sistema hematopoyético del paciente reponer el suministro de células sanguíneas antes de reanudar la quimioterapia. Puede llevar un mes o más el que las células madre anteriormente letárgicas proliferen e incrementen el conteo de células de glóbulos blancos a niveles aceptables a fin de que la quimioterapia se pueda reanudar (cuando de nuevo, se destruyan las células madre de la médula ósea) . Aunque las células sanguíneas se regeneran entre los tratamientos de quimioterapia, no obstante, el cáncer tiene tiempo de crecer y posiblemente volverse más resistente a los fármacos de la quimioterapia debido a la selección natural. En consecuencia, una mayor quimioterapia y una menor duración entre los tratamientos, da mayores probabilidades de aniquilar exitosamente el cáncer. Para reducir el tiempo entre los tratamientos de quimioterapia, se podrían introducir en el paciente células madre similares a las embrionarias o las células progenitoras diferenciadas de conformidad con los métodos de la invención. Tal tratamiento podría reducir el tiempo en el que el paciente podría exhibir un conteo bajo de células sanguíneas, y podría por lo tanto permitir la reanudación temprana del tratamiento con quimioterapia. En otra modalidad, se pueden utilizar las células madre de la placenta humana para tratar o prevenir padecimientos genéticos tales como un padecimiento granulomatoso. 5.6.3. Mejora de la Inflamación Las células madre y progenitoras, la diferenciación de las cuales se ha modulado de conformidad con los métodos de la invención, se puede utilizar como agentes anti- inflamatorios en general . Los inventores han descubierto que las células madre o progenitoras, por ejemplo, la sangre del cordón umbilical, cuando se transplantan en un paciente, reducen o eliminan sustancialmente la respuesta inflamatoria. Por consiguiente, en una modalidad, los métodos de la invención comprenden administrar a un paciente que tenga una respuesta inflamatoria, o que sea susceptible a desarrollar una respuesta inflamatoria, células madre o células progenitoras cuya diferenciación de las cuales se ha modulado mediante uno o más de los compuestos de la invención. En modalidades específicas, las células madre son células madre similares a las embrionarias, y las células progenitoras son células madre hematopoyéticas , particularmente células progenitoras CD34+ ó CD133+. Los inventores también han descubierto que el tratamiento de un individuo con los compuestos de las invenciones, es decir, los IMiDs, estimula el desarrollo y la diferenciación de las células que modulan, mejoran o reducen la respuesta inflamatoria. Por consiguiente, otra modalidad de la invención comprende un método para tratar un individuo que tenga una respuesta inflamatoria, o que sea susceptible a desarrollar una respuesta inflamatoria, que comprende administrar una dosis efectiva o uno o más de los compuestos de la invención, a dicho individuo. En otra modalidad, el método comprende poner en contacto las células madre o progenitores con los compuestos de la invención antes de su administración a dicho individuo, luego administrar una dosis efectiva terapéuticamente de dichas células a dicho individuo. Aún en otra modalidad, se puede co-administrar la célula tratada de ese modo con uno o más de los compuestos de la invención a dicho individuo en dosis efectivas terapéuticamente . En otras modalidades, se puede reducir la inflamación mediante la administración de otros compuestos en combinación con los compuestos y/o células de la invención. Por ejemplo, tales compuestos adicionales pueden comprender esteroides, tales como prednisona, o cualquiera de los agentes no esferoidales anti-inflamatorios , tales como los inhibidores cox-l/cox-2 del ácido acetilsalicílico (aspirina) , ibuprofeno, acetaminofen, inhibidores cox-1 específicos, o derivados de cualquiera de estos compuestos. Tales agentes antiinflamatorios adicionales se pueden suministrar por cualquier ruta estándar, tal como intravenosamente, tópicamente, intradérmicamente, o mediante inhalación, y se pueden suministrar contemporáneamente con los compuestos y/o células de la invención, o en diferentes ocasiones. Los métodos anteriores se pueden utilizar para tratar cualquier padecimiento o condición asociado con, causado por, o como resultado de una inflamación. Por ejemplo, los métodos se pueden utilizar para tratar la inflamación causada por un trauma tal como una lesión accidental . Los métodos también se pueden utilizar para tratar la inflamación causada por o la lesión que está asociada con procedimiento quirúrgicos, en particular procedimientos quirúrgicos relacionados con los vasos tales como injertos de tejido natural, injertos vasculares sintéticos, válvulas coronarias o angioplastias . Los métodos también se pueden utilizar para prevenir la estenosis o restenosis. Los métodos anteriores también se pueden utilizar para tratar la inflamación resultante de cualquier padecimiento o condición, que incluye aunque no está limitado a padecimientos o condiciones tales como padecimientos cardiacos, aterosclerosis , alergia o hipersensibilidad, padecimiento inmune, padecimiento autoinmune tal como la artritis, o inflamaciones debidas a infecciones. Además de tratar una condición inflamatoria que ya exista, las células y/o compuestos de la invención se pueden administrarse a un individuo profilácticamente, para reducir el caso de inflamación. Esto es particularmente útil como una forma de terapia pre-operatoria, por medio de la cual la reducción de la respuesta inflamatoria post-operatoria mejora las oportunidades de un resultado exitoso y reduce el tiempo de estancia en el hospital y los periodos de incapacidad de un individuo.
Se puede lograr un tnonitoreo de la efectividad del efecto anti-inflamatorio de los tratamientos anteriores mediante cualquier método conocido, tal como inspección visual, exploraciones MRI ó CAT, determinación de la temperatura sistémica o local, etc. Debido a que una proteína conocida como proteína reactiva C es un marcador para la inflamación, la efectividad de los métodos de tratamiento anteriores, se puede monitorear evaluando una reducción en la cantidad de proteína reactiva C en un individuo, particularmente en el área que anteriormente experimentaba inflamación. 5.6.4. Producción de Poblaciones de Células Dendríticas y Células Granulocíticas Los compuestos de la invención se pueden administrar específicamente para modular la diferenciación de las células madre y/o progenitoras a lo largo de una ruta de desarrollo de granulocitos contra una ruta de desarrollo de células dendríticas. De manera similar, la célula de la invención se puede modular in vivo o ex vivo para producir poblaciones expandidas de células dendríticas o granulocitos. Se pueden utilizar células dendríticas como reactivos para las terapias con base en la inmunidad. Por ejemplo, se pueden co-cultivar las células dendríticas con linfocitos T y antígenos de proteína in vitro, impulsando así la activación ex vivo con antígenos específicos de las células T. Las células T activadas se administran entonces autologamente para efectuar una respuesta inmune a antígenos específicos in vivo (WO 97/24438) . En otro ejemplo, se pueden activar las células T in vi tro poniendo en contacto los linfocitos T con las células dendríticas que expresan directamente una proteína antigénica de un constructo recombinante . Las células T activadas se pueden utilizar para una infusión autóloga (WO 97/29183) . Las células T activadas con péptidos o fragmentos de proteínas específicos se vuelven agentes inmunizantes contra las proteínas, células u organismos a partir de los cuales se derivan los péptidos o fragmentos. Por ejemplo, se pueden cargar células dendríticas con péptidos de tumores específicos. La aplicación específica de la activación ex vivo de las células T impulsadas con DC al tratamiento del cáncer de próstata, se describe y reivindica en la Patente Norteamericana No. 5,788,963. Mayordomo et al. demostró que las células dendríticas derivadas de la médula ósea pulsadas con péptidos de tumores sintéticos suscitan una inmunidad anti-tumorígena protectora y terapéutica (iVature Medicine 1:1297-1302 (1995); J. Exp. Med. , 183:1357-1365 (1996)). La Patente Norteamericana No. 5,698,679 describe proteínas de fusión de la inmunoglobulina que suministran péptidos antigénicos a las células que presentan los antígenos objetivo (APCs) , incluyendo las células dendríticas, in vivo. Esta misma metodología se puede utilizar con péptidos o antígenos derivados de virus, bacterias, o parásitos para crear vacunas virales, bacteriales, o parasíticas. Las células dendríticas también son objetivos para la intervención terapéutica en el tratamiento de diversos padecimientos mediados con inmunidad. Por ejemplo, las células dendríticas que se han involucrado como un jugador importante en la patogénesis y patofisiología del SIDA (por ejemplo, sirven como depósitos para el virus VIH) . Ver Zoeteweij et al., J. Bio ed. Sci . 5(4):253-259 (1998); Grouard et al., Curr. Opin. Iwmunol . 9(4):563-567 (1997); Weissman et al., Clin. Microbiol. Rev. 10 (2) : 358-367 (1997). Los métodos in vitro para la selección de candidatos farmacéuticos que invaliden la infección VIH de DC, se describen en la Patente Norteamericana No. 5,627,025. En otro ejemplo, se pueden manipular las células dendríticas para inducir la impasibilidad de las células T con respecto al tejido u órgano donador en un receptor (ver la Patente Norteamericana No. 6, 375, 950) . Se pueden utilizar granulocitos en las transfusiones de granulocitos en el tratamiento o prevención de infecciones, por ejemplo, sepsis neonatal bacteriana, infecciones asociadas con la neutropenia en pacientes con cáncer, e infecciones potenciales en pacientes que reciben transplantes de médula ósea. También se pueden utilizar granulocitos en la prevención o tratamiento de alergias. Por ejemplo, los granulocitos involucrados en la inflamación mediada con IgE (es decir, granulocitos recubiertos con anticuerpos IgE algunos de los cuales tienen especificidad con el alérgeno) , se pueden inactivar y utilizar para aliviar los síntomas de una respuesta inmune ya establecida contra el alérgeno (ver la Patente Norteamericana No. 6,383,489). Por consiguiente, en una modalidad de la invención, se expande una población de granulocitos en un individuo de las células progenitoras de la invención mediante un método que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, en donde dicha cantidad es suficiente para inducir la producción de una pluralidad de granulocitos de las células CD34+ endógenas a dicho individuo. En otra modalidad, se expande una población de granulocitos dentro de un individuo mediante un método que comprende administrar a dicho individuo una población de células progenitoras CD34+ ó CD133+, en donde dichas células se han puesto en contacto con un compuesto de la invención durante al menos tres días, y administrar dicha población de células a dicho individuo. En otra modalidad, se expande la población de granulocitos dentro de un individuo mediante un método que comprende administrar a dicho individuo una población de células progenitoras CD34+ ó CD133+ y un compuesto de la invención, en donde la dosis de dicho compuesto de la invención es suficiente para provocar la diferenciación de una pluralidad de dicha población de células en granulocitos. En una modalidad especifica de las modalidades anteriores, dichas células progenitoras CD34+ son células CD34+CD38"CD33+. 5.6.5. Tratamiento de Otros Padecimientos y Condiciones La diferenciación de las células madre o progenitoras de la invención, o los compuestos' de la invención, también se pueden utilizar, solos o en combinación, para tratar o prevenir una variedad de otros padecimientos o condiciones. En ciertas modalidades, por ejemplo, el padecimiento o desorden incluyen, pero no están limitados a un padecimiento vascular o cardiovascular, aterosclerosis, diabetes, anemia aplástica, mielodisplasia, infarto del miocardio, trastorno convulsivo, esclerosis múltiple, apoplejía, hipotensión, paro cardiaco, isquemia, inflamación, pérdida de la función cognoscitiva relacionada con la edad, daño por radiación, parálisis cerebral, padecimiento neurodegenera ivo, padecimiento de Alzheimer, padecimiento de Parkinson, padecimiento de Leigh, demencia asociada con el SIDA, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , padecimiento renal isquémico, trauma del cerebro o espinal dorsal, derivación de corazón-pulmón, glaucoma, isquemia de la retina, trauma de la retina, padecimientos de almacenamiento de lisosomas, tales como los síndromes de Tay-Sachs, Niemann-Pick, Fabry, Gaucher, Hunter y Hurler, así como otros gangliosidosos , mucopolsacaridosos , y glícogenosos , errores congénitos del metabolismo, adrenoleucodistrofia, fibrosis cística, padecimiento del almacenamiento de glicógenos, hipotiroidismo, anemia por células falciformes, síndrome de Pearson, padecimiento de Pompe, fenilcetonuria (PKU) , porfirias, alergia urinaria por jarabe de arce, homocis inuria, mucopolisacaridosis , padecimiento crónico granulomatoso , y tirosinemia, padecimiento de Tay-Sachs, cáncer, tumores u otras condiciones patológicas o neoplásticas. En otras modalidades, las células de la invención (por ejemplo, las cuales se han expuesto a los compuestos de la invención) se pueden utilizar en el tratamiento de cualquier tipo de lesión debida a un trauma, particularmente un trauma que involucre inflamación. Los ejemplos de tales condiciones con un trauma incluyen daños al sistema nervioso central (CNS) , que incluyen lesiones al cerebro, espina dorsal, o el tejido que rodea las lesiones del CNS al sistema nervioso periférico (PNS) ; o lesiones a cualquier parte del cuerpo. Tal trauma puede ser provocado por un accidente, o puede ser una consecuencia normal o anormal de un procedimiento médico tal como la cirugía o angioplastia . El trauma puede estar relacionado con una ruptura u oclusión de un vaso sanguíneo, por ejemplo, en la apoplejía o flebitis. En modalidades especificas, las células se pueden utilizar en terapias o protocolos autólogos o heterólogos de regeneración o reemplazo de tejidos, que incluyen, aunque no están limitados al tratamiento de defectos en el epitelio de la córnea, reparación de cartílago, dermoabrasión facial, membranas mucosas, membranas timpánicas, recubrimientos intestinales, constructos neurológicos (por ejemplo, retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo) , reparación de quemaduras y heridas por lesiones traumáticas de la piel, o para la reconstrucción de otros órganos o tejidos dañados o enfermos. En una modalidad específica, el padecimiento o desorden en anemia aplástica, mielodisplasia, leucemia, un padecimiento de la médula ósea o un padecimiento o desorden hematopoyético. En otra modalidad específica, el sujeto es un humano. 5.7. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden una dosificación y/o dosificaciones de uno o más de los compuestos de la invención, en donde dicha dosificación o dosificaciones son efectivas en una administración individual o múltiple, antes a o después del transplante de células madre o progenitoras CD34+ ó CD133+ acondicionadas o no acondicionadas de humano, a un individuo, ejerciendo un efecto suficiente para inhibir, modular y/o regular la diferenciación de las células madre y/o progenitoras en tipos específicos de células, por ejemplo, células de linaje nematopoyético, particularmente células de linaje mieloide. En este contexto, como en alguna otra parte del contexto de esta invención, "individuo" significa cualquier individuo al cual se administran los compuestos o células, por ejemplo, un mamífero, ave o reptil. Por consiguiente, en una modalidad específica, dicha dosificación o dosificaciones de los compuestos de la invención, se administran a un individuo, para modular la diferenciación de las células progenitoras CD34+ endógenas en células dendríticas. En una modalidad más especifica, la dosificación o dosificaciones incrementan el número de células granulocíticas en dicho individual al que se han administrado dichas dosificación o dosificaciones. En otra modalidad más específica, las dosificación o dosificaciones incrementan el número de células progenitoras CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38"CD33" en un mamífero al cual se ha administrado dicha dosificación o dosificaciones .
