TWI605061B - 會結合及阻斷表現在骨髓細胞上觸發受體－１（ｔｒｅｍ－１）之抗體 - Google Patents

會結合及阻斷表現在骨髓細胞上觸發受體－１（ｔｒｅｍ－１）之抗體 Download PDF

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Description

會結合及阻斷表現在骨髓細胞上觸發受體-1(TREM-1)之抗體
本發明係關於一種鑑別功能性TREM-1抗體之方法。本發明亦關於能夠特異性結合TREM-1且能夠降低或阻斷TREM-1活性(信號傳導及/或活化)之抗體。此外，本發明係關於此等抗體之用途，諸如治療性及醫藥用途。
表現在骨髓細胞上的觸發受體-1(TREM-1)為表現在單核細胞、巨噬細胞及嗜中性白血球上的受體。當活化時，TREM-1與信號傳導蛋白DAP12締合且觸發促炎性細胞激素自表現其的細胞中釋放(Bouchon等人，J.Immunol.2000；164(10)：4991-4995)。TREM-1 mRNA及蛋白質表現已知在患有敗血症、類風濕性關節炎(RA)及發炎性腸病(IBD)之個體的骨髓細胞中受到上調。愈來愈多的科學證據支持TREM-1因募集至發炎區域之TREM-1陽性單核細胞及嗜中性白血球加劇發炎而促進發炎疾病之發展及進展的理論(Bouchon等人，Nature 2001；410：1103-1107；Schenk等人，Clin Invest.2007；117(10)：3097-3106；Kuai等人，Rheumatology(Oxford).2009；48(11)：1352-1358)。
能夠結合TREM-1的抗體已為人所知，包括可市購的TREM26及TREM37(目錄號分別為314902及316102，Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)、MAB1278(目錄號MAB1278，R&D Systems,Minneapolis,MN 55413,USA)、mAb 6B1(目錄號HM2252，Hycult Biotech,Uden,Netherlands)及抗TREM-1 2E2(目錄號HPA005563，Sigma-Aldrich,Denmark)。所有已知的TREM-1抗體當固著時均具有促效性；亦即，其增強細胞激素自單核細胞、巨噬細胞及嗜中性白血球的釋放。已知TREM-1抗體的另一個特徵在於，其與來自靈長類動物(諸如食蟹獼猴或恆河猴)的TREM-1無交叉反應，此意謂已知抗體在此等動物中無法測試到。
因此，此項技術中需要一種能夠結合且阻斷TREM-1功能的抗體。此項技術中需要一種能夠防止TREM-1形成二聚體/多聚體的TREM-1抗體。此項技術中需要一種能夠阻斷TREM-1活化及信號傳導的TREM-1抗體。此項技術中需要一種能夠干擾TREM-1與其配位體之間相互作用的TREM-1抗體。此項技術中需要一種能夠阻斷細胞激素自骨髓細胞釋放的TREM-1抗體。此項技術中需要一種當溶解時或固著時具有很小或無促效活性的TREM-1抗體。此項技術中亦需要一種能夠結合人類TREM-1與來自一或多種其他物種(諸如靈長類動物)之TREM-1的抗體，以便進行毒理學研究以及評估抗體在適合動物模型中的藥物動力學及藥效學。
本文中揭示適用作藥品的TREM-1抗體。此等抗體可對患有敗血症或慢性發炎疾病(諸如類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎及發炎性腸病)之個體的生活品質具有實質性影響。
本發明係關於一種鑑別功能性TREM-1抗體之方法，包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)當該第一細胞與TREM-1調節劑一起培育時，量測該細胞之活性；(c)使(b)之共培養物與TREM-1抗體接觸；及(d)測得該第一細胞之活性小於或大於(b)中所量測之活性。
該方法可經改適以鑑別阻斷性TREM-1分子，諸如抗體。 該鑑別阻斷性TREM-1抗體之方法包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)當該第一細胞與活化化合物(諸如TREM-1配位體)或經活化之嗜中性白血球一起培育時，量測該細胞之活性；(c)使該第一細胞與該活化化合物(諸如TREM-1配位體)或經活化之嗜中性白血球之共培養物與TREM-1抗體接觸；及(d)測得該第一細胞之活性小於(b)中所量測之活性。
該方法可經改適以鑑別刺激性TREM-1抗體。該鑑別刺激性TREM-1抗體之方法包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)量測該第一細胞之活性；(c)使該細胞與TREM-1抗體接觸/一起培育；及(d)測得該第一細胞之活性大於(b)中所量測之活性。
第一細胞可來源於造血系統。(b)中之調節劑可為經活化之嗜中性白血球或TREM-1配位體。信號傳導蛋白可為DAP10、DAP12、TCR ξ、Fc γ RIII及Fc受體，或其一部分。信號傳導蛋白可經由轉錄因子(諸如NFAT或NF κ B)傳導信號。報導基因可為不天然表現於該第一細胞中的基因且可為編碼β-半乳糖苷酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)或氯黴素轉移酶的基因。本發明亦關於藉由本發明方法可鑑別的刺激性TREM-1抗體。
本發明係關於能夠特異性結合至TREM-1且能夠阻斷TREM-1功能的抗體。該等抗體能夠防止或減少TREM-1之二聚化或多聚化。該等抗體能夠阻斷TREM-1與其配位體之間的相互作用，或該等抗體能夠阻斷由TREM-1配位體誘導的TREM-1功能。TREM-1可為人類TREM-1及/或來源於除人類外之另一物種的TREM-1，諸如來源於除人類外之另一靈長類動物的TREM-1。
本發明之抗體能夠與mAb 0170競爭結合至人類TREM-1。 本發明之抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之胺基酸D38至F48的多肽。本發明之抗體可具有包含以下之抗原決定基：選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44及L45組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或全部，及選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之E46、K47及F48組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個或全部，如使用HX-MS所測定。本發明之抗體可具有包含以下之抗原決定基：選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之D42、E46、D92及H93組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個、3個或全部，如藉由量測結合至TREM-1變異體之抗體所測定。
本發明之抗體能夠與mAb 0170競爭結合至食蟹獼猴TREM-1。本發明之抗體能夠特異性結合包含食蟹獼猴TREM-1(SEQ ID NO：12)之胺基酸E19至L26或SEQ ID NO：21之對應胺基酸的多肽，如使用HX-MS所測定。
本發明之抗體可用作治療患有一或多種自體免疫疾病及/或慢性炎症之個體的藥品。因此，本發明亦關於一種治療患有一或多種自體免疫疾病及/或慢性炎症之個體的方法。
序列簡單說明
SEQ ID NO：1表示野生型(wt)人類TREM-1之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2表示m14F69抗體之可變重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3表示m14F69抗體之可變輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4表示第一人類化TREM-1抗體(mAb 0170)之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5表示第一人類化TREM-1抗體(mAb 0170)之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：6表示第二人類化TREM-1抗體(mAb 0122)之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7表示第二人類化TREM-1抗體(mAb 0122)之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8表示m14F128抗體之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：9表示m14F128抗體之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：10表示m14F113抗體之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：11表示m14F113抗體之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：12表示當在大腸桿菌(E.coli)中表現時，野生型(wt)食蟹獼猴(c)TREM-1之胞外域之胺基酸序列。
SEQ ID NO：13表示K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6(構築體0222)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：14表示A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6(構築體0244)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：15表示A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6(構築體0245)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：16表示引子之核酸序列。
SEQ ID NO：17表示引子之核酸序列。
SEQ ID NO：18表示人類(h)TREM-1(1-134)-His6之胺基酸序列。
SEQ ID NO：19表示cTREM-1-Cmyc2-His6(構築體0238)之胺基酸序 列。
SEQ ID NO：20表示hTREM-1-Cmyc2-His6(構築體0247)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：21表示全長cTREM-1之胺基酸序列。
SEQ ID NO：22表示全長鼠科(m)TREM-1之胺基酸序列。
SEQ ID NO：23表示全長hPGLYRP1之胺基酸序列。
圖1：諸如14F128及14F113之抗體可降低BWZ.36/hTREM-1：DAP12：NFAT-LacZ細胞系(本文中亦稱為「BWZ/hTREM-1報導細胞」)活化，而可市購的抗體MAB1278(R&D Systems,Minneapolis,MN 55413,USA：目錄號MAB1278)、抗TREM-1 HPA(Sigma,USA：目錄號HPA005563)、aTREM26(Biolegend,San Diego,CA 92121,USA：目錄號314902)及aTREM37(Biolegend,San Diego,CA 92121,USA：目錄號316102)則不能。
圖2：BWZ/hTREM-1報導細胞單獨或與TLRL預刺激之嗜中性白血球共培養。相較於未活化的嗜中性白血球，經TLRL活化之嗜中性白血球能夠誘導信號(發光)增加15倍(參見最後兩個柱形圖)。在此實驗中，陽性對照(盤結合型促效性MAB1278(R&D Systems,Minneapolis,MN 55413,USA：目錄號MAB1278))產生32倍誘導(參見第二個柱形圖)。資料以平均值±SEM(n=3)作圖。
圖3：歸一化報導體檢定(其中TREM-1由經PGN活化之嗜中性白血球刺激)顯示，可市購的抗體TREM-26(目錄號314902，Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)、TREM-37(目錄號316102，Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)、MAB1278(目錄號MAB1278，R&D Systems,Minneapolis,MN 55413,USA)及抗TREM-1 HPA(目錄號HPA005563，Sigma,St Louis,MO,USA)為在報導體檢定中增強TREM-1依賴性發光信號(產生信號高於1)的促效性抗體。經鑑別為5F27A1及14F69的抗體顯示為最佳阻斷劑(產生信號小於0.5)。資料以平均值±SEM(n=3)作圖。同型對照物MAB002(目錄號MAB002，R&D Systems,Minneapolis,MN 55413,USA)。所有抗體以1μg/ml使用。
圖4：BWZ/hTREM-1報導體檢定中之活性。在x軸上，TREM-1阻斷活性顯示為當添加0.2μg/ml抗體至已用PGN刺激之嗜中性白血球預活化之BWZ/hTREM-1報導細胞中時殘留的活性。當TREM-1抗體為盤結合型抗體時，一些抗體(包括所有可市購的TREM-1抗體)能夠交叉結合TREM-1且從而活化TREM-1。此活性在y軸上顯示。因此，左下角之框中顯示為點的抗體皆顯示不同於已知抗體的有利阻斷特性，而非促效特性。
圖5：人類TREM-1抗體結合至來自恆河猴的PBMC。在左上角中，顯示大部分抗體僅結合人類TREM-1(每個黑點代表一種抗體)。一些抗體(諸如mAb 0025及14F128、14F11、14F29、14F113及14F69)能夠結合至人 類TREM-1與恆河猴TREM-1，從而顯示交叉反應性。
圖6：抗人類TREM-1抗體結合至來自食蟹獼猴的PBMC。圖6A，在左上角中，顯示大部分抗體僅結合人類TREM-1(每個黑點代表一種抗體)。一些抗體(諸如mAb 0025及14F128、14F11、14F29)能夠結合人類TREM-1與食蟹獼猴TREM-1，從而顯示交叉反應性。一些抗體(諸如14F69(mAb 0044))能夠同樣良好地結合食蟹獼猴PBMC(圖6B)與人類PBMC(圖6C)。
圖7：在mAb 0023或mAb 0026(A)、mAb 0024或Biolegend純系26(B)、mAb 0025(C)或RnD Biosystems之MAB1278(D)存在及不存在下，HX分析之hTREM-1肽之序列範圍。初始序列顯示於HX分析之肽(顯示為橫槓)上方。在mAb存在與不存在下均顯示相似交換模式的肽係以白色顯示，而在mAb結合時即顯示氘併入減少的肽係以黑色顯示。框選序列區域界定抗原決定基。
圖8：針對hTREM-1之mAb 0025之抗原決定基的結構性抗原決定基定位。hTREM-1(pdb 1Q8M)之結構係作為二聚體之一部分以黑色C-α線表示。hTREM-1二聚體之另一部分以灰色條帶顯示，0025抗原決定基以黑色顯示。
圖9：BWZ/hTREM-1報導細胞與TREM-1配位體複合物共培養反映出TREM-1mAb-0170可劑量依賴性抑制TREM-1功能性。
圖10：TREM-1抗體阻斷了PGLYRP-1刺激的M2巨噬細胞釋放TNFα。
圖11：人類TREM-1序列與食蟹獼猴TREM-1序列進行比對。兩者之間不同的胺基酸殘基係以粗體顯示。已顯示位於抗原決定基內的殘基(如使用HX-MS及表面電漿子共振所測定)突出顯示。
TREM-1為由234個胺基酸組成的跨膜蛋白，包括單一細胞外免疫球蛋白結構域及具有不明顯信號傳導基元的短細胞質尾。活化時，TREM-1與含有ITAM之信號傳導接附蛋白DAP12締合。下游信號傳導可包括NFAT轉錄因子之活化，引起促炎性細胞激素產生上調。
本發明係關於能夠特異性結合及阻斷TREM-1功能的抗體。本發明之抗體可藉由減少/阻斷TREM-1活化及下游信號傳導來阻斷TREM-1功能。
本發明之抗體可藉由若干不同機制之一或組合來阻斷TREM-1，從而直接或間接地阻斷TREM-1。舉例而言，本發明之抗體可防止TREM-1之天然配位體肽聚糖識別蛋白1(PGLYRP1)與TREM-1形成功能性複合物且/或本發明之抗體可藉由防止個別TREM-1分子形成二聚體或多聚體來阻斷TREM-1。TREM-1抗體可減少或防止TREM-1二聚化或多聚化，TREM-1抗體能夠結合至TREM-1之一部分(否則，該部分會存在於TREM-1二聚體之界面中)，從而防止個別TREM-1分子彼此相締合。干擾TREM-1與其配位體相互作用之TREM-1抗體可減少或防止TREM-1二聚化或多聚化。本發明之抗體可阻斷PGLYRP1誘導之TREM-1活化。PGLYRP1(一種高度保守之具有196個胺基酸長度的蛋白質，其由信號肽及肽聚糖結合域組成)表現於嗜中性白血球中且在其活化時釋放。本發明之抗體可下 調骨髓細胞釋放促炎性細胞激素。本發明之抗體可阻斷巨噬細胞、嗜中性白血球、滑液組織細胞及/或報導細胞釋放TNF α、MIP-1 β、MCP-1、IL-1 β、GM.CSF、IL-6及/或IL-8，如本文所揭示。
本發明之抗體能夠結合人類TREM-1與來自除人類外之另一物種的TREM-1。如本文所用之術語「TREM-1」因此涵蓋可來源於任何適合生物體之TREM-1的任何天然存在形式。舉例而言，如本文所述使用之TREM-1可為脊椎動物TREM-1，諸如哺乳動物TREM-1，諸如來源於靈長類動物(諸如人類、黑猩猩、食蟹獼猴或恆河猴)；齧齒動物(諸如小鼠或大鼠)、兔類動物(諸如兔)或偶蹄類動物(諸如奶牛、綿羊、豬或駱駝)之TREM-1。TREM-1較佳為SEQ ID NO：1(人類TREM-1)。TREM-1可為TREM-1之成熟形式，諸如已在適合細胞內經歷轉譯後加工的TREM-1蛋白。此成熟TREM-1蛋白可經例如糖基化。TREM-1可為全長TREM-1蛋白。
本發明之抗體可為單株抗體，就此而言，其直接或間接地來源於B淋巴細胞之單一純系。TREM-1抗體可使用例如實施例中所述之方法產生、篩檢及純化。簡言之，可用TREM-1、表現TREM-1之細胞或兩者之組合使適合小鼠(諸如TREM-1或TREM-1/TREM-3基因剔除(KO)小鼠)免疫。
本發明之抗體可為多株抗體，就此而言，為本發明之單株抗體之混合物。
初次篩檢融合瘤上清液可使用直接ELISA或FMAT進行且二次篩檢可使用流動式細胞量測術進行。接著可在報導基因檢定中篩檢陽性融合瘤上清液。
