ES2750209T3 - Anticuerpos que se unen a y bloquean al receptor desencadenante expresado en células mieloides-1 (TREM-1) - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo que es capaz de unirse específicamente a TREM-1 y de bloquearlo, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo son capaces de bloquear la activación de TREM-1 inducida por PGLYRP1; en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprenden: una secuencia de CDRH1 TYAMH correspondiente a los restos de aminoácido 31 a 35 de la SEQ ID NO: 6; una secuencia de CDRH2 RIRTKSSNYATYYAASVKG correspondiente a los aminoácidos 50 a 68 de la SEQ ID NO: 6; y una secuencia de CDRH3 DMGQRRQFAY correspondiente a los restos de aminoácido 101 a 110 de la SEQ ID NO: 6; y en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprenden: una secuencia de CDRL1 RASESVDTFDYSFLH correspondiente a los restos de aminoácido 24 a 38 de la SEQ ID NO: 7; una secuencia de CDRL2 RASNLES correspondiente a los restos de aminoácido 54 a 60 de la SEQ ID NO: 7; y una secuencia de CDRL3 QQSNEDPYT correspondiente a los restos de aminoácido 93 a 101 de la SEQ ID NO: 7.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen a y bloquean al receptor desencadenante expresado en células mieloides-1 (TREM-1)

Campo de la invención

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones. La divulgación proporciona un método para identificar un anticuerpo funcional contra TREM-1. La invención se refiere a anticuerpos como se definen en las reivindicaciones que son capaces de unirse específicamente a TREM-1 y que son capaces de bloquear la actividad de TREM-1 bloqueando la activación de TREM-1 inducida por PGLYRP1. Además, la invención se refiere a usos para dichos anticuerpos como se definen en las reivindicaciones, tal como usos terapéuticos y farmacéuticos.

Antecedentes de la invención

El receptor desencadenante expresado en células mieloides-1 (TREM-1) es un receptor que se expresa en monocitos, macrófagos y neutrófilos. Cuando se activa, TREM-1 se asocia con una proteína de señalización, DAP12 y desencadena la liberación de citocinas proinflamatorias de las células que lo expresan (Bouchon et al, J. Immunol.

2000; 164 (10): 4991-4995). Se sabe que la expresión de proteínas y ARNm de TREM-1 está regulada positivamente en las células mieloides de individuos con septicemia, artritis reumatoide (AR) y enfermedad inflamatoria del intestino (EII). Cada vez más pruebas científicas respaldan la teoría de que TREM-1 contribuye al desarrollo y la progresión de enfermedades inflamatorias, ya que los monocitos y neutrófilos TREM-1 positivos reclutados en un área inflamada exacerban la inflamación (Bouchon et al. Nature 2001; 410: 1103-1107; Schenk et al, Clin Invest. 2007; 117 (10): 3097­ 3106); Kuai et al., Rheumatology (Oxford). 2009; 48(11):1352-1358.

Se conocen anticuerpos que son capaces de unirse a TREM-1, incluyendo TREM26 y TREM37 disponibles comercialmente (n.° de cat. 314902 y 316102, respectivamente, Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.), MAB1278 (n.° de cat. MAB1278, R&D Systems, Mineápolis, MN 55413, EE. UU.), mAb 6B1 (n.° de cat. HM2252, Hycult Biotech, Uden, Países Bajos) y anti-TREM-1 2E2 (n.° de cat. HPA005563, Sigma-Aldrich, Dinamarca). Todos los anticuerpos de TREM-1 conocidos son agonistas cuando están inmovilizados; es decir, aumentan la liberación de citocinas por parte de los monocitos, macrófagos y neutrófilos. Otra característica de los anticuerpos de TREM-1 conocidos es que no reaccionan de manera cruzada con TREM-1 de primates, tales como monos cynomolgus o monos rhesus, lo que significa que los anticuerpos conocidos no pueden probarse en estos animales.

Arts, Rob J W, et al., European Cytokine Network, Vol. 22(1), 1 de marzo de 2011, páginas 11-14, describe la interacción de TREM 1 con el complejo LPS/receptor TLR4. El documento WO 2008/088849 describe el tratamiento de la inflamación, detección y monitorización mediante TREM-1. El documento US 2003/165875 describe el receptor TREM (receptor desencadenante expresado en células mieloides) y usos del mismo.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo que sea capaz de unirse y de bloquear la función de TREM-1. Existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo de TREM-1 que sea capaz de prevenir que TREM-1 forme dímeros/multímeros. Existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo de TREM-1 que sea capaz de bloquear la activación y señalización de TREM-1. Existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo de TREM-1 que sea capaz de interferir con la interacción entre TREM-1 y su ligando. Existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo de TREM-1 que sea capaz de bloquear la liberación de citocinas de una célula mieloide. Existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo de TREM-1 que tenga poca o ninguna actividad agonista cuando es soluble o está inmovilizado. También existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo que sea capaz de unirse tanto a TREM-1 humano como a TREM-1 de una o más especies diferentes, tales como un primate, para poder investigar la toxicología así como evaluar la farmacocinética y la farmacodinámica del anticuerpo en modelos animales adecuados.

En el presente documento se describen anticuerpos de TREM-1 que son adecuados para su uso como agentes farmacéuticos. Dichos anticuerpos pueden tener un impacto sustancial en la calidad de vida de individuos con septicemia o una enfermedad inflamatoria crónica, tal como artritis reumatoide, artritis psoriásica y enfermedad inflamatoria del intestino.

Sumario

La presente divulgación se refiere a un método para identificar un anticuerpo de TREM-1 funcional, que comprende (a) cultivar una primera célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización y una construcción indicadora; (b) medir la actividad de la primera célula cuando se incuba dicha célula con un agente modificador de TREM-1; (c) poner en contacto el cocultivo de (b) con un anticuerpo de TREM-1; y (d) medir que la actividad de la primera célula es menor o mayor que la actividad medida en (b).

El método puede adaptarse para identificar una molécula de bloqueo de TREM-1, tal como un anticuerpo. El método para identificar un anticuerpo de bloqueo de TREM-1 comprende (a) cultivar una primera célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización y una construcción indicadora; (b) medir la actividad de la primera célula cuando dicha célula se incuba con un compuesto activante, tal como un ligando de TREM-1 o un neutrófilo activado; (c) poner en contacto el cocultivo de la primera célula y el compuesto activante, tal como un ligando de TREM-1 o un neutrófilo activado con un anticuerpo de TREM-1; y (d) medir que la actividad de la primera célula es menor que la actividad medida en (b).

El método puede adaptarse para identificar un anticuerpo estimulante de TREM-1. El método para identificar un anticuerpo estimulante de TREM-1 comprende (a) cultivar una primera célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización y una construcción indicadora; (b) medir la actividad de la primera célula; (c) poner en contacto/incubar dicha célula con un anticuerpo de TREM-1; y (d) medir que la actividad de la primera célula es mayor que la actividad medida en (b).

La primera célula puede ser de origen hematopoyético. El agente modificador de (b) puede ser un neutrófilo activado o un ligando de TREM-1. La proteína de señalización puede ser DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gamma RIII y un receptor de Fc o una porción del mismo. La proteína de señalización puede señalizar a través de un factor de transcripción, tal como NFAT o NFkB. El gen indicador puede ser un gen que no se expresa de manera nativa en dicha primera célula y puede ser un gen que codifica p-galactosidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) o cloranfenicol transferasa. La presente divulgación también se refiere a anticuerpos de TREM-1 estimulantes que pueden identificarse mediante el método inventado.

La presente invención se refiere a anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a TREM-1 y que son capaces de bloquear la función de TREM-1, como se define en las reivindicaciones. Dichos anticuerpos pueden ser capaces de prevenir o reducir la dimerización o multimerización de TREM-1. Dichos anticuerpos pueden ser capaces de bloquear la interacción entre TREM-1 y su ligando o los anticuerpos pueden ser capaces de bloquear la función de TREM-1 que se induce por un ligando de Tr EM-1. El TREM-1 puede ser TREM-1 humano y/o TREM-1 de una especie distinta a un ser humano, tal como TREM-1 de otro primate distinto de un ser humano.

Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de competir con mAb 0170 por la unión a TREM-1 humano. Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de unirse específicamente a un polipéptido que comprende los aminoácidos D38 a F48 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano). Los anticuerpos de la invención pueden tener un epítopo que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o todos los restos de aminoácido seleccionados entre el grupo que consiste en D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 y L45 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) y uno, dos o todos los restos de aminoácido seleccionados entre el grupo que consiste en E46, K47 y F48 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), como se puede determinar usando HX-MS. Los anticuerpos de la invención pueden tener un epítopo que comprende uno, dos, tres o todos los restos de aminoácido seleccionados entre el grupo que consiste en D42, E46, D92 y H93 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), como se puede determinar midiendo la unión del anticuerpo a variantes de TREM-1.

Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de competir con mAb 0170 por la unión a TREM-1 de mono cynomolgus. Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de unirse específicamente a un polipéptido que comprende los aminoácidos E19 a L26 de TREM-1 de mono cynomolgus (s Eq ID NO: 12) o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 21, como se puede determinar usando HX-MS.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse como agentes farmacéuticos para el tratamiento de individuos con una o más enfermedades autoinmunitarias y/o inflamación crónica. Por lo tanto, la presente invención también proporciona el anticuerpo o fragmento del mismo como se define en las reivindicaciones para su uso como medicamento; tal como para su uso en el tratamiento de individuos con una o más enfermedades autoinmunitarias y/o inflamación crónica, como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La activación de la línea celular BWZ.36 / hTREM-1: DAP12:NFAT-LacZ (también denominada en el presente documento como "célula indicadora BWZ/hTREM-1") se reduce por anticuerpos tales como 14F128 y 14F113, pero no por los anticuerpos disponibles comercialmente MAB1278 (R&D Systems, Mineápolis, MN 55413, EE. UU.: n.° de cat. MAB1278), anti-TREM-1 HPA (Sigma, EE. UU.: n.° de cat. HPA005563), aTREM26 (Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.: n.° de cat. 314902) y aTREM37 (Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.: n.° de cat. 316102).

Figura 2: La célula indicadora BWZ/hTREM-1 sola o cocultivada con neutrófilos preestimulados con TLRL. Los neutrófilos activados por TLRL pueden inducir un aumento de 15 veces en la señal (luminiscencia), en comparación con los neutrófilos no activados (véanse las dos últimas columnas). El control positivo (MAB1278 agonista unido a la placa (R&D Systems, Mineápolis, MN 55413, EE. UU.: n.° de cat. MAB1278) proporcionó una inducción de 32 veces en este experimento (véase la segunda columna). Los datos se representan como medias ± EEM (n = 3). Figura 3: Un ensayo indicador normalizado, en el que se estimula TREM-1 por neutrófilos activados por PGN, demuestra que los anticuerpos para TREM-26 disponibles comercialmente (n.° de cat. 314902, Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.), TREM-37 (n.° de cat. 316102, Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.), MAB1278 (n.° de cat. MAB1278, R&D Systems, Mineápolis, MN 55413, EE. UU.) y anti-TREM-1 HPA (n.° de cat. HPA005563, Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) Son anticuerpos agonistas que mejoran la señal de luminiscencia dependiente de TREM-1 en el ensayo indicador (dando una señal superior a 1). Se ha demostrado que los anticuerpos identificados como 5F27A1 y 14F69 son los mejores bloqueadores (proporcionando una señal inferior a 0,5). Los datos se representan como media ± EEM (n = 3). Control de isotipo MAB002 (n.° de cat. MAB002, R&D Systems, Mineápolis, MN 55413, EE. UU.). Todos los anticuerpos se han usado a 1 pg/ml.

