JPH04501510A - 普遍的なドナー細胞及びキメラ性哺乳類宿主のための相同性組換え - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５、前記細胞が表皮細胞である請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。

６、前記損傷が前記β２−ミクログロブリン遺伝子座のコード領域におけるマー カー遺伝子の挿入である請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。

７、前記マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である請求の範囲第６項記載 の哺乳類細胞。

８、前記値の遺伝子座が異なった損傷を有する請求の範囲第４項記載の哺乳類細 胞。

９、前記細胞がネズミである請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。

１０、前記細胞がヒトのものである請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。

１１、少なくとも１つのＤＮＡ構造体による哺乳類細胞の形質転換により組織適 合性複合体（ＭＨＣ）抗原の１つのサブユニットの個々の遺伝子座での損傷の導 入及び前記遺伝子座での前記構造体（該ＤＮＡ構造体は前記遺伝子座及び前記損 傷の少なくとも一部と相同である配列を含んで成る）の組込みの結果として少な くとも１つの主な前記ＭＨＣ抗原を欠く哺乳類細胞の生成方法であって： 前記ＤＮＡ構造体により宿主細胞を形質転換し、ここで前記構造体は前記ＤＮＡ を含んで成る宿主細胞の選択のためのマーカー遺伝子を含んで成り； 相同組込みのために前記構造体を含んで成る選択された細胞をスクリーンし； 前記構造体により相同組込みを有する細胞を形質転換し；そして 前記ＭＨＣ抗原の不在により表面上に前記ＭＨＣ抗原を欠く細胞を選択すること を含んで成る方法。

１２、前記ＭＨＣ抗原がクラスＩ抗原である請求の範囲第１１項記載の方法。

１３．　前記遺伝子座がβ２−ミクログロブリン遺伝子座である請求の範囲第１ ２項記載の方法。

１４、前記ＭＨＣ抗原がクラス■抗原である請求の範囲第１１項記載の方法。

１５、前記損傷が前記構造体の牛体くとも１つにおけるマーカー遺伝子の挿入で ある請求の範囲第１１項記載の方法。

１６゜　前記β２−ミクログロブリンを欠く細胞の選択がクラスＩ　Ｍ）Ｉｃ抗 原のエピトープに対して特異的な細胞毒性物質を用いることによってである請求 の範囲第１３項記載の方法。

１７．２種の異なった構造体を、２段階の形質転換のために使用する請求の範囲 第１１項記載の方法。

１８、前記構造体のそれぞれが、形質転換された細胞の選択のために異なったマ ーカーを含んで成る請求の範囲第１７項記載の方法。

１９、前記マーカーの１つがネオマイシン耐性であり、そして他のマーカーがア シクロバー又はガンシクロバーに対して敏感である請求の範囲第１８項記載の方 法。

２、特許請求の範囲第１項記載の細胞を含んで成る組織。

２１、前記細胞がケラチン細胞である請求の範囲第２０項記載の組織。

２２、創傷を治療するための方法であって、前記創傷に請求の範囲第２１項記載 の組織を投与することを含んで成る方法。

２３、ＤＮＡ構造体であって、哺乳類宿主において発現できるマーカー遺伝子を コードする配列を端に有するＭＨＣ抗原のサブユニットの遺伝子座と相同の配列 少なくとも５０ｂｐを含んで成るＤＮＡ構造体。

２４、前記ＭＨＣ抗原がクラスＩ抗原である請求の範囲第２３項記載のＤＮＡ構 造体。

２５、前記ＭＨＣ抗原がクラス■抗原である請求の範囲第２３項記載のＤＮＡ構 造体。

２６、　ＤＮＡ構造体であって、哺乳類宿主において発現できるマーカー遺伝子 をコードする配列を端に有するβ２−ミクログロブリン遺伝子座と相同の配列少 なくとも５０ｂｐを含んで成るＤＮＡ構造体。

２７、前記マーカー遺伝子が耐抗生物質性である請求の範囲第２６項記載のＤＮ Ａ構造体。

２８、前記相同性がコード領域と少なくとも部分的に適合する請求の範囲第２７ 項記載のＤＮＡ構造体。

２９、前記相同性は、少なくとも２００ｂｐであり、そして前記β２−ミクログ ロブリン遺伝子座のエキソン２〜４を含んで成る請求の範囲第２８項記載のＤＮ Ａ構造体。

３０、染色体遺伝子中に挿入されるマーカー遺伝子を含んで成る胚の幹細胞。

３１、前記マーカー遺伝子が耐６４１８性である請求の範囲第３０項記載の胚の 幹細胞。

３２、前記マーカー遺伝子がβ２−ミクログロブリン遺伝子中に挿入される請求 の範囲第３０項記載の胚の幹細胞。

３３、キメラ性非−ヒト晴乳類を生成するための方法であって： ＤＮＡ構造体が相同組換え法により組込まれるようになる条件下で胚の幹細胞の 染色体に存在する標的遺伝子配列と相同性のＤＮＡ配列少なくとも５０ｂｐ及び マーカー遺伝子を含んで成るＤＮＡ構造体により胚の幹細胞を形質転換せしめ： 選択された細胞を供給するために前記標的遺伝子中に組込まれる前記構造体を含 んで成る胚の幹細胞について選択し；前記哺乳類の胚盤胞の胚胚腔中に前記選択 された細胞を導入し；そして 前記キメラ性哺乳類中に前記胚盤胞を増殖せしめることを含んで成る方法。

３４、前記選択が前記マーカー遺伝子及びポリマラーゼ鎖反応により行なわれる 請求の範囲第３３項記載の方法。

３５、前記ポリマラーゼ鎖反応が２種のプライマーを使用し、ここで１つのプラ イマーは前記構造体内に存在し、そして他の１つのプライマーは前記構造体外に 存在するが、しかし前記標的遺伝子の遺伝子座で存在する請求の範囲第３４項記 載の方法。

３６、前記標的遺伝子がβ２−ミクログロブリンである請求の範囲第３３項記載 の方法。

３７、クラス■の主要組織適合性複合体抗原を欠くことを特徴とする非−ヒト動 物。

３８、前記動物が哺乳類である請求の範囲第３７項記載の動物。

３９、前記哺乳類がマウスである請求の範囲第３８項記載の動物。

４０、機能的なβ２−ミクログロブリンを生成することができず、クラスＩの主 要組織適合性複合体抗原を欠いており、そして成熟ＣＤ８＋Ｔリンパ球を欠くこ とによって特徴づけられるマウス。

浄書（内容に変更なし） 明　細　書 この出願は、１９８９年１１月６日に出願された出願番号第４３１．８７．２号 及び１９８９年７月２５日に出願された出願番号第３８５、６５１号の一部継続 出願である。

本発明の分野は、キメラ性非ヒト晴乳類を創造するために、遺伝子を変性し、そ して不活性化し、すなわち移植を含む細胞療法において普遍的なドナーとして作 用することができる細胞を生成するために相同性組換え法の使用である。

背景 疾患及び感染からを推動物を保護するために、これまで多くの保護システムが開 発されて来た。哺乳類において、免疫システムは、宿主を保護するために多くの 異なったタイプの細胞及び機構による一次防御として作用する。広範囲の種類の 造血細胞が存在し、そして主な保護系はリンパ及び骨髄である。リンパ及び骨髄 系の細胞に起因する免疫システムは、非自己から自己を認識するためにイン　ビ ボで発生される。

免疫システムが自己を攻撃するこれらの異常な情況、たとえ特表千４−５０１５ １０　（３） ばリウマチ様関節炎、紅斑性狼癒及び糖尿病のある形は、外来性物質のみが攻撃 される宿主に対して重要な証拠である。

ウィルス、細菌又は他の病原体の侵入の結果として病気から宿主を保護する保護 機構はまた、異なった哺乳類宿主（同種の宿主でも）から生じる細胞を認識する ことができる。

自己対外来性の認識のためのシステムの一部として、表面膜タンパク質の主要な 組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原が重要な役割を演じる。個々の宿主は、その宿 主と他の宿主を区別するために作用する個人の１対のクラス■及びＩＩ　ＭＩＩ Ｃ抗原を有する。リンパシステムは、自己としてそのようなＭＨＣ抗原の存在の 認識に基づかれる。他の同種宿主からの移植が生じる場合、その移植物が宿主と 適合せず、又は宿主が免疫適合されないなら、その移植物は免疫システムにより 攻撃され、そして破壊される。リンパ球、単球又はその子孫、特に骨髄を含む移 植が行なわれる場合、移植片が外来物として宿主を攻撃し、移植片一対一宿主の 疾患をもたらす。

