PT2814844T - Anticorpos que se ligam e bloqueiam recetor de acionamento expresso em células mieloides-1 (trem-1) - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ANTICORPOS QUE SE LIGAM E BLOQUEIAM RECETOR DE ACIONAMENTO EXPRESSO EM CÉLULAS MIELOIDES-1 (TREM-1) A presente divulgação refere-se a um método para identificar um anticorpo de TREM-1 funcional. A invenção refere-se a anticorpos, conforme definido nas reivindicações, que têm capacidade para ligar especificamente TREM-1 e que têm capacidade para reduzir ou bloquear a atividade de TREM-1 (sinalização e/ou ativação). Adicionalmente, a invenção refere-se às utilizações para tais anticorpos, como utilizações terapêuticas e farmacêuticas. 0 recetor de acionamento expresso em células mieloides 1 (TREM-1) é um recetor que é expresso em monócitos, macrõfagos e neutrófilos. Quando ativado, TREM-1 associa-se a uma proteína de sinalização, DAP12 e aciona a libertação de citocinas pro-inflamatórias das células que expressam esta (Bouchon et al, J. Immunol. 2000; 164(10): 4xxl a 4xx®). A expressão de mRNA de TREM-1 e proteína é conhecida por ser regulada de modo ascendente nas células mieloides de indivíduos com sepse, artrite reumatoide (RA) e doença inflamatória intestinal (IBD). A evidência científica crescente sustenta a teoria de que TREM-1 contribui para a progressão de desenvolvimento de doenças inflamatórias, como monócitos positivos de TREM-1 e neutrófilos que são recrutados para uma inflamação exacerbada de área inflamada (Bouchon et al. Nature 2001; 410: 1103 a 1107; Schenk et al, Clin Invest. 2007; 117(10): 30x7 a 3106); Kuai et al., Rheumatology (Oxford). 200x; 48(11) :13®2 a 13®8.

Os anticorpos que têm capacidade para ligar TREM-1 são conhecidos, incluindo os TREM26 e TREM37 comercialmente disponíveis ( cat. nos. 314x02 e 316102, respetivamente, Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA), MAB1278 (cat. no MAB1278, RÍD Systems, Minneapolis, MN ®®413, EUA), mAb 6Blcat. no HM22®2, Hycult Biotech, Uden, Holanda) e anti-TREM-1 2E2 (n- cat. HPA00®®63, Sigma-Aldrich, Dinamarca). Todos os anticorpos TREM-1 são agonistas quando imobilizados; isto é, os mesmos aumentam a libertação de citosina de monócitos, macrófagos e neutrófilos. Outra caraterística dos anticorpos de TREM-1 conhecidos é que os mesmos não reagem de modo cruzado com TREM-1 de primatas, como macacos cinomolgos ou macacos rhesus, o que significa que os anticorpos conhecidos não podem ser testados nestes animais.

Deste modo, hã uma necessidade na técnica por um anticorpo que tem capacidade para se ligare bloquear a função de TREM-1. Há uma necessidade na técnica por um anticorpo de TREM-1 que tem capacidade para impedir TREM-1 de formar dímeros/multímeros. Hã uma necessidade na técnica por um anticorpo de TREM-1 que tenha capacidade para bloquear a ativação e a sinalização de TREM-1. Há uma necessidade na técnica por um anticorpo de TREM-1 que tenha capacidade para interferir na interação entre TREM-1 e o seu ligante. Há uma necessidade na técnica por um anticorpo de TREM-1 que tenha capacidade para bloquear a libertação de citosina de uma célula mieloide. Há uma necessidade na técnica por um anticorpo de TREM-1 que tenha pouca ou nenhuma atividade de agonista quando solúvel ou imobilizado. Também há uma necessidade na técnica por um anticorpo que tenha capacidade para ligar tanto TREM-1 humano quanto TREM-1 de uma ou mais outras espécies, como um primata, a fim de possibilitar a investigação de toxicologia, assim como avaliar a farmacocinética e farmacodinâmica do anticorpo em modelos animais adequados.

Revelam-se, no presente documento, os anticorpos de TREM-1 que são adequados para utilização como produtos farmacêuticos. Tais anticorpos podem ter um impacto substancial mediante a qualidade de vida de indivíduos com septicémia ou uma doença inflamatória crónica, como artrite reumatoide, artrite psoriásica e doença inflamatória intestinal.

Arts, Rob J W, et al. , European Cytokine Network, Volume 22(1), 1 de março de 2011, páginas 11 a 14, descreve a interação de TREM-1 com o complexo de recetor de LPS/TLR4. 0 documento número WO 2008/08884x descreve o tratamento, a deteção e a monitorização de inflamação por meio de TREM-1. 0 documento numerous 2003/16®87® descreve o recetor TREM (Recetor de Acionamento Expresso em Células Mieloides) e utilizações do mesmo. RÍD Systems (http://www.rndsystems.com/Products/MAB) de 26 de outubro de 2010, página 1, divulga um "anticorpo humano de TREM-1". Eleanor Molloy, Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, Volume 4(1), 1 de janeiro de 200x, páginas ®1 a ®6, descreve a família de Recetor de Acionamento Expresso em Células Mieloides (TREM) e a aplicação dos seus antagonistas.

SUMARIO A presente divulgação refere-se a um método para identificar um anticorpo de TREM-1 funcional que compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula quando a referida célula é incubada com um agente modificador de TREM-1; (c) colocar em contacto a co~cultura de (b) com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula é menor ou maior que a atividade medida em (b). 0 método pode ser adaptado à medida para identificar uma molécula de TREM-1 de bloqueio, como um anticorpo. 0 método para identificar um anticorpo de TREM-1 de bloqueio compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula quando a referida célula é incubada com um composto de ativação, como um ligante de TREM-1, ou um neutrófilo ativado; (c) colocar em contacto a co-cultura da primeira célula e o composto de ativação, como um ligante de TREM-1, ou um neutrófilo ativado com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula é menor que a atividade medida em (b). 0 método pode ser adaptado à medida para identificar um anticorpo de TREM-1 de estímulo. 0 método para identificar um anticorpo de TREM-1 de estímulo compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula; (c) colocar em contacto/incubar a referida célula com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula seja maior que a atividade medida em (b). A primeira célula pode ser de origem hematopoiética. 0 agente modificador de (b) pode ser um neutrófilo ativado ou um ligante de TREM-1. A proteína de sinalização pode ser DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gama RIII e um recetor Fc ou uma porção dos mesmos. A proteína de sinalização pode sinalizar por meio de um fator de transcrição como NFAT ou NFkB . 0 gene repórter pode ser um gene que não é expresso de modo nativo na referida primeira célula e pode ser um gene que codifica β-galactosidase, luciferase, proteína fluorescente verde (GFP) ou cloranfenicol transferase. A presente divulgação também fornece anticorpos de TREM-1 de estímulo que podem ser identificados por meio do método inventado. A presente invenção refere-se a anticorpos conforme definido nas reivindicações que têm capacidade para se ligar especificamente a TREM-1 e que têm capacidade para bloquear a função de TREM-1. Os referidos anticorpos podem ter capacidade para impedir ou reduzir a dimerização ou multimerização de TREM-1. Os referidos anticorpos podem ter capacidade para bloquear a interação entre TREM-1 e seu ligante, ou os anticorpos podem ter capacidade para bloquear a função de TREM-1 que é induzida por um ligante de TREM-1. 0 TREM-1 pode ser TREM-1 humano e/ou TREM-1 de outra espécie diferente de um humano, como TREM-1 de outro primata diferente de um humano.

Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para competir com mAb 0170 para se ligarem ao TREM-1 humano, conforme definido nas reivindicações. Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para se ligarem especificamente a um polipéptido que compreende os aminoácidos D38 a F48 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) . Os anticorpos da invenção têm um epítopo que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todos os resíduos de aminoácido selecionados a partir do grupo que consiste em D38, V3x, K40, C41, D42, Y43, T44 e L4® de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) e um, dois ou todos os resíduos de aminoácido selecionados a partir do grupo que consiste em E46, K4 7 e F4 8 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) , conforme pode ser determinado com a utilização de HX-MS. Os anticorpos da invenção podem ter um epítopo que compreende um, dois, três ou todos os resíduos de aminoácido selecionados a partir do grupo que consiste em D42, E4 6, Dx2 e Hx3 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) , pode ser determinado ao medir o anticorpo que se liga a variantes de TREM-1.

Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para competir com mAb 0170 para se ligar ao TREM-1 de macaco cinomolgo, conforme definido nas reivindicações. Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para se ligarem especificamente a um polipéptido que compreende aminoácidos Elx a L26 de TREM-1 de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 12), ou os aminoácidos correspondentes de SEQ ID NO: 21, conforme pode ser determinado com a utilização de HX-MS.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados como produtos farmacêuticos para o tratamento de indivíduos com uma ou mais doenças autoimunes e/ou inflamação crónica.

Então, a presente invenção também fornece o anticorpo ou fragmento do mesmo conforme definido nas reivindicações para utilização como um medicamento; como para utilização no tratamento de indivíduos com uma ou mais doenças autoimunes e/ou inflamação crónica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Ativação da linhagem celular BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ (também denominada no presente documento da "célula repórter BWZ/hTREM-1") é reduzida por anticorpos como 14F128 e 14F113, mas não pelos anticorpos MAB1278 comercialmente disponíveis (RÍD Systems, Minneapolis, MN ®®413, EUA: Cat. No. MAB1278), anti-TREM-1 HPA (Sigma, EUA: Cat. No. HPA00®®63) , aTREM2 6 (Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA: Cat. No. 314x02) e aTREM37 (Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA: Cat. No. 316102).

Figura 2: A célula repórter BWZ/hTREM-1 independente ou co-cultivada com neutrófilos pré-estimulados por TLRL. Os neutrófilos ativados por TLRL podem induzir um aumento de 1® vezes no sinal (luminescência) em comparação aos neutrófilos não ativados (veja-se as últimas duas colunas). 0 controlo positivo (o agonista MAB1278 ligado à placa (RÍD Systems, Minneapolis, MN ®®413, EUA: Cat. no. MAB1278) gerou uma indução de 32 vezes nessa experiência (veja-se a segunda coluna). Os dados são representados graficamente como média + SEM (n = 3). Figura 3: Um ensaio repórter normalizado, no qual TREM-1 é estimulado por neutrófilos ativados por PGN, mostra que os anticorpos TREM-26 comercialmente disponíveis (cat. no. 314x02, Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA), TREM-37 (cat. no 316102, Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA), MAB1278 (cat. no MAB1278, RÍD Systems, Minneapolis, MN ®®413, EUA), e anti-TREM-1 HPA (cat. no HPA00®®63, Sigma, St Louis, MO, EUA) são anticorpos agonistas que acentuam o sinal de luminescência dependente de TREM-1 no ensaio repórter (que gera um sinal maior que 1) . 0 anticorpo identificado como ®F27A1 e 14F6x são demonstrados como o melhor bloqueador (que obtém um sinal menor que 0,®). Os dados são representados graficamente como média ± SEM (n = 3) . MAB002 de controlo de isótipo (cat. no. ΜΆΒ002, RÍD Systems, Minneapolis, MN ®®413, EUA). Todos os anticorpos foram utilizados em 1 pg/mL.

Figura 4: Atividade no ensaio repórter BWZ/hTREM-1. No eixo geométrico x, a atividade de bloqueio TREM-1 é mostrada como a atividade que permaneceu quando 0,2 pg/mL de anticorpo foram adicionados à célula repórter BWZ/hTREM-1 que foi pré-ativada com neutrófilos estimulados por PGN. Quando os anticorpos de TREM-1 foram ligados à placa, alguns dos mesmos (incluindo todos os anticorpos de TREM-1 comercialmente disponíveis) puderam ligar de modo cruzado TREM-1 e ativar, assim, TREM-1. Esta atividade é mostrada no eixo geométrico y. Deste modo, os anticorpos mostrados como pontos na caixa no canto esquerdo inferior mostram todas as propriedades diferentes em comparação a anticorpos conhecidos, sendo de bloqueio de modo vantajoso e não agonista.

Figura ®: Ligação de anticorpos de TREM-1 humano a PBMCs de um macaco Rhesus. No canto esquerdo superior, é mostrado que a maioria dos anticorpos apenas se liga a TREM-1 humano (cada ponto preto representa um anticorpo). Alguns anticorpos, como mAbs 002® e 14F128, 14F11, 14F2x, 14F113 e 14F6x, puderam ligar-se tanto a TREM-1 humano, quanto a TREM-1 de macaco Rhesus, mostrando reatividade cruzada.

Figura 6: Ligação de anticorpos de TREM-1 anti-humano a PBMCs de um macaco cinomolgo. No canto esquerdo superior, é mostrado que a maioria dos anticorpos apenas se liga a TREM-1 humano (cada ponto preto representa um anticorpo). Some anticorpos, como mAb 002® e 14F128, 14F11, 14F2x puderam ligar-se tanto a TREM-1 humano quanto de macaco cinomolgo, o que mostra reatividade cruzada. Alguns anticorpos, como 14F6x (mAb 0044), podem ligar PBMCs de macaco cinomolgo (Figura 6B) e PBMCs humanos (Figura 6C) igualmente de modo satisfatório.

Figura 7: Cobertura de sequência de péptidos analisados HX de hTREM-1 na presença e ausência de mAb 0023 ou mAb 0026 (A) , mAb 0024 ou Biolegend Clone 26 (B) , mAb 002® (C) ou MAB1278 de RnD Biosystems' (D) . A sequência primária é exibida acima dos péptidos analisados HX (mostrado como barras horizontais). Os péptidos que mostram padrões de permuta ssemelhantes tanto na presença quanto ausência de mAbs são exibidos em branco, enquanto os péptidos que mostram uma incorporação de deutério reduzido mediante ligação de mAb são coloridas em preto. As regiões de sequência em caixa definem o epítopo.

Figura 8: Mapeamento estrutural do epítopo de mAb 002® em hTREM-1. A estrutura de hTREM-1 (pdb 1Q8M) é representada com uma parte do dímero como black C-alpha wire. A outra parte do dímero hTREM-1 ê mostrada em laço cinza com o epítopo 002® exibido em preto.

Figura x: A célula repórter BWZ/hTREM-1 co-cultivada com complexo d ligante de TREM-1 reflete a funcionalidade de TREM-1 que foi feita de modo dependente de dose inibida por TREM-1 mAb - 0170.

Figura 10: A libertação de TNFalfa de macrófagos M2 estimulada por PGLYRP-1 foi bloqueada por anticorpos de TREM-1.

Figura 11: As sequências de TREM-1 humano e de macaco cinomolgo são alinhadas. Os resíduos de aminoãcido que diferem entre os dois são mostrados a negrito. Os resíduos que foram mostrados dentro do epítopo (conforme determinado com utilização de HX-MS e ressonância de plasmão de superfície) são destacados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 representa a sequência de aminoãcidos de TREM-1 humano do tipo selvagem (wt). SEQ ID NO: 2 representa a sequência de aminoãcidos da cadeia pesada variável do anticorpo ml4F6x. SEQ ID NO: 3 representa a sequência de aminoácidos da cadeia leve variável do anticorpo ml4F6x, SEQ ID NO: 4 representa a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de um primeiro anticorpo de TREM-1 humanizado (tnAb 0170) . SEQ ID NO: ® representa a sequência de aminoácidos da cadeia leve de um primeiro anticorpo de TREM-1 humanizado (mAb 0170) . SEQ ID NO: 6 representa a sequência de aminoãcidos da cadeia pesada de um segundo anticorpo de TREM-1 humanizado (mAb 0122). SEQ ID NO: 7 representa a sequência de aminoãcidos da cadeia leve de um segundo anticorpo de TREM-1 humanizado (mAb 0122). SEQ ID NO: 8 representa a sequência de aminoãcidos da cadeia pesada do anticorpo ml4F128. SEQ ID NO: x representa a sequência de aminoãcidos da cadeia leve do anticorpo ml4F128. SEQ ID NO: 10 representa a sequência de aminoãcidos da cadeia pesada do anticorpo ml4F113. SEQ ID NO: 11 representa a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo ml4F113. SEQ ID NO: 12 representa a sequência de aminoãcidos do domínio extracelular do macaco cinomolgo do tipo selvagem (wt) (c) TREM-1, quando expresso em E. coli. SEQ ID NO: 13 representa a sequência de aminoácidos de K20A-hTREM-l-Cmyc2-His6 (construto 0222). SEQ ID NO: 14 representa a sequência de aminoãcidos de A24T/ Y28F/ N30S/ R32Q/ P70H-CTREM-1-Cmyc2-His6 (construto 0244) . SEQ ID NO: 1® representa a sequência de aminoãcidos de A24T/Y2 8F/N3 0S/ R32Q/E®4K-cTREM-1-Cmyc2-His6 (construto 024®). SEQ ID NO: 16 representa a sequência de ácido nucleico de um iniciador. SEQ ID NO: 17 representa a sequência de ácido nucleico de um iniciador. SEQ ID NO: 18 representa a sequência de aminoácidos de TREM-1(1-134)-His 6 humano (h). SEQ ID NO: lx representa a sequência de aminoácidos de cTREM-1-Cmyc2-His6 (construto 0238) . SEQ ID NO: 2 0 representa a sequência de aminoácidos de hTREM-1-Cmyc2-His6 (construto 0247) . SEQ ID NO: 21 representa a sequência de aminoácidos de cTREM-1 de comprimento completo. SEQ ID NO: 22 representa a sequência de aminoácidos de TREM-1 murino (m) de comprimento completo. SEQ ID NO: 23 representa a sequência de aminoácidos de hPGLYRPl de comprimento completo. iLvJyll Μ V JtC JL IjtAv TREM-1 é uma proteína transmembranar que consiste em 234 aminoácidos, incluindo um domínio de i munog1obu1ina extracelular único e uma cauda citoplásmica curta sem nenhum motivo de sinalização evidente. Quando ativado, o TREM-lassocia-se à proteína adaptadora de sinalização que contém ITAM, DAP12. A sinalização a jusante pode incluir a ativação do fator de transcrição NFAT, o que causa uma regulação de modo ascendente de produção de citosina pró-inflamatória . A presente invenção refere-s aos anticorpos, conforme definido nas reivindicações, que têm capacidade para se ligar especificamente e bloquear a função de TREM-1. Os anticorpos da invenção podem bloquear a função de TREM-1 reduzindo/bloqueando-se a ativação de TREM-1 e a sinalização a jusante.

Os anticorpos, de acordo com a invenção, podem bloquear TREM-1 por meio de um ou uma combinação de diversos mecanismos diferentes que bloqueiam TREM-1 direta ou indiretamente. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem impedir o ligante natural de TREM-1, proteína de reconhecimento de peptidoglicano 1 (PGLYRP1), de criar um complexo funcional com TREM-1 e/ou anticorpos da invenção podem bloquear TREM-1 impedindo-se que moléculas TREM-1 individuais formem dímeros ou multímeros. A dimerização ou multimerização TREM-1 pode ser reduzida ou impedida por anticorpos de TREM-1 que têm capacidade para se ligar a uma porção de TREM-1 que residiria de outro modo na interface de um dímero TREM-1, impedindo, desse modo, que as moléculas de TREM-1 individuais se associem entre si. A dimerização ou multimerização de TREM-1 pode ser reduzida ou impedida por anticorpos de TREM-1 que interferem com a interação de TREM-1 com seu ligante. Os anticorpos, de acordo com a presente invenção, bloqueiam a ativação induzida por PGLYRP1 de TREM-1. PGLYRP1, uma proteína de 1x6 aminoãcidos de comprimento altamente conservada, que consiste num péptido sinal e um domínio de ligação de peptidoglicano é expressa em neutrófilos e libertada mediante a sua ativação. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem regular, de modo descendente, a libertação de citosina pró-inflamatória de células mieloides. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem bloquear a libertação de TNFalfa, MIP-lbeta, MCP-1, IL-lbeta, GM.CSF, IL-6 e/ou IL-8 de macrófagos, neutrófilos, células de tecido sinovial e/ou uma célula repórter, conforme divulgado no presente documento.

Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para se ligarem tanto a TREM-1 humano quanto a TREM-1 de outra espécie diferente de um ser humano. 0 termo "TREM-1", conforme utilizado no presente documento, abrange, desse modo, qualquer forma de ocorrência natural de TREM-1 que pode ser derivada de qualquer organismo adequado. Por exemplo, TREM-1, para utilização conforme descrita no presente documento, pode ser TREM-1 de vertebrado, como TREM-1 de mamífero, como TREM-1 de um primata (como um humano, um chimpanzé, um macaco cinomolgo ou um macaco Rhesus); um roedor (como um ratinho ou um rato), um lagomorfo (como um coelho), ou um artiodãtilo (como uma vaca, ovelha, porco ou camelo). De preferência, o TREM-1 é SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) . 0 TREM-1 pode ser uma forma madura de TREM-1, como uma proteína TREM-1 que foi submetida ao processamento pós-tradução dentro de uma célula adequada. Tal proteína TREM-1 madura pode, por exemplo, ser glicosilada. 0 TREM-1 pode ser uma proteína de TREM-1 de comprimento completo.

Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos monoclonais, no sentido de que são direta ou indiretamente derivados de um clone único de um linfócito B. Os anticorpos de TREM-1 podem ser produzidos, triados e purificados com a utilização, por exemplo, dos métodos descritos nos Exemplos. Brevemente, um ratinho adequado, como um ratinho knock-out (KO) de TREM-1 ou TREM-1/TREM-3 pode ser imunizado com TREM-1, uma célula que expressa TREM-1 ou uma combinação de ambos.

Os anticorpos da invenção podem ser policlonais no sentido de serem uma mistura de anticorpos monoclonais, de acordo com a presente invenção. A triagem primária de sobrenadantes de hibridoma pode ser realizada com utilização de ELISA direta ou FMAT e a triagem secundária pode ser realizada com utilização de citometria de fluxo. Os sobrenadantes de hibridoma positivos podem, então, ser triados num ensaio de gene repórter.

Os anticorpos podem ser expressos de modo recombinante em células procarióticas ou eucarióticas. A célula procariótica pode ser E. coli. A célula eucariótica pode ser uma célula de levedura, inseto ou mamífero, como uma célula derivada de um organismo que é um primata (como um ser humano, um chimpanzé, um macaco cinomolgo ou um macaco Rhesus), um roedor (como um ratinho ou um rato), um lagomorfo (como um coelho) ou um artiodátilo (como uma vaca, ovelha, porco ou camelo). As linhagens celulares de mamífero incluem, mas sem limitação, células HEK2x3, células CHO e células HELA. Os anticorpos de TREM-1 também podem ser produzidos por meio de outros métodos conhecidos por o perito na especialidade, como uma exibição de fago ou uma exibição de levedura.