Figura 4: Actividad en el ensayo indicador de BWZ/hTREM-1. En el eje x, la actividad de bloqueo de TREM-1 se muestra como la actividad que permaneció cuando se añadieron 0,2 pg/ml de anticuerpo a la célula indicadora BWZ/hTREM-1, que se había preactivado con neutrófilos estimulados con PGN. Cuando los anticuerpos de TREM-1 estaban unidos a la placa, algunos (incluidos todos los anticuerpos de TREM-1 disponibles en el mercado) pudieron unirse a TREM-1 y, por lo tanto, activar TREM-1. Esta actividad se muestra en el eje y. Por lo tanto, los anticuerpos que se muestran como puntos en el cuadro en la esquina inferior izquierda muestran propiedades diferentes en comparación con los anticuerpos conocidos, siendo ventajosamente bloqueante y no agonista. Figura 5: Unión de anticuerpos de TREM-1 humanos a PBMC de un mono rhesus. En la esquina superior izquierda, se muestra que la mayoría de los anticuerpos solo se unen a TREM-1 humano (cada punto negro representa un anticuerpo). Algunos anticuerpos, tales como los mAb 0025 y 14F128, 14F11, 14F29, 14F113 y 14F69, fueron capaces de unirse tanto a TREM-1 humano como a TREM-1 de mono rhesus, mostrando reactividad cruzada. Figura 6: Unión de anticuerpos anti-TREM-1 humano a PBMC de un mono cynomolgus. En la esquina superior izquierda, se muestra que la mayoría de anticuerpos solo se unen a TREM-1 humano (cada punto negro representa un anticuerpo). Algunos anticuerpos, tales como mAb 0025 y 14F128, 14F11, 14F29, fueron capaces de unirse a TREM-1 de ser humano y de mono cynomolgus, mostrando reactividad cruzada. Algunos anticuerpos, tales como 14F69 (mAb 0044), pueden unirse a PBMC de mono cynomolgus (Fig. 6B) y a PBMC humanas (Fig. 6C) igualmente bien.

Figura 7: Cobertura de secuencia de péptidos analizados por HX de hTREM-1 en presencia y ausencia de mAb 0023 o mAb 0026 (A), mAb 0024 o Clon 26 de Biolegend (B), mAb 0025 (C) o MAB1278 de R&D Biosystems (D). La secuencia primaria se muestra sobre los péptidos analizados por HX (mostrados como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como en ausencia de mAb se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación reducida de deuterio tras la unión del mAb se colorean en negro. Las regiones de secuencia en recuadro definen el epítopo.

Figura 8: Mapeo estructural del epítopo de mAb 0025 en hTREM-1. La estructura de hTREM-1 (pdb 1Q8M) se representa con una parte del dímero como cable C-alfa negro. La otra parte del dímero hTREM-1 se muestra en una cinta gris con el epítopo 0025 en negro.

Figura 9: La célula indicadora BWZ/hTREM-1 cocultivada con el complejo de ligando TREM-1 refleja la funcionalidad de TREM-1 que se inhibió de forma dependiente de la dosis por mAb para TREM-1 - 0170.

Figura 10: La liberación de TNF alfa por macrófagos M2 estimulados por PGLYRP-1 fue bloqueada por los anticuerpos de TREM-1.

Figura 11: Las secuencias de TREM-1 de ser humano y de mono cynomolgus están alineadas. Los restos de aminoácidos que difieren entre las dos se muestran en negrita. Los restos que se ha demostrado que se encuentran en el epítopo (según se determina usando HX-MS y resonancia de plasmón superficial) están resaltados.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos de TREM-1 humano de tipo silvestre (ts).

La SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable del anticuerpo m14F69. La SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable del anticuerpo m14F69. La SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un primer anticuerpo de TREM-1 humanizado (mAb 0170).

La SEQ ID NO: 5 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un primer anticuerpo de TREM-1 humanizado (mAb 0170).

La SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un segundo anticuerpo de TREM-1 humanizado (mAb 0122).

La SEQ ID NO: 7 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un segundo anticuerpo de TREM-1 humanizado (mAb 0122).

La SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo m14F128.

La SEQ ID NO: 9 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo m14F128.

La SEQ ID NO: 10 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo m14F113. La SEQ ID NO: 11 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo m14F113.

La SEQ ID NO: 12 representa la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del mono cynomolgus de tipo silvestre (ts) (c) TREM-1, cuando se expresa en E. coli.

La SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de aminoácidos de K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (construcción 0222). La SEQ ID NO: 14 representa la secuencia de aminoácidos de A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (construcción 0244).

La s Eq ID NO: 15 representa la secuencia de aminoácidos de A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6 (construcción 0245).

La SEQ ID NO: 16 representa la secuencia de ácido nucleico de un cebador.

La SEQ ID NO: 17 representa la secuencia de ácido nucleico de un cebador.

La SEQ ID NO: 18 representa la secuencia de aminoácidos de (h) TREM-1 (1-134)-His 6 humano.

La SEQ ID NO: 19 representa la secuencia de aminoácidos de cTREM-1-Cmyc2-His6 (construcción 0238). La SEQ ID NO: 20 representa la secuencia de aminoácidos de hTREM-1-Cmyc2-His6 (construcción 0247).

secuencia de aminoácidos de

EM-1 de longitud completa.

secuencia de aminoácidos de TREM-1 murino (m) de longitud completa. secuencia de aminoácidos de hPGLYRP1 de longitud completa.

Descripción

TREM-1 es una proteína transmembrana que consiste en 234 aminoácidos, incluyendo un único dominio de inmunoglobulina extracelular y una cola citoplasmática corta sin motivo de señalización aparente. Cuando está activado, TREM-1 se asocia con la proteína adaptadora de señalización que contiene ITAM, DAP12. La señalización corriente abajo puede incluir la activación del factor de transcripción NFAT, provocando una regulación positiva de la producción de citocinas proinflamatorias.

La presente invención se refiere a anticuerpos que son capaces de unirse y bloquear específicamente la función de TREM-1, como se define en las reivindicaciones. Los anticuerpos de la invención pueden bloquear la función TREM-1 reduciendo/bloqueando la activación y señalización corriente abajo de TREM-1.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden bloquear TREM-1 por medio de uno de uno o una combinación de varios mecanismos diferentes, bloqueando TREM-1 directa o indirectamente. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden evitar que el ligando natural de TREM-1, la proteína de reconocimiento de peptidoglucano 1 (PGLYRP1), al crear un complejo funcional con TREM-1 y/o anticuerpos de la invención puede bloquear a TREM-1 evitando que las moléculas individuales de TREM-1 formen dímeros o multímeros. La dimerización o multimerización de TREM-1 puede reducirse o prevenirse mediante anticuerpos de TREM-1 que son capaces de unirse a una porción de TREM-1 que de otro modo residiría en la interfaz de un dímero TREM-1, evitando de este modo que las moléculas individuales de TREM-1 se asocien entre sí. La dimerización o multimerización de TREM-1 puede reducirse o prevenirse mediante anticuerpos de TREM-1 que interfieren con la interacción de TREM-1 con su ligando. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención bloquean la activación inducida por PGLYRP1 de TREM-1.

PGLYRP1, una proteína altamente conservada de 196 aminoácidos de longitud que consiste en un péptido de señal y un dominio de dominio a peptidoglucano, se expresa en neutrófilos y se libera tras su activación. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden regular negativamente la liberación de citocinas proinflamatorias de las células mieloides. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden bloquear la liberación de TNF alfa, MIP-1beta, MCP-1, IL-1 beta, GM.CSF, IL-6 y/o IL-8 de macrófagos, neutrófilos, células de tejido sinovial y/o una célula indicadora, como se desvela en el presente documento.

Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de unirse tanto a TREM-1 humano como a TREM-1 de otra especie distinta de un ser humano. El término "TREM-1", como se usa en el presente documento, abarca por lo tanto cualquier forma de origen natural de TREM-1 que pueda proceder de cualquier organismo adecuado. Por ejemplo, TREM-1 para su uso como se describe en el presente documento puede ser TREM-1 de vertebrado, tal como TREM-1 de mamífero, tal como TREM-1 de un primate (tal como un ser humano, un chimpancé, un mono cynomolgus o un mono rhesus); un roedor (tal como un ratón o una rata), un lagomorfo (tal como un conejo) o un artiodáctilo (tal como una vaca, oveja, cerdo o camello). Preferentemente, el TREM-1 es la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano). El TREM-1 puede ser una forma madura de TREM-1, tal como una proteína TREM-1 que se ha sometido a un procesamiento postraduccional dentro de una célula adecuada. Dicha proteína TREM-1 madura puede, por ejemplo, estar glucosilada.

El TREM-1 puede ser una proteína TREM-1 de longitud completa.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales, en el sentido de que proceden directa o indirectamente de un solo clon de un linfocito B. Pueden producirse, explorarse y purificarse anticuerpos de TREM-1 usando, por ejemplo, los métodos descritos en los ejemplos. En resumen, puede inmunizarse a un ratón adecuado, tal como un ratón con supresión génica de TREM-1 o de TREM-1/TREM-3 con TREM-1, una célula que expresa TREM-1 o una combinación de ambos.

Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales en el sentido de ser una mezcla de anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención.

La exploración primaria de sobrenadantes de hibridoma puede llevarse a cabo usando ELISA directo o FMAT y la exploración secundaria puede llevarse a cabo usando citometría de flujo. Los sobrenadantes de hibridoma positivos pueden seleccionarse posteriormente en un ensayo de gen indicador.

Los anticuerpos pueden expresarse de forma recombinante en células procariotas o eucariotas. La célula procariota puede ser E. coli. La célula eucariota puede ser una levadura, célula de insecto o de mamífero, tal como una célula procedente de un organismo que es un primate (tal como un ser humano, un chimpancé, un mono cynomolgus o un mono rhesus), un roedor (tal como un ratón o una rata), un lagomorfo (tal como un conejo) o un artiodáctilo (tal como una vaca, oveja, cerdo o camello). Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células HEK293, células CHO y células HELA. Los anticuerpos de TREM-1 también pueden producirse por medio de otros métodos conocidos por el experto en la materia, tal como una presentación en fagos o una presentación en levaduras.

Una vez producidos, los anticuerpos pueden explorarse respecto de su unión a, por ejemplo, TREM-1 de longitud completa o mutantes del mismo usando los métodos descritos en los ejemplos.

La memoria descriptiva desvela un método para identificar un anticuerpo de TREM-1 funcional. Los anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a TREM-1 y que tienen algún efecto sobre la activación de TREM-1 y la señalización corriente abajo se denominan en el presente documento como "anticuerpos de TREM-1 funcionales". Un anticuerpo de TREM-1 "funcional" en el presente documento se refiere a un anticuerpo que es capaz de bloquear o estimular a TREM-1. El método para identificar un anticuerpo de TREM-1 funcional comprende (a) cultivar una primera célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización y una construcción indicadora; (b) medir la actividad de la primera célula cuando se incuba dicha célula con un agente modificador de TREM-1; (c) poner en contacto el cocultivo de (b) con un anticuerpo de TREM-1; y (d) medir que la actividad de la primera célula es menor o mayor que la actividad medida en (b).

La "primera célula" de (a) puede ser una célula de origen hematopoyético, tal como una célula mieloide, tal como un linfocito T. La proteína de señalización de (a) puede ser cualquier proteína de señalización capaz de formar un complejo con TREM-1. Las proteínas de señalización adecuadas incluyen DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gamma RIII y un receptor de Fc o una parte del mismo. La construcción indicadora de (a) puede ser cualquier construcción que pueda activarse a través de la proteína de señalización y generar una señal reconocible. Las construcciones indicadoras adecuadas comprenden un factor de transcripción y un gen indicador. La proteína de señalización puede señalizar a través de un factor de transcripción seleccionado entre el grupo que consiste en NFAT y NFkB. El gen indicador es un gen que no se expresa de manera nativa en dicha primera célula y puede ser un gen que codifica pgalactosidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) o cloranfenicol transferasa. Dicha primera célula puede transfectarse con un factor de transcripción y un gen indicador usando métodos que son bien conocidos en la técnica.

La "célula indicadora BWZ/hTREM-1" descrita en los ejemplos es un ejemplo de una "primera célula".

El agente modificador de (b) puede ser un ligando de TREM-1 o un neutrófilo activado. El "anticuerpo de TREM-1" de (c) puede ser un sobrenadante de hibridoma específico para TREM-1 o un anticuerpo purificado. La actividad medida en (d) es la señal producida por la construcción indicadora. Un ejemplo de dicha señalización es la luminiscencia provocada por la producción de LacZ (luciferasa de p-lactamasa) impulsada por NFAT.

El método puede adaptarse para identificar un anticuerpo de bloqueo de TREM-1. El método para identificar un anticuerpo de bloqueo de TREM-1 comprende (a) cultivar una primera célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización y una construcción indicadora; (b) medir la actividad de la primera célula cuando dicha célula se incuba con un neutrófilo activado; (c) poner en contacto el cocultivo de la primera célula y el neutrófilo activado con un anticuerpo de TREM-1; y (d) medir que la actividad de la primera célula es menor que la actividad medida en (b).