抗體可重組表現於原核或真核細胞中。原核細胞可為大腸桿菌。真核細胞可為酵母、昆蟲或哺乳動物細胞，諸如來源於靈長類動物(諸如人類、黑猩猩、食蟹獼猴或恆河猴)、齧齒動物(諸如小鼠或大鼠)、 兔類動物(諸如兔)或偶蹄類動物(諸如奶牛、綿羊、豬或駱駝)之生物體之細胞。適合的哺乳動物細胞系包括(但不限於)HEK293細胞、CHO細胞及海拉細胞(HELA cells)。TREM-1抗體亦可藉由熟習此項技術者已知的其他方法產生，諸如噬菌體呈現術或酵母呈現術。
抗體一經產生，即可使用實施例中所述之方法，針對結合至例如全長TREM-1或其突變體加以篩檢。
本發明之一個具體實例為鑑別功能性TREM-1抗體之方法。能夠特異性結合TREM-1且對TREM-1活化及下游信號傳導具有任何作用的抗體在本文中稱為「功能性TREM-1抗體」。本文中之「功能性」TREM-1抗體係指能夠阻斷或刺激TREM-1的抗體。鑑別功能性TREM-1抗體之方法包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)當該第一細胞與TREM-1調節劑一起培育時，量測該細胞之活性；(c)使(b)之共培養物與TREM-1抗體接觸；及(d)測得該第一細胞之活性小於或大於(b)中所量測之活性。
(a)中之「第一細胞」可為來源於造血系統之細胞，諸如骨髓細胞，諸如T細胞。(a)中之信號傳導蛋白可為能夠與TREM-1形成複合物的任何信號傳導蛋白。適合的信號傳導蛋白包括DAP10、DAP12、TCR ξ、Fc γ RIII及Fc受體，或其一部分。(a)中之報導構築體可為能夠經由信號傳導蛋白活化及產生可識別信號的任何構築體。適合的報導構築體包含轉錄因子及報導基因。信號傳導蛋白可經由選自由NFAT及NFkB組成之群的轉錄因子傳導信號。報導基因為不天然表現於該第一細胞中的基因且可為編碼β-半乳糖苷酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)或氯黴素轉移酶的基因。該第一細胞可使用此項技術中熟知的方法經轉錄因子及報導基因轉染。
實施例中所述之「BWZ/hTREM-1報導細胞」為「第一細胞」 之一個實例。
(b)中之調節劑可為TREM-1配位體或經活化之嗜中性白血球。(c)中之「TREM-1抗體」可為TREM-1特異性融合瘤上清液或純化抗體。(d)中所量測之活性為報導構築體所產生的信號。此信號傳導之一實例為由NFAT驅動之LacZ(β-內醯胺酶螢光素酶)產生所引起的發光。
該方法可經改適以鑑別阻斷性TREM-1抗體。該鑑別阻斷性TREM-1抗體之方法包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)當該第一細胞與經活化之嗜中性白血球一起培育時，量測該細胞之活性；(c)使該第一細胞與該經活化之嗜中性白血球之共培養物與TREM-1抗體接觸；及(d)測得第一細胞之活性小於(b)中所量測之活性。
該方法亦可經改適以鑑別刺激性TREM-1抗體。該鑑別刺激性TREM-1抗體之方法包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)量測該第一細胞之活性；(c)使該細胞與TREM-1抗體接觸/一起培育；及(d)測得該第一細胞之活性大於(b)中所量測之活性。
本發明係關於阻斷性TREM-1抗體，其可藉由本文揭示之鑑別阻斷性抗體之方法加以鑑別。當使用上文及實施例中所述的方法測試時，本發明之抗體在小於100 μg/ml(諸如小於90 μg/ml，諸如小於80 μg/ml，諸如小於70 μg/ml，諸如小於60 μg/ml，諸如小於50 μg/ml，諸如小於40 μg/ml，諸如小於30 μg/ml，諸如小於20 μg/ml，諸如小於10 μg/ml，諸如小於5 μg/ml，諸如小於1 μg/ml)的濃度下能夠將該第一細胞之活性降低50%，諸如60%，諸如70%，諸如80%，諸如90%，諸如95%，諸如100%。本發明之抗體能夠完全消除第一細胞之活性。當使用上文及實施例中所述的方法測試時，本發明之抗體在小於1 μg/ml(諸如小於0.9 μg/ml，諸如小於0.8 μg/ml，諸如小於0.7 μg/ml，諸如小於0.6 μg/ml，諸如小於0.5 μg/ml，諸如小於0.4 μg/ml，諸如小於0.3 μg/ml，諸如小於0.2 μg/ml)的濃度下能夠消除第一細胞之活性。
本發明亦關於可藉由除本文所揭示方法外之其他手段鑑別的阻斷性TREM-1抗體。
本文中之術語「抗體(antibody)」係指一種來源於生殖系免疫球蛋白序列的蛋白質，其能夠特異性結合至抗原(TREM-1)或其一部分。該術語包括任何種類或同型(亦即IgA、IgE、IgG、IgM及/或IgY)之全長抗體及其任何單鏈或片段。特異性結合至抗原或其一部分的抗體可專一地結合至彼抗原或其一部分，或其可結合至有限數目個同源抗原或其一部分。全長抗體通常包含至少四個多肽鏈：兩個重鏈(H)及兩個輕鏈(L)，藉由二硫鍵相互連接。與醫藥特別有關之一個免疫球蛋白子類為IgG家族。在人類中，根據重鏈恆定區之序列，可將IgG種類再分成4個子類：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。根據序列組成之差異，可將輕鏈分成兩種類型：κ及λ。IgG分子係由兩個重鏈(經兩個或兩個以上二硫鍵相互連接)及兩個輕鏈(各經二硫鍵連接至重鏈)組成。重鏈可包含重鏈可變區(VH)及至多三個重鏈恆定區(CH)：CH1、CH2及CH3。輕鏈可包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其中散置較保守區域，稱為構架區(FR)。VH及VL區典型地由三個CDR及四個FR組成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之高變區形成能夠與抗原相互作用的「結合」域，而抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括(但不限於)免疫系統之各種細胞(效應細胞)、Fc受體及典型補體系統之第一組分(Clq)。
本發明之抗體可加以分離。術語「分離抗體(isolated antibody)」係指一種抗體，其已自產生其之環境中的其他組分分離及/或回收，及/或已自產生其之環境中存在之組分混合物純化。
在本發明之情形中，抗體之某些抗原結合片段可為適合的，因為已顯示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指抗體之一或多個片段，其保留特異性結合至如本文所述之抗原(諸如TREM-1)的能力。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(典型地為抗體之單臂之VL及VH域)、單鏈Fv(scFv；參見例如Bird等人，Science 1988；242：42S-426；及Huston等人，PNAS 1988；85：5879-5883)、dsFv、Fd(典型地為VH及CHI域)及dAb(典型地為VH域)片段；VH、VL、VhH及V-NAR域；包含單一VH及單一VL鏈的單價分子；微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及κ抗體(參見例如Ill等人，Protein Eng 1997；10：949-57)；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多個分離CDR或功能性互補位，其中分離CDR或抗原結合殘基或多肽可締合或連接在一起以便形成功能性抗體片段。各種類型的抗體片段已描述或評述於例如Holliger及Hudson,Nat Biotechnol 2005；2S：1126-1136；WO2005040219，及已公開之美國專利申請案20050238646及20020161201中。此等抗體片段可使用熟習此項技術者已知的習知技術獲得，且可以與完整抗體相同的方式篩檢該等片段的效用。
本發明之抗體可為人類抗體或人類化抗體。如本文所用，術語「人類抗體(human antibody)」意欲包括具有其中構架區之至少一部分及/或CDR區之至少一部分來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。(舉例而言，人類抗體可具有其中構架區與CDR區均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區)。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由試管內隨機或位點特異 性突變誘發引入或藉由活體內體細胞突變引入的突變)。
此人類抗體可為人類單株抗體。此人類單株抗體可由融合瘤產生，此融合瘤包括獲自非人類轉殖基因動物(例如基因組包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因的轉殖基因小鼠)之B細胞與不朽化細胞之融合物。
人類抗體可自序列文庫中分離，序列文庫係基於人類生殖系序列之選擇而建立且進一步多樣化而具有天然及合成序列多樣性。
人類抗體可藉由試管內使人類淋巴細胞免疫、隨後用愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)轉型淋巴細胞來製備。
術語「人類抗體衍生物(human antibody derivative)」係指人類抗體之任何修飾形式，諸如該抗體與另一種藥劑或抗體之結合物。
如本文所用，術語「人類化抗體(humanised antibody)」係指含有一或多個來源於非人類免疫球蛋白之序列(CDR區或其一部分)的人類/非人類嵌合抗體。因此人類化抗體為一種人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中至少來源於該受者之高變區的殘基被來源於非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)且具有所要特異性、親和力、序列組成及功能性之抗體(供者抗體)之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基被相應非人類殘基置換。此種修飾之一實例為引入一或多個所謂的回復突變，其典型地為來源於供者抗體之胺基酸殘基。可使用熟習此項技術者已知的重組技術對抗體進行人類化(參見例如Antibody Engineering,Methods in Molecular Biology，第248卷，Benny K.C.Lo編)。適用於輕鏈與重鏈可變域的人類受者構架可依據例如序列或結構同源性加以鑑別。或者，可例如基於對結構、生物物理學及生物化學特性的瞭解來使用固定的受者構架。受者構架可來源於生殖系或來源於成熟抗體序列。供者抗體之CDR區可藉由CDR移植來轉移。藉由鑑別其中再引入(回復突變) 供者抗體之胺基酸殘基對人類化抗體之特性具有有益影響的關鍵構架位置，可針對例如親和力、功能性及生物物理學特性進一步最佳化CDR移植之人類化抗體。除來源於供者抗體之回復突變外，可藉由將生殖系殘基引入CDR或構架區、消除免疫原性抗原決定基、定點突變誘發、親和力成熟等方式對人類化抗體進行工程改造。
此外，人類化抗體可包含未發現於受者抗體或供者抗體中的殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體包含至少一個(典型地為兩個)可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區且其中所有或實質上所有FR殘基為人類免疫球蛋白序列之FR殘基。人類化抗體視情況亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地為人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。
術語「人類化抗體衍生物(humanised antibody derivative)」係指人類化抗體之任何修飾形式，諸如該抗體與另一藥劑或抗體之結合物。
如本文所用，術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」係指一種抗體，其輕鏈與重鏈基因已由來源於不同物種的免疫球蛋白可變區及恆定區基因、典型地藉由遺傳工程構築而成。舉例而言，可將來自小鼠單株抗體之基因之可變區段連接至人類恆定區段。
抗體之片段可結晶區(「Fc區」/「Fc域」)為抗體之N端區，其包含CH2及CH3恆定域。Fc域可與稱為Fc受體的細胞表面受體以及補體系統之一些蛋白質相互作用。Fc區使得抗體能夠與免疫系統相互作用。在本發明之一個態樣中，抗體可經工程改造以在Fc區內包括修飾，此可典型地改變其一或多種功能特性，尤其諸如血清半衰期、補體固定、Fc-受體結合、蛋白質穩定性及/或抗原依賴性細胞介導之細胞毒性，或其不存在。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分連接至抗體)或經修飾而改變其糖基化，再改變該抗體之一或多種功能特性。IgG1 抗體可攜帶經修飾之Fc域，該Fc域包含一或多個且也許是所有以下突變，該等突變分別引起針對某些Fc受體(L234A、L235E及G237A)的親和力降低及Clq介導之補體固定減少(A330S及P331S)(殘基編號係根據EU索引)。
本發明之抗體之同型可為IgG，諸如IgG1，諸如IgG2，諸如IgG4。需要時，抗體之種類可藉由已知技術「切換」。舉例而言，原先以IgM分子形式產生的抗體可切換種類為IgG抗體。種類切換技術亦可用於將一個IgG子類轉換為另一子類，例如自IgG1轉換為IgG2或IgG4；自IgG2轉換為IgG1或IgG4；或自IgG4轉換為IgG1或IgG2。亦可藉由將來自不同IgG子類的區域組合來對抗體進行工程改造以產生恆定區嵌合分子。
在一個具體實例中，CH1之鉸鏈區經修飾，使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於例如Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。
恆定區可經修飾以使抗體穩定，例如降低二價抗體分離成兩個單價VH-VL片段的風險。舉例而言，在lgG4恆定區中，殘基S228(殘基編號係根據EU索引)可突變為脯胺酸(P)殘基，以使鉸鏈處重鏈間二硫橋的形成穩定化(參見例如Angal等人，Mol Immunol.1995；30：105-8)。
抗體或其片段亦可按照其互補決定區(CDR)定義。本文使用之術語「互補決定區(complementarity-determining region)」或「高變區(hypervariable region)」係指其中涉及抗原結合之胺基酸殘基所處的抗體區域。高變區或CDR可以在抗體可變域之胺基酸比對中具有最高變異性的區域加以鑑別。可利用資料庫鑑別CDR，諸如Kabat資料庫，CDR例如定義為包含輕鏈可變域中之胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈可變域中之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康及人類服務 部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公開號91-3242)。或者，CDR可定義為來自「高變環(hypervariable loop)」之彼等殘基(輕鏈可變域中之殘基26-33(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol 1987；196：901-917)。典型地，此區域內之胺基酸殘基編號係藉由Kabat等人(同上)所述之方法執行。諸如「Kabat位置(Kabat position)」、「Kabat殘基(Kabat residue)」及「根據Kabat(according to Kabat)」一詞在本文中係指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或其他胺基酸，相當於縮短或插入可變域之構架區(FR)或CDR。舉例而言，重鏈可變域可包括位於CDR H2之殘基52之後的胺基酸插入(殘基52a、52b及52c，根據Kabat)及位於重鏈FR殘基82之後的所插入殘基(例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。指定抗體之殘基Kabat編號可藉由與「標準」Kabat編號序列在抗體序列同源區比對來確定。
術語「構架區(framework region)」或「FR」殘基係指不在CDR內的彼等VH或VL胺基酸殘基，如本文所定義。
m14F69抗體具有如SEQ ID NO：2中所示的可變重鏈序列及如SEQ ID NO：3中所示的可變輕鏈序列。本發明之抗體可包含此可變重鏈序列及/或此可變輕鏈序列。m14F69抗體具有SEQ ID NO：2之胺基酸31至35、50至68及101至110及SEQ ID NO：3之胺基酸24至38、54至60及93至101所示的CDR序列。本發明之抗體可包含此等CDR序列中的1個、2個、3個、4個、5個或全部6個。本發明之抗體可包含SEQ ID NO：2之胺基酸101至110。
本發明之抗體之重鏈可包含SEQ ID NO：2之胺基酸31至35(TYAMH)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之重鏈可包含SEQ ID NO：2之胺基酸50至68(RIRTKSSNYATYYADSVKD)之CDR2序列，其中此等胺基酸中之一個、兩個或三個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之重鏈可包含SEQ ID NO：2之胺基酸101至110(DMGQRRQFAY)之CDR3序列，其中此等胺基酸中之一個、兩個或三個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之輕鏈可包含SEQ ID NO：3之胺基酸24至38(RASESVDTFDYSFLH)之CDR1序列，其中此等胺基酸中之一個、兩個或三個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之輕鏈可包含SEQ ID NO：3之胺基酸54至60(RASNLES)之CDR2序列，其中此等胺基酸中之一個或兩個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之輕鏈可包含SEQ ID NO：3之胺基酸93至101(QQSNEDPYT)之CDR3序列，其中此等胺基酸中之一個或兩個可經不同胺基酸取代。
