RS56593B1 - Antitela koja vezuju i blokiraju aktivirajući receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama-1 (trem-1) - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetna objava se odnosi na metodu za identifikaciju funkcionalnog TREM-1 antitela. Predmetni pronalazak se odnosi na antitela kao što je definisano u zahtevima koja su sposobna da specifično vežu TREM-1 i koja su sposobna da smanje ili blokiraju TREM-1 aktivnost (signallizacija i/ili aktivacija). Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na primene za takva antitela, kao što terapijske i farmaceutske primene.

[0002] Aktivirajući receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama-1 (TREM-1) je receptor koji je aktiviran na monocitima, makrofagima i neutrofilima. Kada je aktiviran, TREM-1 se povezuje sa signalizirajućim proteinom, DAP12, i aktivira oslobađanje pro-inflamatornih citokina od ćelija koeje ga eksprimiraju (Bouchon et al, J. Immunol. 2000; 164(10): 4991-4995). TREM-1 mRNK i proteinska ekspresija je poznata kao pozitivno regulisana u mijeloidnim ćelijama pojedinaca sa sepsom, reumatoidnim artritisom (RA) i inflamatornom bolešću creva (IBD). Povećavajući naučni dokaz koji podržava teoriju da TREM-1 doprinosi razvoju i progresiji inflamatornih bolesti, kako TREM-1 pozitivni monociti i neutrofili koji su regrutovani do područja inflamacije pogoršavaju inflamaciju (Bouchon et al. Nature 2001; 410: 1103-1107; Schenk et al, Clin Invest. 2007; 117(10): 3097-3106); Kuai et al., Rheumatology (Oxford). 2009; 48(11):1352-1358.

[0003] Antitela koja su sposobna za vezivanje TREM-1 su poznata, uključujući komercijalno dostupne TREM26 i TREM37 (kat. br. 314902 i 316102, redom, Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD), MAB1278 (kat. br. MAB1278, R&D Systems, Mineapolis, MN 55413, SAD), mAb 6B1 (kat. br. HM2252, Hycult Biotech, Uden, Holandija) i anti-TREM-1 2E2 (kat. br. HPA005563, Sigma-Aldrich, Danska). Sva poznata TREM-1 antitela su agonistična kada se imobilizuju; to jest, ona povećavaju oslobađanje citokina iz monocita, makrofaga i neutrofila. Još jedna karakteristika poznatih TREM-1 antitela je da oni ne reaguju unakrsno sa TREM-1 iz primata, kao što su cinomolgus majmuni ili rezus majmuni, što znači da poznata antitela ne mogu biti testirana u ovim životinjama.

[0004] Prema tome, postoji potreba u oblasti za antitelom koje je sposobno da veže i blokira funkciju TREM-1. Postoji potreba u oblasti za TREM-1 antitelom koje je sposobno da spreči TREM-1 da formira dimere/multimere. Postoji potreba u oblasti za a TREM-1 antitelom koje je sposobno za blokiranje TREM-1 aktivacije i signalizacije. Postoji potreba u oblasti za TREM-1 antitelom koje je sposobno da ometa interakciju između TREM-1 i njegovog liganda. Postoji potreba u oblasti za TREM-1 antitelom koje je sposobno da ometa oslobađanje citokina iz mijeloidne ćelije. Postoji potreba u oblasti za TREM-1 antitelom koje ima malo ili ni malo agonističke aktivnosti kada je rasvorljivo ili imobilizovano. Takođe postoji potreba u oblasti za antitelom koje je sposobno da veže i humani TREM-1 i TREM-1 iz jedne ili više drugih vrsta, kao što su primati, kako bi se omogućilo ispitivanje toksikologije, kao i procena farmakokinetike i farmakodinamike antitela u odgovarajućim modelima životinja.

[0005] Ovde su stavljena na uvid TREM-1 antitela koja su pogodna za primenu kao farmaceutski preparati. Takva antitela mogu imati suštinski uticaj na kvalitet života pojedinaca sa sepsom ili hroničnom inflamatornom bolešću kao što je reumatoidni artritis, psorijatični artritis i inflamatorna bolest creva.

[0006] Arts, Rob J W, et al., European Cytokine Network, tom 22(1), 1. mart 2011, strane 11-14, opisuje TREM_1 interakciju sa LPS/TLR4 receptorskim kompleksom. WO 2008/088849 opisuje lečenje inflamacije, detekciju, i praćenje putem TREM-1. US 2003/165875 opisuje receptor TREM (aktivirajući receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama) i njegove primene. R&D Systems (http://www.rndsystems.com/Products/MAB) 26. oktobar 2010, strana 1, stavlja na uvid javnosti "humano TREM-1 antitelo". Eleanor Molloy, Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, tom 4(1), 1. januar 2009, strane 51-56, opisuje familiju aktivirajućih receptora eksprimiranih na mijeloidnim ćelijama (TREM), i primenu njegovih antagonista.

REZIME

[0007] Predmetna objava se odnosi na metodu za identifikaciju funkcionalnog TREM-1 antitela, koja sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije kada je pomenuta ćelija inkubirana sa TREM-1 modifikujućim agensom; (c) dovođenje u kontakt ko-kulture iz (b) sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje da je aktivnost prve ćelije manja nego aktivnost izmerena u (b).

[0008] Metoda može biti prilagođena da identifikuje blokirajući TREM-1 molekul, kao što je antitelo. Metoda za identifikaciju blokirajućeg TREM-1 antitela sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije kada je pomenuta ćelija inkubirana sa aktivirajućim jedinjenjem, kao što je TREM-1 ligand, ili aktivirani neutrofil; (c) dovođenje u kontakt ko-kulture prve ćelije i aktivirajućeg jedinjenja, kao što je TREM-1 ligand, ili aktivirani neutrofil sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje da je aktivnost prve ćelije manja nego aktivnost izmerena u (b).

[0009] Metoda može biti prilagođena da identifikuje stimulirajuće TREM-1 antitelo. Metoda za identifikovanje stimulirajućeg TREM-1 antitela sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije; (c) dovođenje u kontakt/inkubiranje pomenute ćelije sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje da je aktivnost prve ćelije veća nego aktivnost izmerena u (b).

[0010] Prva ćelija može biti hematopoetskog porekla. Modifikujući agens iz (b) može biti aktivirani neutrofil ili TREM-1 ligand. Signalizirajući protein može biti DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gama RIII i Fc receptor, ili deo istih. Signalizirajući protein može signalizirati preko transkripcionog faktora kao što je NFAT ili NFκB. Reporterski gen može biti gen koji nije nativno eksptrimiran u pomenutoj prvoj ćeliji i može biti gen koji kodira βgalaktozidazu, luciferazu, zeleni fluorescentni protein (GFP) ili hloramfenikol transferazu. Predmetna objava takođe obezbeđuje stimulirajuća TREM-1 antitela koja mogu biti identifikovana pomoću pronađene metode.

[0011] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima koja su sposobna da se specifično vežu za TREM-1 i koja su sposobna za funkciju blokiranja TREM-1. Pomenuta antitela mogu biti sposobna da spreče ili smanje dimerizaciju ili multimerizaciju TREM-1. Pomenuta antitela mogu biti sposobna da blokiraju interaciju između TREM-1 i njegovog liganda, ili antitela mogu biti sposobna da blokiraju TREM-1 funkciju koja je indukovana pomoću TREM-1 liganda. TREM-1 može biti humani TREM-1 i/ili TREM-1 iz druge vrste osim čoveka, kao što je TREM-1 iz drugog primata osim čoveka.

[0012] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna da se takmiče sa mAb 0170 za vezivanje za humani TREM-1 kao što je definisano u patentnim zahtevima. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna da specifično vezuju polipeptid koji sadrži aminokiseline D38 do F48 sa sekvencom koja ima identifikacioni broj - SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1). Antitela predmetnog pronalaska imaju epitop koji sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili sve od aminokiselinskih ostataka odabranih od grupe koja se sastoji od D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 i L45 sa SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1) i jednog, dva ili svih aminokiselinskih ostataka odabranih od grupe koja se sastoji od E46, K47 i F48 sa SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), što može biti određeno korišćenjem HX-MS. Antitela predmetnog pronalaska mogu imati epitop koji sadrži jedan, dva ili sve aminokiselinske ostatke koji su odabrani od grupe koja se sastoji od D42, E46, D92 i H93 sa SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što može biti određeno merenjem vezivanja antitela za varijante TREM-1.

[0013] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna da se takmiče sa mAb 0170 za vezivanje za Trem-1 cinomolgus majmuna kao što je definisano u patentnim zahtevima. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna da specifično vezuju polipeptid koji sadrži aminokiseline E19 do L26 TREM-1 cinomolgus majmuna (SEQ ID NO: 12), ili dogovarajuće aminokiseline sa SEQ ID NO: 21, kao što može biti određeno korišćenjem HX-MS.

[0014] Antitela predmetnog pronalaska mogi biti korišćena kao farmaceutski preparati za lečenje pojedinaca sa jednom ili više autoimunih bolesti i/ili hroničnom inflamacijom. Stoga, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment kao što je definisano u patentnim zahtevima za primenu kao medikament; kao što je za primenu u lečenju pojedinaca sa jednom ili više autoimunih bolesti i/ili hroničnom inflamacijom.

KRATAK OPIS NACRTA

[0015]

Slika 1: Aktivacija BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ ćelijske linije (ovde takođe nazvana kao "BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija") je smanjena pomoću antitela kao što su 14F128 i 14F113 ali ne pomoću komercijalno dostupnih antitela MAB1278 (R&D Systems, Mineapolis, MN 55413, SAD: Kat. br. MAB1278), anti-TREM-1 HPA (Sigma, SAD: Kat. br. HPA005563), aTREM26 (Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD: Kat. br.

314902) i aTREM37 (Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD: Kat. br.316102).

Slika 2: BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija sama ili ko-kultivisana sa TLRL prethodno stimulisanim neutrofilima. TLRL aktivirani neutrofili su sposobni da indukuju 15-struki porast u signalu (luminescencija), u poređenju sa neaktiviranim neutrofilima (videti zadnje dve kolone). Pozitivna kontrola (vezan za ploču, agonistički MAB1278 (R&D Systems, Mineapolis, MN 55413, SAD: Kat. br. MAB1278) dala je 32-struku indukciju u ovom eksperimentu (videti drugu kolonu). Podaci su ucrtani kao srednje vrednosti ± SEM (n = 3).

Slika 3: Normalizovani reporterski esej, u kome je TREM-1 stimulisan pomoću PGN-aktiviranih neutorfila, pokazuje da komercijalno dostupna antitela TREM-26 (kat. br.314902, Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD), TREM-37 (kat. br. 316102, Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD), MAB1278 (kat. br. MAB1278, R&D Systems, Mineapolis, MN 55413, SAD), i anti-TREM-1 HPA (kat. br. HPA005563, Sigma, St Louis, MO, SAD) su agonistička antitela koja pojačavaju luminescentni signal zavistan od Trem-1 u reporterskom eseju (koji daje signal viši od 1). Antitelo identifikovano kao 5F27A1 i 14F69 su pokazana kao najbolji blokator (koji daje signal manji od 0.5). Podaci su ucrtani kao srednja vrednost ± SEM (n = 3). Izotipska kontrola MAB002 (kat. br. MAB002, R&D Systems, Mineapolis, MN 55413, SAD). Sva antitela su korišćena u 1 µg/ml.

Slika 4: Aktivnost u BWZ/hTREM-1 reporterskom eseju. Na x-osi, TREM-1 blokirajuća aktivnost je pokazana kao aktivnost koja je ostala kada je 0.2 µg/ml antitela dodato BWZ/hTREM-1 reporterskoj ćeliji, koja je prethodno aktivirana sa PGN-stimulisanim neutrofilima. Kada su TREM-1 antitela vezana za ploču, neka (uključujući sva komercijalno dostupna TREM-1 antitela) su bila sposoban da inakrsno vežu TREM-1 i time aktiviraju TREM-1. Ova aktivnost je prikazana na y-osi. Prema tome, antitela prikazana kao tačke u kutiji (okviru) u donjem levom uglu sve pokazuju različite osobine u poređenju sa poznatim antitelima, što je povoljno blokirajuće i ne agonistično.

Slika 5: Vezivanje humanih TREM-1 antitela za PBMCs iz rezus majmuna. U gornjem levom uglu, pokazano je da većina antitela vezuje samo humani TREM-1 (svaka crna tačka predstavlja jedno antitelo). Neka antitela, kao što su mAbs 0025 i 14F128, 14F11, 14F29, 14F113 i 14F69, su bila sposobna da vežu i humani TREM-1 i TREM-1 rezus majmuna, pokazujući unakrsnu-reaktivnost.

Slika 6: Vezivanje anti-humanih TREM-1 antitela za PBMCs iz cinomolgus majmuna. U gornjem levom uglu, pokazano je da većina antitela samo vezuju humani TREM-1 (svaka crna tačka predstavlja jedno antitelo). Neka antitela, kao što su mAb 0025 i 14F128, 14F11, 14F29, su bila sposobna da vežu i humani TREM-1 i TREM-1 cinomolgus majmuna, pokazujući unakrsnu-reaktivnost. Neka antitela, kao što je 14F69 (mAb 0044), su sposobna da vežu PBMCs cinomolgus majmuna (Sl. 6B) i PBMCs čoveka (Sl. 6C) jednako dobro.

Slika 7: Pokrivenost sekvenci HX analiziranih peptida od hTREM-1 u prisustvu i odsustvu mAb 0023 ili mAb 0026 (A), mAb 0024 ili Biolegend klon 26 (B), mAb 0025 (C) ili RnD Biosystems' MAB1278 (D). Primarna sekvenca je prikazana iznad HX analiziranih peptida (prikazani kao horizontalni stubovi). Peptidi koji pokazuju slične obrasce razmene i u prisustvu i u odsustvu mAbs su prikazani u beloj boji, dok peptidi koji pokazuju smanjenu inkorporaciju deuterijuma nakon vezivanja mAb su obojeni crnom bojom. Uokvireni regioni sekvenci definišu epitop.

Slika 8: Strukturno mapiranje epitopa mAb 0025 na hTREM-1. Struktura hTREM-1 (pdb 1Q8M) je predstavljena sa jednim delom dimera kao crna C-alfa žica. Drugi deo hTREM-1 dimera je prikazan kao siva traka sa 0025 epitopom koji je prikazan crnim.

Slika 9: BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija ko-kultivisana sa TREM-1 ligandnim kompleksom reflektuje TREM-1 funkcionalnost koja je dozno-zavisno inhibirana pomoću TREM-1 mAb - 0170.

Slika 10: TNFalfa oslobađanje iz M2 makrofaga stimulisano pomoću PGLYRP-1 je blokirano pomoću TREM-1 antitela.

Slika 11: Sekvence TREM-1 čoveka i majmuna su poravnate. Ostaci aminokiselina koji se razlikuju između ove dve su prikazani masnim slovima. Ostaci koji su prikazani da su unutar epitopa (kao što je određeno pomoću HX-MS i površinske plazmonske rezonance) su istaknuti.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0016]

SEQ ID NO: 1 (sekvenca sa identifikacionim brojem: 1) predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog TREM-1 divljeg tipa (wild type - wt).

SEQ ID NO: 2 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca m14F69 antitela.

SEQ ID NO: 3 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca m14F69 antitela.

SEQ ID NO: 4 predstavlja aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prvog humanizovanog TREM-1 antitela (mAb 0170).

SEQ ID NO: 5 predstavlja aminokiselinsku sekvencu lakog lanca prvog humanizovanog TREM-1 antitela (mAB 0170).

SEQ ID NO: 6 predstavlja aminokiselinsku sekvencu teškog lanca drugog humanizovanog TREM-1 antitela (mAb 0122).

SEQ ID NO: 7 predstavlja aminokiselinsku sekvencu lakog lanca drugog humanizovanog TREM-1 antitela (mAb 0122).

SEQ ID NO: 8 predstavlja aminokiselinsku sekvencu teškog lanca m14F128 antitela. SEQ ID NO: 9 predstavlja aminokiselinsku sekvencu lakog lanca m14F128 antitela. SEQ ID NO: 10 predstavlja aminokiselinsku sekvencu teškog lanca m14F113 antitela. SEQ ID NO: 11 predstavlja aminokiselinsku sekvencu lakog lanca m14F113 antitela. SEQ ID NO: 12 predstavlja aminokiselinsku sekvencu vanćelijskog domena TREM-1 divljeg tipa (wt) cinomolgus majmuna (c), kada je eksprimirana u E. coli.

SEQ ID NO: 13 predstavlja aminokiselinsku sekvencu K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (konstrukt 0222).

SEQ ID NO: 14 predstavlja aminokiselinsku sekvencu oA24T/ Y28F/ N30S/ R32Q/ P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (konstrukt 0244).

SEQ ID NO: 15 predstavlja aminokiselinsku sekvencu A24T/ Y28F/ N30S/ R32Q/ E54K-cTREM-1- Cmyc2-His6 (konstrukt 0245).

SEQ ID NO: 16 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline prajmera.

SEQ ID NO: 17 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline prajmera.

SEQ ID NO: 18 predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog (h) TREM-1(1-134)-His 6.

SEQ ID NO: 19 predstavlja aminokiselinsku sekvencu cTREM-1-Cmyc2-His6 (konstrukt 0238).

SEQ ID NO: 20 predstavlja aminokiselinsku sekvencu hTREM-1-Cmyc2-His6 (konstrukt 0247).

SEQ ID NO: 21 predstavlja aminokiselinsku sekvencu cTREM-1 u punoj dužini. SEQ ID NO: 22 predstavlja aminokiselinsku sekvencu mišjeg (m) TREM-1 u punoj dužini.

SEQ ID NO: 23 predstavlja aminokiselinsku sekvencu hPGLYRP1 u punoj dužini.

OPIS

[0017] TREM-1 je transmembranski protein koji se sastoji od 234 amino kiseline, uključujući pojedinačni vanćelijski imunoglobulinski domen i kratak citoplazmatski rep bez očiglednog signalizirajućeg motiva. Kada je aktiviran, TREM-1 se povezuje sa signalizirajućim adapterskim proteinom koji sadrži ITAM, DAP12. Nizvodno signaliziranje može da obuhvati aktivaciju NFAT transkripcionog faktora, uzrokujući pozitivnu regulaciju pro-inflamatorne proizvodnje citokina.

[0018] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima koja su sposobna da specifično vežu i blokiraju funkciju TREM-1. Antitela predmetnog pronalaska mogu blokirati TREM-1 funkciju smanjivanjem/blokiranjem TREM-1 aktivacije i nizvodnog signaliziranja.

[0019] Antitela prema predmetnom pronalasku mogu blokirati TREM-1 pomoću jedne ili kombinacije nekoliko različitih mehanizama, blokirajući TREM-1 direktno ili indirektno. Na primer, antitela predmetnog pronalaska mogu sprečiti da prirodni ligand TREM-1, protein koji prepoznaje peptidoglikane 1 (PGLIRP1), iz stvaranja funkcionalnog kompleksa sa TREM-1 i/ili antitelima predmetnog pronalaska može blokirati TREM-1 sprečavanjem pojedinačnih TREM-1 molekula od formiranja dimera ili multimera. TREM-1 dimerizacija ili multimerizacija mogu se smanjiti ili sprečiti TREM-1 antitelima koja su sposobna za vezivanje dela TREM-1 koji bi se inače nalazio u spoju TREM-1 dimera, prema tome sprečavajući pojedinačne TREM-1 molekule da se vezuju jedni za druge. TREM-1 dimerizacija ili multimerizacija mogu se smanjiti ili sprečiti pomoću TREM-1 antitela koja ometaju interakciju TREM-1 sa njegovim ligandom. Antitela prema predmetnom pronalasku blokiraju aktivaciju TREM-1 indukovanu pomoću PGLYRP1. PGLYRP1, visoko konzerviran, dugačak protein od 196 aminokiselina koji se sastoji od signalnog peptida i domena vezivanja peptidoglikana, je eksprimiran u neutrofilima i oslobađa se nakon njihovog aktiviranja. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu negativno regulisati proinflamatorno oslobađanje citokina iz mijeloidnih ćelija. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu blokirati oslobađanje TNFalfa, MIP-1beta, MCP-1, IL-1beta, GM.CSF, IL-6 i/ili IL-8 iz makrofaga, neutrofila, ćelija sinovijalnog tkiva i/ili reporterske ćelije, kao što je ovde stavljeno na uvid javnosti.

[0020] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna da vežu i humani TREM-1 i TREM-1 iz drugih vrsta osim ljudskog bića. Termin "TREM-1", kao što je ovde korišćeno, prema tome obuhvata bilo koji oblik koji se javlja u prirodi od TREM-1 koji može biti izveden iz bilo kog pogodnog organizma. Na primer, TREM-1 za primenu kao što je ovde opisano može biti TREM-1 kičmenjaka, kao što je TREM-1 sisara, kao što je TREM-1 primata (kao što je čovek, šimpanza, cinomolgus majmun ili rezus majmun); glodara (kao što je miš ili pacov), lagomorfa (kao što je zec), ili artiodaktila (kao što je krava, ovca, svinja ili kamila). Poželjno, TREM-1 je SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1). TREM-1 može biti sazreli oblik od TREM-1 kao što je TREM-1 protein tkoji je podlegao obradi nakon translacije sa pogodnom ćelijom. Takav zreli TREM-1 protein može, na primer, biti glikolizovan. TREM-1 može biti TREM-1 protein u punoj dužini.

[0021] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti monoklonska antitela, u smislu da su direktno ili indirektno izvedena iz jednog klona B limfocita. TREM-1 antitela se mogu proizvoditi, testirati i prečišćavati koristeći, na primer, pometode opisane u Primerima. Ukratko, pogodan miš kao što je TREM-1 ili TREM-1/TREM-3 nokaut (“knock-out” - KO) miš može biti imunizovan sa TREM-1, ćelija koja eksprimira TREM-1 ili kombinacija oba.

[0022] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti poliklonska u smislu da su mešavina monoklonskih antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0023] Primarni skrining supernatanta hibridoma može se izvesti pomoću direktnog ELISA ili FMAT i sekundarni skrining se može izvesti pomoću protočne citometrije. Pozitivni supernatantni hibridoma se zatim mogu testirati u testu reporterskog gena.

[0024] Antitela mogu biti rekombinantno eksprimirana u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama. Prokariotska ćelija može biti E. coli. Eukariotska ćelija može biti ćelija kvasca, insekata ili sisara, kao što je ćelija izvedena iz organizma koji je primat (kao što je čovek, šimpanza, cinomolgus majmun ili rezus majmun), glodar (kao što je miš ili pacov), lagomorf (kao što je zec) ili artiodaktil (kao što je krava, ovca, svinja ili kamila). Pogodne ćelijske linije sisara uključuju, ali nisu ograničene na, HEK293 ćelije, CHO ćelije i HELA ćelije. TREM-1 antitela mogu takođe biti proizvedena pomoću drugih metoda poznatih prosečnom poznavaocu oblasti, kao što je fagni displej ili displej kvasca.

[0025] Jednom proizvedena, antitela mogu biti testirana na vezivanje za, na primer, TREM-1 u punoj dužini ili njegove mutante korišćenjem metoda koje su opisane u Primerima.