受容体宿主の細胞が欠失し、損傷を受け又は機能不全である場合、その受容体歯 に細胞を移植したいかも知れない多くの情況が存在する。宿主が免疫保護される 場合、特定の白細胞、特に種々の疾病から宿主を保護することができるＴ−細胞 をトランスフユーズすることに興味がある。宿主が特定の疾病に対する防護を発 生する能力を欠く場合、宿主の保護される免疫システムを補充することができる 特定のＴ−細胞又はＢ−細胞もしくはその前駆体を投与することにまた興味があ るかも知れない。糖尿病の場合、ランゲルバンズ島が欠乏し、バーキンソング病 の場合、ドパミンを分泌する細胞が欠乏し、種々の造血疾病の場合、骨髄細胞が 欠乏し、視覚疾患の場合、網膜上皮細胞が欠乏する他の情況においては、所望す る機能を満たすことができる細胞を供給できることが所望される。細胞を効果的 にするためには、それらは宿主による攻撃から安全であるべきであり、その結果 、それらは免疫システムにより破壊されないで機能することができる。従って、 受容体の免疫システムによる攻撃から安全に存在しながら、適切に機能し、増殖 し、そして分化することができる細胞を生成するだめの効果的な手段を・見出す ことに興味がある。

動物モデルにおいてイン　ビボで種々の生理学的工程を研究することができるこ とにもまた、実質的な興味が存在する。

これらの多くの情況において、特定部位態様で不活性化され又は導入された特異 的遺伝子を有することも所望される。宿主に存在する細胞のすべて又は実質的に 一部が突然変異を受ける場合、種々の工程が研究され得る。さらに、１つの野生 型遺伝子及び１つの突然変異化された遺伝子を有するペテロ接合体は、ホモ接合 性宿主を得るために接合し、その結果、細胞のすべては適切な変性を有するであ ろう。そのような遺伝子的に変性された動物は、薬物をスクリーニングし、生理 学的工程を見出し、新しい生成物を発生し、そして同様のことのために作用する ことができる。

関連文献 哺乳類、たとえばヒト細胞における相同組換えの使用を多くの文献が記載してい る。これらの文献のうち代表的なものは次のものである：　Ｋｕｃｈｅｒｌａｐ ａｔｉなど、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏ、５　：　７１４−７２０．１９８５；Ｓｍ１ｔ ｈｉｅｓ？、Ｃｃ２．、Ｎａｔｕｒｅ　３１ユニ　２３０２３４．　１９８５　 ；　Ｗａｋｅなど、　、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏ。

８　：　２０８０−２０８９．　１９８５　；　Ａｙａｒｅｓなど、　、Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ　１１１　：　３７５−３８８、　１９８５　；　Ａｙａｒｅｓなど 、　、Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏ、７　：　１６５６−１６６２゜ａｎｄ　Ｃ ａｐｅｃｃｈｉ、　Ｃｅ１ｌ　５１：　５０３−５１２．　１９８７；Ｎａｎｄ ｉなど０、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：３８４５− ３８４９．　１９８８；ａｎｄｔｓｃｈｍａｒ＋？、Ｃ＆、　、Ｎａｔｕｒｅ　 ３３０　：　５７６−５７８　；　Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｃａｐｅ−ｃｃｈｉ 、　Ｃｅ１ｌ　５１　：　５０３−５１２．１９８７　；　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ？ 、に＆、　、Ｃｅ１ｌ　５６：３１６−３２１．１９８９はそれぞれ、胚の幹細 胞における特異的遺伝的突然変異を創造するために及び生殖系にこれらの突然変 異をトランスファーするために相同組換えを用いる種々の観点を説明する。相同 組換えの出来事をスクリーニングするために使用されるポリマラーゼ鎮反応は、 Ｋｉｍ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６　：　８８８７〜８９０３．１９８ ８　；及びＪｏｙｎｅｒ久ど０、Ｎａｔｕｒｅ　３３８：　１５３〜１５６．１ ９８９に記載される。ネオマイシン遺伝子を駆動するために突然変異体ポリオー マエンハンサ−及びチミジンキナーゼプロモーターの組合せは、Ｔｈｏ−１ａｎ ｄ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（４６９〜４９７ページ）：及びＬｉｎｎｅｙ　ａｎ ｄ口ｏｎｅｒｉｙ、　Ｃｅ１ｌ　３５：６９３〜６９９．１９８３により胚の幹 細胞及びＥＣ細胞の両者において活性化することが示された。

発明の要約 突然変異誘発された哺乳類細胞が相同組換え法により生成され、ここで前記細胞 は、ＭＨＣＨＣＯ３失の結果として普遍的なドナー細胞として使用され得又はそ の細胞はこの突然変異を担持するキメラ浦乳類を生成するために使用され得る胚 の幹細胞である。特に、少なくとも１つのＭＨＣ抗原鎖、たとえばβ２−ミクロ グロブリンの少なくとも１つの対立遺伝子を不活性化することによって、ＭＨＣ ＨＣＯ３現のための減じられた能力を有し、そしてＭＨＣＨＣＯ３なくとも１つ のタイプの発現の完全な排除のためにさらに使用され得る細胞が生成され得る。

ＭＨＣＨＣＯ３じられた発現を有するその得られた細胞は、宿主（受容体）の免 疫攻撃のためのマーカーを欠く普遍的なドナーとして使用され得る。その細胞は また、他の細胞と相互作用するためにイン　ビトロでも使用され得る。この気質 を担持するキメラ動物は免疫不全の研究に使用され得る。

特定の態様の説明 相同組換え法は、部位特異的態様による遺伝子、特にＭＨＣＨＣＯ３連する遺伝 子の不活性化又は変更のために使用される。細胞の性質に依存して、少なくとも １つのコンビテン）ＭＨＣ遺伝子を欠く細胞は、同種宿主へのドナーとして使用 され得又は胚の幹細胞の場合、キメラ晴乳類宿主の生成に使用され得る。

少なくとも１種の、好ましくは両種のＭＨＣＨＣＯ３ブ、ユニットのコピー、よ り好ましくはβ２−ミクログロブリンの不活性化に特に興味がある。胚の幹細胞 のβ２−ミクログロブリンにおける突然変異が生成される場合、その胚の幹細胞 に由来する哺乳類宿主が免疫システムの研究及びそのシステムにおけるクラスＩ 　ＭＨＣＨＣＯ３割の研究のために使用され得る。少なくとも１種のＭＨＣＨＣ Ｏ３とえばクラス■又はクラス■、好ましくはクラス■抗原を欠く細胞（該細胞 は種々の宿主において種々の機能を作動せしめることができる）を供給する方法 が特に興味の対象である。この方法は、β２−ミクログロブリン遺伝子、クラス ■又はクラスｎ　ＭＨＣＨＣＯ３−サブユニット又はクラスＩＩ　ＭＨＣＨＣＯ ３−サブユニットに関連する遺伝子座の１つに関連するＤＮＡを有する予定され た種の哺乳類細胞、特に正常な細胞のトランスフェクションを包含する。ヒトク ラスｎ　ＭＨＣＨＣＯ３ＬｉＤＲ，叶及び０口であり、ここでＤＲが主要な興味 の対象のものである。

ＤＮＡは、機能的なＭＨＣ抗原分子の発現を阻ｔｈするために、活性遺伝子の少 な（とも１つのコピー、通常その両コピー中への損傷の導入により特定の遺伝子 座でその遺伝子の少なくとも一部を包含するであろう。その損傷は、挿入、欠失 、置換又はそれらの組合せであり得る。損傷が不活性化される異されていない標 的遺伝子のコピーを有する細胞が変性され、そして第２の形質転換にゆだねられ 、ここで前記損傷は第１の損傷と同じであっても良く又は異なっていても良く、 通常異なっており、モして欠失又は置換が関与される場合、損傷又は対立遺伝子 の少なくとも一部がオーバーラツプするかも知れない。その得られた形質転換体 は機能的な標的抗原の存在についてスクリーンされ、そして細胞中のＤＮＡが、 野生型の標的遺伝子の不在を確保するされにさらにスクリーンされ得る。他方、 表現型に関するホモ接合度が突然変異のためにペテロ接合性である宿主を繁殖す ることによって達成され得る。