mAb 0170抗體具有如SEQ ID NO：4中所示之重鏈序列及如SEQ ID NO：5中所示之輕鏈序列。本發明之抗體可包含此重鏈序列及/或此輕鏈序列。mAb 0170抗體具有SEQ ID NO：4之胺基酸31至35、50至68及101至110及SEQ ID NO：5之胺基酸24至38、54至60及93至101所示的CDR序列。本發明之抗體可包含此等CDR序列中的1個、2個、3個、4個、5個或全部6個。
mAb 0122抗體具有如SEQ ID NO：6中所示之重鏈序列及如SEQ ID NO：7中所示之輕鏈序列。本發明之抗體可包含此重鏈序列及/或此輕鏈序列。mAb 0122抗體具有SEQ ID NO：6之胺基酸31至35、50至68及101至110及SEQ ID NO：7之胺基酸24至38、54至60及93至101所示的 CDR序列。本發明之抗體可包含此等CDR序列中的1個、2個、3個、4個、5個或全部6個。
本發明之抗體之重鏈可包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6之胺基酸31至35(TYAMH)之CDRH1序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸殘基取代。
本發明之抗體之重鏈可包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6之胺基酸50至68(RIRTKSSNYATYYAASVKG)之CDRH2序列，其中此等胺基酸中之一個、兩個或三個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之重鏈可包含SEQ ID NO：4之胺基酸101至110(DMGIRRQFAY)之CDRH3序列，其中此等胺基酸中之一個、兩個或三個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之重鏈可包含SEQ ID NO：6之胺基酸101至110(DMGQRRQFAY)之CDRH3序列，其中此等胺基酸中之一個、兩個或三個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之輕鏈可包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之胺基酸24至38(RASESVDTFDYSFLH)之CDRL1序列，其中此等胺基酸中之一個、兩個或三個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之輕鏈可包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之胺基酸54至60(RASNLES)之CDRL2序列，其中此等胺基酸中之一個或兩個可經不同胺基酸取代。
本發明之抗體之輕鏈可包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之胺基酸93至101(QQSNEDPYT)之CDRL3序列，其中此等胺基酸中之一或兩個可經不同胺基酸取代。
m14F128抗體具有如SEQ ID NO：8中所示的重鏈及如SEQ ID NO：9中所示的輕鏈。本發明之抗體可包含此可變重鏈序列及/或此可變 輕鏈序列。m14F128抗體具有SEQ ID NO：8之胺基酸31至35、50至68及101至110及SEQ ID NO：9之胺基酸24至38、54至60及93至101所示的CDR序列。本發明之抗體可包含此等CDR序列中的1個、2個、3個、4個、5個或全部6個。
m14F113抗體具有如SEQ ID NO：10中所示的重鏈及如SEQ ID NO：11中所示的輕鏈。本發明之抗體可包含此可變重鏈序列及/或此可變輕鏈序列。m14F113抗體具有SEQ ID NO：10之胺基酸31至35、50至68及101至110及SEQ ID NO：11之胺基酸24至38、54至60及93至101所示的CDR序列。本發明之抗體可包含此等CDR序列中的1個、2個、3個、4個、5個或全部6個。本發明之抗體可包含SEQ ID NO：10之胺基酸101至110。
術語「抗原(antigen)」(Ag)係指用於使具有免疫能力之脊椎動物免疫以產生識別Ag之抗體(Ab)的分子實體。本文中，Ag稱謂更廣泛且通常意欲包括由Ab特異性識別的目標分子，因此包括免疫過程或用於產生Ab之其他過程(例如噬菌體呈現)中所用之分子的片段或模擬物。
如本文所用，術語「抗原決定基(epitope)」係在「抗原結合多肽」(諸如抗體(Ab))與其對應抗原(Ag)之分子間相互作用的情形中定義。一般而言，「抗原決定基」係指Ab特異性結合之Ag上的區域或區，亦即，與Ab實體接觸的區域或區。實體接觸可針對Ab及Ag分子中之原子經由多種準則(例如2-6 Å之截斷距離，諸如3 Å，諸如4 Å，諸如5 Å；或溶劑可及性)加以定義。蛋白質抗原決定基在Ag中可包含直接涉及結合至Ab的胺基酸殘基(亦稱為抗原決定基之免疫顯性組分)及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基，諸如Ag中被Ab有效阻斷的胺基酸殘基，亦即，「溶劑拒避表面(solvent-excluded surface)」及/或Ab之「覆蓋區(footprint)」內的胺基酸殘基。
本文術語抗原決定基在特異性結合至TREM-1抗體之 TREM-1的任何特定區域中包含兩種類型之結合區。TREM-1可包含多個不同抗原決定基，可包括(不限於)由在成熟TREM-1構形中彼此位置靠近的一或多個非鄰接胺基酸組成的構形抗原決定基及全部或部分地由共價連接至TREM-1之分子結構(諸如碳水化合物基團)組成的轉譯後抗原決定基。
指定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之抗原決定基可使用各種實驗及計算性抗原決定基定位方法在不同的細節層次上加以描述及特性化。實驗方法包括突變誘發、X射線結晶學、核磁共振(NMR)光譜法、氫氘交換質譜法(HX-MS)及各種競爭性結合方法；此項技術中已知的方法。因為每種方法依賴於獨特的原理，所以抗原決定基之描述與藉以測定其之方法密切相關。因此，視所用抗原決定基定位方法而定，指定Ab/Ag對之抗原決定基可以不同方式加以描述。
用於Ag與Ab之間相互作用的抗原決定基在其細節最多的層次上可藉由定義以Ag-Ab相互作用存在之原子接觸的空間座標以及關於其對結合熱力學之相對影響的資訊加以描述。在細節較少的層次上，抗原決定基可藉由定義Ag與Ab之間原子接觸的空間座標加以特性化。在細節甚至更少的層次上，抗原決定基可藉由其所包含的胺基酸殘基加以特性化，如依據特定準則所定義，諸如Ab：Ag複合物中之原子之間的距離或溶劑可及性。在細節進一步較少的層次上，抗原決定基可依據功能，例如依據與其他Ab競爭性結合加以特性化。抗原決定基亦可更一般性定義為包含胺基酸殘基，其被另一胺基酸取代將改變Ab與Ag之間相互作用的特徵。
在Ab(例如Fab片段)與其Ag之間之複合物經X射線獲得之晶體結構藉由空間座標定義的情形中，術語抗原決定基在本文中(除非另外說明或與上下文相抵觸)特別定義為以所含重原子(亦即非氫原子)距離Ab中之重原子在例如4 Å之距離內為特徵的TREM-1殘基。
抗原決定基之描述及定義(視所用抗原決定基定位方法而定)係在不同細節層次上獲得，由此事實可見，可在不同的細節層次上類似地對不同Ab之針對相同Ag的抗原決定基進行比較。
在胺基酸層次上所述的抗原決定基(例如根據X射線結構確定)若含有同類胺基酸殘基，則稱其相同。若抗原決定基共有至少一個胺基酸，則稱抗原決定基重疊。若抗原決定基不共有胺基酸殘基，則稱抗原決定基為各別的(獨特的)。
抗原決定基亦可藉由比較抗體對野生型人類TREM-1之結合動力學與對預期抗原決定基中具有丙胺酸突變之人類TREM-1變異體之結合動力學來間接地定義。抗體對人類TREM-1之變異體(其中胺基酸殘基已經丙胺酸殘基置換)的親和力降低或結合消除表明，突變胺基酸有助於該抗體與野生型人類TREM-1之間的相互作用。此方法提供抗原決定基之負向鑑別。依據蛋白質錯誤摺疊或去摺疊會產生與相互作用消除相似之結果的實情，該方法有損於有效定義抗原決定基。若存在交叉反應性抗體，則可藉由對直系同源目標蛋白質(例如食蟹獼猴TREM-1)進行比較性功能獲得突變分析來補足分析。該比較將定義與例如食蟹獼猴TREM-1無交叉反應的抗體與可交叉反應之抗體之間的抗原決定基差異。
亦可藉由量測抗體(或抗體片段)結合至野生型抗原(TREM-1)之變異體來間接地鑑別抗原決定基。若抗體或其片段結合例如人類而非食蟹獼猴TREM-1且若該抗體或其片段能夠結合食蟹獼猴TREM-1之部分人類化變異體，則此再獲得的結合表明，所取代的胺基酸殘基對於抗體與抗原之相互作用具有重要性。同樣地，結合至食蟹獼猴TREM-1弱於結合至人類TREM-1的抗人類TREM-1抗體(或其Fab片段)對食蟹獼猴TREM-1之人類化變異體的親和力增強可提供關於組成結合抗原決定基之殘基之身分的資訊。
相同突變對任何指定交叉反應性抗體的影響使得有可能在可能的蛋白質錯誤摺疊(對兩種抗體之結合消除)與對人類TREM-1之相互作用喪失(結合至抗體之一，而與另一種抗體之結合消除)之間作出區分，同時明確地提供關於無交叉反應之抗體與可交叉反應之抗體之間在胺基酸層次上之抗原決定基差異的資訊。
本發明之抗體能夠結合人類TREM-1之變異體。本發明之抗體能夠結合K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6(SEQ ID NO：13)，如利用例如表面電漿子共振所測定。
本發明之抗體能夠結合食蟹獼猴TREM-1之變異體。本發明之抗體能夠結合A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6(SEQ ID NO：14)，如利用例如表面電漿子共振所測定。本發明之抗體能夠結合A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6(SEQ ID NO：15)，如利用例如表面電漿子共振所測定。
本發明之抗體能夠特異性結合TREM-1，其中該抗體能夠特異性結合人類TREM-1之(i)至少一個選自由A21、T22、K23、L24、T25、E26組成之群的胺基酸殘基，及(ii)至少一個選自由以下組成之群的胺基酸殘基：A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85，及(iii)至少一個選自由C113、V114、I115、Y116、Q117、P118及P119組成之群的胺基酸殘基。
本發明之抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO：1之胺基酸D38至F48之多肽(人類TREM-1)，如利用例如HX-MS所測定。
本發明之抗體可具有包含以下之抗原決定基：SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之胺基酸殘基D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44及 L45中的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或全部，及選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之E46、K47及F48組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個或全部，如使用HX-MS所測定。
本發明之抗體可具有包含以下之抗原決定基：選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之D42、E46、D92及H93組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個、3個或全部，如使用TREM-1變異體及表面電漿子共振所測定。
本發明之抗體可具有至少包含SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之胺基酸殘基E46及/或D92的抗原決定基，如使用TREM-1變異體及表面電漿子共振所測定。
本發明之抗體可進一步包含選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之L31、I86及V101組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個或全部。
本發明之抗體能夠特異性結合包含食蟹獼猴TREM-1(SEQ ID NO：12)之胺基酸殘基E19至L26或SEQ ID NO：21之對應胺基酸的多肽，如使用例如HX-MS所測定。
本發明之抗體能夠特異性結合人類TREM-1，其中該抗體之抗原決定基包含選自由SEQ ID NO：1之V39、K40、C41、D42、Y43、L45、E46、K47、F48及A49組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或全部。
本發明之抗體能夠特異性結合人類TREM-1，其中該抗體之抗原決定基包含SEQ ID NO：1之D42。本發明之抗體能夠特異性結合人類TREM-1，其中該抗體之抗原決定基包含SEQ ID NO：1之E46。該抗體之抗原決定基可包含SEQ ID NO：1之V39、C41、D42、Y43、L45。該抗體之抗原決定基可包含SEQ ID NO：1之E46、K47及A49。該抗體之抗原決定基可 進一步包含SEQ ID NO：1之F48。
反過來看，術語「互補位(paratope)」之定義來源於「抗原決定基」之上述定義。因此，術語「互補位」係指Ab上之由Ag特異性結合的區域或區，亦即，與Ag產生實體接觸的區域或區。
在Ab(諸如Fab片段)與其Ag之間之複合物經X射線獲得之晶體結構藉由空間座標定義的情形中，術語互補位在本文中(除非另外說明或與上下文相抵觸)特別定義為以所含重原子(亦即非氫原子)距離TREM-1中之重原子在4 Å之距離內為特徵的Ag殘基。
指定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之抗原決定基及互補位可藉由常規方法鑑別。舉例而言，抗原決定基之一般定位可藉由評估抗體結合至TREM-1多肽之不同片段或變異體的能力來確定。TREM-1內之與抗體(抗原決定基)接觸的特定胺基酸及抗體內之與TREM-1(互補位)接觸的特定胺基酸亦可使用常規方法確定。舉例而言，可將抗體與目標分子合併且可使Ab：Ag複合物結晶。複合物之晶體結構可加以測定且用於鑑別抗體與其目標之間相互作用的特定位點。
結合至相同抗原的抗體可根據其同時結合至其共同抗原的能力特性化且可經受「競爭結合」/「分組(binning)」。在本發明情形中，術語「分組」係指一種對結合至相同抗原之抗體進行分組的方法。抗體「分組」可基於兩種抗體在基於標準技術(諸如表面電漿子共振(SPR)、ELISA或流動式細胞量測術)之檢定中對其共同抗原的競爭結合。
抗體「組(bin)」係利用參考抗體加以定義。若第二抗體不能與參考抗體同時結合至抗原，則稱第二抗體與參考抗體屬於同「組」。在此情況下，參考抗體與第二抗體競爭性結合抗原之相同部分且杜撰為「競爭性抗體」。若第二抗體能夠與參考抗體同時結合至抗原，則稱第二抗體屬於各別「組」。在此情況下，參考抗體與第二抗體不能競爭性結合抗原之相 同部分且杜撰為「非競爭性抗體」。
抗體「分組」不能提供關於抗原決定基的直接資訊。競爭性抗體，亦即屬於同「組」的抗體，可具有相同抗原決定基、重疊抗原決定基，或甚至是各別的抗原決定基。若參考抗體結合至抗原上之其抗原決定基佔據了第二抗體接觸抗原上之其抗原決定基所必需的空間(「空間位阻」)，則為重疊抗原決定基。非競爭性抗體通常具有各別的抗原決定基。
本發明之抗體可與mAb 0170競爭結合至人類TREM-1。本發明之抗體可與mAb 0170競爭結合至食蟹獼猴TREM-1。換言之，本發明之抗體可與mAb 0170屬於同「組」。
本文術語「結合親和力(binding affinity)」係指兩個分子(例如抗體或其片段，與抗原)之間非共價相互作用力之量測結果。術語「結合親和力」用於描述單價相互作用(固有活性)。
兩個分子(例如抗體或其片段，與抗原)之間經由單價相互作用存在的結合親和力可藉由測定平衡解離常數(KD)來定量。又，KD可藉由量測複合物形成及解離之動力學(例如藉由SPR方法)加以測定。對應於單價複合物之締合及解離的速率常數分別稱為締合速率常數ka(或kon)及解離速率常數kd(或koff)。KD經由方程式KD=kd/ka而與ka及kd關聯。
根據上述定義，可藉由比較個別抗體/抗原複合物之KD值來比較與不同分子相互作用有關的結合親和力，諸如比較不同抗體對指定抗原的結合親和力。
本發明之抗體可以1×10-7M或小於1×10-7M、1×10-8M或小於1×10-8M、或1×10-9M或小於1×10-9M、或1×10-10M或小於1×10-10M、1×10-11M或小於1×10-11M、1×10-12M或小於1×10-12M、或1×10-13M或小於1×10-13M之親和力(KD)結合人類TREM-1，如使用表面電漿子共振所測定。本發明之抗體可以1×10-7M或小於1×10-7M、1×10-8M或小於1×10-8M、或1×10-9M 或小於1×10-9M、或1×10-10M或小於1×10-10M、1×10-11M或小於1×10-11M、1×10-12M或小於1×10-12M、或1×10-13M或小於1×10-13M之親和力(KD)結合食蟹獼猴TREM-1，如使用表面電漿子共振所測定。
本文術語「結合特異性(binding specificity)」係指分子(諸如抗體或其片段)與單一排他性抗原或與有限數目個高度同源抗原(或抗原決定基)的相互作用。相比之下，能夠特異性結合至TREM-1的抗體不能夠結合不相似的分子。本發明之抗體不能夠結合Nkp44。
相互作用之特異性及平衡結合常數值可藉由熟知方法直接測定。評估配位體(諸如抗體)結合其目標之能力的標準檢定在此項技術中已為人所知且包括例如ELISA、西方墨點法(Western blots)、RIA及流動式細胞量測術分析。抗體之結合動力學及結合親和力亦可藉由此項技術中已知的標準檢定(諸如SPR)加以評估。
可執行競爭性結合檢定，其中將抗體對目標的結合與彼目標之另一種配位體(諸如另一種抗體)對該目標的結合進行比較。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之分子(諸如TREM-1抗體、本文所述之聚核苷酸、載體及細胞)的組成物及調配物。舉例而言，本發明提供一種醫藥組成物，其包含連同醫藥學上可接受之載劑一起調配的一或多種本發明TREM-1抗體。