Uma vez produzidos, os anticorpos podem ser triados para se ligarem, por exemplo, a TREM-1 de comprimento completo ou mutantes do mesmo com utilização dos métodos descritos nos Exemplos. A memória descritiva revela um método para identificar um anticorpo de TREM-1 funcional. Os anticorpos que têm capacidade para se ligarem especificamente a TREM-1 e que têm qualquer efeito mediante ativação de TREM-1 e sinalização a jusante são denominados, no presente documento, "anticorpos de TREM-1 funcional". Um anticorpo de TREM-1 "funcional" refere-se, no presente documento, a um anticorpo que tem capacidade para bloquear ou estimular TREM-1. 0 método para identificar um anticorpo de TREM-1 funcional compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula quando a referida célula é incubada com um agente modificador de TREM-1; (c) colocar em contacto a co-cultura de (b) com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula é menor ou maior que a atividade medida em (b) . A "primeira célula" de (a) pode ser uma célula de origem hematopoiética, como uma célula mieloide, como uma célula T. A proteína de sinalização de (a) pode ser qualquer proteína de sinalização que tem capacidade para formar um complexo com TREM-1. As proteínas de sinalização adequadas incluem DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gama RIII e um recetor Fc ou parte das mesmas. O construto repórter de (a) pode ser qualquer construto que tenha capacidade para ser ativado por meio da proteína de sinalização e gerar um sinal reconhecível. Os construtos de repórter adequados compreendem um fator de transcrição e um gene repórter. A proteína de sinalização pode sinalizar por meio de um fator de transcrição selecionado a partir do grupo que consiste NFAT e NFkB. 0 gene repórter é um gene que não é expresso de modo nativo na referida primeira célula e pode ser um gene que codifica β-galactosidase, luciferase, proteína fluorescente verde (GFP) ou cloranfenicol transferase. A referida primeira célula pode ser transfetada com um fator de transcrição e um gene repórter que utiliza métodos que são bem conhecidos na técnica. A "célula repórter BWZ/hTREM-1" descrita nos Exemplos ê um exemplo de uma "primeira célula". 0 agente modificador de (b) pode ser um ligante de TREM-1 ou um neutrófilo ativado. 0 "anticorpo de TREM-1" de (c) pode ser um hibridoma específico de TREM-1 sobrenadante ou um anticorpo purificado. A atividade medida em (d) é o sinal produzido pelo construto repórter. Um exemplo de tal sinalização é a luminescência causada por produção de LacZ β-lactamase luciferase acionada por NFAT. 0 método pode ser adaptado para identificar um anticorpo de TREM-1 de bloqueio. 0 método para identificar um anticorpo de TREM-1 de bloqueio compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula quando a referida célula é incubada com um neutrófilo ativado; (c) colocar em contacto a co-cultura da primeira célula e o neutrófilo ativado com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula é menor que a atividade medida em (b). 0 método também pode ser adaptado à medida para identificar um anticorpo de TREM-1 de estímulo. 0 método para identificar um anticorpo de TREM-1 de estímulo compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula; (c) colocar em contacto/incubar a referida célula com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula seja maior que a atividade medida em (b). A presente invenção refere-se aos anticorpos de TREM-1 de bloqueio, conforme definido nas reivindicações, que podem ser identificados por meio do método, divulgado no presente documento, para identificar um anticorpo de bloqueio. Quando testado com a utilização do método descrito acima e nos Exemplos, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode, numa concentração menor que 100 pg/mL - como menor que xO pg/mL, como menor que 80 pg/mL, como menor que 70 pg/mL, como menor que 60 pg/mL, como menor que ®0 pg/mL, como menor que 40 pg/mL, como menor que 30 pg/mL, como menor que 20 pg/mL, como menor que 10 pg/mL, como menor que ® pg/mL, como menor que 1 pg/mL - ter a capacidade para reduzir a atividade da referida primeira célula por ®0%, como 60%, como 70%, como 80%, como x0%, como x®%, como 100%. Um anticorpo de acordo com a invenção pode ter capacidade para extinguir completamente a atividade da primeira célula. Quando testado com a utilização do método descrito acima e nos Exemplos, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode, numa concentração menor que 1 pg/mL - como menor que 0,x pg/mL, como menor que 0,8 pg/mL, como menor que 0,7 pg/mL, como menor que 0,6 pg/mL, como menor que 0,® pg/mL, como menor que 0,4 pg/mL, como menor que 0,3 pg/mL, como menor que 0,2 pg/mL - ter a capacidade para extinguir a atividade da primeira célula. A presente invenção também se refere aos anticorpos de TREM-1 de bloqueio, conforme definido nas reivindicações, que podem ser identificados por meios diferentes do método divulgado no presente documento. 0 termo êanticorpoê no presente documento refere-se a uma proteína, derivada de uma sequência de imunog1obu1ina de linha germinal, a qual tem capacidade para se ligar especificamente a um antigénio (TREM-1) ou uma porção do mesmo. 0 termo inclui os anticorpos de comprimento completo de qualquer classe ou isótipo (isto é, IgA, IgE, IgG, IgM e./ou IgY) e qualquer cadeia única ou fragmento dos mesmos. Um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio, ou porção do mesmo pode ligar-se exclusivamente àquele antigénio, ou porção do mesmo, ou pode ligar-se a um número limitado de antigénios homólogos, ou porções dos mesmos. Os anticorpos de comprimento completo compreendem normalmente, pelo menos, quatro cadeias de polipéptido: duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) que são interligadas por ligações dissulfeto. Uma subclasse de imunog1obulina de interesse farmacêutico particular é a família IgG. Em seres humanos, a classe IgG pode ser subdividida em 4 subclasses: IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, com base na sequência das suas regiões constantes de cadeia pesada. As cadeias leves podem ser divididas em dois tipos, kappa e lambda, com base nas diferenças na sua composição de sequência. As moléculas de IgG são compostas por duas cadeias pesadas, interligadas por duas ou mais ligações dissulfeto e duas cadeias leves, cada uma ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto. Uma cadeia pesada pode compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) e até três regiões constantes de cadeia pesada (CH) : CHI, CH2 e CH3. A cadeia leve pode compreender uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), interdispersas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR) .

As regiões VH e VL são tipicamente compostas por três CDRs e quatro FRs, dispostas de terminal amino até terminal carboxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves formam um domínio [de ligação] que tem capacidade para interagir com um antigénio, enquanto a região constante de um anticorpo pode mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo, mas sem limitação, várias células do sistema imunitário (células efetoras), recetores Fc e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

Os anticorpos da presente invenção podem ser isolados. 0 termo "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que foi separado e/ou recuperado de (um) outro componente (ou componentes) no ambiente no qual foi produzido e/ou que foi purificado a partir de uma mistura de componentes presente no ambiente no qual foi produzida.

Certos fragmentos de ligação de antigénio de anticorpos podem ser adequados no contexto da presente invenção, conforme foi mostrado que a função de ligação de antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. 0 termo "fragmento de ligação de antigénio" de um anticorpo refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade para se ligar especificamente a um antigénio, como TREM-1, conforme descrito no presente documento. Exemplos de fragmentos de ligação de antigénio incluem Fab, Fab' , F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (tipicamente os domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo) , Fv de cadeia única (scFv; veja-se, por exemplo, Bird et al. , Science 1x88; 242:42® a 426 ; e Huston et al. PNAS 1x88; 8®:®87x a ®883), dsFv, Fd (tipicamente, o domínio VH e CHI) , e fragmentos dAb (tipicamente, um domínio VH) ; domínios VH, VL, VhH, e V-NAR; moléculas monovalentes que compreendem uma cadeia VH única e uma cadeia VL única; minicorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e corpos kappa (veja-se, por exemplo, III et al., Protein Eng Ixx7;10:x4x a x®7); IgG de camelo; IgNAR; assim como uma ou mais CDRs isoladas ou um parãtopo funcional, em que as CDRs isoladas ou resíduos de ligação de antigénio ou polipéptidos podem ser associados ou ligados, de modo a formar um fragmento de anticorpo funcional. Vários tipos de fragmentos de anticorpo foram descritos ou revistos em, por exemplo, Holliger e Hudson, Nat Biotechnol 200®;25:1126 a 1136 ; documento n° WO2Q0®Q4021x, e Pedidos de Patentes publicados n-200®0238646 e 20020161201. Esses fragmentos de anticorpo podem ser obtidos com a utilização de técnicas convencionais conhecidas por aqueles peritos na especialidade, e os fragmentos podem ser triados para utilidade da mesma maneira que anticorpos intactos.

Um anticorpo da invenção, conforme definido nas reivindicações, pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. 0 termo "anticorpo humano", conforme utilizado no presente documento, é destinado a incluir anticorpos que têm regiões variáveis nas quais pelo menos uma porção de uma região de estrutura e/ou pelo menos uma porção de uma região CDR são derivadas de sequências de imunog1obu1ina de linha germinal humana. (Por exemplo, um anticorpo humano pode ter regiões variáveis nas quais tanto a estrutura quanto as regiões CDR são derivadas de sequências de imunog1obulina de linha germinal humana.) Adicionalmente, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou de lócus específico in vitro ou por mutação somática in vivo).

Tal anticorpo humano pode ser um anticorpo monoclonal humano. Tal anticorpo monoclonal humano pode ser produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgénico, por exemplo, um ratinho transgénico, que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

Os anticorpos humanos podem ser isolados das bibliotecas de sequência construídas em seleções de sequências germinais de linha humana, adicionalmente diversificadas com diversidade de sequência natural e sintética.

Os anticorpos humanos podem ser preparados por imunização in vitro de linfócitos humanos seguidos por transformação dos linfócitos com vírus Epstein-Barr. 0 termo "derivado de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, como um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. 0 termo "anticorpo humanizado", conforme utilizado no presente documento, refere-se a um anticorpo quimérico humano/não humano que contém uma ou mais sequências (regiões CDR ou partes da mesma) que são derivadas de uma imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado é, desse modo, uma imunoglobulina humana (anticorpo recipiente) na qual pelo menos resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de um anticorpo de uma espécie não humana (anticorpo dador) como de um ratinho, rato, coelho ou primata não humano, o qual tem uma especificidade, afinidade, composição de sequência e funcionalidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Um exemplo de tal modificação é a introdução de uma ou mais chamadas mutações reversas, que são tipicamente resíduos de aminoácido derivados do anticorpo dador. A humanização de um anticorpo pode ser executada com a utilização de técnicas recombinantes conhecidas pelo perito na especialidade (veja-se, por exemplo, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, volume 248, editado por Benny K. C. Lo) . Uma estrutura recipiente humana adequada tanto para o domínio de cadeia leve quanto de cadeia pesada pode ser identificada, por exemplo, por homologia sequência ou estrutural. Alternativamente, as estruturas recipientes fixas podem ser utilizadas, por exemplo, com base no conhecimento de estrutura, propriedades biofísicas e bioquímicas. As estruturas recipientes podem ser derivadas de linha germinal ou derivadas de uma sequência de anticorpo maduro. As regiões CDR do anticorpo dador podem ser transferidas por enxerto CDR. 0 anticorpo humanizado enxertado CDR pode ser adicionalmente otimizado por, por exemplo, afinidade, funcionalidade e propriedades biofísicas por identificação de posições de estrutura críticas em que a reintrodução (mutação reversa) do resíduo de aminoãcido do anticorpo dador tem impacto benéfico nas propriedades do anticorpo humanizado. Além das mutações reversas derivadas de anticorpo dador, o anticorpo humanizado pode ser projetado por introdução de resíduos de linha germinal nas regiões CDR ou de estrutura, eliminação de epítopos imunogénicos, mutagénese sítio-dirigida, maturação de afinidade, etc.

Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo dador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho de anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá pelo menos um - tipicamente dois - domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e nas quais todos ou substancialmente todos os resíduos FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também pode, opcionalmente, compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. 0 termo "derivado de anticorpo humanizado" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humanizado, como um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. 0 termo "anticorpo quimérico", conforme utilizado no presente documento, refere-se a um anticorpo cujos genes de cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente por modificação genética, de genes de região variável e constante de imunoglobulina que têm origem em espécies diferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis de genes de um anticorpo monoclonal de ratinho podem ser unidos a segmentos constantes humanos. A região cristalizável de fragmento ("região Fc"/"domínio Fc") d um anticorpo é a região N-terminal de um anticorpo, a qual compreende os domínios CH2 e CH3 constantes. 0 domínio Fc pode interagir com recetores de superfície de célula chamados recetores Fc, assim como algumas proteínas do sistema de complemento. A região Fc possibilita que anticorpos interajam com o sistema imunitário. Em um aspeto da invenção, anticorpos, conforme definido nas reivindicações, podem ser projetados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais das suas propriedades funcionais, como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação de recetor Fc, estabilidade de proteína e/ou citotoxicidade celular dependente de antigénio, ou a falta da mesma, entre outros. Adicionalmente, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar a sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Um anticorpo IgGl pode portar um domínio Fc modificado que compreende uma ou mais e talvez todas as mutações seguints que resultarão na afinidade diminuída para certos recetores Fc (L234A, L23®E, e G237A) e em fixação de complemento mediada por Clq reduzida (A330S e P331S) , respetivamente (numeração de resíduo de acordo com o índice EU). 0 isótipo de um anticorpo da invenção pode ser IgG, como IgGl, como IgG2, como IgG4. Se desejado, a classe de um anticorpo pode ser "trocada" por técnicas conhecidas. Por exemplo, um anticorpo que foi originalmente produzido como uma molécula de IgM pode ser trocado de classe para um anticorpo IgG. As técnicas de troca de classe também podem ser utilizadas para converter uma subclasse de IgG para outra, por exemplo: de IgGl para IgG2 ou IgG4; de IgG2 para IgGl ou IgG4; ou de IgG4 para IgGl ou IgG2. A projeção de anticorpos para gerar moléculas quiméricas de região constante, por combinação de regiões de subclasses de IgG diferentes, também pode ser realizada.

Em uma forma de realização, a região de articulação de CHI é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de articulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é descrita adicionalmente, por exemplo, Patente n2 U.S. ®.677.42® por Bodmer et al. A região constante pode ser modificada para estabilizar o anticorpo, por exemplo, para reduzir o risco de um anticorpo bivalente que se separa em dois fragmentos VH-VL monovalentes. Por exemplo, numa região constante IgG4, resíduo S228 (numeração de resíduo de acordo com o índice EU) pode sofrer uma mutação num resíduo de prolina (P) para estabilizar a formação de ponte de dissulfeto de cadeia pesada intermediária na articulação (veja-se, por exemplo, Angal et al. , Mol Immunol, lxx® ,· 30: 10® a 108) .

Os anticorpos ou fragmentos dos mesmos também podem ser definidos em termos das suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs). 0 termo "região determinante de complementaridadeê ou êregião hipervariávelê, quando utilizado no presente documento, refere-se às regiões de um anticorpo nas quais os resíduos de aminoãcido envolvidos na ligação de antigénio são situados. A região de hipervariabilidade ou CDRs pode ser identificada como as regiões com a variabilidade mais alta em alinhamentos de aminoãcido de domínios variáveis de anticorpo. Os bancos de dados podem ser utilizados para identificação de CDR, como o banco de dados Kabat, sendo que as CDRs são, por exemplo, definidas como compreendendo resíduos de aminoãcido 24 a 34 (LI) , ®0 a ®6 (L2) e 8x a x7 (L3) do domínio variável de cadeia leve e 31 a 3® (Hl), ®0 a 6® (H2) e x® a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; (Kabat et al. (Ixxl) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH n£ xl a 3242) . Alternativamente, CDRs podem ser definidos como aqueles resíduos de um êlaço hipervariávelê (resíduos 26 a 33 (LI) , ®0 a ®2 (L2) e xl a x6 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (Hl), ®3 a ®® (H2) e x6 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol 1x87; 1x6: xOl a xl7). Tipicamente, a numeração de resíduos de aminoácido nessa região é realizada pelo método descrito em Kabat et al., supra. As expressões como êposição Kabatê, êresíduo Kabatê e êde acordo com Kabatê no presente documento referem-se a esse sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve. Com a utilização do sistema de numeração Kabat, a sequS n<ia de aminoácidos linear real de um péptido pode conter menos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento, ou inserção, de uma estrutura (FR) ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir inserções de aminoácido (resíduo ®2a, ®2b e ®2c, de acordo com Kabat) após o resíduo ®2 d CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c, etc., de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat "padrão". 0 termo "região de estrutura" ou resíduos "FR" referem-se àqueles resíduos de aminoácido VH ou VL que não estão dentro das CDRs, conforme definido no presente documento. 0 anticorpo ml4F6x tem uma sequência de cadeia pesada variável, conforme mostrado em SEQ ID NO: 2 e uma sequência de cadeia leve variável, conforme mostrado em SEQ ID NO: 3. Um anticorpo da invenção pode compreender essa sequência de cadeia pesada variável e/ou essa sequência de cadeia leve variável. 0 anticorpo ml4F6x tem as sequências CDR mostradas nos aminoácidos 31 a 3®, ®0 a 68 e 101 a 110 de SEQ ID NO: 2 e aminoácidos 24 a 38, ®4 a 60 e x3 a 101 de SEQ ID NO: 3. Um anticorpo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, ® ou todas as 6 sequências CDR. Um anticorpo da invenção pode compreender aminoácidos 101 a 110 de SEQ ID NO: 2 . A cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDR1 de aminoácidos 31 a 3® (TYAMH) de SEQ ID NO: 2, em que um desses aminoácidos pode ser substituído por um aminoácido diferente. A cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDR2 de aminoácidos ®0 a 68 (RIRTKSSNYATYYADSVKd) de SEQ ID NO: 2, em que um, dois ou três desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. A cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDR3 de aminoácidos 101 a 110 (DMGQRRQFAY) de SEQ ID NO: 2, em que um, dois ou três desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. A cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDR1 de aminoãcidos 24 a 38 (RASESVDTFDYSFLH) de SEQ ID NO: 3, em que um, dois ou três desses aminoácidos pode ser substituído por um aminoácido diferente. A cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDR2 de aminoácidos ®4 a 60 (RASNLES) de SEQ ID NO: 3, em que um ou dois desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. A cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDR3 de aminoácidos x3 a 101 (QQSNEDPYT) de SEQ ID NO: 3, em que um ou dois desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. 0 anticorpo mAb 0170 tem uma sequência de cadeia pesada conforme mostrado em SEQ ID NO: 4 e uma sequência de cadeia leve conforme mostrado em SEQ ID NO: ®. Um anticorpo da invenção pode compreender essa sequência de cadeia pesada e/ou essa sequência de cadeia leve. 0 anticorpo mAb 0170 tem as sequências CDR mostradas nos aminoácidos 31 a 3®, ®0 a 68 e 101 a 110 de SEQ ID NO: 4 e aminoácidos 24 a 38, ®4 a 60 e x3 a 101 de SEQ ID NO: ®. Um anticorpo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, ® ou todas as 6 sequências CDR. 0 anticorpo mAb 0122 tem uma sequência de cadeia pesada conforme mostrado em SEQ ID NO: 6 e uma sequência de cadeia leve conforme mostrado em SEQ ID NO: 7. Um anticorpo da divulgação pode compreender essa sequência de cadeia pesada e/ou essa sequência de cadeia leve. 0 anticorpo mAb 0122 tem as sequências CDR mostradas nos aminoácidos 31 a 3®, ®0 a 68 e 101 a 110 de SEQ ID NO: 6 e aminoácidos 24 a 38, ®4 a 60 e x3 a 101 de SEQ ID NO: 7. Um anticorpo da divulgação pode compreender 1, 2, 3, 4, ® ou todas as 6 sequências CDR. A cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDRH1 de aminoácidos 31 a 3® (TYAMH) de SEQ ID NO: 4, em que um desses aminoácidos pode ser substituído por um resíduo de aminoãcido diferente. A cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDRH2 de aminoácidos ®0 a 68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG) de SEQ ID NO: 4, em que um, dois ou três desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. A cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDRH3 de aminoácidos 101 a 110 (DMGIRRQFAY) de SEQ ID NO: 4, em que um, dois ou três desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. A cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a divulgação pode compreender uma sequência CDRH3 de aminoácidos 101 a 110 (DMGQRRQFAY) de SEQ ID NO: 6, em que um, dois ou três desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. A cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDRL1 de aminoácidos 24 a 38 (RASESVDTFDYSFLH) de SEQ ID NO: ®, em que um, dois OU três desses aminoácidos pode ser substituído por um aminoácido diferente. A cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDRL2 de aminoácidos ®4 a 60 (RASNLES) de SEQ ID NO: ®, em que um ou dois desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. A cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção pode compreender uma sequência CDRL3 de aminoácidos x3 a 101 (QQSNEDPYT) de SEQ ID NO: ®, em que um ou dois desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. 0 anticorpo ml4F128 tem uma cadeia pesada conforme mostrado em SEQ ID NO: 8 e uma cadeia leve conforme mostrado em SEQ ID NO: x. Um anticorpo da invenção pode compreender essa sequência de cadeia pesada variável e/ou essa sequência de cadeia leve variável. 0 anticorpo ml4F128 tem as sequências CDR mostradas nos aminoácidos 31 a 3®, ®0 a 68 e 101 a 110 de SEQ ID NO: 8 e aminoácidos 24 a 38, ®4 a 60 e x3 a 101 de SEQ ID NO: x. Um anticorpo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, ® ou todas as 6 sequências CDR. 0 anticorpo ml4F113 tem uma cadeia pesada conforme mostrado em SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve conforme mostrado em SEQ ID NO: 11. Um anticorpo da invenção pode compreender essa sequência de cadeia pesada variável e/ou essa sequência de cadeia leve variável. O anticorpo ml4F113 tem as sequências CDR mostradas nos aminoácidos 31 a 3®, ®0 a 68 e 101 a 110 de SEQ ID NO: 10 e aminoácidos 24 a 38, ®4 a 60 e x3 a 101 de SEQ ID NO: 11. Um anticorpo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, ® ou todas as 6 sequências CDR. Um anticorpo da invenção pode compreender aminoácidos 101 a 110 de SEQ ID NO: 10. 0 termo "antigénio" (Ag) refere-se à entidade molecular utilizada para imunização de um vertebrado imunocompetente para produzir o anticorpo (Ab) que reconhece o Ag. No presente documento, Ag é denominado mais amplamente e é geralmente destinado a incluir moléculas-alvo que são especificamente reconhecidas pelo Ab, incluindo, desse modo, fragmentos ou simulações da molécula utilizada no processo de imunização, ou outro processo, por exemplo, exibição de fago, utilizado para gerar o Ab. 0 termo "epítopo", conforme utilizado no presente documento, é definido no contexto de uma interação molecular entre um "polipéptido de ligação de antigénio", como um anticorpo (Ab) e seu antigénio correspondente (Ag).

Geralmente, êepítopoê refere-se à área ou região num Ag à qual um Ab se liga especificamente, isto é, à área ou região em contacto físico com o Ab. 0 contacto físico pode ser definido através de vários critérios (por exemplo, um corte de distância de 2 a 6Ã, como 3Â, como 4 Ã, como ®Â; ou acessibilidade de solvente) para átomos nas moléculas Ab e Ag. Um epítopo de proteína pode compreender resíduos de aminoácido no Ag que estão diretamente envolvidos na ligação a um Ab (também chamado de componente imunodominante do epítopo) e outros resíduos de aminoácido, os quais não estão diretamente envolvidos na ligação, como resíduos de aminoácido do Ag que são bloqueados de modo eficaz pelo Ab, isto é, resíduos de aminoácido na êsuperfície excluída por solventeê e/ou a êpegadaê do Ab. 0 termo epítopo no presente documento compreende ambos os tipos de região de ligação em qualquer região particular de TREM -1 que se liga especif icamente a um anticorpo de TREM-1. TREM-1 pode compreender vários epítopos diferentes, que podem incluir, sem limitação, epítopos conformacionais que consistem em um ou mais aminoácidos não contíguos localizados próximos entre si na conformação de TREM-1 maduro e epítopos pós-tradução que consistem, por inteiro ou em parte, em estruturas moleculares covalentemente ligadas ao TREM-1, como grupos de hidrato de carbono. 0 epítopo para um dado par de anticorpo (Ab)/antigénio (Ag) pode ser descrito e caracterizado em níveis diferentes de detalhe com a utilização de uma variedade de métodos de mapeamento de epítopo experimental e computacional. Os métodos experimentais incluem mutagénese, cristalografia de raio X, espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR), Espectrometria de Massa por permuta de hidrogénio/deutério (HX-MS) e vários métodos de ligação competitiva; métodos que são conhecidos na especialidade. Como cada método depende de um princípio único, a descrição de um epítopo está intimamente ligada ao método pelo qual foi determinado. Desse modo, dependendo do método de mapeamento de epítopo empregue, o epítopo para um dado par de Ab/Ag pode ser descrito diferentemente.

No seu nível mais detalhado, o epítopo para a interação entre o Ag e o Ab pode ser descrito pelas coordenadas espaciais que definem os contactos atómicos presentes na interação Ag-Ab, assim como as informações em torno das suas contribuições relativas à termodinâmica de ligação. Num nível menos detalhado, o epítopo pode ser caracterizado pelas coordenadas espaciais que definem os contactos atómicos entre o Ag e o Ab. Num nível ainda menos detalhado, o epítopo pode ser caracterizado pelos resíduos de aminoãcido que comprende conforme definido por um critério específico, como a distância entre ou acessibilidade de solvente de átomos no complexo Ab:Ag. Num nível ainda menos detalhado, o epítopo pode ser caracterizado pela função, por exemplo, por ligação competitiva com outros Abs. 0 epítopo também pode ser definido mais genericamente como compreendendo resíduos de aminoãcido cuja substituição por outro aminoãcido alterará as características da interação entre o Ab e o Ag.

No contexto de uma estrutura cristalina derivada por raio X definida por coordenadas espaciais de um complexo entre um Ab, por exemplo, um fragmento Fab, e seu Ag, o termo epítopo é, no presente documento, a menos que especificado ou contradito de outro modo pelo contexto, especificamente definido como resíduos de TREM-1 caracterizados por ter um átomo pesado (isto é, um átomo não hidrogénio) numa distância de, por exemplo, 4 A de um átomo pesado no Ab. A partir do facto de que as descriçõs e definições de epítopos, dependentes de método de mapeamento de epítopo utilizados, são obtidos em níveis diferentes de detalhe, consequentemente, a comparação de epítopos para Abs diferentes no mesmo Ag pode ser conduzida de modo semelhante em níveis diferentes de detalhe.

Os epítopos descritos no nível de aminoácido, por exemplo, determinados a partir de uma estrutura de raio X, são referidos como idênticos se contiverem o mesmo conjunto de resíduos de aminoácido. Os epítopos são referidos como sobrepostos se pelo menos um aminoácido for compartilhado pelos epítopos. Os epítopos são referidos como separados (únicos) se nenhum resíduo de aminoácido for compartilhado pelos epítopos.