El método también puede adaptarse para identificar un anticuerpo estimulante de TREM-1. El método para identificar un anticuerpo estimulante de TREM-1 comprende (a) cultivar una primera célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización y una construcción indicadora; (b) medir la actividad de la primera célula; (c) poner en contacto/incubar dicha célula con un anticuerpo de TREM-1; y (d) medir que la actividad de la primera célula es mayor que la actividad medida en (b).

La presente invención se refiere a anticuerpos de bloqueo de TREM-1 como se definen en las reivindicaciones que pueden identificarse mediante el método, desvelado en el presente documento, de identificación de un anticuerpo de bloqueo. Cuando se ensaya usando el método descrito anteriormente y en los ejemplos, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede, a una concentración de menos de 100 pg/ml - tal como de menos de 90 pg/ml, tal como de menos de 80 pg/ml, tal como de menos de 70 pg/ml, tal como de menos de 60 pg/ml, tal como de menos de 50 pg/ml, tal como de menos de 40 pg/ml, tal como de menos de 30 pg/ml, tal como de menos de 20 pg/ml, tal como de menos de 10 pg/ml, tal como de menos de 5 pg/ml, tal como de menos de 1 pg/ml - ser capaz de reducir la actividad de dicha primera célula en un 50 %, tal como un 60 %, tal como un 70 %, tal como un 80 %, tal como un 90 %, tal como un 95%, tal como un 100%. Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser capaz de extinguir completamente la actividad de la primera célula. Cuando se prueba usando el método descrito anteriormente y en los ejemplos, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede, a una concentración de menos de 1 pg/ml - tal como de menos de 0,9 pg/ml, tal como de menos de 0,8 pg/ml, tal como de menos de 0,7 pg/ml, tal como de menos de 0,6 pg/ml, tal como de menos de 0,5 pg/ml, tal como de menos de 0,4 pg/ml, tal como de menos de 0,3 pg/ml, tal como de menos de 0,2 pg/ml - ser capaz de extinguir la actividad de la primera célula.

La presente invención también se refiere a anticuerpos de bloqueo de TREM-1 como se definen en las reivindicaciones que pueden identificarse por medios distintos al método desvelado en el presente documento.

El término "anticuerpo" en el presente documento se refiere a una proteína, procedente de una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno (TREM-1) o una porción del mismo. El término incluye anticuerpos de longitud completa de cualquier clase o isotipo (es decir, IgA, IgE, IgG, IgM y/o IgY) y cualquier cadena única o fragmento del mismo. Un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno o una porción del mismo, puede unirse exclusivamente a ese antígeno o porción del mismo o puede unirse a un número limitado de antígenos homólogos o porciones de los mismos. Los anticuerpos de longitud completa normalmente comprenden al menos cuatro cadenas de polipéptido: dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que están interconectadas por enlaces disulfuro. Una subclase de inmunoglobulina de particular interés farmacéutico es la familia de IgG. En seres humanos, la clase IgG puede subdividirse en 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, basándose en la secuencia de sus regiones constantes de cadena pesada. Las cadenas ligeras pueden dividirse en dos tipos, kappa y lambda, basándose en las diferencias en su composición de secuencia. Las moléculas de IgG están compuestas por dos cadenas pesadas, entrelazadas por dos o más enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, cada una unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro. Una cadena pesada puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) y hasta tres regiones constantes de cadena pesada (CH): CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, de sus siglas en inglés). Las regiones VH y VL están normalmente compuestas de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras forman un dominio [de unión] que es capaz de interactuar con un antígeno, mientras que la región constante de un anticuerpo puede mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo, pero sin limitación, diversas células del sistema inmunitario (células efectoras), receptores de Fc y el primer componente (CIq) del sistema de complemento clásico.

Los anticuerpos de la presente invención pueden estar aislados. La expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que se ha separado y/o recuperado de otros componentes en el ambiente en que se produjo y/o que se ha purificado a partir de una mezcla de componentes presentes en el ambiente en el que se produjo.

Ciertos fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos pueden ser adecuados en el contexto de la presente invención, ya que se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno, tal como TREM-1, como se describe en el presente documento. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (habitualmente, los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo), Fv monocatenario (scFv; véase, por ejemplo, Bird et al., Science 1988; 242:42s -426; y Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (habitualmente el dominio VH y CHI) y dAb (habitualmente un dominio VH); dominios VH, VL, VhH y V-NAR; moléculas monovalentes que comprenden una sola VH y una sola cadena VL; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (véase, por ejemplo, III et al., Protein Eng 1997;10:949-57); IgG de camélido; IgNAR; así como una o más CDR aisladas o un parátopo funcional, donde las CDR aisladas o restos de unión a antígeno o polipéptidos pueden asociarse o unirse entre sí para formar un fragmento de anticuerpo funcional. Se han descrito o revisado varios tipos de fragmentos de anticuerpo en, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; documento WO2005040219 y Publicaciones de Solicitudes de Patente de Estados Unidos 20050238646 y 20020161201. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y puede explorarse la utilidad de los fragmentos del mismo modo que con los anticuerpos intactos.

Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humanizado. La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que al menos una parte de una región marco conservada y/o al menos una parte de una región CDR proceden de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal. (Por ejemplo, un anticuerpo humano puede tener regiones variables en las que tanto las regiones marco como las CDR proceden de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal). Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también proviene de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo).

Dicho anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Dicho anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.

Pueden aislarse anticuerpos humanos de bibliotecas de secuencias construidas sobre selecciones de secuencias de la línea germinal humana, diversificadas adicionalmente con diversidad de secuencias naturales y sintéticas.

Pueden prepararse anticuerpos humanos por inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr.

La expresión "derivado de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

La expresión "anticuerpo humanizado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo quimérico humano/no humano que contiene una o más secuencias (regiones CDR o partes de las mismas) que proceden de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado es, por lo tanto, una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que al menos los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de un anticuerpo de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como de un ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad, composición de secuencia y funcionalidad deseadas. En algunos casos, los restos de FR de la inmunoglobulina humana están sustituidos por los restos no humanos correspondientes. Un ejemplo de dicha modificación es la introducción de una o más de las denominadas retromutaciones, que normalmente son restos de aminoácidos procedentes del anticuerpo donante. La humanización de un anticuerpo puede llevarse a cabo usando técnicas recombinantes conocidas por el experto en la materia (véase, por ejemplo, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, editado por Benny K. C. Lo). Puede identificarse un marco receptor humano adecuado para el dominio variable tanto de cadena ligera como pesada mediante, por ejemplo, homología de secuencia o estructural. Como alternativa, pueden usarse marcos receptores fijos, por ejemplo, basándose en el conocimiento de la estructura, y las propiedades biofísicas y bioquímicas. Los marcos receptores pueden proceder de la línea germinal o proceder de una secuencia de anticuerpo madura. Las regiones donantes del anticuerpo donante pueden transferirse mediante injerto de CDR. El anticuerpo humanizado injertado con CDR puede optimizarse adicionalmente para por ejemplo, afinidad, funcionalidad y propiedades biofísicas mediante la identificación de posiciones marco críticas donde la reintroducción (retromutación) del resto de aminoácido del anticuerpo donante tiene un impacto beneficioso en las propiedades del anticuerpo humanizado. Además de las retromutaciones procedentes del anticuerpo donante, el anticuerpo humanizado puede modificarse mediante la introducción de restos de línea germinal en las regiones CDR o marco, eliminación de epítopos inmunogénicos, mutagénesis dirigida al sitio, maduración de la afinidad, etc.

Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá al menos uno y normalmente dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y en los que todos o sustancialmente todos los restos de FR proceden de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede, opcionalmente, comprender además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana.

La expresión "derivado de anticuerpo humanizado" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humanizado, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

La expresión "anticuerpo quimérico", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, normalmente por ingeniería genética, a partir de genes de región constante y variable de inmunoglobulina que proceden de diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos.

La región cristalizable del fragmento ("región Fc'V'dominio Fc") de un anticuerpo es la región N-terminal de un anticuerpo, que comprende los dominios constantes CH2 y CH3. El dominio Fc puede interactuar con los receptores de la superficie celular denominados receptores de Fc, así como con algunas proteínas del sistema del complemento. La región Fc permite que los anticuerpos interactúen con el sistema inmunitario. En un aspecto de la invención, los anticuerpos se pueden diseñar genéticamente para que incluyan modificaciones en la región Fc, normalmente para alterar una o más de sus propiedades funcionales, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, unión a receptor de Fc, estabilidad de proteínas y/o citotoxicidad dependiente de antígeno o ausencia de la misma, entre otras. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) se puede modificar para alterar su glucosilación, para alterar de nuevo una o más propiedades del anticuerpo. Un anticuerpo IgG1 puede portar un dominio Fc modificado que comprende uno o más y posiblemente todas las mutaciones siguientes que darán como resultado una afinidad reducida por ciertos receptores de Fc (L234A, L235E y G237A) y en la fijación reducida a complemento mediada por C1q (A330S y p 331S), respectivamente (numeración de restos según el índice de EU).

El isotipo de un anticuerpo de la invención puede ser IgG, tal como IgG1, tal como IgG2, tal como IgG4. Si se desea, puede "cambiarse" la clase de un anticuerpo mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, puede cambiarse la clase de un anticuerpo que se produjo inicialmente como IgM a un anticuerpo IgG. También pueden usarse técnicas de cambio de clase para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo: de IgG1 a IgG2 o IgG4; de IgG2 a IgG1 o IgG4; o de IgG4 a IgG1 o IgG2. También puede emplearse ingeniería de anticuerpos para generar moléculas quiméricas de región constante mediante la combinación de regiones de diferentes subclases de IgG.

En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra, por ejemplo, se aumenta o se disminuye. Esta estrategia se describe adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.677.425 por Bodmer et al.

Puede modificarse la región constante para estabilizar el anticuerpo, por ejemplo, para reducir el riesgo de que un anticuerpo bivalente se separe en dos fragmentos VH-VL monovalentes. Por ejemplo, en una región constante de IgG4, el resto S228 (numeración de restos de acuerdo con el índice de EU) puede mutarse a un resto de prolina (P) para estabilizar la formación de puente disulfuro intercadena en la bisagra (véase, por ejemplo, Angal et al., Mol Immunol. 1995; 30: 105-8).

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos también pueden definirse en términos de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR). La expresión "región determinante de la complementariedad" o "región hipervariable", cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un anticuerpo en las que se sitúan los restos de aminoácido implicados en la unión a antígeno. Las regiones de hipervariabilidad o CDR pueden identificarse como las regiones con la máxima variabilidad en los alineamientos de aminoácidos de los dominios variables de anticuerpo. Pueden usarse bases de datos para la identificación de las CDR, tales como la base de datos de Kabat, definiéndose que las CDR, por ejemplo, comprenden los restos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., Publicación de la NIH N.° 91-3242). Como alternativa, las CDR pueden definirse como aquellos restos de un "bucle hipervariable" (restos 26-33 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). Normalmente, la numeración de restos de aminoácido en esta región se realiza por el método descrito en Kabat et al., anteriormente citado. Las frases tales como "posición de Kabat", "resto de Kabat" y "de acuerdo con Kabat" en el presente documento hacen referencia a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera. Usando el sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción en, una región marco conservada (FR) o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (resto 52a, 52b y 52c de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de CDR H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "convencional".

La expresión restos de la "región marco conservada" o "FR" se refiere a los restos de aminoácido de VH o VL que no están dentro de las CDR, como se define en el presente documento.

El anticuerpo m14F69 tiene una secuencia variable de cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 2 y una secuencia variable de cadena ligera como se muestra en la s Eq ID NO: 3. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender esta secuencia variable de cadena pesada y/o esta secuencia variable de cadena ligera. El anticuerpo m14F69 tiene las secuencias de CDR que se muestran en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 68 y 101 a 110 de la SEQ ID NO: 2 y los aminoácidos 24 a 38, 54 a 60 y 93 a 101 de la SEQ ID NO: 3. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias de CDR. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender los aminoácidos 101 a 110 de la SEQ ID NO: 2.

La cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDR1 de los aminoácidos 31 a 35 (TYAMH) de la SEQ ID NO: 2, en donde pueden sustituirse uno de estos aminoácidos por un aminoácido diferente.

La cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDR2 de los aminoácidos 50 a 68 (RIRTKSSNYATYYADSVKD) de la SEQ ID n O: 2, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDR3 de los aminoácidos 101 a 110 (DMGQRRQFAY) de la SEQ ID NO: 2, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDR1 de los aminoácidos 24 a 38 (RASESVDTFDYSFLH) de la SEQ ID NO: 3, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDR2 de los aminoácidos 54 a 60 (RASNLES) de la SEQ ID NO: 3, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDR3 de los aminoácidos 93 a 101 (QQSNEDPYT) de la SEQ ID NO: 3, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

El anticuerpo mAb 0170 tiene una secuencia de cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 4 y una secuencia de cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 5. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender esta secuencia de cadena pesada y/o esta secuencia de cadena ligera. El anticuerpo mAb 0170 tiene las secuencias de CDR que se muestran en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 68 y 101 a 110 de la SEQ ID NO: 4 y los aminoácidos 24 a 38, 54 a 60 y 93 a 101 de la SEQ ID NO: 5. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias de CDR.

El anticuerpo mAb 0122 tiene una secuencia de cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 6 y una secuencia de cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 7. Un anticuerpo de la invención puede comprender esta secuencia de cadena pesada y/o esta secuencia de cadena ligera. El anticuerpo mAb 0122 tiene las secuencias de CDR que se muestran en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 68 y 101 a 110 de la SEQ ID NO: 6 y los aminoácidos 24 a 38, 54 a 60 y 93 a 101 de la SEQ ID NO: 7. Un anticuerpo de la invención comprende las 6 de estas secuencias de CDR.

La cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDRH1 de los aminoácidos 31 a 35 (TYAMH) de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6, en donde pueden sustituirse uno de estos aminoácidos por un resto de aminoácido diferente.

La cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDRH2 de los aminoácidos 50 a 68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG) de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDRH3 de los aminoácidos 101 a 110 (DMGIRRQFAY) de la SEQ ID NO: 4, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDRH3 de los aminoácidos 101 a 110 (DMGQRRQFAY) de la SEQ ID NO: 6, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDRL1 de los aminoácidos 24 a 38 (RASESVDTFDYSFLH) de la SEQ ID NO: 5 o la Se Q ID NO: 7, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDRL2 de los aminoácidos 54 a 60 (RASNLe S) de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

La cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede comprender una secuencia de CDRL3 de los aminoácidos 93 a 101 (QQSNEDPYT) de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

El anticuerpo m14F128 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 8 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 9. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender esta secuencia variable de cadena pesada y/o esta secuencia variable de cadena ligera. El anticuerpo m14F128 tiene las secuencias de CDR que se muestran en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 68 y 101 a 110 de la SEQ ID NO: 8 y los aminoácidos 24 a 38, 54 a 60 y 93 a 101 de la SEQ ID NO: 9. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias de CDR.

El anticuerpo m14F113 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 11. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender esta secuencia variable de cadena pesada y/o esta secuencia variable de cadena ligera. El anticuerpo m14F113 tiene las secuencias de CDR que se muestran en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 68 y 101 a 110 de la SEQ ID NO: 10 y los aminoácidos 24 a 38, 54 a 60 y 93 a 101 de la SEQ ID NO: 11. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias de CDR. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender los aminoácidos 101 a 110 de la SEQ ID NO: 10.

El término "antígeno" (Ag) se refiere a la entidad molecular usada para la inmunización de un vertebrado inmunocompetente para producir el anticuerpo (Ab) que reconoce al antígeno. En el presente documento, el Ag se denomina más ampliamente y generalmente pretende incluir moléculas diana que son reconocidas específicamente por el Ab, incluyendo por tanto fragmentos o miméticos de la molécula usada en el proceso de inmunización u otro proceso, por ejemplo, presentación en fagos, usado para generar el Ab.

El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se define en el contexto de una interacción molecular entre un "polipéptido de unión a antígeno", tal como un anticuerpo (Ab) y su antígeno correspondiente (Ag). En general, "epítopo" se refiere al área o la región en un Ag al que se une específicamente un Ab, es decir, el área o región en contacto físico con el Ab. El contacto físico puede definirse mediante diversos criterios (por ejemplo, un valor de corte de distancia de 2-6 A, tal como 3Á, tal como 4 A, tal como 5 A; o de accesibilidad del disolvente) para átomos en las moléculas de Ab y Ag. Un epítopo de proteína puede comprender restos de aminoácido en el Ag que están implicados directamente en la unión a un Ab (También denominado el componente inmunodominante del epítopo) y otros restos de aminoácido, que no están implicados directamente en la unión, tales como restos de aminoácido del Ag que se bloquean eficazmente por el Ab, es decir, restos de aminoácido en la "superficie excluida al disolvente" y/o la "huella" del Ab.

El término epítopo en el presente documento comprende ambos tipos de región de unión en cualquier región particular de TREM-1 que se une específicamente a un anticuerpo de TREM-1. TREM-1 puede comprender una serie de epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación, epítopos conformacionales que consisten en uno o más aminoácidos no contiguos ubicados próximos entre sí en la conformación de TREM-1 maduro y epítopos postraduccionales que consisten, en su totalidad o en parte, en estructuras moleculares unidas covalentemente a TREM-1, tales como grupos de carbohidrato.

El epítopo para un par de anticuerpo (Ab)/antígeno (Ag) dado puede describirse y caracterizarse con diferentes niveles de detalle usando varios métodos de mapeo de epítopos experimentales y conformacionales. Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HX-MS) y diversos métodos de unión competitiva; métodos que se conocen en la técnica. Como cada método se basa en un principio único, la descripción de un epítopo está íntimamente ligada al método mediante el que se ha determinado. Por lo tanto, dependiendo del método de mapeo de epítopos empleado, el epítopo para un par de Ab/Ag dado puede describirse de un modo distinto.

A su nivel más detallado, el epítopo para la interacción entre el Ag y el Ab puede describirse por las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción de Ab-Ag, así como información acerca de sus contribuciones relativas a la termodinámica de unión. A un nivel menos detallado, el epítopo puede caracterizarse por las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ab y el Ab. A un nivel incluso menos detallado, el epítopo puede caracterizarse por los restos de aminoácido que comprende, definidos por criterios específicos, tales como la distancia entre o la accesibilidad al disolvente de los átomos en el complejo de Ab:Ag. A un nivel menos detallado adicional, el epítopo puede caracterizarse mediante la función, por ejemplo, mediante unión competitiva con otros Ab. También puede definirse de manera más genérica que el epítopo comprende restos de aminoácidos para los que la sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ab y el Ag.

En el contexto de una estructura cristalina obtenida mediante rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, por ejemplo, un fragmento Fab y su Ag, el término epítopo se define específicamente en el presente documento, a menos que se especifique de otro modo o se contradiga por el contexto, como restos de TREM-1 caracterizados por que tienen un átomo pesado (es decir, un átomo distinto de hidrógeno) a una distancia de, por ejemplo, 4 A de un átomo pesado en el Ab.

Partiendo del hecho de que las descripciones y definiciones de los epítopos, dependiendo del método de mapeo de epítopos usado, se obtienen con diferentes niveles de detalle, se deduce que puede realizarse una comparación de epítopos para diferentes Ab en el mismo Ag de manera similar a diferentes niveles de detalle.

Se dice que los epítopos descritos a nivel de aminoácidos, por ejemplo, determinados a partir de una estructura de rayos X, son idénticos si contienen el mismo conjunto de restos de aminoácido. Se dice que los epítopos se solapan si al menos un aminoácido es compartido por los epítopos. Se dice que los epítopos están separados (únicos) en caso de que no haya restos de aminoácido compartidos por los epítopos.

Los epítopos también pueden definirse de manera indirecta, comparando la cinética de unión de los anticuerpos a TREM-1 humano de tipo silvestre con la de variantes de TREM-1 que tienen mutaciones de alanina en epítopos previstos. La afinidad reducida o la supresión de la unión de un anticuerpo a variantes de TREM-1 humano en las que se ha reemplazado un resto de aminoácido por un resto de alanina indica que el aminoácido mutado contribuye a la interacción entre dicho anticuerpo y TREM-1 humano de tipo silvestre. Esta estrategia proporciona una identificación negativa del epítopo. El método se ve comprometido para definir de manera eficaz el epítopo debido al hecho de que un mal plegado de una proteína o la ausencia de plegado podría proporcionar resultados similares, tales como supresión o interacción. El análisis puede complementarse mediante análisis mutacionales comparativos de ganancia de función de una proteína diana ortóloga (por ejemplo, TREM-1 de mono cynomolgus), en caso de que exista un anticuerpo con reactividad cruzada. La comparación definirá las diferencias de epítopo entre el anticuerpo que no reacciona con, por ejemplo, TREM-1 de mono cynomolgus y el anticuerpo con reactividad cruzada.

La identificación indirecta del epítopo también puede proporcionarse midiendo la unión del anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) a variantes del antígeno de tipo silvestre (TREM-1). En caso de que un anticuerpo o fragmento del mismo se una, por ejemplo, a TREM-1 humano pero no de mono cynomolgus y dicho anticuerpo o fragmento del mismo sea capaz de unirse a una variante parcialmente humanizada de TREM-1 de mono cynomolgus, esta unión recuperada indica que el o los restos de aminoácido sustituidos es/son importantes para la interacción del anticuerpo con el antígeno. De la misma manera, la afinidad aumentada por las variantes humanizadas de TREM-1 de mono cynomolgus, de un anticuerpo anti-TREM-1 humano (o su fragmento Fab) que tiene una unión más débil a TREM-1 de mono cynomolgus en comparación con TREM-1 humano, puede proporcionar información acerca de la identidad de los restos que componen el epítopo de unión.

El efecto de las mismas mutaciones en cualquier anticuerpo con reactividad cruzada dado hace posible distinguir entre un posible mal plegamiento de la proteína (unión suprimida a ambos anticuerpos) y pérdida de interacción en TREM-1 humano (unión a uno de los anticuerpos o unión suprimida al otro anticuerpo), mientras que se proporciona información inequívoca acerca de las diferencias en el epítopo entre el anticuerpo que no reacciona de manera cruzada y el anticuerpo que reacciona de manera cruzada a nivel de aminoácidos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser capaces de unirse a variantes de TREM-1 humano. Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de unirse a K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13), como se determina usando, por ejemplo, resonancia del plasmón superficial.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser capaces de unirse a variantes de TREM-1 de mono cynomolgus. Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de unirse a A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14), según se determina usando, por ejemplo, resonancia del plasmón superficial. Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de unirse a A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 15), según se determina usando, por ejemplo, resonancia del plasmón superficial.

Un anticuerpo de la divulgación puede ser capaz de unirse específicamente a TREM-1, en donde dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente a (i) al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en A21, T22, K23, L24, T25, E26 y a (ii) al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en A49, S50, S51, Q52, K53, A54, W55, Q56, I57, I58, R59, D60, G61, E62, M63, P64, K65, T66, L67, A68, C69, T70, E71, R72, P73, S74, K75, N76, S77, H78, P79, V80, Q81, V82, G83, R84, I85 y a (iii) al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en el C113, V114, 1115, Y116, Q117, P118 y P119 de TREM-1 humano.

Un anticuerpo de la invención puede ser capaz de unirse específicamente a un polipéptido que comprende los aminoácidos D38 a F48 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), según se determina usando, por ejemplo, HX-MS.

Un anticuerpo de la invención puede tener un epítopo que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o todos los restos de aminoácido D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44 y L45 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) y uno, dos o todos los restos de aminoácido seleccionados entre el grupo que consiste en E46, K47 y F48 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), según se determina usando, por ejemplo, HX-MS.

Un anticuerpo de la divulgación puede tener un epítopo que comprende uno, dos, tres o todos los restos de aminoácido seleccionados entre el grupo que consiste en D42, E46, D92 y H93 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), según se determina usando variantes de TREM-1 y resonancia de plasmón superficial.

Un anticuerpo de la divulgación puede tener un epítopo que comprende al menos los restos de aminoácido E46 y/o D92 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), según se determina usando variantes de TREM-1 y resonancia de plasmón superficial.

Un anticuerpo de la divulgación puede comprender además uno, dos o todos los restos de aminoácido seleccionados entre el grupo que consiste en L31, I86 y V101 de la SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano).

Un anticuerpo de la divulgación puede ser capaz de unirse específicamente a un polipéptido que comprende los restos de aminoácido E19 a L26 de TREM-1 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 12) o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 21, según se determina usando, por ejemplo, HX-MS.

Un anticuerpo de la divulgación puede ser capaz de unirse específicamente a TREM-1 humano, en donde el epítopo de dicho anticuerpo comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o todos los restos de aminoácido seleccionados entre el grupo que consiste en V39, K40, C41, D42, Y43, L45, E46, K47, F48 y A49 de la SEQ ID NO: 1.