因此，本發明之一個目標為提供一種醫藥調配物，其包含以0.25 mg/ml至250 mg/ml之濃度(諸如10 mg/ml至200 mg/ml之濃度)存在的此TREM-1抗體，且其中該調配物具有2.0至10.0之pH值，諸如4.0至8.0之pH值。調配物可進一步包含緩衝系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑及/或界面活性劑中的一或多種，以及其各種組合。防腐劑、等張劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑在醫藥組成物中的使用已為熟習此項技術者所熟知。可參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版， 1995。
在一個具體實例中，醫藥調配物為水性調配物。此調配物典型地為溶液或懸浮液，但亦可包括膠體、分散液、乳液及多相物質。術語「水性調配物(aqueous formulation)」定義為包含至少50% w/w水的調配物。同樣，術語「水溶液(aqueous solution)」定義為包含至少50% w/w水的溶液，且術語「水性懸浮液」定義為包含至少50% w/w水的懸浮液。
在另一個具體實例中，醫藥調配物為經冷凍乾燥之調配物，在使用之前由醫師或患者向其中添加溶劑及/或稀釋劑。
在另一態樣中，醫藥調配物包含此抗體之水溶液及緩衝液，其中該抗體存在的濃度為1 mg/ml或高於1 mg/ml，且其中該調配物具有約2.0至約10.0之pH值。
本發明之TREM-1抗體及包含此等抗體的醫藥組成物可用於治療發炎疾病，諸如以下：發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(Crohns disease，CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、大腸急躁症、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎、I型糖尿病、格雷夫氏病(Grave's disease)、多發性硬化症(MS)、自體免疫心肌炎、川崎氏病(Kawasaki disease)、冠狀動脈病、慢性阻塞性肺病、間質性肺病、自體免疫甲狀腺炎、硬皮症、全身性硬化症、骨關節炎、異位性皮炎、白斑病、移植物抗宿主疾病、休格連氏症候群(Sjogrens's syndrome)、自體免疫腎炎、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、慢性發炎性髓鞘脫失多神經病變、過敏症、哮喘及作為急性或慢性炎症之結果的其他自體免疫疾病。
本發明之TREM-1抗體可適用於治療患有發炎性腸病的個體。發炎性腸病(IBD)為可影響自口腔至肛門之胃腸道的任何部分，從而引起多種症狀的疾病。IBD主要引起腹痛、腹瀉(可能出血)、嘔吐或體重減輕，但亦可引起胃腸道之外的併發症，諸如皮疹、關節炎、眼睛發炎、 疲勞及缺乏專注力。IBD患者可分成兩大類：潰瘍性結腸炎(UC)患者及克羅恩氏病(CD)患者。CD通常涉及迴腸及結腸，其可影響腸之任何區域，但經常為不連續的(疾病之病灶區域擴散遍及於整個腸中)。UC總是涉及直腸(結腸)且較為連續。在CD中，發炎具有透壁性，導致膿腫、瘺管及狹窄，而在UC中，發炎典型地限於黏膜。對於克羅恩氏病尚無已知的醫藥或外科治癒措施，而患有UC的一些患者可藉由手術移除結腸來治癒。治療方案侷限於控制症狀、維持緩解及防止復發。臨床中於發炎性腸病中之功效可以針對CD之克羅恩氏病活動指數(CDAI)分數之降低加以度量，其為基於實驗室測試及生活品質問卷調查的評分量表。在動物模型中，功效主要係依據體重增加以及疾病活動指數(DAI)加以度量，疾病活動指數為糞便堅實度、體重與糞便含血之組合。
本發明之TREM-1抗體可適用於治療患有類風濕性關節炎的個體。類風濕性關節炎(RA)為影響即使不是全身也幾乎是全身的全身性疾病且為關節炎之最常見形式之一。其特徵為關節發炎，引起疼痛、僵硬、溫熱、發紅及腫脹。此發炎為炎性細胞侵入關節的結果，且此等炎性細胞釋放可消化骨骼及軟骨的酶。結果，此發炎可引起嚴重的骨骼及軟骨損傷且引起關節惡化及嚴重疼痛，以及其他生理效應。所連累的關節會失去其形狀及準直，導致疼痛及運動能力喪失。
此項技術中已知若干用於類風濕性關節炎的動物模型。舉例而言，在膠原蛋白誘發性關節炎(CIA)模型中，小鼠顯現的發炎性關節炎類似於人類類風濕性關節炎。由於CIA與RA共有相似的免疫學及病理學特徵，因此使得其成為適用於篩選潛在人類消炎化合物的模型。於此模型中之功效係依據關節腫脹之減輕來度量。臨床中於RA中之功效係依據減少患者症狀之能力來度量，其係以關節腫脹、紅血球沈降速率、C反應蛋白含量及血清因子含量(諸如抗瓜胺酸化蛋白質抗體)之組合來度量。
本發明之TREM-1抗體可適用於治療患有牛皮癬的個體。牛皮癬為T細胞介導之皮膚發炎病症，其可引起相當的不適。其為目前尚無治癒措施且影響所有年齡人的疾病。雖然患有輕度牛皮癬的個體經常可以局部藥劑控制其疾病，但全世界範圍內有超過一百萬患者需要紫外光治療或全身性免疫抑制療法。遺憾的是，紫外輻射之不便及風險以及許多療法之毒性限制其長期使用。此外，患者牛皮癬通常會復發且在一些情況下，在中止免疫抑制療法之後不久便反彈。最近開發之基於CD4+T細胞轉移的牛皮癬模型模擬人類牛皮癬之許多態樣且因此可用於鑑別適用於治療牛皮癬的化合物(Davenport等人，Internat.Immunopharmacol 2：653-672,2002)。於此模型中之功效係使用評分系統、依據皮膚病變之減少來度量。類似地，於患者中之功效係依據皮膚病變之減少來度量。
本發明之TREM-1抗體可適用於治療患有牛皮癬性關節炎的個體。牛皮癬性關節炎(PA)為發炎性關節炎之一種類型，其發生於牛皮癬患者之子集中。在此等患者中，皮膚病變/症狀伴隨著類似於類風濕性關節炎中所見的關節腫脹。其特徵為皮膚發炎之區域斑駁、鼓起、發紅，且具有鱗屑。牛皮癬經常影響肘及膝之頂端、頭皮、肚臍、及生殖器區域或肛門周圍。約10%牛皮癬患者的關節亦顯現相關的發炎。
如本文所用，術語「治療(treatment)」係指對有需要之任何人類或其他動物個體的醫學療法。該個體預期已經歷由醫學或獸醫學執業者進行的身體檢查，其已給予推測性或明確性診斷，指示使用該治療會有益於該人類或其他動物個體之健康。該治療之時間選擇及目的可根據許多因素(諸如個體健康現狀)，因個體而異。因此，該治療可為預防性、緩解性、症狀性及/或洽愈性治療。
依據本發明，預防性、緩解性、症狀性及/或治癒性治療可代表本發明之各別態樣。
本發明之抗體可非經腸投予，諸如靜脈內，諸如肌肉內，諸如皮下。或者，本發明之抗體可經由非注射(non-parenteral)途徑(諸如經口或局部)投予。本發明之抗體可預防性投予。本發明之抗體可治療性投予(在需要時)。
例示性具體實例
1.一種鑑別功能性TREM-1抗體之方法，包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)當該第一細胞與TREM-1調節劑一起培育時，量測該細胞之活性；(c)使(b)之培養物與TREM-1抗體接觸；及(d)測得該第一細胞之活性小於或大於(b)中所量測之活性。
2.一種鑑別阻斷性TREM-1抗體之方法，包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)當該第一細胞與經活化之嗜中性白血球一起培育時，量測該細胞之活性；(c)使該第一細胞與經活化之嗜中性白血球之培養物與TREM-1抗體接觸；及(d)測得該第一細胞之活性小於(b)中所量測之活性。
3.根據具體實例1至2中任一項之方法，其中(b)中之調節劑為經活化之嗜中性白血球或TREM-1配位體。
4.一種鑑別刺激性TREM-1抗體之方法，包含(a)培養表現TREM-1、信號傳導蛋白及報導構築體之第一細胞；(b)量測該第一細胞之活性；(c)使該細胞與TREM-1抗體接觸/一起培育；及(d)測得該第一細胞之活性大於(b)中所量測之活性。
5.根據具體實例1至4中任一項之方法，其中該第一細胞來源於造血系統。
6.根據具體實例5之方法，其中該來源於造血系統之細胞為骨髓細胞。
7.根據具體實例5之方法，其中該來源於造血系統之細胞為T細胞。
8.根據具體實例1至7中任一項之方法，其中該信號傳導蛋白為DAP10。
9.根據具體實例1至7中任一項之方法，其中該信號傳導蛋白為DAP12。
10.根據具體實例1至7中任一項之方法，其中該信號傳導蛋白為TCR ξ。
11.根據具體實例1至7中任一項之方法，其中該信號傳導蛋白為Fc γ RIII。
12.根據具體實例1至7中任一項之方法，其中該信號傳導蛋白為Fc受體。
13.根據具體實例1至6中任一項之方法，其中該報導構築體包含轉錄因子及報導基因。
14.根據具體實例13之方法，其中該轉錄因子為NFAT。
15.根據具體實例14之方法，其中該轉錄因子為NFkB。
16.根據具體實例13至15中任一項之方法，其中該報導基因編碼β-半乳糖苷酶。
17.根據具體實例13至15中任一項之方法，其中該報導基因編碼螢光素酶。
18.根據具體實例13至15中任一項之方法，其中該報導基因編碼綠色螢光蛋白(GFP)。
19.根據具體實例13至15中任一項之方法，其中該報導基因為編碼氯黴素轉移酶的基因。
20.一種鑑別阻斷性TREM-1抗體之方法，包含(a)培養表 現TREM-1、DAP12及編碼螢光素酶之基因的T細胞；(b)當將該T細胞與經活化之嗜中性白血球一起培育時，量測該T細胞之發光；(c)使(b)之共培養物與TREM-1抗體接觸；及(d)測得該T細胞之發光小於(b)中所量測之活性。
21.根據具體實例7之方法，其中該細胞為BWZ.36/hTREM-1：DAP12：NFAT-LacZT細胞系。
22.一種抗體，其藉由具體實例1至3及5至21中任一項之方法鑑別。
23.一種抗體，其能夠特異性結合至TREM-1且能夠阻斷TREM-1功能。
24.根據具體實例22至23中任一項之抗體，其中該抗體能夠防止或減少TREM-1之二聚化/多聚化。
25.根據具體實例22至24中任一項之抗體，其中該抗體能夠阻斷TREM-1與其配位體之間的相互作用。
26.根據具體實例22至25中任一項之抗體，其中該抗體能夠阻斷PGLYRP1誘導之TREM-1功能。
27.根據具體實例22至26中任一項之抗體，其中該TREM-1為人類TREM-1。
28.根據具體實例27之抗體，其中該抗體亦能夠特異性結合至來自除人類以外之另一物種之TREM-1及阻斷來自除人類以外之另一物種之TREM-1的功能。
29.根據具體實例28之抗體，其中來自另一物種之該TREM-1為食蟹獼猴TREM-1。
30.根據具體實例28之抗體，其中來自另一物種之該TREM-1為恆河猴TREM-1。
31.根據具體實例22至30中任一項之抗體，其能夠特異性結合K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6(SEQ ID NO：13)。
32.根據具體實例22至31中任一項之抗體，其能夠特異性結合A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6(SEQ ID NO：14)。
33.根據具體實例22至32中任一項之抗體，其能夠特異性結合A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6(SEQ ID NO：15)。
34.根據具體實例22至33中任一項之抗體，其與mAb 0170競爭結合至人類TREM-1。
35.根據具體實例22至34中任一項之抗體，其與mAb 0170競爭結合至食蟹獼猴TREM-1。
36.根據具體實例22至35中任一項之抗體，其能夠特異性結合包含SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之胺基酸D38至F48之多肽，如利用例如HX-MS所測定。
37.根據具體實例22至36中任一項之抗體，其具有包含以下之抗原決定基：選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44及L45組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或全部，及選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之E46、K47及F48組成之群之胺基酸殘基中的1個、2個或全部，如使用例如HX-MS所測定。
38.根據具體實例22至37中任一項之抗體，其能夠特異性結合包含食蟹獼猴TREM-1之胺基酸殘基E38至L45的多肽，如使用例如HX-MS所測定。
39.根據具體實例22至38中任一項之抗體，其具有至少包含選自由SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之D42、E46、D92及H93組成之群之胺基酸殘基的抗原決定基，如使用表面電漿子共振所測定。
40.根據具體實例22至39中任一項之抗體，其具有至少包含SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之胺基酸殘基E46及/或D92的抗原決定基，如使用表面電漿子共振所測定。
41.根據具體實例22至40中任一項之抗體，其中該抗體能夠特異性結合人類TREM-1之(i)至少一個選自由A21、T22、K23、L24、T25、E26組成之群的胺基酸殘基，及(ii)至少一個選自由以下組成之群的胺基酸殘基：A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85，及(iii)至少一個選自由C113、V114、I115、Y116、Q117、P118及P119組成之群的胺基酸殘基。
42.根據具體實例22至40中任一項之抗體，其中該抗體能夠特異性結合(i)至少一個選自由以下組成之群的胺基酸殘基：V39、K40、C41、D42、Y43、T44、L45、E46、K47、F48、A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56，及(ii)至少一個選自由以下組成之群的胺基酸殘基：T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85，及(iii)至少一個選自由C113、V114、I115、Y116、Q117、P118及P119組成之群的胺基酸殘基。
43.根據具體實例22至42中任一項之抗體，其重鏈包含對應於SEQ ID NO：4之胺基酸殘基101至110(DMGIRRQFAY)的CDRH3序列，其中該等胺基酸殘基中的1個、2個或3個可經不同胺基酸取代。
44.根據具體實例22至42中任一項之抗體，其重鏈包含對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基101至110(DMGQRRQFAY)的CDRH3序列，其中1個、2個或3個胺基酸殘基可經不同胺基酸取代。
45.根據具體實例43至44中任一項之抗體，進一步包含對 應於SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6之胺基酸殘基31至35(TYAMH)的CDRH1序列，其中此等胺基酸殘基之一可經不同胺基酸殘基取代；及/或對應於SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6之胺基酸50至68(RIRTKSSNYATYYAASVKG)的CDRH2序列，其中該等胺基酸中之1個、2個或3個可經不同胺基酸殘基取代。
46.根據具體實例43至45中任一項之抗體，其輕鏈包含：對應於SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之胺基酸殘基24至38(RASESVDTFDYSFLH)的CDRL1序列，其中此等胺基酸殘基中之1個、2個或3個可經不同胺基酸取代；及/或對應於SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之胺基酸殘基54至60(RASNLES)的CDRL2序列，其中此等胺基酸殘基中之1個或2個可經不同胺基酸取代；及/或對應於SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之胺基酸殘基93至101(QQSNEDPYT)的CDRL3序列，其中此等胺基酸殘基中之1個或2個可經不同胺基酸取代。
47.根據具體實例43至46中任一項之抗體，包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6及/或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7。
48.根據具體實例22至47中任一項之抗體，其以1×10-7M或小於1×10-7M、1×10-8M或小於1×10-8M、或1×10-9M或小於1×10-9M、或1×10-10M或小於1×10-10M、1×10-11M或小於1×10-11M、1×10-12M或小於1×10-12M、或1×10-13M或小於1×10-13M之結合親和力(KD)結合人類TREM-1，如使用表面電漿子共振所測定。
49.根據具體實例48之抗體，其中該結合親和力(KD)為1×10-10M或小於1×10-10M。
50.根據具體實例22至49中任一項之抗體，其以1×10-7M或小於1×10-7M、1×10-8M或小於1×10-8M、或1×10-9M或小於1×10-9M、或1×10-10M或小於1×10-10M、1×10-11M或小於1×10-11M、1×10-12M或小於1×10-12M、 或1×10-13M或小於1×10-13M之結合親和力(KD)結合食蟹獼猴TREM-1，如使用表面電漿子共振所測定。
51.根據具體實例50之抗體，其中該結合親和力為1×10-9M或小於1×10-9M。
52.根據具體實例22至51中任一項之抗體，其為IgG。
53.根據具體實例22至52中任一項之抗體，其係用作藥劑。
54.根據具體實例22至53中任一項之抗體，其用於治療自體免疫疾病及/或慢性炎症。
55.根據具體實例22至52中任一項之抗體，其用於製備供治療自體免疫疾病及/或慢性炎症用的藥劑。
56.一種治療自體免疫疾病及/或慢性炎症的方法，包含向有需要的個體投予根據具體實例22至52中任一項之抗體。
57.根據具體實例53至55中任一項之用途或根據具體實例56之方法，其中該自體免疫疾病為類風濕性關節炎。
58.根據具體實例53至55中任一項之用途或根據具體實例56之方法，其中該自體免疫疾病為克羅恩氏病。
59.根據具體實例53至55中任一項之用途或根據具體實例56之方法，其中該自體免疫疾病為潰瘍性結腸炎。
60.根據具體實例53至55中任一項之用途或根據具體實例56之方法，其中該自體免疫疾病為牛皮癬性關節炎。
本發明藉由以下實施例進一步說明，該等實施例不應視為進一步限制。本申請案中所引述之所有數字及所有參考文獻、專利及已公開之專利申請案的內容係以引用的方式明確併入本文中。
實施例
實施例1：BWZ.36人類TREM-1：DAP12穩定細胞系的產生