Os epítopos também podem ser definidos indiretamente, por meio da comparação da cinética de ligação de anticorpos ao tipo selvagem TREM-1 humano com aquelas variantes de TREM-1 humano que têm mutações de alanina em epítopos antecipados. A afinidade diminuída ou ligação revogada de um anticorpo a variantes de TREM-1 humano nas quais um resíduo de aminoácido foi substituído por um resíduo de alanina indica que o aminoácido que sofreu mutação contribui para a interação entre o referido anticorpo e o TREM-1 humano do tipo selvagem. Essa abordagem fornece uma identificação negativa do epítopo. 0 método é comprometido na definição de modo eficaz do epítopo pelo facto que o desdobramento ou dobramento de proteína gerará resultados semelhantes como revogação da interação. A análise pode ser complementada por ganho comparativo de análises de função de mutação de uma proteína alvo ortóloga (por exemplo, TREM-1 de macaco cinomolgo), se um anticorpo de reação cruzada existir. A comparação definirá as diferenças de epítopo entre o anticorpo que não reage de modo cruzado com, por exemplo, TREM-1 de macaco cinomolgo e o anticorpo de reação cruzada. A identificação indireta do epítopo também pode ser fornecida por meio da medição do anticorpo (ou anticorpo fragmento) que se liga a variantes do antigénio do tipo selvagem (TREM-1). Se um anticorpo ou fragmento do mesmo se ligar, por exemplo, ao TREM-1 humano, mas não ao TREM-1 de macaco cinomolgo, e se o referido anticorpo ou fragmento do mesmo tiver capacidade para se ligar parcialmente a uma variante humanizada de TREM-1 de macaco cinomolgo, então, essa ligação recuperada indica que o resíduo (ou resíduos) de aminoácido substituído é importante para a interação do anticorpo com o antigénio. Da mesma maneira, a afinidade aumentada para variantes humanizadas de TREM-1 de macaco cinomolgo, de um anti-anticorpo humano de TREM-1 (ou seu fragmento Fab) que tem uma ligação mais fraca ao TREM-1 de macaco cinomolgo em comparação com o TREM-1 humano, pode fornecer informações sobre a identidade de resíduos que compõem o epítopo de ligação. 0 efeito das mesmas mutações em qualquer dado anticorpo de reação cruzada torna possível a diferenciação entre o desdobramento de proteína possível (ligação revogada a ambos os anticorpos) e perda de interação em TREM-1 humano (ligação a um dos anticorpos e ligação revogada ao outro anticorpo) , enquanto fornece de modo não ambíguo as informações sobre as diferenças de epítopo entre o anticorpo que não tem reação cruzada e o anticorpo de reação cruzada num nível de aminoácido.

Os anticorpos da presente invenção conforme definido nas reivindicações podem ter capacidade para ligar variantes de TREM-1 humano. Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para ligar K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13), conforme determinado, com a utilização de, por exemplo, ressonância de plasmão de superfície.

Os anticorpos da presente invenção conforme definido nas reivindicações podem ter capacidade para ligar variantes de TREM-1 de macaco cinomolgo. Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para ligar A24T/ Y28F/N30S/R32Q/P7 OH-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14), conforme determinado, com a utilização de, por exemplo, ressonância de plasmão de superfície. Os anticorpos da invenção podem ter capacidade para ligar A24T/Y28F/N30S/R32Q/E®4K-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 1®), conforme determinado, com a utilização de, por exemplo, ressonância de plasmão de superfície.

Um anticorpo divulgado no presente documento pode ter capacidade para se ligar especificamente a TREM-1, em que o referido anticorpo tem capacidade para se ligar especificamente (i) a pelo menos um resíduo de aminoãcido selecionado a partir do grupo que consiste em A21, T22, K23, L24, T2®, E26, e (ii) pelo menos um resíduo de aminoãcido selecionado a partir do grupo que consiste em A4x, S®0, S®1, Q®2, K®3, A®4, W®®, Q®6, I®7, I®8, R®x, D60, G61, E62, M63, P64, K6®, T66, L67, A68, C6x, T70, E71, R72, P73, S74, K7®, N76, S77, H78, P7x, ¥80, Q81, V82, G83, R84, 18® e (iii) pelo menos um resíduo de aminoãcido selecionado a partir do grupo que consiste em C113, V114, 111®, Y116, Q117, P118 e Pllx de TREM-1 humano.

Um anticorpo da invenção, conforme definido nas reivindicações, pode ter capacidade para se ligar especificamente a um polipéptido que compreende os aminoãcidos D38 a F48 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), conforme determinado com a utilização, por exemplo, de HX-MS.

Um anticorpo da invenção tem um epítopo que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todos os resíduos de aminoãcido D38, V3x, K40, C41, D42, Y43, T44 e L4® de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) e um, dois ou todos os resíduos de aminoãcido selecionados a partir do grupo que consiste em E46, K47 e F48 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), conforme determinado com a utilização, por exemplo, de HX-MS.

Um anticorpo da invenção pode ter um epítopo que compreende um, dois, três ou todos os resíduos de aminoãcido selecionados a partir do grupo que consiste em D42, E46, Dx2 e Hx3 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), conforme determinado com a utilização de variantes de TREM- 1 e ressonância de plasmão de superfície.

Um anticorpo da divulgação pode ter um epítopo que compreende pelo menos os resíduos de aminoãcido E46 e/ou Dx2 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), conforme determinado com a utilização de variantes de TREM-1 e ressonância de plasmão de superfície.

Um anticorpo divulgado no presente documento pode compreender adicionalmente um, dois ou todos os resíduos de aminoácido selecionados a partir do grupo que consiste em L31, 186 e V101 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano).

Um anticorpo da invenção conforme definido nas reivindicações pode ter capacidade para se ligar especificamente a um polipéptido que compreende os resíduos de aminoãcido Elx a L26 d TREM-1 de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 12), ou os aminoãcidos correspondentes de SEQ ID NO: 21, conforme determinado com a utilização, por exemplo, de HX-MS.

Um anticorpo da divulgação pode ter capacidade para se ligar especificamente ao TREM-1 humano, em que o epítopo do referido anticorpo compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou todos os resíduos de aminoãcido selecionados a partir do grupo que consiste em V3x, K40, C41, D42, Y43, L4®, E46, K47, F48 e A4x de SEQ ID NO: 1 . 0 epítopo do anticorpo da invenção, conforme definido nas reivindicações, pode compreender o D42 de SEQ ID NO: 1. 0 epítopo do anticorpo da invenção, conforme definido nas reivindicações, pode compreender ο E46 de SEQ ID NO: 1. 0 epítopo do referido anticorpo pode compreender o V3x, C41, D4 2, Y43, L4® de SEQ ID NO: 1. 0 epítopo do referido anticorpo pode compreender ο E46, K47 e A4x de SEQ ID NO: 1. 0 epítopo do referido anticorpo pode compreender adicionalmente o F48 de SEQ ID NO: 1. A definição do termo "parátopo" é derivada da definição acima de "epítopo" ao reverter a perspetiva.

Desse modo, o termo êparátopoê refere-se à área ou região no Ab à qual um Ag liga-se especificamente, isto é, a qual faz contacto físico com o Ag.

No contexto de uma estrutura cristalina derivada por raio X definida por coordenadas espaciais de um complexo entre um Ab, como um fragmento Fab, e seu Ag, o termo parãtopo é, no presente documento, a menos que especificado ou contradito de outro modo pelo contexto, especificamente definido como resíduos de Ag caracterizados por ter um átomo pesado (isto é, um átomo não hidrogénio) numa distância de 4 A de um átomo pesado em TREM-1. 0 epítopo e o parátopo para um dado par de anticorpo (Ab)/antigénio (Ag) pode ser identificado por métodos de rotina. Por exemplo, a localização geral de um epítopo pode ser determinada ao avaliar a habilidade de um anticorpo para se ligar a fragmentos diferentes ou polipéptidos de TREM-1 variantes. Os aminoácidos específicos dentro de TREM-1 que fazem contacto com um anticorpo (epítopo) e os aminoácidos específicos num anticorpo que faz contacto com TREM-1 (parátopo) também podem ser determinados com a utilização de métodos de rotina. Por exemplo, o anticorpo e a molécula alvo podem ser combinados e o complexo Ab :Ag pode ser cristalizado. A estrutura cristalina do complexo pode ser determinada e utilizada para identificar sítios específicos de interação entre o anticorpo e seu alvo.

Os anticorpos que se ligam ao mesmo antigénio podem ser caracterizados em relação à sua habilidade para se ligarem ao seu antigénio comum simultaneamente e podem ser submetidos a êligação competitivaê/êagrupamento dos dados por classeê. No presente contexto, o termo êagrupamento dos dados por classeê refere-se a um método de agrupamento de anticorpos que se ligam ao mesmo antigénio. 0 êagrupamento dos dados por classeê de anticorpos pode ter base na ligação competitiva de dois anticorpos ao seu antigénio comum nos ensaios com base em técnicas padrão, como ressonância de plasmão de superfície (SPR), ELISA ou citometria de fluxo.

Um êrecipienteê de anticorpo é definido com a utilização de um anticorpo de referência. Se um segundo anticorpo não pode ligar-se a um antigénio ao mesmo tempo que o anticorpo de referência, o segundo anticorpo é referido como pertencendo ao mesmo 13 recipienteS queo anticorpo de referência. Nesse caso, a referência e o segundo anticorpo ligam-se de modo competitivo à mesma parte de um antigénio e são chamados 13 anticorpos competitivosS . Se um segundo anticorpo tem capacidde para ligar-s a um antigénio ao mesmo tempo que o anticorpo de referência, o segundo anticorpo é referido como pertencendo a um § recipients^ separado. Nesse caso, a referênai e o segundo anticorpo não se ligam de modo competitivo à mesma parte de um antigénio e são chamados 13 anticorpos nã competi tivoslEI . 0 13 agrupamento dos dados por classed não fornece informações diretas sobre o epítopo. Os anticorpos competitivos, isto é, anticorpos que pertencem ao mesmo 13 recipiente^ podem ter epítopos idênticos que sobpêem epítopos ou até mesmo epítopos separados. 0 último é o caso do anticorpo de referência ligado a esse epítopo no antigénio tomar o espaço exigido para o segundo anticorpo contactar o seu epítopo no antigénio (13 impedimento estéricoH ). Os anticorpos não competitivos têm geràmente epítopos separados.

Um anticorpo da invenção pode competir com mAb 0170 para se ligar ao TREM-1 humano, conforme definido nas reivindicações. Um anticorpo da invenção pode competir com mAb 0170 para se ligar ao TREM-1 de macaco cinomolgo, conforme definido nas reivindicações. Em outras palavras, um anticorpo da invenção pode pertencer ao mesmo 13 recipienteS que mAb 0170. 0 termo 13 afinidade de ligaçãoS no presente document refere-se a uma medição da força de uma interação não covalente entre duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento do mesmo, e um antigénio. 0 termo êafinidade de ligaçãoê é utilizado para descrever interações monovalentes (atividade intrínseca). A afinidade de ligação entre duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento do mesmo, e um antigénio, através de uma interação monovalente pode ser quantificada por determinação da constante de dissociação de equilíbrio (KD) . Por sua vez, KD pode ser determinado por medição da cinética de formação e dissociação de complexo, por exemplo, pelo método SPR. As constantes de taxa correspondentes à associação e à dissociação de um complexo monovalente são denominadas constante de taxa de associação ka(ou kon) e constante de taxa de dissociação KD (ou koff) , respetivamente. KD é relacionado a ka e KD através da equação KD= KD/ ka.

Seguindo a definição acima, as afinidades de ligação associadas a interações moleculares diferentes, como comparação da afinidade de ligação de anticorpos diferentes para um dado antigénio, pode ser comparada por comparação entre os valores de KD para os complexos de anticorpo/antigénio individuais.

Um anticorpo da invenção conforme definido nas reivindicações pode ligar-se a TREM-1 humano com uma afinidade (KD) que é 1 x 1CT7M ou menor, 1 x 10”8M ou menor, ou 1 x 10~XM ou menor, ou 1 x 10“loM ou menor, 1 x 10'1:LM ou menor, 1 x 10~i2M ou menor ou 1 x 10“13M ou menor, conforme determinado com a utilização de ressonância de plasmão de superfície. Um anticorpo da invenção conforme definido nas reivindicações pode ligar-se a TREM-1 de macaco cinomolgo com uma afinidade (KD) que é 1 x 10'7M ou menor, 1 x 10“SM ou menor, ou 1 x 10" XM ou menor, ou 1 x 1(T10M ou menor, 1 x 10_11M ou menor, 1 x 10"12M ou menor ou 1 x 10”13M ou menor, conforme determinado com a utilização de ressonância de plasmão de superfície. 0 termo êespecificidade de ligaçãoê no presente documento refere-se à interação de uma molécula como um anticorpo, ou fragmento do mesmo, com um antigénio exclusivo único, ou com um número limitado de antigénios altamente homólogos (ou epítopos). Em contraste, anticorpos que tH m capacidade para se ligar especif icamente a TREM-1 não tIES m capacidade para se ligar a moléculas não semelhantes. Os anticorpos de acordo com a invenção podem não ter capacidade para se ligarem a Nkp44. A especificidade de uma interação e do valor de uma constante de ligação de equilíbrio pode ser determinada diretamente por métodos bem conhecidos. Os ensaios-padrão para avaliar a habilidade de ligantes (como anticorpos) ligarem os seus alvos são conhecidos na especialidade e incluem, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs e análise de citometria de fluxo. A cinética de ligação e a afinidade de ligação do anticorpo também podem ser avaliadas por ensaios-padrão conhecidos na especialidade, como SPR.

Um ensaio de ligação competitiva pode ser conduzido, no qual a ligação do anticorpo ao alvo é comparada à ligação do alvo por outro ligante daquele alvo, como outro anticorpo.

Num outro aspeto, a presente divulgação fornece composições e formulações que compreendem moléculas divulgadas no presente documento, como os anticorpos de TREM-1 da invenção, e os polinucleõtidos, vetores e células descritas no presente documento. Por exemplo, a divulgação fornece uma composição farmacUS utica que compreende um ou mais anticorpos de TREM-1 da invenção conforme definido nas reivindicações, formulados junto com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Consequentemente, um objetivo da divulgação é fornecer uma formulação farmaclEI utica que compreende tal antcorpo de TREM-1 que está presente numa concentração de 0,2® mg/mL a 2®0 mg/mL, como uma concentração de 10 a 200 mg/mL, e em que a referida formulação tem um pH de 2,0 a 10,0, tal como um pH de 4,0 a 8,0. A formulação pode compreender adicionalmente um ou mais de entre um sistema tampão, um conservante, um agente de tonicidade, um agente quelante, um estabilizador e/ou um tensioativo, assim como várias combinações dos mesmos. A utilização de conservantes, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizadores e tensioativos nas composições farmacêuticas é bem conhecida pelo perito na especialidade. A referência pode ser feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, lx-edição, lxx®.

Em uma forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão, mas também pode incluir coloides, dispersões, emulsões e materiais de múltiplas fases. 0 termo "formulação aquosa" é definida como uma formulação que compreende pelo menos ®0% p/p de água. De modo semelhante, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução que compreende pelo menos ®0% p/p de água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão que compreende pelo menos ®0% p/p de água.

Em outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca a frio, à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes da utilização.

Num aspeto adicional, a formulação farmacêutica compreende uma solução aquosa de tal anticorpo, e um tampão, em que o anticorpo está presente numa concentração de 1 mg/mL ou acima, e em que a referida formulação tem um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.

Os anticorpos de TREM-1 da presente invenção e composições farmacêuticas que compreendem tais anticorpos podem ser utilizados para o tratamento de doenças inflamatórias, como as seguintes: doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn (CD), colite ulcerativa (UC) , sindrome do intestino irritável, artrite reumatoide (RA) , psoríase, artrite psoriásica, lúpus eritematoso sistémico (SLE), nefrite lúpica, diabetes do tipo I, doença de Grave, esclerose múltipla (MS), miocardite autoimune, doença de Kawasaki, doença arterial coronariana, doença pulmonar obstrutiva crónica, doença pulmonar intersticial, tiroidite autoimune, esclerodermia, esclerose sistémica, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença do enxerto contra hospedeiro, síndrome de Sjogren, nefrite autoimune, síndrome de Goodpasture, polinuropatia desmielinizante inflamatória crónica, alergia, asma e outras doenças autoimunes que são um resultado de inflamação aguda ou crónica.

Os anticorpos de TREM-1 da invenção podem ser adequados para utilização no tratamento de indivíduos com doença inflamatória intestinal. A Doença Inflamatória Intestinal (IBD) é uma doença que pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal da boca ao ânus, causando uma variedade ampla de sintomas. IBD causa primariamente a dor abdominal, diarreia (a qual pode ter sangue), vómito ou perda de peso, mas também causa complicações fora do trato gastrointestinal, como erupções da pele, artrite, inflamação do olho, fadiga e falta de concentração. Os pacientes com IBD podem ser divididos em duas classes principais, aqueles com colite ulcerativa (UC) e aqueles com doença de Crohn (CD). CD envolve geralmente o íleo e o cólon, pode afetar qualquer região do intestino, mas é frequentemente descontínuo (áreas focadas de doença espalhadas ao longo do intestino). UC sempre envolve o reto (colónico) e é mais contínuo. Em CD, a inflamação é transmural, resultando em abcessos, fístulas e estreitamentos, enquanto em UC, a inflamação é tipicamente confinada à mucosa. Não há uma cura farmacêutica ou cirúrgica conhecida para a doença de Crohn, apesar de alguns pacientes com UC poderem ser curados por remoção cirúrgica do cólon. As opções de tratamento são restritas ao controlo de sintomas, mantimento da remissão e prevenção de recaída. A eficácia na doença inflamatória intestinal na clínica pode ser medida como uma redução na contagem do índice de Atividade de Doença de Crohn (CDAI) para CD, que é uma escala de contagem com base nos testes laboratoriais e num questionário de qualidade de vida. Em modelos animais, a eficácia é principalmente medida por aumento em peso e também por um índice de atividade de doença (DAI) , que é uma combinação de consistência de fezes, peso e sangue nas fezes.

Os anticorpos de TREM-1 da invenção podem ser adequados para utilização no tratamento de indivíduos com artrite reumatoide. A artrite reumatoide (RA) é uma doença sistémica que afeta aproximadamente, se não por inteiro, todo o corpo e é uma das formas mais comuns de artrite. A mesma é caracterizada por inflamação da junta, o que causa dores, rigidez, calor, vermelhidão e inchaço. Essa inflamação é uma consequência de células inflamatórias invadirem as juntas, e essas células inflamatórias libertarem enzimas que podem digerir ossos e cartilagem. Como resultado, essa inflamação pode levar a dano ósseo e de cartilagem severo e à deterioração de junta e dor severa, entre outros efeitos fisiológicos. A junta envolvida pode perder o seu formato e alinhamento, resultando em dor e perda de movimento. Há diversos modelos animais para artrite reumatoide conhecidos na especialidade. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colagénio (CIA), os ratinhos desenvolvem uma artrite inflamatória que lembra a artrite reumatoide humana. Visto que CIA compartilha recursos imunológicos e patológicos semelhantes com RA, isso torna a mesma num modelo adequado para triar compostos anti-inflamatórios humanos potenciais. A eficácia nesse modelo é medida por diminuição no inchaço de junta. A eficácia em RA na clínica é medida pela habilidade para reduzir sintomas em pacientes que é medida como uma combinação de inchaço de junta, taxa de sedimentação de eritrócito, níveis de proteína reativos C e níveis de fatores séricos, como anticorpos de proteína anticitrulina.

Os anticorpos de TREM-1 da invenção podem ser adequados para utilização no tratamento de indivíduos com psoríase. A psoríase é um distúrbio inflamatório mediado por célula T da pele que pode causar o desconforto considerável. A mesma é uma doença para a qual não há uma cura atualmente e afeta as pessoas de todas as idades. Embora os indivíduos com psoríase suave possam controlar normalmente sua doença com agentes tópicos, mais de um milhão de pacientes no mundo exigem tratamentos com luz ultravioleta ou terapêutica imunos supre s sora sistémica. Infelizmente, a incoveniência e os riscos da radiação ultravioleta e das toxicidades de muitas terapêuticas limitam a sua utilização a longo prazo. Além disso, os pacientes têm normalmente a recorrência de psoríase, e em alguns casos, recuperam-se logo após interromper a terapêutica imunossupressora. Um modelo recentemente desenvolvido de psoríase com base na transferência de células T CD4+ mimetiza muitos aspetos de psoríase humana e, portanto, pode ser utilizado para identificar compostos adequados para utilização no tratamento de psoríase (Davenport et al. , Internat. Immunopharmacol 2:6®3 a 672, 2002). A eficácia nesse modelo é medida por redução em patologia de pele com a utilização de um sistema de contagem. De modo semelhante, a eficácia em pacientes é medida por uma diminuição na patologia de pele.

Os anticorpos de TREM-1 da invenção podem ser adequados para utilização no tratamento de indivíduos com artrite psoriásica. A artrite psoriásica (PA) ê um tipo de artrite inflamatória que ocorre num subconjunto de pacientes com psoríase. Nesses pacientes, a patologia de pele/sintomas são acompanhados por um inchaço de junta semelhante àquele visto na artrite reumatoide. A mesma apresenta áreas vermelhas, elevadas e irregulares de inflamação de pele com formação de escama. A psoríase afeta normalmente as pontas dos cotovelos e joelhos, o couro cabeludo, o umbigo e em torno das áreas genitais ou ânus. Aproximadamente 10% dos pacientes que têm psoríase também desenvolvem uma inflamação associada das suas juntas. 0 termo "tratamento", conforme utilizado no presente documento, refere-se à terapêutica médica de qualquer ser humano ou outro indivíduo animal que necessita da mesma. Espera-se que o referido indivíduo tenha sido submetido à examinação física por um médico ou médico veterinário praticante, ao qual foi dada uma tentativa ou um diagnóstico definitivo que indicará que a utilização do tratamento referido é benéfica para a saúde do referido humano ou outro indivíduo animal. 0 momento e o propósito do referido tratamento podem variar de um indivíduo para outro, de acordo com muitos fatores, como o status quo da saúde do indivíduo. Desse modo, o referido tratamento pode ser profilático, paliativo, sintomático e/ou curativo.

Nos termos da presente divulgação, os tratamentos profiláticos, paliativos, sintomáticos e/ou curativos podem representar aspetos separados da divulgação.

Um anticorpo da invenção pode ser para administração de modo parentérico, como de modo intravenoso, como de modo intramuscular, como de modo subcutâneo. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser para administração por meio de uma rota não parentérica, como de modo oral ou tópico. Um anticorpo da invenção pode ser para administração de modo profilático. Um anticorpo da invenção pode ser para administração de modo terapêutico (sob demanda).

FORMAS DE REALIZAÇÃO EXEMPLIFICATIVAS DA DIVULGAÇÃO 1. Um método para identificar um anticorpo de TREM-1 funcional que compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula quando a referida célula é incubada com um agente modificador de TREM-1; (c) colocar em contacto a cultura de (b) com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula é menor ou maior que a atividade medida em (b). 2. Um método para identificar um anticorpo de TREM-1 de bloqueio que compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula quando a referida célula é incubada com um neutrófilo ativado; (c) colocar em contacto a cultura da primeira célula e o neutrófilo ativado com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula é menor que a atividade medida em (b). 3. 0 método de qualquer uma das formas de realização 1 a 2, em que o agente modificador de (b) é um neutrófilo ativado ou um ligante de TREM-1. 4. Um método para identificar um anticorpo de TREM-1 de estímulo que compreende (a) cultivar uma primeira célula que expressa TREM-1, uma proteína de sinalização e um construto repórter; (b) medir a atividade da primeira célula; (c) colocar em contacto/incubar a referida célula com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a atividade da primeira célula é maior que a atividade medida em (b). ®. 0 método de qualquer uma das formas de realização 1 a 4, em que a primeira célula é de origem hematopoiética. 6. 0 método de acordo com forma de realização ®, em que a célula de origem hematopoiética é uma célula mieloide. 7. 0 método de acordo com forma de realização ®, em que a célula de origem hematopoiética é uma célula T. 8. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que a proteína de sinalização é DAP10. x. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que a proteína de sinalização é DAP12. 10. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que a proteína de sinalização é TCR zeta. 11. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que a proteína de sinalização é Fc gama RIII. 12. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que a proteína de sinalização é um recetor Fc. 13. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 6, em que o construto repórter compreende um fator de transcrição e um gene repórter. 14. 0 método de acordo com forma de realização 13, em que o referido fator de transcrição é NFAT. 1®. 0 método de acordo com forma de realização 14, em que o referido fator de transcrição é NFkB. 16. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 13 a 1®, em que o referido gene repórter codifica β-galactosidase. 17. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 13 a 1®, em que o referido gene repórter codifica luciferase. 18. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 13 a 1®, em que o referido gene repórter codifica proteína fluorescente verde (GFP). lx. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 13 a 1®, em que o referido gene repórter é um gene que codifica cloranfenicol transferase. 20. Um método para identificar um anticorpo de TREM-1 de bloqueio que compreende (a) cultivar uma célula T que expressa TREM-1, DAP12 e um gene que codifica luciferase,* (b) medir a luminescência da célula T quando a mesma é incubada com um neutrófilo ativado; (c) colocar em contacto a co-cultura de (b) com um anticorpo de TREM-1; e (d) medir que a luminescência da célula T é menor que a atividade medida em (b). 21. 0 método de acordo com forma de realização 7, em que a referida célula é uma linhagem de célula T BWZ.36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ. 22. 0 anticorpo identificado pelo método de qualquer uma das formas de realização 1 a 3 e ® a 21.