Un anticuerpo de la divulgación puede ser capaz de unirse específicamente a TREM-1 humano, en donde el epítopo de dicho anticuerpo comprende D42 de la s Eq ID NO: 1. Un anticuerpo de la invención puede ser capaz de unirse específicamente a TREM-1 humano, en donde el epítopo de dicho anticuerpo comprende E46 de la SEQ ID NO: 1. El epítopo de dicho anticuerpo puede comprender v 39, C41, D42, Y43, L45 de la SEQ ID NO: 1. El epítopo de dicho anticuerpo puede comprender E46, K47 y A49 de la SEQ ID NO: 1. El epítopo de dicho anticuerpo puede comprender además F48 de la SEQ ID NO: 1.

La definición del término "parátopo" procede de la definición anterior de "epítopo", desde una perspectiva opuesta. Por lo tanto, el término "parátopo" se refiere al área o región en el Ab a la que se une específicamente un Ag, es decir, con la que hace un contacto físico con el Ag.

En el contexto de una estructura cristalina obtenida por rayos X, definida por las coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, tal como un fragmento Fab y su Ag, el término parátopo se define especialmente en el presente documento, a menos que se especifique o contradiga de otro modo por el contexto, como restos del Ag caracterizados por que tienen un átomo pesado (es decir, un átomo distinto de hidrógeno) a una distancia de 4 A de un átomo pesado en TREM-1.

El epítopo y el parátopo para un par de anticuerpo (Ab)/antígeno (Ag) dado puede identificarse por métodos rutinarios. Por ejemplo, puede determinarse la ubicación general de un epítopo evaluando la capacidad de un anticuerpo para unirse a diferentes fragmentos o variantes de polipéptidos de TREM-1 variantes. Los aminoácidos específicos en TREM-1 que entran en contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que entran en contacto con TREM-1 (parátopo) también pueden determinarse usando métodos rutinarios. Por ejemplo, pueden combinarse el anticuerpo y la molécula diana y puede cristalizarse el complejo de Ab:Ag. Puede determinarse la estructura cristalina del complejo y usarse para identificar sitios de interacción específicos entre el anticuerpo y su diana.

Los anticuerpos que se unen al mismo antígeno pueden caracterizarse con respecto a su capacidad para unirse a su antígeno común de manera simultánea y pueden someterse a "unión competitiva frente a agolpamiento". En el presente contexto, el término "agolpamiento" se refiere a un método de agrupamiento de anticuerpos que se unen al mismo antígeno. El "agrupamiento" de anticuerpos puede basarse en la unión competitiva de dos anticuerpos a su antígeno común en ensayos basados en técnicas convencionales, tales como resonancia de plasmón superficial (SPR), ELISA o citometría de flujo.

Un "grupo" de anticuerpo se define usando un anticuerpo de referencia. En caso de que un segundo anticuerpo sea incapaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece al mismo "grupo" que el anticuerpo de referencia. En este caso, el anticuerpo de referencia y el segundo se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan "anticuerpos competitivos". En caso de que un segundo anticuerpo sea capaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece a un "grupo" diferente. En este caso, el anticuerpo de referencia y el segundo anticuerpo no se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan "anticuerpos no competitivos".

El "agrupamiento" de anticuerpos no proporciona información directa acerca del epítopo. Los anticuerpos competitivos, es decir, anticuerpos que pertenecen al mismo "grupo", pueden tener epítopos idénticos, epítopos solapantes o incluso epítopos separados. Este último es el caso en caso de que el anticuerpo de referencia unido a su epítopo en el antígeno tome el espacio necesario para que el segundo anticuerpo ponga en contacto su epítopo en el antígeno ("impedimento estérico"). Los anticuerpos no competitivos generalmente tienen epítopos separados.

Un anticuerpo de la invención puede competir con el mAb 0170 por la unión a TREM-1 humano. Un anticuerpo de la invención puede competir con el mAb 0170 por la unión a TREM-1 de mono cynomolgus. En otras palabras, un anticuerpo de la invención puede pertenecer al mismo "grupo" que mAb 0170.

La expresión "afinidad de unión" se refiere en el presente documento a una medida de la fuerza de una interacción no covalente entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno. La expresión "afinidad de unión" se usa para describir interacciones monovalentes (actividad intrínseca).

La afinidad de unión entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno, a través de una interacción monovalente puede cuantificarse mediante la determinación de la constante de disociación en equilibrio (K^d). A su vez, la K^d puede determinarse mediante la medición de la cinética de la formación y disociación del complejo, por ejemplo, mediante el método SPR. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y disociación de un complejo monovalente se denominan constante de velocidad de asociación ka (o kon) y constante de velocidad de disociación kd (o koff), respectivamente. K^d se relaciona con ka y kd mediante la ecuación K^d = kd / ka.

Siguiendo la definición anterior, pueden compararse las afinidades de unión con diferentes interacciones moleculares, tal como una comparación de la afinidad de unión de diferentes anticuerpos por un antígeno dado, mediante la comparación de los valores de K^d para los complejos de anticuerpo/antígeno individuales.

Un anticuerpo de la invención puede unirse a TREM-1 humano con una afinidad (KD) que es de 1 x 10'7M o menor, 1 x 10'8M o menor o 1 x 10'9M o menor o 1 x 10'1°M o menor, 1 x 10'11M o menor, 1 x 10'12M o menor o 1 x 10'13M o menor, como se determina usando resonancia de plasmón superficial. Un anticuerpo de la invención puede unirse a TREM-1 de mono cynomolgus con una afinidad (KD) que es de 1 x 10'7M o menor, 1 x 10'8M o menor o 1 x 10'9M o menor o 1 x 10'10M o menor, 1 x 10'11M o menor, 1 x 10'12M o menor o 1 x 10'13M o menor, como se determina usando resonancia de plasmón superficial.

La expresión "especificidad de unión" se refiere en el presente documento a la interacción de una molécula, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, con un solo antígeno exclusivo o con un número limitado de antígenos (o epítopos) altamente homólogos. Por el contrario, los anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a TREM-1 no son capaces de unirse a moléculas disímiles. Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden no ser capaces de unirse a Nkp44.

La especificidad de una interacción y el valor de una constante de unión en equilibrio pueden determinarse directamente mediante métodos bien conocidos. Se conocen ensayos convencionales para evaluar la capacidad de los ligandos (tal como anticuerpos) para unirse a sus dianas e incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias de Western, RIA y análisis de citometría de flujo. La cinética de unión y la afinidad de unión del anticuerpo también puede evaluarse por ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como SPR.

Puede realizarse un ensayo de unión competitivo en el que la unión del anticuerpo a la diana se compara con la unión de la diana por otro ligando de esa diana, tal como otro anticuerpo.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas, tales como los anticuerpos de TREM-1, polinucleótidos, vectores y células descritos en el presente documento. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos de TREM-1 de la invención, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Por consiguiente, un objetivo de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende dicho anticuerpo de TREM-1 que está presente en una concentración de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, tal como una concentración de 10 a 200 mg/ml y en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0, tal como un pH de 4,0 a 8,0. La formulación puede comprender además uno o más de un sistema tampón, un conservante, un agente de tonicidad, un agente quelante, un estabilizador y/o un tensioactivo, así como diversas combinaciones de los mismos. El uso de conservantes, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizantes y tensioactivos en composiciones farmacéuticas se conoce bien por los expertos en la materia. Puede hacerse referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edición, 1995.

En una realización, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Dicha formulación es normalmente una solución o una suspensión, pero también puede incluir coloides, dispersiones, emulsiones y materiales multifase. La expresión "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos un 50 % p/p de agua. Igualmente, la expresión "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos un 50 % p/p de agua y la expresión "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos un 50 % p/p de agua.

En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añade disolventes y/o diluyentes antes de su uso.

En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de dicho anticuerpo y un tampón, en donde el anticuerpo está presente en una concentración de 1 mg/ml o mayor y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

Los anticuerpos de TREM-1 de la presente invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos pueden usarse para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como las siguientes: enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad de Crohn (EC), colitis ulcerosa (CU), síndrome del intestino irritable, artritis reumatoide (AR), psoriasis, artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis por lupus, diabetes de tipo I, enfermedad de Grave, esclerosis múltiple (EM), miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Kawasaki, arteriopatía coronaria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad pulmonar intersticial, tiroiditis autoinmunitaria, esclerodermia, esclerosis sistémica, artrosis, dermatitis atópica, vitíligo, enfermedad de injerto contra huésped, síndrome de Sjogren, nefritis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, alergia, asma y otras enfermedades autoinmunitarias que son el resultado de una inflamación aguda o crónica.

Los anticuerpos de TREM-1 de la invención pueden ser adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con enfermedad inflamatoria del intestino. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad que puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano, causando una amplia variedad de síntomas. La EII causa principalmente dolor abdominal, diarrea (que puede ser sanguinolenta), vómitos o pérdida de peso, pero también puede causar complicaciones fuera del tracto gastrointestinal, tales como erupciones cutáneas, artritis, inflamación del ojo, fatiga y falta de concentración. Los pacientes con EII se pueden dividir en dos clases principales, aquellos con colitis ulcerosa (CU) y aquellos con enfermedad de Crohn (EC). La EC normalmente implica el íleon y el colon, puede afectar a cualquier región del intestino, pero normalmente es discontinua (focos de enfermedad diseminados por todo el intestino). La CU siempre implica el recto (colónica) y es más continua. En la EC, la inflamación es transmural, resultando en abscesos, fístulas y estenosis, mientras que en la CU, la inflamación normalmente está confinada a la mucosa. No hay cura farmacéutica o quirúrgica conocida para la enfermedad de Crohn, mientras que algunos pacientes con CU pueden curarse mediante la extirpación quirúrgica del colon. Las opciones de tratamiento se restringen al control de los síntomas, manteniendo la remisión y previniendo la recidiva. La eficacia en la enfermedad inflamatoria del intestino en la clínica puede medirse como una reducción en la puntuación del índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI) para la EC, que es una escala de puntuación basada en pruebas de laboratorio y un cuestionario de calidad de vida. En modelos en animales, la eficacia se mide principalmente por el aumento de peso y también por un índice de actividad de la enfermedad (DAI), que es una combinación de consistencia de heces, peso y sangre en las heces.

Los anticuerpos de TREM-1 de la invención pueden ser adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con artritis reumatoide. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica que afecta a la práctica totalidad si no a todo el organismo y es una de las formas de artritis más común. Se caracteriza por la inflamación de las articulaciones, lo que causa dolor, rigidez, calor, enrojecimiento e hinchazón. Esta inflamación es la consecuencia de la invasión de las articulaciones por parte de células inflamatorias y estas células inflamatorias liberan enzimas que pueden digerir el hueso y el cartílago. Como resultado, esta inflamación puede desembocar en un grave daño en el hueso y el cartílago y en deterioro de la articulación y dolor severo, entre otros efectos fisiológicos. La articulación implicada puede perder su forma y alineamiento, dando como resultado dolor y pérdida de movimiento.

Se conocen en la técnica varios modelos animales para artritis reumatoide. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), los ratones desarrollan una artritis inflamatoria que se asemeja a la artritis reumatoide humana. Dado que la CIA comparte características inmunológicas y patológicas similares con la AR, esto lo convierte en un modelo adecuado para explorar potenciales compuestos antiinflamatorios en humanos. La eficacia en este modelo se mide por una reducción en la inflamación de la articulación. La eficacia en la AR en la clínica se mide por la capacidad para reducir los síntomas en pacientes, que se mide como una combinación de inflamación articular, tasa de sedimentación de eritrocitos, niveles de proteína C-reactiva y niveles de factores séricos, tales como anticuerpos anti-proteína citrulinada.

Los anticuerpos de TREM-1 de la invención pueden ser adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con psoriasis. La psoriasis es un trastorno inflamatorio mediado por linfocitos T de la piel que puede provocar un malestar considerable. Es una enfermedad para la que no existe una cura en la actualidad y afecta a personas de todas las edades. Aunque los individuos con psoriasis leve pueden normalmente controlar su enfermedad con agentes tópicos, más de un millón de pacientes en todo el mundo requieren tratamientos con luz ultravioleta o terapia inmunosupresora sistémica. Desafortunadamente, los inconvenientes y riesgos de la radiación ultravioleta y la toxicidad de muchas terapias limitan su uso a largo plazo. Además, los pacientes generalmente tienen recurrencia de la psoriasis y en algunos casos tienen una recidiva poco después de suspender la terapia inmunosupresora. Un modelo de psoriasis recientemente desarrollado basado en la transferencia de linfocitos T CD4+ imita muchos aspectos de la psoriasis y por lo tanto, puede usarse para identificar compuestos adecuados para su uso en el tratamiento de la psoriasis (Davenport et al., Internat. Immunopharmacol 2:653-672, 2002). La eficacia en este modelo se mide por la reducción en la patología de la piel usando una escala de puntuación. De manera similar, la eficacia en pacientes se mide por una reducción en la patología de la piel.