形質転換にゆだねられ得る細胞はいづれか対象の哺乳類細胞であり、これは細胞 療法、研究、４７　ビトロでの他の細胞との相互作用又は同様のことに使用され 得る。特定の興味ある細胞は中でも、ランゲルバンズ島、ドパミンを分泌するこ とができる副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、Ｔ−１７ ７３球、ニューロン、ダリア細胞、神経節細胞、網膜細胞、胚の幹細胞、肝細胞 、骨髄細胞及び筋芽（筋肉）細胞を包含する。

これらの細胞は、特定の機能を達成し、そして哺乳類宿主中に導入され又は研究 又は他の目的のために使用されるために選択されるであろう。上記細胞のいづれ かのための前駆体として作用する幹細胞もまた興味の対象であり、そして前記幹 細胞は特定の系統にすでに寄与される起源の前駆体又は前養に長期間維持され得 、そして宿主中に導入され得る表皮細胞、たとえばケラチン細胞及び副腎上皮細 胞及び筋芽細胞及び造血細胞及び他の細胞が特に興味の対象である。

胚の幹細胞に関しては、胚の幹細胞系が使用され得、又は胚の幹細胞が宿主から 新たに得られる。この細胞は、適切な線維芽細胞−支持細胞層上で増殖され又は 白血病阻害因子の存在下で増殖され、そして次に突然変異のために使用され得る 。

特定のＭＨＣＨＣＯ３つの又は両方のコピーを不活性化するために使用される方 法は類似し、配列、使用される選択可能なマーカー及びＭＭＣ抗原の不在を同定 するために使用される方法の選択において主に異なり、但し類似する方法が特定 の抗原の発現の不在を確保するために使用され得る。その方法は類似するので、 β２−ミクログロブリン遺伝子の不活性化が例として使用されるであろう。実質 的に同じ方法（但し、他の遺伝子配列を有する）がクラスＴＩ　Ｍｌ（Ｃ抗原の α−及びβ−サブユニットのために十分であろうことが理解される。

細胞中への損傷の所望する導入を提供するＤＮＡ構造体が使用され得る。構造体 は、その構造体の調製に使用され得る突然変異誘導された配列以外の機能的な作 用、たとえば増幅、宿主細胞の形質転換及び宿主細胞中への構造体の組込みを包 含するように変性され得る。使用され得る技法は、リン酸カルシウム／ＤＮＡ同 時沈殿物、核中へのＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーショ ン、損なわれていない細胞との細菌性プロトプラスト融合、トランスフエクショ ン又は同様な技法を包含する。ＤＮＡは一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、弛緩 した又は超らせんＤＮＡであり得る。哺乳類細胞を形質転換するだめの種々の技 法に関しては、Ｋｅｏｗｎなど、　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙを参照のこと。

構造体を標的にするための相同配列は、１又は複数の欠失、挿入、置換又はそれ らの組合せを有する。たとえば、β２−ミクログロブリンは、１つの部位での欠 失及び選択のために使用され得る遺伝子を包含する他の部位での挿入（ここで挿 入された遺伝子の存在は不完全な不活性タンパク質生成物をもたらすであろう） を包含することができる。好ましくは、置換が用いられる。挿入された遺伝子の ためには、マーカー、たとえば耐抗生物質性、たとえば耐ネオマイシン性、たと えば耐６４１８性を供給する遺伝子が特に興味の対象である。

欠失は、少なくとも約５０ｂｐ、より普通には少なくとも約１００ｂｐであり、 そして一般的に約２０ｋｂｐ以上でなく、ここで欠失は通常コード領域の少なく とも一部、たとえば１又は複数のエキソンの一部、１又は複数のイントロンの一 部を包含し、そして端の非コード領域の一部、特に５′−非コード領域（転写調 節領域）の一部を含んでも良く又は含まなくても良い。従って、相同領域は、コ ード領域を越えて５′−非コード領域又は他方、３′−非コード領域に延長する ことができる。挿入は一般的に１ｏｋｂｐを越えず、普通５　ｋｂｐを越えず、 一般的に少なくとも５０ｂｐ、より普通には少なくとも２００ｂｐである。

相同配列は、少なくとも約１００ｂｐ　、好ましくは少なくとも約１５０ｂｐ　 、より好ましくは少なくとも約３００ｂｐ〜一般的に約２０ｋｂｐ以下、通常１ ０ｋｂｐ以下、好ましくは５　ｋｂｐ以下の標的配列を包含し、二重クロスオー バー組換えを提供するために挿入及び／又は欠失の反対側上に少なくとも約５０ ｂｐの標的配列を有する。

標的細胞構造体から上流及び／又は下流に、二重クロスオーバーが生じたかどう かの同定を提供する遺伝子が存在する。

このためには、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子が使用され得る 。なぜならば、チミジンキナーゼ遺伝子の存在は、機能的なＨ３Ｖ−ｔｋ遺伝子 を含む細胞に対するそれらの細胞毒性効果のためにヌクレオシド相同体、たとえ ばアシクロバー（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）又はガンシクロバー（Ｇａｎｃｙｃｌｏ ｖｉｒ）の使用により検出され得るからである。これらのヌクレオシド相同体に 対する感受性の不在は、チミジンキナーゼ遺伝子の不在を示し、そして従って、 二重クロスオーバーの出来事がまた生じている相同組換えが生じた場所を示す。

β２−ミクログロブリン遺伝子中に挿入されるマーカー遺伝子の存在は、宿主ゲ ノム中への標的構造体の組込みを確立する。しかし、なから、ＤＮＡ分析が、相 同又は非相同組換えが生じたかどうかを確立するために必要とされるであろう。

これは、挿入体のためのプローブを使用し、そして次に、構造体のフランキング 領域を越えて延長するβ２−ミクログロブリンの存在のために挿入体を端に有す る５′及び３′領域を配列決定し、又はそのような欠失が導入される場合、欠失 の存在を同定することによって決定され得る。

ポリマラーゼ鎖反応は、相同組換えの存在を決定することにおいて都合良く使用 され得る。標的遺伝子座で、構造体内の配列に相補的であり、そして構造体外の 配列に相補的であるプライマーが使用され得る。この方法においては、相同組換 えが生じる場合、相補的鎖に存在する両方のプライマーを有するＤＮＡ重複体が 単に得られる。プローブ配列又は予測される大きさの配列の存在を示すことによ って、相同組換えの存在が支持される。

構造体は、哺乳類宿主細胞において機能的である複製システムをさらに包含する ことができる。はとんどの場合、これらの複製システムは、ウィルス、たとえば ＳＶ４０、エプスタイン−バールウィルスウィルス、乳頭腫ウィルス、アデノウ ィルス及び同様のウィルスの複製システムを包含するであろう。

マーカー遺伝子が、その遺伝子の性質に依存して、挿入体及び／又はフランキン グ遺伝子として包含される場合、それは野生型の転写調節領域、特に転写開始調 節領域又は異なった転写開始領域を有することができる。遺伝子が、転写開始領 域が哺乳類宿主細胞の転写機構により認識されない宿主からである場合いっても 、異なった転写開始領域が必要とされるであろう。この領域は、構造的又は誘発 的、好ましくは誘発的であり得る。広範囲の種類の転写開始領域が単離され、そ して種々の遺伝子により使用されて来た。哺乳類宿主からのメタロチオネイン− ■及び■のプロモーター、チミジンキナーゼ、β−アクチン、免疫グロブリンプ ロモーター、ヒトサイトメガロウィルス、プロモーター及びＳＶ４０プロモータ ーが特に興味あるプロモーターである。これらのプロモーターの他に、野生タイ プのエンハンサ−が存在し、又は異なった遺伝子からのエンハンサ−がプロモー ター領域に連結され得る。

構造体はさらに、構造体を調製し、個々の操作の後、クローンし、分析、たとえ ば制限地図の構成又は配列決定を可能にし、続いてクローンを拡張、そして追加 の操作のためにプラスミドを単離することに使用するための原核生物、特にＥ。

−１ＩＪについての複製システムを包含する。必要な場合、異なったマーカーが 細菌の形質転換体を検出するために使用され得る。

ベクターが調製された後、それは細菌配列の欠失及び線状化によりさらに操作さ れ、ここで短い、一般的に約５００ｂＰを越えない、一般的には約５０〜３００ ｂｐの欠失が相同配列に提供され得る。短い欠失は一般的に、標的構造遺伝子の １つの又は他の端の近くに存在するであろう。