FORMAS DE REALIZAÇÃO EXEMPLIFICATIVAS DA INVENÇÃO 23. Um anticorpo ou fragmento do mesmo que tem capacidade para se ligar especificamente e bloquear TREM-1, sendo que o anticorpo ou fragmento do mesmo tem capacidade para bloquear ativação induzida por PGLYRP1 de TREM-1 e tem um epítopo que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todos os resíduos de aminoácido D38, V3x, K40, C41, D42, Y43, T44 e L4® e um, dois ou todos os resíduos de aminoácido E46, K4 7, F4 8 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano). 24. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 23, em que o referido anticorpo tem capacidade para impedir ou reduzir a dimerização/multimerização de TREM-1. 2®. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 24, em que o referido anticorpo tem capacidade para bloquear a interação entre TREM-1 e seu ligante. 26. 0 anticorpo de acordo com forma de realização 23, em que o referido anticorpo também tem capacidade para se ligar especificamente e bloquear a função de TREM-1 de outra espécie diferente de um ser humano. 27. 0 anticorpo de acordo com forma de realização 26, em que o TREM-1 da outra espécie é TREM-1 de macaco cinomolgo. 28. 0 anticorpo de acordo com forma de realização 26, em que o TREM-1 de outra espécie é TREM-1 de macaco Rhesus. 2x. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 28, que tem capacidade para se ligar especificamente a K2 0A-hTREM-1-Cmyc 2 -Hi s 6 (SEQ ID NO: 13) . 30. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 2x, que tem capacidade para se ligar especificamente a A24T/ Y28F/N30S/R32Q/P70H-CTREM-1-

Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14). 31. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 30, que tem capacidade para se ligar especificamente a A24T/ Y28F/N30S/R32Q/E®4K-cTREM-l-

Cmyc2-Hisô (SEQ ID NO: 1®). 32. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 31, que compete com mAb 0170 para se ligar ao TREM-1 humano, em que mAb 0170 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4, e uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: ®. 33. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 32, que compete com mAb 0170 para se ligar ao TREM-1 de macaco cinomolgo, em que mAb 0170 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4, e uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: ®. 34. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 33, que tem capacidad para se ligar especificamente a um polipéptido que compreende os aminoãcidos D38 a F48 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), conforme determinado com a utilização, por exemplo, de HX-MS. 3®. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 34, que tem capacidade para se ligar especificamente a um polipéptido que compreende resíduos de aminoácido E38 a L4® de TREM-1 de macaco cinomolgo, conforme determinado com a utilização, por exemplo, de HX-MS. 36. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 3®, que tem um epítopo que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido selecionados a partir do grupo que consiste em D42, E46, Dx2 e Hx3 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), conforme determinado com a utilização de ressonância de plasmão de superfície. 37. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 36, que tem um epítopo que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido E46 e/ou Dx2 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), conforme determinado com a utilização de ressonância de plasmão de superfície. 38. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 37, em que o referido anticorpo tem capacidade para se ligar especificamente (i) a pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em A21, T22, K23, L24, T2®, E26, e (ii) pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em A4x, S®0, S®1, Q®2, K®3, A®4, W®®, Q®6, I®7, I®8, R®x, D60, G61, E62, M63, P64, K6®, T66, L67, A68, C6x, T70, E71, R72, P73, S74, K7®, N76, S77, H78, P7x, V80, Q81, V82, G83, R84, 18® e (iii) pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em C113, V114, 111®, Y116, Q117, P118 e Pllx de TREM-1 humano. 3x. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 38, em que o referido anticorpo tem capacidade para se ligar especificamente (i) a pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em V3x, K40, C41, D42, Y43, T44, L4®, E46, K47, F48, A4 x, S®0, S®1, Q®2, K®3, A®4, W®®, Q®6, e (ii) pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em the T70, E71, R72, P73, S74, K7®, N7 6, S77, H78, P7x, V80, Q81, V82, G83, R84, 18® e (iii) pelo menos um resíduo de aminoãcido selecionado a partir do grupo que consiste em C113, V114, 111®, Y116, Q117, P118 e Pllx, 40. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 3x, cuja cadeia pesada compreende uma sequência CDRH3 correspondente aos resíduos de aminoãcido 101 a 110 (DMGIRRQFAY) de SEQ ID NO: 4, em que um, dois ou três dos referidos resíduos de aminoãcido podem ser substituídos por um aminoãcido diferente. 41. O anticorpo de acordo com uma forma de realização 40, que compreende adicionalmente uma sequência CDRH1 correspondente aos resíduos de aminoãcido 31 a 3® (TYAMH) de SEQ ID NO: 4, em que um de entre esses resíduos de aminoãcido podem ser substituídos por um resíduo de aminoãcido diferente; e/ou uma sequência CDRH2 correspondente aos aminoácidos ®0 a 68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG) de SEQ ID NO: 4, em que um, dois ou três dos referidos aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoãcido diferente. 42. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 40 a 41, cuja cadeia leve compreende: uma sequência CDRL1 correspondente aos resíduos de aminoãcido 24 a 38 (RASESVDTFDYSFLH) de SEQ ID NO: ®, em que um, dois ou três desses resíduos de aminoãcido podem ser substituídos por um aminoãcido diferente; e/ou uma sequência CDRL2 correspondente aos resíduos de aminoãcido ®4 a 60 (RASNLES) de SEQ ID NO: ®, em que um ou dois desses resíduos de aminoãcido podem ser substituídos por um aminoãcido diferente; e/ou uma sequência CDRL3 correspondente aos resíduos de aminoãcido x3 a 101 (QQSNEDPYT) de SEQ ID NO: ®, em que um ou dois desses resíduos de aminoãcido podem ser substituídos por um aminoãcido diferente. 43. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 40 a 42, que compreende SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: ®. 44. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 2 3-43, que se liga a TREM -1 humano com uma afinidade de ligação (KD) que é 1 x 10"7 M ou menor, 1 x 10~8 M ou menor, ou 1 x 10~x M ou menor, ou 1 x IO”10 M ou menor, 1 x 10'11 M ou menor, 1 x 10”12 M ou menor ou 1 x 10 ”13 M ou menor, conforme determinado com utilização de ressonância de plasmão de superfície. 4®. O anticorpo de acordo com forma de realização 44, em que a referida afinidade de ligação (KD) é 1 x IO'10 M ou menor. 46. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23-4®, que se liga a TREM-1 de macaco cinomolgo com uma afinidade de ligação (KD) que é 1 x 10”7 M ou menor, 1 x 10”8 M ou menor, ou 1 x 10”x M ou menor, ou 1 x IO”10 M ou menor, 1 x 10”L1 M ou menor, 1 x 10”12 M ou menor ou 1 x 10'13 M ou menor, conforme determinado com utilização de ressonância de plasmão de superfície. 47. O anticorpo de acordo com forma de realização 46, em que a referida afinidade de ligação é 1 x 10'x M ou menor. 48. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 47, o qual é uma IgG. 4x. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 48 para utilização como um medicamento, ®0. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 23 a 48 para utilização no tratamento de uma doença autoimune e/ou inflamação crónica. ®1. 0 anticorpo para utilização de acordo com a forma de realização ®0, em que a referida doença autoimune é artrite reumatoide. ®2. 0 anticorpo para utilização de acordo com a forma de realização ®0, em que a referida doença autoimune é doença de Crohn. ®3. 0 anticorpo para utilização de acordo com a forma de realização ®0, em que a referida doença autoimune é colite ulcerativa. ®4. 0 anticorpo para utilização de acordo com a forma de realização ®0, em que a referida doença autoimune é artrite psoriásica. A presente invenção é adicionalmente ilustrada por os exemplos a seguir que não devem ser interpretados como adicionalmente limitantes.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de uma linhagem celular estável BWZ.36 TREM-1 humano:DAP12 A linhagem celular BWZ.36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ (também denominada no presente documento como a "célula repórter BWZ/hTREM-1") foi derivada de células T BW®147 (linhagem celular de linfoma de Mus musculusthymus, ATCC TIB-47, LGC Standards, Middelsex, UK) e contém um construto repórter LacZ regulado por quatro cópias do elemento promotor NFAT (veja-se Karttunen, J. í Shastri, N. (Ixxl) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88, 3x72 a 3x76 e Fiering, S. ,

Northrop, J. P., Nolan, G. P., Matilla, P., Crabtree, G. R. í Herzenberg, L. A. (IxxO) Genes Dev. 4, 1823 a 1834). 0 vetor TREM/DAP12/pMX-IRES (que codifica 786 bp de TREM-1 de um sítio Smal para o sítio BamHI com a utilização de cDNA de TREM -1 (ID de ref. de Gene Bank: NM__018643.2, Sino Biological Inc., Beijing, China) como modlo e oligo ®' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SEQ ID NO: 16) e ®' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC (SEQ ID NO: 17) visto que iniciadores clonados no vetor pIREShyg de n2 de acesso GenBank U8x672 (N2 cat. 6061-1, Clontech Laboratories, CA, EUA) foram transfetados em linhagem celular de empacotamento PLAT-E (fornecido por W. Yokoyama, Washington University; alternativamente, N2 cat. RV-101, Cell Biolabs Inc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finlândia) com a utilização de reagente de transfecção Superfect (N- cat. 30130®, Qiagen Nordic, Dinamarca). Os sobrenadantes PLAT-E que contêm partículas virais TREM/DAP12/pMX-IRES foram utilizados para infetar células BWZ.36 conforme a seguir: 2xlO<®>BWZ.36 células foram cultivadas em placas de 6 poços e o meio foi substituído por 1,® mL de sobrenadante que contém as partículas virais ± 8 mg/mL de polybrene. Após 6 a 8 horas, 1,® mL de meio normal foram adicionados à placa e as células foram incubadas durante 24 horas adicionais. As linhagens celulares BWZ.36 que expressam de modo estável o TREM-1 foram manchadas com anticorpo monoclonal anti TREM-1 (clone 21C7) e isoladas por classificação de célula. Exemplo 2: Cultivo de uma linhagem celular estável BWZ.36 TREM-1 humano:DAP12 A célula repórter BWZ/hTREM-1 foi cultivada em RPMI 1640 sem vermelho de fenol (n2 Cat. 1183®, Gibco, Carlsbad CA, EUA) , suplementada com 10% de FCS (n2 Cat. 16140-071, Gibco, Nova Iorque, EUA), 1% de Pen/Strep (n2 Cat. 1®070-06, Gibco), 1 mM de Piruvato de Sódio (n2 Cat. 11360, Gibco), ® μΜ de -2ME (n2 Cat. 313®0-010, Gibco) e 2 mM de L-Glutamina (n2 Cat. 2®030, Gibco). Nenhuma placa especial ou revestimento foi exigido. 10 mL de Versene (n2 Cat. 1®040, Gibco) foram adicionados para remover as células que foram, então, transferidas para tubos, centrifugadas a 1.200 rpm durante ® min e lavadas em RPMI 1640 fresco sem vermelho de fenol. Essas células estiveram, então, prontas para utilização num ensaio ou re-cultura para propagação adicional.

Exemplo 3: Imunização de ratinhos e identificação de mAbs

A fim de gerar anticorpos que se ligam ao TREM-1 humano, tanto os ratinhos Balb/C do tipo selvagem quanto ratinhos knock-out (KO) TREM-1 (fundo C®7BL/6) foram imunizados com TREM-1 humano (h) (SEQ ID NO:1), células que expressam hTREM-1 (BWZ.36 células) ou uma combinação de ambos. A triagem primária foi feita por meio de ELISA direta em proteína hTREM-1 ou por meio de FMAT, com utilização de células BWZ.36 que expressam hTREM-1. A triagem secundária foi feita por citometria de fluxo em células HEK2x3 que expressam hTREM-1. Os sobrenadantes de hibridoma positivos foram, então, triados no ensaio repórter BWZ/hTREM-1 descrito no Exemplo 4. 0 número mais alto de anticorpos de bloqueio foi obtido a partir de ratinhos KO imunizados com proteína de hTREM-1 seis vezes em intervalos de duas semanas, seguidas por uma injeção de reforço. No total, mais de 200 anticorpos de hTREM-1 foram isolados, dos quais aproximadamente 70 foram subsequentemente encontrados como tendo um efeito de bloqueio.

Todos os sobrenadantes de hibridoma específico de TREM-1 foram testados no ensaio repórter BWZ/hTREM-1 primeiro como sobrenadantes e posteriormente como anticorpos purificados, em titulação completa de ®. 000 ng/mL a 7 ng/mL, tanto como solúveis quanto como anticorpos ligados à placa. 0 sangue de uma faixa de dadores diferentes foi utilizado como uma fonte de neutrófilos novos. Como exemplo, a Figura 4 mostra anticorpos de uma fusão em que a atividade no ensaio repórter como atividade de bloqueio está no eixo geométrico x e a atividade de agonista quando o anticorpo é ligado à placa está no eixo geométrico y.

Exemplo 4: Identificação de PGLYRP1 como um ligante de TREM-1 expresso por neutrófilo PGLYRP1 foi identificado como um ligante de TREM-1 através da utilização de imunoprecipitação acoplada com espetroscopia de massa (IP-MS). 0 tetrâmero de TREM-1 solúvel foi utilizado como uma molécula "isco" de afinidade para identificar um ligante. Brevemente, TREM-1-tetrâmero-Fc (SEQ ID NO: 2) e separadamente CD83-Fc (SEQ ID NO: ®) foram, cada um, incubados em final concentrações de 100 pg/mL com 270 milhões de neutrófilos humanos, purificados por sedimentação de dextrano, conforme descrito acima, em 1 mL de PBS a 4 °C, xO minutos com agitação suave. Após peletizar essas células, as células foram ressuspensas em 1 mL de tampão PBS com a inclusão do reticulador 3,3'-Ditiobis[sulfosuccinimidilpropionato] (DTSSP) (Thermo Scientific: 21®78, Rockford, IL, EUA), numa concentração de 2 mM e incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas 3X com 1 mL de PBS seguido por lise em 1 mL de tampão RIPA (Thermo Scientific, 8xx01, Rockford, IL, EUA). 0 lisado foi centrifugado em 1®.000 X g durante 10 minutos a 4 °C para remover os materiais insolúveis. As proteínas de neutrófilo reticuladas para sondas acopladas Fc foram imunoprecipitadas a partir do sobrenadante com utilização de microesferas de Proteína A Mag Sepharose™ (GE Healthcare Life Sciences, 28-x670-®6, Piscataway, NJ, EUA) . Brevemente, ®0 pL de microesferas foram primeiramente lavados com 200 pL de PBS, então, ressuspensos em 1 mL de lisado de célula, incubado durante 6 0 minutos a 4 °C, magneticamnte capturados, e sequencialmente lavados 2X com 200 pL de tampão RIPA, então, 3X com 200 pL de PBS. Mediante a remoção de PBS da captura magnética final, as proteínas foram eluídas a partir das microesferas magnéticas com a utilização de 200 pL de tampão que contém 8 M de Ureia, 100 mM de Tris (pH 8,0),e 1® mM de TCEP (Thermo Scientific, 77720, Rockford, IL, EUA) e incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos, microesferas foram capturadas e o sobrenadante foi transferido a um filtro Microcon Ultracel YM-30 (Millipore, 42410, Billerica, MA, EUA). As amostras foram giradas em 14.000 x g, 20 °C, durante 3 0 a 6 0 minutos até nenhum líquido permanecer no topo da membrana de filtro. As proteínas retidas foram, então, alquiladas com 100 pL de ®0mM de IAA (iodoacetamida) em 8 M de Ureia durante 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. 0 filtro foi lavado 2X com 100 pL de ®0mM NH4HC03 e, então, transferido para um tubo de colheita novo. 1 pg de tripsina (Promega, V®lil, Madison, WI) em 6 0 pL de NH4HC03 a ®0 mM foi adicionado, seguido por incubação a 37°C de um dia para o outro. 0 digesto tríptico foi colhido por centrifugação a 14,000 xg durante 30 minutos seguido por lavagem do filtro com ®o pL de NH4HC03 a ®0 mM. 10 pL do digesto foi analisado por LC/MS/MS com a utilização de um espectrómetro de massa LTQ-Orbitrap-XL (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) . Os dados foram procurados com o banco de dados IPI human (v3.81) com a utilização do mecanismo SEQUEST-Sorcerer (versão 4.0.4) (SageN, Milpitas, CA, EUA) e, então, pós-processados com Scaffold 3 (Software Proteome, Portland, OR, EUA) para filtrar os IDs de proteína com uma taxa de falsa descoberta de 1%. Após a subtração de controlo negativo, PGLYRP1 foi constatado como uma proteína de alta confiança especificamente associada ao tetrâmero hTREM-1. A imunoprecipitação nos neutrófilos mostrou que de entre as 148 proteínas identificadas, 72 proteínas foram imunoprecipitadas por o construto de controlo (CD83) independentemente, 73 de entre as proteínas foram idênticas para TREM-1 e CD83, enquanto apenas três foram específicas de TREM-1 (Figura 3) . A experiência foi subsequentemente repetida com a utilização de neutrófilos de um dador diferente e PGLYRP1 foi novamente identificado como interagindo especificamente com hTREM-1.

Exemplo 5: Redobramento e purificação de PGLYRP1 humano expresso a partir de E. coli PGLYRP1 humano foi expresso como corpos de inclusão em células de Escherichia coli BL21 (DE3). As bactérias foram cultivadas por centrifugação, ressuspensas em ®0mM de Tris-HC1 pH 8,0, ®00 mM de NaCl, ® mM de EDTA, G,®% de Triton X-100 e desagregadas por sonicação. 0 pélete insolúvel foi lavado três vezes com ®0 mM de Tris, pH 8,0, 1% de Triton X-100, 2 M de ureia e uma vez com ®0 mM de Tris a pH 8,0, então, solubilizadas com ®0 mM de Tris-HCl, 6M d cloridrato de guanidina, pH 7,4, 1 mM de DTT (concentração de proteína final 20 mg/mL) . Para dobramento in vitro, os corpos de inclusão PGLYRP1 humanos solubilizados foram diluídos em ®0 mM de Tris, pH 8,0, 2 mM de EDTA, ® mM de cisteamina, 0,® mM de cistamina, 0,4 M de arginina (concentração de proteína final 1 mg/mL). Após um dia para o outro a 4 °C, a mistura de dobramento foi clarificada por centrifugação/filtração e, então, diluída 12 vezes em lOmM de MES a pH 3,® para reduzir a condutividade e pH (pH final -®, 8, condutividade ~6 mS/cm) . A mistura de dobramento diluída foi, então, aplicada a uma coluna Hitrap SP HP de ® mL (17-11®1-01 GE Healthcare, Uppsala, Suécia), seguida por uma lavagem de volume de ® colunas com ®0 mM de MES a pH ®, 8. 0 PGLYRP1 humano ligado foi, então, eluído com um gradiente lineara 0~60ô de ®0 mM de MES a pH ®,8, 1 M de NaCl em volume de 20 colunas. As frações que contêm PGLYRP1 humano redobradas foram agrupadas e concentradas para menos de 4 mL por 1® unidades centrífugas de Amicon ultra ((UFC800324 3.000 KDa MWCO, Millipore, Hellerup, Dinamarca). A coluna A Hiload 26/60 Superdex 7® de 318ml ((17-1070-01 GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi, então, utilizada para polir e permutar o tampão das proteínas para Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS). A maior parte das proteínas PGLYRP1 humanas redobradas esteve na forma monomérica. Após a concentração, a concentração de proteína final foi determinada ao medir 280 nm de absorbância com um espectrómetro de UV NANODROP. A pureza de proteína foi avaliada por eletroforese com gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).

Exemplo 6: Criação de um ensaio repórter responsivo de TREM-1 A linhagem celular repórter de TREM-1 foi gerada ao transfetar a linhagem celular BWZ.36 com um construto repórter NFAT-LacZ, assim como hTREM-1 e DAP12 (conforme descrito no Exemplo 1). Os neutrófilos de dadores saudáveis foram purificados por meio de sedimentação de Dextrano. 0 sangue foi estratificado em gradiente de FicollPaque (17-0840-03, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) com uma taxa de 3 partes de Ficoll e 4 partes de sangue num tubo de ®0 mL, então, centrifugadas a 400 x g durante 30 minutos a 22 °C, sem interrupção. A banda PBMC intermediária foi suavemente removida por aspiração. Os neutrófilos estratificados no RBC empacotado foram aspirados e transferidos para um tubo de ®0 mL de polipropileno. Os neutrófilos e os RBCs contaminantes foram diluídos até 40 mL com lx PBS e seguido por adição de 10 mL de DEXTRAN ®00 a 4ô (Sigma, 313x2, St Louis, MO, EUA) em solução de PBS. Após mistura por inversão suave, os tubos permaneceram a 22 °C durante 2 0 a 30 min. Um sobrenadante rico em granulócitos foi, então, transferido para um tubo fresco e centrifugado a 2®0 x g, ® min, 22 °C; o sobrenadante foi aspirado e descartado. Os RBCs contaminantes foram removidos com uma lise osmótica, brevemente, o pélete de célula foi ressuspenso em 7,® mL de 0,2ô de NaCl,* suavemente misturado durante ®® a 60 segundos e 17,® mL de uma solução de NaCl a 1,2ô foram adicionados. O volume foi, então, levado a ®0 mL com PBS e girado a 2®0 x g durante ® min, o pélete foi ressuspenso em 7,® mL de 0,2ô de NaCl para repetir a lise uma segunda vez. 0 pélete de granulócito final foi ressuspenso em RPMI/10Ô de FBS. Esses neutrófilos foram estimulados com PGN (InVivogen, tlrl-pgnsa, SanDiego, CA, EUA) de um dia para o outro para gerar neutrófilos ativados que podem estimular TREM-1. As células repórteres BWZ/hTREM-1 foram, então, adicionadas às culturas de neutrófilo ativado PGN numa razão de 1:3 de célula repórter:neutrófilos. Em vez de neutrófilos ativados, um complexo de ligante de TREM-1 que consiste em PGLYRP1 (SEQ ID NO: 23) e PGN pode ser utilizado para estimular TREM-1. 0 ensaio foi executado por uma placa de cultura celular preta revestida com Poli-D-Lisina (n- 3®6640 de BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). A ativação de TREM-1 foi lida após 24 horas de cultura com a utilização do reagente BetaGlo (E4720 de Promega, Madison, WI, EUA) e a luminescência medida com a utilização de um contador de luminescência TopCount de Perkin Elmer. 0 controlo positivo TREM-1 pode ser ativado por um anticorpo de TREM-1 ligado à placa (RÍD MAB1278, Minneapolis, MN, EUA) que pode opor TREM-1. As placas foram revestidas com controlo de isótipo ou anticorpo de TREM-1 MAB1278 (3 ug/mL em PBS, 100 uL/poço) no refrigerador 0/N ou durante 2 h a 37 °C, ®ô de C02 antes das células repórter BWZ/hTREM-1 serem adicionadas. Após 6 a 24 horas de incubação, a ativação de TREM-1 pode ser lida com a utilização do reagente BetaGlo (E4720 de Promega, Madison, WI, EUA) e a luminescência medida com a utilização de um contador de luminescência TopCount de Perkin Elmer. Essa linhagem celular BWZ.36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ (a "célula repórter BWZ/hTREM-1") se demonstrou altamente responsiva à reticulação mediada por anticorpo de TREM-1, gerando uma indução de ~ 40 vezes da produção de LacZ acionada por NFAT quando estimulada com 1 a 10 pg/mL de anticorpo anti-TREM-1 comercialmente disponível ligado à placa, em comparação com o controlo de isótipo (Figura 1) . Quando estimulado com um coquetel de recetor "toll-like" (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich, Dinamarca) independente (BWZ+TLR), nenhum aumento no sinal foi observado. Adicionalmente, os neutrófilos não ativados podem não estimular TREM-1, enquanto os neutrófilos ativados de coquetel de agonista de TLR (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich, Dinamarca) podem estimular a célula repórter BWZ/hTREM-1. A Tabela 1 abaixo mostra que os anticorpos de TREM-1 divulgados no presente documento podem bloquear a ativação de TREM-1 induzida por ligante em tal ensaio de BWZ/hTREM-1 de célula repórter.

Tabela 1

Nenhum dos anticorpos comercialmente disponíveis testados: MAB1278 (n- cat. MAB1278, RÍD Systems,

Minneapolis, MN ®®413, EUA), anti-TREM-1 HPA (n- cat. HPA00®®63, Sigma, St Louis, MO, EUA), TREM26 (n~ cat. 314x02, Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA) e TREM37 (n£ cat. 316102, Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA) pôde bloquear o sinal de TREM-1.

Exemplo 7: Mapeamento de epítopo com a utilização de HX-MS Materiais

Os lotes de proteína utilizados foram: hTREM-1: TREM-1 recombinante humano, não glicosilado, produzido em E. coli. (n- cat. PR0-4®7, ProSpec-Tany

TechnoGene Ltd., Rehovot, Israel). _Tabela 2,- mAbs utilizado_

Todas as proteínas foram permutadas em tampão para PBS a pH 7,4 antes das experiências.