BWZ.36/hTREM-1：DAP12：NFAT-LacZ細胞系(本文中亦稱為「BWZ/hTREM-1報導細胞」)來源於BW5147 T細胞(小家鼠胸腺淋巴瘤細胞系，ATCC TIB-47，LGC Standards,Middelsex,UK)且含有受NFAT啟動子元件之四個複本調控的LacZ報導構築體(參見Karttunen,J.及Shastri,N.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,3972-3976；及Fiering,S.,Northrop,J.P.,Nolan,G.P.,Matilla,P.,Crabtree,G.R.及Herzenberg,L.A.(1990)Genes Dev.4,1823-1834)。使用Superfect轉染試劑(目錄號301305，Qiagen Nordic,Denmark)將TREM/DAP12/pMX-IRES載體(編碼786 bp之TREM-1(自SmaI位點至BamHI位點)，使用TREM-1 cDNA(基因庫參考ID：NM_018643.2，Sino Biological公司，Beijing,China)作為模板且使用寡核苷酸5'TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG(SEQ ID NO：16)及5'TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC(SEQ ID NO：17)作為引子選殖入pIREShyg載體(GenBank寄存編號U89672)(目錄號6061-1，Clontech Laboratories,CA,USA)中)轉染於PLAT-E封裝細胞系(由W.Yokoyama,Washington University；或者Cell Biolabs公司(目錄號RV-101),Bio-Mediator KY,Vantaa,Finland提供)中。使用含有TREM/DAP12/pMX-IRES病毒粒子的PLAT-E上清液如下感染BWZ.36細胞：2×105個BWZ.36細胞於6孔盤中培養且培養基用1.5 ml含有病毒粒子+8 mg/ml凝聚胺(polybrene)的上清液置換。6至8小時之後，向培養盤中添加1.5 ml常規培養基且細胞另培育24小時。穩定表現TREM-1的BWZ.36細胞系經抗TREM-1單株抗體(純系21C7)染色且藉由細胞分選術加以分離。
實施例2：培養BWZ.36人類TREM-1：DAP12穩定細胞系
BWZ/hTREM-1報導細胞於具有/不具有酚紅之RPMI 1640(目錄號11835，Gibco,Carlsbad CA,USA)中培養，該具有/不具有酚紅之RPMI 1640補充有10% FCS(目錄號16140-071，Gibco,New York,USA)、1%青黴 素/鏈黴素(目錄號15070-06，Gibco)、1 mM丙酮酸鈉(目錄號11360，Gibco)、5 μM-2ME(目錄號31350-010，Gibco)及2 mM L-麩醯胺酸(目錄號25030，Gibco)。不需要特別的培養盤或塗佈。添加10 ml維爾烯(Versene)(目錄號15040，Gibco)以分離細胞，接著轉移至管中，1200 rpm離心5分鐘且於新鮮的具有/不具有酚紅之RPMI 1640中洗滌。此等細胞接著即可用於檢定中或再培養以便進一步增殖。
實施例3：小鼠免疫及鑑別mAb
為了產生結合人類TREM-1的抗體，用人類(h)TREM-1(SEQ ID NO：1)、表現hTREM-1之細胞(BWZ.36細胞)或兩者之組合使野生型Balb/C小鼠與TREM-1基因剔除(KO)小鼠(C57BL/6背景)均免疫。藉由直接ELISA，用hTREM-1蛋白進行初次篩選，或藉由FMAT，使用表現hTREM-1之BWZ.36細胞進行初次篩選。二次篩選係藉由流動式細胞量測術、用表現hTREM-1之HEK293細胞進行。接著在實施例4中所述的BWZ/hTREM-1報導體檢定中篩選陽性融合瘤上清液。
自以hTREM-1蛋白免疫(六次，間隔時間為兩週，隨後為加強注射)之KO小鼠獲得數目最多的阻斷性抗體。分離得到總計逾200種hTREM-1抗體，隨後發現其中約70種具有阻斷作用。
所有TREM-1特異性融合瘤上清液在BWZ/hTREM-1報導體檢定中首先以上清液形式加以測試，且隨後以純化抗體形式(作為可溶性抗體與盤結合型抗體，自5000 ng/ml充分滴定至7 ng/ml)加以測試。使用多位不同供者的血液作為新鮮嗜中性白血球來源。舉例而言，圖4顯示來自一種融合物之抗體，其中報導體檢定中作為阻斷活性的活性示於x軸上且抗體為盤結合型抗體時的促效活性示於y軸上。
實施例4：PGLYRP1鑑別為受嗜中性白血球表現的TREM-1配位體
PGLYRP1經使用免疫沈澱法聯合質譜分析法(IP-MS)鑑別為TREM-1配位體。使用可溶性TREM-1四聚體作為鑑別配位體的親和性「誘餌」分子。簡言之，TREM-1四聚體-Fc(SEQ ID NO：2)及CD83-Fc(SEQ ID NO：5)分別各以100 μg/ml之最終濃度與藉由如上文所述之聚葡萄糖沈降法純化的2.7億個人類嗜中性白血球在1 mL PBS中，在4℃及輕緩震盪下培育90分鐘。在此等細胞集結之後，將細胞以2 mM之濃度再懸浮於1 mL包含交聯劑3,3'-二硫基雙[磺基丁二醯亞胺丙酸酯](DTSSP)(Thermo Scientific：21578，Rockford,IL,USA)的PBS緩衝液中且在室溫下培育30分鐘。細胞用1 mL PBS洗滌3次，隨後於1 mL RIPA緩衝液(Thermo Scientific,89901,Rockford,IL,USA)中溶解。溶胞物在4℃下以15,000 X g離心10分鐘以移除不溶性物質。使用蛋白質A Mag SepharoseTM珠粒(GE Healthcare Life Sciences,28-9670-56,Piscataway,NJ,USA)使與Fc偶合探針交聯的嗜中性白血球蛋白自上清液中免疫沈澱。簡言之，50 μL珠粒首先用200 μL PBS洗滌，接著再懸浮於1 mL細胞溶胞液中，在4℃下培育60分鐘，經磁力捕捉，且依序用200 μl RIPA緩衝液洗滌2次，接著用200 μL PBS洗滌3次。自最後磁力捕捉物移除PBS之後，使用含有8 M尿素、100 mM Tris(pH 8.0)及15 mM TCEP(Thermo Scientific,77720,Rockford,IL,USA)的200 μL緩衝液溶離磁性珠粒上的蛋白質且在室溫下培育30分鐘，捕捉珠粒且將上清液轉移至Microcon Ultracel YM-30過濾器(Millipore,42410,Billerica,MA,USA)中。樣品在20℃以14,000 x g離心30-60分鐘，直至濾膜之頂部無液體殘留。所滯留之蛋白質接著在室溫下，在黑暗中用100 μL含於8 M尿素中的50 mM IAA(碘乙醯胺)烷基化30分鐘。過濾器用100 μL 50 mM NH4HCO3洗滌2次且接著轉移至新收集管中。添加含有1 μg胰蛋白酶(Promega,V5111,Madison,WI)的60 μL 50 mM NH4HCO3，隨後在37℃培育隔夜。藉由以14,000 x g離心30分鐘、隨後用50 μL 50 mM NH4HCO3洗滌過濾器來 收集胰蛋白酶消化物。使用LTQ-Orbitrap-XL質譜儀(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)藉由LC/MS/MS分析10 μL消化物。針對IPI人類資料庫(3.81版本)，使用SEQUEST-Sorcerer引擎(4.0.4版本)(SageN,Milpitas,CA,USA)搜尋資料且接著用Scaffold 3(Proteome Software,Portland,OR,USA)進行後處理以過濾錯誤發現率(false discovery rate)為1%的蛋白質ID。減去陰性對照之後，發現PGLYRP1為與hTREM-1四聚體特異性締合的高置信蛋白質。嗜中性白血球之免疫沈澱顯示，在148種所鑑別的蛋白質中，72種蛋白質由單獨對照構築體(CD83)免疫沈澱，73種蛋白質對TREM-1與對CD83相同，而僅3種具有TREM-1特異性(圖3)。隨後使用來自不同供者的嗜中性白血球重複實驗且再次鑑別PGLYRP1與hTREM-1特異性相互作用。
實施例5：大腸桿菌所表現之人類PGLYRP1之再摺疊及純化
人類PGLYRP1以包涵體形式於大腸桿菌BL21(DE3)細胞中表現。細菌藉由離心收集，再懸浮於50 mM Tris-HCl pH 8.0、500 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5% Triton X-100中且藉由音波處理加以分裂。不溶性集結粒用50 mM Tris pH 8.0、1% Triton X-100、2 M尿素洗滌三次且用50 mM Tris pH 8.0洗滌一次，接著溶解於50 mM Tris-HCl、6 M鹽酸胍pH 7.4、1 mM DTT(最終蛋白質濃度20 mg/ml)中。對於試管內摺疊而言，將所溶解的人類PGLYRP1包涵體於50 mM Tris pH 8.0、2 mM EDTA、5 mM半胱胺、0.5 mM胱胺、0.4 M精胺酸中稀釋(最終蛋白質濃度1 mg/ml)。在4℃隔夜之後，摺疊混合物藉由離心/過濾澄清且接著於10 mM MES pH 3.5中稀釋12倍以降低電導率及pH值(最終pH值約5.8，電導率約6 mS/cm)。所稀釋之摺疊混合物接著施加於Hitrap SP HP 5 ml管柱(17-1151-01 GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上，隨後用50 mM MES pH 5.8、以5個管柱體積進行洗滌。所結 合的人類PGLYRP1接著用0-60%線性梯度之50 mM MES pH 5.8、1 M NaCl、以20個管柱體積溶離。將含有再摺疊之人類PGLYRP1的溶離份彙集且藉由Amicon ultra 15離心裝置(UFC800324 3,000 kDa MWCO,Millipore,Hellerup,Denmark)濃縮至小於4 ml。接著使用Hiload 26/60 Superdex 75 318 ml管柱(17-1070-01 GE Healthcare,Uppsala,Sweden)純化及使蛋白質相對於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)進行緩衝交換。大部分再摺疊人類PGLYRP1蛋白呈單體形式。濃縮之後，藉由NANODROP UV光譜儀量測280 nm吸光度來測定最終蛋白質濃度。藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)評估蛋白質純度。
實施例6：建立TREM-1反應性報導體檢定
TREM-1報導細胞系係藉由用NFAT-LacZ報導構築體以及hTREM-1及DAP12轉染BWZ.36細胞系(如實施例1中所述)來產生。藉由聚葡萄糖沈降法純化健康供者之嗜中性白血球。血液在FicollPaque(17-0840-03，GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)上梯度分層(在50 ml管中，3份Ficoll及4份血液之比率)，接著在22℃以400xg離心30分鐘而不制動。中間PBMC帶藉由抽吸平緩地移除。將在所包裝之RBC上分層的嗜中性白血球吸出且轉移至50 ml聚丙烯管中。嗜中性白血球及污染性RBC用1×PBS稀釋至40 ml且隨後添加10 ml 4% DEXTRAN 500(Sigma,31392,St Louis,MO,USA)之PBS溶液。藉由輕緩倒置進行混合之後，將管在22℃擱置20-30分鐘。接著將富含粒細胞的上清液轉移至新管中且在22℃以250 x g離心5分鐘；吸出上清液且丟棄。污染性RBC經滲透性溶胞而移除，簡言之，將細胞集結粒再懸浮於7.5 ml 0.2% NaCl中；輕緩混合55-60秒且添加17.5 ml1.2% NaCl溶液。接著用PBS使體積達到50 ml且以250 x g離心5分鐘，集結粒再懸浮於7.5 ml 0.2% NaCl中，以再次重複溶胞。將最終粒細胞集結粒再懸浮於RPMI/10% FBS中。此等嗜中性白血球用PGN(InVivogeh,tlrl-pgnsa, SanDiego,CA,USA)刺激隔夜以產生能夠刺激TREM-1的經活化之嗜中性白血球。接著以報導細胞：嗜中性白血球之1：3比率向PGN活化之嗜中性白血球培養物中添加BWZ/hTREM-1報導細胞。可使用由PGLYRP1(SEQ ID NO：23)及PGN組成的TREM-1配位體複合物替代經活化之嗜中性白血球來刺激TREM-1。在經聚-D-離胺酸塗佈之黑色細胞培養盤(編號356640，購自BD Biosciences,San Jose,CA,USA)中進行檢定。培養24小時之後，使用BetaGlo試劑(E4720，購自Promega,Madison,WI,USA)讀取TREM-1活化且使用Perkin Elmer之TopCount發光計數器量測發光。作為陽性對照，可藉由能夠促效TREM-1的盤結合型TREM-1抗體(R&D MAB1278,Minneapolis,MN,USA)活化TREM-1。培養盤用同型對照物或TREM-1抗體MAB1278(3 μg/ml，於PBS中，100微升/孔)在冷凍機中塗佈隔夜或在37℃、5% CO2下塗佈2小時，隨後添加BWZ/hTREM-1報導細胞。培育6-24小時之後，可使用BetaGlo試劑(E4720，購自Promega,Madison,WI,USA)讀取TREM-1活化且使用Perkin Elmer之TopCount發光計數器量測發光。此BWZ.36/hTREM-1：DAP12：NFAT-LacZ細胞系(「BWZ/hTREM-1報導細胞」)對抗體介導之TREM-1交聯顯示高反應性，當用1-10 μg/ml盤結合型市購抗TREM-1抗體刺激時，對NFAT驅動之LacZ產生的誘導作用為同型對照的約40倍(圖1)。用單獨toll樣受體混合液(tlrl-kit2hm,Invivogen,Sigma-Aldrich Denmark)(BWZ+TLR)刺激時，未觀測到信號增強。此外，未活化的嗜中性白血球不能刺激TREM-1，而經TLR促效劑混合液(tlrl-kit2hm,Invivogen,Sigma-Aldrich Denmark)活化的嗜中性白血球可刺激BWZ/hTREM-1報導細胞。
下表1顯示，本文揭示之TREM-1抗體在此BWZ/hTREM-1報導細胞檢定中能夠阻斷配位體誘導之TREM-1活化。
表1
所測試之市購抗體：MAB1278(目錄號MAB1278，R&D Systems,Minneapolis,MN 55413,USA)、抗TREM-1HPA(目錄號HPA005563，Sigma,St Louis,MO,USA)、TREM26(目錄號314902，Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)及TREM37(目錄號316102，Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)皆不能阻斷TREM-1信號。
實施例7：使用HX-MS進行的抗原決定基定位
材料
所用蛋白質批料為：hTREM-1：人類重組TREM-1，非糖基化，於大腸桿菌中產生(目錄號PRO-457，ProSpec-Tany TechnoGene有限公司，Rehovot,Israel)。
實驗之前，所有蛋白質皆相對於PBS pH 7.4進行緩衝交換。
方法：HX-MS實驗
儀器及資料記錄
HX實驗藉由LeapShell軟體(Leap Technologies公司)操作的Leap自動儀器(H/D-x PAL；Leap Technologies公司)自動操作，其執行氘交換反應之起始、反應時間控制、中止反應、注射於UPLC系統上及消化時間控制。Leap自動儀器裝備有兩個溫度控制堆疊，其分別維持在20℃用於儲存緩衝液及HX反應以及維持在2℃用於儲存蛋白質及中止溶液。Leap自動儀器此外含有在1℃冷卻的Trio VS裝置(Leap Technologies公司)，該裝置容納前置管柱及分析管柱以及胃蛋白酶管柱、LC管及切換閥。Trio VS裝置之切換閥已自HPLC升級至Microbore UHPLC切換閥(Cheminert,VICI AG)。對於管線內胃蛋白酶消化，裝載100 μl含有200 pmol hTREM-1的中止樣品且使用200 μL/min之等濃度流速(0.1%甲酸：CH3CN 95：5)通過Poroszyme®固著胃蛋白酶筒柱(2.1×30 mm(Applied Biosystems))。所得肽截留且脫鹽於VanGuard前置管柱BEH C18 1.7 μm(2.1×5 mm(Waters公司))上。隨後，切換閥以將前置管柱定位成與分析管柱UPLC-BEH C18 1.7 μm(2.1×100 mm(Waters公司))串聯，且使用9分鐘15-35% B梯度(以200 μl/min自AQUITY UPLC系統(Waters公司)遞送)分離肽。移動相由A：0.1%甲酸及B：0.1%甲酸/CH3CN組成。使用Q-TOF Premier MS(Waters公司)，以正離子模式獲得ESI MS資料，及依據MS/MS擷取(CID)及高能(MSE)實驗的各別資料。使用白胺酸-腦啡肽作為鎖定質量([M+H]+離子，m/z 556.2771)且以連續模式收集資料(關於配置之進一步描述，參見Andersen及Faber,Int.J.Mass Spec.,302,139-148(2011))。
資料分析
在各別實驗中使用標準CID MS/MS或MSE方法(Waters公司)鑑別出胃酶解肽。使用BiopharmaLynx 1.2(017版本)處理MSE資料。使用MassLynx軟體及內部MASCOT資料庫分析依據CID資料的MS/MS擷取。
對HX-MS原始資料文檔進行連續性鎖定質量校正。使用原型定製軟體(HDX瀏覽器，Waters公司)及HX-Express((β版本)；Weis等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.17,1700(2006))進行資料分析，亦即，氘化肽之質心確定及交換曲線之作圖。所有資料亦目視評估以確保僅解析之肽同位素包膜經受分析。
抗原決定基定位實驗
藉由在mAb存在或不存在下、在相應氘化緩衝液(亦即於D2O中製備之PBS，最終96% D2O，pH 7.4(未校正的值))中將hTREM-1稀釋6至8倍來起始醯胺氫/氘交換(HX)。所有HX反應皆在20℃進行且在4 μM mAb不存在或存在下含有4 μM hTREM-1，從而得到2倍莫耳濃度過量的mAb結合位點。以10秒至10000秒的適當時間間隔，用50 μl冰冷中止緩衝液(1.35 M TCEP)中止HX反應物之50 μl等分試樣，使得最終pH值為2.5(未校正的值)。