[0026] Specifikacija stavlja na uvid javnosti metodu za identifikaciju funkcionalnog TREM-1 antitela. Antitela koja su sposobna za specifično vezivanje TREM-1 i koja imaju bilo kakav efekat na TREM-1 aktivaciju i negativnu signalizaciju su nazvana ovde kao "funkcionalna TREM-1 antitela". "Funkcionalno" TREM-1 antitelo se ovde odnosi na antitelo koje je sposobno za blokiranje ili stimulaciju TREM-1. Metoda za identifikaciju funkcionalnog TREM-1 antitela sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije kada je pomenuta ćelija inkubirana sa TREM-1 modifikujućim agensom; (c) dovođenje u kontakt ko-kulure iz (b) sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje da je aktivnost prve ćelije manja od aktivnosti izmerene u (b).

[0027] “Prva ćelija” iz (a) može biti hematopoetskog porekla, kao što je mijeloidna ćelija, kao što je T-ćelija. Signalizirajući protein iz (a) može biti bilo koji signalizirajući protein koji je sposoban da formira kompleks sa TREM-1. Pogodni signalizirajući proteini obuhvataju DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gama RIII i Fc receptor, ili deo istih. Reporterski konstrukt iz (a) može biti bilo koji konstrukt koji je sposoban da se aktivira putem signalizirajućeg proteina i generiše prepoznatljiv signal. Pogodni reporterski konstrukti sadrže transkripcioni faktor i reporterski gen. Signalizirajući protein može da signalizira putem transkripcionog faktora odabranog od grupe koja se sastoji od NFAT i NFkB. Reporterski gen je gen koji nije nativno eksprimiran u pomenutoj prvoj ćeliji i može biti gen koji kodira β-galaktozidazu, luciferazu, zeleni fluorescentni protein (GFP) ili hloramfenikol transferazu. Pomenuta prva ćelija može biti transfektovana sa transkripcionim faktorom i reporterskim genom korišćenjem metoda koje su dobro poznate u oblasti.

[0028] "BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija" opisana u Primerima je jedan primer “prve ćelije”.

[0029] Modifikujući agens iz (b) može biti TREM-1 ligand ili aktivirani neutrofil. "TREM-1 antitelo" iz (c) može biti TREM-1 specifični hiridomski supernatant ili prečišćeno antitelo. Aktivnost izmerena u (d) je signal proizveden pomoću reporterskog konstrukta. Primer takve signalizacije je luminescencija uzrokovana pomoću NFAT-vođene LacZ β-laktamazne luciferazne) proizvodnje.

[0030] Metoda može biti prilagođena da identifikuje blokirajućeTREM-1 antitelo. Metoda za identifikovanje blokirajućeg TREM-1 antitela sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije kada je pomenuta ćelija inkubirana sa aktiviranim neutrofilom; (c) dovođenje u kontakt ko-kulture prve ćelije i ativiranog neutrofila sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje da je aktivnost prve ćelije manja nego aktivnost izmerena u (b).

[0031] Ova metoda takođe može biti prilagođena da identifikuje stimulirajuće TREM-1 antitelo. Metoda za identifikovanje stimulirajućeg TREM-1 antitela sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije; (c) kontaktiranje/inkubiranje pomenute ćelije sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje da je aktivnost prve ćelije veća nego aktivnost izmerena u (b).

[0032] Predmetni pronalazak se odnosi na blokirajuća TREM-1 antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima koja mogu biti identifikovana pomoću metode, stavljene ovde na uvid javnosti, ili identifikacijom blokirajućeg antitela. Kada je testirano korišćenjem metode opisane iznad i u Primerima, antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može, u koncentraciji manjoj od 100 µg/ml - kao što je manje od 90 µg/ml, kao što je manje od 80 µg/ml, kao što je manje od 70 µg/ml, kao što je manje od 60 µg/ml, kao što je manje od 50 µg/ml, kao što je manje od 40 µg/ml, kao što je manje od 30 µg/ml, kao što je manje od 20 µg/ml, kao što je manje od 10 µg/ml, kao što je manje od 5 µg/ml, kao što je manje od 1 µg/ml – biti sposbno da smanji aktivnost pomenute prve ćelije za 50%, kao što je 60%, kao što je 70%, kao što je 80%, kao što je 90%, kao što je 95%, kao što je 100%. Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti sposobno da potpuno prekine aktivnost prve ćelije. Kada je testirano korišćenjem metode opisane iznad i u Primerima, u skladu sa predmetnim pronalaskom može, u koncentraciji od manje od 1 µg/ml - kao što je manje od 0.9 µg/ml, kao što je manje od 0.8 µg/ml, kao što je manje od 0.7 µg/ml, kao što je manje od 0.6 µg/ml, kao što je manje od 0.5 µg/ml, kao što je manje od 0.4 µg/ml, kao što je manje od 0.3 µg/ml, kao što je manje od 0.2 µg/ml – biti sposobno da prekine aktivnost prve ćelije.

[0033] Predmetni pronalazak takođe se odnosi na blokiranje TREM-1 antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima koje može biti identifikovano drugim načinima osim metode koja je ovde stavljena na uvid javnosti.

[0034] Termin "antitelo" se ovde odnosi na protein, izveden iz germinativne imunoglobulinske sekvence, koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen (TREM-1) ili njegov deo. Termin obuhvata antitela u punoj dužini bilo koje klase ili izotipa (to jest, IgA, IgE, IgG, IgM i/ili IgY) i bilo koji pojedinačni lanac ili fragment istog. Antitelo koje se specifično vezuje za antigen, ili njegov deo, može da se vezuje isključivo za taj antigen, ili njegov deo, ili može da se veže za ograničen broj homologih antigena, ili njihovih delova. Antitela u punoj dužini obično sadrže najmanje četiri polipeptidna lanca: dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koja su međusobno povezana disulfidnim vezama. Jedna imunoglobulinska pod-klasa od posebnog farmaceutskog interesa je IgG familija. Kod ljudi, igG klasa može biti podeljena u 2 pod-klase: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, na osnovu sekvence njihovih konstantnih regiona teških lanaca. Laki lanci mogu biti podeljeni u dva tipa, kapa i lambda, na osnovu razlika u kompoziciji njihovih sekvenci. IgG molekuli se sastoje od dva teška lanca, međusobno spojena pomoću dve ili više disulfidnih veza, i dva laka lanca svaki spojen za teški lanac disulfidnom vezom. Teški lanac može sadržati varijabilni region teškog lanca (VH) i do tri konstantna regiona teškog lanca (CH): CH1, CH2 i CH3. Laki lanac može da sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni region lakog lanca (CL). VH i VL regioni mogu biti dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), izmešane sa regionima koji su više konzervirani, nazvani okvirni regioni (FR). VH i VL regioni tipično se sastoje od tri CDRs i četiri FRs, postavljeni od amino-terminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Hipervarijabilni regioni teških i lakih lanaca formiraju [vezujući] domen koji je sposoban da interaguje sa antigenom, dok konstantni region antitela može posredovati vezivanju imunoglobulina u tkiva ili faktore domaćina, uključujući, ali ne ograničavajući se na različite ćelije imunskog sistema (efektorske ćelije), Fc receptore i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0035] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti izolovana. Termin "izolovano antitelo" odnosi se na antitelo koje je izdvojeno i/ili ponovo dobijeno od druge komponente (drugih komponenti) u sredini u kojoj je proizvedeno i/ili je prečišćeno iz smeše komponenti koje su prisutne u sredini u kojoj je proizvedeno.

[0036] Određeni antigen-vezujući fragmenti antitela mogu biti pogodni u kontekstu predmetnog pronalaska, pošto se pokazalo da antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvedena fragmentima antitela u punoj dužini. Termin "antigen-vezujući fragment" antitela odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koja zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen, kao što je TREM-1, kao što je opisano ovde. Primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (tipično VL i VH domene pojedinačnog kraka antitela), jednolančani Fv (scFv; videti npr. Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; i Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (tipično VH i CHI domen), i dAb (tipično VH domen) fragmente; VH, VL, VhH, i V-NAR domene; monovalentne molekule koji sadrže pojedinačni VH i pojedinačni VL lanac; minitela, diatela, triatela, tetratela, i kapa tela (videti, npr., III et al., Protein Eng 1997;10:949-57); IgG kamile; IgNAR; kao i jedan ili više izolovanih CDRs ili funkcionalni paratop, gde izolovani CDRs ili antigen-vezujući ostaci ili polipetidi mogu biti povezani ili spojeni zajedno tako da formiraju funkcionalni fragment antitela. Razni tipovi fragmenata antitela su opisani ili razmotreni u, npr. Holliger i Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219, i objavljenim Američkim patentnim prijavama 20050238646 i 20020161201. Ovi fragmenti antitela mogu biti dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih prosečnim poznavaocima oblasti, i fragmenti mogu biti ispitani na korisnost na isti način kao intaktna antitela.

[0037] Antitelo predmetnog pronalaska, kao što je definisano u patentnim zahtevima, može biti humano antitelo ili humanizovano antitelo. Termin "humano antitelo", kao što je ovde korišćeno, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne regione u kojima je bar deo okvirnog regiona i/ili barem deo CDR regiona izveden iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. (Na primer, ljudsko antitelo može imati varijabilne regione u kojima su i okvirni i CDR regioni izvedeni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije.) Pored toga, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz sekvenci imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela predmetnog pronalaska mogu da uključe aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani pomoću sekvenci imunogloblina humane germinativne linije (npr., mutacije uvedene pomoću nasumične ili mesto-specifične mutageneze in vitro ili pomoću somatske mutacije in vivo).

[0038] Takvo humano antitelo može biti humano monoklonsko antitelo. Takvo humano monoklonsko antitelo može biti proizvedeno pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju koja se dobija od transgene ne-humane životinje, npr. transgeni miš, koji ima genom koji sadrži humani transgen teškog lanca i transgen lakog lanca fuzionisan sa imortalizovanom ćelijom.

[0039] Humana antitela mogu biti izolovana iz biblioteka sekvenci sagrađenih na selekcijama humanih germinativnih sekvenci, dalje koji su dalje raznovrsni sa prirodnom i sintetičkom raznovrsnošću sekvence. Dalje modifikovanih pomoću raznovrsnosti prirodnih i sintetičkih sekvenci.

[0040] Humana antitela mogu biti pripremljena pomoću in vitro imunizacije humanih limfocita praćeno sa transformacijom limfocita sa Epštajn-Bar virusom.

[0041] Termin "derivat humanog antitela" odnosi se na bilo koji modifikovani oblik humanog antitela, kao što je konjugat antitela ili drugi agens ili antitelo.

[0042] Termin "humanizovana antitela", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na humano/nehumano himerno antitelo koje sadrži jednu ili više sekvenci (CDR regioni ili njihovi delovi) koji su izvedeni iz ne-humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo je, prema tome, humani imunoglobulin (antitelo primaoca) u kome su bar ostaci iz hiper-varijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima iz hiper-varijabilnog regiona antitela iz ne-humane vrste (antitelo donora) kao što je iz miša, pacova, zeca ili ne-humanog primata, koji imaju željenu specifičnost, afinitet, kompoziciju sekvence i funkcionalnost. U nekim slučajevima, ostaci FR humanog imunoglobulina zamjenjuju se odgovarajućim ne-humanim ostacima. Primer ovakve modifikacije je uvođenje jedne ili više tzv. povratnih-mutacija, koji su tipični aminokiselinski ostaci izvedeni iz antitela donora. Humanizacija antitela se može izvesti pomoću rekombinantnih tehnika poznatih prosečnom poznavaocu oblasti (videti, npr., Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, tom 248, uređeno od strane Benny K. C. Lo). Pogodni humani okvir primaoca za varijabilni domen i lakog i teškog lanca može se identifikovati, na primer, sa sekvencijalnom ili strukturalnom homologijom. Alternativno, mogu se koristiti fiksni okviri primaoca, na primer, na osnovu znanja o strukturi, biofizičkim i biohemijskim svojstvima. Okviri primaoca mogu biti izvedeni iz germinativne linije ili izvedeni iz sekvence zrelog antitela. CDR regioni iz antitela donora mogu se preneti CDR kalemljenjem. CDR graftovano humanizovano antitelo može se dalje optimizovati za npr. afinitet, funkcionalnost i biofizičke osobine identifikacijom kritičnih okvirnih položaja gde ponovno uvođenje (povratna mutacija) amino kiselog ostatka iz antitela donora ima blagotvorno dejstvo na osobine humanizovanog antitela. Pored povratnih mutacija izvedenih iz antitela donora, humanizovano antitelo može se projektovati uvođenjem ostataka germinativne linije u CDR ili okvirne regione, eliminacijom imunogenih epitopa, usmerenom mutagenezom, sazrevanjem afiniteta itd.

[0043] Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove izmene su načinjene kako bi se dalje poboljšale performanse antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će obuhvatiti najmanje jedan tipično dva varijabilna domena, u kojima svi ili u suštini svi CDR regioni odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina i u kojima su svi ili u suštini svi od FR ostataka oni humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo može, opciono, takođe sadržati bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog od humanog imunoglobulina.

[0044] Termin "derivat humanizovanog antitela" odnosi se na bilo koji modifikovani oblik humanizovanog antitela, kao što je konjugat antitela ili drugi agens ili antitelo.

[0045] Termin "himerno antitelo", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na antitelo čiji su geni lakog i teškog lanca konstruisani, tipično genetičkim inženjeringom, od gena varijabilnog i konstantnog regiona imunoglobulina koji potiču od različitih vrsta. Na primer, varijabilni segmenti gena iz mišjeg monoklonskog antitela mogu biti udruženi sa humanim konstantnim segmentima.

[0046] Fragment kristalizirajućeg regiona ("Fc region"/"Fc domen") antitela je N-terminalni region antitela, koji sadrži konstatne CH2 i CH3 domene. Fc domen može interagovati sa ćelijskim površinskim receptorima koji se nazivaju Fc receptori, kao i nekim proteinima sistema komplementa. Fc region omogućava antitelima da interaguju sa imunskim sistemom. U jednom aspektu predmetnog pronalaska, antitela, kao što je definisano u patentnim zahtevima, mogu biti projektovana tako da obuhvataju modifikacije unutar Fc regiona, tipično da menjaju jedno ili više njegovih funkcionalnih svojstava, kao što je polu-život u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc-receptora, stabilnost proteina i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena, ili njen nedostatak, između ostalog. Pored toga, antitelo predmetnog pronalaska može biti hemijski modifikovano (npr., jedan ili više hemijskih delova se mogu vezati za antitelo) ili mogu biti modifikovani da promene njegovu glikozilaciju, ponovo da bi se promenilo jedno ili više funkcionalnih osobina antitela. IgG1 antitelo može nositi modifikovan Fc domen koji sadrži jednu ili više, možda sve od sledećih mutacija što će rezultovati u smanjenom afinitetu za određene Fc receptore (L234A, L235E, i G237A) i u smanjenoj C1q-posredovanoj fiksaciji komplementa (A330S i P331S), redom (numerisanje ostatka u skladu sa EU indeksom).

[0047] Izotip antitela predmetnog pronalaska može biti IgG, kao što je IgG1, kao što je IgG2, kao što je IgG4. Ako je poželjno, klase antitela mogu biti "zamenjene" poznatim tehnikama. Na primer, antitelo koje je originalno proizvedeno kao molekul IgM može biti klasa prebačena (zamenjena) na IgG antitelo. Tehnike prebacivanja klasa se takođe mogu koristiti za pretvaranje jedne IgG podklase u drugu, na primer: od IgG1 do IgG2 ili IgG4; od IgG2 do IgG1 ili IgG4; ili od IgG4 do IgG1 ili IgG2. Inženjering antitela za stvaranje himernih molekula sa konstantnim regionima, kombinacijom regiona iz različitih podklasa IgG, takođe se može izvesti.

[0048] U jednom tehničkom rešenju, zglobni region od CH1 je modifikovan tako da je broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu izmenjen, npr. povećan ili smanjen. Ovaj pristup je opisan dalje na primer u Američkom patentu br.5,677,425 od strane Bodmer et al.

[0049] Konstantni region može biti modifikovan da stabilizuje antitelo, npr., kako bi se smanjio rizik od bivalentnog antitela koje se razdvaja na dva monovalentna VH-VL fragmenta. Na primer, u konstantnom regionu IgG4, ostatak S228 (brojanje ostataka prema EU indeksu) može biti mutiran do prolinskog (P) ostatka za stabilizaciju formiranja disulfidnog mosta među teškim lancima na zglobu (videti, npr., Angal et al., Mol Immunol.

1995; 30: 105-8).

[0050] Antitela ili fragmenti mogu takođe biti definisani u smislu njhovih regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Termin "region koji određuje komplementarnost" ili "hipervarijabilni region", kada se ovde koristi, odnosi se na regione antitela u kojima se nalaze aminokiselinski ostaci uključeni u vezivanje antigena. Region hipervarijabilnosti ili CDR mogu se identifikovati kao regioni sa najvećom varijabilnošću u poravnanjima aminokiselina varijabilnih domena antitela. Baze podataka mogu se koristiti za identifikaciju CDR kao što je Baza podataka Kabat, CDR regioni koji su definisani tako da sadrže aminokiselinske ostatke 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) varijabilnog domena lakog lanca i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95 -102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH br. objave 91-3242) Alternativno CDR regioni mogu biti definisani kao oni ostaci od "hipervarijabilne petlje" (ostaci 26-33 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). Tipično, numerisanje aminokiselinskih ostataka u ovom regionu je izvedeno metodom koja je opisana u Kabat et al., iznad. Fraze kao što je "Kabat pozicija", "Kabat ostatak", i "prema Kabatu" ovde se odnosi na ovaj sistem numeracije za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca. Koristeći Kabat sistem za numerisanje, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca peptida može sadržavati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili unošenju u, okvirni region (FR) ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključivati aminokiselinske insercije (npr. ostaci 52a, 52b i 52c prema Kabatu) posle ostatka 52 CDR H2 i insertovani ostaci (npr. ostaci 82a, 82b i 82c itd. prema Kabatu) nakon ostatka FR teškog lanca lanca 82. Kabatovo numerisanje ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnavanjem na regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" sekvencom numerisanom po Kabatu.

[0051] Termin "okvirni region" ili "FR" ostaci odnosi se na one VH ili VL aminokiselinske ostatke koji nisu u sklopu CDR regiona, kao što je ovde definisano.

[0052] Tm14F69 antitelo ima varijabilnu sekvencu teškog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2 i varijabilnu sekvencu lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca /ili varijabilnu sekvencu lakog lanca. m14F69 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 68 i 101 do 110 SEQ ID NO: 2 i aminokiseline 24 do 38, 54 do 60 i 93 do 101 od SEQ ID NO: 3. antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži amino kiseline 101 do 110 sa SEQ ID NO: 2.

[0053] Teški lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDR1 sekvencu aminokiselina 31 do 35 (TYAMH) od SEQ ID NO: 2, gde jedna od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0054] Teški lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDR2 sekvencu aminokiselina 50 do 68 (RIRTKSSNYATYYADSVKD) od SEQ ID NO: 2, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0055] Teški lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDR3 sekvencu aminokiselina 101 do 110 (DMGQRRQFAY) od SEQ ID NO: 2, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0056] Laki lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDR1 sekvencu aminokiselina 24 do 38 (RASESVDTFDYSFLH) od SEQ ID NO: 3, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0057] Laki lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDR2 sekvencu aminokiselina 54 do 60 (RASNLES) od SEQ ID NO: 3, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0058] Laki lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDR3 sekvencu aminokiselina 93 do 101 (QQSNEDPYT) od SEQ ID NO: 3, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0059] mAb 0170 antitelo ima sekvencu teškog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4 i sekvencu lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 5. Antitelo predmetnog pronalaska ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 68 i 101 do 110 od SEQ ID NO: 4 i aminokiseline 24 do 38, 54 do 60 i 93 do 101 od SEQ ID NO: 5. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.

[0060] mAb 0122 antitelo ima sekvencu teškog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 6 i sekvencu lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 7. Antitelo ove predmetne objave može da sadrži ovu sekvencu teškog lanca i/ili ovu sekvencu lakog lanca. mAb 0122 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 68 i 101 do 110 od SEQ ID NO: 6 i aminokiselina 24 do 38, 54 do 60 i 93 do 101 of SEQ ID NO: 7. Antitelo predmetne objave može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.

[0061] Teški lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDRH1 sekvencu aminokiselina 31 do 35 (TYAMH) od SEQ ID NO: 4, gde jedna od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitim aminokiselinskim ostatkom.

[0062] Teški lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDRH2 sekvencu aminokiselina 50 do 68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG) od SEQ ID NO: 4, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitom aminokiselinom.

[0063] Teški lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDRH3 sekvencu aminokiselina 101 do 110 (DMGIRRQFAY) od SEQ ID NO: 4, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitom aminokiselinom.

[0064] Teški lanac antitela u skladu sa predmetnom objavom može da sadrži CDRH3 sekvencu aminokiselina 101 do 110 (DMGQRRQFAY) od SEQ ID NO: 6, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitom aminokiselinom.

[0065] Laki lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDRL1 sekvencu aminokiselina 24 do 38 (RASESVDTFDYSFLH) od SEQ ID NO: 5, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitom aminokiselinom.

[0066] Laki lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDRL2 sekvencu aminokiselina 54 do 60 (RASNLES) od SEQ ID NO: 5, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0067] Laki lanac antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži CDRL3 sekvencu aminokiselina 93 do 101 (QQSNEDPYT) od SEQ ID NO: 5, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

[0068] m14F128 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO: 8 i laki lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO: 9. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. m14F128 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 68 i 101 do 110 od SEQ ID NO: 8 i aminokiseline 24 do 38, 54 do 60 i 93 do 101 od SEQ ID NO: 9. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.

[0069] m14F113 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO: 10 i laki lanac kao što je prikazano u SEQ ID NO: 11. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. m14F113 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 68 i 101 do 110 od SEQ ID NO: 10 i aminokiselinama 24 do 38, 54 do 60 i 93 do 101 od SEQ ID NO: 11. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci. Antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži aminokiseline 101 do 110 od SEQ ID NO: 10.

[0070] Termin "antigen" (Ag) odnosi se na molekularni entitet korišćen za imunizaciju imunokompetentnog kičmenjaka da proizvede antitelo (Ab) koje prepoznaje Ag. Ovde, Ag se naziva i šire i generalno bi trebalo da obuhvati ciljne molekile koji su specifično prepoznati od strane Ab, prema tome uključujući fragmente ili mimike molekila koji su korišćeni u procesu imunizacije, ili drugom procesu, npr. fagni displej, korišćen za generisanje Ab.

[0071] Termin "epitop", kao što je ovde korišćeno, je definisan u kontekstu molekularne interakcije između "antigen vezujućeg polipeptida", kao što je antitelo (Ab), i njegov odgovarajući antigen (Ag). Generalno, "epitop" odnosi se na oblast ili region na Ag na kome se Ab specifično vezuje, tj. oblast ili region u fizičkom kontaktu sa Ab. Fizički kontakt se može definisati kroz različite kriterijume (npr. prekid udaljenosti od 2-6 Å, kao što je 3 Å, kao što je 4 Å, kao što je 5 Å ili pristupačnost rastvarača) za atome u molekulima Ab i Ag. Proteinski epitop može sadržati amino kiselinske ostatke u Ag koji su direktno uključeni u vezivanje za Ab (takođe nazvana imunodominantna komponenta epitopa) i ostale aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci Ag koji su efikasno blokirani pomoću Ab, tj. aminokiselinski ostaci unutar "površine koja isključuje rastvarače" i/ili "otiska" Ab.