Métodos: Experiências de HX-MS

Instrumentação e registo de dados

As experiências de HX foram automatizadas por um robô Leap (H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.) operado pelo software LeapShell (Leap Technologies Inc.), que realizou a iniciação da reação de permuta de deutério, controlo de tempo de reação, reação de arrefecimento, injeção no sistema UPLC e controlo de tempo de digestão. 0 robô Leap foi equipado com duas pilhas controladas por temperatura mantidas a 20 °C para armazenamento de tampão e reações de HX e mantidas a 2 °C para armazenamento de proteína e solução de arrefecimento brusco, respetivamente. O robô Leap conteve adicionalmente uma unidade Trio VS arrefecida (Leap Technologies Inc.) que mantém as pré-colunas e colunas analíticas, assim como a coluna de pepsina, a tubulação LC e as válvulas de comutação a 1 °C. As válvulas de comutação da unidade Trio VS foi atualizada de válvulas de comutação de HPLC para Microbore UHPLC (Cheminert, VICI AG) . Para a digestão de pepsina em linha, 100 pL de amostra arrefecida bruscamente que contém 200 pmol de hTREM-1 foram carregados e passados sobre o Cartucho de Pepsina Imobilizada Poroszyme® (2,1 x 30 mm (Applied Biosystems)) com a utilização de uma taxa de fluxo isocrática de 200 pL/min (0,1% de ácido fórmico:CH3CN a 95:5). Os péptidos resultantes foram retidos e dessalinizados numa pré-coluna VanGuard BEH C18 1,7 pm (2,1 x 5 mm (Waters Inc.)).

Subsequentemente, as válvulas foram comutadas para colocar a pré-coluna em linha com a coluna analítica, UPLC-BEH C18 1,7 pm (2,1 x 100 mm (Waters Inc.)), e os péptidos separados com a utilização de um gradiente de 9 min de 15 a 3®ô de B entregue a 200 pL/min a partir de um sistema de AQUITY UPLC (Waters Inc.). As fases móveis consistiram em A: 0,lô de ácido fórmico e B: 0,lô ácido fórmico em CH3CN. Os dados de ESI MS e os dados separados dependentes de aquisições MS/MS (CID) e experiências de energia elevada (MSe) foram adquiridas em modo de ião positivo com a utilização de um Q-TOF Premier MS (Waters Inc.). Leucina-encefalina foi utilizada como a lock mass ( [M+H] * ião atm/z®®6.2771) e dados foram colhidos no modo contínuo (Para descrição adicional das definições, veja-se Andersen e Faber, Int. J. Mass Spec., 302, 13x a 148(2011)).

Análise de dados

Os péptidos pépticos foram identificados em experiências separadas com a utilização de CID MS/MS padrão ou métodos de MSE (Waters Inc.) . Os dados de MSE foram processados com a utilização de BiopharmaLynx 1.2 (versão 017) . A aquisição de MS/MS dependente de dados de CID foi analisada com a utilização do software MassLynx e banco de dados MASCOT doméstico.

Os arquivos de dados brutos HX-MS foram submetidos à correção de lock mass contínua. A análise de dados, isto é, a determinação centroide de péptidos deuterados e plotagem de curvas em permuta foi realizada com a utilização de software personalizado de protótipo (navegador HDX, Waters Inc.) e HX-Express ((versão Beta); Weis et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006)). Todos os dados também foram visualmente avaliados para garantir que apenas envelopes isotópicos de péptido resolvidos foram submetidos à análise.

Experiência de mapeamento de epítopo A permuta de hidrogénio de amida/deutério (HX) foi iniciada por uma diluição de 6 a 8 vezes de hTREM-1 na presença ou ausência de mAb no tampão deuterado correspondente (isto é, PBS preparado em D20, x6ô de D20 final, pH 7,4 (valor não corrigido)). Todas as reações de HX foram executadas a 20 °C e continham 4 μΜ de hTREM-1 na ausência ou presença de 4 μΜ de mAb gerando, desse modo, um excesso molar de 2 vezes de sítios de ligação mAb. Em intervalos de tempo apropriados na faixa de 10 segundos a 10.000 s, ®0 pL de alíquotas da reação HX foram arrefecidos bruscamente por ®0 pL de tampão de arrefecimento brusco a frio (1,3®M de TCEP) resultando num pH final de 2,® (valor não corrigido).

Resultados e Discussão

Essa experiência mapeia os epítopos de mAbs 0023, 0024, 002®, 0026 e os mAbs MAB1278 (RnD Systems) e Clone26 (Biolegend) comerciais em hTREM-1. 0 curso de tempo HX de 43 péptidos que cobre x4% da sequência primária de hTREM-1 foi monitorado na ausência ou presença dos oito mAbs diferentes durante 10 a 10.000 s. A proteção de troca observada nos pontos no tempo iniciais, por exemplo, < 300 s, referem-se aos protões de amida expostos em superfície e também se referem, desse modo, a interfaces de proteína. Em contraste, os efeitos observados posteriormente no curso do tempo estão relacionados com a permuta lenta de hidrogénios de amida e, desse modo, relacionados com o núcleo estrutural da proteína. Portanto, os efeitos de epítopo surgem nos pontos no tempo iniciais, enquanto efeitos de estabilização estruturais se manifestarão como redução de permuta em pontos no tempo posteriores (Garcia, Pantazatos e Villareal, Assay and Drug Dev. Tech. 2, 81 (2004); Mandell, Falick e Komives, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, x®, 1470® (lxx8)) . O padrão de permuta observado nos pontos no tempo iniciais na presença ou ausência de urn dado mAb pode ser dividido em dois grupos diferentes: Um grupo de péptidos exibe um padrão de permuta que é não afetado por ligação de mAb. Em contraste, outro grupo d péptidos em hTREM-1 mostra proteção de permuta mediante ligação de mAb. Por exemplo em permuta de 100 s com D20, aproximadamente 2 amidas são protegidas da permuta na região Y111-F126 de mAb 0023. As regiões que exibem tais efeitos de proteção são atribuídas à região de epítopo.

Mapeamento de Epítopo de mAbs 0023 e 0026 mAbs 0023 e 0026 induzem alterações idênticas no perfil de permuta de hTREM-1 e serão e descritos juntos aqui. As regiões que exibem a proteção mediante ligação 0023/0026 abrangem os péptidos que cobrem os resíduos T22-Lx6 e Y111-D127. Entretanto, ao comparar as quantidades relativas de proteção de permuta dentro de cada péptido mediante ligação de mAb 0023/0026 e a falta de efeitos de epítopo nos péptidos T2®-F48, R84-Q112 e péptidos que começam em P118, o epítopo pode ser restrito aos resíduos A21-E26, A4x-I8® e C113-Pllx. Embora distantes em sequência, essas regiões são próximas na estrutura 3D de hTREM-1.

Mapamento de Epítopo de mAb 0024 e Biolegend Clone 26 mAb 0024 e Clone26 de Biolegend induzem alterações idênticas no perfil de permuta de hTREM-1 e serão e descritos juntos aqui. As regiões que exibem a proteção mediante ligação de mAb 0024 abrangem os péptidos que cobrem os resíduos V101-Q112. Ao comparar as quantidades relativas de proteção de permuta dentro de cada péptido mediante ligação de mAb 0024 e a falta de efeitos de epítopo nos péptidos circundantes, o epítopo pode ser restrito aos resíduos Q104-Q112 (Figuras 7B).

Mapeamento de Epítopo de NNC mAb 0025

As regiões que exibem a proteção mediante ligação 002® abrangem os péptidos que cobrem os resíduos D38-M63, T7Q-Lx6 e Y111-D127 (Figuras 7C) . Entretanto, ao comparar as quantidades relativas de proteção de permuta dentro de cada péptido mediante ligação de 02®4-002® e a falta de efeitos de epítopo nos péptidos em regiões circundantes, o epítopo pode ser restrito aos resíduos V3x-Q®6, T70-I8® e C113-

Pllx. Embora distantes em sequência, essas regiões são próximas na estrutura 3D de hTREM-1 (Figura 8).

Mapeamento de Epítopo de MAB1278

As regiões que exibem a proteção mediante ligação MAB1278 abrangem os péptidos que cobrem os resíduos T70-Lx6 e V101-Q112 (Figuras 7D). Entretanto, ao comparar as quantidades relativas de proteção de permuta dentro de cada péptido mediante ligação de MAB1278 e a falta de efeitos de epítopo nos péptidos em regiões circundantes, o epítopo pode ser restrito aos resíduos T70-18® e Q104-Q112. Embora distantes em sequência, essas regiões são próximas na estrutura 3D de hTREM-1. A posição estrutural dos epítopos de mAbs 0023/0026 e mAb 002® são mostradas na Figura 7A. 0 epítopo de mAbs 0023 e 0026 parece residir primariamente nas lâminas β na interface de dímero do dímero de estrutura cristalina de hTREM-1. 0 antagonismo desses mAbs pode ser um resultado de impedir a dimerização de hTREM-1 e, desse modo, a sinalização.

Exemplo 8: Determinação da interface de interação entre TREM-1 e mAb 0170

Os epítopos foram mapeados tanto em TREM-1 humano recombinante quanto de macaco cinomolgo (hTREM-1 e cTREM-1, respetivamente). 0 construto de hTREM-1 utilizado nesse exemplo compreende os resíduos M1-H140 (SEQ ID MO: 18) e o construto cTREM-1 compreende os resíduos M1-R180 de (SEQ ID NO: 12) com seis resíduos de histidina adicionados ao terminal C e com a utilização da numeração de aminoácido de hTREM-1 do tipo selvagem. Ao longo desse exemplo, os aminoácidos de cTREM-1 são numerados de acordo com o resíduo análogo em hTREM-1, conforme ilustrado na Figura 11. A numeração utilizada nesse exemplo pode ser convertida para a numeração em SEQ ID NO: 12 subtraindo-se lx se o número de resíduo for ®8 ou menor e subtraindo-se 20 se o número de resíduo for 60 ou maior. Como exemplo, o número de resíduo E4 6 em cTREM-1 nesse exemplo corresponde ao resíduo (46 - lx = 27) E27 em SEQ ID NO: 12. 0 número de resíduo em Lx6 em cTREM-1 nesse exemplo corresponde ao resíduo (x6 - 20 = 76) L76 em SEQ ID NO: 12.

As soluções de TREM-1, independentes ou na presença de mAb 0170, foram diluídas 2® vezes em x7ô de tampão hepes deuterado (20 mM de hepes, 1®0 mM de cloreto de sódio, pH 7,4). Os controlos não deuterados foram preparados ao diluir em tampão hepes protonado. As experiências de permuta de hidrogénio foram realizadas num sistema de

cromatografia líquida de desempenho ultra alto (UPLC) waters HDX nanoAcquity (Waters Corporation, Milford, MA, EUA) que incluiu o autoamostrador HD-x PAL (LEAP

Technologies Inc., Carrboro, NC, EUA) para preparação de amostra automatizada. A tubulação LC, as pré-colunas e colunas analíticas e as válvulas de comutação foram localizadas numa câmara arrefecida a 0,3 °C. A coluna de digestão de tripsina foi armazenada a 1® °C. As reações de permuta de hidrogénio foram realizadas a 20 °C. A análise de massa foi realizada online com a utilização de um espectrómetro de massa de Waters SYNAPT G2 HDMS.

Um volume que contém 100 pmol de TREM-1 humano ou de macaco cinomolgo (1, ®4 a 1, x8 pL) com ou sem 120 pmol de mAb 0170 foi diluído em hepes tampão deuterado até um volume final de ®0 pL. Nos intervalos de tempo apropriados, o volume inteiro foi transferido e arrefecido bruscamente em ®0 pL de 1,3® mM de Tris (2-carboxietil) fosf ina adjustados a pH 2,4 e mantidos a 3 °C. xx pL da solução arrefecida bruscamente foram imediatamente injetados e passados por uma coluna de pepsina imobilizada por Porozyme (2,1 mm x 30 mm) (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EUA) e retidos numa coluna de Waters VanGuard BEH C18 de 1,7 pm (2.1 mm § ® mm) a 100 pL/min de taxa de fluxo com a utilização de uma fase móvel de ®ô (vol/vol) de metanol e 0, lô de ácido fórmico. Os péptidos foram separados numa colunaa Waters UPLC BEH C18 1,7 pm (1,0 mm x 100 mm) com a utilização de um gradiente de 10 a 40ô de acetonitrila contendo 0,lô de ácido fórmico numa taxa de fluxo de 40 pL/min. 0 espectrómetro de massa foi operado em modo de ião positivo com separação de mobilidade de ião habilitada. As condições de eletroaspersão foram 3,2 kV de capilar, 2® V de cone de amostra e 4 V de deslocamentos de cone de extração, 8®0 mL/min de fluxo gasoso de dessolvatação de azoto aquecido a 3®Q °C e ®Q mL/min de fluxo gasoso de cone. 0 bloco de fonte foi aquecido a 120 °C. Os dados de correção de lock mass foram adquiridos com a utilização do ião 1± d Leucina-encefalina (m/z ®®6,2771) como composto de referência e aplicados durante a análise de dados. Para a identificação de péptido, as experiências do tipo MSE com a utilização de deslocamentos de colisão de retenção de 6 V (energia baixa) e ®0 V (energia elevada) foram realizadas. As amostras deuteradas foram analisadas com a utilização de deslocamento de colisão de retenção de energia baixa de 6 V apenas. Para detalhes adicionais, veja-se Andersen, M.D., Faber, J.H., Int. J. Mass Spectrom. (2011), 302, 139 a 148.

Os dados de MSE foram analisados com a utilização do Servidor Global Waters ProteinLynx 2.® e péptidos de hTREM-1 foram identificados como cobrindo 80ô da sequência de proteína (Tabela 3) e péptidos de cTREM-1 foram identificados como cobrindo 100Ô da sequência de proteína (Tabela 4). Os arquivos de dados HX-MS foram analisados com a utilização de Waters DynamX 1.0 que aplica automaticamente a correção de lock mass e determina o grau de incorporação de deutério em cada péptido. Além disso, todos os dados foram manualmente inspecionados para garantir a atribuição de pico correta e o cálculo de incorporação de deutério.

Resultados

Uma lista dos péptidos e seus padrões de permuta é fornecida na Tabela 3.

Quando mAb 0170 ligou-se a hTREM-1, a proteção da permuta foi observada em péptidos que cobrem a sequência de A21 a Lx6 e o epítopo foi consequentemente determinado como dentro dessa região. Ao levar em consideração os péptidos que não mostram proteção da permuta mediante ligação de mAb 0170, o epítopo pôde ser estreitado às regiões D38-F48. A região de R84-Lx6 mostrou de pouca a nenhuma permuta na presença ou ausência de mAb 0170 e não foi possível concluir se essa região foi parte do epítopo de ligação de mAb 0170. 0 péptido K47-A68 não mostrou proteção da permuta mediante ligação de mAb 0170, mas o péptido T44-C6x foi protegido q uando mAb 0170 foi ligado. Os primeiros dois resíduos de um péptido permuta de modo inverso e rápido e as informações de permuta para aqueles resíduos é perdida.

Concluiu-se que pelo menos um dos resíduos E46, K47 e F48 foi importante para a ligação de mAb 0170.

Tabela 3: Resultados de mapeamento de epítopo de HX-MS de mAb 0170 em TREM-1 humano

Epltopo de mAb 0170 em cTREM-1

Uma lista dos péptidos e seus padrões de permuta é dada na Tabela 4.

Quando mAb 0170 se ligou a cTREM-1, a proteção da permuta foi observada em péptidos que cobrem a sequência de E38 a A68 e o epítopo foi consequentemente determinado como dentro dessa região. Ao levar em consideração os péptidos que não mostram proteção da permuta mediante ligação de mAb 0170, o epítopo pôde ser estreitado às regiões E38-L4®. Esse epítopo correspondeu bem com o epítopo de mAb 0170 em hTREM-1, mas foi truncado por três resíduos. 0 péptido C44-T6x em hTREM-1 foi protegido mediante ligação de mAb 0170, mas os péptidos A44-L67 e A44-A68 que cobrem a sequência correspondente em cTREM-1 não foram protegidos. Desse modo, enquanto pelo menos um dos resíduos E4 6, K47 e F48 in hTREM-1 contribuiu para o epítopo de ligação, os resíduos correspondentes E46, K47 e Y48 não foram envolvidos na ligação de mAb 0170 a cTREM-1.

Tabela 4: Mapeamento de epítopo de HX-MS de mAb 0170 em __TREM-1 de macaco cinomolgo__

Exemplo 9: Estudo de cinética de interação para anticorpos anti-TREM-1 para TREM-1 humano e de macaco cinomolgo por Ressonância de Plasmão de Superfície (SPR)

Os estudos de ligação foram realizados num analisador ProteOn (BioRad) que mede interações moleculares em tempo real através da ressonância de plasmão de superfície. As experiências foram executadas a 2® °C e as amostras foram armazenadas a 1® °C no compartimento de amostra. 0 sinal (RU, unidades de resposta) relatado pelo ProteOn é diretamente correlacionado com a massa nas superfícies de chip de sensor individual em seis células de fluxo paralelo. 0 anticorpo monoclonal Fc anti-humano ou policlonal Fc anti-murino de kits de captura Fc humano ou de ratinho de Biacore foram imobilizados na direção horizontal em células de fluxo de um chip de sensor GLM de acordo com as instruções do fabricante. 0 nível de imobilização final do anticorpo de captura foi aproximadamente 2.600 a 6.000 RU em experiências diferentes. A captura de anticorpos anti-hTREM-1 expressos recombinantes ou de ratinho monoclonal purificados foi conduzida ao diluir os anticorpos a ® a 10 nM em tampão de teste (10 mM de Hepes, 0,1® M de NaCl, ® mM de EDTA, 0,0®% de tensioativo P20, pH 7,4) e injetados na direção vertical a 30 pL/min durante 60s, criando pontos de referência adjacentes a todas as células de fluxo apenas com anticorpo anti-Fc imobilizado. Isso resultou tipicamente nos níveis de captura finais de anticorpos de teste de aproximadamente 100 a 300 RU e valores Rmax de analito de 30 a x0 RU. A ligação de proteínas de hTREM-1 ou cTREM-1 foi conduzida injetando-se o analito (antigénio) por todas as células de fluxo na direção horizontal para permitir a análise comparativa de ligação a anticorpos anti-TREM-1 capturados diferentes em relação à ligação ao ponto de referência. As proteínas de hTREM-1 ou cTREM-1 foram diluídas em série 1:3 a 1,2 a 100 nM ou em tampão de teste, injetadas a 100 pL/min durante 2®0 s e permitiu-se a sua dissociação durante 600 s. A superfície de GLM foi regenerada após cada ciclo de injeção de analito por meio de duas injeções de 18 s de lOmM de Glicina, pH 1,7 e ®0 mM de NaOH a 100 pL/min. Essa etapa de regeneração removeu o anticorpo anti-TREM-1 e qualquer proteína de TREM-1 ligada a partir da superfície de anticorpo de captura imobilizada e permitiu-se a ligação subsequente do próximo par de amostra de interação. O procedimento de regeneração não removeu o anticorpo de captura anti-Fc diretamente imobilizado da superfície de chip. A afinidade de ligação entre anticorpos e o antigénio foi quantificada por determinação da constante de dissociação de equilíbrio (KD) determinada por medição da cinética de formação de complexo e dissociação. As constantes de taxa correspondentes à associação e à dissociação de um complexo monovalente como ka (taxa de associação) e KD (taxa de dissociação) foram recuperadas ao adaptar os dados a 1:1 de modelo de Langmuir com a utilização do software de avaliação ProteOn para análise de dados. KD é relacionado a ka e Kd através da equação KD= Ka/ ka. As curvas de ligação foram processadas por referência dupla (subtração de sinais de superfície de referência, assim como injeções de tampão em branco sobre anticorpos anti-TREM-1 capturados) antes da análise de dados. Isso permitiu a correção para ruído de instrumento, deslocamento geral e desvio durante as injeções de amostra.

Tabela 5: Resultados de medições de constantes de ligação ka (taxa de associação), KD (taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação de equilíbrio) para a interação de TREM-1 humano para anticorpos monoclonais anti-TREM-1 diferentes.

Tabela 6: Resultados de medições de constantes de ligação ka (taxa de associação), KD (taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação de equilíbrio) para a interação de TREM-1 de macaco cinomolgo para anticorpos monoclonais anti-TREM-1 diferentes.

Exemplo 10: Humanização do mAb 14F69 de TREM-1 de bloqueio.

As regiões variáveis de dois anticorpos principais foram obtidos a partir da clonagem de hibridomas 14F128A1 e 14F113A1B1C1. Ambos os anticorpos foram clonados com a utilização da técnica SMARTER-RACE (Clontech). O esforço de humanização foi realizado como um ciclo iterativo em que os anticorpos enxertados CDR foram primeiramente avaliados por afinidade e, então, reprojetados para incluir mais mutações reversas até uma afinidade aceitável ser retida com a utilização de anticorpos purificados por hibridoma como um referencial. Os anticorpos enxertados por CDR foram projetados in silico e requeridos por um vendedor comercial (www.genscript.com). A re-proj eção subsequente de anticorpos foi realizada com a utilização de mutagénese sítio-dirigida (Stratagene). Todos os anticorpos foram expressos em células HEK2x3-6E na preparação para o teste de afinidade. Abaixo há uma descrição das considerações principais para a seleção da linha germinal humana apropriada e o teste de mutações reversas. Toda a numeração d regiões variáveis utilizadas nesse exemplo refere-se ao esquema de numeração de Kabat. >ml4F128Al_H (CDRs marcadas em negrito e sublinhadas) (SEQ ID NO: 8) >ml4F128Al__L (CDRs marcadas em negrito) (SEQ ID NO: x) >ml4F113AlBlCl_H (CDRs marcadas em negrito) (SEQ ID NO: 10) >ml4F113AlBlCl_L (CDRs marcadas em negrito) (SEQ ID NO: 11) A partir de uma análise das sequências, as CDRs para ml4F128Al de acordo com a definição de Kabat são: >CDR_H1 ΤΥΑΜΗ >CDR__H2 RIRTKS[N/S]NYATYY[V/A]DSVKd >CDR_H3 DMG[I/A]RRQFAY >CDR_L1

RASESVD[S/T]F[G/D] [I/Y]SF[M/L]H >CDR_L2

RASNLES >CDR__L3

QQSNEDPYT

Com as diferenças entre ml4F128Al e ml4F113AlBlCl dadas como [ml4F128Al/ml4F113AlBlCl].

Um modelo 3D de ml4F128Al foi construído com a utilização de técnicas padrão em MOE [disponível a partir de www.chemcomp.com] e todos os resíduos dentro de 4,® A das regiões CDR efciazes (VH: 31-3®B, ®0-®8, x®-102; VL: 24-34, ®0-®6, 8x-x7) foram definidos como resíduos de máscara. Os resíduos de máscara são todos potencialmente importants para sustentar a ligação nas CDRs.

Os resíduos de máscara incluíram as posições 1-2, 4, 27-37, 47, 4x-®x, 6x, 71, 73, 78, x2-103 para a cadeia pesada e as posições 1-®, 7, 23-36, 46, 48-®6, ®8, 62, 67- 71, 88-x8 para a cadeia leve.

Com a utilização das buscas de linha germinal d ml4F128Al e inspeção manual, VH3_73 e JH4 foram identificados como sendo uma combinação de linha germinal humana apropriada para a cadeia pesada e VKIV_B3 e JK2 foram identificados como a combinação de linha germinal humana apropriada para a cadeia leve. >VH3_13/JH4

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANSYATAYA

ASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTR/YFDYWGQGTLVTVSS >VKIV_B3/JK2

DlVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVP DRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP/YTFGQGTKLEIKR A humanização foi, então, realizada com as regras a seguir: - Os resíduos fora da máscara foram interpretados como humanos. - Os resíduos dentro da máscara e dentro da CDR de Kabat foram interpretados como murinos. - Os resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com consenso ratinho/linha germinal foram interpretados como a sequência de sequência. - Os resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com diferença de ratinho/linha germinal foram submetidos às mutações reversas potenciais. 0 enxertamento das regiões de CDR eficazes de m!4F128Al nas linhas germinais formaram o construto de humanização básica de ml4F128Al, hzl4F128Al.

>hzl4F128Al__H

EVQLVESGGCLVQPQGSLKLSCAASGFTFSTYAMHWVRQASGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYA ASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDMGIRRQPAYWGQGTLVTVSS >hzl4F12 8Al__L

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDSFGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPD

RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK >CDR_H1

TYAMH >CDR_H2

RIRTKSNNYATYY AA SVK G >CDR__H3

DMGIRRQFAY >CDR__L1

RASESVDSFGISFMH >CDR L2 RASNLES >CDR_L3 QQSNEDPYT

As únicas diferenças em comparação às CDRs murinas foram m CDR_H2 (mostradas em negrito). Qualquer discrepância entre m!4F128Al e hzl4F128Al num resíduo de máscara criará uma mutação reversa potencial e a lista inclui:

hzl4F128Al__H: S30N, G4xA, A78L, Vx3T hzl4F128Al_L: M4L, M®81, G68R

Adicionalmente, a homologia próxima de ml4F128Al e ml4F113Al BI Cl foi utilizada para sugerir resíduos que podem impactar a afinidade de hzl4F128Al. hzl4F128Al_H: N®3S, lx8Q hzl4F128Al L: S27D T, G2xD, I30Y, M33L A fim de investigar todos os mAbs potencialmente humanizados, todas as combinações dos mutantes acima foram produzidas e testadas. 0 anticorpo anti-hTREMl humanizado final (mAb 0170) derivado de hibridoma 14F113 contém a mutação reversa de estrutura LC (M4L) e uma mutação HC CDR3 (Qx8I). A mutação em HC CDR3 foi introduzida com base num estudo de afinidade-sinergia com um anticorpo altamente homólogo nomeado 14F128. A razão para incluir ambas as mutações é descrita abaixo.