Los anticuerpos de TREM-1 de la invención pueden ser adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con artritis psoriásica. La artritis psoriásica (AP) es un tipo de artritis inflamatoria que ocurre en un subconjunto de pacientes con psoriasis. En estos pacientes, la patología/síntomas en la piel van acompañados por una inflamación articular similar a la observada en la artritis reumatoide. Presenta áreas elevadas, enrojecidas y desiguales de inflamación de piel con descamación. La psoriasis normalmente afecta a las puntas de los codos y las rodillas, el cuero cabelludo, el ombligo y alrededor de las áreas genitales o el ano. Aproximadamente un 10 % de los pacientes que tienen psoriasis también desarrollan una inflamación asociada de sus articulaciones.

El término "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la terapia médica de cualquier sujeto humano u otro sujeto animal que lo necesite. Es de esperar que dicho sujeto se haya sometido a un examen físico por un médico o veterinario, que ha recibido un diagnóstico provisional o definitivo que indicaría que el uso de dicho tratamiento es beneficioso para la salud de dicho sujeto humano u otro sujeto animal. La programación de tiempos y el objetivo de dicho tratamiento puede variar de un individuo a otro, de acuerdo con muchos factores, tal como el estado de salud del sujeto en ese momento. Por lo tanto, dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo.

En términos de la presente invención, los tratamientos profilácticos, paliativos, sintomáticos y/o curativos pueden representar aspectos separados de la invención.

Un anticuerpo de la invención se puede administrar por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, tal como por vía intramuscular, tal como por vía subcutánea. Como alternativa, un anticuerpo de la invención se puede administrar por una vía no parenteral, tal como por vía peroral o tópica. Un anticuerpo de la invención se puede administrar profilácticamente. Un anticuerpo de la invención puede administrarse terapéuticamente (a petición).

La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que no han de interpretarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de una línea celular BWZ.36 TREM-1 humano:DAP12 estable

La línea celular BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ (también citada en el presente documento como "célula indicadora BWZ/hTREM-1") se obtuvo de linfocitos T BW5147 (línea celular de linfoma de timo de Mus musculus, ATCC TIB-47, LGC Standards, Middlesex, R. U.) y contiene una construcción indicadora de LacZ regulada por cuatro copias del elemento promotor NFAT (véase Karttunen, J. y Shastri, N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3972 3976 y Fiering, S., Northrop, J. P., Nolan, G. P., Matilla, P., Crabtree, G. R. y Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4, 1823-1834). El vector TREM/DAP12/pMX-IRES (que codifica 786 pb de Tr Em -1 a partir de un sitio de Smal a un sitio de BamHI usando ADNc de TREM-1 (Gene Bank ID. de Ref: NM_018643.2, Sino Biological Inc., Pekín, China) como molde y el oligo 5' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SEQ ID NO: 16) y 5' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC (SEQ ID NO: 17) como cebadores clonados en el vector pIREShyg, n.° de registro de GenBank U89672 (n.° de cat. 6061-1, Clontech Laboratories, CA, EE. UU.) se transfectó en la línea celular empaquetadora PLAT-E (proporcionada por W. Yokoyama, Universidad de Washington; como alternativa, n.° de cat. RV-101, Cell Biolabs Inc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finlandia) usando el reactivo de transfección Superfect (n.° de cat. 301305, Qiagen Nordic, Dinamarca). Se usaron sobrenadantes de PLAT-E que contenían partículas víricas de TREM/DAP12/pMX-IRES para infectar a las células BWZ.36 del siguiente modo: se cultivaron 2x105 células BWZ.36 en placas de 6 pocillos y el medio se reemplazó con 1,5 ml de sobrenadante que contenía las partículas víricas 8 mg/ml de polibreno. Después de 6-8 horas, se añadieron 1,5 ml de medio normal a la placa y las células se incubaron durante 24 horas adicionales. Las líneas celulares BWZ.36 que expresan TREM-1 de manera estable se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti TREM-1 (clon 21C7) y se aislaron por clasificación celular.

Ejemplo 2: Cultivo de una línea celular BWZ.36 TREM-1 humano:DAP12 estable

Las células indicadoras BWZ/hTREM-1 se cultivaron en RPM11640 sin rojo de fenol (n.° de cat. 11835, Gibco, Carlsbad CA, EE. UU.), complementado con FCS al 10% (n.° de cat. 16140-071, Gibco, Nueva York, EE. UU.), 1 % de Pen/Strep (n.° de cat. 15070-06, Gibco), Piruvato de sodio 1 mM (n.° de cat. 11360, Gibco), -2ME 5 pM (n.° de cat. 31350-010, Gibco) y L-Glutamina 2 mM (n.° de cat. 25030, Gibco). No se requirieron placas o recubrimientos especiales. Se añadieron 10 ml de Versene (n.° de cat. 15040, Gibco) para separar las células que luego se transfirieron a tubos, se centrifugaron a 1200 rpm 5 min y se lavaron en RPMI 1640 sin rojo de fenol. Después, estas células estaban listas para su uso en un ensayo o recultivo para su propagación adicional.

Ejemplo 3: Inmunización de ratones e identificación de mAb

Para generar anticuerpos que se unen a TREM-1 humano, se inmunizó tanto a ratones Balb/C de tipo silvestre como a ratones con supresión génica (KO) de TREM-1 (origen de C57BL/6) con TREM-1 humano (h) (SEQ ID NO: 1), células que expresan hTREM-1 (células BWZ.36) o una combinación de ambos. La exploración primaria se realizó mediante ELISA directo en proteína hTREM-1 o mediante FMAT, usando células BWZ.36 que expresan hTREM-1. La exploración secundaria se realizó mediante citometría de flujo en células HEK293 que expresan hTREM-1. Después, se exploraron los sobrenadantes de hibridoma positivos en el ensayo indicador de BWZ/hTREM-1 descrito en el ejemplo 4.

El mayor número de anticuerpos de bloqueo se obtuvo de ratones KO inmunizados con proteína hTREM-1 seis veces a intervalos de dos semanas, seguido de una inyección de refuerzo. En total, se aislaron más de 200 anticuerpos para hTREM-1, de los cuales aproximadamente 70 posteriormente se descubrió que tenían un efecto de bloqueo.

Todos los sobrenadantes de hibridoma específicos de TREM-1 se analizaron en el ensayo indicador de BWZ/hTREM-1 primero como sobrenadantes y luego como anticuerpos purificados, en titulación completa a partir de 5000 ng/ml hasta 7 ng/ml, como anticuerpos tanto solubles como unidos a placas. Se usó sangre de una serie de donantes diferentes como fuente de neutrófilos frescos. Como ejemplo, la figura 4 muestra anticuerpos de una fusión, donde la actividad en el ensayo indicador como actividad bloqueante se encuentra en el eje x y la actividad agonista cuando el anticuerpo está unido a la placa se encuentra en el eje y.

Ejemplo 4: Identificación de PGLYRP1 como un ligando TREM-1 expresado en neutrófilos

Se identificó PGLYRP1 como un ligando de TREM-1 mediante el uso de inmunoprecipitación acopada con espectrometría de masas (IP-EM). El tetrámero de TREM-1 soluble se usó como molécula "señuelo" de afinidad para identificar un ligando. En resumen, se incubaron tetrámero de TREM-1-Fc (SEQ ID NO: 2) y por separado, CD83-Fc (SEQ ID NO: 5) cada uno a concentraciones finales de 100 pg/ml con 270 millones de neutrófilos humanos, purificados mediante sedimentación de dextrano como se ha descrito anteriormente, en 1 ml de PBS a 4 °C, 90 minutos con agitación suave. Después de sedimentar estas células, las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de PBS con la inclusión del reticulante 3,3'-ditiobis[sulfosuccinimidilpropionato] (DTSSP) (Thermo Scientific: 21578, Rockford, IL, EE. UU.), a una concentración de 2 mM y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3X con 1 ml de PBS seguido de lisis en 1 ml de tampón RIPA (Thermo Scientific, 89901, Rockford, IL, EE. UU.). El lisado se centrifugó a 15.000 X g durante 10 minutos a 4 °C para retirar los materiales solubles. Las proteínas de neutrófilos reticuladas con sondas acopladas a Fc se inmunoprecipitaron a partir del sobrenadante usando perlas de Proteína A Mag Sepharose™ (GE Healthcare Life Sciences, 28-9670-56, Piscataway, NJ, EE. UU.). En resumen, en primer lugar se lavaron 50 pl de perlas con 200 pl de PBS, después se resuspendieron en 1 ml de lisado celular, se incubaron 60 minutos a 4 °C, se capturaron magnéticamente y se lavaron secuencialmente 2X con 200 pl de tampón RIPA y después 3X con 200 pl de PBS. Tras eliminar el PBS de la captura magnética final, se eluyeron las proteínas de las perlas magnéticas usando 200 pl de tampón que contenía urea 8 M, Tris 100 mM (pH 8,0) y TCEP 15 mM (Thermo Scientific, 77720, Rockford, IL, EE. UU.) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, se capturaron las perlas y el sobrenadante se transfirió a un filtro Microcon Ultracel YM-30 (Millipore, 42410, Billerica, MA, EE. UU.).

Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g, 20 °C, 30-60 minutos hasta que no quedaba líquido sobre la membrana de filtro. Las proteínas retenidas se alquilaron posteriormente con 100 |jl de IAA (yodoacetamida) 50 mM en urea 8 M durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. El filtro se lavó 2X con 100 j l de NH⁴HCO³ 50 mM y después se transfirió a un nuevo tubo de recogida. Se añadió 1 jg de tripsina (Promega, V5111, Madison, WI) en 60 j l de NH⁴HCO³ 50 mM seguido de incubación durante una noche a 37 °C. La digestión tríptica se recogió por centrifugación a 14.000 xg durante 30 minutos, seguido de lavado del filtro con 50 j l de NH⁴HCO³ 50 mM. Se analizaron 10 j l de la digestión mediante CL/EM/EM usando un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap-XL (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se buscaron los datos contra la base de datos humana IPI (v3.81) usando el motor SEQUEST-Sorcerer (compilación 4.0.4) (SageN, Milpitas, CA, EE. UU.) y después se postprocesaron con Scaffold 3 (Proteome Software, Portland, OR, EE. UU.) para filtrar las ID de proteínas con una tasa de falso descubrimiento del 1 %. Después de restar el control negativo, se observó que PGLYRP1 es una proteína altamente fiable especialmente asociada con el tetrámetro de hTREM-1. La inmunoprecipitación en los neutrófilos mostró que de las 148 proteínas identificadas, 72 proteínas se inmunoprecipitaron por la construcción de control (CD83) sola, 73 de las proteínas eran idénticas para t Re M-1 y CD83, mientras que solo tres eran específicas para TREM-1 (Fig. 3). El experimento se repitió posteriormente usando neutrófilos de un donante distinto y nuevamente, se identificó que PGLYRP1 interactuaba específicamente con hTREM-1.