[0072] Termin epitop ovde sadrži oba tipa regiona vezivanja u bilo kom određenom regionu TREM-1 koji se specifično vezuje za TREM-1 antitelo. TREM-1 može sadržati niz različitih epitopa, koji mogu uključivati, bez ograničenja, konformacione epitope koje se sastoje od jedne ili više ne-susednih amino kiselina lociranih jedna blizu druge u zreloj TREM-1 konformaciji i post-translacijskim epitopama koji se sastoje, bilo u celini ili delom, od molekulskih struktura kovalentno vezanih za TREM-1, kao što su grupe ugljenih hidrata.

[0073] Epitop za dati par antitelo (Ab)/antigen (Ag) može se opisati i okarakterisati na različitim nivoima detalja koristeći mnoštvo eksperimentalnih i kompjuterskih metoda mapiranja epitopa. Eksperimentalne metode uključuju mutagenezu, rendgensku kristalografiju, spektroskopiju nuklearne magnetne rezonance (NMR), masenu spektrometriju sa izmenom deuterijum vodonik (HX-MS) i različite metode kompetitivnog vezivanja; metode koje su poznate u oblasti. Kako se svaka metoda oslanja na jedinstveni princip, opis epitopa je blisko povezan sa metodom pomoću koje je određen. Prema tome, zavisno od korišćene metode mapiranja epitopa, epitop za dati Ab/Ag par se može opisati različito.

[0074] Na svom najdetaljnijem nivou, epitop za interakciju između Ag i Ab se može opisati prostornim koordinatama koje definišu atomske kontakte prisutne u interakciji Ag-Ab, kao i informacije o njihovom relativnom doprinosu termodinamici vezivanja. Na manje detaljnom nivou, epitop se može karakterisati prostornim koordinatama koje definišu atomske kontakte između Ag i Ab. Na još manje detaljnom nivou, epitop se može okarakterisati sa aminokiselinskim ostacima koje on sadrži kao što je definisano specifičnim kriterijumima, kao što je rastojanje između ili dostupnost rastvarača atoma u kompleksu Ab:Ag. Na još manje detaljnom nivou epitop se može okarakterisati kroz funkciju, npr. kompeticijom vezivanja za druga Abs. Epitop takođe može biti više generički definisan kao da sadrži aminokiselinske ostatke za koje će supstitucija drugim aminokiselinama promeniti karakteristike interakcije između Ab i Ag.

[0075] U kontekstu kristalne strukture izvedene rendgenskim zracima definisane su prostorne koordinate kompleksa između Ab, npr. Fab fragment i njegov Ag, termin epitop je ovde, osim ako nije drugačije naznačeno ili suprotstavljeno kontekstom, specifično definisan kao ostaci TREM-1 koji se karakterišu time što imaju težak atom (tj. atom koji nije vodonik) unutar udaljenosti, npr.4 A od teškog atoma u Ab.

[0076] Iz činjenice da se opisi i definicije epitopa, zavisno od korišćenog metoda mapiranja epitopa, dobijaju na različitim nivoima detalja, sledi da se poređenje epitopa za različite Abs na istom Agu može slično voditi na različitim nivoima detalja.

[0077] Kaže se da su epitopi opisani na nivou amino kiseline, npr. utvrđeni iz rendgenske strukture, identični ako sadrže isti skup aminokiselinskih ostataka. Kaže se da se epitopi preklapaju ako epitopi dele najmanje jednu aminokiselinu. Kaže se da su epitopi odvojeni (jedinstveni) ako epitopi ne dele nikakav amino kiselinski ostatak.

[0078] Epitopi se takođe mogu indirektno definisati pomoću upoređivanja kinetike vezivanja antitela sa humanim TREM-1 divljeg tipa sa humanim TREM-1 varijantama koje imaju mutacije alanina u predviđenim epitopima. Smanjen afinitet ili ukinuto vezivanje antitela za varijante humanog TREM-1 u kome je amino kiselinski ostatak zamenjen ostatkom alanina ukazuje na to da mutirana aminokiselina doprinosi interakciji između pomenutog antitela i humanog TREM-1 divljeg tipa. Ovaj pristup obezbeđuje negativnu identifikaciju epitopa. Metoda je kompromitovana u efektivnom definisanju epitopa pomoću činjenice da bi pogrešno sklapanje ili nesklapanje proteina dalo slične rezultate kao i ukidanje interakcije. Analiza može biti upotpunjena komparativnim dobitkom funkcionalnih mutacijskih analiza ortološkog ciljnog proteina (npr., TREM-1 cinomolgus majmuna), ako postoji unakrsno reaktivno antitelo. Poređenje će definisati razlike između epitopa između antitela koje ne reaguje unakrsno sa, npr., TREM-1 cinomolgus majmuna i unakrsno reaktivnim antitelom.

[0079] Indirektna identifikacija epitopa se takođe može obezbediti pomoću merenja vezivanja antitela (ili fragmenta antitela) koje se vezuje za varijante antigena divljeg tipa (TREM-1). Ako antitelo ili njegov fragment vezuje, npr. humani ali ne TREM-1 cinomolgus majmuna i ako je pomenuto antitelo ili njegov fragment sposoban vezati delimično humanizovanu varijantu TREM-1 cinomolgus majmuna, onda ovo ponovno stečeno vezivanje ukazuje na to da supstituisani amino kiselinski ostatak (ostaci) je/su važni za interakciju antitela sa antigenom. Na isti način, povećani afinitet za humanizovane varijante TREM-1 cinomolgus majmuna, humanog TREM-1 antitela (ili njegovog Fab fragmenta) koje imaju slabije vezivanje za TREM-1 cinomolgus majmuna u poređenju sa humanim TREM-1, može pružiti informacije o identitetu ostataka koji čine vezujući epitop.

[0080] Efekat istih mutacija na bilo koje dato antitelo koje unakrsno reaguje omogućava diskriminaciju između mogućeg pogrešnog sklapanja proteina (ukinuto vezivanje za oba antitela) i gubitka interakcije u humanom TREM-1 (vezivanje za jedno od antitela i ukinuto vezivanje za drugo antitelo), pri čemu nedvosmisleno pruža informacije o razlikama epitopa između antitela koje ne raguje unakrsno i antitela koje reaguje unakrsno na nivou amino kiselina.

[0081] Antitela predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima mogu biti sposobna za vezivanje varijanti humanog TREM-1. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna za vezivanje K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13), kao što je određeno korišćenjem, npr., površinske plazmonske rezonance.

[0082] Antitela predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima mogu biti sposobna da vezuju varijante TREM-1 cinomolgus majmuna. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna za vezivanje A24T/ Y28F/ N30S/ R32Q/ P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14), kao što je određeno korišćenjem, npr., površinske plazmonske rezonance. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti sposobna za vezivanje A24T/ Y28F/ N30S/ R32Q/ E54K-cTREM-1- Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 15), kao što je određeno korišćenjem, npr. površinske plazmonske rezonance.

[0083] Antitelo stavljeno na uvid javnosti ovde može biti sposobno za specifično vezivanje TREM-1, gde pomenuto antitelo je sposobno da za specifično vezivanje (i) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od A21, T22, K23, L24, T25, E26, i (ii) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od A49, S50, S51, Q52, K53, A54, W55, Q56, I57, I58, R59, D60, G61, E62, M63, P64, K65, T66, L67, A68, C69, T70, E71, R72, P73, S74, K75, N76, S77, H78, P79, V80, Q81, V82, G83, R84, I85 i (iii) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od C113, V114, I115, Y116, Q117, P118 i P119 of human TREM-1.

[0084] Antitelo predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima može biti sposobno za specifično vezivanje polipeptida koji sadrži aminokiseline D38 do F48 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što je određeno korišćenjem, npr., HX-MS.

[0085] Antitelo predmetnog pronalaska ima epitop koji sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili sve od aminokiselinskih ostataka D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 i L45 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1) i jedan, dva ili sve od aminokiselinskih ostataka koji su odabrani iz grupe koja se sastoji od E46, K47 i F48 of SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što je određeno korišćenjem, npr., HX-MS.

[0086] Antitelo predmetnog pronalaska može imati epitop koji sadrži jedan, dva ili sve aminokiselinske ostatke koji su odabrani od grupe koja se sastoji od D42, E46, D92 i H93 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što je određeno korišćenjem varijanti TREM-1 i površinske plazmonske rezonance.

[0087] Antitelo predmetne objave može imati epitop koji sadrži barem aminokiselinske ostatke E46 i/ili D92 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što je određeno korišćenjem varijanti TREM-1 i površinske plazmonske rezonance.

[0088] Antitelo stavljeno ovde na uvid javnosti može dalje da sadrži jedan, dva ili sve od aminokiselinskih ostataka odabranih iz grupe koja se sastoji od L31, I86 i V101 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1).

[0089] Antitelo predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima može biti sposobno za specifično vezivanje polipeptida koji sadrži amonokiselinske ostatke E19 do L26 TREM-1 cinomolgus majmuna (SEQ ID NO: 12), ili odgovarajuće aminokiseline sa SEQ ID NO: 21, kao što je određeno korišćenjem, npr., HX-MS.

[0090] Antitelo predmetne objave može biti sposobno za specifično vezivanje humanog TREM-1, gde epitop pomenutog antitela sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam od aovih aminokiselinskih ostataka odabranih iz grupe koja se sastoji od V39, K40, C41, D42, Y43, L45, E46, K47, F48 i A49 od SEQ ID NO: 1.

[0091] Epitop antitela predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima može da sadrži D42 od SEQ ID NO: 1. Epitop antitela predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima može da sadrži E46 od SEQ ID NO: 1. Epitop pomenutog antitela može da sadrži V39, C41, D42, Y43, L45 od SEQ ID NO: 1. Epitop pomenutog antitela može da sadrži E46, K47 i A49 od SEQ ID NO: 1. Epitop pomenutog antitela može dalje da sadrži F48 od SEQ ID NO: 1.

[0092] Definicija termina "paratop" je izvedena iz gornje definicije "epitop" preokretanjem perspektive. Prema tome, termin "paratop" odnosi se na oblast ili region na Ab za koji se specifično vezuje Ag, tj. sa kojim ono ostvaruje fizički kontakt sa Ag.

[0093] U kontekstu kristalne strukture izvedene rendgenskim zracima, definisane prostornim koordinatama kompleksa između Ab, kao što je Fab fragment i njegov Ag, termin paratop je ovde, osim ako nije drugačije naznačeno ili protivrečeno kontekstom, konkretno definisan kao ostaci Ag koji su naznačeni time da imaju težak atom (tj. atom koji nije vodonik) na rastojanju od 4 A od teškog atoma u TREM-1.

[0094] Epitop i paratop za dato antitelo (Ab)/antigen (Ag) mogu biti identifikovani rutinskim metodama. Na primer, generalna loakacija epitopa može biti definisana procenjivanjem sposobnosti antitela da se veže za različite fragmente ili varijante TREM-1 polipeptida. Specifične aminokiseline u sklopu TREM-1 koje čine kontakt sa antitelom (epitop) i specifične aminokiseline u antitelu koje prave kontakt između sa TREM-1 (paratop) mogu takođe biti određene korišćenjem rutinskih metoda. Na primer, antitelo i ciljni molekul mogu biti kombinovani i kompleks Ab:Ag može biti kristalisan. Kristalna struktura kompleksa mogu biti određeni i korišćeni da se identifikuju specifična mesta interakcije između antitela i njegovog cilja.

[0095] Antitela koja se vezuju za isti antigen mogu se okarakterisati u pogledu njihove sposobnosti da se istovremeno vezuju za njihov zajednički antigen i mogu biti podvrgnuti "kompetitivnom vezivanju"/"binning-u" (karakterizaciji, grupisanju). U sadašnjem kontekstu, termin "binning" odnosi se na metod “grupisanja” (binning) antitela koja se vezuju za isti antigen. "Binning" antitela može biti zasnovan na kompeticiji vezivanja dva antitela za njihov zajednički antigen u testovima zasnovanim na standardnim tehnikama kao što je površinska plazmonska rezonanca (SPR), ELISA ili protočna citometrija.

[0096] "Grupa" (“bin”) antitela je definisana korišćenjem referentnog antitela. Ako drugo antitelo nije sposobno da se veže za antigen u isto vreme kao referentno antitelo, kaže se za drugo antitelo da pripada istoj “grupi” antitela kao referentno antitelo. U ovom slučaju. referentno i drugo antitelo kompetitivno vezuju isti deo antigena i oni su skrivena “kompetirajuća antitela”. Ako je drugo antitelo sposobno da se veže za antigen u isto vreme kao referentno antitelo, za drugo antitelo se kaže da pripada odvojenoj “grupi”. U ovom slučaju, referentno i drugo antitelo ne vezuju kompetitivno isti deo antigena i oni su skrivena “ne-kompetirajuća antitela”.

[0097] “Grupisanje” antitela ne obezbeđuje direktnu informaciju o epitopu. Kompetirajuća antitela, tj. antitela koja pripadaju istoj “grupi” mogu imati identične epitope, preklapajuće epitope, ili čak odvojene epitope. Ovo drugo je slučaj kada referentno antitelo vezano za njegov epitop na antigenu zauzima prostor potreban drugom antitelu da kontaktira njegov epitop na antigenu (“prostorna smetnja”). Ne-kompetirajuća antitela generalno imaju odvojene epitope.

[0098] Antitelo predmetnog pronalaska može da kompetira sa mAb 0170 za vezivanje za humani TREM-1, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Antitelo predmetnog pronalaska može da kompetira sa mAb 0170 za vezivanje za TREM-1 cinomolgus majmuna, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Drugim rečima, antitelo predmetnog pronalaska može da pripada istoj “grupi” kao mAb 0170.

[0099] Termin "afinitet vezivanja" ovde odnosi se na merenje snage nekovalentne interakcije između dva molekula, npr. antitela, njegovog fragmenta, i antigena. Termin “afinitet vezivanja” je korišćen da se opišu monovalentne interakcije (unutrašnja aktivnost).

[0100] Afinitet vezivanja između dva molekula, npr. antitela, njegovog fragmenta, ili antigena, preko monovalentne interakcije može biti kvantifikovan određivanjem kontantne disocijacije u ravnoteži (KD). Zauzvrat, KDmože btii određena merenjem kinetike formiranja kompleksa i disocijacije, npr. pomoću SPR metode. Konstantne brzine koje odgovaraju asocijaciji i disasocijaciji monovalentnog kompleksa nazivaju se kao konstanta brzine asocijacije ka(ili kon) i konstanta brzine disasocijacije kd(ili koff), redom. KDje povezana sa kai kdpreko jednačine KD= kd/ ka.

[0101] Praćenjem gornje definicije, afiniteti vezivanja povezani sa različitim molekulskim interakcijama, kao što je upoređivanje afiniteta vezivanja različitih antitela za datog antigena, mogu se uporediti poređenjem vrednosti KDza pojedinačne komplekse antitelo/antigen.

[0102] Antitelo predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima može vezati humani TREM-1 sa afinitetom (KD) koji je 1 x 10<-7>M ili manje, 1 x 10<-8>M ili manje, ili 1 x 10<-9>M ili manje, ili 1 x 10<-10>M ili manje, 1 x 10<-11>M ili manje, 1 x 10<-12>M ili manje ili 1 x 10<-13>M ili manje, kao što je određeno korišćenjem površinske plazmonske rezonance. Antitelo predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima može da veže TREM-1 cinomolgus majmnuna sa afinitetom (KD) koji je 1 x 10<-7>M ili manje, 1 x 10<-8>M ili manje, ili 1 x 10<-9>M ili manje, ili 1 x 10<-10>M ili manje, 1 x 10<-11>M ili manje, 1 x 10<-12>M ili manje ili 1 x 10<-13>M ili manje, kao što je određeno korišćenjem površinske plazmonske rezonance.

[0103] Termin "specifičnost vezivanja" ovde se odnosi se na interakciju molekula kao što je antitelo, ili njegov fragment, sa pojedinačnim isključivim antigenom, ili sa ograničenim brojem visoko homologih antigena (ili epitopa). Suprotno tome, antitela koja su sposobna za specifično vezivanje za TREM-1 nisu sposobna za vezivanje različitih molekula. Antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da ne budu sposobna za vezivanje Nkp44.

[0104] Specifičnost interakcije i vrednost konstante vezivanja u ravnoteži mogu se odrediti direktno dobro poznatim metodama. Standardni testovi za procenu sposobnosti liganda (kao što su antitela) da se vežu za svoje ciljeve su poznati u oblasti i uključuju, na primer, ELISA, Western blotove, RIA i analizu protočnom citometrijom. Vezujuća kinetika i afinitet vezivanja antitela takođe se mogu proceniti standardnim testovima poznatim u oblasti, kao što je SPR.

[0105] Mogu se sprovoditi testovi kompetitivniog vezivanja u kojima je vezivanje antitela za cilj upoređeno sa vezivanjem cilja od strane drugog liganda tog cilja, kao što je drugo antitelo.

[0106] U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje kompozicije i formulacije koje sadrže molekule koji su ovde stavljeni na uvod javnosti, kao što su TREM-1 antitela predmetnog pronalaska, i polinukleotidi, vektori i ćelije opisane ovde. Na primer, objava obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno ili više TREM-1 antitela predmetnog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima, formulisanu zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0107] Prema tome, jedan cilj predmetne objave je da obezbedi farmaceutsku formulaciju koja sadrži takvo TREM-1 antitelo koje je prisutno u koncentraciji od 0.25 mg/ml do 250 mg/ml, kao što je koncetracija od 10 do 200 mg/ml, i gde pomenuta formulacija ima pH od 2.0 do 10.0, kao što je pH od 4.0 do 8.0. Formulacija može dalje da sadrži jedan ili više puferskih sistema, konzervans, agens za toničnost, agens za heliranje, stabilizator i/ii surfaktant, kao i razne kombinacije istih. Primena konzervanasa, izotoničnih agenasa, stabilizatora i surfaktanata u farmaceutskim kompozicijama je dobro poznata prosečnom poznavaocu oblasti. Moguće je pozivanje na Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izdanje, 1995.

[0108] U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska formulacija je u vodenoj formulaciji. Takva formulacija je tipično rastvor ili suspenzija, ali može takođe da uključi koloide, disperzije, emulzije, i više-fazne materijale. Termin “vodena formulacija” je definisan kao formulacija koja sadrži najmanje 50% m/m vode. Isto tako, termin "vodeni rastvor" je definisan kao rastvor koji sadrži najmanje 50 % m/m vode, i termin "vodena suspenzija" je definisan kao a suspenzija koja sadrži najmanje 50 % m/m vode.

[0109] U još jednom tehničkom rešenju, farmaceutska formulacija je formulacija koja je osušena zamrzavanjem, kojoj lekar ili pacijent dodaje rastvarače i/ili razblaživače pre upotrebe.

[0110] U dodatnom aspektu, farmaceutska formulacija sadrži vodeni rastvor takvog antitela, i pufer, gde je antitelo prisutno u koncentraciji od 1 mg/ml ili iznad, i gde pomenuta formulacija ima pH od oko 2.0 do oko 10.0.

[0111] TREM-1 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije koje sadrže takva antitela mogu biti korišćene za lečenje inflamatornih bolesti kao što su sledeće: inflamatorna bolest creva (IBD), Kronova bolest (CD), ulcerozni kolitis (UC), sindrom iritabilnog creva, reumatoidni artritis (RA), psorijaza, psorijatični artritis, sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, dijabetes tipa I, Gravesova bolest, multipla skleroza (MS), autoimunski miokarditis, Kavasaki bolest, bolest koronarne arterije, hronična opstruktivna plućna bolest, intersticijska bolest pluća, autoimuni tiroiditis, skleroderma, sistemska skleroza, osteoartritis, atopijski dermatitis, vitiligo, bolest kalem protiv domaćina, Sjogrenov sindrom, autoimuni nefritis, Goodpasture-ov sindrom, hronična inflamatorna demijelinizirajuća polineuropatija, alergija, astma i druge autoimune bolesti koje rezultat ili akutne ili hronične inflamacije.

[0112] TREM-1 antitela predmetnog pronalaska mogu biti pogodna za primenu u lečenju pojedinaca sa inflamatornom bolešću creva. Inflamatorna bolest creva (IBD) je bolest koja može da utiče na bilo koji deo gastrointestinalnog trakta od usta do anusa, uzrokojući širok spektar simptoma. IBD prvenstveno uzrokuje abdominalnu bol, dijareju (koja može biti krvava), povraćanje ili gubitak težine, ali može takođe uzrokovati komplikacije izvan gastrointestinalnog trakta kao što su kožni osipi, artritis, zapaljenje očiju, zamor i nedostatak koncentracije. Pacijenti sa IBD mogu se podeliti na dve glavne klase, one sa ulcerativnim kolitisom (UC) i one sa Kronovom bolešću (CD). CD generalno uključuje ileum i debelo crevo, može uticati na bilo koji region creva, ali je često diskontinuiran (fokusirane oblasti bolesti šire se kroz crevni sistem). UC uvek uključuje rektum (kolonski) i više je kontinuiran.

U CD, inflamacija je transmuralna, što dovodi do apscesa, fistula i striktura, dok u UC, zapaljenje je tipično ograničeno na sluznicu. Nema poznatog farmaceutskog ili hirurškog leka za Kronovu bolest, dok se neki bolesnici sa UC mogu izlečiti hirurškim uklanjanjem debelog creva. Opcije lečenja su ograničene na kontrolisanje simptoma, održavanje remisije i sprečavanje recidiva. Efikasnost inflamatorne bolesti creva u klinici može se meriti kao redukcija indeksa aktivnosti Kronove bolesti (CDAI) za CD koji je skala rezultata bazirana na laboratorijskim testovima i upitniku o kvalitetu života. U modelima životinja, efikasnost se uglavnom meri povećanjem težine i takođe indeksom aktivnosti bolesti (DAI), što je kombinacija konzistencije stolice, mase i krvi u stolici.

[0113] TREM-1 antitela predmetnog pronalaska mogu biti pogodna za upotrebu u lečenju pojedinaca sa reumatoidnim artritisom. Reumatoidni artritis (RA) je sistemska bolest koja pogađa skoro ako ne celo telo i jedan je od najčešćih oblika artritisa. Karakteriše ga upala zgloba, koja uzrokuje bol, krutost, toplota, crvenilo i oticanje. Ova inflamacija je posledica inflamatornih ćelija koje napadaju zglobove, i ove inflamatorne ćelije oslobađaju enzime koji mogu digerirati kost i hrskavicu. Kao rezultat toga, ova inflamacija može dovesti do oštrog oštećenja kosti i hrskavice, kao i do pogoršanja zglobova i jakog bola, između ostalog fizioloških efekata. Zajednički zglob može izgubiti svoj oblik i poravnanje, što rezultira bolom i gubitkom kretanja.