En otras modalidades, se transplantan células madre o progenitoras CD34+ ó CD133+ de interés en un sujeto humano o paciente en necesidad de las mismas. Subsecuente al transplante, se administra un compuesto de la invención al sujeto humano o paciente, para modular la diferenciación de las células transplantadas de interés in vivo. En una modalidad específica, tales células se diferencian in vivo en granulocitos . En aún otras modalidades, la diferenciación de las células madre o progenitoras de interés en un sujeto humano o paciente se modula in situ mediante la administración de un compuesto de la invención. En aún otra modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las poblaciones aisladas de células madre o progenitoras de la sangre de cordón umbilical que se han aumentado con las células progenitoras hematopoyéticas que se han diferenciado por su exposición a compuestos que inhiben la actividad TNF-a, de conformidad con los métodos de la invención. En otra modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la sangre del cordón umbilical que se suplementa con células madre o progenitoras puestas en contacto con los compuestos de la invención, en una modalidad específica, dichas células madre o progenitoras se han diferenciado mediante dichos compuestos.
En aún otra modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tanto uno como más de los compuestos inmunomoduladores de la invención, y las células madre y/o progenitoras de la invención. Tales composiciones se pueden preparar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 días por adelantado de la administración para modular la diferenciación de las células madre y/o progenitoras a lo largo de diferentes rutas de desarrollo/diferenciación . En aún otra modalidad, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender las células madre, o progenitoras en si mismas, en donde dichas células se han diferenciado de conformidad con los métodos descritos aquí. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células madre y/o células progenitoras en donde dicha pluralidad de células madre y/o progenitoras se han puesto en contacto con uno o más de los compuestos inmunomoduladores de la invención en una concentración y durante una duración suficiente para dicho (s) compuestos (s) para modular la diferenciación de dichas células. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden los compuestos de la invención, administrados a un individuo; las células de la invención, administradas a un individuo, en combinación con los compuestos de la invención, administrados por separado; y las células de la invención, se ponen en contacto con los compuestos de la invención, administrados a dicho individuo. La invención proporciona métodos de tratamiento y prevención de un padecimiento o desorden mediante la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto o una composición de la invención a un mamífero, preferiblemente un sujeto humano, con el fin de efectuar la modulación de la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras CD34+ ó CD133+ o células madre transplantadas a,, o que residen dentro del sujeto. En una modalidad, la invención proporciona un método para modular la diferenciación de células madre o progenitoras CD34+ y CD133+ para incrementar dentro de un mamífero el número de células granulocíticas . En otra modalidad, cualquier linaje de células que se puede derivar de una células madre o progenitora CD34+ y/o CD133+ se, puede modular mediante la administración de los compuestos de la invención a un mamífero, preferiblemente a un humano. El término "mamífero" como se utiliza aquí, abarca cualquier mamífero. Preferiblemente un mamífero que tenga la necesidad de tal tratamiento o prevención. Los ejemplos de mamíferos incluyen, aunque no están limitados a, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, monos, etc., más preferiblemente, un humano . La administración de los compuestos de la invención puede ser sistémica o local. En la mayoría de los casos, la administración a un mamífero dará como resultado la liberación sistémica de los compuestos de la invención (es decir, en la corriente sanguínea) . Los métodos de administración incluyen rutas entérales tales como oral, bucal, sublingual, y rectal; administración tópica, tal como transdérmica e intradérmica ; y administración parenteral . Las rutas parenterales adecuadas incluyen la inyección mediante una aguja hipodérmica o catéter, por ejemplo, inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal , intraarterial , intraventricular, intratecal, intraocular e intracameral y rutas no inyectables, tales como administración intravaginalw, rectal, o nasal. Preferiblemente, los compuestos y composiciones de la invención se administran oralmente. En modalidades específicas, puede ser deseable administrar uno o más compuestos de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con una venda para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, dicho implante es de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, que incluye membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras . Los compuestos de la invención se pueden administrar a través de sistemas de administración típicos así como no estándares, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas , microcápsulas , cápsulas, etc. Por ejemplo, los compuestos y composiciones de la invención se pueden suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., en Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cáncer, López-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver por lo general el ibídem.) . En otro ejemplo, los compuestos y composiciones de la invención se pueden suministrar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref Bio ed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507 Saudek et al., 1989, N. Engl . J. Med. 3:574). En otro ejemplo, se pueden utilizar materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Press., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J".
Macromo1. Sci. Rev. Macromol . Chem. 2_3:61; ver también Levy et al., 1985, Science 228 : 190 ; During et al., 1989, Ann. Neurol . 23:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). En todavía otro ejemplo, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad al área objetivo a ser tratada, por ejemplo, el hígado, requiriendo así solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol . 2, pp. 115-138 (1984) ) . Se pueden utilizar otros sistemas de liberación controlada descritos en la revisión de Langer, 1990, Science 249 : 1527-1533) . Cuando se administran como una composición, se formulará un compuesto de la invención con una cantidad adecuada de un vehículo o portador aceptable farmacéuticamente para proporcionar la forma para una administración apropiada al mamífero. El término "aceptable farmacéuticamente" significa aprobado por una agencia de regulación federal o de un gobierno estatal, o listado en la Farmacopea Norteamericana u otra farmacopea reconocida generalmente, para su uso en mamíferos, y más particularmente en humanos. El término "vehículo", se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o portador con el cual un compuesto de la invención se formula para su administración a un mamífero. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, que incluyen aquéllos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los vehículos farmacéuticos pueden ser de solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea, y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizadores, espesantes, lubricantes y colorantes. Preferiblemente, cuando se administran a un mamífero, los compuestos y composiciones de la invención y los vehículos, excipientes o diluyentes aceptables farmacéuticamente, son estériles. Un medio acuoso es un vehículo preferido cuando se administra intravenosamente el compuesto de la invención, tal como agua, soluciones salinas, y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol. Los presentes compuestos y composiciones pueden tener la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, comprimidos, grageas., polvos, granulos, jarabes, elixires, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, o cualquier otra forma adecuada para su administración a un mamífero. En una modalidad preferida, los compuestos y composiciones de la invención se formulan para su administración de conformidad con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración oral o intravenosa a humanos. En una modalidad, el vehículo aceptable farmacéuticamente es una cápsula de gelatina dura. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados y métodos para la formulación de los mismos, se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed. , Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed., 1995, Capítulos 86, 87, 88, 91, y 92, incorporada aquí como referencia. Los compuestos y composiciones de la invención formulados para suministro oral, preferiblemente están la forma de cápsulas, tabletas, pildoras, o cualquier forma farmacéutica comprimida. Además, cuando están en la forma de tableta o pildora, los compuestos y composiciones de la invención se pueden recubrir para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal proporcionando de este modo una acción sostenida durante un periodo de tiempo prolongado. Las membranas permeables selectivamente que circundan un compuesto conductor activo osmóticamente, también son adecuados para administrar oralmente compuestos y composiciones de la invención. En estas últimas plataformas, el fluido del ambiente que rodea la cápsula se impregna por el compuesto conductor que se hincha para desplazar el agente o composición de agentes a través de una abertura. Estas plataformas de suministro pueden proporcionar un perfil de suministro esencialmente en el orden de cero a diferencia de los perfiles neutralizados de las formulaciones de liberación intermediada. También se puede utilizar un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir vehículos, excipientes, y diluyentes estándar, tales como estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, jarabe, y metilcelulosa, las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio, aceite mineral, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservadores tales como metil- y propilhidroxibenzoatos . Tales vehículos preferiblemente son de calidad farmacéutica. Los compuestos y composiciones administrados oralmente de la invención pueden incluir opcionalmente uno o más agentes edulcorantes, tales como fructosa, aspartamo o sacarina, uno o más agentes saborizantes tales como hierbabuena, aceite de gaulteria, o cereza; o uno o más agentes colorantes para proporcionar una preparación apetecible farmacéuticamente. Un régimen de dosificación efectiva terapéuticamente para el tratamiento de un desorden o condición particular dependerá de su naturaleza y severidad, y se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar de conformidad con la opinión de un practicante médico. Además, se pueden utilizar ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar dosificaciones óptimas. Por supuesto, la cantidad de un compuesto de la invención que constituye una dosis