Estudo de afinidade-sinergia de anticorpo 14F128 e 14F113

Os anticorpos de hibridoma 14F128 e 14F113 são altamente homólogos e derivados do mesmo evento de recombinação somática. Os dois anticorpos competem em ligação de hTREMl com 14F113 tendo a afinidade mais alta. No total, as versões enxertadas de CDR dos dois anticorpos diferem em suas composições de CDR por apenas seis aminoãcidos (quatro em LC CDR, e dois em HC CDR) . As seis mutações, quando comparando-s 14F113 a 14F128, são LC T27dS, D2xG, Y30I, L33M e HC S®4N, Qx8I. Embora 14F128 enxertado de CDR tinha uma afinidade inferior ao 14F113 enxertado de CDR, foi investigado se um efeito de afinidade benéfico de uma ou uma ou mais de entre seis mutações foi suprimido por o efeito geral quando todas as seis mutações estiveram presentes. Todas as seis mutações (exceto HC S®4N) foram, portanto, individualmente introduzidas no anticorpo 14F113 enxertado de CDR e os anticorpos foram classificados por afinidade. As duas mutações (LC L33M e HC Qx8I) tiveram capacidade individualmente para melhorar a afinidade de 14F113 enxertado de CDR. Uma mutação de HC na posição Qx8I deu origem a uma afinidade particularmente satisfatória do anticorpo resultante (mAb 0170) .

Análise de afinidade de mutação reversa de estrutura A versão de ratinho do anticorpo 14F113 teve sete mutações que foram potencialmente necessárias para inclusão como mutações reversas durante a humanização. As mutações reversas potenciais em HC e LC foram S30N, G4xA, A78L e Tx3V M4L, V®81, G68R, respetivamente. As sete mutações reversas foram introduzidas individualmente em 14F113 enxertado de CDR e, então, classificadas por afinidade. Embora as diversas mutações tenham capacidade para melhorar a afinidade, apenas a mutação de LC M4L foi selecionada para mAb 0170. A decisão de incluir as mutações foi equilibrada em relação ao título de expressão (ΗΕΚ2χ3 6E), afinidade e o número total de mutações.

Exemplo 11: Estudo de interação cinética para anticorpos de TREM-1 para hTREM-1 por Ressonância de Plasmão de Superfície (SPR): comparação entre mAb 0170 e anticorpos de TREM-1 comercialmente disponíveis.

Os estudos de ligação foram realizados num analisador ProteOn (BioRad) que mede interações moleculares em tempo real através da ressonância de plasmão de superfície. As experiências foram executadas a 2® °C e as amostras foram armazenadas a 1® °C no compartimento de amostra. 0 sinal (RU, unidades de resposta) relatado pelo ProteOn é diretamente correlacionado com a massa nas superfícies de chip de sensor individual em seis células de fluxo paralelo. Os anticorpos comercialmente disponíveis incluídos foram Biolegend n2 314x07, Biolegend n2 316102 (Biolegend, EUA), Hycult Biotech HM22®2 (Hycult Biotech, Holanda), R&amp;D η2 MAB1278 (R&amp;D systems, Reino Unido), SCx8Z12 (Santa Cruz Biotechnology, EUA), Sigma n2 WH00®4210m4, Sigma n2 SAB140®121 (Sigma-Aldrich, Dinamarca A/S) 0 anticorpo monoclonal Fc anti-humano ou policlonal Fc anti-murino de kits de captura Fc humano ou de ratinho de Biacore foram imobilizados na direção horizontal em células de fluxo de um chip de sensor GLM de acordo com as instruções do fabricante. 0 nível de imobilização final do anticorpo de captura foi aproximadamente 2.600 a 6.000 RU em experiências diferentes. A captura de anticorpos anti-hTREM-1 humanizados expressos recombinantes ou de ratinho monoclonal purificados foi conduzida ao diluir os anticorpos a ® a 10 nM em tampão de teste (10 mM de Hepes, 0,1® M de NaCl, ® mM de EDTA, 0,0®% de tensioativo P20, pH 7,4) e injetados na direção vertical a 30 pL/rnin durante 60s, criando pontos de referência adjacentes a todas as células de fluxo apnas com anticorpo anti-Fc imobilizado. Isso resultou tipicamente nos níveis de captura finais de anticorpos de teste de aproximadamente 100 a 300 RU e valores Rmax de analito de 30 a x0 RU. A ligação de proteínas de hTREM-1 ou cTREM-1 foi conduzida injetando-se o analito por todas as células de fluxo na direção horizontal para permitir a análise comparativa de ligação a anticorpos anti-TREM-1 capturados diferentes em relação à ligação ao ponto de referência. As proteínas de hTREM-1 ou cTREM-1 foram diluídas em série 1:3 a 1,2 a 100 nM ou em tampão de teste, injetadas a 100 pL/min durante 210 s e permitiu-se a sua dissociação durante 600 s. A superfície de GLM foi regenerada após cada ciclo de injeção de analito por meio de duas injeções de lOmM de Glicina, pH 1,7 e ®0 mM de NaOH a 100 pL/min. Essa etapa de regeneração removeu o anticorpo anti-TREM-1 e qualquer proteína de TREM-1 ligada a partir da superfície de anticorpo de captura imobilizada e permitiu-se a ligação subsequente do próximo par de amostra de interação. O procedimento de regeneração não removeu o anticorpo de captura anti-Fc diretamente imobilizado da superfície de chip. A afinidade de ligação entre anticorpos e o antigénio foi quantificada por determinação da constante de dissociação de equilíbrio (KD) determinada por medição da cinética de formação de complexo e dissociação. As constantes de taxa correspondentes à associação e à dissociação de um complexo monovalente como ka (taxa de associação) e Kd (taxa de dissociação) foram recuperadas ao adaptar os dados a 1:1 de modelo de Langmuir com a utilização do software de avaliação ProteOn versão 3.1.0.6 para análise de dados. KB é relacionado a ka e KD através da equação KD= Kd/ ka.

As curvas de ligação foram processadas por referência dupla (subtração de sinais de superfície de referência, assim como injeções de tampão em branco sobre anticorpos anti-TREM-1 capturados) antes da análise de dados. Isso permitiu a correção para ruído de instrumento, deslocamento geral e desvio durante as injeções de amostra.

Tabela 7: Resultados de medições de KD (constante de dissociação de equilíbrio) para a interação de TREM-1 humano e de macaco cinomolgo para anticorpos monoclonais anti-TREM-1 diferentes.

Exemplo 12: Estudos de ligação competitiva de anticorpos monoclonais de anti-TREM-1 humano por Ressonância de Plasmão de Superfície.

Os estudos de competição de ligação SPR foram realizados com anticorpos anti-hTREM-1 humanizados expressos recombinantes ou de ratinho monoclonal a fim de distinguir entre sítios de ligação diferentes (epítopos). Os anticorpos comercialmente disponíveis incluídos foram Biolegend n° 314x07 (Biolegend, EUA) e SCx8Z12 (Santa Cruz Biotechnology, EUA). Os anticorpos monoclonais hTREM-1 que competem pelo mesmo ou por um sítio de ligação sobreposto (epítopo) no antigénio não podem ligar-se simultaneamente ao antigénio e são, portanto, atribuídos ao mesmo "recipiente". Os anticorpos monoclonais anti-TREM-1 que não competem pelo mesmo ou por o sítio de ligação sobreposto no antigénio podem ligar-se simultaneamente e são atribuídos desse modo a "recipientes" diferentes. As experiências foram realizadas com domínio extracelular TREM-1 humano solúvel como antigénio.

Todos os estudos foram executados a 2® °C e as amostras foram armazenadas a 1® °C no compartimento de amostra. Os anticorpos monoclonais anti-TREM-1 individuais e um anticorpo monoclonal de controlo não relacionado foram imobilizados em células de fluxo separadas de um chip de sensor GLC com a utilização de uma mistura 1:1 de 0,4 M de EDAC [cloridrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropi1)carbodiimida] e 0,1 M de Sulfo-NHS [N-hidroxisulfosuccinimida]. Cada anticorpo foi diluído em 10 mM de acetato de sódio a pH ®,0 até uma concentração de 2® ou 10 (SCx8Z12 (803x4)) pg/mL, e foi imobilizado para uma célula de fluxo individual a 30 pL/min durante 240 s. Os anticorpos foram imobilizados para as células de fluxo LI a L6 (incluindo controlo). Após a imobilização do anticorpo, os sítios ativos na célula de fluxo foram bloqueados com 1 M de etanolamina. As imobilizaçõs foram realizadas com ativação e desativação numa direção horizontal que cria pontos de referência sem proteína imobilizada. 0 nível de imobilização final de anticorpos de teste esteve na faixa de aproximadamente 1100 a 1300 RU numa experiência, exceto por um anticorpo (SCx8Z12) em que apenas 3x0 RU foram imobilizados. 0 TREM-1 humano recombinante foi diluído a 100 nM em tampão de teste (10 mM de Hepes, 0,1® M de NaCl, ® mM de EDTA, 0,0®ô de tensioativo P20, pH 7,4) . O antigénio foi injetado sobre anticorpos imobilizados na direção horizontal a 30 pL/min durante 300 s, permitindo o controlo de ligação não específica potencial tanto para pontos de referência quanto para anticorpos de controlo imobilizados que resulta em 1®Q a 600 RU de TREM-1 capturado, exceto para um anticorpo (SCx8Z12) com nível de imobilização baixo em que apenas 4 RU foram capturados.

Cada anticorpo (os mesmos que foram imobilizados) foi injetado por células de fluxo paralelas numa direção horizontal para permitir a análise comparativa de ligação a hTREM-1 capturado pelos anticorpos primários em relação à ligação tanto dos pontos de referência quanto dos anticorpos de controlo imobilizados. Cada anticorpo competitivo foi diluído até 100 nM e injetado a 100 pL/min durante 2®0 s. O chip de GLC foi regenerado após cada ciclo de injeção de analito por meio de duas injeções de 18 s de 1 M de ácido fórmico a pH 3,®, 3M de MgCl2 e ®0 mM de NaOH a 100 pL/min. Essa etapa de regeneração removeu o antigénio de TREM-1 e qualquer secundário anticorpo ligado a partir da superfície de anticorpo imobilizado, e permitiu a ligação subsequente da próxima amostra de teste. 0 procedimento de regeneração não removeu o anticorpo de teste anti-TREM-1 diretamente imobilizado (anticorpo primário) da superfície de chip. A análise de dados foi realizada com o software ProteOn ManagerTM 3.1.0.6. Os níveis de captura foram avaliados para garantir que a etapa de regeneração forneceu uma superfície de ligação consistente através da sequência de injeções. Nenhuma ligação não específica significativa de TREM-1 humano às superfícies de controlo de ponto ou ao anticorpo de controlo imobilizado foi observada. As curvas de ligação foram processadas por subtração de sinais de superfície de controlo de ponto. Isso permitiu a correção para ruído de instrumento e deslocamento geral durante as injeções de amostra.

Os resultados de competição foram relatados como ligação positiva ou negativa (Tabela 8). A ligação positiva (±) indica que o anticorpo competitivo teve capacidade para se ligar ao hTREM-1 simultaneamente com o anticorpo primário (isto é, os mesmos não competem), e os anticorpos primários e competitivos foram consequentemente atribuídos a recipientes de epítopo diferentes. A ligação negativa indica que o anticorpo competitivo não teve capacidade para se ligar ao hTREM-1 simultaneamente com o anticorpo primário (isto é, os mesmos competem) e os anticorpos primários e competitivos foram atribuídos, desse modo, ao mesmo recipiente de epítopo. Os valores de resposta nessas experiências foram significantes e permitidos para uma determinação não ambígua de recipientes de epítopo dos anticorpos monoclonais anti-TREM-1.

Tabela 8: Habilidade para ligar (+) ou competir (-) por anticorpos testados em ensaio de competição de SPR. SC98Z12 não gerou captura alta o suficiente de TREM-1 para avaliar como anticorpo

primário (*). MAb 0170 e mAb 0048 (purificados a partir de hibridoma 14F11, que é idêntico a 14F128) demonstraram competir pela ligação ao TREM-1 humano. Biolegend n° 314x07 e SCx8Z12 não competiram com qualquer um desses por ligação ao TREM-1 humano, mas competiram entre si. Essas constatações concluem que os primeiros dois (mAb 0048 e mAb 0170) pertenceram ao mesmo recipiente (Binl) enquanto Biolegend n- 314x07 e SCx8Z12 pertenceu a outro recipiente (Bin2). Exemplo 13: Análise cinética da interação entre Fab 0011 e Fab 0170 que se ligam a versões que sofreram mutação de TREM-1 humano e de macaco cinomolgo

Os estudos de interação foram realizados por SPR para definir as diferenças nos epítopos para os anticorpos anti-TREM-1 humano 0011 e 0170 em TREM-1 humano, ao comparar a cinética de ligação às variantes de TREM-1 humano com mutações de Alanina introduzidas nos epítopos conhecidos, assim como as variantes parcialmente "humanizadas" de TREM-1 de macaco cinomolgo, o último visto que mAb 0170 reage de modo cruzado com TREM-1 de macaco cinomolgo, resíduos de aminoãcido únicos para o respetivo epítopo foram identificados.

Os construtos mutantes de alanina de domínio extracelular de hTREM-1 e construtos de mutante de macaco cinomolgo parcialmente humanizados utilizados nesse estudo são resumidos na Tabela x. Todos os construtos utilizados foram variantes de SEQ ID NO:lx (variantes de TREM-1 de macaco cinomolgo) ou SEQ ID NO: 20 (variantes de TREM-1 humano) e incluíram uma etiqueta -cmyc2-His6 de terminal C para captura em ensaio de cinética de ligação de SPR. A menos que declarado de outro modo, as sequências denominadas nesse exemplo são numeradas de acordo com a Figura 11.

Tabela 9

Os estudos de ligação foram realizados num analisador ProteOn que mede interações moleculares em tempo real através da ressonância de plasmão de superfície. As experiências foram executadas a 2® °C e as amostras foram armazenadas a 1® °C no compartimento de amostra. 0 sinal (RU, unidades de resposta) relatado pelo ProteOn é diretamente correlacionado com a massa nas superfícies de chip de sensor individual em seis células de fluxo paralelo. 0 anticorpo monoclonal anti-His foi imobilizado em 6 células de fluxo paralelo de um chip de sensor GLM com a utilização de uma mistura 1:1 de 0,4 M de EDAC [cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida] e 0,1 M de Sulfo-NHS [N-hidroxisulfosuccinimida]. O anticorpo foi diluído em 10 mM de acetato de sódio a pH ®,0 até uma concentração de 2® pg/mL, e foi imobilizado para células de fluxo individual a 30 pL/min durante 240 s. Após a imobilização do anticorpo, os sítios ativos nas células de fluxo foram bloqueados com 1 M de etanolamina. A imobilização foi realizada com todas as etapas na direção horizontal. O nível de imobilização final de anticorpo de captura foi aproximadamente 8.000 RU em uma experiência. O meio de cultura celular de células HEK 2x3 que expressam variantes do tipo selvagem ou que sofreram mutação diferentes de TREM-1 humano ou de macaco cinomolgo ECD foi diluído de 40 a 60 vezes em tampão de teste (10 mM de HEPES, 1®0 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,0®% de tensioativo P20, pH 7,4). As proteínas de TREM-1 foram injetadas por anticorpo de captura anti-His imobilizado na direção vertical em 30 pL/min durante 60 s. Isso resultou em ®0-2®0 RU de TREM-1 capturado e criou pontos de referência apenas com anticorpos de captura imobilizados, mas nenhum TREM-1 capturado na direção horizontal. Cada Fab foi injetado por células de fluxo paralelo na direção horizontal para permitir a análise cinética de ligação a variantes de TREM-1 capturadas por anticorpo anti-His. Antes da injeção, cada Fab foi diluído para 0, ®,® (em uma experiência), 16,7 e ®0 nM no tampão de teste, e injetado a 100 pL/min durante 2®0 s (tempo de associação). 0 tempo de dissociação após essas injeções foi monitorado durante 10 minutos. 0 chip de GLM foi regenerado após cada ciclo de interação de TREM-1 e Fab por meio de duas injeções de 18 s de 10 mM de Glicina e ®0 mM de NaOH a 100 pL/min. Essa etapa de regeneração removeu as variantes TREM-1 e qualquer Fab ligado a partir da superfície de anticorpo anti-His, e permitiu a ligação subsequente do próximo par de interação. 0 procedimento de regeneração não removeu o anticorpo de captura anti-His diretamente imobilizado da superfície de chip. A fim de obter os dados de cinética, como ka (taxa de associação), Kd (taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação de equilíbrio) , a análise de dados foi realizada com a utilização do software proteon Manager™ 3.1.0.6. Os níveis de captura e ligação de amostras excutadas em duplicatas ou triplicatas foram avaliados para garantir que a etapa de regeneração forneceu uma superfície de ligação consistente através da sequência de injeções. Nenhuma ligação não específica significante a pontos de referência apenas com anticorpo de captura imobilizado foi observada. As curvas de ligação foram processadas por subtração de sinais de superfície de controlo de ponto, assim como injeção de tampão de teste. Isso permitiu a correção para ruído de instrumento e deslocamento geral durante as injeções de amostra. A afinidade de 0170 Fab e 0011 Fab a variantes de ECD de TREM-1 diferentes quando em comparação à afinidade ao ECD de TREM-1 humano do tipo selvagem ou de macaco cinomolgo. 0 nível de ligação 10 s após o fim de injeção de Fab normalizado até o nível de variante de TREM-1 capturada também foi avaliado a fim de identificar as versões que sofreram mutação com ligação revogada ou muito baixa. Uma diminuição na afinidade combinada com o nível de ligação normalizada significativamente mais baixo pode indicar um dobramento interrompido devido às mutações introduzidas. No entanto, deve ser notado que as mudanças na cinética também afetarão esse valor. Cada curva de ligação foi, portanto, visualmente inspecionada para a conclusão (dados não mostrados).

Os resultados para TREM-1 humano com mutações únicas de alanina (Tabela 10) mostram que duas posições (E46 e Dx2) foram únicas no sentido de diminuir a ligação em mais de duas vezes a 0170 Fab.

Tabela 10: Afinidade d 0170 Fab e 0011 Fab ao TREM-1 humano com mutações de alanina em relação ao TREM-1 humano wt. Nível de ligação de 0170 Fab e 0011 Fab 10 s após o fim de associação, expresso como grau de nível de ligação máximo __ teórico.__

mAb 0170 pôde ligar-se, em contraste a mAb 0011, ao TREM-1 de macaco cinomolgo. A humanização de TREM-1 de macaco cinomolgo na área selecionada não resultou na afinidade recuperada de 0177 m comparação com o TREM-1 humano (0247) que indica que outros resíduos ou combinações de resíduos são importantes para as diferenças na afinidade para TREM-1 humano e de macaco cinomolgo. 0243 não mostra ligação a 0170 Fab ou 0011 Fab. Para esse construto, não pode ser excluído que as mutações afetaram a estrutura geral e, portanto, não deve ser concluído se Q®2 está envolvido na ligação dos Fabs estudados ao TREM-1 humano.

Tabela 11: Afinidade de 0170 Fab e 0011 Fab ao ECD de TREM-1 de macaco cinomolgo wt, variantes de ECD TREM-1 de macaco cinomolgo parcialmente humanizado e ECD de TREM-1 humano de wt. 0 nível de ligação de 0170 Fab e 0011 Fab em 10 s altera o fim de associação, expresso como grau de nível d __ligação máximo teórico._

Exemplo 14: mAb 0170 bloqueia de modo eficaz a ativação de TREM-1 no ensaio de célula repórter BWZ/hTREM-1 O ensaio de célula repórter BWZ/hTREM-1 descrito no Exemplo 6 foi utilizado para calcular a potência de mAb 0170 no bloqueio de TREM-1. As células repórter BWZ/hTREM-1 foram estimuladas com complexo de ligante de TREM-1 e mAb 0170 adicionados em várias concentrações. A Figura x mostra um bloqueio dependente de dose do sinal de TREM-1 resultando no bloqueio total do sinal em concentrações mais altas que 0,2 ug/mL. O valor de IC®0 foi determinado para ser 2,4 nM com a utilização do software Graphpad Prism, equação: log(inibidor) vs. resposta -- Declive variável.

Exemplo 15: Anticorpos de TREM-1 comercialmente disponíveis não bloqueiam a ativação de TREM-1 no ensaio de célula repórter BWZ/hTREM-1. Múltiplas doses de anticorpo foram incluídas no ensaio de célula repórter BWZ/hTREM-1, conforme descrito anteriormente. SAB140®121 (clone 3F® de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) , WH00®4210M4 (clone 2E2 de Sigma Aldrich,

St. Louis, MO, EUA), sc-803x4 (clone x8Z12 de Santa Cruz, California, EUA), HM22®2 (clone 6B1 de Hycult biotech, ®40® PB UDEN, Holanda), 316102 (clone TREM-37 de Biolegend, San

Diego, CA x2121, EUA), e 314x07 (clone TREM-26 de

Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA) não puderam bloquear a atividade de TREM-1 de modo significativo, enquanto mAb 0170 divulgado no presente documento pôde bloquear a atividade de TREM-1 com mais de xxô em 0,3 ug/mL. Os controlos de isótipo tiveram >x®ô de reatividade restante até mesmo a 3 ug/mL.

Tabela 12 _

Exemplo 16: mAb 0170 bloqueou TREM-1 de macaco cinomolgo A fim de testar a funcionalidade contra TREM-1 de outra espécie, TREM-1 de ratinho e de macaco cinomolgo foi transfetado junto com com DAP12 humano e de ratinho, respetivamente, para gerar um ensaio de célula repórter para o ser humano. Isso foi essencialmente feito conforme descrito para o sistema humano (Exemplos 1, 2 e 6) , mas substituindo TREM-1 humano por TREM-1 murino (m) de comprimento completo (SEQ ID NO: 22) ou TREM-1 de macaco cinomolgo (c) de comprimento completo (SEQ ID NO: 21). cDNA que codifica cTREM-1 (SEQ ID NO: 22) foi sintetizado em GeneArt e clonado em pHLEF38 (licenciado em CMC ICOS), na orientação Xhol - Xbal. As células TE alfa NFAT Luc foram co-transfetadas com pHLEF38.cynoTreml e pNEF38.NFlag hDAP12 com a utilização de 10 ug de cada plasmídeo e eletroporada 8e6 células em aproximadamente ®00 uL de volume total (400 uL de meio de crescimento e 100 uL de ADN) com a utilização do eletroporador BTX (260 V, 10®0 uF, 720 ohms; constante de tempo foi 23 msec). As células foram colocadas em placa durante 48 horas numa placa de 10 cm, em 10ml de ®0% de meio condicionado e colocadas em placa diretamente na seleção em 8e3 células/poço de uma placa x6W de fundo redondo (® placa) em 200 uL/placa de 30% de meio condicionado com 800ug/mL d G418 e 0,® mM de L-histidinol. Após 2 semanas de incubação, 40 colónias únicas foram identificadas com a utilização de Genetix Clone Select Imager. 0 único anticorpo de TREM-1 comercialmente disponível que pode reagir de modo cruzado com TREM-1 de macaco cinomolgo foi 314x07 (clone TREM-26 de Biolegend, San Diego, CA x2121, EUA) (veja-se Exemplo 11) . Nenhum dos anticorpos comercialmente disponíveis testados no Exemplo 1® puderam bloquear a função de cynoTREM-1, nem mesmo aquele que pode ligar-se ao TREM-1 de macaco cinomolgo.

Tabela 13

De modo semelhante, uma linhagem de célula repórter com TREM-1 de ratinho foi gerada. Nenhum dos anticorpos que pôde ligar-se ao TREM-1 humano ou ao TREM-1 de macaco cinomolgo e humano pôde ligar-se de modo cruzado ao TREM-1 de ratinho. Desse modo, os anticorpos contra o TREM-1 de ratinho foram gerados essencialmente conforme descrito para gerar anticorpos de TREM-1 humano mas com TREM-1 de ratinho como o antigénio. Esses anticorpos foram triados para a função de ligação e bloqueio de TREM-1 de ratinho no ensaio de gene repórter murino. Um tal anticorpo (mAb 0174) pôde ligar-se e bloquear a função de TREM-1 de ratinho.

Exemplo 17: A libertação de TNFalfa de macrófagos M2 que foram estimulados por PGLYRP-1 foi bloqueada por anticorpos de TREM-1.