[0114] Postoji nekoliko životinjskih modela za reumatoidni artritis koji su poznati u oblasti. Na primer, u modelu artritisa izazvanog kolagenom (CIA), miševi razvijaju inflamatorni artritis koji liči na humani reumatoidni artritis. S obzirom da CIA deli slične imunološke i patološke karakteristike sa RA, to ga čini pogodnim modelom za skrining potencijalnih humanih anti-inflamatornih jedinjenja. Efikasnost u ovom modelu meri se smanjenjem otoka zglobova. Efikasnost u RA u klinici meri se sposobnošću smanjenja simptoma kod pacijenata koja se meri kao kombinacija otoka zglobova, brzine sedimentacije eritrocita, nivoa C-reaktivnog proteina i nivoa serumskih faktora, kao što su anti-citrulisana proteinska antitela.

[0115] TREM-1 antitela predmetnog pronalaska mogu biti pogodna za upotrebu u lečenju osoba sa psorijazom. Psorijaza je inflamatorni poremećaj kože posredovan T-ćelijom koji može izazvati značajnu neugodnost. To je bolest za koju trenutno ne postoji lek i utiče na ljude svih uzrasta. Iako pojedinci sa blagom psorijazom često mogu kontrolisati svoju bolest pomoću topikalnih agenasa, više od milion pacijenata širom svijeta zahteva lečenje ultraljubičastim svetlom ili sistemsku imunosupresivnu terapiju. Nažalost, neugodnost i rizici od ultraljubičastog zračenja i toksičnosti mnogih terapija ograničavaju njihovu dugotrajnu upotrebu. Osim toga, pacijenti obično imaju ponovnu pojavu psorijaze, i u nekim slučajevima se oporavljaju kratko nakon zaustavljanja imunosupresivne terapije. Nedavno razvijen model psorijaze zasnovan na prenosu CD4 T ćelija podražava mnoge aspekte humane psorijaze i stoga se može koristiti za identifikaciju jedinjenja pogodnih za upotrebu u lečenju psorijaze (Davenport et al., Intern., Immunopharmacol 2: 653-672, 2002). Efikasnost u ovom modelu meri se smanjenjem patologije kože pomoću sistema bodovanja. Slično tome, efikasnost kod pacijenata meri se smanjenjem patologije kože.

[0116] TREM-1 antitela predmetnog pronalaska mogu biti pogodna za upotrebu u lečenju osoba sa psorijatičnim arteritisom. Psorijatični artritis (PA) je vrsta zapaljenog artritisa koji se javlja u podskupu pacijenata sa psorijazom. Kod ovih pacijenata, patologija/simptomi kože su praćeni oticanjem zglobova slično onom koji je opažen kod reumatoidnog artritisa. Odlikuju ga pečati, podignute, crvene oblasti kožne inflamacije sa skaliranjem. Psorijaza često utiče na vrhove laktova i kolena, skalp, pupak i oko genitalnih oblasti ili anusa. Približno 10% pacijenata koji imaju psorijazu takođe razvijaju povezanu inflamaciju njihovih zglobova.

[0117] Termin "tlečenje", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na medicinsku terapiju bilo kog humanog ili drugog životinjskog subjekta kojem je to potrebno. Očekuje se da je pomenuti subjekat podvrgnut fizičkom pregledu od strane medicinskog ili veterinarskog lekara, koji je dao privremenu ili konačnu dijagnozu koja bi ukazala na to da je upotreba navedenog lečenja korisna za zdravlje navedenog humanog ili drugog životinjskog subjekta. Tajming (odabiranje najboljeg vremena) i svrha navedenog tretmana mogu varirati od jednog pojedinca do drugog, prema mnogim faktorima, kao što je “status quo” zdravlja subjekta. Prema tome, pomenuti tretman može biti profilaktičan, palijativan, simptomatski i/ili kurativni.

[0118] U smislu predmetne objave, profilaktički, palijativni, simptomatski i/ili kurativni tretmani mogu predstavljati odvojene aspekte predmetne objave.

[0119] Antitelo predmetnog pronalaska može biti za parenteralnu administraciju, kao što je intravenski, kao štoje intramuskularno, kao što je subkutano. Alternativno, antitelo predmetnog pronalaska može biti za administraciju putem ne-parenteralnog puta, kao što je peroralno ili topikalno. Antitelo predmetnog pronalaska može biti za administraciju profilaktički. Antitelo predmetnog pronalaska može biti za administraciju terapijski (na zahtev).

TEHNIČKA REŠENJA PREDMETNE OBJAVE KOJA SLUŽE KAO PRIMER [0120]

1. Metoda za identifikaciju funkcionalnog TREM-1 antitela, koja sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije kada je pomenuta prva ćelija inkubirana sa agensom koji modifikuje TREM-1; (c) stupanje u kontakt kulture iz (b) sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje aktivnosti prve ćelije je manje od ili više od aktivnosti izmerene pod (b).

2. Metoda za identifikaciju blokirajućeg TREM-1 antitela, koja sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije kada je pomenuta ćelija inkubirana sa aktiviranim neutrofilom; (c) stupanje u kontakt kulture prve ćelije i aktivranog neutrofila sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje da je aktivnost prve ćelije manja nego aktivnost izmerena u (b).

3. Metoda iz bilo kog tehničkog rešenja 1-2, gde modifikujući agens iz (b) je aktivirani neutrofil ili TREM-1 ligand.

4. Metoda za identifikaciju stimulirajućeg TREM-1 antitela, koja sadrži (a) kultivaciju prve ćelije koja eksprimira TREM-1, signalizirajući protein i reporterski konstrukt; (b) merenje aktivnosti prve ćelije; (c) kontaktiranje/inkubiranje pomenute ćelije sa TREM-1 antitelom; i (d) da je aktivnost prve ćelije veća nego aktivnost izmerena u (b).

5. Metoda bilo kog od tehničkih rešenja 1-4, gde je prva ćelija hematopoetskog porekla.

6. Metoda u skladu sa tehničkim rešenjem 5, gde ćelija hematopoetskog porekla je mijeloidna ćelija.

7. Metoda u skladu sa tehničkim rešenjem 5, gde ćelija hematopoetskog porekla je T-ćelija.

8. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 1-7, gde signalizirajući protein je DAP10.

9. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 1-7, gde signalizirajući protein je DAP12.

10. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 1-7, gde signalizirajući protein je TCR zeta.

11. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 1-7, gde signalizirajući protein je Fc gama RIII.

12. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 1-7, gde signalizirajući protein je Fc receptor.

13. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 1-6, gde reporterski konstrukt sadrži transkripcioni faktor i reporterski gen.

14. Metoda u skladu sa tehničkim rešenjem 13, gde pomenuti transkripcioni faktor je NFAT.

15. Metoda u skladu sa tehničkim rešenjem 14, gde pomenuti transkripcioni faktor je NFkB.

16. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 13-15, gde pomenuti reporterski gen kodira β-galaktozidazu.

17. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 13-15, gde pomenuti reporterski gen kodira luciferazu.

18. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 13-15, gde pomenuti reporterski gen kodira zeleni fluorescentni protein (GFP).

19. Metoda u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 13-15, gde gde pomenuti reporterski gen je gen koji kodira hloramfenikol transferazu.

20. Metoda za identifikaciju blokirajućeg TREM-1 antitela, koja sadrži (a) kultivaciju T-ćelije koja eksprimira TREM-1, DAP12 i gena koji kodira luciferazu; (b) merenje luminescenije T-ćelije kada je inkubirana sa aktiviranim neutrofilom; (c) kontaktiranje kokulture iz (b) sa TREM-1 antitelom; i (d) merenje luminescencije T-ćelije je manja od aktivnosti izmerene u (b).

21. Metoda u skladu sa tehničkim rešenjem 7, gde pomenuta ćelija je BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ T-ćelijska linija.

22. Antitelo identifikovano pomoću metode bilo kog od tehničkih rešenja 1-3 i 5-21.

TEHNIČKA REŠENJA PREDMETNOG PRONALASKA KOJA SLUŽE KAO PRIMER

[0121]

23. Antitelo ili njegov fragment koje je sposobno za specifično vezivanje za i blokiranje TREM-1, gde antitelo ili njegov fragment je sposobno za blokiranje PGLYRP1-indukovane aktivacije TREM-1, i ima epitop koji sadrži jedan, dva, tri, četiri, per, šest, sedam ili sve od aminokiselinskih ostataka D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 i L45 i jedan, dva ili sve od aminokiselinskih ostataka E46, K47, F48 odSEQ ID NO: 1 (humani TREM-1).

24. Antitelo u skladu sa bilo kojim tehničkim rešenjem 23, gde pomenuto antitelo je sposobno za sprečavanje ili smanjivanje dimerizacije/multimerizacije TREM-1.

25. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-24, gde pomenuto antitelo je sposobno za blokiranje interakcije između TREM-1 i njegovog liganda.

26. Antitelo u skladu sa tehničkim rešenjem 23, gde pomenuto antitelo je takođe sposobno za specifično vezivanje za i blokiranje funkcije TREM-1 iz druge vrste osim čoveka.

27. Antitelo u skladu sa tehničkim rešenjem 26, gde TREM-1 iz druge vrste je TREM-1 cinomolgus majmuna.

28. Antitelo u skladu sa tehničkim rešenjem 26, gde TREM-1 iz druge vrste je TREM-1 rezus majmuna.

29. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-28, koje je sposobno za specifično vezivanje K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13).

30. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-29, koje je sposobno za specifično vezivanje A24T/ Y28F/ N30S/ R32Q/ P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14).

31. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-30, koje je sposobno za specifično vezivanje A24T/ Y28F/ N30S/ R32Q/ E54K-cTREM-1- Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 15).

32. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-31, koje kompetira sa mAb 0170 za vezivanje za humani TREM-1, gde mAb 0170 sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5.

33. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-32, koje kompetira sa mAb 0170 za vezivanje za TREM-1 cinomolgus majmuna, gde mAb 0170 sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5.

34. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-33, koje je sposobno za specifično vezivanje polipeptida koji sadrži aminokiseline D38 do F48 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što je određeno korišćenjem, npr., HX-MS.

35. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-34, koje je sposobno za specifično vezivanje polipeptida koji sadrži aminokiselinske ostatke E38 do L45 TREM-1 cinomolgus majmuna, kao što je određeno korišćenjem, npr., HX-MS.

36. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-35, koje ima epitop koji sadrži barem aminokiselinske ostatke odanrane iz grupe koja se sastoji od D42, E46, D92 i H93 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što je određeno korišćenjem površinske plazmonske rezonance.

37. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-36, koje ima epitop koji sadrži barem aminokiselinske ostatke E46 i/ili D92 od SEQ ID NO: 1 (humani TREM-1), kao što je određeno korišćenjem površinske plazmonske rezonance.

38. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-37, gde pomenuto antitelo je sposobno da za specifično vezivanje (i) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od A21, T22, K23, L24, T25, E26, i (ii) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od A49, S50, S51, Q52, K53, A54, W55, Q56, I57, I58, R59, D60, G61, E62, M63, P64, K65, T66, L67, A68, C69, T70, E71, R72, P73, S74, K75, N76, S77, H78, P79, V80, Q81, V82, G83, R84, I85 i (iii) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od C113, V114, I115, Y116, Q117, P118 i P119 humanog TREM-1.

39. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-38, gde pomenuto antitelo je sposobno da za specifično vezivanje (i) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od V39, K40, C41, D42, Y43, T44, L45, E46, K47, F48, A49, S50, S51, Q52, K53, A54, W55, Q56, i (ii) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od T70, E71, R72, P73, S74, K75, N76, S77, H78, P79, V80, Q81, V82, G83, R84, I85 i (iii) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od i C113, V114, I115, Y116, Q117, P118, P119.

40. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-39, teški lanac koji sadrži CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 101 do 110 (DMGIRRQFAY) od SEQ ID NO: 4, gde jedan, dva ili tri pomenuta aminokiselinska ostatka mogu biti supstituisana pomoću drugačije aminokiseline.

41. Antitelo u skladu sa sa bilo kojim od tehničkog rešenja 40, koji dalje sadrži CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (TYAMH) od SEQ ID NO: 4, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan pomoću različitog aminokiselinskog ostatka; i/ili CDRH2 sekvencu u skladu sa aminokiselinama 50 do 68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG) od SEQ ID NO: 4, gde jedna, dve ili tri od pomenutih aminokiselina mogu biti supstituisane pomoću različitog aminokiselinskog ostatka.

42. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 40-41, laki lanac koji: CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 38 (RASESVDTFDYSFLH) od SEQ ID NO: 5, gde jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka mogu biti zamenjeni sa drugačijom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 54 do 60 (RASNLES) od SEQ ID NO: 5, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka mogu biti supstituisani sa različitom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 93 do 101 (QQSNEDPYT) od SEQ ID NO: 5, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka mogu bti suptituisani sa različitom aminokiselinom.

43. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 40-42, koje sadrži SEQ ID NO: 4 i/ili SEQ ID NO: 5.

44. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-43, koje vezuje humani TREM-1 sa afinitetom vezivanja (KD) koji je 1 x 10<-7>M ili manje, 1 x 10<-8>M ili manje, ili 1 x 10<-9>M ili manje, ili 1 x 10<-10>M ili manje, 1 x 10<-11>M ili manje, 1 x 10<-12>M ili manje ili 1 x 10<-13>M ili manje, kao što je određeno korišćenjem površinske plazmonske rezonance.

45. Antitelo u skladu sa tehničkim rešenjem 44, gde pomenuti afinitet vezivanja (KD) je 1 x 10<-10>M ili manje.

46. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-45, koje vezuje TREM-1cinomolgus majmuna sa afinitetom vezivanja (KD) koji je 1 x 10<-7>M ili manje, 1 x 10<-8>M ili manje, ili 1 x 10<-9>M ili manje, ili 1 x 10<-10>M ili manje, 1 x 10<-11>M ili manje, 1 x 10<-12>M ili manje ili 1 x 10<-13>M ili manje, kao što je određeno korišćenjem površinske plazmonske rezonance.

47. Antitelo u skladu sa tehničkim rešenjem 46, gde pomenuti afinitet vezivanja je 1 x 10<-9>M ili manje.

48. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-47, koje je IgG.

49. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-48 za primenu kao medikament.

50. Antitelo u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 23-48 za primenu u lečenju autoimune bolesti i/ili hronične inflamacije.

51. Antitelo za primenu u skladu sa tehničkim rešenjem 50, gde pomenuta autoimuna bolest je reumatoidni artritis.

52. Antitelo za primenu u skladu sa tehničkim rešenjem 50, gde pomenuta autoimuna bolest je Kronova bolest.

53. Antitelo za primenu u skladu sa tehničkim rešenjem 50, gde pomenuta autoimuna bolest je ulcerozni kolitis.

54. Antitelo for use u skladu sa tehničkim rešenjem 50, gde pomenuta autoimuna bolest je psorijatični artritis.

[0122] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima koje ne bi trebalo tumačiti kao dodatno ograničavajuće.

PRIMERI

Primer 1: Generisanje BWZ.36 humaniTREM-1:DAP12 stabilne ćelijske linije [0123] BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ ćelijska linija (ovde takođe nazvana kao "BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija") je izvedena iz BW5147 T ćelija (ćelijska linija limfoma timusa Mus musculus, ATCC TIB-47, LGC Standards, Middelsex, UK) i sadrži LacZ reporterski konstrukt regulisan pomoću četiri kopije NFAT promoterskog elementa (videti Karttunen, J. & Shastri, N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3972-3976 i Fiering, S., Northrop, J. P., Nolan, G. P., Matilla, P., Crabtree, G. R. & Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4, 1823-1834). TREM/DAP12/pMX-IRES vektor (koji kodira 786 bp od TREM-1 iz Smal mesta do BamHI mesta korišćenjem TREM-1 cDNK (Gene Bank Ref. ID: NM_018643.2, Sino Biological Inc., Peking, Kina) kao šablon i oligo 5' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SEQ ID NO: 16) i 5' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC (SEQ ID NO: 17) kao prajmere klonirane u pIREShyg vektor GenBank Pristupni br. U89672 (Kat. br. 6061-1, Clontech Laboratories, CA, SAD) je transfektovan u PLAT-E “pakujućoj” ćelijskoj liniji (obezbeđeno od strane W. Yokoyama, Washington University; alternativno, Kat. br. RV-101, Cell Biolabs Inc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finska) korišćenjem Superfect reagensa za transfekciju (Kat. br. 301305, Qiagen Nordic, Danska). PLAT-E supernatanti koji sadrže TREM/DAP12/pMX-IRES viralne čestice su korišćene za inficiranje BWZ.36 ćelija kao što sledi: 2x10<5>BWZ.36 ćelije su gajene u pločama sa 6 bunarića i medijum je zamenjen sa 1,5 ml supernatanta koji sadrži viralne čestice 8 mg/ml polibrena. Nakon 6-8 sati, 1,5 ml normalnog medijuma je dodato u ploču i ćelije su inkubirane tokom dodatnih 24 sata. BWZ.36 ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju TREM-1 su bojene sa anti TREM-1 monoklonskim antitelom (klon 21C7) i izolovane ćelijskim sortiranjem.

Primer 2: Kultivacija BWZ.36 humaniTREM-1:DAP12 stabilne ćelijske linije [0124] BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije su gajene u RPMI 1640 bez fenol crvenog (kat. br.

11835, Gibco, Carlsbad CA, SAD), obogaćenog sa 10% FCS (Kat. br. 16140-071, Gibco, Njujork, SAD), 1% Pen/Strep (Kat. br. 15070-06, Gibco), 1 mM natrijum piruvata (Kat. br.11360, Gibco), 5 µM -2ME (Kat. br. 31350-010, Gibco) i 2 mM L-Glutamina (Kat. br.

25030, Gibco). Nisu potrebne posebne ploče ili obloge. 10 ml Versena (Kat. br. 15040, Gibco) je dodato da se odvoje ćelije koje će zatim biti prebačene u epruvete, centrifugirane 1200 rpm 5 min i isprane u svežem RPMI 1640 bez fenol crvenog. Ove ćelije su zatim spremne da se koriste u testu ili ponovo gaje radi dalje propagacije.

Primer 3: Imunizacija miševa i identifikacija mAbs

[0125] U cilju da se generišukoaj vezuju humani TREM-1, i miševi sa Balb/C divljeg tipa i TREM-1 nokaut (“knock-out” - KO) miševi (C57BL/6 pozadina) su imunizovani sa ili humanim (h) TREM-1 (SEQ ID NO:1), ćelijama koje eksprimiraju hTREM-1 (BWZ.36 ćelije), ili kombinacijom oba. Primarni skrining je izveden ili pomoću direktne ELISA na hTREM-1 proteinu ili pomoću FMAT, korišćenjem BWZ.36 ćelija koje eksprimiraju hTREM-1. Sekundarni skrining je izveden protočnom citometrijom na HEK293 ćelijama koje eksprimiraju hTREM-1. Pozitivni hibridomski supernatanti su zatim ispitani u BWZ/hTREM-1 reporterskom eseju opisanom u Primeru 4.

[0126] Najveći broj blokirajućih antitela je dobijen od KO miševa imunizovanih sa hTREM-1 proteinom šest puta u intervalima od dve nedelje, nakon čega je usledila injekcija pojačivača. Ukupno, više od 200 hTREM-1 antitela je izolovano, od čega je nađeno nakon toga da otprilike 70 ima blokirajući efekat.

[0127] Svi TREM-1 specifični hibridomski supernatanti su testirani u BWZ/hTREM-1 reporterskom eseju prvokao supernatanti i kasnije kao prečišćena antitela, u kompletnoj titraciji od 5000 ng/ml do 7 ng/ml, oba kao solubilna i kao antitela vezana za ploču. Krv iz opsega različitih donora je korišćena kao izvor svežih neutrofila. Kao primer, slika 4 prikazuje antitela iz jedne fuzije gde aktivnost u reporterskom eseju kao blokirajuća aktivnost je na x-osi i agonistička aktivnost kada je antitelo vezano za ploču je na y-osi.

Primer 4: Identifikacija PGLYRP1 kao neutrofil-eksprimiranog TREM-1 liganda

[0128] PGLYRP1 je identifikovan kao TREM-1 ligand kroz primenu imunoprecipitacije kuplovane sa masenom spektroskopijom (IP-MS). Solubilni TREM-1 tetramer je korišćen kao afinitetni “mamac” molekul da se identifikuje ligand. Ukratko, TREM-1-tetramer-Fc (SEQ ID NO: 2) i odvojeno CD83-Fc (SEQ ID NO: 5) su svaki inkubiran u finalnim koncentracijama od 100 µg/ml sa 270 miliona humanih neutrofila, prečišćenih pomoću dekstranske sedimentacije kao što je opisano iznad, u 1 mL PBS na 4°C, 90 minuta uz blago mešanje. Nakon peletiranja ovih ćelija, ćelije su ponovo suspendovane u 1 mL PBS pufera sa uključivanjem kroslinkera (unakrsnog veznika) 3,3'-Ditiobis[sulfosuksinimidilpropionat] (DTSSP) (Thermo Scientific: 21578, Rokford, IL, SAD), u koncentraciji od 2 mM i inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane 3X sa 1 mL PBS praćeno lizom u 1 mL RIPA pufera (Thermo Scientific, 89901, Rokford, IL, SAD). Lizat je centrifugiran na 15,000 X g tokom 10 minuta na 4°C da se uklone nerastvorljivi materijali. Neutrofilni proteini unakrsno povezani sa Fc kuplovanim probama su imunoprecipitirani iz supernatanta korišćenjem Protein A Mag Sepharose™ perlica (GE Healthcare Life Sciences, 28-9670-56, Piscataway, NJ, SAD). Ukratko, 50 µL perlica je prvo isprano sa 200 µL PBS, zatim ponovo suspendovano u 1 mL ćelijskog lizata, inkubirano 60 minuta na 4°C, magnetički uhvaćeno, i zatim isprano 2X sa 200 µl RIPA puferom zatim 3X sa 200 µL PBS. Nakon uklanjanja PBS iz finalnog magnetičkog hvatanja, proteini su eluirani iz magnetičkih perlica korišćenjem 200 µL pufera koji sadrži 8 M Uree, 100 mM Tris (pH 8.0), i 15 mM TCEP (Thermo Scientific, 77720, Rokford, IL, SAD) i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, perlice su uhvaćene i supernatant je prebačen u Microcon Ultracel YM-30 filter (Millipore, 42410, Billerica, MA, SAD). Uzorci su se vrteli na 14, 000 x g, 20°C, 30-60 minuta dok nije uklonjena tečnost sa vrha filter membrane. Zadržani proteini su onda alkilovani sa 100 µL 50mM IAA (jodoacetamid) u 8 M Uree tokom 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Filter je ispran 2X sa 100 µL 50mM NH4HCO3i zatim prebačen u novu epruvetu za sakupljanje. 1 µg tripsina (Promega, V5111, Madison, WI) u 60 µL 50 mM NH4HCO3je dodato praćeno sa inkubacijom na 37°C preko noći. Triptični digest je sakupljen centifugiranjem na 14,000 xg tokom 30 minuta praćeno ispiranjem filtera sa 50 µL 50 mM NH4HCO3. 10 µL digesta je analizirano pomoću LC/MS/MS korišćenjem LTQ-Orbitrap-XL masenog spektrometra (Thermo Scientific, Waltham, MA, SAD). Podaci su pretraženi nasuprot IPI humane baze podataka (v3.81) korišćenjem SEQUEST-Sorcerer mašine (4.0.4 verzija) (SageN, Milpitas, CA, SAD) i zatim posle obrađeni sa Scaffold 3 (Proteome Softver, Portland, OR, SAD) da se filtriraju proteiniki IDs sa lažnom brzinom otkrivanja od 1%.