efectiva terapéuticamente también depende de la ruta de administración. En general, los rangos adecuados de dosificación para administración oral son de alrededor de 0.001 miligramos a alrededor de 20 miligramos de un compuesto de la invención por kilogramo del peso corporal por día, preferiblemente, alrededor de 0.7 miligramos hasta alrededor de 6 miligramos, más preferiblemente, desde alrededor de 1.5 miligramos hasta alrededor de 4.5 miligramos. En una modalidad preferida, un mamífero, preferiblemente, un humano se administra oralmente con alrededor de 0.01 mg hasta alrededor de 1000 mg de un compuesto de la invención por día, más preferiblemente, alrededor de 0.1 mg hasta alrededor de 300 mg por día, o alrededor de 1 mg hasta alrededor de 250 mg en dosis individuales o divididas. Las cantidades de dosificación descritas aquí se refieren a cantidades totales administradas ,-es decir, si se administra más de un compuesto de la invención, las dosificaciones preferidas corresponderán a la cantidad total de los compuestos de la invención administrados. Las composiciones orales preferiblemente contienen de 10% a 95% en peso de un compuesto de la invención. Las formas preferidas de dosificación oral unitaria incluyen pildoras, tabletas, y cápsulas, más preferiblemente cápsulas. Típicamente tales formas de dosificación unitaria contendrán alrededor de 0.01 mg, 0.1 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, ó 500 mg de un compuesto de la invención, preferiblemente, desde alrededor de 5 mg hasta alrededor de 200 mg del compuesto por dosificación unitaria. En otra modalidad, los compuestos y composiciones de la invención se pueden administrar parenteralmente (por ejemplo, mediante rutas intramusculares, intratecales , intravenosas, e intraarteriales) , preferiblemente, intravenosamente. Típicamente, los compuestos y composiciones de la invención para una administración intravenosa, son soluciones en vehículos acuosos, isotónicos, estériles, tales como agua, solución salina, solución de Ringer, o solución de dextrosa. Cuando sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente de solubilización . Las composiciones para administración intravenosa opcionalmente pueden incluir un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Para la administración intravenosa, los compuestos y composiciones de la invención se pueden suministrar como un polvo liofilizado, seco, estéril, o un concentrado libre de agua en un contenedor sellado herméticamente, tal como una ampolleta o sachette (saquito o ámpula) , el contenedor indica la cantidad de un agente activo. Tal polvo o concentrado se diluye entonces con un medio acuoso apropiado antes de la administración intravenosa. Se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril, solución salina, otro medio acuoso apropiado con el polvo o concentrado para su dilución antes de la administración. O se pueden suministrar las composiciones en forma pre-mezclada, lista para su administración.- Cuando un compuesto y composición de la invención se va a administrar mediante infusión intravenosa, se puede distribuir, por ejemplo, con un frasco de infusión que contenga agua de calidad farmacéu ica, solución salina, u otro medio adecuado. Se puede efectuar la administración rectal a través del uso de supositorios formulados a partir de portadores convencionales tales como manteca de cacao, aceites vegetales modificados, y otras bases. Los supositorios se pueden formular mediante métodos bien conocidos utilizando formulaciones bien conocidas, por ejemplo, ver Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed. , ack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed., 1995, pp. 1591-1597, incorporada aquí como referencia. Para formular y administrar formas de dosificación tópicas, se pueden utilizar medios bien conocidos de suministro transdérmico e intradérmico tales como lociones, cremas, y ungüentos y dispositivos de suministro transdérmicos tales como parches (Ghosh, T.K.; Pfister, W.R.; Yum, S.I. Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, Interpharm Press, Inc. p. 249-297, incorporada aquí como referencia). Por ejemplo, un diseño de parche de tipo depósito puede comprender una película de respaldo revestida con un adhesivo, y un compartimiento de depósito que comprende un compuesto o composiciones de la invención, que se separa de la piel mediante una membrana semipermeable (por ejemplo. Patente Norteamericana No. 4,615,699, incorporada aquí como referencia) . La capa de respaldo revestida con adhesivo se extiende alrededor de los bordes del depósito para proporcionar un sello concéntrico con la piel y para mantener el depósito adyacente a la piel. La invención también proporciona paquetes o equipos farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores rellenos con uno o más compuestos de la invención. Opcionalmente puede estar asociada con tal (es) contenedor (s) , una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuya notificación refleje la aprobación de la agencia de fabricación, para su uso o venta para administración humana. En una modalidad, el equipo contiene más de un compuesto de la invención. En otra modalidad, el equipo comprende un compuesto de la invención y otro agente activo biológicamente. Los compuestos de la invención preferiblemente se evalúan in vi tro e in vivo, para la actividad terapéutica o prolifáctica deseada, antes de su uso en humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos in vi tro para determinar si se prefiere la administración de un compuesto específico de la invención o una combinación de compuestos de la invención. Los compuestos y composiciones de la invención también puede demostrar ser efectiva y seguridad utilizando sistemas con modelos animales . Otros métodos serán conocidos para el experto y están dentro del alcance de la invención. 5.8. ENSAYOS UTILIZANDO LOS MÉTODOS DE LA INVENCIÓN La metodología descrita anteriormente, es decir, el examen del efecto de los IMiDs tales como Actimid™ sobre la diferenciación en las células progenitoras tempranas, tales como células CD34+, se puede aplicar a cualquier compuesto de interés, el efecto del cual se desea en la diferenciación que es conocida. Esto se puede lograr de diversas maneras. En una modalidad, el compuesto simplemente se puede sustituir por Actimid™ o cualquiera de los otros compuestos de la invención. Aquí, las células progenitoras CD34+ y/o células progenitoras CD133+ se pueden poner en contacto con el compuesto de interés, en diversas concentraciones, bajo condiciones que permitan la proliferación y/o diferenciación de las células progenitoras en células consignadas y/o totalmente diferenciadas. Se pueden utilizar los métodos de cultivo descritos aquí, particularmente los métodos de cultivo descritos en la Sección 5.4. El efecto, si existe, del compuesto de interés se determina evaluando el cambio, si existe, en las poblaciones de células que se diferencian de las células progenitoras, donde el cambio se puede monitorear mediante cualquier cambio fenotípico, pero preferiblemente se evalúa determinando los marcadores de superficie celular que están presentes o ausentes. Al igual que los métodos de la invención, el compuesto de interés se puede administrar en una dosis individual en cualquier momento a partir del cultivo inicial para el logro de la(s) célula (s) finalmente diferenciada (s) . Alternativamente, el compuesto de interés se puede administrar en dosis múltiples durante la etapa de proliferación, la etapa de diferenciación, o ambas. El cambio en las características fenotípicas de las células progenitoras de proliferación/diferenciación, preferiblemente se compara con un cultivo de control de células, tales como las células tratadas con DMSO. Podría ser de interés particular cualquier efecto en la proliferación o diferenciación tal como, pero no limitado a: la modulación de la relación de proliferación; la modulación de la relación de diferenciación; la modulación de la diferenciación de las células progenitoras en células precursoras consignadas específicas; el bloqueo de la diferenciación en tipos particulares de células; y la mejora en la diferenciación en tipos particulares de células. En otra modalidad, el cultivo, la proliferación y la diferenciación tienen lugar como se mencionó anteriormente, aunque el compuesto de interés se pone en contacto con la(s) célula (s) progenitora (s) junto con Actimid™. De esta manera, se pueden determinar los efectos, posiblemente sinérgicos, de los múltiples compuestos. Podría ser de particular interés cualquier compuesto que no tenga, o que tenga un ligero efecto solamente en la proliferación o diferenciación, pero que tengan un efecto significativo en combinación con Actimid™. En otra modalidad, cualquiera de los dos compuestos se puede poner en contacto con las células progenitoras bajo condiciones de cultivo, como se mencionó anteriormente, que normalmente permiten la proliferación y diferenciación de las células progenitoras. Aquí, preferiblemente un experimento en el cual las células precursoras se ponen en contacto con dos compuestos de interés, contiene un control en el cual las células progenitoras se ponen en contacto solamente con uno de cada uno de dichos compuestos; un control en el cual las células se ponen en contacto con Actimid™, y un control en el cual las células no se ponen en contacto con un compuesto, o se ponen en contacto con DMSO. De nuevo, las variaciones en las dosificaciones, y el momento oportuno de dosificación, son como se describen anteriormente en la Sección 5.4. 6. EJEMPLOS DE TRABAJO 6.1. EJEMPLO 1: Efectos de la Talidomida, Actimid™ y Revimid™ en la Diferenciación de las Células Progenitoras CD34+ En el siguiente ejemplo, se estudiaron los efectos de la Talidomida (Thal) , Actimid™ ("Actimid™") y Revimid™ en la diferenciación de las células CD34+ (progenitores hematopoyétieos) y la generación de unidades formadoras de colonias (CFU) . De manera significativa, los resultados demuestran que el Actimid™ y Revimid™ se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar la generación de colonias formadoras tanto de leucocitos como de plaquetas (CFU-GM) y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias (CFU-Total) . Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de formación de colonias, que proporciona beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción de plaquetas. Las células progenitoras hetnatopoyéticas CD34+ de sangre de cordón umbilical, se colocan en placas en platos de cultivo 96 pozos a una densidad de 1000 células por pozo en IMDM suplementado con suero de ternera fetal al 20% y citocinas (IL-3, G-CSF y conjuntos de ligandos (R&D Systems, Inc.) . Las células se exponen a Talidomida (Thal) , Actimid™ y Revimid™, o D SO (un compuesto de control) , y se dejan cultivar durante 6 días. Las células CD34+ de sangre de cordón umbilical se colocan en placas en platos de cultivo de 96 pozos a una densidad de 1000 células por pozo en IMDM suplementado con suero de ternera fetal al 20% y citocinas (IL-3, G-CSF y equipo-ligandos (KL) (R&D Systems, Inc.)). Después del cultivo, las células se tiñen y se clasifican con un clasificador de células activado con fluorescencia (FACS) . Se cosechan 400 /xL de células teñidas y se diluyen a 1.0 mi con suero de ternera fetal al 1% en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se cuantifican las células para determinar el efecto de la modulación de la diferenciación de las células madre. Los conteos de células obtenidas se muestran en la FIG. 1. Estos resultados demuestran que los compuestos de la invención son efectivos en la modulación de la consignación del linaje de células madre progenitoras hematopoyéticas . Por consiguiente, se puede utilizar el Actimid™ y el Revimid™ para suprimir específicamente la generación de células rojas de la sangra o glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto de la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) , y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias específicas, proporcionando beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos y/o la producción plaquetas mediante la consignación de las células madre originales hacia los linajes injertables deseados. La inhibición de la eritropoyesis y expansión de las poblaciones de progenitores C34+CD38- por el Actimid™ y el Revimid™, se representan además en la FIG. 2. 6.2. EJEMPLO 2: Efectos de la Talidomida, Actimid™ y Revimid™ en la Proliferación y Diferenciación de las Células CD34+ de Sangre del Cordón Umbilical En el siguiente ejemplo, se estudian los efectos de la Talidomida, Actimid™ y Revimid™ en la proliferación y di erenciación de las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical (CB) en las células mononucleares CD34+ (progenitor hematopoyético) . Las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical, son una población mezclada de células que incluyen una pequeña población de células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) . Un subconjunto de esta pequeña población de células CD34+ incluye una población (aproximadamen e 1% del total de las células mononucleares CB) de células CD34+CD38+ y una población aún más pequeña (menos del 1% del total de las células mononucleares CB) de las células CD34+CD38-. En forma significativa, los resultados demuestran que el Actimid™ demuestran una sobre-regulación (diferenciación incrementada) de células CD34+, y que el Actimid™ y Revimid™ aparentemente pueden inhibir o retardar de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas o células progenitoras comparadas con controles positivos y negativos (FIGS. 3-7) . 6.2.1. Materiales y Métodos Las células CB CD34+ se inician a 4xl04 células/ml en una placa de 24 pozos en FCS IMDM al 20% (suero de ternera fetal/Medio Dulbecco Modificado de Iscove) suplementado con citocinas (IL-3, G-CSF y equipo-ligando) (R&D Systems, Inc.). Se incluyeron la Talidomida (Thal) , Actimid™ o Revimid™ en el cultivo en tres diferentes concentraciones: 5 µg/ml, 1 µg/ml y 0.3 µg/ml . Los mismos volúmenes de DMSO se utilizan como controles. También se utiliza un control negativo sin, ningún compuesto (indicado por "ninguno" en las FIGS. 3-7) . Las células se cultivan a 37 °C y C02 al 5% en un incubador humidificado durante 7 días. Luego las células se cosechan desde cada pozo. Se determina el número total de células de cada pozo cuantificándolas en un CELL-DY ® 1700 (Abbott Diagnostics) y se analiza la expresión de CXCR4 , CD45, CD34, CD38, CD 1 Ib y la expresión de Gly-A mediante teñido por FACS (clasificación de células activadas con fluorescencia) . (FIGS. 3-7) . Se cultivan, evalúan y analizan por separado células CB de dos diferentes donadores (CB2276 y CB2417) (Tabla 1) . 6.2.2. Resultados y Descripción Se prueban los efectos de la Talidomida, el Actimid™ ó el Revimid™ en la expansión estimulada con citocinas de las células CD34+. Como se muestra en la FIG. 4, la Talidomida, Actimid™ y Revimid™ no tienen un efecto significativo en la proliferación de las células CD34+ que se cultivan en la presencia de IL-3, equipo-ligando (KL) y G-CSF, cuando se comparan con el control negativo ("ninguno") . Sin embargo, parece que la Talidomida, el Actimid™ y el Revimid™ inducen un rendimiento de un número ligeramente superior de células, cuando se comparan con el control de DMSO. Considerando que el DMSO generalmente tiene un efecto negativo en la proliferación de células en estos experimentos, estos resultados sugieren que los compuestos de Talidomida, Actimid™ ó Revimid™ pueden tener un efecto estimulador en la proliferación de las células CD34+ que se cultivan en la presencia de IL-3, KL y G-CSF, puesto que se utiliza la misma cantidad de DMSO como un portador. En este sentido, el Actimid™ y el Revimid™ tienen un efecto mayor al de la Talidomida. Los efectos de la Talidomida, Actimid™ ó Revimid™ en la expresión de la diferenciación de células se analizan mediante el análisis FACS de las proteínas superficiales CXCR4 y CD34 (FIGS. 3 y 4) . El Actimid™ y Revimid™, pero no la Talidomida, muestran un efecto inhibidor en la expresión del CXC4R. El Actimid™ tiene un efecto más potente que el Revimid™. Con respecto a la proteína de superficie CD34+, el Actimid™ provoca una sobre-regulación (proliferación incrementada) de células CD34+ en los cultivos tanto CB2276 como CB2417. La Talidomida y el Revimid™, sin embargo, exhiben un efecto similar en un donador pero no en el otro donador. De manera interesante, en las células tratadas tanto con Actimid™ como con Revimid™, la mayoría de las células CD34+ y CD34~ serán CD38", mientras que las células en las poblaciones de control, tratadas con DMSO, y tratadas con Talidomida, principalmente son CD38+. Esto indica que el Actimid™ y el evimid™ se pueden utilizar para suprimir específicamente la generación de células de glóbulos rojos o colonias eritropoyéticas (BFU-E y CFU-E) , al mismo tiempo que para aumentar tanto la generación de leucocitos como las colonias formadoras de plaquetas (CFU-GM) , y para mejorar la producción total de la unidad formadora de colonias. Por lo tanto los métodos de la invención se pueden utilizar para regular la diferenciación de las células madre, y también se pueden utilizar para estimular la relación de la formación de colonias específicas, proporcionando beneficios significativos al transplante de células madre hematopoyéticas mejorando la rapidez del injerto de médula ósea y la recuperación de leucocitos; y/o la producción plaquetas. Ver la Tabla 4 a continuación. Se analizan los efectos de la Talidomida, el Actimid™ y el Revimid™ en la expresión de la diferenciación de células mediante un análisis FACS de las proteínas de superficie de las células que fueron CD34+CD38- contra CD34+CD38+ ó que fueron CDllb+. Los resultados se establecen en la Tabla 1.
Tabla 1: Ejemplos de los Efectos en la Diferenciación de Células y Expresión del Marcador de Superficie Celular CD34, CD38 y CDllb en las Células Progenitoras Hematopoyéticas Derivadas de Sangre de Cordón Umbilical Población de Células CD34+CD38-/CD34+CD38+ CB2276 Ninguno . DMSO Thal Actimid™ Revimid™ 5 9/p?1 1.2/6.3 2.7/3. .7 3.5/6.5 17.3/0.2 1 µ?/ml 1.5/8.5 2.6/5. .3 1.0/3.8 15.0/0.2 10.3/1 0.3 g/ml ND 1.5/5. .7 3.2/15. 1 5.9/0.2 9.8/1.7 CB2417 Ninguno . DMSO Thal Actimid™ Revimid™ 5 9/p?1 0.5/5.7 0.8/5. .2 1.1/3.0 1 . /0.1 4.2/0.3 1 /¿g/ml 0.5/4.9 0.7/3. .9 1.0/3.8 12.0/0.8 3.8/0.6 0.3 g ml ND 0.5/4. .4 0.8/5.0 5.9/0.2 3.4/0.9 Población de Células CDllb+ CB2276 Ninguno . DMSO Thal Actimid™ Revimid™ 5 ^g/ml 11.7% 5.0% 8.1% 1.6% 4.8% 1 µ?/ml 9.1% 7.3% 6.2% 3.8% 8.6% 0.3 g/ml ND 7.0% 7.6% 6.9% 13.3% CB2417 Ninguno . DMSO Thal Actimid™ Revimid' 5 /¿g/ml 12.0% 7.2% 6.5% 2.5% 5.5% 1 /xg/ml 7.2% 5.3% 5.2% 3.9% 8.2% 0 .3 gml ND 5.1% 7.8% 8.4% 11.2% el caso de Revimid™, se observó una población más grande de células CD llb+ en concentraciones inferiores. Sin embargo, se disminuye el nivel de la expresión del CD1 Ib en las células tratadas tanto con Actimid™ como con Revimid™, como se determina mediante una inmunofluorescencia media (MIF) , que indica que se reprimió la expresión del CD 11b. Esto sugiere que las células CDllb+ están en un estado menos diferenciado cuando se cultivan en la presencia del Actimid™ y Revimid™. 6.3. EJEMPLO 3: Efectos del Actimid™ y Revimid™ en las Células MNC de Sangre de Cordón Umbilical de Humano En los ejemplos previos, Actimid™ y Revimid™ demostraron que sub-regulan significativamente la expresión del CXCR4 en las células CD34+ de sangre del cordón umbilical y que incrementan la población de células CD34+CD38". En este ejemplo, Actimid™ y Revimid™ mostraron que tienen actividades similares en las células mononucleadas (MNC) de la sangre de cordón umbilical. 6 . 3 . 1 . Materiales y Métodos Las MNCs de sangre de cordón umbilical que se han criopreservado y descongelado utilizando métodos estándar, se aislaron mediante un método estándar de separación de Ficoll y se cultivaron en una placa de 24 pozos a 0.5xl06 células/ml en FCS-I DM al 20% con citocinas (10 ng/ml de cada uno de IL6, KL y G-CSF) por triplicado. Los grupos experimentales fueron Ninguno (citocinas solamente), DMSO (1.7 µ?) , Actimid™ (5.0 en 1.7 µ? de DMSO), Revimid™ (5.0 µ< en 1.7 µ? de DMSO). Las células cultivadas se cosecharon y analizaron mediante el teñido FACS después de 1 semana de cultivo. Los resultados se resumen en la Tabla 2 y en las FIGS . 8-12. Los datos e expresan como un promedio +/- SD de tres pozos independientes Tabla 2 Ninguno DMSO Actimid™ Revimid™ Total de células (lxl O6) 0.50+/-0.10 0.30+/-0.17 0.223+/-0.06 0.30+/-0 CD34(%) 2.50+/-0.33 2.73+/-0.07 3.31+/-0.64 2.34+/-0.22 Total de células CD34+ 7933+/-7310 8133+/-4623 7800+/-2600 7166+/-802 CD34+CD38-(%) 0.05+1-0.01 0.06+/-0.04 1.70+/-0.22 0.80+/-0.29 CXCR4+CD45+(%) 8.7+/-0.54 12.1+/-1.30 2.9+/-0.5 3.6+/-0.9 CXCR4+CD45-(%) 0.48+/-0.15 0.66+/-0.04 4.27+/-0.23 3.28+/-0.89 Resultados y Descripción Como se muestra en la Tabla 2 y en las FIGS. 8-12, el número total de células de MNCs cultivadas con DMSO, Actimid™ ó Revimid™, fue menor que en el grupo de control ("Ninguno", citocinas solamente) . Esto puede haber resultado de los efectos del DMSO. Los cultivos de células que se cultivaron con MID 1 exhibieron un porcentaje superior de células CD34+ al de todos los otros grupos, mientras que el número total de células CD34+ fue similar en todos los grupos. El número de células CD34+CD38- fue significativamente superior en las células tratadas con IMJD1 y Revimid™, el cual es consistente con los resultados del tratamiento de las células CD34+ purificadas con los compuestos. Es bien aceptado que las células CD34+CD38- sean una célula progenitora hematopoyética menos diferenciada la cual se injerta y prolifera después del transplante a una eficiencia superior que las células CD34+CD38+ (Dao et al. 1998, Blood 91 (4) : 1243-55; Huang et al., 1994, Blood 83(6): 1515-26). Parece que el DMSO estimula la expresión del CXCR4 en las MNCs de sangre de cordón umbilical. El Actimid™ y el Revimid™ inhibieron significativamente la expresión de la expresión del CXCR4 en las células CD45+ cuando se compararon con ambos grupos de control. Una mayoría de las células CXCR4+ en los cultivos de las células tratadas con Actimid™ y Revimid™, fueron CD45 negativas. Esta población de células fue significativamente superior en las células tratadas con Actimid™ y Revimid™.