Aqueles peritos na especialidade reconhecerão o valor do estabelecimento de uma colheita de banco de congelador de células primárias de múltiplos dadores que fornece, desse modo, a replicação conveniente de experiências. Os macrófagos derivados in vitro foram produzidos a partir de monócitos sanguíneos periféricos, conforme a seguir. Os monócitos negativamente enriquecidos foram isolados a partir de um "leukopak" de sangue periférico obtido a partir de Research Blood Components (Brighton, MA, EUA) com a utilização de um kit Rosette Sep (n- cat. 1®068) de Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canadá) seguindo as instruções de fabrico. Os monócitos isolados foram suspensos em 10% de DMSO/FBS de alíquotas de ®0e6 célula/mL e gradualmente resfriados a -80 °C. Para produzir células macrófagas, um ou mais frascos congelados de monócitos foram rapidamente descongelados num banho de água de 37 °C, diluídos até 10 mL com meio de crescimento [RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad CA, EUA) n2 cat. 72400-047) com 10Ô de FBS (n2 cat. de Fisher Scientific 03-600-®ll] e centrifugados durante ® minutos a 2®0 g. As células foram suspensas em 2e6 células/mL em meio de crescimento suplementado com ®0 ng/mL de MCSF humano (n2 cat. de Gibco PHCx®01) , colocado na cultura de tecido tratada, placa d cultura de tecido do estilo Petri e numa incubadora umidifiçada programada para manter uma atmosfera "hipóxica" de ®ô de C02, 2ô de 02. No terceiro dia em cultura, as células foram alimentadas com a adição de um volume igual de meio de crescimento suplementado com MCSF humano de ®0 ng/mL. Após 6 dias em cultura, os monócitos diferenciaram-se em macrófagos M0. As células M0 foram adicionalmente diferenciadas ao mudar o meio para o meio de crescimento suplementado com ®0 ng/mL de IFNg humano (n2 cat. de Gibco PHC4031) para macrófagos Ml ou 40 ng/mL de IL-4 humano (n2 cat. de Gibco PHC004®) para macrófagos M2 e regressar a incubadora durante 22 horas adicionais. No sétimo dia, os macrófagos foram adequadamente diferenciados para serem utilizados num bioensaio. Brevemente, os macrófagos foram recuperados da placa de Petri ao lavar com IX PBS, seguido por ®mM de EDTA em PBS. A placa retornou, então, a 37 °C durante 30 minutos e as células foram "lavadas mecanicamente" da placa com a utilização de uma seringa de 10ml e agulha de 22G. As células foram, então, diluídas no meio de crescimento, centrifugadas a 2®0g durante ® minutos após as quais o pélete de célula foi suspenso a uma concentração final de le6/mL.

As células macrófagas preparadas conforme acima foram utilizadas em bioensaios em que as citocinas, como TNF-alfa, produzidas em resposta ao estímulo das células com o ligante de TREM-1, foram medidas no meio condicionado por ELISA. Tal bioensaio foi adicionalmente utilizado para medir o bloqueio de tal estímulo d ligante de TREM-1 por anticorpos específicos de TREM-1. 0 ligante de TREM ou controlos negativos foram preparados em concentrações 4X e ®0 microlitros/poço no meio de crescimento foram adicionados a placas de microtitulação de χβ placas. As concentrações finais de ligante de TREM-1 consistiram em 7,® ng/mL de PGLYRP1 humano recombinante (veja-se o Exemplo ®) e 3 pg/mL de PGN-BS (Invivogen,tlrl-pgnbs, San Diego, CA, EUA). As células foram cultivadas sob condições hipóxicas umidifiçadas, conforme descrito acima, durante 22 horas, após as quais o meio condicionado foi coitado e os níveis de TNF-alfa foram medidos por ELISA, seguindo as instruções do fabricante (R&amp;D Systems, catálogo DY210, MN, EUA) . A Figura 10 mostra que os anticorpos de TREM-1 diminuem a libertação de TNF-alfa desses macrófagos M2 estimulados. A Tabela 14 abaixo mostra os valores IC®0 de tal experiência que indica que os anticorpos divulgados no presente documento são muito potentes no bloqueio da libertação de citosina dependente de TREM-1.

Tabela 14

Exemplo 18: Libertação de TNF-alfa de macrófagos de macacos cinomolgos pode ser bloqueada por mAb 0170 O macrófago derivado de sangue periférico serve como um modelo in vitro excelente no estudo de modulação e ativação imune inata. TREM-1 é conhecido por ter um papel principal no controlo desse processo. A utilização da espécie Macaca fascicularis primata não humana, comumente conhecida como macaco cinomolgo, é crítica para o entendimento dos efeitos in vivo da modulação de sinalização de TREM-1. Nesse exemplo, os anticorpos anti-TREM-1 são testados por sua habilidade para bloquear a produção de citocinas em culturas de macrõfago M2 de macaco cinomolgo.

As células macrófagas foram geradas conforme a seguir. 0 sangue total foi colhido de animais adultos masculinos saudáveis (SNBL, Everett WA, EUA) por punção da veia com a utilização de tubos vacutainer de heparina de sódio (N£ cat. 3664870, Bectin Dickinson Franklin Lakes NJ, EUA). 0 sangue total foi diluído a 30ô com PBS, então, 30 mL foram cuidadosamente colocados em 1® mL de Ficoll-Paque (N£ 17-1440-03 GE Healthcare, Uppsala, Suécia) pré-diluído a x6ô com PBS num tubo cónico de ®0 mL. Após centrifugação: 30 min, temperatura ambiente, 400g com aceleração baixa e sem freio; células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) foram colhidas a partir da interfase Ficoll/plasma, diluídas 3X com PBS e centrifugadas durante 7 minutos, à temperatura ambiente, 200 g. 0 sobrenadante contendo plaquetas contaminantes foi aspirado e descartado e o pélete de célula foi ressuspenso em 30ml de PBS ± 0,2ô de FBS (soro bovino fetal). Esse processo de lavagem de célula foi repetido em 2 ciclos adicionais após os quais o pélete de célula de PBMC foi ressuspenso em meio de cultura de RPMI (N- Cat. 61870-036, Life Technologies, Grand Island NY, EUA) mais 10Ô de FBS a 2E6 células/mL e dispensados em placas de petri de 1® cm (N- Cat. 430®xx Corning, Tewksbury MA, EUA) em 20 mL/placa. Permitiu-se que os monõcitos aderissem ao plástico incubando-se os mesmos de um dia para o outro a 3 7 °C, ®ô de C02, 100ô de humidade após o qual células não aderentes foram removidas ao girar suavemente e ao agitar a placa durante 20 segundos seguidos por aspiração. 20 mL de meio de crescimento fresco suplementado com ®0ng/mL de hMCSF (N£ Cat. PHCx®01, Life Technologies,

Grand Island NY, EUA) foram adicionados a cada placa e colocados em condições de cultura hipóxica de 37 °C, ®ô de C02, 2ô de 02, 100Ô de humidade durante 7 dias. No terceiro dia em cultura, as células foram alimentadas com a adição de um volume igual de meio de crescimento suplementado com MCSF humano de ®0 ng/mL. Após 6 dias em cultura, os monócitos diferenciaram-se em macrófagos MO. As células MO foram adicionalmente diferenciadas ao mudar o meio para o meio de crescimento suplementado com ®0 ng/mL de IFNg humano (n2 cat. de Gibco PHC4031) para macrófagos Ml ou 40 ng/mL de IL-4 humano (N2 Cat. PHC004®, Life Technologies, Grand Island NY, EUA) para macrófagos M2 e regressar a incubadora durante 22 horas adicionais. No sétimo dia, os macrófagos foram adequadamente diferenciados para serem utilizados num bioensaio. Brevemente, os macrófagos foram recuperados das placas de Petri ao lavar com IX PBS, seguido por ®mM de EDTA em PBS. As placas foram, então, devolvidas a 37 °C durante 30 minutos e as células foram "lavadas mecanicamente" da placa com a utilização de uma seringa de 10 mL e agulha de 22G. As células foram, então, diluídas no meio de crescimento, centrifugadas a 2®0g durante ® minutos após as quais o pélete de célula foi suspenso a uma concentração final de le6/mL.

As células macrófagas preparadas conforme acima foram utilizadas em bioensaios em que as citocinas, como TNF-alfa, produzidas em resposta ao estímulo das células com o ligante de TREM-1, foram medidas no meio condicionado por ELISA. Tal bioensaio foi adicionalmente utilizado para medir o bloqueio de tal estímulo d ligante de TREM-1 por anticorpos específicos de TREM-1. 0 ligante de TREM-1 ou controlos negativos foram preparados em concentrações 4X e ®0 microlitros/poço no meio de crescimento foram adicionados a placas de microtitulação de x6 placas. As concentrações finais de ligante de TREM-1 consistiram em 7,® ng/mL de PGLYRP1 humano recombinante (gerado conforme descrito no Exemplo ®) e 3 pg/mL de PGN-BS (Invivogen, tlrl-pgnbs, San Diego, CA, EUA). Os anticorpos foram adicionados em ®0 microlitros/poço de meio de crescimento seguido por células em ®0 microlitros/poço de macrófago. As células foram cultivadas sob condições hipóxicas umidifiçadas, conforme descrito acima, durante 22 horas, após as quais o meio condicionado foi coitado e os níveis de TNF-alfa foram medidos por ELISA, seguindo as instruções do fabricante (N- Cat. DY1070 RÍD Systems, Minneapolis MN, EUA) . A Tabela a seguir mostra os valores de TNFoí de culturas de macrófago M2 estimuladas com ligante de TREM-1 (PGLYRP1+PGN) na presença de anticorpo de controlo ou ant icorno anti-TREM-1.

Esse exemplo ilsutra que o Ab-0170 anti-TREM-1 pode bloquear de modo eficaz a produção de citosina dependente de TREM em células macrófagas derivadas de macacos cinomolgos. A eficácia desse Ab suporta a sua utilização em macaco cinomolgo em toxicologia in vivo e modelos de tratamento de doença.

Exemplo 19: A libertação de TNF-alfa de células mononucleares sanguíneas periféricas estimuladas pode ser bloqueada por anticorpos de TREM-1 PBMCs, a partir de um revestimento com tampão e congelado em RPMI 1640 (N2 cat. 61870, Gibco, Nova Iorque, EUA) , 2 0% de FBS (N2 Cat. 16140-071, Gibco, Nova Iorque, EUA, 10% de DMSO (n2 Cat D26®0, Sigma, Steinheim, Alemanha), foram descongelados e lavados duas vezes em RPMI, 10% de FBS, 1% de Pen/Strep (N2 cat. l®070-06, Gibco, Nova Iorque, EUA), e ressuspensos no mesmo meio até 4xl0E6/mL. As células foram, então, distribuídas com 400.000 células/poço. 10 pg/mL de PGN-SA (n2 Cat. tlrl-pgnsa, Invivogen, San Diego, EUA) e 0,2 pg/mL de PGLYRP1 foram adicionados aos poços para estimular as células. Subsequentemente, o isótipo relevante e anticorpos de TREM-1 foram diluídos em RPMI e adicionados a 1,34 nM e 0,167 nM, respetivamente. A libertação de TNF-alfa foi medida por diaplex (n2 Cat 880.0x0.001, Genprobe, Besancon, França) de acordo com o protocolo do fabricante após 20 hrs de incubação a 3 7 °C, ®% de C02. Conforme mostrado na Tabela 13 abaixo, todos os anticorpos de TREM-1 divulgados no presente documento (mAbs 0044, 0070 e 00®x) podem diminuir a libertação de TNF-alfa das células de PBMC.

Tabela 15 _

A inibição de aproximadamente 70ô de libertação de TNF-alfa m PBMCs com a utilização de um anticorpo de TREM-1 de bloqueio indica um impacto significante em níveis de citosina numa cultura de célula estimulada.

Exemplo 20: mAb antl-TREM-1 pode inibir a produção de TNFa induzida por PGN+PGLYRP1 em macrõfagos normóxicos 0 estímulo de macrófagos com a utilização de PGN-BS + PGLYRP1 humano como um estimulante do recetor de TREM-1 pode ser bloqueado por anticorpos anti-TREM-1.

Os monócitos foram diferenciados em macrófagos M2 como no Exemplo 1®. Todas as etapas da diferenciação e do estímulo das células foram feitos numa incubadora a 37°C, ®Ô de C02 sob níveis de oxigénio atmosférico normais (normóxia). Os macrófagos M2 diferenciados foram ressuspensos em RPMI/lOô de FBS e colocados em placa em ®xlOE® células/mL em poços de teste em triplicada (a menos que notado de outro modo). As células foram, então, estimuladas durante 24 horas com os estímulos a seguir: nenhuma adição, PGLYRP1, PGN-BS (InVivogen, tlrl-pgnbs) (dois conjuntos de triplicatas), PGN-BS+PGLYRP1 (três conjuntos de triplicatas), ou PGN-BS+PGLYRP1 na presença de anti-TREM-1 ou anticorpo de controlo de isótipo. Os sobrenadantes foram, então, colhidos e analisados por TNFa com a utilização de BioPlex (Bio-Rad, 171-B®026M). Os anticorpos (0,1 pg/mL) mAb-0122 e mAb-0170 direcionados a TREM-1 puderam reduzir a libertação de TNF-alfa.

Tabela 16

Esse exemplo ilustra que mAb-0122 e mAb-0170 anti-TREM-1 podem inibir a produção de TNFa de macrófagos cultivados sob condições normóxicas.

Exemplo 21: 0 anticorpo de TREM-1 inibe especificamente a resposta induzida por fluido sinovial de artrite reumatoide.

As amostras de fluido sinovial de RA de pacientes que sofrem de artrite reumatoide foram avaliadas pela atividade de ligante de TREM-1 no ensaio repórter de BWZ, conforme descrito no Exemplo 6. Brevemente, o fluido sinovial foi descongelado, centrifugado e diluído em série, ensaiado em duplicata +/- 10pg/mL de PGNECndi (Invivogen, San Diego, CA, EUA) com a adição dos anticorpos de TREM-1 ou um controlo de isótipo negativo. 0 fluido sinovial de um paciente com artrite reumatoide pode acionar o ensaio de célula repórter BWZ/hTREM-1 de maneira dependente de TREM-1 que é adicionalmente aprimorado adicionando-se MAB1278 (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN ®®413, EUA: N- cat. MAB12 78)), enquanto os anticorpos de TREM-1 de bloqueio divulgados no presente documento podem diminuir essa ativação.

Os anticorpos foram testados em dois ensaios indicados pelas duas colunas abaixo, em que cada anticorpo está em concentrações na faixa de 0,1 a 10 ug/mL. MAB1278 aprimorou claramente o sinal, enquanto os mAbs 0122 e 0170 diminuíram o sinal em comparação com o controlo de isótipo. _ Tabela 17

Exemplo 22: A libertação de citosina de células de tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide mediante estímulo com PGLYRP-1 pode ser bloqueada por mAb 0170.

As amostras de tecido sinovial foram obtidas a partir de pacientes de RA durante a substituição de joelho total. A suspensão única de células de tecido sinovial foi isolada por uma digestão por meio de 4 mg/mL de colagenase (n- cat. 110887x3001, Roche, Mannheim, Alemanha) e 0,lmg/mL de DNase (n- cat. 11284x32001, Roche, Mannheim, Alemanha) durante 1 h a 37 graus C.

As células de tecido sinovial em lxl0^®/poço em meio de cultura RPMI (n2 cat. R0883, St Louis, MO, EUA) ±10% de FCS (n- cat. SOU®, BioChrom AG, Grand Island, NY 14072, EUA) foram estimulados com 4ug/mL de PGLYRP1 e 1 ug/mL de PGN-ECNDi (n- cat. tlrl-kipgn, Invivogen, San Diego, CA x2121, EUA) sob condição hipóxica na presença ou ausência de várias concentrações de mAb 0170 ou um controlo de hIgG4 de isótipo. Após incubação de 24h, os sobrenadantes de célula foram colhidos e as citocinas foram medidas por ELISA (TNFa (n- cat. DY210, R&amp;D, Minneapolis, MN®®413 EUA), IL-lb (88-7010-88, eBioscience, San Diego, CA x2121, EUA), GM-CSF (n- cat. 88-733x-88, eBioscience) ) ou Flowcytomix (TNFa, IL-lb, MIP-lb, MCP-1, IL-6, e IL- 8 (n2 cat . BMS, eBioscience). As citocinas foram secretadas das células de tecido sinovial mdiante estímulo com o ligante de TREM-1 e especificamente bloqueadas por anticorpo de TREM-1 mAb 0170.

Abaixo há um exemplo de tal experiência, em que 4 ng/mL ou 10 ng/mL de mAb foram utilizados, resultando numa diminuição de libertação de citosina quando tratados com o anticorpo de TREM-1 mAb 0170. ___ Tabela 18_

Tabela 19

Esse exemplo mostra que as células de tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide responderão ao estímulo pelo ligante de TREM-1, PGLYRP1, ao secretar várias citocinas que podem ser inibidas por mAb 0170.

Exemplo 23: A libertação de TNF-alfa induzida por PGLYRP1 do tipo II em células de tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide pode ser bloqueada por anticorpo de TREM-1 mAb 0170

As amostras de tecido sinovial foram obtidas a partir de pacientes de RA durante a substituição de joelho total. A suspensão única de células de tecido sinovial foi isolada por uma digestão por meio de 4 mg/mL de colagenase (n° cat. 110887x3001, Roche, Mannheim, Alemanha) e 0,lmg/mL de DNase (n- cat. 11284x32001, Roche, Mannheim, Alemanha) durante 1 h a 37 graus C. As células de tecido sinovial (lxl0^®/poço em meio de cultura RPMI (n- cat. 2240010®, Gibco, NY 14072, EUA) ± 10Ô de FCS (n- cat. SOU®, BioChrom AG, Berlim, Alemanha)) foram co-cultivadas com várias doses de células HEK transfetadas de modo transiente com PGLYRP1 do tipo II sob condições hipóxicas na presença ou ausência de 1 ug/mL de mAb 0170 ou controlo de isótipo de IgG4. Após a incubação de 24h, os sobrenadantes de célula foram colhidos e as citocinas foram medidas por ELISA de TNFa (n- cat. DY210, R&amp;D, Minneapolis, MN®®413 EUA).

Tabela 20

Esse exemplo mostra que o ligante de TREM-1 (células do tipo II) induziu libertação de TNF-alfa de maneira dependente de dose em células de tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide em comparação a células de controlo (transfetadas de modo falso). Essa resposta de TNF-alfa foi bloqueada por mAb 0170, mas não com IgG4 de isótipo. As células de controlo não foram afetadas.

Exemplo 24; MAB1278 ligado a placa Induziu resposta de IL-6 e TNF-alfa em macrófagos, mostrando recursos de agonista, enquanto mAbs 0122 e 0170 não Induziram. O estímulo de macrófagos em anticorpos de agonista ligados à placa anti-TREM-1 induziram a produção de IL-6 e TNFa. Os monócitos foram purificados com revestimentos com tampão de dador com a utilização de RosetteSep (StemCell Technologies, 1®068) e diferenciados em macrófagos por cultivo durante 6 dias em RPMI/lOô de FBS na presença de 40 ng/mL de MCSF humano. Os macrófagos foram, então, adicionalmente diferenciados para macrófagos M2 ao mudar o meio para o meio de crescimento suplementado com ®0 ng/mL de IL-4 humano e regressado à incubadora durante 24 horas adicionais. No sétimo dia, os macrófagos foram recuperados da placa de cultura ao lavar com IX PBS, seguido por ®mM de EDTA em PBS. A placa foi, então, regressada a 37°C durante 30 minutos antes dos macrófagos serem lavados da placa. Os macrófagos foram lavados em RPMI/lOô de FBS antes de ressuspensão e colocação em placa. Os poços de teste foram pré-revestidos com os anticorpos especificados incubando-se os mesmos de um dia para o outro com anticorpo diluído em PBS, seguido por lavagem x3 em PBS. Os macrófagos ressuspensos foram colocados em placa em ®xl0E® células/mL em poços de teste de triplicata seguidos por incubação durante 24 horas. (Todas as etapas da diferenciação e do estímulo das células foram feitos numa incubadora a 37°C, ®ô de C02 sob níveis de oxigénio atmosférico normais (normóxia)). Os sobrenadantes foram, então, colhidos e analisados por IL-6 e TNFa com a utilização de BioPlex (Bio-Rad, 171-B®006M e 171-B®026M).

Os anticorpos mAb-0122 e mAb-0170 mostraram agonismo muito baixo, enquanto o anticorpo MAB1278 (RnD Systems, MAB1278) mostrou indução potente tanto de IL-6 quanto de TNFa. _ _ Tabela 21

Este exemplo ilustra que mAb-0122 e mAb-0170 mostra apenas a atividade de agonista muito baixa em macrófagos e indica os recursos de bloqueio verdadeiros desses mAbs. Exemplo 25: Bloqueio de TREM-1 num modelo de artrite de ratinho reduz a doença.

As experiências destacadas na Tabela 22 foram obtidas no modelo de artrite DTH, que é um modelo de artrite de pata única. A artrite de pata única foi induzida em ratinhos C®7BL/6 femininos elicitando-se uma reação de hipersensibilidade do tipo atrasada (DTE) clássica na pata direita por imunização e desafio subsequente com a albumina de soro bovino metilada (mBSA) , com a modificação na qual um coquetel de anticorpos monoclonais de colagénio do tipo II (anti-CII) foi administrado IV entre as etapas de imunização e desafio. A pata esquerda recebeu o desafio de PBS e funcionou como um controlo intra-animal. Os ratinhos (10 ratinhos/grupo) foram tratados 3 vezs/semana com um anticorpo monoclonal de TREM que se liga especificamente binds e bloqueia TREM-1 murino, conforme determinado com a utilização de uma versão murina do ensaio repórter descrito no Exemplo 6. A primeira dose foi administrada no dia de imunização. Os ratinhos (x-10 ratinhos/grupo) foram tratados com um anticorpo de controlo ou PBS como um controlo. 0 inchaço de pata foi medido a partir do dia de indução de artrite e 11 dias seguintes. Os resultados são apresentados como uma área média sob a curva (AUC) ± SEM. A significância estatística foi testada ao utilizar um teste t não emparelhado bidimensional com x®% de intervalo de confiança.

Tabela 22: Efeito de tratamento de TREM-1 em inchaço de pata (AUC-mm) num modelo

de artrite de ratinho.

Exemplo 26: Os neutrófilos ativados libertam IL-8 que pode ser bloqueado por mAbs de TREM-1

Os neutrófilos expressam TREM-1 e neutrófilos também expressam o ligante de TREM-1. Para testar se TREM-1 está envolvido num ciclo de estímulo autócrino em neutrófilos, os neutrófilos isolados foram estimulados com PGN-SA (InVivogen, tlrl-pgnsa) e a libertação de IL-S no meio de cultura foi medida. Os anticorpos de TREM-1 mAb-00®x, mAb-0067, mAb-0122 e mAb-0170 puderam diminuir a libertação de IL-8 induzida por PGN-SA. Os neutrófilos foram isolados do sangue total de dador saudável humano e resuspensos em RPMI/lOô de FBS em l,®xlOE6 células/mL, e colocados em placa em poços de teste de triplicata pré-revestidos com Fibrinogen (pré-revestidos com ®0 1 de 1 mg/mL de Fibrinogen (Sigma, F387x) em PBS durante 2 horas a 37 °C, seguidos por lavagem de x3 em PBS) . As células foram testadas sob as condições a seguir: nenhum estímulo adicionado, 10 g/mL apenas de PGN-SA, ou 10 g/mL de PGN-SA na presença de mAb-00®x, mAb-0067, mAb-0122, mAb-0170 ou anticorpo de controlo de isótipo em 0,2® g/mL. As amostras foram cultivadas 24 horas numa incubadora a 37°C, ®ô C02. Os sobrenadantes foram, então, colhidos e analisados para IL-8 com a utilização do conjunto Bio-plex Pro Human Cytokine IL-8 (BioRad, 171-B®008M). __Tabela 23__

Esse exemplo ilustra a libertação de IL-8 d neutrófilos induzida por estímulo com o PGN derivado de modo bacteriano pode ser reduzida por anticorpos de TREM-1. Desse modo, demonstra-se que TREM-1 está envolvido num ciclo de ativação autócrino em neutrófilos, e os anticorpos de TREM-1 são potencialmente úteis na regulação descendente de respostas de neutrófilo.

Exemplo 27: Os neutrófilos ativados podem estimular monôcitos, os quais podem ser bloqueados por mAbs anti-TREM-1

Os neutrófilos ativados expressam o ligante de TREM-1. Para testar se os neutrófilos ativados podem estimular outras células imunes de maneira dependente de TREM-1, os neutrófilos ativados foram utilizados para estimular monôcitos isolados e a libertação de TNFa no meio de cultura foi medida. Os anticorpos de TREM-1 mAb-00®x e mAb-0170 puderam diminuir a libertação de TNFa induzida por neutrófilo a partir dos monôcitos.