Nakon oduzimanja negativne kontrole, nađeno je da je PGLYRP1 protein sa velikim poverenjem specifično povezan sa hTREM-1 tetramerom. Imunoprecipitacija u neutrofilima pokazala je da od 148 identifikovanih proteina, 72 proteina su imunoprecipitirana pomoću kontrolnog konstrukta (CD83) samog, 73 od proteina su bili identični za TREM-1 i CD83, dok su samo tri bili TREM-1 specifični (Sl. 3). Eksperiment je zatim ponovljen korišćenjem neutrofila od različitog donora i PGLYRP1 je zatim ponovo identifikovan da specifično interaguje sa hTREM-1.

Primer 5: Ponovno savijanje i prečišćavanje huamanog PGLYRP1 eksprimiranog iz E. coli

[0129] Humani PGLYRP1 je eksprimiran kao inkluziona tela u Escherichia coli BL21 (DE3) ćelijama. Bakterije su sakupljene centrifugiranjem, ponovo suspendovane u 50mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 i narušene sonifikacijom. Nerastvorni talog je ispran tri puta sa 50 mM Tris, pH 8.0, 1% TritonX-100, 2 M uree i jednom sa 50 mM Tris pH 8.0, zatim solubilizovan u 50 mM Tris-HCl, 6M guanidin hidrohlorida, pH7.4, 1 mM DTT (finalna koncentracija proteina 20mg/ml). Za savijanje in vitro, solubilizovana humana PGLYRP1 inkluziona tela su razblažena u 50 mM Tris, pH 8.0, 2mM EDTA, 5 mM cisteamina, 0.5 mM cistamina, 0.4 M arginina (finalna koncentracija proteina 1mg/ml). Nakon držanja preko noći na 4°C, smeša u kojoj se odigrava savijanje je očišćena centrifugiranjem/filtracijom i zatim razblažena 12 puta u 10mM MES pH 3.5 da se smanje provodljivost i pH (finalni pH -5.8, provodljivost ∼6mS/cm). Razbažena smeša u kojoj se odigrava savijanje je zatim primenjena na Hitrap SP HP koloni od 5 ml (17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Švedska), praćeno sa 5 kolonskih zapreminskih ispiranja sa 50 mM MES pH 5.8. Vezani humani PGLYRP1 je zatim eluiran sa 0∼60% linearnom gradijenta od 50 mM MES pH 5.8, 1 M NaCl u 20 kolonskih zapremina. Frakcije koje sadrže ponovo savijeni humani PGLYRP1 su pulovane i koncentrovane do manje od 4ml pomoću Amicon ultra 15 centrifugalnih jedinica ((UFC800324 3,000 kDa MWCO, Millipore, Hellerup, Danska). Hiload 26/60 Superdex 75 318ml kolona ((17-1070-01 GE Healthcare, Uppsala, Švedska) je zatim korišćena za doterivanje i izmenu pufera proteina do fosfatnog slanog pufera (PBS). Većina ponovo savijenih humanih PGLYRP1 proteina je u obliku monomera. Nakon koncentrovanja, finalna koncentracija proteina kao što je bila kao kao što je određeno merenjem apsorbance na 280 nm sa NANODROP UV spektrometrom. Čistoća proteina je procenjena elektroforezom u poliakrilamidnom gelu sa natrijum dodecil sulfatom (SDS-PAGE).

Primer 6: Stvaranje TREM-1 reaktivnog reporterskog testa

[0130] TREM-1 reporterska ćelijska linija je generisana transfektovanjem BWZ.36 ćelijske linije sa NFAT-LacZ reporterskim konstruktom, kao i hTREM-1 i DAP12 (kao što je opisano u Primeru 1). Neutrofili zdravih donora su prečišćeni pomoću dekstranske sedimentacije. Krv je stratifikovana na nFicollPaque (17-0840-03, GE Healthcare, Piscataway, NJ, SAD) gradijentu sa stopom od 3 dela Ficolla-a i 4 dela krvi u epruveti od 50ml, zatim centrifugirana na 400xg tokom 30 minuta na 22 °C, bez pauze. Srednja PBMC traka je nežno uklonjena aspiriranjem. Neutrofili stratifikovani na nabijenim RBC su aspirirani i prebačeni u polipropilensku epruvetu od 50ml. Neutrofili i kontaminirajuće RBC su razblažene do 40 ml sa 1x PBS i praćeno dodavanjem 10 ml 4% DEKSTRANA 500 (Sigma, 31392, St Louis, MO, SAD) u ratstvoru PBS. Nakon mešanja nežnom inverzijom, epruvete su ostavljene na 22 °C tokom 20-30 min. Supernatant bogat granulocitima je zatim prebačen u čistu epruvetu i centrifugiran na 250 x g, 5 min, 22 °C; supernatant je aspiriran i odbačen. Kontaminirajuće RBCs su uklonjene osmotskom lizom, ukratko, ćelijski talog je ponovo suspendovan u 7.5 ml 0.2 % NaCl; nežno mešan tokom 55-60 sekundi i 17.5 ml 1.2 % NaCl rastvora je dodato. Zapremina je zatim dovedena do 50 ml sa PBS i zavrtena na 250 x g tokom 5 min, talog je ponovo suspendovan u 7.5 ml 0.2 % NaCl da se ponovi liza drugi put. Finalni talog granulocita je ponovo suspendovan u RPMI/10% FBS. Ovi neutrofili su stimulisani sa PGN (InVivogen, tlrl-pgnsa, SanDiego, CA, SAD) preko noći da se generišu aktivirani neutrofili sposobni da stimulišu TREM-1. BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije su zatim dodate u PGN aktivirane neutrofilne kulture u odnosu 1:3 reporterska ćelija u odnosu na neutrofile. Umesto aktiviranih neutrofila, TREM-1 ligand compleks koji se sastoji od PGLYRP1 (SEQ ID NO: 23) i PGN mogao bi biti korišćen za stimulaciju TREM-1. Test je izveden u crnim pločama obloženim Poli-D-Lizinom za ćelijske kulture (br.356640 od BD Biosciences, San Jose, CA, SAD). TREM-1 aktivacija je pročitana nakon 24 sata kulture korišćenjem BetaGlo reagensa (E4720 od Promega, Madison, WI, SAD) i luminescencija je izmerena korišćenjem TopCount Luminescence brojača od Perkin Elmer. Kao pozitivna kontrola TREM-1 bi mogao biti aktiviran pomoću TREM-1 antitela vezanog za ploču (R&D MAB1278, Minneapolis, MN, SAD) sposobnog da agonizuje TREM-1. Ploče su obložene sa izotipskom kontrolom ili TREM-1 antitelom MAB1278 (3 ug/ml u PBS, 100 ul/bunariću) u frižideru O/N ili tokom 2 h na 37°C, 5 % CO2 pre nego što si dodate BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije. Nakon inkubacije 6-24h TREM-1 aktivacija bi mogla biti očitana korišćenjem BetaGlo reagensa (E4720 od Promega, Madison, WI, SAD) i luminescencija je izmerena korišćenjem TopCount Luminescence brojača od Perkin Elmer. Ova BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ ćelijska linija ("BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija") pokazala se kao visoko reaktivna na unakrsno povezivanje posredovano antitelom od TREM-1, dajući ∼ 40-struku indukciju NFAT-vođene LacZ proizvodnje kada je stimulisana sa 1-10 µg/ml komercijalno dostupnog anti-TREM-1 antitela vezanog za ploču, u poređenju sa izotipskom kontrolom (Slika 1). Kada je stimulisana na koktelom toličnog (“toll-like”) receptora (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich Danska) samim (BWZ+TLR) nije opažen porast u signalu. Pored toga, neaktivirani neutrofili ne bi mogli da stimulišu TREM-1, dok TLR agonistički koktel (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich Danska) je aktivirano neutrofila da mogu da stimulišu BWZ/hTREM-1 reportersku ćeliju.

[0131] Tabela 1, ispod, pokazuje da TREM-1 antitela stavljena ovde na uvid javnosti su sposobna da blokiraju ligand-indukovanu TREM-1 aktivaciju u takvom BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom eseju.

Tabela 1

[0132] Nijedno od testiranih komercijalno dostupnih antitela: MAB1278 (kat. br. MAB1278, R&D Systems, Mineapolis, MN 55413, SAD), anti-TREM-1 HPA (kat. br. HPA005563, Sigma, St Louis, MO, SAD), TREM26 (kat. br. 314902, Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD) i TREM37 (kat. br. 316102, Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD) su sposobna da blokiraju TREM-1 signal.

Primer 7: Epitopsko mapiranje korišćenjem HX-MS

Materials

Proteinske serije koje su se koristile:

[0133] hTREM-1: humani rekombinanti TREM-1, ne-glikozilovan, proizveden u E. coli. (kat. br. PRO-457, ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Rehovot, Izrael).

Tabela 2: mAbs korišćena

[0134] Svim proteinima su zamenjeni puferi u PBS pH 7.4 pre eksperimenata.

Metode: HX-MS eksperimenti

Instrumentacija i beleženje podataka

[0135] HX eksperimenti su automatizovani pomoću Leap robota (H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.) kojim upravlja LeapShell softver (Leap Technologies Inc.), koji je sproveo inicijaciju reakcije izmene deuterijuma, kontrolu vremena reakcije, reakciju kvenčovanja, ubrizgavanja u UPLC sistem i kontrolu vremena digestije. Leap robot je opremljen sa dve temperaturno kontrolisane kutije održavane na 20 °C za skladištenje pufera i HX reakcije i održavana na 2 °C za čuvanje proteina i rastvora za kvenčovanje, redom. Leap robot pored toga je sadržao ohlađenu Trio VS jedinicu (Leap Technologies Inc.) držeči pre- i analitičke kolone kao i pepsinsku kolonu, LC Tubiranje i ventile za prebacivanje na 1 °C. Ventili za prebacivanje Trio VS jedinice su nadograđeni od HPLC do Microbore UHPLC ventila za prebacivanje (Cheminert, VICI AG). Za linijsku pepsinsku digestiju, 100 µL kvenčovanog uzorka koji sadrži 200 pmol hTREM-1 je naliveno i propušteno kroz Poroszyme® imobilisani pepsinski kertridž (2.1 × 30 mm (Applied Biosystems)) korišćenjem izokratske brzine protoka od 200 µL/min (0.1% mravlja kiselina:CH3CN 95:5). Dobijeni peptidi su zarobljeni i odstranjena im je so na VanGuard pre-koloni BEH C181.7 µm (2.1 × 5 mm (Waters Inc.)). Zatim, ventili su prebačeni na mesto gde je prekolona u liniji sa analitičkom kolonom, UPLC-BEH C18 1.7 µm (2.1 × 100 mm (Waters Inc.)), i peptidi su razdvojeni korišćenjem 9 min gradijenta od 15-35% B isporučenog pri 200 µl/min iz AQUITY UPLC sistema (Waters Inc.). Mobilne faze su se sastojale od A: 0.1% mravlja kiselina i B: 0.1% mravlja kiselina u CH3CN. ESI MS podaci, i MS/MS akvizicije zavisne od odvojenih podataka (CID) i eksperimenti pri povišenim energijama (MS<E>) su stečeni u pozitivnom jonskom režimu korišćenjem Q-TOF Premier MS (Waters Inc.). Leucin-enkefalin je korišćen kao zaključana masa (lock mass) ([M+H]<+>jon pri m/z 556.2771) i podaci su sakupljeni u kontinuum režimu (Za dalji opis postavke, videti Andersen i Faber, Int. J. Mass Spec., 302, 139-148(2011)).

Analiza podataka

[0136] Peptični peptidi su identifikovani u odvojenim eksperimentima korišćenjem standardnih CID MS/MS ili MS<E>metoda (Waters Inc.). MS<E>podaci su obrađeni korišćenjem BiopharmaLynx 1.2 (version 017). MS/MS akvizicija zavisna od CID podataka je analizirana korišćenjem MassLynx softvera i interne MASCOT baze podataka.

[0137] HX-MS neobrađene datoteke sa podacima su bile podvrgnute stalnoj korekciji za zaključanu masu. Analiza podataka, tj. centroidno određivanje deutersanih peptida i crtanje kriva zamene, obavljena je korišćenjem prototipnog prilagođenog softvera (HDX browser, Waters Inc.) i HX-Express ((Verzija Beta)), Weis et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom.17, 1700 (2006)). Svi podaci su takođe vizuelno evaluirani da bi se osiguralo da su samo rešeni peptidni izotopski omotači bili podvrgnuti analizi.

Eksperiment epitopskog mapiranja

[0138] Razmena Amidni vodonik/deuterijum (HX) je inicirana pomoću 6-8 strukog razblaživanja hTREM-1 u prisustvu ili odustsvu mAb u odgovarajućem deuterisanom puferu (tj. PBS pripremljenom u D2O, 96% D2O finalno, pH 7.4 (nekorigovana vrednost)). Sve HX reakcije su izvedene na 20°C i sadržale 4 µM hTREM-1 u odsustvu ili prisustvu 4 µM mAb prema tome dajući 2 struki molarni višak mAb vezujućih mesta. U odgovarajućim vremenskim intervalima koji su u opsegu od 10 sek do 10000 sek, alikvoti od 50 µl HX reakcije su kvenčovani pomoću 50 µl ledeno-hladnog kvenčujućeg pufera (1.35M TCEP) rezultujući u finalnom pH od 2.5 (nekorigovana vrednost).

Rezultati i Diskusija

[0139] Ovaj eksperiment mapira epitope od mAbs 0023, 0024, 0025, 0026 i komercijalno dostupnih mAbs MAB1278 (RnD Systems) i Klon26 (Biolegend) na hTREM-1. HX tok vremena od 43 peptida, koji pokriva 94% primarne sekvence hTREM-1, su praćeni u odsustvu ili prisustvu osam različitih mAbs za 10 do 10000 sek.

[0140] Razmena zaštite primećena u ranim vremenskim tačkama, npr. <300 sek, odnosi se na površinske izložene amidne protone i prema tome i na proteinske interfejse. Nasuprot tome, efekti koji se posmatraju kasnije u vremenskom toku su vezani za sporu razmenu amidnih vodonika i prema tome vezani za strukturno jezgro proteina. Zbog toga, efekti epitopa se pojavljuju u ranim vremenskim tačkama, dok se efekti strukturalne stabilizacije manifestuju kao smanjenje razmene u kasnim vremenskim tačkama (Garcia, Pantazatos i Villareal, Assay and Drug Dev. Tech. 2, 81 (2004); Mandell, Falick i Komives, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14705 (1998)).

[0141] Opaženi obrazac razmene u ranim vremenskim tačkama u prisustvu ili odsustvu datog mAb može se podeliti u dve različite grupe: Jedna grupa peptida prikazuje obrazac razmene koji nije pod uticajem vezivanja mAb. Nasuprot tome, druga grupa peptida u hTREM-1 pokazuje zaštitu od razmene nakon vezivanja mAb. Za prajmer na 100 sekundi razmena sa D2O približno od 2 amida zaštićena je od razmene u regionu I111-F126 od mAb 0023. Regioni koji prikazuju takve zaštitne efekte dodeljuju se regionu epitopa.

Epitopsko mapiranje mAbs 0023 i 0026

[0142] mAbs 0023 i 0026 oba indukuju identične izmene u profilu razmene TREM-1 i biće opisane ovde zajedno. Regioni koji pokazuju zaštitu na 0023/0026 vezivanje obuhvtaju peptide koji pokrivaju ostatke T22-L96 i Y111-D127. Međutim, poređenjem relativnih količina zaštite razmene sa svakim peptidom po vezivanju mAb 0023/0026 i nedostatka epitopskog efekta u peptidima T25-F48, R84-Q112 i peptidima počevši na P118, epitop može biti sužen na ostatke A21-E26, A49-I85 i C113-P119. Iako su udaljeni u sekvenci, ovi regioni su bliski u 3D strukturi hTREM-1.

Epitopsko mapiranje mAb 0024 i Biolegend klona 26

[0143] mAb 0024 i klon26 od Biolegend oba indukuju identične promene u profilu razmene hTREM-1 i biće opisani zajedno ovde. Regioni koji pokazuju zaštitu nakon vezivanja mAb 0024 obuhvataju peptide koji pokrivaju ostatke V101-Q112. Upoređujući relativne količine zaštitne razmene unutar svakog peptida po vezivanju mAb 0024 i nedostatka epitopskih efekata u okolnim peptidima, epitop se može suziti do ostataka Q104-Q112 (Sl.7B).

Epitopsko mapiranje NNC mAb 0025

[0144] Regioni koji pokazuju zaštitu po 0025 vezivanju obuhvataju peptide koji pokrivaju ostatke D38-M63, T70-L96 i Y111-D127 (Sl. 7C). Međutim, poređenjem relativnih količina zaštite razmene u sklopu svakog peptida po vezivanju 0254-0025 i nedostatka epitopskih efekata u okolnim peptidima, epitop se može suziti do ostataka V39-Q56, T70-I85 i C113-P119. Iako su udaljeni u sekvenci, ovi regioni su bliski u 3D strukturi hTREM-1 (Sl.8).

Epitopsko mapiranje MAB1278

[0145] Regioni koji pokazuju zaštitu po MAB1278 vezivanju obuhvataju peptide koji pokrivaju ostatke T70-L96 i V101-Q112 (Slike 7D). Međutim, poređenjem relativnih količina zaštite razmene u sklopu svakog peptida po vezivanju MAB1278 i nedostatka epitopskih efekata u okolnim peptidima, epitop se može suziti do ostataka T70-185 i Q104-Q112. Iako su udaljeni u sekvenci, ovi regioni su bliski u 3D strukturi hTREM-1.

[0146] Strkturalna pozicija epitopa mAbs 0023/0026 i mAb 0025 su prikazane na Slici 7A. Epitop mAbs 0023 i 0026 čini se da pretežno živi u β-listovima u dimerskom interfejsu kristalne strukture hTREM-1 dimera. Antagonizam ovih mAbs može biti rezultat sprečavanja dimerizacije hTREM-1 i prema tome signalizacije.

Primer 8: Određivanje površine interakcije između TREM-1 i mAb 0170

[0147] Epitopi su mapirani i na rekombinanntom humanom i na TREM-1 cinomolgus majmuna (hTREM-1 i cTREM-1, redom). hTREM-1 konstrukt korišćen u primeru sadrži ostatke M1-H140 (SEQ ID NO: 18) i cTREM-1 konstrukt sadrži ostaci M1-R180 od (SEQ ID NO: 12) sa šest histidinskih ostataka dodatih na C-terminus i korišćenjem numerisanja aminokiselina od hTREM-1 divljeg tipa. Kroz ovaj primer aminokiseline cTREM-1 su numerisane u skladu sa analognim ostatkom u hTREM-1, kao što je ilustrovano u Sl. 11. Numerisanje korišćeno u ovom primeru može biti konvertovano u numerisanje u SEQ ID NO: 12 oduzimanjem 19 ako je broj ostataka 58 ili manje i oduzimanjem 20 ako je broj ostataka 60 ili veći. Kao primer, broj ostatka E46 na cTREM-1 u ovom primeru odgovara ostatku (46 - 19 = 27) E27 u SEQ ID NO: 12. Broj ostatka na L96 na cTREM-1 u ovom primeru odgovara ostatku (96 - 20 = 76) L76 u SEQ ID NO: 12.

[0148] Rastvori od TREM-1, samo ili u prisustvu mAb 0170, su razblaženi 25-puta u 97% deuterisanom hepes puferu (20 mM hepes, 150 mM natrijum hlorid, pH 7.4). Ne-deuterisane kontrole su pripremljene razblaživanjem u hepes puferu koji sadrži protijum. Eksperimenti razmene vodonika su izvedeni na waters HDX nanoAcquity sistemu za tečnu hromatografiju ultra visokih performansi (UPLC) system (Waters Corporation, Milford, MA, SAD) koji je obuhvatao HD-x PAL auto probit za uzimanje uzoraka (LEAP Technologies Inc., Carrboro, NC, SAD) za automatsku pripremu uzoraka. LC tubiranje, pre- i analitičke kolone i ventili za prebacivanje su bili postavljeni u komori ohlađenoj do 0.3°C. Kolona za tripsinsku digestiju je čuvana na 15°C. Reakcije razmene vodonika su izvedene na 20°C. Masene analize su izvedene onlajn korišćenjem Waters SYNAPT G2 HDMS masenog spektrometra.

[0149] Zapremina koja sadrži 100 pmol humanog ili cinomolgus TREM-1 (1.54-1.98 µl) sa ili bez 120 pmol mAb 0170 je razblažena u deuterisanom hepes puferu do finalne zapremine od 50 µl. U odgovarajućim vremenskim intervalima celokupna zapremina je prebačena do i kvenčovana u 50 µl 1.35 mM Tris(2-karboksietil)fosfina podešenog do pH 2.4 i držana na 3°C. 99 µl kvenčovanog rastvora je odmah ubrizgano i pušteno preko Porozyme imobilisane pepsinske kolone (2.1 mm x 30 mm) (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, SAD) i uhvaćeno na Waters VanGuard BEH C181.7 µm (2.1 mm × 5 mm) koloni pri brzini protoka od 100 µl/min korišćenjem mobilne faze 5 % (vol/vol) metanola i 0.1 % mravlje kiseline. Peptidi su razdvojeni na Waters UPLC BEH C18 1.7 µm (1.0 mm x 100 mm) koloni korišćenjem gradijenta 10 - 40 % acetonitrila koji sadrži 0.1 % mravlje kiseline pri brzini protoka od 40 µl/min.

[0150] Maseni spektrometar je radio u pozitivnom jonskom režimu sa omogućenom separacijom jonske mobilnosti. Uslovi elektrospreja bili su 3.2 kV kapilara, 25 V konus uzorka, i 4 V ekstrakcioni konusni ogranak, 850 ml/min protok azotnog desolvacionog gasa koji je zagrejan do 350 °C i protok konusnog gasa od 50 ml/min. Izvorni blok je zagrejan na 120 °C. Podaci za korekciju zaključane mase su dobijeni korišćenjem 1+ jona Leucinenkefalin (m/z 556.2771) kao referentnog jedinjenja i primenjeni tokom analize podataka. Za identifikaciju peptida eksperimenti MS<E>tipa koji koriste ogranke kolizije po principu zamke zamke od 6 V (niska energija) i 50 V (povišena energija) su izvedeni. Deuterisani uzorci su analizirani korišćenjem samo ogranka kolizije po principu zamke niske energije od 6V. Za dalje detalje pogledajte Andersen, M.D., Faber, J.H., Int. J. Mass Spectrom. (2011), 302, 139-148.