Los resultados indican que el Actimid™ y el Revimid™ son útiles en el acondicionamiento de las células madre para contrarrestar los efectos nocivos de la criopreservación, deshielo y/o exposición a los crioconservadores en las células madre. Los resultados además indican que la supresión mediante D SO de la producción de células CD34+ y CD14+ , se puede contrarrestar tratándola con Actimid™ ó Revimid™, el cual mejora aquella capacidad proliferativa de las células CD34+ y CD14+. 6.4. EJEMPLO 4: Efectos de la Talidomida, Actimid™ y Revimid™ en la Producción de Monocitos 6.4.1. Materiales y Métodos Se cultivaron células purificadas CD34+ de sangre de cordón umbilical de humano (más del 90% de CD34+) en un medio FCS IMDM al 20% suplementado con citocinas (IL3, IL6, G-CSF, KL y Epo) a 4 x 104 células/ml durante 14 días a 37 °C en un incubador humidificado con C02 al 5%. Los grupos experimentales consisten de un grupo en el cual (i) no se agregó ni DMSO ni compuestos químicos ("Ninguno"), (ii) DMSO solamente, y (iii) Talidomida disuelta en DMSO, (iv) Actimid™ disuelto en DMSO, y (v) Revimid™ disuelto en DMSO. Se cosecharon y tiñeron alícuotas de células con un anticuerpo monoclonal conjugado CD34-PE y un anticuerpo monoclonal conjugado CD14-FITC. 6.4.2. Resultados y Discusión Los resultados mostraron que en el grupo "Ninguno" , solamente el 0.95% del total de las células, fue CD34+. En el grupo tratado con DMSO, solamente el 0.17% de las células fue CD34+ , que sugiere que el DMSO tiene un efecto negativo en la expansión y preservación del CD34+. En el grupo tratado con Talidomida, el 0.24% de las células fue CD34+ , el cual no es significativamente diferente de las células tratadas con DMSO el porcentaje superior de células CD34+ (18.7% y 7.1%, respectivamente) . (Ver también los resultados experimentales mostrados en la FIG. 13 y la leyenda acompañante de la figura) . El CD14 es un marcador para monocitos. En el grupo "Ninguno", el 11.5% de las células fue CD14+ , mientras que en el grupo tratado con DMSO, 3.7% fue CD14+ , que indica que la producción disminuida de monocitos. Como fue el caso para la expresión del CD34 anterior, los resultados para el grupo tratado con Talidomida y el grupo tratado con DMSO, fueron similares. Puesto que los grupos tratados con Actimid™ y Revimid™ se expusieron al DMSO también, se puede deducir que la producción de monocitos que se inhibe por medio del DMSO, se supera mediante el tratamiento con Actimid™ ó Revimid™. 6.5. EJEMPLO 5: Efectos del Pretratamiento con Actimid™ en las Células Nucleadas Transplantadas de Sangre de Cordón Umbilical y de Placenta Este experimento demuestra que el pre-tratamiento con Actimid™ incrementa la supervivencia de las células nucleadas de placenta transplantadas (PLNC) , células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y células de médula ósea (BMNC) . 6.5.1. Materiales y Métodos Las células nucleadas de placenta transplantadas (PLNC) , las células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y las células de médula ósea (BMNC) , se obtienen de donadores humanos. Las PLNC y UCBNC se obtuvieron de placenta y cordón umbilical utilizando los métodos descritos en la Sección 5.4 anterior . Las células se pretrataron mediante incubación en DMEM suplementado con suero de CB de humano al 2% con 10 g/ml de Actimid™ durante 24 horas. Las células entonces se lavaron, se resuspendieron en plasma autólogo, y se administraron intravenosamente a ratones adultos SJL/L receptores (Jackson Laboratories) a los que se les realizó la extirpación de la médula ósea mediante irradiación letal (900cGy) de conformidad con los métodos estándar. Tal irradiación es mejor que una post-irradiación de 50 días letal a un 90% (Ende et al, 2001, Life Sciences 69 (13) : 1531-1539 ; Chen y Ende, 2000, J. Med. 31: 21-30; Ende et al., 2000, Life Sci . 67(l) :53-9; Ende y Chen, 2000, Am. J. Clin. Pathol . 114: 89) . 6.5.2. Resultados y Descripción Los efectos del pretratamiento con Actimid™ en las PLNC, UCBNC y BMNC transplantadas , se muestran en la Tabla 3 posterior. Como se puede ver en la Tabla 3, el pretratamiento con Actimid™ incrementa la supervivencia de las células nucleadas de placenta transplantadas (PLNC) , las células nucleadas de sangre de cordón umbilical (UCBNC) y de las células de médula ósea (BMNC) . # de % del Peso Animales Corporal Grupo # de Animales Muertos de Partida Experimental Tratamiento Irradiados en 50 días en 50 días 1 PLNC 5x106 intravenoso 3 1 84 2 PLNC 5x106 intravenoso 3 0 89 3 PLNC 5x 106 + pretratamiento 4 0 102 intravenoso con Actimid™ 4 UCBNC lOOxlO6 intravenoso 3 0 81 5 UCBNC 1 Ox 106 + pretratamiento 3 0 84 intravenoso con Actimid™ 6 UCBNC ??? 106 intravenoso 1 78 7 BMNC 0.5xl06 3 3 79 8 BMNC 5x106 3 3 74 9 BMNC50xl06 3 2 83 10 Control 12 11 N/A Abreviaturas : PLNC: células nucleadas de placenta UCBNC: células nucleadas de sangre de cordón umbilical BMNC : células de médula ósea N/A: NO APLICABLE 6.6. Modulación de la Diferenciación de las Células Progenitoras CD34+ 6.6.1. Materiales y Métodos Las células progenitoras CD34+ de médula ósea y sangre de cordón umbilical se obtuvieron de Clonetics y se cultivaron en MDM de Iscove con BIT 95000 (StemCell Technologies) en la presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-OÍ durante 6 días, y luego en la presencia de GM-CSF y TNF-a durante 6 días adicionales . Análisis del fenotipo superficial de células: Las células se procesaron en un teñido doble (30 min. a 4°C) en el día 6 y día 12 utilizando mABs conjugado con FITC y PE. Se utilizaron anticuerpos de BD Pharmingen: CD34 (PE) , CD38 (FITC) , CD33 (FITC) , CDla (FITC) , CD86 (PE) , CD14 (PE) , CD83 (PE), CD54 (PE), CDllb (PE), CDllc (PE), HLA-DR (PE), CD15 (FITC), y CD133 (PE) de Miltenyi. Se realizó un análisis de fluorescencia en un citómetro de flujo FACScan después de la adquisición de 10,000 casos (Coulter) . Los resultados presentados son representativos de cuatro experimentos independientes . Detección de apoptosis: Se determinó la exposición de fosfatidil serina utilizando un teñido Annexin V-FITC en combinación con yoduro de propidio (equipo I de detección de apoptosis de BD Pharmingen) siguiendo las instrucciones del fabricante . Fagocitosis: La actividad endocítica de las células se analizó midiendo la absorción de FITC-dextrano . Se incubaron células con 1 mg/ml de dextrano-FITC (Sigma) en un medio completo a 37 °C durante 1 hora y 4°C durante 1 hora como un control negativo. Los resultados presentados son representativos de dos experimentos independientes. Ensayo de proliferación de las células T: Después de 13 días de cultivo, se recolectaron las células DC derivadas de CD34+, y después del tratamiento con mitomicina (50 µg/ml, Sigma) , se utilizaron como células estimuladoras para las células T alogénicas CD3+ de adulto purificadas de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de voluntarios saludables. Las células T CD3+ de respuesta se utilizaron en una concentración de 5 x 104 células/pozo. Se agregaron células estimuladoras en dosis graduadas a las células T en placas de cultivo de tejido, de color negro, de 96 pozos, de fondo plano, con fondo claro, para la detección de quimioluminiscencia . Los cultivos se realizaron en un medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% inactivado con calor, glutamina y Penicilina-estreptomicina. Después de 6 días de cultivo, se midió la proliferación de células con el ensayo de quimioluminiscencia BrdU (Roche, Nutley NJ) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan como la media ± SD obtenida de los cultivos por triplicado. 6.6.2. Resultados y Descripción Se encontró que el Actimid™ altera significativamente el desarrollo de las DC de los progenitores CD34+. Para estudiar el efecto del Actimid™ en la generación de DC, se cultivaron células progenitoras CD34+ con o sin Actimid™ (1 µ?) por un periodo de 12 días durante la fase de expansión y maduración (día 1 a día 12) , o un periodo de 16 días durante la fase de maduración (día 6 a día 12) (FIG . 14) . La adición de Actimid™ del día 1 al día 12, inhibe la adquisición del fenotipo DC (FIG. 15) y que incremente de manera más importante la población CD34"CD38", alterando la diferenciación normal de las células CD34+CD38" en las células CD34+CD38+ (FIG. 16) . Sin embargo, las células CD34+ tratadas con Actimid™ adquieren el marcador mieloide CD33, y estas células presentaron un fenotipo CD34+CD38~CD33+ en el día 6. El Actimid™ casi previene por completo la generación de células CDla+ en el día 6, y particularmente la generación de células dobles positivas CD86+CDla+. Se cree que esta población positiva doble será la precursora de las DC epidérmicas Langerhans . El Actimid™ también puede disminuir la generación de las células CD14+ CDla" que pueden dar lugar tanto a DC dérmicas como a monocitos/macrófagos . El incremento en la población de progenitores tempranos (células CD34+CD38~) y el bloqueo en los progenitores DC mieloides (células CDla+CD14" y CDla"CD14+) , dependieron de la dosis y alcanzaron un máximo en 1 µ? de Actimid™ (FIG. 17) . Este efecto fue reversible y solamente se observó una interferencia con la ruta diferenciación CD34 si los progenitores CD34+ se cultivaron durante al menos 3 días con Actimid™ (FIG. 18) . Las dosis múltiples de Actimid™ entre los días 0 y 6 intensificaron el incremento en la población CD34+ (FIG. 19A) .
Las células progenitoras CD34+ cultivadas en la presencia de Actimid™, también exhibieron en el día 12 una expresión disminuida de moléculas1 co-estimuladoras (CD86, CD80) (FIG. 20) . La molécula de adhesión CD54 se alteró con la expresión disminuida del CD54bri9ht y la expresión incrementada de las poblaciones CD54dltn (FIG. 21) . La expresión de las moléculas HLA-DR se redujo en los progenitores CD34+ tratados con Actimid™.