Ejemplo 5: Replegamiento y purificación de PGLYRP1 humana expresada por E. coli

Se expresó PGLYRP1 humano como cuerpos de inclusión en células de Escherichia coli BL21 (DE3). Las bacterias se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 0,5 % y se rompieron por ultrasonidos. El sedimento insoluble se lavó tres veces con Tris 50 mM, pH 8,0, Triton X-100 al 1 %, urea 2 M y una vez con Tris 50 mM, pH 8,0, después se solubilizó en Tris-HCl 50 mM, clorhidrato de guanidina 6 M, pH 7,4, DTT 1 mM (concentración final de proteína de 20 mg/ml). Para el plegamiento in vitro, se diluyeron los cuerpos de inclusión de PGLYRP1 humana solubilizados en Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, cisteamina 5 mM, cistamina 0,5 mM, arginina 0,4 M (concentración final de proteína de 1 mg/ml). Después de una noche a 4 °C, la mezcla de plegamiento se aclaró por centrifugación/filtración y después se diluyó 12 veces en MES 10 mM, pH 3,5 para reducir la conductividad y el pH (pH final ~5,8, conductividad ~6mS/cm). La mezcla de plegado diluida se aplicó posteriormente a una columna Hitrap SP HP de 5 ml (17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Suecia), seguido de un lavado de 5 volúmenes de columna con MES 50 mM a pH 5,8. Después, se eluyó PGLYRP1 humano unido con un gradiente lineal del 0-60% de MES 50 mM, pH 5,8, NaCl 1 M en 20 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían PGLYRP1 humana replegada se agruparon y concentraron a menos de 4 ml mediante 15 unidades de centrifugación Amicon Ultra ((UFC800324 MWCO de 3.000 kDa, Millipore, Hellerup, Dinamarca). Después, se usó una columna Hiload 26/60 Superdex 75 de 318 ml ((17-1070-01 GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para refinar e intercambiar el tampón de las proteínas a suero salino tamponado con fosfato (PBS). La mayoría de las proteínas PGLYRP1 humanas replegadas se encontraban en forma de monómero. Después de la concentración, se determinó la concentración final de proteína midiendo la absorbancia a 280 nm con un espectrómetro NANODROP UV. La pureza de la proteína se evaluó mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Ejemplo 6: Creación de un ensayo indicador sensible a TREM-1

La línea celular indicadora de TREM-1 se generó transfectando la línea celular BWZ.36 con una construcción indicadora de NFAT-LacZ, así como hTREM-1 y DAP12 (como se describe en el ejemplo 1). Los neutrófilos de donantes sanos se purificaron mediante sedimentación con dextrano. La sangre se estratificó sobre un gradiente de FicollPaque (17-0840-03, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) con una proporción de 3 partes de Ficoll y 4 partes de sangre en un tubo de 50 ml, después se centrifugó a 400xg durante 30 minutos a 22 °C, sin freno. La banda intermedia de PBMC se retiró cuidadosamente mediante aspiración. Los neutrófilos estratificados sobre los RBC empaquetados se aspiraron y transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml. Los neutrófilos y RBC contaminantes se diluyeron hasta 40 ml con PBS 1x y seguido de la adición de 10 ml de DEXTRAN 500 al 4 % (Sigma, 31392, St Louis, MO, EE. UU.) en solución con PBS. Después de mezclar por inversión suave, los tubos se dejaron a 22 °C durante 20-30 min. Después, se transfirió un sobrenadante rico en granulocitos a un tubo fresco y se centrifugó a 250 x g, 5 min, 22 °C; el sobrenadante se aspiró y se desechó. Los RBC contaminantes se retiraron con una lisis osmótica, en resumen, el sedimento celular se resuspendió en 7,5 ml de NaCl al 0,2 %; se mezcló suavemente durante 55-60 segundos y se añadieron 17,5 ml de una solución de NaCl al 1,2 %. Después, se enrasó el volumen a 50 ml con PBS y se centrifugó a 250 x g durante 5 min, el sedimento se resuspendió en 7,5 ml de NaCl al 0,2 % para repetir la lisis una segunda vez. El sedimento final de granulocitos se resuspendió en RPMI/FBS al 10%. Estos neutrófilos se estimularon con PGN (InVivogen, tlrl-pgnsa, San Diego, CA, e E. UU.) durante una noche para generar neutrófilos activados capaces de estimular a TREM-1. Después, se añadieron las células indicadoras BWZ/hTREM-1 a los cultivos de neutrófilos activados con PGN a una relación de células indicadoras:neutrófilos de 1:3. En lugar de neutrófilos activados, puede usarse un complejo de ligando de TREM-1 que consiste en PGLYRP1 (SEQ ID NO: 23) y PGN para estimular a TREM-1. El ensayo se ejecutó en placas de cultivo celular negras recubiertas con poli-D-lisina (n.° 356640 de BD Biosciences, San Jose, CA, Ee . UU.). La activación de TREM-1 se leyó después de 24 horas de cultivo usando el reactivo BetaGlo (E4720 de Promega, Madison, WI, EE. UU.) y la luminiscencia se midió usando un contador de luminiscencia TopCount de Perkin Elmer. Como control positivo, se pudo activar TREM-1 mediante un anticuerpo de TREM-1 unido a la placa (R&D MAB1278, Mineápolis, MN, EE. u U.) capaz de agonizar a TREM-1. Las placas se recubrieron con anticuerpo de control de isotipo o para TREM-1 MAB1278 (3 ug/ml en PBS, 100 ul/pocillo) en la nevera durante una noche o durante 2 horas a 37 °C, 5% de CO2 antes de que se añadieran las células indicadoras BWZ/hTREM-1. Después de 6-24 horas de incubación, se pudo leer la activación de TREM-1 utilizando el reactivo BetaGlo (E4720 de Promega, Madison, WI, EE. UU.) y la luminiscencia se midió usando un contador de luminiscencia TopCount de Perkin Elmer. Esta línea celular BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ (la "célula indicadora BWZ/hTREM-1") demostró ser altamente sensible a la reticulación de TREM-1 mediada por anticuerpos, dando una inducción de ~ 40 veces de la producción de LacZ impulsada por NFAT cuando se estimula con 1-10|jg/ml de anticuerpo anti-TREM-1 disponible comercialmente unido a la placa, en comparación con el control de isotipo (Figura 1). Cuando se estimula con un cóctel receptor tipo toll (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich, Dinamarca) solo (BWZ+TLR) no se observó aumento en la señal. Además, los neutrófilos no activados no pudieron estimular a TREM-1, mientras que el cóctel agonista de TLR (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich Dinamarca) y los neutrófilos activados podrían estimular la célula indicadora BWZ/hTREM-1.

La tabla 1 a continuación muestra que los anticuerpos de TREM-1 divulgados en el presente documento son capaces de bloquear la activación de TREM-1 inducida por ligando en dicho ensayo de célula indicadora BWZ/hTREM-1.

Tabla 1

Ninguno de los anticuerpos comerciales disponibles probados: MAB1278 (n.° de cat. MAB1278, R&D Systems, Mineápolis, MN 55413, EE. UU.), anti-TREM-1 HPA (n.° de cat. HPA005563, Sigma, St Louis, MO, EE. UU.), TREM26 (n.° de cat. 314902, Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.) y TREM37 (n.° de cat. 316102, Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.) fueron capaces de bloquear la señal de TREM-1.

Ejemplo 7: Mapeo de epítopos usando HX-MS

Materiales

Los lotes de proteína utilizados fueron:

hTREM-1: TREM-1 humano recombinante, no glucosilado, producido en E. coli. (n.° de cat. PRO-457, ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Rehovot, Israel).

Tabla 2: mAb usados

Se intercambió el tampón de todas las proteínas a PBS pH 7,4 antes de los experimentos.

Métodos: Experimentos de HX-MS

Instrumentación y registro de datos

Los experimentos de HX se automatizaron con un robot Leap (H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.) operado por el programa informático LeapShell (Leap Technologies Inc.), que realizó el inicio de la reacción de intercambio de deuterio, el control del tiempo de reacción, la reacción de enfriamiento, la inyección en el sistema UPLC y el control del tiempo de digestión. El robot Leap estaba equipado con dos pilas de temperatura controlada mantenidas a 20 °C para el almacenamiento del tampón y las reacciones HX y mantenidas a 2 °C para el almacenamiento de la proteína y la solución de enfriamiento, respectivamente. Además, el robot Leap contenía una unidad Trio VS enfriada (Leap Technologies Inc.) que sostenía las columnas pre y analíticas, así como la columna de pepsina, el tubo LC y las válvulas de conmutación a 1 °C. Las válvulas de conmutación de la unidad Trio VS se han actualizado de HPLC a válvulas de conmutación Microbore UHPLC (Cheminert, VICI AG). Para la digestión en línea de pepsina, se cargaron 100 pl de muestra inactivada que contenía 200 pmol de hTREM-1 y se pasaron sobre el cartucho de pepsina inmovilizada Poroszyme® (2,1 x 30 mm (Applied Biosystems)) usando un caudal isocrático de 200 pl/min (ácido fórmico al 0,1 %:CH³CN 95:5). Los péptidos resultantes fueron atrapados y desalados en una precolumna VanGuard BEH C18 1,7 pm (2,1 x 5 mm (Waters Inc.)). Posteriormente, se conmutaron las válvulas para colocar la precolumna en línea con la columna analítica, UPLC-BEH C18 1,7 pm (2,1 x 100 mm (Waters Inc.)) y los péptidos se separaron usando un gradiente de 9 min de 15-35 % de B suministrado a 200 pl/min a partir de un sistema AQUITY UPLC (Waters Inc.). Las fases móviles consistieron en A: 0,1% de ácido fórmico y B: 0,1% de ácido fórmico en CH³CN. Los datos de IEN EM y las adquisiciones de datos dependientes de EM/EM (CID) y los experimentos de alta energía (EM^E) se registraron en modo de ionización positiva usando un EM Q-TOF Premier (Waters Inc.). Se usó leucina-encefalina como masa de bloqueo (ion [M+H]⁺ en m/z 556,2771) y los datos se recopilaron en modo continuo (para una descripción más detallada de la configuración, véase Andersen y Faber, Int. J. Mass Spec., 302, 139-148(2011)).

Análisis de datos

Los péptidos pépticos se identificaron en experimentos separados usando métodos de CID EM/EM o EM^E convencionales (Waters Inc.). Los datos de EM^E se procesaron usando BiopharmaLynx 1.2 (versión 017). La adquisición de datos de CID dependiente de EM/EM se analizó usando el programa informático MassLynx y la base de datos propia MASCOT.

Los archivos de datos en bruto HX-MS se sometieron a una corrección de masa de bloqueo continuo. El análisis de datos, es decir, la determinación del centroide de los péptidos deuterados y la representación de las curvas de intercambio iónico, se llevó a cabo usando un prototipo de programa informático a medida (buscador HDX, Waters Inc.) y HX-Express ((versión beta); Weis et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006)). Asimismo, todos los datos se evaluaron visualmente para asegurar que solo se sometieron a análisis las envueltas isotópicas del péptido.

Experimento de mapeo de epítopos

El intercambio de hidrógeno/deuterio de amida (HX) se inició mediante una dilución de 6-8 veces de hTREM-1 en presencia o ausencia de mAb en el tampón deuterado correspondiente (es decir, PBS preparado en D²O, 96 % de D²O final, pH 7,4 (valor no corregido)). Todas las reacciones de HX se llevaron a cabo a 20 °C y contenían hTREM-1 4 pM en ausencia o presencia de mAb 4 pM proporcionando de este modo un exceso molar de 2 veces de sitios de unión de mAb. A intervalos de tiempo adecuados que variaban de 10 s a 10000 s, se inactivaron alícuotas de 50 pl de la reacción de HX mediante 50 pl de tampón de inactivación enfriado en hielo (TCEP 1,35M) dando como resultado un pH final de 2,5 (valor no corregido).

Resultados y análisis

Este experimento mapea los epítopos de los mAbs 0023, 0024, 0025, 0026 y los mAb comerciales MAB1278 (R&D Systems) y Clon26 (Biolegend) en hTREM-1. El transcurso de HX de 43 péptidos, que abarcan el 94 % de la secuencia primaria de hTREM-1, se monitorizaron en ausencia o presencia de los ocho mAb diferentes durante de 10 a 10000 s.

Se observó protección de intercambio en los puntos de tiempo tempranos, por ejemplo, <300 s, relacionada con los protones de amida expuestos en la superficie y por tanto también se relacionan con interfaces de proteína. Por el contrario, los efectos observados posteriormente en el transcurso de tiempo están relacionados con el lento intercambio de hidrógenos de amida y por lo tanto, están relacionados con el núcleo estructural de la proteína. Por lo tanto, los efectos epitópicos aparecen en puntos de tiempo cercanos, mientras que los efectos de la estabilización estructural se manifestarán como una reducción del intercambio en puntos de tiempo tardíos (Garcia, Pantazatos y Villareal, Assay and Drug Dev. Tech. 2, 81 (2004); Mandell, Falick y Komives, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 95, 14705 (1998)).

El patrón de intercambio observado en los puntos de tiempo tempranos en presencia o ausencia de un mAb dado pueden dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos presenta un patrón de intercambio que no se ve afectado por la unión del mAb. Por el contrario, otro grupo de péptidos en hTREM-1 muestra protección frente al intercambio tras la unión del mAb. Por ejemplo, a los 100 s, el intercambio con D2O, aproximadamente 2 amidas están protegidas frente al intercambio en la región Y111-F126 del mAb 0023. Las regiones que presentan dichos efectos de protección se asignan a la región del epítopo.