構造体が調製され、そして操作され、そして所望しない配列、たとえば所望しな い細菌配列がベクターから除去された後、ＤＮＡ構造体が標的細胞中に容易に導 入される。すでに指摘されたように、標的細胞中へのＤＮＡの導入のためのいづ れかの便利な技法が使用され得る。標的細胞の形質転換の後、多くの標的細胞が 、前で指摘したように、陽性及び／又は陰性マーカー、たとえばネオマイシン耐 性及びアシクロバー又はガンシクロバー耐性マーカーにより選択される。次に、 所望する表現型を示すこれらの細胞がさらに、制限分析、電気泳動、サザン分析 、ポリマラーゼ鎖反応又は同様の手段により分析され得る。標的遺伝子部位での 損傷の存在を示すフラグメントを同定することによって、２種の標的遺伝子のコ ピーの１つを不活性化するために相同組換えが生じた細胞を同定することができ る。

第２構造体は、選択のために７７カー必ずしも必要としない事において第１構造 体と異なる。なぜならば、細胞の表面上での標的ＭＨＣ抗原の不在がマーカーと して使用され得るからである。従って、標的遺伝子を変性し、そして不活性化す るために損傷として挿入、欠失又は置換を再び使用することができる。同様に、 特定のクラスＩＩ　ＭＩＩＣ抗原の発現の不在の証拠として、その表面上でのク ラスＩｒＭ肛抗原の不在を検出することができる。

コピーの１つが不活性化された細胞の形質転換が、形質転換の前記方法と同じ又 は異なった手段で行なわれ得る。次に、得られる形質転換された細胞は、細胞の 表面上での標的ＭＨＣ抗原の不在により選択され得る。これは種々の方法で達成 され得る。たとえば、抗原を有するいづれかの細胞を殺害するために補体と共に 標的ＭＨＣ抗原のいづれかのエピトープに対する抗体を使用することができる。

他方、適切な抗体、特にモノクローナル抗体と毒素、たとえばリシンのＡ鎖、ア ブリン、ジフテリア毒素又は同様の毒素との接合体を使用することができる。抗 体が標的抗原を含む細胞を除去するために使用され得るアフィニティークロマト グラフィーが使用され得る。生存するその得られた細胞は、それらの表面上に少 なくとも１つのＭＨＣ抗原も有すべきでなく、そして野生型細胞としてイン　ビ ボで導入される場合、移植片拒否反応を受けるべきでない。

次に、その得られた細胞は、クラスＩ　Ｍｌ（Ｃ抗原をその表面上に実質的に有 さないことを確保するためにスクリーンされるであろう。これは、クラスＩ　Ｍ ＨＣ抗原を欠く細胞について選択することによって上記のようにして達成され得 る。次に、細胞は、拡張のために適切な栄養培地において増殖せしめられ、そし て種々の方法に使用され得る。たとえばケラチン細胞に関しては、その細胞は熱 傷の場合、皮膚の置換のために使用され得、ここでケラチン細胞は適用の前、連 続した層を形成するために増殖され得る。同様に、ケラチン細胞は、他の部位で 使用するために宿主から除去された皮膚を置換するために形成手術の場合に使用 され得る。ケラチン細胞のための他の使用は、癒性遺瘍における移植を包含する 。

ランゲルバンズ島の場合、それらはインシュリン生成のために宿主中への挿入の ために、増殖せしめられ、そしてカプセル又は他のものに導入され得る。副腎皮 質細胞の場合、それらは視覚疾患、たとえば黄斑変性を治療するために眼の網膜 上空間中に注入され得る。免疫細胞の場合、それらは免疫欠損を治療するために 血管又は他の場所に注入され得る。筋芽細胞の場合、それらは筋肉るいそう、た とえばＤｕｃｈｅｎｎｅ’　ｓ筋ジストロフィーを治療するために種々の部位で 注入され得る。

細胞の性質、包含される療法及び疾患に依存して、細胞はフィルムとして使用さ れ、特定の部位での維持のために容器に導入され、又は不活性マトリックスに含 浸され又はマトリックスに関係なく含浸された固体塊状物として使用され得る。

投与される細胞の数は、特定の用途及び細胞が投与される態様に依存して広く異 なるであろう。

投与は、適切な位置での注射、局部的な適用、切開及び配置によってである。

胚の幹細胞に関しては、突然変異誘発の後、その細胞は適切な培地、たとえばウ シ胎児血清増強されたＤＭＥＭにおける支持細胞層上にプレートされ得る。構造 体を含む細胞は、選択培地を用いることによって検出され得、そしてコロニが増 殖するために十分な時間の後、コロニは摂取され、そして相同組換えの発生につ いて分析され得る。前で記載したように、ポリマラーゼ鎮反応は、構造体配列を 伴って及び伴わないで、但し標的遺伝子座でプライマーと共に使用され得る。次 に、相同組換えを示すこれらのコロニーが胚操作及び胚盤胞注入のために使用さ れ得る。胚盤胞は、排卵後３３５日での子宮をフラッシュすることによって４〜 ６週目の排卵過度化された雌から得られた。次に、胚の幹細胞がトリプシン処理 され、そして変性された細胞が胚盤胞を含む小滴に添加され得る。

少なくとも１個、通常少なくとも１０個〜約３０個までの変性された胚の幹細胞 が胚盤胞の胞胚腔中に注入され得る。注入の後、少なくとも１個〜約１５個の胚 盤胞が偽妊娠の雌の個々の子宮角に戻される。次に、ある期間放置され、そして 得られた同腹子が構造体を有する突然変異細胞についてスクリーンされる。胚盤 胞が、形質転換されたＥＳ細胞から種々の百分率で選択される。胚盤胞及びＥＳ 細胞の種々の表現型を供給することによって、キメラ性子孫が容易に検出され得 る。特に有用な表現型は、いづれの表現型でも使用され得るが、着色した毛のも のであり、又は所望により、変性されたゲノムＤＮＡの存在についてプローブす る遺伝子型を目ざすことができる。

子犬は、育成量中への胚盤胞の導入後１６〜１８日で通常生まれるであろう。キ メラ動物は、形質転換されたゲノムの存在についてスクリーンされ、そしてその 形質転換された雌及び雄が接合される。ホモ接合性子孫はクラスＩ　ＭＨＣ細胞 及び成熟Ｃロ８Ｔ−細胞（ＴＣＲαβ）を欠く。

哺乳類は、いづれか非ヒト畦乳類、たとえば実験用動物、家畜、ペット、等であ り得る。

次の例は例示的であって、本発明を限定するものではない。

マウス上皮ケラチン細胞を新生マウスの皮膚から得る。その皮膚サンプルを血清 を含まない培体によりすすぎ、そして小さなフラグメントに切りきざむ。そのフ ラグメントをトリプシンにより処理し、そしてその得られた単一細胞懸濁液を洗 浄し、そして３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層上にプレートする。Ｅ　Ｇ　Ｆ　（５ ｏｇ／　ｍｌ、）を５日目の最後で添加する。その細胞を、ヒドロコルチゾン（ １０−’Ｍ）　、コレラ毒素（１０−’Ｍ）、インシュリン（５ｏｇ／ｍｊり　 、）ランスフェリン（５ｏｇ／ｒｒｄｌ）、Ｔ　３　（２Ｘ　１０−”Ｍ）及び ２０％ウシ胎児血清により補足された培地に維持する。未使用細胞は液体窒素中 で貯蔵する。

ヒト上皮ケラチン細胞を、ケラチン細胞の源として包皮を除かれた皮膚から新鮮 な皮膚サンプルとして単離する。次にそのサンプルを上記のようにして実質的に 処理する。

離され、そして特徴づけられたようなマウス及びヒトβ２−ミクログロブリン遺 伝子を、相同性のために使用する。

不活性化ベクター１の構成 不活性化ベクターを、β２−ミクログロブリン遺伝子の第２、第３及び第４エキ ソンを包含するゲノムＤＮＡの４ｋｂのそして選択可能なネオマイシンホスホト ランスフェラーゼ（ｎｅｏＲ）遺伝子を挿入する。そのｎｅｏ′１遺伝子はｐＳ Ｖ２．、。

［５ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１　 ：　３３２．　（１９８２））から得られる。その得られたベクターを８２ＫＯ １と命名する。

不活性化ベクター２の構成 第２ベクターの構成のための出発プラスミドは８２ＫＯ１である。この場合、単 純ヘルペスウィルスタイプ１チミジンキナーゼ遺伝子を、８２ＫＯ１の旧ｎｄｌ ＩＩ部位で挿入する。