[0151] MS<E>-podaci su analizirani korišćenjem Waters ProteinLynx Global Servera 2.5 i peptidi od hTREM-1 su identifikovani koji su pokrili 80 % proteinske sekvence (Tabela 3) i peptidi od cTREM-1 su identifikovani koji su pokrili 100 % proteinske sekvence (Tabela 4). HX-MS datoteke podataka su analizirane korišćenjem Waters DynamX 1.0 koji automatski primenjuje korekciju za zaključanu masu i određuje stepen inkorporacije deuterijuma u svaki peptid. Dodatno, svi podaci su ručno pregledani kako bi se obezbedio ispravni maksimalni prenos i izračunavanje inkorporiranja deuterijuma.

Rezultati

[0152] Spisak peptida i njihovi obrasci razmene su obezbeđeni u Tabeli 3.

[0153] Kada je mAb 0170 vezao hTREM-1, zaštita od razmene je primećena kod peptida koji pokrivaju sekvencu od A21 do L96, a epitop je prema tome utvrđen da je unutar ovog regiona. Kada se uzmu u obzir peptidi koji ne pokazuju nikakvu zaštitu od razmene nakon vezivanja mAb 0170, epitop se može smanjiti na regione D38-F48. Region od R84-L96 je pokazivao od malo do nikakve razmene u prisustvu ili odsustvu mAb 0170 vezivanja i nije bilo moguće zaključiti da li je ovaj region bio deo mAb 0170 vezujućeg epitopa. Peptid K47-A68 nije pokazao zaštitu od razmene nakon vezivanja mAb 0170, ali je peptid T44-C69 zaštićen kada je vezan mAb 0170. Prva dva ostataka peptida povratno razmenjuju brzo i informacija o razmeni za ove ostatke je izgubljena. Zaključeno je da je najmanje jedan od ostataka E46, K47 i F48 su važni za vezivanje mAb 0170.

Tabela 3: Rezultati iz HXMS epitopskog mapiranja mAb 0170 na humani TREM-1

mAb 0170 epitop na cTREM-1

[0154] Spisak peptida i njihovi obrasci razmene su dati u Tabeli 4.

[0155] Kada se mAb 0170 vezuje za cTREM-1, opažena je zaštita od razmene kod peptida koji pokrivaju sekvencu od E38 do A68 i posledično se određuje da je epitop unutar ovog regiona. Kada se uzmu u obzir peptidi koji ne pokazuju zaštitu od razmene nakon vezivanja mAb 0170, epitop se može suziti na regione E38-L45. Ovaj epitop dobro je odgovarao mAb 0170 epitopu na hTREM-1, ali je bio skraćen za tri ostatka. Peptid C44-T69 u hTREM-1 je zaštićen nakon vezivanja mAb 0170, ali peptidi A44-L67 i A44-A68 koji pokrivaju odgovarajuću sekvencu u cTREM-1 nisu zaštićeni. Prema tome, dok je najmanje jedan od ostataka E46, K47 i F48 u hTREM-1 doprineo vezujućem epitopu, odgovarajući ostaci E46, K47 i I48 nisu bili uključeni u vezivanje mAb 0170 na cTREM-1.

Tabela 4: HXMS epitopsko mapiranje mAb 0170 na cinomolgus TREM-1

Primer 9: Studija kinetike interakcije za anti TREM-1 antitela za humani i cinomolgus TREM-1 pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR)

[0156] Studije vezivanja su izvedene na analizatoru ProteOn Analyzer (BioRad) koji meri molekularne interakcije u stvarnom vremenu putem površinske plazmonske rezonance. Eksperimenti su izvedeni na 25°C i uzorci su čuvani na 15 °C u odeljku za uzorke. Signal (RU, response units – jedinice odgovora) prijavljen od strane ProteOn je direktno korelisan sa masom pojedinačnih površina senzorskog čipa u šest paralelnih protočnih ćelija. Antihumano Fc monoklonsko ili anti-murinsko Fc poliklonsko antitelo od Biacore kitova za hvatanje humanog ili mišjeg Fc su imobilisani u horizontalnom pravcu na protočne ćelije GLM senzorskog čipa u skladu sa instrukcijama proizvođača. Nivo finalne imobilizacije uhvaćenog antitela je približno 2600-6000 RU u razlilčitim eksperimentima. Hvatanje prečišćenih monoklonskih mišjih ili rekombinantno eksprimiranih anti-hTREM-1 antitela je sprovedeno razblaživanjem antitela do 5-10 nM u “running” puferu (10 mM Hepes 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4) i ubrizgavanjem u vertikalnom pravcu pri 30 µl/min tokom 60s, kreirajući referentna međumesta susedna svim protočnim ćelijama sa samo anti-Fc antitelom imobilisanim. Ovo tipično rezultuje u finalnim nivoima hvatanja test antitela od približno 100-300 RU i Rmaks vrednostima analita od 30-90 RU. Vezivanje hTREM-1 ili cTREM-1 proteina je sprovedeno injektiranjem analita (antigena) preko svih protočnih ćelija u horizontalnom pravcu kako bi se omogućile komparativne analize vezivanja za različita uhvaćena anti-TREM-1 antitela u odnosu na vezivanje za referentna međumesta. hTREM-1 ili cTREM-1 proteini su razblaženi serijski od 1: 3 do 1.2-100 nM ili u “running” pufer, ubrizgani u 100 µl/min za 250 s i ostavljeni da disociraju tokom 600 s.

Površina GLM je regenerisana nakon svakog ciklusa injektiranja analita preko dva injektiranja od 18 s od 10 mM glicina, pH 1.7 i 50 mM NaOH na 100µl/min. Ovaj korak regeneracije uklonio je anti-TREM-1 antitelo i bilo koji vezani TREM-1 protein od površine imobilizovanog uhvaćenog antitela, i omogućio je naknadno vezivanje sledećeg para uzorka interakcije. Procedura regeneracije nije uklonila direktno imobilizovano anti-Fc uhvaćeno antitelo sa površine čipa.

[0157] Afinitet vezivanja između antitela i antigena je kvantifikovan određivanjem ravnotežne konstante disocijacije (KD) određene merenjem kinetike formiranja kompleksa i disocijacije. Konstante brzine koje odgovaraju asocijaciji i disascoijaciji monovalentnoog kompleksa kao što je ka(brzina asocijacije) i kd(brzina disasocijacije) su ponovo dobijene prilagođavanjem podataka u 1: 1 Langmuir model koristeći softver za procenu ProteOn za analizu podataka. KDje povezana sa kai kdpreko jednačine KD= kd/ ka. Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referenciranjem (oduzimanje referentnih površinskih signala kao i praznih puferskih ubrizgavanja preko uhvaćenih anti-TREM-1 antitela) pre analize podataka. To je omogućilo korekciju za šum instrumenta, pomeranje glavnog dela i pomeranje tokom injektiranja uzoraka.

Tabela 5: Rezultati iz merenja konstanti vezivanja ka (brzina asocijacije), kd (brzina disasocijacije) i KD (ravnotežna konstanta disocijacije) za interakciju humanog TREM-1 za različita anti-TREM-1 monoklonska antitela.

Tabela 6: Rezultati iz merenja konstanti vezivanja ka (brzina asocijacije), kd (brzina disasocijacije) i KD (ravnotežna konstanta disocijacije) za interakciju cinomolgus TREM-1 za različita anti-TREM-1 monoklonska antitela.

Primer 10: Humanizacija blokirajućeg TREM-1 mAb 14F69.

[0158] Varijabilni regioni dva vodeća antitela su dobijeni su iz kloniranja hibridoma 14F128A1 i 14F113A1B1C1. Oba antitela su bila klonirana koristeći tehniku SMARTER-RACE (Clontech). Napor humanizacije je izvršen kao iterativna petlja u kojoj su CDR graftovana antitela bila prvi afinitet evaluisan i zatim su ponovo projektovana tako da uključe veći broj povratnih mutacija dok se ne zadrži prihvatljiv afinitet, korišćenjem hibridomski prečišćenih antitela kao repera. CDR graftovana antitela su dizajnirana in silico i naručena od komercijalnog proizvođača (www.genscript.com). Ponovno projektovanje antitela koje je usledilo je izvedeno korišćenjem usmerene mutageneze (Stratagene). Sva antitela su eksprimirana u HEK293-6E ćelijama u pripremanju afinitetnoih testiranja. Ispod je opis glavnih razmatranja za odabir odgovarajuće humane germinativne linije i test povratnih mutacija. Sva numerisanja varijabilnih regiona korišćena u ovom primeru odnose se na Kabat shemu numerisanja.

>m14F128A1_H (CDRs označena masnim slovima i podvučena) (SEQ ID NO 8) >m14F128A1_L (CDRs označena masnim slovima) (SEQ ID NO 9) >m14F113A1B1C1_H (CDRs označena masnim slovima) (SEQ ID NO 10) >m14F113A1B1C1_L (CDRs označena masnim slovima) (SEQ ID NO 11)

[0159] Iz analize sekvence, CDRs za m14F128A1 prema Kabatovoj definiciji su: >CDR_H1

TYAMH

>CDR_H2

RIRTKS[N/S]NYATYY[V/A]DSVKD

>CDR_H3

DMG[I/A]RRQFAY

>CDR_L1

RASESVD[S/T]F[G/D] [I/Y]SF[M/L]H

>CDR_L2

RASNLES

>CDR_L3

QQSNEDPYT

[0160] Sa razlikama između m14F128A1 i m14F113A1B1C1 datim kao [m14F128A1/m14F113A1B1C1].

[0161] 3D model od m14F128A1 je izgrađen korišćenjem standardnih tehnika u MOE [dostupno iz www.chemcomp.com] i svi ostaci unutar 4.5 A efektivnih CDR regiona (VH: 31-35B, 50-58, 95-102; VL: 24-34, 50-56, 89-97) su definisani kao ostaci maske. Ostaci maske su potencijalno značajni za za održavanje vezivanja u CDRs.

[0162] Ostaci maske su obuhvatili položaje 1-2, 4, 27-37, 47, 49-59, 69, 71, 73, 78, 92-103 za teški lanac i položaje 1-5, 7, 23-36, 46, 48-56, 58, 62, 67-71, 88-98 za laki lanac.

[0163] Korišćenjem pretraga germinativne linije od m14F128A1 i ručne inspekcije, VH3_73 i JH4 su identifikovani kao odgovarajuća humana germinativna kombinacija za teški lanac i VKIV_B3 i JK2 su identifikovani kao odgovarajuća humana germinativna kombinacija za laki lanac.

>VH3_13/JH4

>VKIV_B3/JK2

[0164] Humanizacija je zatim izvedena uz sledeća pravila:

• Ostaci izvan maske su uzeti kao humani.

• Ostaci unutar maske i unutar Kabat CDR su uzeti kao murinski.

• Ostaci unutar maske i izvan Kabat CDR sa mišjim/germinativnim konsenzusom su uzeti kao konsenzus sekvenca.

• Ostaci unutar maske i izvan Kabat CDR sa mišjom/germinativnom razlikom su podvrgnuti potencijalnim povratnim mutacijama.

[0165] Graftovanjem efektivnih CDR regiona m14F128A1 u germinativnim linijama formiralo je osnovni humanizacioni konstrukt od m14F128A1, hz14F128A1.

>hz14F128A1_H

>hz14F128A1_L

>CDR_H1

TYAMH

>CDR_H2

RIRTKSNNYATYYAASVKG

>CDR_H3

DMGIRRQFAY

>CDR_L1

RASESVDSFGISFMH

>CDR_L2

RASNLES

>CDR_L3

QQSNEDPYT

[0166] Jedine razlike upoređene sa murinskim CDRs su u CDR_H2 (prikazano masnim). Bilo kakvo neslaganje između m14F128A1 i hz14F128A1 u ostatku maske će kreirati potencijalnu povratnu mutaciju i spisak obuhvata:

hz14F128A1_H: S30N, G49A, A78L, V93T

hz14F128A1_L: M4L, M58I, G68R

[0167] Pored toga, bliska homologija od m14F128A1 i m14F113A1 B1 C1 je korišćena da ukaže na ostatke koji bi mogli da utiču na afinitet hz14F128A1.

hz14F128A1_H: N53S, 198Q

hz14F128A1_L: S27D_T, G29D, I30Y, M33L

[0168] Da bi se istražila sva potencijalno humanizovana mAbs, sve kombinacije gore navedenih mutanata su proizvedene i testirane.

[0169] Finalno humanizovano anti hTREM1 antitelo (mAb 0170) izvedeno iz 14F113 hibridoma sadrži jednu povratnu mutaciju LC okvirnog regiona (M4L) i jednu HC CDR3 mutaciju (Q98I). Mutacija u HC CDR3 je uvedena na osnovu studije afinitet-sinergija sa visoko homologim antitelom koje je nazvano 14F128. Obrazloženje za uključivanje obe mutacije opisani su ispod.

Studija afiniteta-sinergije antitela 14F128i 14F113

[0170] Hibridomska antitela 14F128 i 14F113 su visoko homologa i izvedena iz istog somatskog rekombinantnog događaja. Dva antitela se takmiče u hTREM1 vezivanju sa 14F113 koji ima najviši afinitet. Ukupno CDR graftovane verzije dva antitela se razlikuju u njihovim CDR kompozicijama za samo šest aminokiselina (četiri u LC CDR, i dve u HC CDR). Šest mutacija, kada se poredi 14F113 sa 14F128, su LC T27dS, D29G, Y30I, L33M i HC S54N, Q98I. Iako je graftovan CDR 14F128 imao afinitet inferioran u odnosu na graftovan CDR 14F113 istraženo je da li je povoljni afinitetni efekat od jedne ili više od šest mutacija supresovan opštim efektom kada su prisutne svih šest mutacija. Svih šest mutacija (osim HC S54N) su stoga pojedinačno uvedene u antitelo sa CDR graftovanim 14F113 i antitela su rangirana po afinitetu. Dve mutacije (LC L33M i HC Q98I) su pojedinačno sposobne da poboljšaju afinitet CDR graftovanog 14F113. Mutacija HC na položaju Q98I dala je rast posebno dobrom afinitetu dobijenog antitela (mAb 0170).

Analiza afniteta povratne mutacije okvirnog regiona

[0171] Mišja verzija 14F113 antitela imala je sedam mutacija koje su potencijalno bile neophodne da se uključe kao povratne mutacije tokom humanizacije. Potencijalne povratne mutacije u HC i LC su bile S30N, G49A, A78L i T93V M4L, V58I, G68R, redom. Sedam povratnih mutacija uvedeno je pojedinačno u CDR graftovan 14F113 i zatim rangirano prema afinitetu. Iako je nekoliko od tih mutacija bilo sposobno da poboljša afinitet, samo LC mutacija M4L je izabrana za mAb 0170. Odluka o uključivanju mutacija bila je uravnotežena protiv ekspresionog titra (HEK2936E), afiniteta i ukupnog broja mutacija.

Primer 11: Studija kinetike interakcije za TREM-1 antitela za hTREM-1 pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR): poređenje između mAb 0170 i komercijalno dostupnih TREM-1 antitela.

[0172] Studije vezivanja su izvedene na analizatoru ProteOn (BioRad) koji meri molekularne interakcije u realnom vremenu putem površinske plazmonske rezonance. Eksperimenti su izvedeni na 25 °C, a uzorci su bili čuvani na 15 °C u odeljku za uzorke. Signal (RU, jedinice odgovora) koje je prijavio ProteOn direktno je korelisan prema masi pojedinačnih površina senzorskoh čipa u šest paralelnih protočnih ćelija. Komercijalno dostupna antitela koja su uključena su bila Biolegend #314907, Biolegend #316102 (Biolegend, SAD), Hycult Biotech HM2252 (Hycult Biotech, Netherlands), R&D #MAB1278 (R&D systems, United Kingdom), SC98Z12 (Santa Cruz Biotechnology, SAD), Sigma #WH0054210m4, Sigma #SAB1405121 (Sigma-Aldrich Denmark A/S)

[0173] Anti-humano Fc monoklonsko ili anti-murinsko Fc poliklonsko antitelo od Biacore kitova za hvatanje humanog ili mišjeg Fc imobilisano je u horizontalnom pravcu na protočne ćelije GLM senzorskog čipa prema uputstvima proizvođača. Konačni nivo imobilizacije uhvaćenog antitela bio je oko 2600-6000 RU u različitim eksperimentima. Hvatanje prečišćenog monoklonskih mišjih ili rekombinantno eksprimiranih humanizovanih antihTREM-1 antitela sprovedeno je razblaženjem antitela do 5-10 nM u “running” puferu (10 mM Hepes 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4) i ubrizgano je u vertikalnom pravcu pri 30 µl/min za 60 sekundi, stvarajući referentna međumesta pored svih protočnih ćelija sa samo imobilizovanim anti-Fc antitelom. Ovo je tipično rezultovalo u finalnim nivoima hvatanja test antitela od približno 100-300 RU i Rmaks vrednostima analita od 30-90 RU. Vezivanje hTREM-1 ili cTREM-1 proteina je sprovedeno ubrizgavanjem analita preko svih protočnih ćelija u horizontalnom smeru da se dozvoli uporedna analiza vezivanja za različita uhvaćena anti-TREM-1 antitela u odnosu na vezivanje za referento međumesto. hTREM-1 ili cTREM-1 proteini su razblaženi serijski 1:3 do 1.2-100 nM ili u “running” puferu, ubrizgani pri 100 µl/min za 210 s i ostavljeni da disociraju tokom 600s. GLM površina je regenerisana nakon svakog ciklusa ubrizgavanja analita putem dva ubrizgavanja 10mM Glicina, pH 1.7 i 50 mM NaOH pri 100 µl/min. Ovaj korak regeneracije uklonio je anti-TREM-1 antitelo i bilo koji vezan TREM-1 protein iz površine imobilizovanog uhvaćenog antitela, i omogućio je naknadno vezivanje sledećeg para uzorka interakcije. Procedura regeneracije nije uklonila direktno imobilizovano anti-Fc uhvaćeno antitelo sa površine čipa.

[0174] Afinitet vezivanja između antitela i antigena je kvantifikovan određivanjem ravnotežne konstante disocijacije (KD) određene merenjem kinetike formiranja kompleksa i disocijacije. Konstante brzine koje odgovaraju asocijaciji i disasocijaciji monovalentnog kompleksa kao što je ka(brzina asocijacije) i kd(brzina disasocijacije) su ponovo dobijene prilagođavanjem podataka u 1:1 Langmuir modelu koristeći softver za procenu ProteOn 3.1.0.6 za analizu podataka. KDje povezana sa kai kdpreko jednačine KD= kd/ ka.

[0175] Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referenciranjem (oduzimanje referentnih površinskih signala kao i praznih puferskih ubrizgavanja preko uhvaćenih anti-TREM-1 antitela) pre analize podataka. To je omogućilo korekciju za šum instrumenta, pomeranje glavnog dela i pomeranje tokom injektiranja uzoraka.

Tabela 7: Rezultati iz merenja KD (ravnotežna konstanta disocijacije) za interakciju humanog i cinomolgus TREM-1 ka različitim anti-TREM-1 monoklonskim antitelima.

Primer 12: Studije kompeticije vezivanja anti-humanih TREM-1 monoklonskih antitela pomoću površinske plazmonske rezonance.

[0176] SPR studije kompeticije vezivanja su izvedene pomoću monoklonskih mišjih ili rekombinantno eksprimiranih humanizovanih anti-hTREM-1 antitela u cilju diskriminisanja između različitih mesta vezivanja (epitopi). Komercijalno dostupna antitela koja su bila uključena su Biolegend #314907 (Biolegend, SAD) i SC98Z12 (Santa Cruz Biotechnology, SAD). Anti hTREM-1 monoklonska antitela koja se takmiče za isto ili preklapajuće mesto vezivanja (epitop) na antigenu koja nisu sposobna da se vežu istovremeno za antigen i stoga su dodeljena istoj “grupi”. Anti-TREM-1 monoklonska antitela koja ne kompetiraju za isto ili preklapajuće mesto vezivanja na antigenu su sposobna da vežu istovremeno i prema tome su dodeljena različitim “grupama”. Eksperimenti su izvedeni sa solubilnim, humanim TREM-1 ekstraćelijskim domenom kao antigenom.

[0177] Sve studije su izvedene na 25 °C, i uzorci su čuvani na 15 °C u odeljku za uzorke. Pojedinačna anti-TREM-1 monoklonska antitela i nepovezano kontrolno monoklonsko antitelo su imobilisani na odvojenim protočnim ćelijama na GLC senzorskom čipu korišćenjem 1:1 smeše 0.4 M EDAC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid] i 0.1 M Sulfo-NHS [N-hidroksisulfosukcinimid]. Svako antitelo je razblaženo u 10 mM natrijum acetata pH 5.0 do koncentracije 25 ili 10 (SC98Z12 (80394)) µg/ml, i imobilisano je do pojedinačne protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 240s. Antitela su imobilisana za protočne ćelije L1-L6 (uključujući kontrolu). Nakon imobilizacije antitela, aktivna mesta na protočnoj ćeliji su blokirana sa 1 M etanolamina. Imobilizacije su izvedene sa aktivacijom i deaktivacijom u horizontalnom pravcu kreirajući refrentne tačke međumesta bez imobilisanog proteina. Nivo finalne imobilizacije test antitela je bio u opsegu od približno 1100 do 1300 RU u jednom eksperimentu, osim za jedno antitelo (SC98Z12) gde samo 390 RU je imobilisano. Rekombinantni humani TREM-1 je razblažen do 100 nM u “running” puferu (10 mM Hepes 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4). Antigen je ubrizgan preko imobilisanog antitela u horizontalnom pravcu pri 30 µl/min za 300 s, omogućavajući kontrolu potencijalnog nespecifičnog vezivanja kako za reference međumesta i za imobilizovana kontrolna antitela, što rezultira u uhvaćenom TREM-1 od 150-600 RU, izuzev jednog antitela (SC98Z12) sa malim imobilizacijskim nivoom gde je uhvaćeno samo samo 4 RU.

[0178] Svako antitelo (ista ona koja su bila imobilizovana) ubrizgano je preko paralelnih protočnih ćelija u horizontalnom pravcu, kako bi se omogućila komparativna analiza vezivanja za hTREM-1 uhvaćenog primarnim antitelima u odnosu na vezivanje i za reference međumesta i za imobilizovana kontrolna antitela. Svako kompetirajuće antitelo je razblaženo do 100 nM i injektirano je pri 100 µl/min tokom 250 s. GLC čip je regenerisan nakon svakog ciklusa injektiranja analita preko dva ubrizgavanja od 18 s od 1 M mravlje kiseline pH 3.5, 3 M MgCl2 i 50 mM NaOH pri 100 µl/min. Ovaj korak regeneracije uklonio je TREM-1 antigen i bilo koje vezano sekundarno antitelo sa površine imobilizovanog antitela, i dozvolio je naknadno vezivanje sledećeg test uzorka. Procedura regeneracije nije uklonila direkto imoblizovano anti-TREM-1 test antitelo (primarno antitelo) sa površine čipa. Analiza podataka je izvedena ProteOn ManagerTM 3.1.0.6 Softverom. Nivoi hvatanja su procenjeni da se osigura da je korak regeneracije obezbedio konzistentnu vezujuću površinu kroz niz ubrizgavanja. Nije opaženo nikakvo značajno ne-specifično vezivanje humanog TREM-1 niti za kontrolne površine međumesta niti za imobilizovano kontrolno antitelo. Krive vezivanja su obrađene oduzimanjem kontrolnih površinskih signala međumesta. Ovo je dozvolilo korekciju za šum instrumenta i pomeranje glavnog dela tokom ubrizgavanja uzorka.