結果及論述
此實驗係對針對hTREM-1之mAb 0023、0024、0025、0026及市購mAb MAB1278(RnD Systems)及純系26(Biolegend)之抗原決定基進行定位。在8種不同mAb不存在或存在下，對43種肽(涵蓋hTREM-1之初級序列之94%)之HX時程監測10至10000秒。
在較早時間點(例如<300秒)觀測到之交換保護作用與表面暴露之醯胺質子有關且從而亦與蛋白質界面有關。相比之下，在時程後期觀測到之作用與醯胺氫緩慢交換有關且從而與蛋白質之結構核心有關。因此，抗原決定基作用出現於較早時間點，而結構穩定化作用顯現為後期時間點之交換減少(Garcia,Pantazatos及Villareal,Assay and Drug Dev.Tech.2,81(2004)；Mandell,Falick及Komives,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,14705(1998))。
在指定mAb存在或不存在下在較早時間點觀測到之交換模式可分成兩個不同類別：一類肽顯示不受mAb結合影響的交換模式。相比之下，hTREM-1中之另一類肽在mAb結合時顯示保護作用而免於交換。舉例而言，在與D2O交換100秒時，mAb 0023之區域Y111-F126中，約2個以上醯胺被保護而免於交換。顯示此等保護作用的區域指定為抗原決定基區域。
mAb 0023及0026之抗原決定基定位
mAb 0023與0026均誘導hTREM-1之交換特徵發生相同改變且在此一併描述。在0023/0026結合時顯示保護作用的區域包括涵蓋殘基T22-L96及Y111-D127的肽。然而，藉由比較各肽在結合mAb 0023/0026時內部之交換保護作用之相對量及抗原決定基作用在肽T25-F48、R84-Q112及起始於P118之肽中之缺乏，可將抗原決定基範圍縮小至殘基A21-E26、A49-I85及C113-P119。雖然在序列中相隔較遠，但此等區域在hTREM-1之3D結構中較近。
mAb 0024及Biolegend純系26之抗原決定基定位
來自Biolegend之mAb 0024與純系26均誘導hTREM-1之交換特徵發生相同改變且在此一併描述。在mAb 0024結合時顯示保護作用的區域包括涵蓋殘基V101-Q112的肽。藉由比較各肽在結合mAb 0024時其內部之交換保護作用之相對量及在周圍肽中抗原決定基作用之缺乏，可將抗原決定基範圍縮小至殘基Q104-Q112(圖7B)。
NNC mAb 0025之抗原決定基定位
在0025結合時顯示保護作用的區域包括涵蓋殘基D38-M63、T70-L96及Y111-D127的肽(圖7C)。然而，藉由比較各肽在結合0254-0025時內部之交換保護作用之相對量及抗原決定基作用在周圍區域之肽中的缺乏，可將抗原決定基範圍縮小至殘基V39-Q56、T70-I85及 C113-P119。儘管在序列中相隔較遠，但此等區域在hTREM-1之3D結構中較近(圖8)。
MAB1278之抗原決定基定位
在MAB1278結合時顯示保護作用的區域包括涵蓋殘基T70-L96及V101-Q112的肽(圖7D)。然而，藉由比較各肽在結合MAB1278時內部之交換保護作用之相對量及抗原決定基作用在周圍區域之肽中的缺乏，可將抗原決定基範圍縮小至殘基T70-I85及Q104-Q112。雖然在序列中相隔較遠，但此等區域在hTREM-1之3D結構中較近。
mAb 0023/0026及mAb 0025之抗原決定基之結構位置顯示於圖7A中。mAb 0023及0026之抗原決定基似乎主要存在於hTREM-1晶體結構二聚體之二聚體界面之β片中。此等mAb之拮抗作用可為防止hTREM-1二聚化及因此進行信號傳導的結果。
實施例8：TREM-1與mAb 0170之間相互作用界面的確定
對重組人類TREM-1與食蟹獼猴TREM-1(分別為hTREM-1及cTREM-1)進行抗原決定基定位。此實施例中所用的hTREM-1構築體包含殘基M1-H140(SEQ ID NO：18)且cTREM-1構築體包含殘基M1-R180(SEQ ID NO：12)，其中向C端添加六個組胺酸殘基且使用野生型hTREM-1之胺基酸編號。在此實施例中，cTREM-1之胺基酸係根據hTREM-1中之類似殘基編號，如圖11中所說明。若殘基編號為58或小於58，則此實施例中所用之編號可藉由減去19來轉換為SEQ ID NO：12中之編號，且若殘基編號為60或大於60，則此實施例中所用之編號可藉由減去20來轉換為SEQ ID NO：12中之編號。舉例而言，此實施例中之cTREM-1上之殘基編號E46對應於SEQ ID NO：12中之殘基(46-19=27)E27。此實施例中之cTREM-1上之殘基編號L96對應於SEQ ID NO：12中之殘基(96-20=76)L76。
TREM-1單獨或在mAb 0170存在下的溶液於97%氘化hepes 緩衝液(20 mM hepes，150 mM氯化鈉，pH 7.4)中稀釋25倍。非氘化對照物係藉由於質子化hepes緩衝液中稀釋來製備。氫交換實驗係在waters HDX nanoAcquity超高效液相層析(UPLC)系統(Waters公司，Milford,MA,USA)上進行，該系統包括用於自動化樣品製備的HD-x PAL自動取樣器(LEAP Technologies公司，Carrboro,NC,USA)。LC管、前置管柱及分析管柱及切換閥位於冷卻至0.3℃的腔室中。胰蛋白酶消化管柱在15℃儲存。氫交換反應在20℃進行。質譜分析係使用Waters SYNAPT G2 HDMS質譜儀線上進行。
在120 pmol mAb 0170存在或不存在下含有100 pmol人類或食蟹獼猴TREM-1(1.54-1.98 μl)的體積於氘化hepes緩衝液中稀釋至最終體積為50 μl。以適當的時間間隔，將整個體積轉移至且中止於50 μl 1.35 mM參(2-羧乙基)膦(經調節至pH 2.4且保持在3℃)中。立即注射99 μl中止溶液且通過Porozyme固著胃蛋白酶管柱(2.1 mm×30 mm)(Applied Biosystems,Life Technologies公司，Carlsbad,CA,USA)且截留於Waters VanGuard BEH C18 1.7 μm(2.1 mm×5 mm)管柱上(流速為100 μl/min，使用5%(vol/vol)甲醇及0.1%甲酸移動相)。在Waters UPLC BEH C18 1.7 μm(1.0 mm×100 mm)管柱上，使用10-40%乙腈梯度(含有0.1%甲酸)、以40 μl/min流速分離肽。
質譜儀係以正離子模式(啟動離子遷移性分離)操作。電噴霧條件為3.2 kV毛細管，25 V樣品錐，及4 V萃取錐偏移，850 ml/min流速之氮氣脫溶劑氣體(加熱至350℃)及50 ml/min錐氣流速。源塊加熱至120℃。鎖定質量校正資料係使用作為參考化合物之白胺酸-腦啡肽之1+離子(m/z 556.2771)獲得且在資料分析期間應用。為了鑑別肽，使用6 V(低能)及50 V(高能)之阱碰撞偏移來進行MSE類型實驗。僅使用6 V低能阱碰撞偏移來分析氘化樣品。關於其他細節，參見Andersen,M.D.,Faber,J.H.,Int.J.Mass Spectom.(2011),302,139-148。
使用Waters ProteinLynx Global Server 2.5分析MSE資料且鑑別hTREM-1肽涵蓋80%蛋白質序列(表3)且鑑別cTREM-1肽涵蓋100%蛋白質序列(表4)。使用自動應用鎖定質量校正且測定各肽中之氘結合度的Waters DynamX 1.0分析HX-MS資料文檔。另外，人工檢查所有資料以確保氘結合之恰當峰值分配及計算。
結果
肽及其交換模式之清單提供於表3中。
當mAb 0170結合hTREM-1時，在涵蓋A21至L96序列之肽中觀測到防止交換的保護作用且因此確定抗原決定基位於此區域內。考慮到在mAb 0170結合時不顯示防止交換之保護作用的肽，可將抗原決定基範圍縮小至區域D38-F48。在mAb 0170存在或不存在下，區域R84-L96顯示很小直至無交換，且不可能斷定此區域是否為mAb 0170結合抗原決定基之一部分。肽K47-A68在mAb 0170結合時顯示免於交換的保護作用，但當mAb 0170結合時，肽T44-C69被保護。肽之開頭兩個殘基快速回復交換且失去彼等殘基的交換資訊。結論為殘基E46、K47及F48中之至少一者對於mAb 0170結合具有重要作用。
針對cTREM-1之mAb 0170抗原決定基
肽及其交換模式之清單示於表4中。
當mAb 0170結合至cTREM-1時，在涵蓋E38至A68序列之肽中觀測到防止交換的保護作用且因此確定抗原決定基位於此區域內。考慮到在mAb 0170結合時不顯示防止交換之保護作用的肽，可將抗原決定基範圍縮小至區域E38-L45。此抗原決定基與hTREM-1上之mAb 0170抗原決 定基很好對應，但截斷三個殘基。hTREM-1中之肽C44-T69在mAb 0170結合時受到保護，但cTREM-1中涵蓋相應序列之肽A44-L67及A44-A68不受保護。因此，儘管hTREM-1中之殘基E46、K47及F48中的至少一者促成了結合抗原決定基，但相應殘基E46、K47及Y48不涉及mAb 0170結合至cTREM-1。
實施例9：藉由表面電漿子共振(SPR)研究抗TREM-1抗體與人類及食蟹獼猴TREM-1的相互作用動力學
在經由表面電漿子共振即時量測分子相互作用的ProteOn分析儀(BioRad)上進行結合研究。在25℃進行實驗且樣品在15℃樣品隔室中儲存。藉由ProteOn報導的信號(RU，反應單位)與六個平行流動池中之個別感測晶片表面上的質量直接相關。根據製造商說明書，將Biacore人類或小鼠Fc捕捉套組中的抗人類Fc單株抗體或抗鼠科Fc多株抗體沿水平方向固著於GLM感測晶片之流動池上。捕捉抗體之最後固著含量在不同實驗中為約2600-6000 RU。捕捉純化單株小鼠抗hTREM-1抗體或重組表現之抗hTREM-1抗體如下進行：抗體於操作緩衝液(10 mM Hepes、0.15 M NaCl、5 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中稀釋至5-10 nM，且以30 μl/min沿垂直方向注射60秒，靠近所有流動池形成參考區間斑點，其中僅抗Fc抗體被固著。此典型地使測試抗體之最終捕捉量為約100-300 RU且使分析物之Rmax值為30-90 RU。hTREM-1或cTREM-1蛋白之結合如下進行：將分析物(抗原)沿水平方向注射於所有流動池上，以便相對於結合至參考區間斑點比較性分析與所捕捉之不同抗TREM-1抗體的結合。hTREM-1或 cTREM-1蛋白於操作緩衝液中1：3連續稀釋至1.2-100 nM，以100 μl/min注射250秒且允許解離600秒。在分析物每輪注射(經由兩次18秒以100 μl/min注射10 mM甘胺酸pH 1.7及50 mM NaOH)之後，使GLM表面再生。此再生步驟將抗TREM-1抗體及所結合的任何TREM-1蛋白自所固著的捕捉抗體表面移除，且使得下一個相互作用樣品對隨後結合。再生程序不能將直接固著的抗Fc捕捉抗體自晶片表面移除。
抗體與抗原之間的結合親和力係藉由測定平衡解離常數(KD)來定量，平衡解離常數係藉由量測複合物形成及解離之動力學來測定。使用用於資料分析的ProteOn評估軟體，藉由將資料與1：1朗繆爾模型(Langmuir model)擬合來檢索對應於單價複合物之締合及解離的速率常數，諸如ka(締合速率)及kd(解離速率)。KD經由方程式KD=kd/ka而與ka及kd關聯。
在資料分析之前，藉由雙重參照(減去參考表面信號以及將空白緩衝液注射於所捕捉的抗TREM-1抗體上)來處理結合曲線。由此校正樣品注射期間的儀器雜訊、主體移動及漂移。
實施例10：阻斷性TREM-1 mAb 14F69之人類化
經由選殖融合瘤14F128A1及14F113A1B1C1獲得兩種主要抗體之可變區。兩種抗體均使用SMARTER-RACE技術(Clontech)選殖。人類化嘗試係使用融合瘤純化抗體作為基準、以迭代循環的形式進行，其中首先評估CDR移植抗體的親和力且接著再工程改造以包括更多回復突變直至保留可接受的親和力。CDR移植抗體用計算機(in silico)設計且自供應商(www.genscript.com)定購。隨後使用定點突變誘發(Stratagene)對抗體進行再次工程改造。所有抗體表現於HEK293-6E細胞中為親和力測試作準備。下文描述選擇適當人類生殖系及測試回復突變之主要考慮因素。此實施例中所用可變區之所有編號係指Kabat編號方案。
>m14F128A1_H(CDR以粗體及下劃線標出)(SEQ ID NO 8)
>m14F128A1_L(CDR以粗體標出)(SEQ ID NO 9)
>m14F113A1B1C1_H(CDR以粗體標出)(SEQ ID NO 10)>m14F113A1B1C1_L(CDR以粗體標出)(SEQ ID NO 11)
依據序列分析，根據Kabats定義之m14F128A1之CDR為：
m14F128A1與m14F113A1B1C1之間的差異指定為[m14F128A1/m14F113A1B1C1]。
在MOE[可購自www.chemcomp.com]中使用標準技術建立m14F128A1之3D模型且有效CDR區(VH：31-35B、50-58、95-102；VL：24-34、50-56、89-97)之4.5 Å內之所有殘基定義為掩蔽殘基。掩蔽殘基對於維持CDR中之結合皆具有潛在重要作用。
對於重鏈而言，掩蔽殘基包括位置1-2、4、27-37、47、49-59、69、71、73、78、92-103，且對於輕鏈而言，掩蔽殘基包括位置1-5、7、23-36、46、48-56、58、62、67-71、88-98。
對m14F128A1使用生殖系搜尋及人工檢驗，鑑別VH3_73及JH4為重鏈之適當人類生殖系組合且鑑別VKIV_B3及JK2為輕鏈之適當人類生殖系組合。
接著根據以下規則進行人類化：
- 視掩蔽殘基外的殘基為人類殘基。
- 視掩蔽殘基內及Kabat CDR內的殘基為鼠科殘基。
- 視掩蔽殘基內及Kabat CDR外的具有小鼠/生殖系共同序列的殘基為共同序列。
- 對掩蔽殘基內及Kabat CDR外的具有小鼠/生殖系差異的殘基進行潛在回復突變。
將m14F128A1之有效CDR區移植入生殖系中形成m14F128A1、hz14F128A1之基本人類化構築體。
與鼠科CDR的唯一差異在於CDR_H2(以粗體顯示)。m14F128A1與hz14F128A1之間在掩蔽殘基方面的任何不一致將形成潛在回復突變且清單包括：hz14F128A1_H：S30N,G49A,A78L,V93T
hz14F128A1_L：M4L,M58I,G68R。
此外，利用m14F128A1與m14F113A1B1C1之親密同源性提出可影響hz14F128A1之親和力的殘基。
hz14F128A1_H：N53S,I98Q
hz14F128A1_L：S27D_T,G29D,I30Y,M33L。
為了研究所有潛在人類化mAb，產生且測試上述突變體之所有組合。
來源於融合瘤14F113的最後人類化抗hTREM1抗體(mAb 0170)含有1個LC構架回復突變(M4L)及1個HC CDR3突變(Q98I)。根據親和力增效研究，在HC CDR3中引入突變，其中高同源性抗體命名為14F128。用於包括兩個突變的基本原理描述如下。
對抗體14F128及14F113之親和力增效研究
融合瘤抗體14F128與14F113高度同源且來源於相同體細胞再組合事件。兩種抗體競爭結合hTREM1，其中14F113具有最高親和力。總體而言，兩種抗體之CDR移植形式在其CDR組成上僅有6個胺基酸不同(4個位於LC CDR中且2個位於HC CDR中)。6個突變(當比較14F113與14F128時)為LC T27dS、D29G、Y30I、L33M及HC S54N、Q98I。儘管CDR移植之14F128的親和力小於CDR移植之14F113，但研究出當所有6個突變皆存在時的總體作用可抑制6個突變中之一或多種所產生的有益親和力作用。因此將所有6個突變(除HC S54N外)個別地引入CDR移植之14F113抗體中且依據親和力對抗體評級。兩個突變(LC L33M及HC Q98I)個別地能夠改良CDR移植之14F113的親和力。HC在位置Q98I之突變使所得抗體(mAb 0170)產生極佳親和力。
構架回復突變親和力分析
小鼠型式14F113抗體具有7個在人類化期間潛在需要包括在內的突變作為回復突變。HC及LC中之潛在回復突變分別為S30N、 G49A、A78L及T93V M4L、V58I、G68R。將7個回復突變個別地引入CDR移植之14F113中且接著依據親和力評級。儘管若干突變能夠改良親和力，但對mAb 0170僅選擇LC突變M4L。對包括突變的決定相對於表現效價(HEK293 6E)、親和力及突變總數作出平衡。
實施例11：藉由表面電漿子共振(SPR)研究TREM-1抗體對hTREM-1的相互作用動力學：在mAb 0170與市購TREM-1抗體之間作出比較
在經由表面電漿子共振即時量測分子相互作用的ProteOn分析儀(BioRad)上進行結合研究。在25℃進行實驗且樣品在15℃樣品隔室中儲存。藉由ProteOn報導的信號(RU，反應單位)與六個平行流動池中之個別感測晶片表面上的質量直接相關。所包括的市購抗體為Biolegend #314907、Biolegend #316102(Biolegend,USA)、Hycult Biotech HM2252(Hycult Biotech,Netherlands)、R&D #MAB1278(R&D systems,United Kingdom)、SC98Z12(Santa Cruz Biotechnology,USA)、Sigma #WH0054210m4、Sigma #SAB1405121(Sigma-Aldrich Danmark A/S)。
根據製造商說明書，將Biacore人類或小鼠Fc捕捉套組中的抗人類Fc單株抗體或抗鼠科Fc多株抗體沿水平方向固著於GLM感測晶片之流動池上。捕捉抗體之最後固著含量在不同實驗中為約2600-6000 RU。捕捉純化單株小鼠抗hTREM-1抗體或重組表現之抗hTREM-1抗體如下進行：抗體於操作緩衝液(10 mM Hepes、0.15 M NaCl、5 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中稀釋至5-10 nM，且以30 μl/min沿垂直方向注射60秒，靠近所有流動池形成參考區間斑點，其中僅抗Fc抗體被固著。此典型地使測試抗體之最終捕捉量為約100-300 RU且使分析物之Rmax值為30-90 RU。hTREM-1或cTREM-1蛋白之結合如下進行：將分析物沿水平方向注射於所有流動池上，以便相對於結合至參考區間斑點比較性分析與所捕捉之 不同抗TREM-1抗體的結合。hTREM-1或cTREM-1蛋白於操作緩衝液中1：3連續稀釋至1.2-100 nM，以100 μl/min注射210秒且允許解離600秒。在分析物每輪注射(經由兩次以100 μl/min注射10 mM甘胺酸pH 1.7及50 mMNaOH)之後，使GLM表面再生。此再生步驟將抗TREM-1抗體及所結合的任何TREM-1蛋白自所固著的捕捉抗體表面移除，且使得下一個相互作用樣品對隨後結合。再生程序不能將直接固著的抗Fc捕捉抗體自晶片表面移除。