第１又は第２段階における形質転換のために使用されるＤＮＡは、クローニング プラスミド８２ＫＯ１からのフランキング相同配列及び細菌プラスミドＤＮＡを 含まないｔｋ遺伝子を一端で有する同じ配列を有する挿入された配列を含んで成 る。そのＤＮＡフラグメントをエタノール沈殿法により精製し、そして０．２２ ミクロンのフィルターを通すことによりきれいにする。そのＤＮＡを従来の手段 により単離し、そしてマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、　Ｃｅ１ ｌ　２２：　４７９〜４８８（１９８０）によりケラチン細胞中に導入する。約 ５〜５０コピーのＤＮＡ構造体をそれぞれの核中に注入する。次にその細胞を、 ２００、ｇ／ｍ！！のＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、　Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｓ ）を含む選択培地中において増殖せしめる。第２構造体のためには、その細胞を また、ガンシクロバー（Ｓｙｎｔｅｘ　Ｃａｒｐ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｃｙ、　 ＣＡ）又はアシクロバー（Ｂｕｒｒｏｗ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ。

ＮＣ）にプレートする。コロニーからの細胞を単離し、そしてポリマラーゼ鎖反 応及びサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析する。不活性化される β２−ミクログロブリンの１つのコピーを示す細胞を、第２コピーをノックアウ トするために使用する。

単一の不活性化されたβ２−ミクログロブリン遺伝子を有する上記から得られた 細胞に、変性された８２ＫＯ２プラスミドを上記のようにしてマイクロインジェ クトし、そしてガンシクロバー又はアシクロバー耐性細胞を単離する。クラスＩ 遺伝子発現を欠く細胞を、その細胞とβ２−ミクログロブリン及び補体に対して 特異的なモノクローナル抗体と共にＰａｒｉｓｈなど、（１９７４）　Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４　：　８０８により記載されるように組合すことによっ て単離する。得られた生存細胞を選択培地中で増殖せしめ、そして前記と同じモ ノクローナル抗体のアフィニティーカラムを通す。そのカラムは、Ｏａｒ　ｌｏ ｗａｎｄＬａｎｅ、　１９８８．　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣＳＨＰｒｅｓｓにより記載されるようにして調 製する。細胞のサザンプロット分析を行ない、組込みの適切な遺伝子座を確立す る。次にその細胞を拡張し、そして追加の使用のために貯蔵する。

ケラチン細胞の単層の生成 りラスＩ　ＭＨＣを欠く得られた細胞を用いて、Ｒｈｅｉｎ智ａｌｄ　ａｎｄＧ ｒｅｅｎ、　Ｃｅ１ｌ　６　：　３３１〜３４３．１９７５により記載されてい るようにしてケラチン細胞の単層を増殖せしめる。この層を、Ｒｈｅｉ−ｎｗａ ｌｄ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ、　１９７５　、前記により記載されるようにして同 種マウス上に移植する。細胞をその表面に付着せしめ、そして保護皮膚層を供給 するために増殖せしめる。

β２−ミクログロブリンについての上記と同じ方法に従って、ＩＩＬＡ−ＯＲ遺 伝子を、宿主細胞の）ＩＬＡ−ＯＲ遺伝子のａ−サブユニットを端に有する相同 配列を用いることによって不活性化することができる。この場合、クラスｎ　Ｍ ＨＣ抗原を有する又はそのような抗原の発現を誘発せしめる能力を有することが できる細胞が、細胞性免疫応答と関係する主要なりラス■抗原の発現から妨げら れる。

次の研究においては、胚の幹細胞を、β２−ミクログロブリン遺伝子の１つとの 相同組換えにより変性した。

ＢａｍＨＩフラグメントをｐＵｃ１９中にサブクローンした。２種のによる消化 により、続＜Ｔ４ポリマラーゼによる処理により除去し、そして再連結した。ユ ニークＣＩａＩ部位を、ＥｃｏＲＩによる部分消化、続くタレノウポリマラーゼ による処理及びＣＩａＩリンカ−との連結によりエキソン２に創造した。単純ヘ ルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＦＩＳＶ−ｔｋ）プロモーター及び ポリオーマエンハンサ−により駆動されるネオマイシン遺伝子を含む、プラスミ ドｐＭｃＩ　Ｎｅｏ（Ｋｉｍ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔ−一を通して挿入した。２種の プラスミド、すなわちＣ６５，２，３及びＣ６５，５，９を得た。ここでそれら のプラスミドは、β２−ミクログロブリン遺伝子の挿入されたフラグメントに関 して挿入されたフラグメントの転写配向において異なった。これらの個々の５’ ＸｈｏＩ〜Ｋｐｎｌフラグメントを、本発明の実験に使用される標的ベクターを 得るためにｐＵｃ１９中にクローン化した。プラスミドＣ８４，４Ｂに右いて、 ネオマイシン及びβ２ｍプロモーターの５′から３′への配向は同一である。反 対の配置がプラスミドＣ８４，２０に生じる。

ＥＳ細胞の培養、エレクトロポレーション及び選択ＥＳ細胞系Ｅ１４ＴＧ２ａ　 （Ｓａｗｉｃｋｉなど、　、Ｎａｔｕｒｅ　２９４　：　４５０〜４５１、　１ ９８１＞を、　Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇなど、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、８６　：　５０８４〜５０８８．１９８９に記載されているようにして 、ミドマイシン処理された一次胚の線維芽細胞−支持細胞層上で培養した。胚の 線維芽細胞を、ネオマイシントランス遺伝子のためにホモ接合性である雄と１４ 〜１７日早く対合されたＣ５７ＢＬ／６雌からの胚から調製しくＥｖａｎｓ　ａ ｎｄ　Ｋａｕｆｍａ、ｎ、　Ｎａｔｕｒｅ壜狙：１５４〜１５６　；　１９８１ ）　；これらの細胞はＧ４１８を含む培地において増殖することができる。エレ クトロポレーション条件は、前に記載された条件に類似した（Ｄｏｅｔｓｃｈｍ ａｎなど９、Ｎａｔｕｒｅｙ川：５７６〜５７８．１９８７）。ＥＳ細胞をトリ プシン処理し、４Ｘ１０’　／ｄの濃度で培養培地に再懸濁し、そして最初の実 験において］、２　ｎ　Ｍの濃度で及び第２の実験において５ｎＭのＤＮ７４度 で標的ＤＮＡの存在下でエレクトロポレーションた。１５０〜２５０μＦの容量 でもって３００Ｖの電圧が、長さ５ｍｍ及び断面積１００ｍｍ２のエレクトロポ レーションセルにより最適であることが見出された。５Ｘ１０’個のエレクトロ ボレートされた細胞を、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．１　ｍＭの２ −メルカプトエタノールにより補足されたダルベット変性イーグル培地（ＤＭＥ Ｍ）の存在下で１００ｍの皿におけるミドマイシン処理された線維芽細胞上にプ レートした。培地を、２００ｐｇ／ｉのＧ４１８を含む培地により、エレクトロ ポレーションの後２４時間で交換した。

Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞コロニーの分析 エレクトロポレーションの後１０〜１４日での眼に見えるＥＳコロニーを、ポリ マラーゼ鎮反応（ＰＣＲ，）を用いての分析のための細管ピペットにより採取し た。それぞれの採取されたコロニーの半分を、ミドマイシン処理された支持細胞 によりすでに接種された２４−ウェルプレートに蓄えた。他の半分（３〜４のプ ールに組合された）を、ＰＢＳ約０．５ｍｊ２を含むＥｐｐｅ−ｎｄｏｒｆ管に 移し、そしてＰＣＨによる相同組換えのために分析した。ＰＣＲ反応のための条 件は、Ｌｉｎｎｅｙ　ａｎｄ　Ｄｏｎｅｒｌｙ。

Ｃｅ１ｌ　３５　：　６９３〜６９９．１９８３により実質的に記載されている 。

ＥＳ細胞をペレット化し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　５ｉｔｌに再懸濁し、そ して個々の管に水５５Ｉ！！の添加により破壊した。ＤＮアーゼを、９５℃で１ ０分間、個々の管を加熱することによって不活性化した。５５℃で３０分間プロ テインナーゼＫによる処理の後、個々の溶解物３０Ｉ１１を、ＰＣＲ緩衝液、個 々のプライマ１、５１ｇ、　３　Ｕ（７）　Ｔａｑホ’Ｊ　７５−セ、１ｏ％Ｄ ＭＳＯ及びソレソれ０．２　ｍＭのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ及び ｄＴＴＰを含む反応混合物２０ｄを含む管に移した。ＰＣＲを、９２℃で６５秒 間の溶融及び１ｏ分間のアニーリング及び６５℃での拡張時間を伴って、Ｋｉｍ 　ａｎｄＳｍｉｔｈｉｅｓ、　躾艦、１９８８により前記に記載される方法の後 、設計されたサーモサイクラ−を用いて５５サイクルの間行なった。