[0179] Rezultati kompeticije prijavljeni su kao ili pozitivno ili negativno vezivanje (Tabela 8). Pozitivno (+) vezivanje ukazuje na to da je kompetirajuće antitelo sposobno da veže hTREM-1 istovremeno sa primarnim antitelom (tj. oni ne kompetiraju), a primarna i kompetirajuća antitela su posledično dodeljena različitim grupama epitopa. Negativno vezivanje ukazuje na to da kompetirajuće antitelo nije moglo vezati hTREM-1 istovremeno sa primarnim antitelom (tj. oni kompetiraju), a primarna i kompetirajuća antitela su prema tome dodeljena istoj epitopskoj grupi. Vrednosti odgovora u ovim eksperimentima bile su značajne i dopuštene su za nedvosmisleno određivanje epitopnskih grupa anti-TREM-1 monoklonskih antitela.

Tabela 8: Sposobnost da se vežu (+) ili da se kompetira (-) za antitela testirana u SPR eseju kompeticije. SC98Z12 nije dala dovoljno hvatanja TREM-1 da se proceni primarno antitelo

(*).

[0180] MAb 0170 i mAb 0048 (prečišćen iz hibridoma 14F11, koji je identičan sa 14F128) su pokazani da kompetiraju za vezivanje za humani TREM-1. Biolegend #314907 i SC98Z12 nisu kompetirali sa bilo kojim od ovih za vezivanje humanog TREM-1 ali su kompetirali jedan sa drugim. Ovi nalazi zaključili su da prva dva (mAb 0048 i mAb 0170) pripadaju istoj grupi (grupa 1) dok Biolegend #314907 i SC98Z12 pripadaju drugoj grupi (grupa 2).

Primer 13: Kinetička analiza interakcije između Fab 0011 i Fab 0170 vezivanja za mutirane verzije humanog i cinomolgus TREM-1

[0181] Studije interakcije su izvedene pomoću SPR da bi definisale razlike u epitopima za 0011 i 0170 anti-humana TREM-1 antitela na humani TREM-1. Upoređivanjem kinetike vezivanja sa humanim TREM-1 varijantama sa uvedenim mutacijama alanina u poznatim epitopama, kao i delimično "humanizovanim" varijantama cinomolgus TREM-1, poslednji pošto samo mAb 0170 reaguje sa cinomolgus TREM-1, identifikovani su ostaci amino kiselina jedinstveni za odgovarajući epitop.

[0182] Alaninski mutantni konstrukti vanćelijskog domena hTREM-1 i delimično humanizovani cinomolgus mutantni konstrukti korišćeni u ovoj studiji su rezimirani u Tabeli 9. Svi upotrebljeni konstrukti su varijante ili od SEK ID NO: 19 (cinomolgus TREM-1 varijante) ili SEK ID NO: 20 (humane TREM-1 varijante) i obuhvatali su C-terminal-cmic<2>-His<6>oznaku za hvatanje u SPR testu kinetike vezivanja. Ako nije drugačije naznačeno, sekvence pomenute u ovom primeru su numerisane prema Sl.11.

Tabela 9

Studije vezivanja su izvedene na ProteOn Analizatoru koji meri molekularne interakcije u realnom vremenu putem površinske plazmonske rezonance. Eksperimenti su rađeni na 25 °C, a uzorci su smešteni na 15 °C u odeljku za uzorke. Signal (RU, jedinice odgovora) koje je prijavio ProteOn direktno je direktno korelisan u odnosu na masu na pojedinačnim površinama senzorskih čipova u šest paralelnih protočnih ćelija. Anti-His monoklonsko antitelo je imobilizovano na 6 paralelnih protočnih ćelija GLM senzorskog čipa koristeći smešu 1:1 od 0.4 M EDAC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid] i 0.1 M Sulfo-NHS [N-hidroksisulfosukcinimid]. Antitelo je razblaženo u 10 mM natrijum acetata pH 5.0 do koncentraciji od 25 µg/ml i imobilizovano je na pojedinačnim protočnim ćelijama pri 30 µl/min za 240s. Nakon imobilizacije antitela, aktivne lokacije na protočnim ćelijama blokirane su 1 M etanolaminom. Imobilizacija je obavljena sa svim koracima u horizontalnom pravcu. Konačni nivo imobilizacije za hvatanje antitela bio je oko 8000 RU u jednom eksperimentu. Medijum ćelijske kulture iz HEK 293 ćelije koji je ekspresivao divlje vrste ili različite mutirane varijante humane ili cinomolgusa TREM-1 ECD je razblažen 40-60 puta u toku pufra (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4). TREM-1 proteini su injektirani preko imobilizovanog anti-His inhibitora zauzimanja u vertikalnom smeru pri 30 ml / min tokom 60 s. Ovo je dovelo do toga da 50-250 RU zauzima TREM-1 i kreira referencu međumesta samo imobilizovanim antitelima za zarobljavanje, ali da nije uhvaćen TREM-1 u horizontalnom pravcu. Nakon imobilizacije antitela, aktivna mesta na protočnim ćelijama su blokirana su sa 1 M etanolamina. Imobilizacija je izvedena sa svim koracima u horizontalnom pravcu. Konačni nivo imobilizacije uhvaćenog antitela bio je oko 8000 RU u jednom eksperimentu. Medijum za ćelijske kulture za HEK 293 ćelije koje eksprimiraju divlji tip ili različite mutirane varijante humanog ili cinomolgus TREM-1 ECD je razblažen 40-60 puta u “running” puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4). TREM-1 proteini su injektirani preko imobilizovanog anti-His antitela za hvatanje u vertikalnom smeru pri 30 µl/min tokom 60 s. Ovo je dovelo do uhvaćenom TREM-1 od 50-250 RU i kreiralo reference međumesta samo imobilizovanim antitelima za hvatanje, ali da nije uhvaćen TREM-1 u horizontalnom pravcu. Svaki Fab je injektiran preko paralelnih protočnih ćelija u horizontalnom pravcu kako bi se omogućila kinetička analiza vezivanja za varijante TREM-1 uhvaćene anti-His antitelom. Pre injekcije svaki Fab je razblažen do 0, 5.5 (u jednom eksperimentu), 16.7 i 50 nM u “running” puferu i injektiran je pri 100 µl/min za 250 s (vreme asocijacije). Vreme disocijacije nakon ovih injekcija pratilo se 10 minuta. GLM čip je regenerisan nakon svakog ciklusa TREM-1 i Fab preko dva ubrizgavanja od 18 s 10 mM Glycine i 50 mM NaOH pri 100 µl/min. Ovaj korak regeneracije uklonio je TREM-1 varijante i bilo kojivezan Fab sa površine anti-His antitela, i dozvolio je naknadno vezivanje sledećeg para interakcije. Procedura regeneracije nije uklonila direktno imobilizovano anti-His antitelo za hvatanje sa površine čipa.

[0183] Radi dobijanja kinetičkih podataka, kao što je ka (brzina asocijacije), kd (stopa disociacije) i KD (ravnotežna konstanta disocijacije), izvršena je analiza podataka pomoću softvera ProteOn Manager™ 3.1.0.6. Nivoi hvatanja i vezivanja uzoraka koji su pušteni u duplikatima ili triplikatima su procenjeni da bi se osiguralo da je korak regeneracije obezbedio konzistentnu vezujuću površinu tokom niza ubrizgavanja. Nije primećeno značajno nespecifično vezivanje za reference međumesta sa samo imobilizovanim antitelo za hvatanje. Krive vezivanja su obrađene oduzimanjem kontrolnih površinskih signala međumesta, kao i ubrizgavanjem “running” pufera. To je omogućilo korekciju šuma instrumenta i masovnog pomeranja tokom ubrizgavanja uzoraka. Afinitet od 0170 Fab i 0011 Fab za različite TREM-1 ECD varijante u poređenju sa afinitetom za divljni tip humanog ili cinomolgus TREM-1 ECD.

[0184] Nivo vezivanja od 10 s nakon kraja ubrizgavanja Fab, normalizovan sa nivoom uhvaćene TREM-1 varijante, je takođe procenjen u cilju da se identifikuju mutirane verzije sa sa ukinutim ili veoma niskim vezivanjem. Smanjenje afiniteta u kombinaciji sa značajno nižim normalizovanim nivoom vezivanja može ukazati na poremećeno savijanje usled uvedenih mutacija. Međutim, treba napomenuti da će promene u kinetici uticati na ovu vriednost. Stoga je svaka krivavezivanja vizuelno pregledana za zaključak (podaci nisu prikazani).

[0185] Rezultati za humani TREM-1 sa alaninskim pojedinačnim mutacijama (Tabela 10) pokazuju da su dva položaja (E46 i D92) bila jedinstvena u tome što su smanjivala vezivanje dva puta više prema 0170 Fab.

Tabela 10: Afinitet 0170 Fab i 0011 Fab za humani TREM-1 sa alaninskim mutacijama u odnosu na humani TREM-1 divljeg tipa. Nivo vezivanja 0170 Fab i 0011 Fab 10 s nakon kraja asocijacije, izražen kao stepen teorijskog maksimalnog nivoa vezivanja.

[0186] mAb -0170 je, nasuprot mAb -0011, sposobno da veže cinomolgus TREM-1. Humanizacija cinomolgus TREM-1 u izabranoj oblasti nije rezultovalo u ponovo stečenom afinitetu 0177 u poređenju sa humanim TREM-1 (0247) ukazujući na to da su drugi ostaci ili kombinacije ostataka važni za razlike u afinitetu za humani i cinomolgus TREM-1.

[0187] 0243 ne pokazuje vezivanje za 0170 Fab ili 0011 Fab. Za ovaj konstruktne može biti isključeno da su mutacije uticale na sveukupnu strukturu i stoga se ne može zaključiti da li je Q52 uključen u vezivanje proučenih Fabs za humani TREM-1.

Tabela 11: Afinitet 0170 Fab i 0011 Fab za cinomolgus TREM-1 ECD divljeg tipa, delimično humanizovane TREM-1 ECD varijante i humani TREM-1 ECD divljeg tipa. Nivo vezivanja 0170 Fab i 0011 Fab 10 menja kraj asocijacije, izražen kao stepen teorijskog maksimalnog nivoa vezivanja.

Primer 14: mAb 0170 efikasno blokira TREM-1 aktivaciju u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom eseju

[0188] BWZ/hTREM-1 reporterski ćelijski esej opisan u Primeru 6 je korišćen za izračunavanje potentnosti mAb 0170 u blokiranju TREM-1. BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije su stimulisane sa TREM-1 ligand kompleksom i mAb 0170 je dodat u raznim koncentracijama. Slika 9 prikazuje dozno-zavisno blokiranje TREM-1 signala koje rezultuje u totalnom bloku signala pri koncentracijama višim od 0.2 ug/ml. IC50 vrednost kao što je određena da je 2.4 nM korišćenjem Graphpad Prism softvera, jednačina: log(inhibitor) u odnosu na odgovor – Varijabilni nagib.

Primer 15: Komercijalno dostupna TREM-1 antitela ne blokiraju TREM-1 aktivaciju u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom eseju

[0189] Višestruke doze su uključene u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom eseju, kao što je opisano prethodno. SAB1405121 (klon 3F5 od Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SAD), WH0054210M4 (klon 2E2 from Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SAD), sc-80394 (klon 98Z12 from Santa Cruz, Kalifornija, SAD), HM2252 (klon 6B1 od Hycult biotech, 5405 PB UDEN, Holandija), 316102 (klon TREM-37 od Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD), i 314907 (klon TREM-26 of Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD), nisu bili sposobni da blokiraju TREM-1 aktivnost značajno, dok mAb 0170 stavljeno ovde na uvid javnosti je moglo da blokira TREM-1 aktivnost sa više od 99% pri 0.3 ug/ml. Izotipske kontrole su imale >95% preostale reaktivnost čak pri 3 ug/ml.

Tabela 12

Primer 16: mAb 0170 blokirao je cinomolgus TREM-1

[0190] U cilju testiranja funkcionalnosti protiv TREM-1 iz drugih vrsta, mišji i TREM-1 cinomolgus majmuna je transfektovan zajedno sa humanim i mišjim DAP12, redom, da se generiše reporterski ćelijski esej kao onaj za čoveka. Ovo je u suštini učinjeno kako je opisano za humani sistem (Primeri 1, 2 i 6) ali zamenjivanjem humanog TREM-1 sa murinskim (m)TREM-1 (SEQ ID NO: 22) u punoj dužini ili (c)TREM-1 cinomolgus majmuna (SEQ ID NO: 21) u punoj dužini. cDNK koja kodira cTREM-1 (SEQ ID NO: 22) je sintetisana na GeneArt i klonirana u pHLEF38 (licencirana od CMC ICOS), u Xhol - Xbal orijentaciji. TE alfa NFAT Luc ćelije su ko-transfektovane sa pHLEF38.cynoTrem1 i pNEF38.NFlag hDAP12 korišćenjem 10 ug svakog plazmida i elektroporisale 8e6 ćelije u približno 500 ul ukupne zapremine (400 ul medijuma za rast i 100ul DNK) korišćenjem BTX electoporatora (260 V, 1050 uF, 720 ohms; vremesnka konstanta je bila 23 msek). Ćelije su postavljene u ploče tokom 48 h u ploču od 10 cm, u 10 ml 50% kondicioniranog medijuma i postavljene u ploče direktno u selekciju pri 8e3 ćelija/bunariću ploča sa ravnim dnom sa 96 bunarića (5 ploča) u 200 ul/bunariću 30% kondicioniranog medijuma sa 800ug/ml G418 i0.5mM L-histidinola. Nakon 2 nedelje inkubacije, 40 pojedinačnih kolonija je identifikovano korišćenjem Genetix Klon Select Imager.

[0191] Jedino komercijalno dostupno TREM-1 antitelo asposobno da unakrsno reaguje sa TREM-1 cinomolgus majmuna bilo je 314907 (klon TREM-26 od Biolegend, San Dijego, CA 92121, SAD) (videti Primer 11). Nijedno od komercijalno dostupnih antitela testirano u Primeru 15 nije bilo sposobno da blokira funkciju cinoTREM-1, čak ni ono koje bi moglo da se veže za TREM-1 cinomolgus majmuna.

Tabela 13

[0192] Takođe, stvorena je reporterska ćelijska linija sa mišjim TREM-1. Nijedno od antitela sposobno da se veže za humani TREM-1 ili cinomolgus i humani TREM-1 nije moglo unakrsno da se veže za mišji TREM-1. Prema tome, antitela protiv mišjeg TREM-1 su generisana u suštini kao što je opisano za generisanje humanih TREM-1 antitela, ali sa mišjim TREM-1 kao antigenom. Ove antitela su prikazana za vezivanje mišjeg TREM-1 i blokiranje funkcije u murinskom reporterskom genskom eseju. Jedno takvo antitelo (mAb 0174) je uspelo da veže i blokira funkciju TREM-1 miša.

Primer 17: Oslobađanje TNFalfa iz M2 makrofaga koji su bili stimulisani pomoću PGLYRP-1 je blokirano pomoću TREM-1 antitela

[0193] Prosečni poznavaoci oblasti će prepoznati vrednost uspostaljavanja bankovne kolekcije u zamrzivaču primarnih ćelija prema tome obezbeđujući prikladnu replikaciju eksperimenata. In vitro izvedeni makrofagi su proizvedeni iz monocita periferne krvi kao što sledi. Negativno obogaćeni monociti su izolovani iz “leukopaka” periferne krvi dobijenog od Research Blood Components (Brajton, MA, SAD) korišćenjem Rosette Sep kita (kat. br.

15068) od Stem Cell Technologies (Vankuver, BC, Kanada) praćenjem instrukcija proizvođača. Izolovani monociti su suspendovani u 10% DMSO/FBS alikvotima od 50e6 ćelija/ml i postepeno ohlađeni do -80C. Da se proizvedu ćelije makrofaga, jedna ili više zamrznutih vajlica monocita se brzo otope u vodenom kupatilu na 37C, razblaže do 10ml sa medijumom za rast [RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad CA, SAD) kat. br. 72400-047) sa 10% FBS (Fisher Scientific kat. br. 03-600-511] i centirfugiraju 5 minuta na 250g. Ćelije su suspendovane do 2e6 ćelija/ml u medijumu za rast obogaćenom sa 50 ng/ml humanog MCSF (Gibco kat. br. PHC9501), postavljene u ploče za tkivne kulture tipa petri sa tretiranim tkivnim kulturama i u vlažnom inkubatoru programiranom da održi “hipoksičnu” atmosferu od 5% CO2, 2% 02.na treći dan u kulturi, ćelije su nahranjene dodatkom jednake zapremine medijuma za rast obogaćenih sa 50 ng/ml humanog MCSF. Nakon 6 dana u kulturi monociti su diferencirali u M0 makrofage. M0 ćelije su dalje diferencirale menjanjem medijuma za rast obogaćenih sa 50 ng/ml humanih IFNg (Gibco kat. br. PHC4031) za M1 makrofage ili 40 ng/ml humanof IL-4 (Gibco kat. br. PHC0045) za M2 makrofage i vraćanjem u inkubator tokom dodatna 22 sata. Na sedmi dan, makrofage su pogodno diferencirale da budu korišćene u bioeseju. Ukratko, makrofage su oporavljene iz petri ploča ispiranjem sa 1X PBS, praćeno sa 5mM EDTA u PBS. Ploče su zatim vraćene na 37C tokom 30 minuta i ćelije su "snažno isprane" sa ploče korišćenjem šprica od 10ml i igle od 22G. Ćelije su zatim razblažene u medijumima za rast, centrifugirane na 250g tokom 5 minuta nakon čega je ćelijski talog suspendovan do finalne koncentracije od 1e6/ml.

[0194] Makrofagne ćelije pripremljene kao iznad su korišćene u bioesejima gde citokini kao što je TNF-alfa proizvedeni kao odgovor na stimulaciju ćelija sa TREM-1 ligandom su izmereni u kondicioniranim medijumima pomoću ELISA. Takav bioesej je dalje korišćen da se izmeri blokada takve stimulacije liganda TREM-1 pomoću TREM-1 specifičnog antitela. TREM ligand ili negativne kontrole su pripremljeni u 4X koncentracijama i 50 mikrolitara/bunariću u medijumima za rast su dodati u mikrotitarske sudove sa 96 bunarića. Finalne koncentracije TREM-1 liganda sastojale su se od 7.5 ng/ml rekombinantnog humanog PGLYRP1 (videti Primer 5) i 3 µg/ml PGN-BS (Invivogen,tlrl-pgnbs, San Dijego CA, SAD). Ćelije su kultivisane u vlažnim hipoksičnim uslovima kao što je opisano iznad tokom 22 sata nakon čega je kondicionirani medijum sakupljen i izmereni su nivoi TNF-pomoću ELISA, praćenjem instrukcija proizvođača (R&D Systems, katalog DY210, MN, SAD). Slika 10 pokazuje da TREM-1 antitela smanjuju oslobađanje TNFalfa iz ovih stimulisanih M2 makrofaga.

Tabela 14, ispod, prikazuje IC50 vrednosti iz takvog eksperimenta ukazujući da su antitela stavljena ovde na uvid javnosti veoma potentna u blokiranju oslobađanja citokina zavisnog od TREM-1.

Tabela 14

Primer 18: Oslobađanje TNFalfa iz makrofaga cinomolgusa može biti blokirano pomoću mAb 0170

[0195] Makrofag izveden iz periferne krvi služi kao odličan in vitro model u proučavanju urođene imunološke modulacije i aktivacije. Poznato je da TREM-1 igra ključnu ulogu u kontrolisanju ovog procesa. Upotreba ne-humane vrste primata Macaca fascicularis, obično poznate kao Cinomolgus majmun, je kritična za razumevanje in vivo efekata modulacije signalizacije TREM1. U ovom primeru anti-TREM-1 antitela su testirana za njihovu sposobnost da blokiraju proizvodnju citokina u M2 makrofagnim kulturama cinomolgusa.

[0196] Ćelije makrofaga su generisane kao što sledi. Puna krv je sakupljena iz adravih odraslih muških životinja (SNBL, Everett WA, SAD) venipunkturom korišćenjem vakutajner epruveta sa heparinom (Kat. br. 3664870, Bectin Dickinson Franklin Lakes NJ, SAD). Puna krv je razblažena 30% sa PBS, zatim 30 ml je pažljivo naslagano na 15ml Ficoll-Paque (Kat. br. 17-1440-03 GE Healthcare, Uppsala Švedska) prethodno razblaženog do 96% sa PBS u konusnoj epruveti od 50ml. Nakon centrifugiranja: 30 min, sobna temperatura, 400g sa niskim ubrzavanjem i bez pauze; monojedarne ćelije periferne krvi (PBMC) su sakupljene iz međufaze Ficoll/plazma, razblažene 3X sa PBS i centrifugirane 7 minuta, sobna temperatura, 200g. Supernatant koji sadrži kontaminirane trombocite je aspiriran i odbačen i ćelijski pelet je ponovo suspendovan u 30ml of PBS 0.2% FBS (fetalni goveđi serum). Ovaj proces ispiriranja ćelija je ponovljen 2 dodatna ciklusa nakon čega je ćelijski pelet od PBMC ponovo suspendovan u medijumu za kulture RPMI (Kat. br. 61870-036, Life Technologies, Grand Island NY, SAD) plus 10% FBS do 2E6 ćelija/ml i podeljen na petri posude od 15 cm (Kat. br. 430599 Corning, Tewksbury MA, SAD) pri 20ml/posudi. Monociti su ostavljeni da se zalepe za plastiku inkubiranjem preko noći na 37C, 5% CO2, 100% vlažnosti nakon čega su uklonjene ćelije koje se nisu zalepile nežnim vrtenjem i ljuljanjem ploča tokom 20 sekundi praćeno aspiracijom. 20 ml svežeg medijuma za rast obogaćenog sa 50ng/ml hMCSF (Kat. br. PHC9501, Life Technologies, Grand Island NY, SAD) je dodato svakoj ploči i postavljeno u uslove hipoksične za kulturu od 37C, 5% CO2, 2% O2, 100% vlažnosti tokom 7 dana. Na treći dan u kulturi, ćelije su nahranjene sa dodatkom jednake zapremine medijuma za rast obogaćenog sa 50 ng/ml humanog MCSF. Nakon 6 dana u kulturi monociti su diferencirali u M0 makrofage. M0 ćelije su dalje diferencirale zamenjivanjem medijuma u medijum za rast obogaćen sa 50 ng/ml humanog IFNg (Gibco Kat. br. PHC4031) za M1 makrofage ili 40 ng/ml humanog IL-4 (Kat. br. PHC0045, Life Technologies, Grand Island NY, SAD) za M2 makrofage i vraćanjem u inkubator tokom dodatna 22 sata. Na sedmi dan, makrofage su pogodno diferencirale da budu korišćene u bioeseju. Ukratko, makrofage su oporavljene iz petri ploča ispiranjem sa 1X PBS, praćeno sa 5mM EDTA u PBS. Ploče su zatim vraćene na 37C tokom 30 minuta ćelije su "snažno isprane" sa ploče korišćenjem šprica od 10ml i igle od 22G. Ćelije su zatim razblažene u medijumima za rast, centrifugirane na 250g tokom 5 minuta nakon čega je ćelijski talog suspendovan do finalne koncentracije od 1e6/ml.