抗體與抗原之間的結合親和力係藉由測定平衡解離常數(KD)來定量，平衡解離常數係藉由量測複合物形成及解離之動力學來測定。使用用於資料分析的ProteOn評估軟體3.1.0.6，藉由將資料與1：1朗繆爾模型擬合來檢索對應於單價複合物之締合及解離的速率常數，諸如ka(締合速率)及kd(解離速率)。KD經由方程式KD=kd/ka而與ka及kd關聯。
在資料分析之前，藉由雙重參照(減去參考表面信號以及將空白緩衝液注射於所捕捉的抗TREM-1抗體上)來處理結合曲線。由此校正樣品注射期間的儀器雜訊、主體移動及漂移。
實施例12：藉由表面電漿子共振對抗人類TREM-1單株抗 體進行競爭結合研究
為了區別不同結合位點(抗原決定基)，使用單株小鼠抗hTREM-1抗體或重組表現之人類化抗hTREM-1抗體進行SPR競爭結合研究。所包括的市購抗體Biolegend #314907(Biolegend,USA)及SC98Z12(Santa Cruz Biotechnology,USA)。競爭抗原上之相同或重疊結合位點(抗原決定基)的抗hTREM-1單株抗體不能同時結合至抗原且因此歸為同「組」。不競爭抗原上之相同或重疊結合位點的抗TREM-1單株抗體能夠同時結合且因此歸為不同「組」。使用人類可溶性TREM-1胞外域作為抗原來進行實驗。
所有研究均在25℃進行，且樣品在15℃樣品隔室中儲存。使用0.4 M EDAC[1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽]與0.1 M磺基-NHS[N-羥基磺基丁二醯亞胺]之1：1混合物將個別抗TREM-1單株抗體及無關的對照單株抗體固著於GLC感測晶片之各別流動池上。各抗體於10 mM乙酸鈉pH 5.0中稀釋至濃度為25 μg/ml或10 μg/ml(SC98Z12(80394))，且以30 μl/min固著至個別流動池240秒。抗體固著至流動池L1-L6(包括對照)。抗體固著之後，流動池上之活性位點用1 M乙醇胺阻斷。在水平方向上利用活化及去活化作用進行固著，從而形成無蛋白質固著之區間斑點參考點。在一個實驗中，測試抗體之最終固著量的範圍為約1100 RU至1300 RU，除一種抗體(SC98Z12)外(其中固著量僅390 RU)。重組人類TREM-1於操作緩衝液(10 mM Hepes、0.15 M NaCl、5 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中稀釋至100 nM。抗原以30 μl/min沿水平方向注射於所固著之抗體上300秒，從而控制對區間斑點參考物及所固著之對照抗體的潛在無特異性結合，使得TREM-1捕捉量為150-600 RU，固著量低的一種抗體(SC98Z12)除外(其中捕捉量僅4 RU)。
各抗體(已固著者)沿水平方向注射於平行流動池上，以便相對於結合至區間斑點參考物及所固著之對照抗體比較性分析與初級抗體 所捕捉之hTREM-1的結合。各競爭性抗體稀釋至100 nM且以100 μl/min注射250秒。在分析物每輪注射(經由兩次18秒以100 μl/min注射1 M甲酸pH 3.5、3 M MgCl2及50 mM NaOH)之後，使GLC晶片再生。此再生步驟自所固著之抗體表面移除TREM-1抗原及所結合之任何二級抗體，且允許下一個測試樣品之隨後結合。再生程序不能將直接固著之抗TREM-1測試抗體(初級抗體)自晶片表面移除。使用ProteOn ManagerTM 3.1.0.6軟體進行資料分析。評估捕捉量以確保再生步驟在依序注射期間提供一致的結合表面。觀測到人類TREM-1未顯著地非特異性結合至區間斑點對照表面，亦未顯著地結合至所固著之對照抗體。藉由減去區間斑點對照表面信號來處理結合曲線。由此校正樣品注射期間的儀器雜訊及主體轉移。
競爭結果係以陽性或陰性結合報導(表8)。陽性(+)結合表示競爭性抗體能夠與初級抗體同時結合hTREM-1(亦即其不競爭)，且初級抗體及競爭性抗體因此歸為不同抗原決定基組。陰性結合表示競爭性抗體不能與初級抗體同時結合hTREM-1(亦即其競爭)，且初級抗體及競爭性抗體因此歸為相同抗原決定基組。此等實驗中之反應值顯著且從而可明確地確定抗TREM-1單株抗體之抗原決定基組。
MAb 0170及mAb 0048(由融合瘤14F11純化而得，其與 14F128相同)顯示可競爭性結合至人類TREM-1。Biolegend #314907與SC98Z12對於結合人類TREM-1不與此等中之任一者競爭，但彼此之間競爭。此等發現得出結論：前兩者(mAb 0048及mAb 0170)屬於同組(組1)，而Biolegend #314907及SC98Z12屬於另一組(組2)。
實施例13：對結合至人類及食蟹獼猴TREM-1之突變型式之Fab 0011與Fab 0170之間相互作用的動力學分析
藉由SPR進行相互作用研究，以定義針對人類TREM-1之0011與0170抗人類TREM-1抗體之抗原決定基的差異。藉由比較已知抗原決定基中引入丙胺酸突變之人類TREM-1變異體與食蟹獼猴TREM-1之部分「人類化」變異體(後者係因為僅mAb 0170與食蟹獼猴TREM-1交叉反應)的結合動力學，鑑別對於各別抗原決定基而言為獨特的胺基酸殘基。
此研究中所用的hTREM-1胞外域丙胺酸突變體構築體及部分人類化食蟹獼猴突變體構築體概述於表9中。所用全部構築體為SEQ ID NO：19(食蟹獼猴TREM-1變異體)或SEQ ID NO：20(人類TREM-1變異體)之任一變異體且在SPR結合動力學檢定中包括用於捕捉的C端-cmyc2-His6標籤。除非另有說明，否則此實施例中提及的序列係根據圖11編號。
在經由表面電漿子共振即時量測分子相互作用的ProteOn分析儀上進行結合研究。在25℃進行實驗且樣品在15℃樣品隔室中儲存。藉由ProteOn報導的信號(RU，反應單位)與六個平行流動池中之個別感測晶片表面上的質量直接相關。使用0.4 M EDAC[1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽]與0.1 M磺基-NHS[N-羥基磺基丁二醯亞胺]之1：1混合物將抗His單株抗體固著於GLM感測晶片之6個平行流動池上。抗體於10 mM乙酸鈉pH 5.0中稀釋至濃度為25 μg/ml，且以30 μl/min在個別流動池上固著240秒。抗體固著之後，流動池上之活性位點用1 M乙醇胺阻斷。使用所有步驟沿水平方向進行固著。在一個實驗中，捕捉抗體之最終固著量為約8000 RU。表現人類或食蟹獼猴TREM-1 ECD之野生型或不同突變變異體之HEK 293細胞的細胞培養基在操作緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20，pH 7.4)中稀釋40-60倍。將TREM-1蛋白沿垂直方向以30 μl/min注射於所固著之抗His捕捉抗體60秒。由此使得TREM-1捕捉量為50-250 RU且形成區間斑點參考物，其中在水平方向 上僅固著有捕捉抗體，而無捕捉之TREM-1。各Fab沿水平方向注射於平行流動池上以便對與抗His抗體所捕捉之TREM-1變異體的結合進行動力學分析。注射之前，各Fab於操作緩衝液中稀釋至0 nM、5.5 nM(在一個實驗中)、16.7 nM及50 nM，且以100 μl/min注射250秒(締合時間)。對此等注射之後的解離時間監測10分鐘。經由兩次18秒以100 μl/min注射10 mM甘胺酸及50 mM NaOH，在TREM-1與Fab每輪相互作用之後，使GLM晶片再生。此再生步驟將TREM-1變異體及所結合之任何Fab自抗His抗體表面移除，且允許下一個相互作用對之隨後結合。再生程序不能將直接固著的抗His捕捉抗體自晶片表面移除。
為了獲得動力學資料，諸如ka(締合速率)、kd(解離速率)及KD(平衡解離常數)，使用ProteOn ManagerTM3.1.0.6軟體進行資料分析。對一式兩份或一式三份操作之樣品的捕捉及結合量進行評估，以確保再生步驟在依序注射期間提供一致的結合表面。對於僅固著有捕捉抗體的區間斑點參考物未觀測到顯著的無特異性結合。藉由減去區間斑點對照表面信號以及注射操作緩衝液來處理結合曲線。由此校正樣品注射期間的儀器雜訊及主體轉移。
將0170 Fab及0011 Fab對不同TREM-1 ECD變異體的親和力與對野生型人類或食蟹獼猴TREM-1 ECD之親和力進行比較。
亦評估在Fab注射結束之後10秒時的結合量(相對於所捕捉之TREM-1變異體之量歸一化)，以便鑑別結合消除或極低的突變型式。親和力下降與歸一化結合量顯著降低之組合可表示因引入突變所引起的摺疊中斷。然而應注意動力學變化亦將影響此值。因此目測檢查各結合曲線以便得出結論(資料未示)。
具有丙胺酸單一突變之人類TREM-1的結果(表10)顯示，兩個位置(E46及D92)獨特之處在於其使針對0170 Fab的結合降低超過兩倍。
與mAb-0011相比，mAb-0170能夠結合食蟹獼猴TREM-1。食蟹獼猴TREM-1在所選區域中之人類化使得0177之親和力相較於人類TREM-1(0247)未恢復，表示其他殘基或殘基組合對針對人類TREM-1與食蟹獼猴TREM-1之親和力之差異具有重要作用。
0243顯示不結合至0170 Fab或0011 Fab。對於此構築體，不能排除突變已影響總體結構且因此不能斷定Q52涉及所研究之Fab結合至人類TREM-1。
實施例14：mAb 0170在BWZ/hTREM-1報導細胞檢定中有效阻斷TREM-1活化
使用實施例6中所述之BWZ/hTREM-1報導細胞檢定計算mAb 0170阻斷TREM-1之效力。用TREM-1配位體複合物刺激BWZ/hTREM-1報導細胞且添加各種濃度的mAb 0170。圖9顯示TREM-1信號之劑量依賴性阻斷，在濃度高於0.2 μg/ml時，信號被完全阻斷。使用Graphpad Prism軟體(方程式：log(抑制劑)相對於反應--可變斜率)測定IC50值為2.4 nM。
實施例15：市購TREM-1抗體在BWZ/hTREM-1報導細胞檢定中不能阻斷TREM-1活化
如先前所述，BWZ/hTREM-1報導細胞檢定中包括多種劑量之抗體。SAB1405121(純系3F5，購自Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA)、WH0054210M4(純系2E2，購自Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA)、sc-80394(純系98Z12，購自Santa Cruz,California,USA)、HM2252(純系6B1，購自Hycult biotech,5405 PB UDEN,The Netherlands)、316102(純系TREM-37，購自Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)及314907(純系TREM-26，購自Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)不能顯著阻斷TREM-1活性，而本文揭示之mAb 0170在0.3 μg/ml下可阻斷TREM-1活性超過99%。即使在3 μg/ml下，同型對照物具有>95%殘餘活性。
實施例16：mAb 0170阻斷食蟹獼猴TREM-1
為了測試針對其他物種之TREM-1的功能性，將小鼠及食蟹獼猴TREM-1連同人類及小鼠DAP12一起分別轉染，以產生報導細胞檢定作為用於人類的檢定。此舉基本上如針對人類系統(實施例1、2及6)所述進行，但用全長鼠科(m)TREM-1(SEQ ID NO：22)或全長食蟹獼猴(c)TREM-1(SEQ ID NO：21)置換人類TREM-1。在GeneArt合成編碼cTREM-1(SEQ ID NO：22)之cDNA且以XhoI-XbaI位向選殖於pHLEF38(由CMC ICOS特許)中。使用BTX電穿孔儀(260 V，1050 μF，720 ohm；時間常數為23毫秒)，使用10 μg各質體及8e6個電穿孔細胞，以約500 μl總體積(400 μl生長培養基及100 μl DNA)將TE α NFAT Luc細胞與pHLEF38.cynoTrem1及pNEF38.NFlag hDAP12共轉染。細胞於10 ml 50%改良性培養基中在10 cm培養盤中塗鋪48小時且於具有800 μg/ml G418及0.5 mM L-組胺醇之30%改良性培養基中、以200微升/孔、以8e3個細胞/孔直接塗鋪於所選擇之96孔平底盤(5個盤)中。2週培育之後，使用Genetix純系選擇影像儀鑑別40種單一純系。
能夠與食蟹獼猴TREM-1交叉反應的唯一市購TREM-1抗體為314907(純系TREM-26，購自Biolegend,San Diego,CA 92121,USA)(參見實施例11)。實施例15中所測試之市購抗體皆不能阻斷食蟹獼猴TREM-1之功能，甚至不能阻斷可結合至食蟹獼猴TREM-1之食蟹獼猴TREM-1之功 能。
同樣，產生具有小鼠TREM-1之報導細胞系。能夠結合至人類TREM-1或結合至食蟹獼猴及人類TREM-1的抗體皆不能交叉結合至小鼠TREM-1。因此，基本上如針對產生人類TREM-1抗體所述產生針對小鼠TREM-1的抗體，但使用小鼠TREM-1作為抗原。在鼠科報導基因檢定中，針對小鼠TREM-1結合及阻斷功能篩選此等抗體。一種此抗體(mAb 0174)能夠結合且阻斷小鼠TREM-1功能。
實施例17：TREM-1抗體阻斷了PGLYRP-1刺激的M2巨噬細胞釋放TNF α
熟習此項技術者將認識到建立來自多位供者之初級細胞之冷凍庫、從而方便地複製實驗的意義。試管內獲得的巨噬細胞係由外周血液單核細胞如下產生。使用來自Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)的Rosette Sep套組(目錄號15068)，依據製造商說明書，自獲自Research Blood Components(Brighton,MA,USA)的外周血液「leukopak」分離出負向增濃之單核細胞。所分離的單核細胞以50e6個細胞/毫升懸浮於10% DMSO/FBS中且逐漸冷卻至-80℃。為產生巨噬細胞，將一或多個冷凍單核細胞小瓶在37℃水浴中快速解凍，用具有10% FBS(Fisher Scientific，目錄號03-600-511)的生長培養基(RPMI 1640(Gibco,Carlsbad CA,USA)，目錄號72400-047)稀釋至10 ml且以250 g離心5分鐘。細胞以2e6個細胞/毫升懸浮於補充有50 ng/ml人類MCSF(Gibco，目錄號PHC9501)的生長 培養基中，置於經組織培養液處理的皮氏樣式(petri style)組織培養盤中且置於經程式化以維持5% CO2、2% O2之「低氧」氛圍的增濕恆溫箱中。培養第三天時，添加等體積之補充有50 ng/ml人類MCSF之生長培養基供養細胞。培養6天之後，單核細胞已分化成M0巨噬細胞。如下使M0細胞進一步分化：將培養基更換為補充有50 ng/ml人類IFNg(Gibco，目錄號PHC4031)(分化成M1巨噬細胞)或40 ng/ml人類IL-4(Gibco，目錄號PHC0045)(分化成M2巨噬細胞)的生長培養基且返回至恆溫箱中另培育22小時。在第七天，巨噬細胞適當分化而可用於生物檢定中。簡言之，藉由用1X PBS洗滌、隨後用含有5 mM EDTA之PBS洗滌而自皮氏盤中回收巨噬細胞。接著使盤恢復至37℃維持30分鐘且使用10 ml注射器及22G針將細胞自盤「強力洗去」。細胞接著於生長培養基中稀釋，以250 g離心5分鐘，隨後將細胞集結粒懸浮直至最終濃度為1e6/ml。
如上製備的巨噬細胞用於生物檢定中，其中藉由ELISA量測改良性培養基中回應TREM-1配位體刺激細胞所產生的細胞激素，諸如TNF-α。此生物檢定進一步用於量測TREM-1特異性抗體對此TREM-1配位體刺激的阻斷作用。TREM配位體或陰性對照係以4倍濃度製備且於生長培養基中向96孔微量滴定盤中每孔添加50微升。TREM-1配位體之最終濃度由7.5 ng/ml重組人類PGLYRP1(參見實施例5)及3 μg/ml PGN-BS(Invivogen,tlrl-pgnbs,SanDiego CA,USA)組成。細胞在如上文所述之增濕低氧條件下培養22小時，隨後收集改良性培養基且藉由ELISA，依據製造商說明書(R&D Systems，目錄號DY210,MN,USA)量測TNF-α含量。圖10顯示TREM-1抗體減少TNF α自此等所刺激之M2巨噬細胞中的釋放。
下表12顯示此實驗之IC50值，表示本文揭示之抗體非常有效地阻斷TREM-1依賴性細胞激素釋放。
表14
實施例18：mAb 0170可阻斷食蟹獼猴巨噬細胞釋放TNF α
外周血液源巨噬細胞在先天免疫調節及活化之研究中充當極好的試管內模型。TREM-1已知在控制此過程中起關鍵作用。為瞭解調節TREM1信號傳導的活體內作用，關鍵是使用非人類靈長類動物物種長尾獼猴(Macaca fascicularis)，一般稱為食蟹獼猴(Cynomolgus monkey)。在此實施例中，測試抗TREM-1抗體在食蟹獼猴M2巨噬細胞培養液中阻斷細胞激素之產生的能力。