２種のオリゴヌクレオチド、すなわちＴＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＴＡＧＧＡＣ 及びＧＡＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＴＣＧは、ネオマイシン遺伝子の開始 コドンの６５０個の塩基の３′側に位置する配列及びβ２ｍ遺伝子のエキソン３ に位置する配列にそれぞれ対応する。反応混合物２０！ｉをアガロースゲル上で 電気泳動し、そしてナイロン膜（Ｚｅｔａ　Ｂｉｎｄ）に移した。フィルターを 、β２ＩＴｌ遺伝子の３２Ｐによりラベルされた４５０ｂｐのＢｃｏＲＩ−Ｋ　 ｐｎ　ＩフラグメントにゲノムＤＮＡを、ＥＳ細胞、完全な新生マウス及びマウ スの尾から従来の方法により調製した。ＤＮＡを製造業者により指図されたよう な制限酵素により消化し、そしてフラグメントを０．７％のアガロースゲル上で 分離した。ＤＮＡをナイロン膜に移し、そして上記３２Ｐ−ラベル化フラグメン トによマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ　Ｈａｒ ｂｏｒ、　ＭＥ）又はＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ（Ｒａｌｅｉｇｈ、　ＮＣ） のいずれかから購入した。

Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞を、生後３〜４週目の過剰排卵された雌から得た。子宮を 、排卵後３．５日目にＭ２媒体（Ｊｏｙｎｅｒなど５、Ｎａｔｕｒｅ　３３８． １５３〜１５６．１９８９）によりフラッシュした。胚盤胞を集め、新鮮なＭ２ 媒体により数回洗浄し、そしてパラフィン油下でのＭ２の１００４小滴中に置い た。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、新鮮なりＭＥＭ媒体により１度洗浄し、そし て約２Ｘ１０’個の細胞／ｒｎｌに希釈した。１０〜１５個のＥＳ細胞を、個々 の胚盤胞の胞胚腔中に注入した。注入の後、６〜９個の胚盤胞を、精管切除され た雄と前もって交尾された偽妊娠性雌の個々の子宮角に戻した。Ｃ５７ＢＬ／６ 　ＸＤＢＡＰ、及びＣ５７ＢＬ／６　ＸＣＢＡＦ、マウスとも、卓越した育成母 であることがわかっており、そして１００％に近い妊娠割合を示し、そして小さ な同産児の獲得を可能にする。

標的ＥＳ細胞の単離及び特徴化 ２種の独立した標的実験を行なった。それぞれにおいて、２Ｘ１０’個の細胞を 、得られたＤＮＡの存在下でエレクトロポレートし、そして次に０１４を含む培 地で培養した。約２週間後、Ｇ４１８耐性コロニーが容易に現われた。次に、個 々のコロニーの一部を２４−ウェルプレートの個々のウェルに移し、そして残る 部分をＰＣＲ分析のために２〜４種の他のコロニーからの部分と共にプールした 。最初の実験において、合計１００個の６４１８耐性コロニーを含む３２個のブ ルーのうち１つのプールが陽性のＰＣＲシグナルを付与した。この陽性のプール に寄与した３種の個々のコロニーをＰＣＲによりそれぞれ分析し、そして陽性ク ローン、Ｂ５３９Ｂを同定した。第２実験で得られた１３４６４１８耐性コロニ ーの類似する分析はまた、クローン、Ｂ５２２Ａを付与し、これは、ＰＣＲにゆ だねられる場合、好結果をもたらす標的を示す９１０ｂｐのＤＮＡフラグメント を生成した。

β２ｍ遺伝子（該遺伝子は常染色体であり、そして２つのコピーで存在する）の １つのコピーの標的化された破壊を確かめるために、２種のＰＣＲ陽性クローン 、Ｂ５３９Ｂ及びＥＳ２２Ａを拡張し、そしてそれらのＤＮＡを単離し、そして 次に、β２１１’ｌ遺伝子の第２エキソン及び第１イントロンの一部からの配列 を検出するプローブを用いて、サイン法により分析した。

制限酵素Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｂａｎ＋ＨＩ及びＫｐｎＩにより得られたパターンは 、β２ｍ遺伝子の２種のコピーのうち１つがＰＣＲ−陽性クローンにおいて計画 された態様で破壊されたかどうかを予測するパターンに匹敵する。すなわち、未 熟細胞に存在するＤＮＡフラグメントと大きさが同一の１つのＤＮＡフラグメン ト（但し、ＰＣＲ陽性クローンにおいて低められた強度のもの）が、すべての３ 種の酵素による未処理の細胞に存在した。相同組換えの出来事のために予測され る大きさの追加のフラグメントは、ＰＣＲ−陽性クローンにおいてのみ存在した 。組換えによる第２エギソンにおけるネオマイシン遺伝子の挿入は、生来の遺伝 子座における同等のフラグメントより遺伝子座中に導入し、１．０．６ｋｂｐ〜 ９００ｂｐのβ２ｍプローブによ伝子座との間での交差により予測されるように 、長さ７ｋｂでに導入されなかったことを示す。この観察は、細胞系ＥＳ２２Ａ られるＤＮＡの挿入されたネオマイシン遺伝子との間を、たぶん交差中間体の分 枝移動の後、分解したことを示す。５′交差部位は異なるが、変性された両細胞 系は今、エキソン２におけるネオマイシン遺伝子の挿入により計画された手段で 破壊されたβ２ｍ遺伝子を含む。ネオマイシン遺伝子のためのプローブによるオ ー　トラジオグラフィーのために使用されるフィルターの再ハイブリダイゼーシ ョンは、ハイブリダイズするバンドのみが構造体の構造により予測されるバンド であることを示す。

標的ＥＳ細胞のキメラ性子孫 不活性化されたβ７ｍ遺伝子を担持する２種のＥＳ細胞は、マウス生殖系中への この突然、変異の導入を可能にすることが予測される。最後に、Ｃ５７ＢＬ／６ 胚盤胞中に１０〜１５個の細胞を注入した。胚を偽妊娠の雌中に再移植した。Ｅ Ｓ細胞系［Ｅ１４ＴＧ２ａは１２９１０１ａの胚とから単離されるので、それ及 びそれに由来するすべての細胞系は、このマウス株の特徴を示す毛の色のマーカ ーを担持することが予測される。これらは、アグーヂの遺伝子座で優性Ａ”対立 遺伝子、Ｃ−遺伝子座で劣性チンチラの対立遺伝子及びｐ−遺伝子座で劣性ｐ一 対立部分へのＥＳ細胞の寄与がアグーチの毛をもたらす。ＥＳ細胞起源のメラノ サイト（及び従ってｐ及びｃ″ｈ突然変異物を担持する）が移動した毛のうがク リーノ、色の毛を作り出す。

両方のこれらの毛の色は、非アグーチＣ５７ＢＬ／６宿主胚盤胞に由来する子供 に見られる濃い黒色の毛と容易に区別される。

生存する子供の７０％以上がキメラ体である。標的β２ｍ遺伝子座の特徴を示す ６．ＩＸｂａｌバンドの強度は、変性されたＥＳ細胞がこの動物の組織に広範に わたって貢献したことを生後３〜４週目のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、ＰＭＳ及 びｂ　ＣＧの連続した注入により過剰排卵せしめ、そして類似する株の繁殖用雄 により受精せしめた。受精の４日後、雌のマウスを殺害し、そして胚盤胞をＭ９ 培地により子宮をフラッシュすることによって得た。集められた胚盤胞を、パラ フィン油に含浸され、そしてまたいくつかの１Ｅｓ２２ａ細胞を含む同じ培地の 小滴に移した。これらの細胞は、トリプシン処理、続く洗浄及びＭ２培地中への 再懸濁により注射のために調製された。１０〜１５個のＥＳ２２ａ細胞を、標準 のミクロ操作技法を用いて個々の胚盤胞の肺胞腔中に導入した。次にＥＳ細胞含 有胚盤胞を偽妊娠育成母の子宮に移した。育成器は、８６／Ｄ２の雌と精管切除 された雄マウスとを受精せしめることによって得られた。膣栓の存在により断定 されるように、その移行の日の前、２．５日で受精された雌が、ＥＳ細胞含有胚 盤胞のための育成器として使用された。胚盤胞の発生をイン　ビボで続り、そし て子供は一般的に１６〜１８日後に生まれた。子孫へのＥＳ細胞の貢献度は、子 供の毛の色の試験により視覚的に評価され得た。胚盤胞は、濃い色の毛を有する Ｃ：５７ＢＬ／６マウスから得られた。ＥＳ細胞系Ｅ１４ＴＧ２ａ　、すなわち ε５２２ａが由来された親の系統を、１２９１０１ａのマウスから単離した。こ のマウス品種は、クリーム色であり、３種の毛の色の遺伝子の組合された効果、 たとえばアグーチの遺伝子座で優性Ａｗ対立遺伝子、ｐ−遺伝子座で劣性のピン クの眼をした希釈対立遺伝子及びＣ−遺伝子座で劣性ｃｃｈを有する。ＥＳ２２ ａがこの動物の形成に関与した子孫は、カッ色及びクリーム色の毛を有した。Ｅ Ｓ２２ａ細胞を含む胚盤胞からの子供の約８０％は、ある程度の毛の色のキメラ 性を示した。