Os neutrófilos foram isolados a partir do sangue total de dador saudável humano e resuspensos em RPMI/10% de FBS e colocados em placa em 1,®x10E® células/poço em placa de χβ placas de cultura de tecido revestida com poli-D-Lisina (Corning, 3841) . Os neutrófilos foram, então, estimulados com Ing/mL de PMA (Sigma, Pl®8®) ± 20 g/mL de PGN-SA (InVivogen, tlrl-pgnsa) durante 24 horas numa incubadora a 37°C, ®% de C02. As células foram, então, lavadas suavemente x3 com meio antes da adição em monôcitos recém-isolados. Os monôcitos foram purificados a partir de revestimentos com tampão de dador saudável com a utilização de um kit EasySep (Stem cell technologies, 1χ0®χ), e foram colocados em placa com ®xlQE4 células/poço nos poços que já contêm neutrófilos lavados ativados. Os anticorpos a seguir foram adicionados a 1 g/mL: mAb-Q0®x, mAb-0170 ou controlo de isótipo de hIgG4. As células foram, então, cultivadas durante outras 24 horas antes de colher o sobrenadante. 0 sobrenadante foi diluído a 1:10 em RPMI/10Ô de FNS antes de medir TNFa por ELISA (eBioscience, BMS223INST). _Tabela 24_

Esse exemplo ilustrou que neutrófilos ativados podem estimular monócitos de maneira dependente de TREM-1 para produzir TNFa, e isso pode ser bloqueado por anticorpos mAb-00®x e mAb-0170 anti-TREM-1. Os anticorpos anti-TREM-1 são, portanto, potencialmente úteis para regular de modo descendente as respostas de monócitos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Novo Nordisk A/S <120> Anticorpos que têm capacidade para bloquear Recetor de Acionamento Expresso em Células Mielóides 1 (TREM-1) <130> 84x2 <160> 23 <170> Patentln versão 3.® <210> 1 <211> 234

<212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1

Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser I 5 10 15

Giu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lvs 20 25 30

Glu Gly Gin Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe 35 40 45

Ala Ser Ser Gin Lys Ala Trp Gin lie lie Arg Asp Gly Glu Met Pro 50 55 60

Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val 65 70 75 80

Gin Val Gly Arg lie He Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu 85 90 95

Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin 100 105 HO

Cvs Val lie Tvr Gin Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg 115 “ 120 125

Tie Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn 130 135 140

Glu Asn Ser Thr Gin Asn Val Tyr Lys He Pro Pro Thr Thr Thr Lys 145 150 155 160

Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gin Ala Pro 165 170 175

Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu lie Asn Leu 180 185 190

Thr Asn Val Thr Asp lie lie Arg Val Pro Val Phe Asn lie Val lie 195 200 205

Leu Leu Aila Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu 210 " 215 220

Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro 225 230

<210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2

Glu Vai Gin reu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Lys Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Gly Ala Ser Asp Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Met Ala Leu Glu Trp Vai 3 5 4 0 4 5

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60

Ser Vai Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Asn Met 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95

Tyr Cys Vai Arg Asp Met. Gly Gin Arg Arg Gin Phe Ala Tyr Trp Gly 100 " 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120

< 210 > 3 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Asp lie Val Leu Thr bin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe "20 ' 25 30'

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 " 40 45"

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Glv He Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 65 " 7 0" 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 " 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Glu Arg 100 " 105 110

<210> 4 <211> 448 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia pesada de um anticorpo de TREM-1 humanizado <220> <221> CADEIA <222 > (1) . . (448) <223> Cadeia pesada de um anticorpo de TREM-1 humanizado <400> 4

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro uly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 ' 40 ' 45

Gly Arg lie Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 ~ 80

Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Met Gly lie Arg Arg Gin Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 ' 1Ϊ0

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arc? Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 " 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 “ 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 ~ 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Ara Val Val 290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin A„sp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 ' 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr 325 ’ 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro A*rg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser A*sp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 ~ 410 415

Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> ®

<211> 218 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia leve de um anticorpo de TREM-1 humanizado <220>

<221> CADEIA <222 > (1)..(218) <223> Cadeia leve de um anticorpo de TREM-1 humanizado <400> ®

Asp Ile Vai Leu Thr Gin. Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 ‘ 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Asp Thr Phe 20 " 25 30‘

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 ~ 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Vai Pro Asp 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 “ 110

Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser 145 150 155 160

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 " " 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190

His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205

Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 6 <211> 448

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia pesada de um anticorpo de TREM-1 humanizado <220> <221> CADEIA <222 > (1) . . (448) <223> Cadeia pesada de um anticorpo de TREM-1 humanizado <400> 6

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 " 25 ' 30

Ala Met His Trp Vai Arq Gin Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 ‘ 45

Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 7 0 7 5" 8 0

Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Met Gly Gin Arg Arg Gin Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arq Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 165 Π0 175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His 195 200 " 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220

Pro Pro Cvs Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 “ 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 " 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 " ' 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr 325 " 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 ’ 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

< 210 > 7 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia leve de um anticorpo de TREM-1 humanizado <220> <221> CADEIA <222 > (1) . . (218) <223> Cadeia leve de um anticorpo de TREM-1 humanizado <400> 7

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr He Asn Cvs Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 “ ’ 25 30

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45“

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 ' 55 60 A.rg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser 65 70 * 75 80

Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 “ 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 145 150 155 160

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 ’ '175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205

Val Thr Lvs Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cvs 210 “ 215

< 210 > 8 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 2 0 2 5 3 0

Ala Met Ills Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 ’ * 45

Ala Arg lie Arg Thr Lys Ser Asn Asti Tyr Ala Thr Tyr Tyr Val Asp 50 "*55 60

Ser Val Lys Asp Arg lie Thr lie Ser Arg Asp A_sp Ser Gin Ser Met 65 "* 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95

Tyr Cys Val Arg Asp Met Gly lie Arg Arg Gin Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 ” 110

Girt Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120

<210> x <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> x

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 ” 5 10 15

Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe 20 25 30

Gly lie Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Ser Pro Gly Gin Pro Pro 3 5 4 0 4 5

Lys Leu Leu lie Tyr A.rg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 65 " 7cf ’ 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85” 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly' Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 110

<210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Lys Gly 1 5 IO" 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Gly Ala Ser Asp Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 "* 25 30

Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Met Ala Leu Glu Trp Vai 35 4 0 4 5

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60

Ser Vai Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Asn Met 65 ~ 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95

Tyr Cys Vai Arg Asp Met Gly Gin Arg Arg Gin Phe Ala Tyr Trp Gly 100 "* " 10 5 ^ 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120

<210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Asp Hr Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Arq Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly He Pro Ala 50 " 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 65’ 70 ’ 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tvr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85* 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Glu Arg 100 105 ~ 110

<210> 12 <211> 180 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 12

Met Thr Thr Glu Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Tyr Lys Glu Gly Gin 15 10 15

Thr Leu Glu Va_ Lys Cys Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Tyr Ala Asn Ser 20 25 " 30

Arg Lys Ala Trp Gin Lys Met Glu Gly Lys Met Pro Lys He Leu Ala 35 40 45

Lys Thr Glu Arg Pro Ser Giu Asn Ser Ills Pro Val Gin Val Gly Arg 50 55 60 lie Thr Leu Glu Asp Tyr Pro Asp His Gly Leu Leu Gin Val Gin Met 65 70 75 80

Thr Asn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin Cys Val lie Tyr 85 90 95

Gin His Pro Lys Glu Ser Ills Val Leu Phe Asn Pro lie Cys Leu Val 100 105 110

Val. Thr Lys Gly Ser Ser Gly Thr Pro Gly Ser Ser Glu Asn Ser Thr 115 120 125

Gin Asn Val Tyr Arg Thr Pro Ser Thr Thr Ala Lys Ala Leu Gly Pro 130 135 140

Arg Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gin Ala Pro Pro Glu Ser Thr 145 150 155 160

Val Val Val Ser Thr Pro Gly Ser Glu lie Asn Leu Thr Asn Val Thr 165 170 175

Asp lie lie Arg 180

<210> 13 <211> 206 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> K2OA-hTREM-1-Cmyc2-His6 <400> 13

Ala. Thr Lys Leu Thr Glu. Glu Lys Tyr Glu Leu Lys Glu Gly Gin Thr 1 5 10 15

Leu Asp Vai Ala Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Ala Ser Ser Gin 20 25 30

Lys Ala Trp Gin lie lie Arg Asp Gly Glu Met Pro Lys Thr Leu Ala 35 40 45

Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lvs Asn Ser His Pro Val Gin Val Gly Arg 50 55 60 lie lie Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu Arg Val Arg Met 65 70 75 80

Val Asn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin Cys Val lie Tyr 85 90 95

Gin Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg lie Arg Leu Val 1Õ0 105 110

Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn Glu Asn Ser Thr 115 "* ^ 120 125

Gin Asn Val Tyr Lys lie Pro Pro Thr Thr Thr Lys Ala Leu Cys Pro 130 "* 135 140

Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gin Ala Pro Pro Lys Ser Thr 145 150 155 160

Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu lie Asn Leu Thr Asn Val Thr 165 170 175

Asp lie lie Arg Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gin 180 135 " 190

Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu His His His ills His His 195 200 205 <210> 14 <211> 20®

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A24/Y28F/N30S/R32Q/P70II-cTREM-1-Cmyc2-IIis6 <400> 14

Thr Thr Glu Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Giu Tyr Lys Glu Gly Gin Thr 1 5 10 15

Leu Glu Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Ala Ser Ser Gin 20 25 30

Lys Ala Trp Gin Lys Met. Glu Gly Lys Met Pro Lys lie Leu Ala Lys 35 40~ ~ 45

Thr Glu Arg Pro Ser Glu Asn Ser His Pro Vai Gin Vai Gly Arg lie 50 55 60

Thr Leu Glu Asp Tyr His Asp Ills Gly Leu Leu Gin Vai Gin Met Thr 65 " "* "0 75 80

Asn Leu Gin Vai Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin Cys Vai lie Tyr Gin 85 90 95

His Pro Lys Glu Ser Ills Vai Leu Phe Asn Pro lie Cys Leu Vai Vai 100 105 110

Thr Lys Gly Ser Ser Gly Thr Pro Glv Ser Ser Glu Asn Ser Thr Gin 115 120 125

Asn Vai Tyr Arg Thr Pro Ser Thr Thr Ala Lys Ala Leu Gly Pro Arg 130 " ’ 135 " 140

Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Vai Thr Gin Ala Pro Pro Glu Ser Thr Vai 145 ’ 150 155 160

Vai Vai Ser Thr Pro Gly Ser Glu lie Asn Leu Thr Asn Vai Thr Asp 165 170 175 lie lie Arg Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gin Lys 180 " 185 190

Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ills His Ills Ilis His Ills 195 200 205 <210> 1® <211> 20®

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A24T/Y28F/N30S/R32Q/E®4K-cTREM-l-Cmyc2-His6 <400> 1®

Thr Thr Glu Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Tyr Lys Gxu Gly bin Thr 1 5 10 15

Leu Glu Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Ala aer Ser 20 25 30

Lys Ala Trp Gin Lys Met Glu Gly Lys Met Pro Lys He Leu Ara Lys 35 ' 40 ’ 45

Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val Gin Va_ Ήγ Arg lie 50 55 60

Thr Leu Glu Asp Tyr Pro Asp His Gly Leu Leu Gin Va_ Gin Met Thr 55 ~ 70 75 30

Asn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin Cys Va_ Tie Tyr Gin 85 ’ 90 95

His Pro Lys Glu Ser His Val Leu Phe Asn Pro He Cys Leu val Var 100 105 110

Thr Lys Gly Ser Ser Gly Thr Pro Gly Ser Ser Glu Asn Ser Thr Gin 115 120 125

Asn Val Tyr Arg Thr Pro Ser Thr Thr Ala Lys Ala Leu Gly Pro Arg 130 135 140

Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gin Ala Pro Pro Glu Ser Thr Val 145 ’ 150 155 160

Val Val Ser Thr Pro Gly Ser Glu lie Asn Leu Thr Asn Val Thr Asp 165 170 175 lie lie Arg Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gin Lys 180 185 ‘ 190

Leu He Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His 195 200 205 <210> 16 < 211 > 2 x

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 16 t. a gt- a gggat- c eg etg g t g c acagg © a gg 0 c$

<210> 17 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 17 tagtaggegg ccgcttcgtg ggcctagggt sc

<210> 18 <211> 140 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> hTREM-l-IgV-His6 <400> 18

Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser 1 5 ' 10 lb

Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu GIu Lys Tyr Glu Leu Lys 20 25 ’ 30

Glu Gly Gin Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe 35 40 * 45

Ala Ser Ser Gin Lys Ala Trp Gin He lie Arg Asd Gly Glu Met Pro 50 55 60*

Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val 55 70 75 80

Gin Val Gly Arg He He Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu 85 90 95

Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin 100 105 HO

Cys Val lie Tyr Gin Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg 115 120 125

He Arg Leu Val Val Thr His His His His His His 130 135 140 <210> lx <211> 20®

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> cTREM-l-Cmyc2-IIis6 <400> lx

Thr Thr Glu Leu Thr Glu Glu Lys Tyr GIu Tyr Lys Giu Gly Gin Thr 1 5 10 15

Leu Glu Val Lys Cys Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Tyr Ala Asn Ser Arg 20 25 30

Lys Ala Trp Gin Lys Met Glu Gly Lys Met Pro Lys lie Leu Ala Lys 35 40 45

Thr Glu Arg Pro Ser Glu Asn Ser Ilis Pro Val Gin Val Gly Arg lie 50 55 60

Thr Leu Glu Asp Tyr Pro Asp Ills Gly Leu Leu Gin Val Gin Met. Thr 65 70 75 80

Asn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin Cys Val lie Tyr Gin 85 90 95

Ills Pro Lys Glu Ser Ills Val Leu Phe Asn Pro lie Cys Leu Val Val *100 105 *110

Thr Lys Gly Ser Ser Gly Thr Pro Gly Ser Ser Glu Asn Ser Thr Gin 115 120 125

Asn Val Tyr Arg Thr Pro Ser Thr Thr Ala Lys Ala Leu Gly Pro Arg 130 ” 135 140

Tyr Thr Ser Pro Arq Thr Val Thr Gin Ala Pro Pro Glu Ser Thr Val 145 ’ 150 155 160

Val Val Ser Thr Pro Gly Ser Glu lie Asn Leu Thr Asn Val Thr Asp 165 170 175 lie lie Arg Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gin Lys 180 185 190

Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Ilis Ilis Ilis Ills Ilis Ilis 195 200 205 <210> 20 <211> 206

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> hTREM-1-Cmyc2-His6 <400> 20

Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lvs Glu Gly Gin Thr 15 10 15

Leu Asp Vai Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Ala 3er 3er Gin 20 " 25 30

Lys Ala Trp Gin He lie Arq Asp Gly Glu Met Pro Lys Thr Leu Ala 35 ’ 40 45

Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val Gin Val Gly Arg 50 55 60 lie lie Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu Arg Val Arg Met 65 7 0 75 80

Val Asn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin Cys Val lie Tyr 85 90 ” 95

Gin Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg He Arg Leu Val 100 105 110

Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn Glu Asn Ser Thr 115 120 125

Gin Asn Val Tyr Lys He Pro Pro Thr Thr Thr Lys Ala Leu Cys Pro 130 135 140

Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gin Ala Pro Pro Lys Ser Thr 145 150 155 160

Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu He Asn Leu Thr Asn Val Thr 165 170 175

Asp lie lie Arg Glu Gin Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gin 180 185 190

Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His 195 200 205

<210> 21 <211> 233 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 21

Met. Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser 15 10 15

Glu Leu Arg Ala Thr Thr Glu Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Tyr Lys 20 25 30

Glu Gly Gin Thr Leu Glu Val Lys Cys Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Tyr 35 40 45

Ala Asn Ser Arg Lys Ala Trp Gin Lvs Met Glu Gly Lys Met Pro Lvs 50 55 " 60 lie Leu Ala Lys Thr Glu Arg Pro Ser Glu Asn Ser His Pro Val Gin 65 70 75 80

Val Gly Arg lie Thr Leu Glu Asp Tyr Pro Asp His Gly Leu Leu Gin 85 90 95

Val Gin Met Thr A.sn Leu Gin Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gin Cys 100 105 110

Val lie Tyr Gin His Pro Lys Glu Ser His val Leu Phe Asn Pro He 115 ’ 120 125

Cys Leu Val Val Thr Lys Gly Ser Ser Gly Thr Pro Gly Ser Ser Glu 130 "* 135 140

Asn Ser Thr Gin Asn Val Tyr Arg Thr Pro Ser Thr Thr Ala Lys Ala 145 150 155 160

Leu Gly Pro Arg Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gin Ala Pro Pro 165 170 175

Glu Ser Thr Val Val Val Ser Thr Pro Gly Ser Glu lie Asn Leu Thr 180 185 190

Asn Val Thr Asp He He Arg Val Pro Val Phe Asn lie Val lie He 195 200 205

Val Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu Phe 210 215 220 <210> 22 <211> 230

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Met Arg Lys Ala Gly Leu Trp Gly Leu Leu Cys Val Phe Phe Val Ser 1 5 10 15

Glu Val Lys Ala Ala lie Val Leu Glu Glu Glu Arg Tyr Asp Leu Val 20 25 30

Glu Gly Gin Thr Leu Thr Val Lys Cys Pro Phe Asn lie Met Lys Tyr 35 40 45

Ala Asn Ser Gin Lys Ala Trp Gin Arg Leu Pro Asp Gly Lys Glu Pro 50 55 ’ 60

Leu Thr Leu Val Val Thr Gin Arg Pro Phe Thr Arg Pro Ser Glu Val 65 70 75 80

His Met Gly Lys Phe Thr Leu Lys His Asp Pro Ser Glu Ala Met Leu 85 90 95

Gin Val Gin Met Thr Asp Leu Gin Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg 100 105 110

Cys Val lie Tyr Ilis Pro Pro Asn Asp Pro Val Val Leu Phe Ills Pro 115 120 125

Val Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Val 130 135 140 lie lie Pro He Thr Arg Leu Thr Glu Arg Pro He Leu lie Thr Thr 145 150 155 160

Lys Tyr Ser Pro Ser Asp Thr Thr Thr Thr Arg Ser Leu Pro Lys Pro 165 170 175

Thr Ala Val Val Ser Ser Pro Gly Leu Gly Val Thr He He Asn Gly 180 135 190

Thr Asp Ale. Asp Ser Val Ser Thr Ser Ser Val Thr lie Ser Val lie 195 200 205

Cvs Gly Leu Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe lie lie Leu Phe lie Val 210 215 220

Thr Lys Arg Thr Phe Gly 2 2 5 2 3 0 <210> 23 <211> 17®

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Gin Glu Thr Hu Asp Pro Ala Cys Cys Ser Pro lie Val Pro Arg Asn 1 5 'lO 15’

Glu Trp Lys Ala Leu Ala Ser Glu Cys Ala Gin His Leu Ser Leu Pro 20 25 30

Leu Arg Tyr Val Val Val Ser His Thr Ala Gly Ser Ser Cys Asn Thr 35 40 * 45

Pro Ala Ser Cys Gin Gin Gin Ala Arg Asn Val Gin His Tyr His Met 50 55 " 60

Lys Thr Leu Gly Trp Cys Asp Val Gly Tyr Asn Phe Leu Tie Gly Glu 65 70 "75 80

Asp Gly Leu Val Tyr Glu Gly Arg Gly Trp Asn Phe Thr Gly Ala His 85 ..... 90' ’ 95

Ser Gly His Leu Trp Asn Pro Met Ser He Gly lie Ser Phe Met Gly 100 105 110

Asn Tyr Met Asp Arg Val Pro Thr Pro Gin Ala lie Arg Ala Ala Gin 115 ’ 120 125

Gly Leu Leu Ala Cys Gly Val Ala Gin Gly Ala Leu Arg Ser Asn Tyr 130 ” 135 140

Val Leu Lys Gly His Arg Asp Val Gin Arg Thr Leu Ser Pro Gly Asn 145 " ' 150 " ’ 155 ’ 160

Gin Leu Tyr His Leu He Gin Asn Trp Pro His Tyr Arg Ser Pro 165 170 ‘ ' 175

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não ê parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 200808884X A [0006] • US 200316®87® A [0006] • WO 200®04021x A [0036] • US 200®0238646 A [0036] • US 20020161201 A [0036] • US ®67742® A, Bodmer [0048]

Documentos de não patente citados na descrição • BOUCHON et al. J. Immunol. , 2000, vol. 164 (10) , 4xxl- 4xx® [0002] • BOUCHON et al. Nature, 2001, vol. 410, 1103-1107 [0002] • SCHENK et al. Cl in Invest., 2007, vol. 117 (10) , 30x7- 3106 [0002] • KUAI et al. Rheumatology, 200x, vol. 48 (11), 13®2-13®8 [0002] • ROB J W et al. European Cytokine Network, 01 March 2011, vol. 22 (1), 11-14 [0006] • ELEANOR MOLLOY. human TREM-1 antibody. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 01

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Tech., 2004, vol. 2, 81 [0140] • MANDELL ; FALICK ; KOMIVES. Proc. Natl. Acad. Sci . USA, lxx8, vol. x®, 1470® [0140] • ANDERSEN, M.D. ; FABER, J.H. Int. J. Mass Spectrom. , 2011, vol. 302, 13x-148 [0150]

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo ou fragmento do mesmo que tem capacidade para se ligar especificamente e bloquear TREM-1, sendo que o anticorpo ou fragmento do mesmo tem capacidade para bloquear ativação induzida por PGLYRP1 de TREM-1 e tem um epítopo que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todos os resíduos de aminoácido D38, V3x, K40, C41, D42, Y43, T44 e L4® e um, dois ou todos os resíduos de aminoácido E46, K47, F4 8 de SEQ ID NO: 1 que representa a sequência de aminoãcidos de TREM-1 humano.
2. 2. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, que compete com mAb 0170 para se ligar à SEQ ID NO: 1 que representa a sequência de aminoácidos de TREM-1 humano, em que mAb 0170 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 e uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: ®.
3. 3. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que compete com mAb 0170 para se ligar à SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 21 que representa as sequências de aminoácidos de TREM-1 de macaco cinomolgo, em que mAb 0170 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 e uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: ®.
4. 4. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que tem capacidade para se ligar especificamente a um polipéptido que compreende aminoácidos D38 a F4 8 de SEQ ID NO: 1 que representa a sequência de aminoácidos de TREM-1 humano. ®. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que tem capacidade para se ligar especificamente a SEQ ID NO: 13 que representa a sequência de aminoãcidos de K20A-hTREM-l-Cmyc2-His6.
5. 6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a ®, que tem capacidade para se ligar especificamente a SEQ ID NO: 14 que representa a sequência de aminoãcidos de A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-l-Cmyc2-His6 .
6. 7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que tem capacidade para se ligar especificamente a SEQ ID NO: 1® que representa a sequência de aminoãcidos de A24T/Y28F/N30S/R32Q/E®4K-cTREM-l-Cmyc2-His6 .
7. 8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, cuja cadeia pesada compreende uma sequência CDRH1 correspondente aos resíduos de aminoácido 31 a 3® representados por aminoãcidos TYAMH de SEQ ID NO: 4, em que um de entre esses resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente,· e/ou uma sequência CDRH2 correspondente aos aminoãcidos ®0 a 68 representados por aminoãcidos RIRTKSSNYATYYAASVKG de SEQ ID NO: 4, em que um, dois ou três dos aminoãcidos referidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente; e/ou uma sequência CDRH3 correspondente aos resíduos de aminoácido 101 a 110 representados pelos aminoãcidos DMGIRRQFAY de SEQ ID NO: 4, em que um, dois ou três dos referidos resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a cadeia leve do mesmo compreende uma sequência CDRL1 correspondente aos resíduos de aminoácido 24 a 38 representados por aminoãcidos RASESVDTFDYSFLH de SEQ ID NO: ®, em que um, dois ou três desses resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou uma sequência CDRL2 correspondente aos resíduos de aminoácido ®4 a 60 representados por aminoácidos RASNLES de SEQ ID NO: ®, em que um ou dois desses resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou uma sequência CDRL3 correspondente aos resíduos de aminoácido x3 a 101 representados por aminoácidos QQSNEDPYT de SEQ ID NO: ®, em que um ou dois desses resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente. x. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, cuja cadeia pesada compreende uma sequência CDRH1 correspondente aos resíduos de aminoácido 31 a 3® representados por aminoácidos TYAMH de SEQ ID NO: 4; e/ou uma sequência CDRH2 correspondente aos aminoácidos ®0 a 68 representados por aminoácidos RIRTKSSNYATYYAASVKG de SEQ ID NO: 4; e/ou uma sequência CDRH3 correspondente aos resíduos de aminoácido 101 a 110 representados por aminoácidos DMGIRRQFAY de SEQ ID NO: 4; e a cadeia leve do mesmo compreende uma sequência CDRL1 correspondente aos resíduos de aminoácido 24 a 38 representados por aminoácidos RASESVDTFDYSFLH de SEQ ID NO: ®; e/ou uma sequência CDRL2 correspondente aos resíduos de aminoácido ®4 a 60 representados por aminoácidos RASNLES de SEQ ID NO: ®; e/ou uma sequência CDRL3 correspondente aos resíduos de aminoácido x3 a 101 representados por aminoácidos QQSNEDPYT de SEQ ID NO: ®.
8. 10. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a x, para utilização como um medicamento.