Cuando se agregó Actimid™ en el día 6, después del cultivo de los días 0-6 sin tratamiento, y cuando ya ha sido generada la población CDla+, el Actimid™ incrementó la persistencia de la población CDla+ (Tabla 1) . El cultivo tratado con Actimid™ contiene relativamente más precursores CDla+ en el día 12 que el control de DMSO. La adición de Actimid™ a las células diferenciadas CD34+ del día 6 también disminuyeron considerablemente la generación de precursores CD14+ y la expresión de las moléculas co-estimuladoras (CD86, CD80) . Tabla 1: Caracterización fenotípica en el día 12 de DC generadas a partir de células progenitoras CD34+ en la presencia del Actimid™ del día 6 al día 12 Día 12 DMSO día 6 al día 12 Actimid™ día 6 a día 12 CDla+ 8.5% 11.5% CD14+ 19.0% 8.0% CD86+ 28.8% 18.5% CD80+ 19.6% 13.8% El Actimid™ promueve la diferenciación granulocítica : Para determinar si el bloqueo en la generación de DC estuvo asociado con un cambio a una diferente ruta de diferenciación mieloide, se monitoreó la expresión del marcador granulocítico CD15. Se incrementó la expresión de la molécula superficial CD15 en las células progenitoras CD34+ cultivadas en la presencia de Actimid™ (FIG. 22) . En la presencia de un cóctel de citocina que conduce la diferenciación de DC, la adición de Actimid™ desvía la expansión/maduración de células progenitoras en un fenotipo más similar a un granulocito. También se estudió la oblicuidad en una diferenciación mieloide monitoreando la expresión de 2 marcadores: CDllc, expresado por los progenitores DC mieloides para las células Langerhans y DC intersticiales, y CD15 expresado por los progenitores de granulocitos . Se asoció una disminución en la población CDllc+CD15- con una incremento concomitante en la población granulocítica CDllc-CD15+. De un modo interesante, las dosis múltiples de Actimid™ mejoran el cambio hacia el linaje granulocítico . Bloqueo en la generación de DC no mediado por una exterminación específica de los progenitores de DC: Para determinar si la disminución en los progenitores de DC estuvo mediada por una exterminación específica. Las células progenitoras CD34+ se cultivaron durante un periodo de 6 días en la presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF- . En el día 6, se aislaron las células CDla+CD14" y CDla"CD14+ (progenitores DC) mediante una clasificación magnética de células ( iltenyi) . Se cultivaron poblaciones purificadas durante unos 2 días adicionales en la presencia de GM-CSF y TNF-a con o sin Actimid™ (1 µ?) . No hubo un incremento significativo en el nivel de poblaciones de anexina V+-PT~ (apoptosis temprana) y anexina V+-PT+ (apoptosis tardía) en el tratamiento con Actimid™ (FIG. 23) . Se altera la actividad funcional de las DC generadas a partir de los progenitores CD34+: Se evaluó la capacidad fagocítica de las células derivadas de las células progenitoras CD34+ cultivadas con citocinas con o sin Actimid™ mediante la endocitosis mediada con receptores de mañosa de dextrano-FITC en el día 12. Cuando se agregó Actimid™ desde el día 1 hasta el día 12, hubo una fuerte disminución en la capacidad fagocítica comparada con el control de DMSO (FIG. 24) . Cuando se agregó Actimid™ desde el día 6 hasta el día 12 la capacidad fagocítica fue comparable con las células de control de DMSO (FIG. 25) . Se evaluó la capacidad de presentación de antígenos (APC) de las células CD34+ cultivadas con citocina con o sin Actimid™ midiendo su capacidad para inducir la proliferación de células T alogénicas CD3+ en un ensayo con la Reacción de Leucocitos Mezclados (MLR) en el día 12. Cuando se agregó Actimid™ desde el día 1 hasta el día 12, las células CD34+ mostraron una capacidad reducida para estimular la proliferación de células T cuando se compara con el control de DMSO (FIG. 26) . En contraste, cuando se agregó Actimid™ desde el día 6 hasta el día 12, la capacidad para estimular la proliferación de células T, fue comparable con las células de control de DSMO (FIG. 27) . La ruta de diferenciación normal seguida por las células CD34+, se muestra en la FIG. 28. Estos resultados indican que el Actimid™ atenúa dramáticamente la diferenciación de las células progenitoras CD34+ en células dendríticas. Como consecuencia, las células tratadas con Actimid™ presentaron una capacidad fagocítica baja y una capacidad APC reducida. De manera más importante, el Actimid™ incrementó los progenitores hematopoyéticos tempranos, las células CD34+CD38". Aquellos progenitores hematopoyéticos tempranos que han demostrado dar un mejor injerto y repoblación en el modelo de ratón NOD-SCID (Tamaki et al., J. Neurosci. Res. 69 (6) : 976-86 (2002)). Además, el Actimid™ bifurcó la diferenciación de las células CD34+ cambiando la diferenciación mieloide hacia el linaje granulocítico, aún cuando la presión de la citocina esté a favor de la diferenciación de células dendríticas. Además, se encontró que el Actimid™ no tiene efectos tóxicos en las células CD34+, y que no imparte la capacidad de proliferar de las células. Esta modulación de la función de DC y la promoción de la diferenciación granulocítica pueden tener una utilidad terapéutica significativa para el tratamiento de diversos cánceres, padecimientos inmunológicos, y padecimientos infecciosos, y en los transplantes de órganos, y la medicina regenerativa . Ver la FIG. 29 para un resumen gráfico de lo anterior. 6.7. Actimid™ Modula la Diferenciación de las Células Progenitoras CD133* Las dosis múltiples de Actimid™, además de intensificar el incremento en la población CD34+, también incrementan la expresión del CD133, el cual usualmente se expresa mediante las células progenitoras hematopoyéticas cD34brillante y algunas subpoblaciones CD34" primitivas (FIGS. 19A, 19B) . El Actimid™, al enriquecer las células hematopoyéticas primitivas CD34+CD133+, debe de tener una implicación clínica en la recuperación hematopoyética después del transplante de las células madre. Además, las células madre CD133+ también pueden dar lugar al linaje endotelial y contribuir en el término de la cicatrización de heridas. Las dosis múltiples de Actimid™ no exacerban el bloqueo en la generación de precursores de DC Langerhans . 6.8. Generación de células Dendríticas de Murino a partir de Células Progenitoras Hematopoyéticas Sea'*' de Médula Ósea (BM) 6.8.1. Materiales y Métodos Se obtuvo la médula ósea de ratón a partir de ratones C57BL/6 innatos de Clonetics. Se enriquecieron los progenitores hematopoyéticos Sca+Lin- utilizando un cóctel de enriquecimiento de progenitores murinos SpinSep (StemCell Technologies) y se cultivaron en MDM de Iscove con BIT 95000 (StemCell Technologies) en la presencia de factores de crecimiento de murinos SCF, Flt3L, GM-CSF y M-CSF durante 9 días, para promover la expansión de las células Sca+ y un fenotipo del precursor DC y luego en la presencia de GM-CSF y TNF-OÍ durante 3 días adicionales para conducir las células a un fenotipo DC inmaduro. Ver la FIG. 30. Las células enriquecidas Sca+Lin- se cultivaron en la presencia de DMSO (0.1%), Actimid™ en 10 µ? ó ácido retinóico todo-trans (ATRA) (ICN Biomedicals) en 10 µ? a partir del día 0. Se agregaron compuestos a las células en el día 0 y el día 9. Análisis del fenotipo de la superficie celular de murinos: Se procesaron las células de murinos en un teñido doble (14 min a RT (TA) ) en el día 9 y día 12; utilizando mABs conjugado con FITC y PE. Se utilizaron anticuerpos de BD Pharmingen: Sea (PE), CDllb (FITC), Gr-1 (FITC), CD86 (PE), CD14 (PE), CD80 (PE), I-Ab (PE), CD40 (PE) y CD32.1/16.1 (FITC) de Miltenyi. Se realizó un análisis de fluorescencia en un citómetro de flujo FACScan (Coulter) después de la adquisición de 10,000 casos. Se encontró que el Actimid™ altera el desarrollo de las DC de Murinos de progenitores Sca+. En el día 9 las células presentaron un fenotipo precursor DC con una expresión de superficie alta de marcadores dendríticos/mieloides CD32/16 (receptores Fe), CDllb, CD80, expresión baja de I-Ab y CD86, y una carencia de la expresión de marcadores de linaje como el CD14 y Gr-1 (FIG. 31) . El Actimid™ no mostró un efecto significativo en la expresión del marcador de superficie celular en el día 9, mientras que ATRA mostró una marcada sub-regulación de la expresión de CD80, I-Ab y Sca+ {no se mostraron los datos) . Sin embargo en el día 12, Actimid™ mostró una sub-regulación de la expresión de CD86 y brillante I-Ab y una sobre-regulación de la expresión de CDllb (FIG. 32) . El ATRA mostró efectos similares pero más pronunciados que el Actimid™. Además, el Actimid™ no mostró efectos en la expresión del CD40 y CD80 mientras que el ATRA mostró una marcada sub-regulación de estas moléculas (no mostrada) . Estos resultados sugieren que el Actimid™ inhibe la diferenciación de los precursores DC en DC inmaduras sub-regulando la expresión de CD86 y MHC II. Los efectos del compuesto no son tan dramáticos como aquéllos observados en los progenitores hematopoyéticos de humanos y esto se asemeja a la baja actividad del Actimid™ en los ratones in vitro e in vivo en otros modelos. El efecto del Actimid™ es mucho menos pronunciado que el del ATRA, el cual es un teratógeno en los ratones . 6.9. Aplicación del Ensayo de Diferenciación a Compuestos Distintos de los IMiDs La metodología descrita anteriormente, es decir, el examen del efecto de los ImiDs tales como el Actimid™ sobre la diferenciación en las células progenitoras tempranas, tales como las células CD34+, se puede aplicar a cualquier compuesto de interés, el efecto del cual sobre la diferenciación se desea conocer. Como un ejemplo de la extensión de este método de ensayo a otros compuestos, se comparó el efecto del ácido retinóico (ATRA) y de la aspirina con los del Actimid™ en la diferenciación de las célula CD34+ hacia el linaje DC contra las células de control (tratadas con DMSO) . Se estudió el ácido retinóico debido a su efecto conocido en la proliferación y diferenciación celular, su uso terapéutico en algún cáncer, y su efecto teratogénico conocido. Por el contrario, se estudió el efecto de la aspirina debido a que la misma es un fármaco anti -inflamatorio comúnmente utilizado con propiedades no inmuno-moduladoras . Los resultados en el día 6 de las células progenitoras CD34+ cultivadas en la presencia de SCF, Flt-3L, GM-CSF y TNF-a, con o sin un compuesto durante un periodo de 6 días, se presentan a continuación en la Tabla 2 (flecha hacia arriba) indica un incremento en la población de células; la flecha hacia abajo indica una disminución, diferenciación de células progenitoras .
Población de células Actimid™ RA todo- Aspirina trans CD34+ CD38" T i Sin cambio CD34" CD38+ i † Sin cambio CDla+ CD14" ¿ i Sin cambio CDla" CD14+ i i Sin cambio CD15+ r † Sin cambio En la literatura se ha mostrado que otros fármacos modulan la diferenciación celular, por ejemplo, un artículo reciente reporta la modulación mediante corticosteroides de la generación de DC a partir de las células progenitores CD34+. El perfil difiere del Actimid™ con un incremento en la población de CDla+ y una disminución en la población CD14+. 6.10. EJEMPLO 10: Inducción de la Diferenciación en Tipos Particulares de Células Las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias se inducen para diferenciarse en un tipo particular de célula mediante exposición a un factor de crecimiento. Los factores de crecimiento que se utilizan para inducir la inducción incluyen, pero no están limitados a: G -CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-alfa, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-2, IL-6, ácido retinóico, factor de crecimiento de fibroblastos básicos, TGF-beta-1, TGF-beta-3, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento epidérmico, cardiotropin- 1 , angiotensinógeno, angiotensina I (AI) , angiotensina II (AII) , agonistas del receptor tipo 2 AII AT2, o análogos o fragmentos de los mismos. 6.10.1. Inducción de la Diferenciación en Neuronas Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en neuronas. El siguiente protocolo se emplea para inducir una diferenciación neuronal: 1. Se cultivan células madre de placenta durante 24 horas en un medio de preinducción que consiste de DMEM/FBS al 20% y 1 mM de beta-mercaptoetanol. 2. Se remueve el medio de preinducción y las células se lavan con PBS . 3. Se agrega un medio de inducción neuronal que consiste de DMEM y 1-10 mM de betamercaptoetanol . Alternativamente, se puede utilizar un medio de inducción que consiste de DMEM/DMSO al 2%/200 µ? de hidroxianisol butilado para mejorar la eficiencia de la diferenciación neuronal. 4. En ciertas modalidades, pueden ocurrir cambios morfológicos y moleculares tan pronto como 60 minutos después de la exposición a un medio libre de suero y betamercaptoetanol ( oodbury et al., J. Neurosci. Res., 61:364-370). Se puede utilizar RT/PCR para evaluar la expresión de por ejemplo el receptor del factor de crecimiento de los nervios y los genes de cadena pesada de los neurofilamentos . 6.10.2. Inducción de la Diferenciación Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en adipocitos. El siguiente protocolo se emplea para inducir una diferenciación adipogénica : 1. Se cultivan células madre de placenta en MSCGM (Bio Whittaker) ó DMEM suplementado con suero de sangre de cordón umbilical al 15%. 2. Se utilizaron tres ciclos de inducción/mantenimiento. Cada ciclo consiste de alimentar las células madre de placenta con un Medio de Inducción de Adipogénesis (Bio Whittaker) y cultivar las células durante 3 días (a 37°C, C02 al 5%) , seguido por 1-3 días de cultivo en el Medio de Mantenimiento de Adipogénesis (Bio Whittaker) . Se utiliza un medio de inducción que contiene 1 µ? de dexametasona, 0.2 mM de indometacina, 0.01 mg/ml de insulina, 0.5 mM de IBMX, DMEM-glucosa elevada, FBS, y antibióticos . 3. Después de 3 ciclos completos de inducción/mantenimiento, las células se cultivan durante unos 7 días adicionales en un medio de mantenimiento de adipogénesis , que reemplaza el medio cada 2-3 días. 4. Se puede evaluar la adipogénesis mediante el desarrollo de múltiples vesículas intracitoplásmicas de lípidos que se pueden observar fácilmente utilizando el teñido lipofílico con aceite rojo O. Se emplean ensayos con RT/PCR para examinar la expresión de los genes de proteínas de enlace de ácido graso. 6.10.3. Inducción de la Diferenciación en Condrocitos Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en condrocitos. El siguiente protocolo se emplea para inducir una diferenciación condrogénica : 1. Se mantienen células madre de placenta en MSCGM (Bio Whittaker) ó DMEM suplementado con suero de sangre de cordón umbilical al 15%. 