[0197] Ćelije makrofaga pripremljene kao iznad su korišćene u bioesejima gde su citokini kao što je TNF-alfa proizvedeni kao odgovor na stimulaciju ćelija sa TREM-1 ligandom izmereni u kondicioniranom medijumu pomoću ELISA. Takav bioesej je dalje korišćen da se meri blokada stimulacije TREM-1 liganda pomoću antitela specifičnih za TREM-1. TREM-1 ligand ili negativne kontrole su pripremljene u 4X koncentracijama i 50 mikrolitara/bunariću u medijumu za rast je dodato u mikrotitarske posude sa 96 bunarića. Finalne koncentracije TREM-1 liganda sastojale su se od 7.5 ng/ml rekombinantnog humanog PGLYRP1 (koji je generisan kao što je opisano u Primer 5) i 3 µg/ml PGN-BS (kat. br. tlrl-pgnbs, Invivogen San Dijego CA, SAD). Antitela su dodata u 50 mikrolitara/bunariću medijuma za rast praćeno sa ćelijama u 50 mikrolitara/bunariću makrofaga. Ćelije su kutivisane u vlažnim hipoksičnim uslovima kao što je opisano iznad tokom 22 sata nakon čega je kondicionirani medijum sakupljen i TNF-alfa nivoi su izmereni pomoću ELISA, praćenjem instrukcija proizvođača (Kat. br. DY1070 R&D Systems, Minneapolis MN, SAD). Tabela koja sledi tabelu prikazuje TNFα vrednosti kultura M2 makrofaga koje su stimulisane sa TREM-1 ligandom (PGLYRP1+PGN) u prisustvu kontrolnog antitela ili anti-TREM-1 antitela.

Ovaj primer ilustruje da anti TREM-1 Ab- 0170 može efikasno blokirati proizvodnju citokina zavisnu od TREM-1 u ćelijama makrofaga izvedenim iz cinomolgus majmuna. Efikasnost ovog Ab podržava njegovu upotrebu u cinomolgus majmunu u in vivo modelima toksikologije i lečenja bolesti.

Primer 19: Oslobađanje TNFalfa iz stimulisanih monojedarnih ćelija periferne krvi može biti blokirano pomoću TREM-1 antitela

[0198] PBMC's, iz leukocitno trombocitnog međusloja (buffy coat) i zamrznute u RPMI 1640 (Kat. br.61870, Gibco, Njujork, SAD), 20% FBS (Kat. br.16140-071, Gibco, Njujork, SAD, 10% DMSO (Kat. br. D2650, Sigma, Štajnhajm, Nemačka), su otopljene i isprane dva puta u RPMI, 10% FBS, 1% Pen/Strep (Kat. br. 15070-06, Gibco, Njujork, SAD), i ponovo suspendovane u istom medijumu do 4x10E6/ml. Ćelije su zatim distribuirane sa 400.000 ćelije/well. 10 µg/ml PGN-SA (Kat. br. tlrl-pgnsa, Invivogen, San Dijego, SAD) i 0.2 µg/ml PGLYRP1 su dodati u bunariće za stimulisanje ćelija. Zatim, relevantni izotip i TREM-1 antitela su razblažena u RPMI i dodata pri 1.34 nM, i 0.167 nM redom. Oslobađanje TNFalfa je izmereno pomoću diaplex-a (Kat. br. 880.090.001, Genprobe, Besancon, Francuska) u skaldu sa protokolom proivođača nakon 20 h inkubacije pri 37 °C, 5 % CO2. Kao što je prikazano u Tabeli 13, ispod, TREM-1 antitela stavljena ovde na uvid javnosti (mAbs 0044, 0070 i 0059) su sva bila sposobna da smanje oslobađanje TNFalfa iz PBMC ćelija.

Tabela 15

Približno 70% inhibicije oslobađanja TNFalfa u PBMCs korišćenjem blokirajućeg TREM-1 antitela ukazuje na značajan uticaj na nivoe citokina u stimulisanoj ćelijskoj kulturi.

Primer 20: Anti-TREM-1 mAb može da inhibira PGN+PGLYRP1-indukovanu TNFa proizvodnju u normoksičnim makrofagama

[0199] Stimulacija makrofaga korišćenjem PGN-BS humani PGLYRP1 kao stimulansa TREM-1 receptora može biti blokirana pomoću anti-TREM-1 antitela.

[0200] Monociti su diferencirani u M2 makrofage kao u Primeru 15. Svi koraci diferencijacije i stimulacije ćelija su izvedeni u inkubatoru na 37°C, 5% CO2 pod normalnim atmosferskim nivoima kiseonika (normoksija). Diferencirani M2 makrofagi su ponovo suspendovani u RPMI/10%FBS i postavljeni u ploče pri 5x10E5 ćelije/ml u triplikatu (ukoliko nije drugačije naznačeno) test bunarića. Ćelije su stimulisane tokom 24 sata sa sledećim stimulacijama: bez dodatka, PGLYRP1, PGN-BS (InVivogen, tlrl-pgnbs) (dva seta triplikata), PGN-BS+PGLYRP1 (tri seta triplikata), ili PGN-BS+PGLYRP1 u prisustvu anti-TREM-1 ili izotipskog kontolnog antitela. Supernatanti su zatim sakupljeni i analizirani za TNFa korišćenjem BioPlex (Bio-Rad, 171-B5026M). Antitela (0.1 µg/ml) mAb-0122 i -0170 usmerena na TREM-1 su sposobni da snize oslobađanje TNF-alfa.

Tabela 16

Ovaj primer ilustruje da anti-TREM-1 mAb-0122 i -0170 mogu da inhibiraju TNFa proizvodnju iz makrofaga koji su rasli pod normoksičnim uslovima.

Primer 21: TREM-1 antitelo specifično inhibira odgovor kod reumatoidnog artritisa indukovanog sinovijalnom tečnošću.

[0201] Uzorci RA sinovijalne tečnosti iz pacijenata koji pate od reumatoidnog artritisa su testirani za aktivnost TREM-1 liganda u BWZ reporterskom eseju kao što je opisano u Primeru 6. Ukratko, sinovijalna tečnost je otopljena, vorteksovana, i serijski razblažena, testirana u duplikatu /-10µg/ml PGNECndi (Invivogen, San Dijego, CA, SAD) sa dodatkom TREM-1 antitela ili negativne izotipske kontrole. Sinovijalna tečnost pacijenata sa reumatoidnim artritisom je sposobna da aktivira BWZ/hTREM-1 reporterski ćelijski esej na način zavistan od TREM-1 koji je dalje poboljšan dodavanjem MAB1278 (R&D Systems, Mineapolis, MN 55413, SAD: Kat. br. MAB1278)) dok su blokirajuća TREM-1 antitela stavljena ovde na uvid javnosti sposobna da smanje ovu aktivaciju.

[0202] Antitela su testirana u dva eseja naznačena pomoću dve kolone ispod, svako antitelo u koncentracijama u opsegu od 0.1 do 10 ug/ml. MAB1278 je očigledno poboljšao signal, dok su mAbs 0122 i 0170 smanili signal u poređenju sa izotipskom kontrolom.

Tabela 17

Primer 22: Oslobađanje citokina iz ćelija sinovijalnog tkiva iz pacijenata sa reumatoidnim artritisom nakon stimulacije sa PGLYRP-1 može biti blokirano pomoću mAb 0170.

[0203] Uzorci sinovijalnog tkiva su dobijeni od RA pacijenata tokom totalne zamene kolena. Pojedinačna suspenzija ćelija sinovijalnog tkiva je izolovana digestijom preko 4mg/ml kolagenaze (kat. br.11088793001, Roche, Manhajm, Nemačka) i 0.1mg/ml DNaze (kat. br.11284932001, Roche, Manhajm, Nemačka) tokom 1h na 37 stepeni C.

[0204] Ćelije sinovijalnog tkiva pri 1x10^5/bunariću u medijum za kulture RPMI (kat. br.R0883, St Louis, MO, SAD) 10% FCS (kat. br.S0115, BioChrom AG, Grand Island, NY 14072, SAD) su stimulisani sa 4ug/ml PGLYRP1 i 1ug/ml of PGN-ECNDi (kat. br. tlrlkipgn, Invivogen, San Dijego, CA 92121, SAD) u hipoksičnim uslovima u prisustvu ili odusutv raznih koncentracija mAb 0170 ili izotipske hIgG4 kontrole. Nakon inkubacije od 24, ćelijski supernatanti su sakupljeni, i citokini su izmereni pomoću ili ELISA (TNFa (kat. br. DY210, R&D, Mineapolis, MN55413 SAD), IL-1b (88-7010-88, eBioscience, San Dijego, CA 92121, SAD), GM-CSF (kat. br.88-7339-88, eBioscience)) ili Flowcytomix (TNFa, IL-1b, MIP-1b, MCP-1, IL-6, i IL-8 (kat. br.BMS, eBioscience). Citokini su izlučeni iz ćelija sinovijalnog tkiva na stimulaciju sa TREM-1 ligandom i specifično blokirani pomoću TREM-1 antitelom mAb 0170.

Ispod je primer takvog eksperimenta, gde ili 4 ng/ml ili 10 ng/ml mAb je korišćeno rezultujući u smanjenju oslobađanja citokina kada je tretiran sa TREM-1 antitelom mAb 0170.

Tabela 18

Tabela 19

[0205] Ovaj primer pokazuje da ćelije iz sinovijalnog tkiva pacijenata sa reumatoidnim artritisom reaguju na stimulaciju pomoću TREM-1 liganda, PGLIRP1, sekretujući brojne citokine koje mogu biti inhibirani pomoću mAb 0170.

Primer 23: PGLYRP1 tipa II indukovao je oslobađanje TNFalfa u ćelijama sinovijalnog tkiva iz pacijenata sa reumatoidnim artritisom koje može biti blokirano pomoću TREM-1 antitela mAb 0170

[0206] Uzorci sinovijalnog tkiva su dobijeni od RA pacijenata tokom totalne zamene kolena. Pojedinačna were obtained from RA patients during total knee replacement. Pojedinačna suspenzija ćelija sinovijalnog tkiva je izolovana digestijom preko 4mg/ml kolagenaze (kat. br. 11088793001, Roche, Manhajm, Nemačka) i 0.1mg/ml DNaze (kat. br. 11284932001, Roche, Manhajm, Nemačka) tokom 1 sata na 37 stepeni. Ćelije sinovijalnog tkiva (1x10^5/bunariću u medijumu za kulture RPMI (kat. br.22400105, Gibco, NY 14072, SAD) 10 % FCS (kat. br. S0115, BioChrom AG, Berlin, Nemačka)) su ko-kultivisane sa raznim dozama HEK ćelija kratkotrajno transfektovanim sa PGLYRP1 tipa II pod hipoksičnim uslovima u prisustvu ili odusstvu 1ug/ml mAb 0170 ili IgG4 izotipske kontrole. Nakon inkubacije od 24h, ćelijski supernatanti su sakupljeni, i citokini su izmereni pomoću TNFa ELISA (kat. br. DY210, R&D, Mineapolis, MN55413 USA).

Tabela 20

Ovaj primer pokazuje da je TREM-1 ligand (ćelije tipa II) indukovao oslobađanje TNF-alfa na dozno-zavistan način u ćelijama sinovijalnog tkiva iz pacijenata sa reumatoidnim artritisom u poređenju sa kontrolnim ćelijama (lažno transfektovane). Ovaj TNFalfa odgovor je bio blokiran pomoću mAb 0170 ali ne pomoću IgG4 izotipa. Kontrolne ćelije nisu bile pogođene.

Primer 24: MAB1278 vezan za ploču je indukovao IL-6 i TNFalfa odgovor u makrofagama, pokazujući agonistička svojstva, dok mAbs 0122 i 0170 nisu.

[0207] Stimulacija makrofaga na agonistička anti-TREM-1 antitela vezana za ploču indukovala je proizvodnju IL-6 i TNFa. Monociti su prečišćeni iz “buffy” sloja zdravog donora korišćenjem RosetteSep (StemCell Technologies, 15068) i diferencirali u makrofage kultivacijom tokom 6 dana u RPMI/10%FBS u prisustvu 40 ng/ml humanog MCSF. Makrogafi su zatim dalje diferencirani u M2 makrofage zamenjivanjem medijuma u medijum za rast koji je obogaćen sa 50 ng/ml humanog IL-4 i vraćenjem u inkubator tokom dodatna 24 sata. Na sedmi dan, makrofage su oporavljene iz ploča za kulture ispiranjem sa 1X PBS, praćeno sa 5mM EDTA u PBS. Tploče su zatim vraćene na 37°C tokom 30 minuta pre nego što su makrofage isprane sa ploča. Makrofage su isprane u RPMI/10%FBS pre resuspendovanja i postavljanja u ploče. Test bunarići su prethodno obloženi specifičnim antitelima inkubiranjem njih preko noći sa antitelom koje je razblaženo u PBS, praćeno sa ispiranjem x3 u PBS. Ponovo suspendovane makrofage su nanete u 5x10E5 ćelija/ml u test bunariće u triplikatu praćeno sa inkubacijom tokom 24 sata. (Svi koraci diferencijacije i stimulacije ćelija su izvedene u inkubatoru na 37°C, 5% CO2 pri normalnim nivoima atmosferskog kiseonika (normoksijia)). Supernatanti su zatim sakupljeni i analizirani za IL-6 i TNFa korišćenjem BioPlex (Bio-Rad, 171-B5006M i 171-B5026M).

[0208] Antitela mAb-0122 i -0170 spokazala su veoma nizak antagonizam dok je MAB1278 antitelo (RnD Systems, MAB1278) pokazalo indukciju kako i IL-6 tako i TNFa.

Tabela 21

Ovaj primer ilustruje da mAb-0122 i -0170 samo pokazuju veoma nisku agonističku aktivnost u makrofagama i ukazuje na jake blokirajuće karakteristike ovih mAbs.

Primer 25: Blokiranje TREM-1 u modelu mišjeg artritisa umanjuje bolest.

[0209] Eksperimenti oizloženi u Tabeli 22 su dobijeni u modelu DTH-artritisa, koji je model artritisa jedne šape. Artritis jedne šape je indukovan kod ženki miševa C57BL/6 izazivanjem reakcije klasičnog odloženog tipa preosetljivosti (DTH) u desnoj zadnjoj šapi imunizacijom i kasnijim izazovom sa metilovanim goveđim serumom albumimom (mBSA), sa modifikacijom da je koktel kolagenskog tipa II monoklonsko antitela (anti-CII) administriran IV između koraka imunizacije i izazova. Zadnja leva šapa je primila PBS izazov i funkcionisala kao među-životinjska kontrola. Miševi (10 miševa/grupi) su tretirani 3 puta/nedeljno sa TREM monoklonskim antitelom koje specifično vezuje i blokira murinski TREM-1, kao što je određeno korišćenjem murinske verzije reporterskog eseja opisanog u Primeru 6. Prva doza je administrirana na dan imunizacije. Miševi (9-10 miševa/grupi) su tretirani ili sa kontrolnim antitelom ili PBS kao kontrolom. Oticanje šape je mereno od dana indukcije artritisa i 11 dana dalje. Rezultati su predstavljeni kao srednja površina ispod krive (AUC) ± SEM. Statistička značajnost testirana je korišćenjem dvostranog neuparenog t-testa, interval poverenja od 95%.

Tabela 22: Efekat TREM-1 tretmana na oticanje šape (AUC-mm) u mišjem modelu artritisa.

Primer 26: Aktivirani neutrofili oslobađaju IL-8 koji može biti blokiran pomoću TREM-1 mAb

[0210] Neutrofili koji eksprimiraju TREM-1 i neutrofili koji takođe eksprimiraju TREM-1 ligand. Da bi se testiralo da li je TREM-1 uključen u autokrinu stimulacionu petlju u neutrofilima, izolovani neutrofili su stimulisani sa PGN-SA (InVivogen, tlrl-pgnsa), i solobađanje IL-8 u medijumza kulture je izmeren. TREM-1 antitela mAb-0059, -0067, -0122, i -0170 su bila sposobna da smanje PGN-SA-indukovano oslobađanje IL-8. Neutrofili su izolovani iz pune krvi humanog zdravog donora i ponovo suspendovani u RPMI/10% FBS pri 1.5x10E6 ćelija/ml, postavljeni u ploče u triplikatima u test bunariće prethodno obložene sa Fibrinogenom (prethodno obložene sa 50 l 1mg/ml Fibrinogena (Sigma, F3879) u PBS tokom 2 sata na 37°C, praćeno ispiranjem x3 u PBS). Ćelije su testirane u sledećim uslovima: bez dodate stimulacije, 10 g/ml PGN-SA samo, ili 10 g/ml PGN-SA u prisustvu mAb-0059, -0067, -0122, -0170 ili izotipskog kontrolnog antitela pri 0.25 g/ml. Uzorci su kultivisani tokom 24 h u inkubatoru na 37°C, 5% CO2. Supernatanti su zatim sakupljeni i analizirani za IL-8 korišćenjem Bio-plex Pro Human Cytokine IL-8 seta (BioRad, 171-B5008M).

Tabela 23

Ovaj primer ilustruje da oslobađanje IL-8 iz neutrofila indukovano stimulacijom sa bakterijski izvedenim PGN može biti smanjeno pomoću TREM-1 antitela. Prema tome pokazuje da je TREM-1 uključen u autokrinu aktivacionu petlju u neutrofilima, i da su TREM-1 antitela potencijalno korisna u negativnoj regulaciji odgovora neutrofila.

Primer 27: Aktivirani neutrofii mogu da stimulišu monocite, koji mogu biti blokirani pomoću anti-TREM-1 mAbs

[0211] Aktivirani neutrofili eksprimiraju TREM-1 ligand. Da bi se testiralo da li aktivirani neutrofili mogu da stimulišu druge imune ćelije na način zavistan od TREM-1, aktivirani neutrofili su korišćeni da stimulišu izolovane monocite i oslobađanje TNFa u medijum za kulture je izmereno. TREM-1 antitela mAb-0059 i -0170 su bila sposobna da smanje oslobađanje TNFa indukovano neutrofilima iz monocita.

[0212] Neutrofili su izolovani iz pune krvi humanih zdravih donora i ponovo suspendovani u RPMI/10% FBS, i postavljeni u 1.5x10E5 ćelija/bunariću u ploče obložene poli-D-Lizinom za tkivne kulture sa 96 bunarića (Corning, 3841). Neutrofili su zatim stimulisani sa 1ng/ml PMA (Sigma, P1585) 20 g/ml PGN-SA (InVivogen, tlrl-pgnsa) tokom 24 sata u inkubatoru na 37°C, 5% CO2. Ćelije su zatim isprane nežno 3x medijumom pre dodavanja sveže izolovanih monocita. Monociti su prečišćeni iz “buffy” slojeva zdravih donora korišćenjem EasySep kita (Stem cell technologies, 19059), i postavljene su u 5x10E4 ćelija/bunariću u bunariće koji su već sadržali aktivirane, isprane neutrofile. Sledeća antitela su dodata pri 1 g/ml: mAb-0059, mAb-0170, ili hIgG4 izotipske kontrola. Ćelije su zatim gajene u kulturi tokom dodatna 24 sata pre sakupljanja supernatanta. Supernatant je razblažen 1:10 u RPMI/10%FNS pre merenja TNFa pomoću ELISA (eBioscience, BMS223INST).

Tabela 24

Ovaj primer je ilustrivao da aktivirani neutrofili mogu da stimulišu monocite na način zavistan od TREM-1 da proizvedu TNFa, i ovo može biti blokirano pomoću mAb-0059 i mAb-0170 anti-TREM-1 antitela. Anti-TREM-1 antitela su stoga potencijalno korisna za negativnu regulaciju odgovora monocita.

LISTA SEKVENCI

[0213]

Claims (10)

PATENTI ZAHTEVI

1. Antitelo ili njegov fragment koje je sposobno za specifično vezivanje i blokiranje TREM-1, gde je antitelo ili njegov fragment sposoban za blokiranje PGLYRP1-indukovane aktivacije TREM-1, i ima epitop koji sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili sve od aminokiselinskih ostataka D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 i L45 i jedan, dva ili sve od aminokiselinskih ostataka E46, K47, F48 sekvence sa identifikacionim brojem - SEQ ID NO:1 koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog TREM-1.

2. Antitelo ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1, koje se takmiči sa mAb 0170 za vezivanje za SEQ ID NO:1 koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog TREM-1, gde mAb 0170 sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5.

3. Antitelo ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, koji se takimiči sa mAb 0170 za vezivanje za SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 21 koja predstavlja aminokiselinske sekvence TREM-1 cinomolgus majmuna, gde mAb 0170 sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5.

4. Antitelo ili njegov fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, koje je sposobno za specifično vezivanje polipeptida koji sadrži aminokiseline D38 do F48 sa SEQ ID NO: 1 koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog TREM-1.

5. Antitelo u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-4, koje je sposobno za specifično vezivanje SEQ ID NO: 13 koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6.

6. Antitelo u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5, koje je sposobno za specifično vezivanje SEQ ID NO: 14 koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6.

7. Antitelo u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-6, koje je sposobno za specifično vezivanje SEQ ID NO: 15 koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6.

8. Antitelo u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-7, teški lanac koji sadrži CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 predstavljene pomoću aminokiselina TYAMH sa SEQ ID NO: 4, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka može biti zamenjen sa drugačijim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 68 koje su predstavljene pomoću aminokiselina RIRTKSSNYATYYAASVKG sa SEQ ID NO: 4, gde jedna, dve ili tri od pomenutih aminokiselina mogu biti zamenjene sa drugačijim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 101 do 110 predstavljenih pomoću aminokiselina DMGIRRQFAY sa SEQ ID NO: 4, gde jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka mogu biti zamenjeni sa drugačijom aminokiselinom; i laki lanac koji sadrži CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 38 predstavljene pomoću aminokiselina RASESVDTFDYSFLH sa SEQ ID NO: 5, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka mogu biti zamenjeni sa drugačijom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 54 do 60 predstavljenih pomoću aminokiselina RASNLES sa SEQ ID NO: 5, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka mogu biti zamenjeni sa drugačijom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 93 do 101 predstavljenih pomoću aminokiselina QQSNEDPYT sa SEQ ID NO: 5, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka mogu biti zamenjeni sa drugačijom aminokiselinom.

9. Antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 8, teški lanac koji sadrži CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 predstavljenih pomoću aminokiselina TYAMH sa SEQ ID NO: 4; i/ili CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 68 predstavljenih pomoću aminokiselina RIRTKSSNYATYYAASVKG sa SEQ ID NO: 4; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 101 do 110 predstavljenih pomoću aminokiselina DMGIRRQFAY sa SEQ ID NO: 4; i laki lanac koji sadrži CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 38 predstavljenih pomoću aminokiselina RASESVDTFDYSFLH sa SEQ ID NO: 5; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 54 do 60 predstavljenih pomoću aminokiselina RASNLES sa SEQ ID NO: 5; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 93 do 101 predstavljenih pomoću aminokiselina QQSNEDPYT sa SEQ ID NO: 5.

10. Antitelo ili njegov fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9 za primenu kao medikament.