Ｂ５２２ａ細胞が生殖腺に貢献する場合、動物は、ＥＳ２２ａゲノムを含み、そ してその子孫にそれを伝える精子を生成することが予測される。ＥＳ２２ａゲノ ムは、優性の毛マーカーＡ”に対してホモ接合性である。そのキメラが非−アグ ーチ、たとえばＣ５７ＢＬ／６又はＢ６／Ｄ２と接合される場合、精子又はＥＳ Ｓ細胞凍原子孫は、それらの毛の色により精子又は胚盤胞起原に由来する子孫と 区別され得る。これらは、尾から単離されたＤＮＡの分析により同定され得る。

従って、アグーチの尾を１０ｍ切除し、そしてＤＮＡを標準技法で調製した。Ｄ ＮＡを制限酵素ＸｂａＩ又は旧ｎｄｌｌｌのいづれかにより消化し、そしてサイ ン法によより分析し、そしてβ２ｍ遺伝子の放射性ラベルされたフラグメントに よりプローブした。対照マウスに見出されるフラグメントよりも長いｌｋｂのＸ ｂａＩ又は旧ｎｄＩｒＩフラグメントの存在は、その動物における突然変異誘発 されたβ２ｍ遺伝子の存在の表示である。

突然変異誘発されたβ２ｍ遺伝子に対するホモ接合性動物の生炙 突然変異誘発されたβ２ｍ遺伝子の１つのコピーを担持することを示されたＤＮ Ａを有する雄及び雌の動物を接合せしめた。これらの接合体の子孫を再び、大き なＸｂａＩ又は旧ｎｄＩＩＩフラグメントの存在について分析した。そのような 接合体からの子孫の１／４が欠陥遺伝子に対してホモ接合性であった。

これらの動物は現在、相同組換え法によりＥＳ細胞Ｂ１４ＴＧ２ａ中に元来導入 された突然変異体を担持する新規のマウス株を示す。

β２ｍ−１−マウスの表現型の決定 予測されるように、β２ｍタンパク質の突然変異がクラス１発現の損失をもたら すかどうかを決定するために、β２ｍ突然変異に対してホモ接合性の２匹の動物 を殺害し、そして細胞表面クラスＩ発現の存在について試験した。リンパ節、膵 臓及び胸腺から単離された細胞を、クラス■抗原１（−２Ｋｂ及びＨ−２Ｄｂに 対して向けられたモノクローナル抗体により試験した。ＥＳ細胞系が由来される マウス株、１２９１０１ａ及びこれらの動物を発生せしめるキメラが接合された 株Ｃ５７ＢＬ／６の両者は、Ｈ−２ｂハブロタイブを表わす。試験されたいづれ の組織においても、ホモ接合性β２ｍ−１−マウスから得られた細胞に関して、 バックグラウンド上の染色は見出されなかった。従って、予測されるように、β ２ｍ遺伝子の不活性化は、細胞表面でクラスＩ抗原を発現できない動物をもたら した。動物は、健康のように見え、そしてそれらの同産児仲間と目に見えて区別 され得なかった。

Ｔ−細胞の成熟に基づくクラスＩ抗原の欠乏の効果を、Ｔ−細胞分化の種々の段 階を決定する抗体を単離し、そしてそれにより胸腺細胞を染色することによって 試験した。そのデータは、正常なβ２ｍ−１−及びヘテロ接合性動物の胸腺にお ける０口４−８−、ＣＤ４＋　８＋及び（：Ｄ４＋　８−細胞集団は同一である ことを示した。対照的に、ＣＤ４−８＋集団は、異なった遺伝子型の動物間で異 なる。ＣＤ４−８＋細胞は、正常な胸腺の細胞の１０％を表わすが、しかしβ２ ｍマウスの胸腺における細胞の１％以下を表わす。興味あることには、ヘテロ接 合体におけるこれらの細胞の数はまた、いく分減じられる。

Ｔ細胞受容体遺伝子の発現により示されるように、クラスＩ遺伝子の存在がＴ− 細胞の成熟に影響を及ぼすかどうかを決定するために、胸腺細胞を、ＴＣＲαβ 又はＴＣＲｒδ受容体のいづれかに対して向けられる抗体により染色した。αβ 細胞受容体のプロフィールにおける有意な差異は、正常な細胞、　に比べて、β ２ｍ−１−動物に見られず、それはクラスＩ抗原がＴＣＲ担持性ＣＤ４＋　８　 ＋、又はＣＤ４＋　８−細胞への胸腺細胞の成熟のために必要とされないことを 示す。

次に、末梢Ｔ−細胞を、αβＴＣＲ及びＣＤ４並びにＣＤ８の発現について試験 した。β２ｍを欠く動物の膵臓及びリンパ節からのαβＴＣＲを担持するＴ−細 胞の収率は〈正常な同産児対照の収率と有意な差異はなかった。αβＴＣＲを担 持するすべてのＴ−細胞の２０％〜３２％がまた、β２ｍ＋１＋及び＋１−動物 にＣＤ８を生んだ。ＣＤ４−、ＣＤ８＋胸腺細胞はβ２ｍへテロ接合性動物にお いて幾分使い尽くされたが、これらのマウスにおける末梢ＣＤ８−１−Ｔ−細胞 のレベルは正常な同産児のレベルに相当した。対照的に、３２ｍ突然変異体に対 してホモ接合性である動物においては、αβＴＣＲ−担持性Ｔ−細胞発現ＣＤ８ は実質的に存在しなかった。予備実験を行ない、突然変異体のマウスに６口８＋ を現わす数少ないαβＴ−細胞が染色方法におけるノイズによるかどうかを見出 した。従って、これらの動物からのＴ−細胞を、抗−ＣＤ３抗体及びインターロ イキン−２により被覆されたプラスチック上で数日間増殖せしめ、こ、二でこの 方法はしばしば、ＣＤａ＋Ｔ−細胞の増殖を好ましく刺激する。ＣＤ８担持性の αβ＋Ｔ−細胞は、そのような処理の後、多数現われず、但しγδ担持性Ｔ−細 胞は増殖した。

この結論は、ＣＤ８＋、αβ細胞がクラスＩ　ＭＨＣ発現を欠く動物において実 質的に不在であることを示す。

膵臓及びリンパ節からの胸腺細胞及びＴ−細胞をまた、αδＴＣＲの発現につい て試験した。これらの細胞の数は、β２ｍ−］−マウス及び対照において同じで あった。実験結果（上記）は、β２ｍからのＴδ−担持性細胞が増殖し得ること 示し、そしてさらに、これらの細胞の予備試験は、それらの約１／４がＣＤ８を 産生したことを示した。従って、これらの研究は、αδＴ−細胞は、それらがま たＣＤ８を生成したとしても、それらの存在のためにクラス１発現を必要としな いことを示す。

上記結果によれば、クラスＩ　ＭＨＣ抗原の存在の結果として免疫破壊を受けな いであろう細胞が供給され得る。その細胞は広く使用され得る。なぜならば、そ れらは、同種宿主中に導入される場合、免疫攻撃を受けず、そしてそれらはさら に、それらの生来の態様で機能することができるであ、ろうからである。この方 法においては、細胞の数及び／又は機能の損失に起因する広範囲の疾病が治療さ れ得、ここでその導入される細胞は生存し、増殖し；そして機能することができ る。従って、熱傷、擦過傷、病原体又は同様のものの結果としての疾病が治療さ れ得るだけでなく、また遺伝子欠損の結果としての疾病も治療され得る。