2. Se hacen alícuotas de células madre de placenta en un tubo estéril de polipropileno. Las células se centrifugan (150 x g durante 5 minutos) , y se lavan dos veces en un Medio de Condrogénesis Incompleto (Bio Whittaker) . 3. Después del último lavado, las células se resuspenden en un Medio de Condrogénesis Completo (Bio Whittaker) que contiene 0.01 µg/ml de TGF-beta-3 a una concentración de 5 x 10(5) células/ml. 4. 0.5 mi de células se forman en alícuotas en un tubo de cultivo de polipropileno de 15 mi. Las células se aglomeran en 150 x g durante 5 minutos. El aglomerado se deja intacto en el medio. 5. Se incuban los tubos con tapas no cerradas a 37 °C, C02 al 5% durante 24 horas. 6. Los aglomerados de células se alimentan cada 2-3 días con un medio de condrogénesis completo preparado recientemente . 7. Los aglomerados se mantienen suspendidos en un medio mediante agitación diaria utilizando un vórtice de baja velocidad. 9. La condrogénesis se puede caracterizar por ejemplo mediante la observación de la producción de una sustancia de base eosinofílica, evaluando la morfología celular, y/o RT/PCR para examinar la expresión genética del colágeno 2 y colágeno 9. 6.10.4. Inducción de la Diferenciación en Osteocitos Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en osteocitos. El siguiente protocolo se emplea para inducir una diferenciación osteogenica : 1. Se cultivan cultivos adherentes de células madre de placenta en MSCGM (Bio Whittaker) ó DMEM suplementado con suero de sangre de cordón umbilical al 15%. 2. Se dejan reposar los cultivos durante 24 horas en matraces de cultivo de tejido. 3. Se induce una diferenciación osteogénica reemplazando el MSCGM con un Medio de Inducción Osteogénica (Bio Whittaker) que contiene 0.1 µ? de dexametasona, 0.05 mM de ácido ascórbico-2-fosfato, 10 mM de beta- glicerofosfato . 4. Las células se alimentan cada 3-4 días durante 2-3 semanas con un Medio de Inducción Osteogénica. 5. Se evalúa la diferenciación utilizando un teñido específico de calcio y RT/PCR para la expresión genética de fosfatasa alcalina y osteopontin . 6.10.5. Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en hepatocitos. El siguiente protocolo se emplea para inducir una diferenciación hepatogénica : 1. Se cultivan células madre de placenta en DMEM/CBS al 20% suplementado con un factor de crecimiento de hepatocitos, 20 ng/ml; y un factor de crecimiento epidérmico, 100 ng/ml. Se puede utilizar un Reemplazo de Suero Adormecedor en lugar de FBS . 2. Se agregan 50 ng/ml de IL-6 a los matraces de inducción. 6.10.6. Inducción de la Diferenciación en Células Pancreáticas Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en células pancreáticas. El siguiente protocolo se emplea para inducir una diferenciación pancreática : 1. Se cultivan células madre de placenta en DMEM/CBS al 20%, suplementado con un factor de crecimiento de fibroblastos básicos, 10 ng/ml; y un factor de crecimiento de transformación beta-1, 2 ng/ml. Se puede utilizar un Reemplazo de Suero Adormecedor en lugar de CBS . 2. Se agrega un medio acondicionado de cultivos de células neurales nestin-positivas al medio a una concentración de 50/50. 4. La diferenciación se caracteriza evaluando la expresión genética de insulina o proteína de insulina mediante RT/PCR. 6.10.7. Inducción de la Diferenciación en Células Cardiacas Este ejemplo describe la inducción de las células de sangre de cordón umbilical y/o células madre similares a las embrionarias para diferenciarse en células cardiacas. El siguiente protocolo se emplea para inducir una diferenciación miogénica : 1. Se cultivan células madre de placenta en DMEM/CBS al 20%, suplementado con ácido retinóico, 1 µ?; factor de crecimiento de fibroblastos básicos, 10 ng/ml ; y un factor de crecimiento de transformación beta-1, 2 ng/ml; y un factor de crecimiento epidérmico, 100 ng/ml. Se puede utilizar un Reemplazo de Suero Adormecedor en lugar de CBS. 2. Alternativamente, se cultivan células madre de placenta en DMEM/CBS al 20%, suplementado con 50 ng/ml de Cardiotropin-1 durante 24 horas. 3. Alternativamente, se mantienen las células madre de placenta en un medio libre de proteínas durante 5-7 días, luego se estimulan con un extracto de miocardio de humano (análisis de dosis escalonada) . El extracto de miocardio se produce homogeneizando 1 gm de miocardio de humano en amortiguador de HEPES al 1% suplementado con suero de sangre de cordón umbilical al 1%. La suspensión se incuba durante 60 minutos, luego se centrifuga y el sobrenadante se recolecta. 4. Se cultivan células durante 10-14 días, realimentándolas cada 3-4 días. 5. Se evalúa la diferenciación utilizando ensayos de expresión genética RT/PCR con actina cardiaca. 6.10.8. Caracterización de las Células de Sangre de Cordón Umbilical y/o Células Madre Similares a las Embrionarias Antes de y/o Después de la Diferenciación Las células madre similares a las embrionarias, las células de sangre de cordón umbilical y/o las poblaciones de células de sangre de cordón umbilical neutralizadas con células madre similares a las embrionarias se caracterizan antes de y/o después de la diferenciación midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de superficie celular utilizando técnicas tales como la citometría de flujo y la inmunocitoquímica, y midiendo los cambios en la expresión genética utilizando técnicas, tales como la PCR. Las células que se han expuesto a los factores de crecimiento y/o que se han diferenciado, se caracterizan por la presencia o ausencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, 0CT-4+, y ABC-p+. Preferiblemente, las células madre similares a las embrionarias se caracterizan, antes de la diferenciación, por la presencia de los marcadores de superficie celular 0CT-4+, APC-p+, CD34- y CD38-. Las células madre que portan estos marcadores son tan versátiles (por ejemplo pluripotentes) como las células madre embrionarias de humano. Las células de sangre de cordón umbilical se caracterizan, antes de la diferenciación, por la presencia de los marcadores de superficie celular CD34+ y CD38+. Las células diferenciadas derivadas de las células madre similares a las embrionarias, células de sangre de cordón umbilical no expresan estos marcadores. La presente invención no estará limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas aquí. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquéllas descritas aquí serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. 7. LITERATURA Todas las referencias citadas aquí se incorporan en la misma como referencia en su totalidad y para todos los propósitos para el mismo alcance como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente que se indicó específica e individualmente se incorporara como referencia en su totalidad para todos los propósitos. La cita bibliográfica de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no se debe interpretar como una admisión de que la presente invención no está facultada a anteceder tal publicación en virtud de su previa invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. - Un método para la modulación de la diferenciación de una célula madre de mamífero, caracterizado porque comprende diferenciar dicha célula madre bajo condiciones adecuadas y en la presencia de un compuesto que inhiba la actividad TNF- , en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico. 2. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha célula madre se diferencia en una célula hematopoyética . 3. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha célula madre se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula madre de placenta, una célula madre de sangre de cordón umbilical, una célula madre de sangre periférica, y una célula madre de médula ósea. 4. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho compuesto es un análogo de talidomida sustituido con amino o isoindolina sustituida con amino. 5. - El método de la reivindicación 4, caracterizado porque dicho análogo de talidomida sustituido con amino o isoindolina sustituida con amino se selecciona del grupo que consiste de Actimid™, Revimid™, un análogo o profármaco de Actimid™, un análogo o profármaco de Revimid™, y un compuesto de la fórmula: en donde uno de X y Y es C=0 y el otro de X y Y es C=0 ó CH2. 6.- El método de la reivindicación 4, caracterizado porque dicha talidomida sustituida con amino se selecciona del grupo que consiste de l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina, l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -4-aminoisoindolina, l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -6-aminoisoindolina, l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina, 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) —4-aminoisoindolina, y 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina . 7. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho paso de contacto se realiza en un cultivo celular . 8. - El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho paso de contacto se realiza dentro de dicho individuo . 9.- El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración del compuesto es desde alrededor de 0.005 yg/ml hasta alrededor de 5 mg/ml. 10.- El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es una célula madre de humano. 11. - Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula progenitora CD34+ ó CD133+ de mamífero, caracterizado porque comprende proliferar o diferenciar dicha célula bajo condiciones adecuadas para su proliferación o diferenciación y en la presencia de un compuesto que inhiba la actividad TNF-a, en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido, o ácido nucleico. 12. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicha célula progenitora se selecciona del grupo que consiste de una célula progenitora CD34+ y una célula progenitora CD133+. 13. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dichas células progenitoras se diferencian en células CD34+CD38"CD33+ ó CD34+CD38-CD33- . 14. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho compuesto análogo es un análogo de talidomida sustituido con amino o isoindolina sustituida con amino . 15. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de Actimid™, Revimid™, un análogo o profármaco de Actimid™, un análogo o profármaco de Revimid™, y un compuesto de la fórmula en donde uno de X y Y es C=0 y el otro de X y Y es C=0 ó CH2. 16.- El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina, l-oxo-2-(2, 6-dioxopiperidin-3-il) -4-aminoisoindolina, l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -6-aminoisoindolina, l-oxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina, 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -4-aminoisoindolina, y 1 , 3-dioxo-2- (2 , 6-dioxopiperidin-3-il) -5-aminoisoindolina . 17. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho paso de contacto se realiza en un cultivo celular . 18. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho paso de contacto se realiza dentro de un individuo . 19.- El método de la reivindicación 17, caracterizado porque dichas células progenitoras son células que se han transplantado en dicho individuo. 20.- El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho paso de contacto es suficiente para provocar una diferencia detectable en la diferenciación o proliferación con relación a un control . 21.- El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicha célula progenitora CD34+ ó CD133+ se ha criopreservado y descongelado antes de dicha diferenciación. 22. - Un método para la modulación de la diferenciación de una célula progenitora CD34+ ó CD133+, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una población de dichas células progenitoras bajo condiciones tales que pueda ocurrir la diferenciación; (b) poner en contacto dichas células progenitoras con un compuesto, en donde dicho compuesto es un análogo de talidomida sustituido con amino o isoindolina sustituida con amino; y (c) diferenciar dichas células progenitoras bajo condiciones adecuadas para la diferenciación, en donde dicho compuesto se pone en contacto con dichas células progenitoras durante al menos parte del tiempo en el que se diferencian dichas células progenitoras. 23.- El método de la reivindicación 22, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza en cualquier momento entre el día 0 al día 6 del cultivo. 24. - El método de la reivindicación 22, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza al inicio del cultivo de dichas células progenitoras. 25. - El método de la reivindicación 22, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza después de que hayan proliferado dichas células progenitoras durante al menos dos días. 26. - El método de la reivindicación 22, caracterizado porque en el paso (b) , dicho contacto se realiza después de que hayan proliferado dichas células progenitoras durante al menos seis días. 27. - El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dichas células progenitoras son células progenitoras CD34+. 28.- El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dichas células progenitoras se diferencian en células que exhiben características del marcador de superficie celular seleccionadas del grupo que consiste de: una disminución en la expresión CDllc con relación a un control; una disminución en la expresión CD38 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD80 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD86 con relación a un control ; una disminución en la expresión CDla con relación a un control ; una disminución en la expresión CD14 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD54brillante con relación a un control ; una disminución en la expresión HLA-DR con relación a un control; una disminución en la expresión CD15 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD33 con relación a un control ; una disminución en la expresión CD54opaco con relación a un control ; una disminución en la expresión CD133 con relación a un control ,- y una combinación de cualquiera de las características de los marcadores anteriores; en donde dicho control es una célula progenitora CD34+ cultivada bajo las mismas condiciones que dicha célula progenitora en la ausencia de dicho compuesto. 29. - El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dichas células progenitoras se diferencian en células CD34+CD38~CD33+ ó CD34+CD38~CD33 " . 