如下產生巨噬細胞。使用肝素鈉真空採血管(目錄號3664870，Bectin Dickinson Franklin Lakes NJ,USA)，藉由靜脈穿刺收集來自健康雄性成年動物(SNBL,Everett WA,USA)的全血。全血用PBS稀釋至30%，接著取30 ml小心地鋪層在於50 ml錐形管中用PBS預稀釋至96%的15 ml Ficoll-Paque(目錄號17-1440-03，GE Healthcare,Uppsala Sweden)上。在室溫以400 g低加速及無制動離心30分鐘之後，自Ficoll/血漿界面收集外周血液單核細胞(PBMC)，用PBS稀釋3次且在室溫以200 g離心7分鐘。將含有污染性血小板的上清液吸出且丟棄且將細胞集結粒再懸浮於30 ml之PBS+0.2% FBS(胎牛血清)中。此細胞洗滌過程另外重複2輪，隨後將PBMC細胞集結粒以2E6個細胞/毫升再懸浮於RPMI培養基(目錄號61870-036，Life Technologies,Grand Island NY,USA)+10% FBS中且以20毫升/盤分配於15 cm皮式盤(目錄號430599 Corning,Tewksbury MA,USA)上。藉由在37℃、5% CO2、100%濕度下培育隔夜來讓單核細胞黏附至塑膠上， 隨後藉由輕緩渦旋及振動盤20秒、隨後抽吸來移除未黏附細胞。向各盤中添加20 ml補充有50 ng/ml hMCSF(目錄號PHC9501，Life Technologies,Grand Island NY,USA)的新鮮生長培養基且在37℃、5% CO2、2% O2、100%濕度之低氧培養條件下置放7天。培養第三天時，添加等體積之補充有50 ng/ml人類MCSF之生長培養基供養細胞。培養6天之後，單核細胞已分化成M0巨噬細胞。如下使M0細胞進一步分化：將培養基更換為補充有50 ng/ml人類IFNg(Gibco，目錄號PHC4031)(分化成M1巨噬細胞)或40 ng/ml人類IL-4(目錄號PHC0045，Life Technologies,Grand Island NY,USA)(分化成M2巨噬細胞)的生長培養基且返回至恆溫箱中另培育22小時。在第七天，巨噬細胞適當分化而可用於生物檢定中。簡言之，藉由用1X PBS洗滌、隨後用含有5 mM EDTA之PBS洗滌而自皮氏盤中回收巨噬細胞。接著使盤恢復至37℃維持30分鐘且使用10 ml注射器及22G針將細胞自盤「強力洗去」。細胞接著於生長培養基中稀釋，以250 g離心5分鐘，隨後將細胞集結粒懸浮直至最終濃度為1e6/ml。
如上製備的巨噬細胞用於生物檢定中，其中藉由ELISA量測改良性培養基中回應TREM-1配位體刺激細胞所產生的細胞激素，諸如TNF-α。此生物檢定進一步用於量測TREM-1特異性抗體對此TREM-1配位體刺激的阻斷作用。TREM-1配位體或陰性對照物係以4倍濃度製備且於生長培養基中向96孔微量滴定盤中每孔添加50微升。TREM-1配位體之最終濃度由7.5 ng/ml重組人類PGLYRP1(如實施例5所述產生)及3 μg/mlPGN-BS(目錄號tlrl-pgnbs，Invivogen SanDiego CA,USA)組成。抗體於生長培養基中以50微升/孔添加，隨後細胞以每孔50微升巨噬細胞添加。細胞在如上文所述之增濕低氧條件下培養22小時，隨後收集改良性培養基且藉由ELISA，依據製造商說明書(目錄號DY1070，R&D Systems,Minneapolis MN,USA)量測TNF-α含量。下表顯示在對照抗體或抗TREM-1抗體存在 下經TREM-1配位體(PGLYRP1+PGN)刺激之M2巨噬細胞培養物之TNF α值。
此實施例說明抗TREM-1 Ab-0170可有效阻斷來源於食蟹獼猴之巨噬細胞的TREM依賴性細胞激素產生。此Ab之功效證明其在食蟹獼猴活體內毒理學及疾病治療模型中的用途。
實施例19：TREM-1抗體可阻斷所刺激之外周血液單核細胞釋放TNF α
將來自白血球層(buffy coat)且於RPMI 1640(目錄號61870，Gibco,New York,USA)、20% FBS(目錄號16140-071，Gibco,New York,USA)、10% DMSO(目錄號D2650，Sigma,Steinheim,Germany)中冷凍之PBMC 解凍且於RPMI、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(目錄號15070-06，Gibco,New York,USA)中洗滌兩次，且再懸浮於相同培養基中至4×10E6/ml。細胞接著以400,000個細胞/孔分佈。向孔中添加10 μg/ml PGN-SA(目錄號tlrl-pgnsa，Invivogen,San Diego,USA)及0.2 μg/ml PGLYRP1用於刺激細胞。隨後，在RPMI中稀釋有關同型及TREM-1抗體且分別以1.34 nM及0.167 nM添加。在37℃、5% CO2下培育20小時之後，藉由diaplex(目錄號880.090.001，Genprobe,Besancon,France)，根據製造商方案量測TNF α釋放。如下表13中所示，本文揭示之TREM-1抗體(mAb 0044、0070及0059)皆能夠減少TNF α自PBMC細胞的釋放。
PBMC釋放TNF α被抑制約70%(使用阻斷性TREM-1抗體)指示對所刺激之細胞培養物中之細胞激素含量產生顯著影響。
實施例20：抗TREM-1 mAb可抑制含氧量正常之巨噬細胞中PGN+PGLYRP1誘導之TNF α產生
抗TREM-1抗體可阻斷巨噬細胞之刺激(使用PGN-BS+人類PGLYRP1作為TREM-1受體之刺激劑)。
如實施例15，單核細胞分化成M2巨噬細胞。分化及刺激細胞之所有步驟皆在正常大氣含氧量(氧正常)下、在37℃、5% CO2恆溫箱中進行。所分化之M2巨噬細胞再懸浮於RPMI/10% FBS中且以5×10E5個細胞/毫升一式三份地(除非另有說明)塗鋪於測試孔中。接著利用以下刺激方案刺激細胞24小時：無添加；PGLYRP1、PGN-BS(InVivogen,tlrl-pgnbs) (兩組，一式三份)、PGN-BS+PGLYRP1(三組，一式三份)，或PGN-BS+PGLYRP1(在抗TREM-1或同型對照抗體存在下)。接著收集上清液且使用BioPlex(Bio-Rad,171-B5026M)分析TNF α。針對TREM-1的抗體(0.1 μg/ml)mAb-0122及mAb-0170能夠降低TNF-α釋放。
此實施例說明抗TREM-1 mAb-0122及mAb-0170可抑制在含氧量正常條件下所生長之巨噬細胞產生TNF α。
實施例21：TREM-1抗體特異性抑制類風濕性關節炎滑液誘導之反應
如實施例6中所述，在BWZ報導體檢定中，針對TREM-1配位體活性檢定罹患類風濕性關節炎之患者的RA滑液樣品。簡言之，將滑液解凍，渦旋且連續稀釋，使用添加有TREM-1抗體或陰性同型對照物的+/-10 μg/ml PGNECndi(Invivogen,SanDiego,CA,USA)一式兩份地進行檢定。類風濕性關節炎患者的滑液能夠以TREM-1依賴性方式觸發BWZ/hTREM-1報導細胞檢定，其藉由添加MAB1278(R&D Systems,Minneapolis,MN 55413,USA；目錄號MAB1278)可進一步增強，而本文揭示之阻斷性TREM-1抗體能夠降低此活化。
在以下兩欄所指明之兩個檢定中測試抗體，各抗體的濃度範 圍為0.1 μg/ml至10 μg/ml。MAB1278明顯地增強信號，而mAb 0122及0170降低信號(相較於同型對照物)。
實施例22：mAb 0170可阻斷細胞激素自PGLYRP-1刺激之類風濕性關節炎患者之滑液組織細胞釋放
滑液組織樣品獲自全膝關節置換術期間的RA患者。藉由4 mg/ml膠原蛋白酶(目錄號11088793001，Roche,Mannheim,Germany)及0.1 mg/ml脫氧核糖核酸酶(目錄號11284932001，Roche,Mannheim,Germany)在37℃消化1小時來分離滑液組織細胞之單一懸浮液。
以1×105個/孔存於培養基RPMI(目錄號R0883，St Louis,MO,USA)+10% FCS(目錄號S0115，BioChrom AG,Grand Island,NY 14072,USA)中的滑液組織細胞在低氧條件下，在各種濃度之mAb 0170或同型hIgG4對照物存在或不存在下，用4 μg/ml PGLYRP1及1 μg/ml PGN-ECNDi(目錄號tlrl-kipgn，Invivogen,San Diego,CA 92121,USA)刺激。培育24小時之後，收集細胞上清液，且藉由ELISA(TNF α(目錄號DY210，R&D,Minneapolis,MN55413 USA)、IL-1b(88-7010-88，eBioscience,San Diego,CA 92121,USA)、GM-CSF(目錄號88-7339-88，eBioscience))或Flowcytomix(TNF α、IL-1b、MIP-1b、MCP-1、IL-6及IL-8(目錄號BMS,eBioscience))量測細胞激素。滑液組織細胞經TREM-1配位體刺激而分泌細胞激素且被TREM-1抗體mAb 0170特異性阻斷。
以下為此實驗之實施例，其中使用4 ng/ml或10 ng/ml mAb， 從而在用TREM-1抗體mAb 0170處理時，減少細胞激素釋放。
此實施例顯示，類風濕性關節炎患者之滑液組織細胞對TREM-1配位體PGLYRP1刺激有反應，此反應為分泌很多細胞激素，mAb 0170可抑制此分泌。
實施例23：TREM-1抗體mAb 0170可阻斷II型PGLYRP1誘導之類風濕性關節炎患者滑液組織細胞釋放TNF α
滑液組織樣品獲自全膝關節置換術期間的RA患者。藉由4 mg/ml膠原蛋白酶(目錄號11088793001，Roche,Mannheim,Germany)及0.1 mg/ml脫氧核糖核酸酶(目錄號11284932001，Roche,Mannheim,Germany)在37℃消化1小時來分離滑液組織細胞之單一懸浮液。將滑液組織細胞(以1×105個/孔存於培養基RPMI(目錄號22400105，Gibco,NY 14072,USA)+10% FCS(目錄號S0115，BioChrom AG,Berlin,Germany)中)與各種劑量之經II型PGLYRP1瞬間轉染之HEK細胞在低氧條件下在1 μg/ml mAb 0170或IgG4同型對照物存在或不存在下共培養。培育24小時之後，收集細胞上清 液，且藉由TNF α ELISA(目錄號DY210，R&D,Minneapolis,MN55413 USA)量測細胞激素。
此實施例顯示，TREM-1配位體(II型細胞)誘導TNF-α以劑量依賴性方式自類風濕性關節炎患者之滑液組織細胞釋放(相較於對照細胞(模擬轉染))。此TNF α反應被mAb 0170而非同型IgG4阻斷。對照細胞不受影響。
實施例24：盤結合型MAB1278誘導巨噬細胞中之IL-6及TNF α反應，顯示促效特徵，而mAb 0122及0170則不然。
盤結合型促效性抗TREM-1抗體刺激巨噬細胞誘導IL-6及TNF α之產生。使用RosetteSep(StemCell Technologies,15068)自健康供者之白血球層純化出單核細胞且藉由在RPMI/10% FBS中、在40 ng/ml人類MCSF存在下培養6天來分化成巨噬細胞。接著藉由將培養基更換為補充有50 ng/ml人類IL-4之生長培養基且返回至恆溫箱中另維持24小時來使巨噬細胞進一步分化為M2巨噬細胞。第七天，藉由用1X PBS洗滌、隨後用含有5 mM EDTA之PBS洗滌來自培養盤中回收巨噬細胞。接著將培養盤恢復至37℃維持30分鐘，隨後將巨噬細胞自盤中洗去。巨噬細胞於RPMI/10% FBS中洗滌，隨後再懸浮且塗鋪。測試孔藉由與PBS中稀釋之抗體培育隔夜、隨後於PBS中洗滌3次而已經指定抗體預塗。再懸浮的巨噬細胞以5×10E5個細胞/毫升一式三份地塗鋪於測試孔中，隨後培育24小時。(分化 及刺激細胞之所有步驟皆在正常大氣含氧量(氧正常)下、在37℃、5% CO2恆溫箱中進行)。接著收集上清液且使用BioPlex(Bio-Rad,171-B5006M及171-B5026M)分析IL-6及TNF α。
抗體mAb-0122及mAb-0170顯示極低的促效作用，而MAB1278抗體(RnD Systems,MAB1278)對IL-6與TNF α均顯示有效的誘導作用。
此實施例說明mAb-0122及mAb-0170對巨噬細胞僅顯示極低的促效活性且表明此等mAb之真實阻斷特徵。
實施例25：在小鼠關節炎模型中阻斷TREM-1可減少疾病
表22中概述之實驗係以DTH關節炎模型獲得，該模型為單爪關節炎模型。在雌性C57BL/6小鼠中，藉由免疫作用在右後爪中引發典型遲緩型超敏性(DTH)反應及隨後用甲基化牛血清白蛋白(mBSA)攻擊而誘導單爪關節炎，改變之處為在免疫與攻擊步驟之間靜脈內投予II型膠 原蛋白單株抗體(抗CII)混合液。左後爪接受PBS攻擊且充當動物內對照。小鼠(10隻小鼠/組)用TREM單株抗體每週處理3次，TREM單株抗體特異性結合且阻斷鼠科TREM-1，如使用實施例6中所述之鼠科型式之報導體檢定所測定。免疫當天投予第一劑量。小鼠(9至10隻小鼠/組)用對照抗體或PBS處理作為對照。自關節炎誘發之日起直至第11天量測爪腫脹。結果以曲線下平均面積(AUC)±SEM提供。統計顯著性係利用雙側不成對t檢驗(95%信賴區間)檢驗。
實施例26：TREM-1 mAb可阻斷經活化之嗜中性白血球釋放IL-8
嗜中性白血球表現TREM-1且嗜中性白血球亦表現TREM-1配位體。為測試TREM-1是否涉及嗜中性白血球中之自分泌刺激迴路，用PGN-SA(InVivogen,tlrl-pgnsa)刺激所分離的嗜中性白血球，且量測IL-8在培養基中的釋放。TREM-1抗體mAb-0059、mAb-0067、mAb-0122及mAb-0170能夠降低PGN-SA誘導之IL-8釋放。自健康人類供者全血中分離出嗜中性白血球且以1.5×10E6個細胞/毫升再懸浮於RPMI/10% FBS中，且一式三份地塗鋪於經血纖維蛋白原預塗之測試孔(經50 μl含有1 mg/ml血纖維蛋白原(Sigma,F3879)之PBS在37℃預塗2小時，隨後於PBS中洗滌3次)中。細胞在以下條件下測試：不添加刺激物；僅10 μg/ml PGN-SA，或10 μg/ml PGN-SA(在0.25 μg/ml mAb-0059、mAb-0067、mAb-0122、mAb-0170或同型對照抗體存在下)。樣品在37℃、5% CO2恆溫箱中培養24小時。接著收集上清液且使用Bio-plex Pro人類細胞激素IL-8集合(BioRad,171-B5008M)針對IL-8加以分析。
此實施例說明TREM-1抗體可減少IL-8自細菌源PGN刺激誘導之嗜中性白血球釋放。從而證明TREM-1涉及嗜中性白血球之自分泌活化迴路，且TREM-1抗體潛在地適用於下調嗜中性白血球反應。
實施例27：經活化之嗜中性白血球可刺激單核細胞，此可由抗TREM-1 mAb阻斷
經活化之嗜中性白血球表現TREM-1配位體。為測試經活化之嗜中性白血球是否可以TREM-1依賴性方式刺激其他免疫細胞，使用經活化之嗜中性白血球刺激所分離的單核細胞且量測TNF α在培養基中的釋放。TREM-1抗體mAb-0059及mAb-0170能夠降低嗜中性白血球誘導單核細胞釋放TNF α。
自人類健康供者全血中分離出嗜中性白血球且再懸浮於RPMI/10% FBS中，且以1.5×10E5個細胞/孔塗鋪於經聚-D-離胺酸塗佈之96孔組織培養盤(Corning,3841)中。嗜中性白血球接著在37℃、5% CO2恆溫箱中用1 ng/ml PMA(Sigma,P1585)+20 μg/ml PGN-SA(InVivogen,tlrl-pgnsa) 刺激24小時。細胞接著用培養基輕緩洗滌3次，隨後添加剛分離之單核細胞。使用EasySep套組(Stem cell technologies,19059)自健康供者白血球層純化出單核細胞，且以5×10E4個細胞/孔塗鋪於已含有經洗滌之活化嗜中性白血球的孔中。添加1 μg/ml之以下抗體：mAb-0059、mAb-0170或hIgG4同型對照物。接著將細胞另培養24小時，隨後收集上清液。上清液於RPMI/10% FNS中1：10稀釋，隨後藉由ELISA(eBioscience,BMS223INST)量測TNF α。
此實施例說明經活化之嗜中性白血球可以TREM-1依賴性方式刺激單核細胞產生TNF α，且此可由mAb-0059及mAb-0170抗TREM-1抗體阻斷。因此抗TREM-1抗體潛在適用於下調單核細胞反應。
雖然本發明之某些特徵已在本文中加以說明及描述，但許多修改、取代、變化及等效物對一般技術者而言現為顯而易見的。因此應瞭解，希望所附申請專利範圍涵蓋屬於本發明之真實精神範圍內的所有此等修改及變化。
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<213> 人工序列
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<223> 人類化TREM-1抗體之重鏈
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<223> 人類化TREM-1抗體之重鏈
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<223> 人類化TREM-1抗體之輕鏈
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<223> A24/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6
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<212> DNA
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Claims (4)

  1. 一種抗體或其片段，其能夠特異性結合至表現在骨髓細胞上觸發受體-1(TREM-1)並結合至包含SEQ ID NO：1(人類TREM-1)之胺基酸殘基D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44及L45中之1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或全部及胺基酸殘基E46、K47、F48中之1個、2個或全部的抗原決定基，且該抗體可阻斷TREM-1活化。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或其片段，其中該抗體為mAb 0170，其包含含有SEQ ID NO：4之序列的重鏈以及含有SEQ ID NO：5之序列的輕鏈。
  3. 如申請專利範圍第1-2項中任一項之抗體或其片段，其重鏈包含對應於SEQ ID NO：4之胺基酸殘基31至35(TYAMH)的CDRH1序列；及/或對應於SEQ ID NO：4之胺基酸殘基50至68(RIRTKSSNYATYYAASVKG)的CDRH2序列；及/或對應於SEQ ID NO：4之胺基酸殘基101至110(DMGIRRQFAY)的CDRH3序列；且其輕鏈包含對應於SEQ ID NO：5之胺基酸殘基24至38(RASESVDTFDYSFLH)的CDRL1序列；及/或對應於SEQ ID NO：5之胺基酸殘基54至60(RASNLES)的CDRL2序列；及/或對應於SEQ ID NO：5之胺基酸殘基93至101(QQSNEDPYT)的CDRL3序列。
  4. 一種用作醫藥品之如申請專利範圍第1-3項中任一項之抗體或其片段。
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