また、胚の幹細胞は、キメラ性哺乳類宿主を生成するために相同組換え法により 変性され得る。キメラ性哺乳類宿主は、次に選択され、そして不活性化された遺 伝子を欠くホモ接合性宿主を生成するために繁殖のために使用され得る。

本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、当業者の技術水準の表示 であって、これらは引用により本明細書に組込まれる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的にいくらか詳細に記載され ているけれども、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

手続補正書（方式） 平成３年　【０月　３日

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つのＤＮＡ構造体による１哺乳類細胞の形質転換により組織適 合性複合体（ＭＨＣ）抗原の１つのサブユニットの個々の遺伝子座での損傷の導 入及び前記遺伝子座での前記構造体の組込みの結果として少なくとも１つの主な 前記ＭＨＣ抗原を欠く哺乳類細胞であって、前記ＤＮＡ構造体は前記遺伝子座及 び前記損傷の少なくとも一部と相同である配列を含んで成ることを特徴とする哺 乳類細胞。
2. ２．前記ＭＨＣ抗原がクラスＩ抗原である請求の範囲第１項記載の哺乳類細胞。
3. ３．前記ＭＨＣ抗原がクラスＩＩ抗原である請求の範囲第１項記載の哺乳類細胞 。
4. ４．少なくとも１つのＤＮＡ構造体による哺乳類細胞の形質転換により個々のβ ２−ミクログロブリン遺伝子座での損傷の導入及び前記遺伝子座での前記構造体 の組込みの結果としてクラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子を欠く 哺乳類細胞であって、前記ＤＮＡ構造体が前記遺伝子座及び前記損傷の一部と相 同である配列を含んで成ることを特徴とする哺乳類細胞。
5. ５．前記細胞が表皮細胞である請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。
6. ６．前記損傷が前記β２−ミクログロブリン遺伝子座のコード領域におけるマー カー遺伝子の挿入である請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。
7. ７．前記マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である請求の範囲第６項記載 の哺乳類細胞。
8. ８．前記個の遺伝子座が異なった損傷を有する請求の範囲第４項記載の哺乳類細 胞。
9. ９．前記細胞がネズミである請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。
10. １０．前記細胞がヒトのものである請求の範囲第４項記載の哺乳類細胞。
11. １１．少なくとも１つのＤＮＡ構造体による哺乳類細胞の形質転換により組織適 合性複合体（ＭＨＣ）抗原の１つのサブユニットの個々の遺伝子座での損傷の導 入及び前記遺伝子座での前記構造体（該ＤＮＡ構造体は前記遺伝子座及び前記損 傷の少なくとも一部と相同である配列を含んで成る）の組込みの結果として少な くとも１つの主な前記ＭＨＣ抗原を欠く哺乳類細胞の生成方法であって： 前記ＤＮＡ構造体により宿主細胞を形質転換し、ここで前記構造体は前記ＤＮＡ を含んで成る宿主細胞の選択のためのマーカー遺伝子を含んで成り； 相同組込みのために前記構造体を含んで成る選択された細胞をスクリーンし； 前記構造体により相同組込みを有する細胞を形質転換し；そして 前記ＭＨＣ抗原の不在により表面上に前記ＭＨＣ抗原を欠く細胞を選択すること を含んで成る方法。
12. １２．前記ＭＨＣ抗原がクラスＩ抗原である請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．前記遺伝子座がβ２−ミクログロブリン遺伝子座である請求の範囲第１２ 項記載の方法。
14. １４．前記ＭＨＣ抗原がクラスＩＩ抗原である請求の範囲第１１項記載の方法。
15. １５．前記損傷が前記構造体の少なくとも１つにおけるマーカー遺伝子の挿入で ある請求の範囲第１１項記載の方法。
16. １６．前記β２−ミクログロブリンを欠く細胞の選択がクラスＩ　ＭＨＣ抗原の エピトープに対して特異的な細胞毒性物質を用いることによってである請求の範 囲第１３項記載の方法。
17. １７．２種の異なった構造体を、２段階の形質転換のために使用する請求の範囲 第１１項記載の方法。
18. １８．前記構造体のそれぞれが、形質転換された細胞の選択のために異なったマ ーカーを含んで成る請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．前記マーカーの１つがネオマイシン耐性であり、そして他のマーカーがア シクロバー又はガンシクロバーに対して敏感である請求の範囲第１８項記載の方 法。
20. ２０．請求の範囲第１項記載の細胞を含んで成る組織。
21. ２１．前記細胞がケラチン細胞である請求の範囲第２０項記載の組織。
22. ２２．創傷を治療するための方法であって、前記創傷に請求の範囲第２１項記載 の組織を投与することを含んで成る方法。
23. ２３．ＤＮＡ構造体であって、哺乳類宿主において発現できるマーカー遺伝子を コードする配列を端に有するＭＨＣ抗原のサブユニットの遺伝子座と相同の配列 少なくとも５０ｂｐを含んで成るＤＮＡ構造体。
24. ２４．前記ＭＨＣ抗原がクラスＩ抗原である請求の範囲第２３項記載のＤＮＡ構 造体。
25. ２５．前記ＭＨＣ抗原がクラスＩＩ抗原である請求の範囲第２３項記載のＤＮＡ 構造体。
26. ２６．ＤＮＡ構造体であって、哺乳類宿主において発現できるマーカー遺伝子を コードする配列を端に存するβ２−ミクログロブリン遺伝子座と相同の配列少な くとも５０ｂｐを含んで成るＤＮＡ構造体。
27. ２７．前記マーカー遺伝子が耐抗生物質性である請求の範囲第２６項記載のＤＮ Ａ構造体。
28. ２８．前記相同性がコード領域と少なくとも部分的に適合する請求の範囲第２７ 項記載のＤＮＡ構造体。
29. ２９．前記相同性は、少なくとも２００ｂｐであり、そして前記β２−ミクログ ロブリン遺伝子座のエキソン２〜４を含んで成る請求の範囲第２８項記載のＤＮ Ａ構造体。
30. ３０．染色体遺伝子中に挿入されるマーカー遺伝子を含んで成る胚の幹細胞。
31. ３１．前記マーカー遺伝子が耐Ｇ４１８性である請求の範囲第３０項記載の胚の 幹細胞。
32. ３２．前記マーカー遺伝子がβ２−ミクログロブリン遺伝子中に挿入される請求 の範囲第３０項記載の胚の幹細胞。
33. ３３．キメラ性非−ヒト哺乳類を生成するための方法であって： ＤＮＡ構造体が相同組換え法により組込まれるようになる条件下で胚の幹細胞の 染色体に存在する標的遺伝子配列と相同性のＤＮＡ配列少なくとも５０ｂｐ及び マーカー遺伝子を含んで成るＤＮＡ構造体により胚の幹細胞を形質転換せしめ； 選択された細胞を供給するために前記標的遺伝子中に組込まれる前記構造体を含 んで成る胚の幹細胞について選択し；前記哺乳類の胚盤胞の胚胚腔中に前記選択 された細胞を導入し；そして 前記キメラ性哺乳類中に前記胚盤胞を増殖せしめることを含んで成る方法。
34. ３４．前記選択が前記マーカー遺伝子及びポリマラーゼ鎖反応により行なわれる 請求の範囲第３３項記載の方法。
35. ３５．前記ポリマラーゼ鎖反応が２種のプライマーを使用し、ここで１つのプラ イマーは前記構造体内に存在し、そして他の１つのプライマーは前記構造体外に 存在するが、しかし前記標的遺伝子の遺伝子座で存在する請求の範囲第３４項記 載の方法。
36. ３６．前記標的遺伝子がβ２−ミクログロブリンである請求の範囲第３３項記載 の方法。
37. ３７．クラスＩの主要組織適合性複合体抗原を欠くことを特徴とする非−ヒト動 物。
38. ３８．前記動物が哺乳類である請求の範囲第３７項記載の動物。
39. ３９．前記哺乳類がマウスである請求の範囲第３８項記載の動物。
40. ４０．機能的なβ２−ミクログロブリンを生成することができず、クラスＩの主 要組織適合性複合体抗原を欠いており、そして成熟ＣＤ８＋Ｔリンパ球を欠くこ とによって特徴づけられるマウス。