30. - El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dicho análogo de talidomida es Actimid™ ó Revimid™. 31. - Un método para expandir una población de células progenitoras en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de células progenitoras CD34+ y un compuesto que inhiba la actividad TNF-OÍ a dicho sujeto mamífero, en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico. 32. - El método de la reivindicación 31, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se diferencian en dicho sujeto mamífero. 33. - El método de la reivindicación 31, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se administran a dicho sujeto mamífero en una preparación de células que está sustancialmente libre de células de glóbulos rojos. 34.- El método de la reivindicación 31, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se administran a dicho sujeto mamífero en una preparación de células que comprende células de médula ósea, células de placenta, o células de médula ósea. 35. - El método de la reivindicación 31, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ se administran a dicho sujeto mamífero en conjunción con un portador. 36. - El método de la reivindicación 31, caracterizado porque dichas células progenitoras CD34+ son células progenitoras CD34+CD38-CD33+ ó CD34+CD38"CD33 - . 37. - El método de la reivindicación 31, caracterizado porque dicha célula CD34+ es una célula progenitora CD34+CD133+. 38.- El método de la reivindicación 31, caracterizado porque las células progenitoras expresan material genético incorporado de interés . 39. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una célula madre de mamífero y un portador aceptable farmacéuticamente, en donde dicha célula madre se ha puesto en contacto con un compuesto que inhibe la actividad TNF-OÍ durante un tiempo suficiente para provocar la modulación de la diferenciación o proliferación de dicha célula madre, y en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico. 40. - La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque la célula madre se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula madre de placenta, una célula madre de sangre del cordón umbilical, una célula madre de sangre periférica, y una célula madre de médula ósea. 41.- La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de Actimid™, Revimid™, un análogo de Actimid™, un análogo de Revimid™, y un compuesto de la fórmula en donde uno de X y Y es C=0 y el otro de X y Y es C=0 ó CH2. 42. - La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque dicho paso de contacto se realiza en un cultivo celular. 43. - La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque la concentración de dicho compuesto es desde alrededor de 0.005 mg/ml hasta alrededor de 5 mg/ml. 44. - La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque la célula madre es una célula madre de humano . 45. - La composición farmacéutica de la reivindicación 39, caracterizada porque la diferenciación es una diferenciación en una célula hematopoyética . 46. - La composición farmacéutica de la reivindicación 45, caracterizada porque dicha célula hematopoyética es una célula hematopoyética CD34+ ó CD38+. 47. - La composición farmacéutica de la reivindicación 45, caracterizada porque la célula hematopoyética es una célula CDllb+. 48. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende células aisladas de sangre de cordón umbilical y una población aislada de células de glóbulos blancos, en donde las células de glóbulos blancos se generan mediante un método que comprende diferenciar las células madre bajo condiciones adecuadas y en la presencia de un compuesto que inhiba la actividad TNF- , con la condición de que el compuesto no sea un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico, y aislar las células de glóbulos blancos diferenciadas mediante los mismos. 49. - La composición farmacéutica de la reivindicación 48, caracterizada porque el compuesto es una imida o amida. 50. - La composición farmacéutica de la reivindicación 48, caracterizada porque el paso de diferenciación se realiza en un cultivo celular. 51. - La composición farmacéutica de la reivindicación 48, caracterizada porque la concentración del compuesto es desde alrededor de 0.005 g ml hasta alrededor de 5 mg/ml. 52. - La composición farmacéutica de la reivindicación 48, caracterizada porque la célula madre es una célula madre de humano . 53. - La composición farmacéutica de la reivindicación 48, caracterizada porque la célula madre es una célula progenitora . 5 . - La composición farmacéutica de la reivindicación 53, caracterizada porque la célula progenitora está consignada a un linaje específico de células. 55.- La composición farmacéutica de la reivindicación 53, caracterizada porque la célula progenitora es una célula progenitora hematopoyética . 56.- Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende cultivar células progenitoras CD34+ ó CD133+ y un portador aceptable farmacéuticamente, en donde dichas células progenitoras se han puesto en contacto dentro de los primeros seis días del cultivo con un compuesto que inhibe la actividad TNF-a, bajo condiciones que promueven la proliferación y diferenciación de dichas células progenitoras. 57.- La composición farmacéutica de la reivindicación 56, caracterizada porque dichas células progenitoras se recolectan y criopreservan después de seis días del cultivo. 58. - La composición farmacéutica de la reivindicación 56, caracterizada porque dichas células progenitoras son células CD34+CD38~CD34~ ó CD34+CD38~CD34+ . 59. - La composición farmacéutica de la reivindicación 56, caracterizada porque dicho compuesto es talidomida o un análogo de talidomida. 60. - La composición farmacéutica de la reivindicación 56, caracterizada porque dicho compuesto es Actimid™ ó Revimid™ . 61.- Un método para transplantar una célula madre de mamífero, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto dicha célula madre con una talidomida o un análogo de talidomida para producir una célula madre tratada, en donde dicho contacto es suficiente para modular la diferenciación de dicha célula madre; y (b) administrar dicha célula madre tratada a un individuo . 62. - El método de la reivindicación 61, caracterizado porque el paso (b) comprende administrar dicha célula madre tratada en combinación con células no tratadas. 63. - El método de la reivindicación 61, caracterizado porque la célula no tratada se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula de placenta, una célula de sangre de cordón umbilical, una célula de sangre periférica, y una célula de médula ósea. 64. - El método de la reivindicación 61, caracterizado porque dicha célula madre se ha criopreservado y descongelado antes de dicha administración. 65. - Un método para transplantar una célula progenitora de mamífero, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto dicha célula progenitora con talidomida o un análogo de talidomida para producir una célula progenitora tratada, en donde dicho contacto es suficiente para modular la diferenciación de dicha célula progenitora; y (b) administrar dicha célula progenitora tratada a un individuo . 66. - El método de la reivindicación 65, caracterizado porque el paso (b) comprende administrar dicha célula progenitora tratada en combinación con células no tratadas. 67. - El método de la reivindicación 65, caracterizado porque la célula no tratada se selecciona del grupo que consiste de una célula madre embrionaria, una célula de placenta, una célula de sangre de cordón umbilical, una célula de sangre periférica, y una célula de médula ósea. 68. - El método de la reivindicación 65, caracterizado porque dicha célula madre se ha criopreservado y descongelado antes de dicha administración. 69.- Un método para tratar un individuo que experimente una condición, caracterizado porque administrar a dicho individuo un agente seleccionado del grupo que consiste de: (a) un compuesto que inhiba la actividad TNF-OÍ durante un tiempo suficiente para provocar una modulación de la diferenciación o proliferación de dicha célula madre, en donde dicho compuesto no es un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleótido o ácido nucleico; (b) una célula madre diferenciada en la presencia de dicho compuesto; y (c) una célula progenitora diferenciada en la presencia de dicho compuesto, en donde dicho agente detectablemente reduce o mejora dicha condición . 70.- El método de la reivindicación 69, caracterizado porque dicha condición es una inflamación. 71.- Un método para tratar un individuo caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de células blancas de la sangre o glóbulos blancos a dicho sujeto mamífero receptor, en donde las células blancas de la sangre o glóbulos blancos se generan mediante un método que comprende diferenciar la célula madre bajo condiciones adecuadas y en la presencia de un compuesto que inhiba la actividad TNF- , con la condición de que el compuesto no sea un polipéptido, péptido, proteína, hormona, citocina, oligonucleotido o ácido nucleico. 72.- El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células madre se diferencian in vi tro. 73. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células madre se diferencian en una placenta perfusionada post-parto. 74. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células blancas de la sangre o glóbulos blancos se administran al individuo en una preparación de células que está sustancialmente libre de células rojas de la sangre o glóbulos rojos. 75. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células blancas de la sangre o glóbulos blancos se administran al individuo en una preparación de células que comprende células de sangre de cordón umbilical . 76. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células blancas de la sangre o glóbulos blancos se administran al individuo en conjunción con un portador. 77.- El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células blancas de la sangre o glóbulos blancos se administran para tratar o reparar un defecto en el sujeto mamífero receptor. 78. - El método de la reivindicación 77, caracterizado porque el defecto es un defecto de proliferación de células sanguíneas o hematopoyéticas . 79. - El método de la reivindicación 77, caracterizado porque el defecto de proliferación de células sanguíneas o hematopoyéticas es neutropenia o leucopenia. 80. - El método de la reivindicación 77, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran sistemáticamente . 81.- El método de la reivindicación 77, caracterizado porque las células de glóbulos blancos se administran intravenosamente . 82. - El método de la reivindicación 77, caracterizado porque las células de glóbulos blancos expresan un material genético incorporado de interés. 83. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque las células de glóbulos blancos son alogenéicas. 84. - El método de la reivindicación 71, caracterizado porque el sujeto mamífero receptor es un humano. 85.- Un método para producir células diferenciadas de las células progenitoras CD34+, caracterizado porque comprende cultivar dichas células en un medio de cultivo que permite la proliferación y diferenciación, y poner en contacto dichas células progenitoras con Actimid™ ó Revimid™. 86. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dicho contacto se realiza en el primer día del cultivo. 87. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dicho contacto tiene lugar al menos dos veces durante los primeros seis días del cultivo. 88. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dicho contacto no tiene lugar antes de dicho primer día del cultivo. 89. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dicha célula diferenciada es una célula dendrítica, un granulocito, una célula CD34+CD38-CD33+ ó CD34+CD38 -CD33 - . 90. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dicha célula progenitora CD34+ es una célula progenitora CD34+CD133+. 91.- El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dichas células diferenciadas se aislan en el día 6 del cultivo . 92. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dichas células diferenciadas se aislan en el día 12 del cultivo. 93. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dichas células CD34+ se han aislado de otras células sanguíneas antes de dicho cultivo. 94. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene adicionalmente GM-CSF y 95. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque dicho Actimid™ está presente en una concentración de entre 0.1 µ? y 10.0 µ?. 96. - El método de la reivindicación 85, caracterizado porque el Actimid™ está presente en una concentración de 1.0 fiM. 97.- Un método para elaborar una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto las células progenitoras CD34+ ó CD133+ con un compuesto que inhiba la actividad TNF-a, en donde dichas células progenitoras se cultivan durante seis días bajo condiciones de cultivo que permitan la proliferación y diferenciación de dichas células progenitoras; (b) recolectar dichas células después de seis días de cultivo; y (c) colocar en placas dichas células en un portador aceptable farmacéuticamente. 98.- El método de la reivindicación 97, caracterizado porque dicho contacto se realiza en el primer día del cultivo. 99. - El método de la reivindicación 97, caracterizado porque dicho contacto se realiza al menos dos veces durante dichos seis días del cultivo. 100. - El método de la reivindicación 97, caracterizado porque dicho compuesto es talidomida o un análogo de talidomida . 101. - El método de la reivindicación 97, caracterizado porque dicho compuesto es Actimid™ ó Revimid™. 102. - El método de la reivindicación 97, caracterizado porque dichas células progenitoras se han aislado de otras células sanguíneas antes de dicho cultivo. 103. - El método de la reivindicación 97, caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene adicionalmente GM-CSF y TNF-a. 104.- El método de la reivindicación 101, caracterizado porque dicho Actimid™ ó Revimid™ está presente en una concentración de entre 0.1 µ? y 10.0 µ?. 105. - El método de la reivindicación 101, caracterizado porque dicho Actimid™ ó Revimid™ está presente en una concentración de 1.0 µ?. 106. - El método de la reivindicación 6, caracterizado porque dichas células se criopreservan después de dicha recolección. 107.- Una composición farmacéutica elaborada mediante proceso de la reivindicación 97.
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