Mapeo de epítopos de los mAb 0023 y 0026

Los mAb 0023 y 0026 inducen alteraciones idénticas en el perfil de intercambio de hTREM-1 y se describirán aquí de manera conjunta. Las regiones que presentan protección tras la unión de 0023/0026 abarcan péptidos que cubren los restos T22-L96 e Y111-D127. Sin embargo, al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio en cada péptido tras la unión de mAb 0023/0026 y la ausencia de efectos de epítopo en los péptidos T25-F48, R84-Q112 y los péptidos que comienzan en P118, puede restringirse el epítopo a los restos A21-E26, A49-I85 y C113-P119. Aunque se encuentran distantes en secuencia, estas regiones se encuentran próximas en la estructura 3D de hTREM-1.

Mapeo de epítopo del mAb 0024 y el clon 26 de Biolegend

El mAb 0024 y el clon26 de Biolegend inducen alteraciones idénticas en el perfil de intercambio de hTREM-1 y se describirán aquí de manera conjunta. Las regiones que presentan protección tras la unión del mAb 0024 abarcan péptidos que cubren los restos V101-Q112. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio en cada péptido tras la unión de mAb 0024 y la ausencia de efectos de epítopo en los péptidos circundantes, puede restringirse el epítopo a los restos Q104-Q112 (Fig. 7B).

Mapeo de epítopo de NNC mAb 0025

Las regiones que presentan protección tras la unión de 0025 abarcan péptidos que cubren los restos D38-M63, T70-L96 y Y111-D127 (Fig. 7C). Sin embargo, al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio en cada péptido tras la unión de 0254-0025 y la ausencia de efectos de epítopo en los péptidos en las regiones circundantes, puede restringirse el epítopo a los restos V39-Q56, T70-I85 y C113-P119. Aunque se encuentran distantes en secuencia, estas regiones se encuentran próximas en la estructura 3D de hTREM-1 (Fig. 8).

Mapeo de epítopo de MAB1278

Las regiones que presentan protección tras la unión de MAB1278 abarcan péptidos que cubren los restos T70-L96 y V101-Q112 (Fig. 7D). Sin embargo, al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio en cada péptido tras la unión de MAB1278 y la ausencia de efectos de epítopo en los péptidos en las regiones circundantes, el epítopo puede restringirse a los restos T70-I85 y Q104-Q112. Aunque se encuentran distantes en secuencia, estas regiones se encuentran próximas en la estructura 3D de hTREM-1.

La posición estructural de los epítopos de los mAb 0023/0026 y el mAb 0025 se muestran en la figura 7A. El epítopo de los mAb 0023 y 0026 parece encontrarse principalmente en las p-láminas en la interfaz del dímero en el dímero de estructura cristalina de hTREM-1. El antagonismo de estos mAb podría ser un resultado de prevenir la dimerización de hTREM-1 y por tanto de su señalización.

Ejemplo 8: Determinación de la interfaz de interacción entre TREM-1 y mAb 0170

Se mapearon los epítopos en TREM-1 tanto humano recombinante como de mono cynomolgus (hTREM-1 y cTREM-1, respectivamente). La construcción de hTREM-1 usada en este ejemplo comprende los restos M1-H140 (SEQ ID NO: 18) y la construcción de cTREM-1 comprende los restos M1-R180 (SEQ ID NO: 12) con seis restos de histidina añadidos al extremo C-terminal y usando la numeración de aminoácidos de hTREM-1 de tipo silvestre. A lo largo de este ejemplo, los aminoácidos de cTREM-1 se numeran de acuerdo con el resto análogo en hTREM-1, como se ilustra en la fig. 11. La numeración usada en este ejemplo puede convertirse a la numeración en la SEQ ID NO: 12 restando 19 si el número de resto es 58 o menor y restando 20 si el número de resto es 60 o mayor. Como ejemplo, el número de resto E46 en cTREM-1 en este ejemplo corresponde al resto (46 - 19 = 27) E27 en la SEQ ID NO: 12. El número de resto en L96 en cTREM-1 en este ejemplo corresponde al resto (96 - 20 = 76) L76 en la SEQ ID NO: 12.

Las soluciones de TREM-1, solo o en presencia de mAb 0170, se diluyeron 25 veces en tampón HEPES deuterado al 97% (HEPES 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, a pH 7,4). Se prepararon controles no deuterados diluyendo en tampón HEPES protiado. Los experimentos de intercambio de hidrógeno se llevaron a cabo en un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC) HDX nanoAcquity (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.) que incluyó el automuestreador HD-x PAL (LEAP Technologies Inc., Carrboro, NC, EE. UU.) para la preparación automatizada de la muestra. Los tubos de CL, las columnas pre y analíticas y las válvulas de conmutación se ubicaron en una cámara enfriada a 0,3 °C. La columna de digestión de tripsina se almacenó a 15 °C. Las reacciones de intercambio de hidrógeno se llevaron a cabo a 20 °C. El análisis de masas se llevó a cabo en línea usando un espectrómetro de masas Waters SYNAPT G2 HDMS.

Se diluyó un volumen que contenía 100 pmol de TREM-1 humano o de cynomolgus (1,54-1,98 j l) con o sin 120 pmol de mAb 0170 en tampón HEPES deuterado a un volumen final de 50 pl. A los intervalos de tiempo adecuados, se transfirió el volumen completo y se inactivó en 50 pl de Tris(2-carboxietil)fosfina 1,35 mM ajustado a pH 2,4 y se mantuvo a 3 °C. Se inyectaron inmediatamente 99 pl de la solución inactivada y se pasó sobre una columna de pepsina inmovilizada Porozyme (2,1 mm x 30 mm) (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, Carlsbad, Ca , EE. UU.) y se atrapó en una columna Waters VanGuard BEH C18 1,7 pm (2,1 mm x 5 mm) a un caudal de 100 pl/min usando una fase móvil de metanol al 5 % (vol/vol) y ácido fórmico al 0,1 %. Los péptidos se separaron en una columna Waters UPLC BEH C18 1,7 pm (1,0 mm x 100 mm) usando un gradiente de acetonitrilo al 10 - 40 % que contenía ácido fórmico al 0,1 % a un caudal de 40 pl/min.

El espectrómetro de masas se empleó en modo de ionización positiva con separación de movilidad de iones habilitada. Las condiciones de electropulverización fueron capilar a 3,2 kV, cono de muestra a 25 V y compensaciones de cono de extracción de 4 V, caudal de nitrógeno gaseoso de desolvatación de 850 ml/min calentado a 350 °C y caudal de gas del cono de 50 ml/min. El bloque de fuente se calentó a 120 °C. Los datos de corrección de masa bloqueada se adquirieron usando el ion 1+ de leucina-encefalina (m/z 556,2771) como compuesto de referencia y se aplicó durante el análisis de datos. Para la identificación de péptidos, se llevaron a cabo experimentos de tipo EME usando compensaciones de colisión de trampa de 6 V (baja energía) y 50 V (energía elevada). Las muestras deuteradas se analizaron usando únicamente la compensación por colisión de trampa de baja energía de 6 V. Para más detalles, véase Andersen, M.D., Faber, J.H., Int. J. Mass Spectrom. (2011), 302, 139-148.

Los datos de EME se analizaron usando Waters ProteinLynx Global Server 2.5 y se identificaron péptidos de hTREM-1 identificados que abarcaban un 80 % de la secuencia de proteína (tabla 3) y péptidos de cTREM-1 que abarcaban un 100 % de la secuencia de proteína (tabla 4). Los archivos de datos de HX-MS se analizaron usando Waters DynamX 1.0, que aplica automáticamente corrección de masa bloqueada y determina el grado de incorporación de deuterio en cada péptido. Además, todos los datos se inspeccionaron manualmente para asegurar la asignación correcta de picos y el cálculo de la incorporación de deuterio.

Resultados

En la tabla 3 se proporciona una lista de los péptidos y sus patrones de intercambio.

Cuando mAb 0170 se unió a hTREM-1, se observó protección frente al intercambio en los péptidos que abarcaban la secuencia de A21 a L96 y por consiguiente, se determinó que el epítopo se encuentra en esta región. Cuando se tienen en cuenta péptidos que no muestran protección frente al intercambio tras la unión de mAb 0170, el epítopo pudo restringirse a las regiones D38-F48. La región de R84-L96 mostró un intercambio de escaso a nulo en presencia o ausencia de mAb 0170 y no fue posible determinar si esta región formaba parte del epítopo de unión del mAb 0170. El péptido K47-A68 no mostró protección frente al intercambio tras la unión de mAb 0170, pero el péptido T44-C69 se encontraba protegido cuando se unió el mAb 0170. Los dos primeros restos de un péptido vuelven a intercambiarse rápidamente y se pierde la información de intercambio para estos restos. Se llegó a la conclusión de que al menos uno de los restos E46, K47 y F48 era importante para la unión de mAb 0170.

T l R l l m í HXEM l mA 1 n TREM-1 h m n

continuación

Epítopo de mAb 0170 en cTREM-1

En la tabla 4 se proporciona una lista de los péptidos y sus patrones de intercambio.

Cuando mAb 0170 se unió a cTREM-1, se observó protección frente al intercambio en los péptidos que abarcaban la secuencia de E38 a A68 y por consiguiente, se determinó que el epítopo se encuentra en esta región. Cuando se tienen en cuenta péptidos que no muestran protección frente al intercambio tras la unión de mAb 0170, el epítopo pudo restringirse a las regiones E38-L45. Este epítopo tenía buena correspondencia con el epítopo de mAb 0170 en hTREM-1 pero estaba truncado por tres restos. El péptido C44-T69 en hTREM-1 estaba protegido frente a la unión del mAb 0170, pero los péptidos A44-L67 y A44-A68 que abarcan la secuencia correspondiente en cTREM-1 no estaban protegidos. Por lo tanto, aunque al menos uno de los restos E46, K47 y F48 en hTREM-1 contribuyeron al epítopo de unión, los restos correspondientes E46, K47 e Y48 no estaban implicados en la unión del mAb 0170 a cTREM-1.

T l 4 M í r HXEM l mA 1 n TREM-1 m n n m l

continuación

Ejemplo 9: Estudio de la cinética de interacción para anticuerpos anti-TREM-1 con TREM-1 humano y de cynom olgus mediante resonancia de plasmón superficial (SPR)

Se llevaron a cabo estudios de unión en un dispositivo ProteOn Analyzer (BioRad) que mide las interacciones moleculares en tiempo real mediante resonancia de plasmón superficial. Los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C y las muestras se almacenaron a 15 °C en el compartimento de muestras. La señal (UR, unidades de respuesta) informada por el dispositivo ProteOn está directamente correlacionada con la masa en las superficies de la microplaca sensora individual en seis celdas de flujo paralelas. Se inmovilizaron anticuerpo monoclonal anti-Fc humano o policlonal anti-Fc murino de kits de captura de Fc humano o de ratón de Biacore en dirección horizontal en las celdas de flujo de una microplaca sensora GLM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de inmovilización final de anticuerpo de captura fue de aproximadamente 2600-6000 UR en diferentes experimentos. La captura de los anticuerpos anti-hTREM-1 monoclonales de ratón o recombinantes purificados expresados se llevó a cabo diluyendo los anticuerpos a 5-10 nM en tampón de ejecución (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 5 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) y se inyectaron en dirección vertical a 30 pl/min durante 60 s, creando entre puntos de referencia adyacentes a todas las celdas de flujo con solo anticuerpo anti-Fc inmovilizado. Esto dio como resultado normalmente niveles finales de captura de anticuerpos de ensayo de aproximadamente 100-300 UR y valores de Rmáx de analito de 30-90 UR. La unión de las proteínas hTREM-1 o cTREM-1 se llevó a cabo inyectando el analito (antígeno) en todas las celdas de flujo en dirección horizontal para permitir los análisis comparativos de la unión a diferentes anticuerpos anti-TREM-1 capturados en relación con la unión al entre punto de referencia. Las proteínas hTREM-1 o cTREM-1 se diluyeron en serie a 1:3 hasta 1,2-100 nM o en tampón de ejecución, se inyectaron a 100 pl/min durante 250 s y se dejaron disociar durante 600s. La superficie de g Lm se regeneró después de cada ciclo de inyección de analito mediante dos inyecciones de 18 s de glicina 10 mM, pH 1,7 y NaOH 50 mM a 100 pl/min. Esta etapa de regeneración retiró el anticuerpo anti-TREM-1 y cualquier proteína TREM-1 unida de la superficie de anticuerpo de captura inmovilizado y permitió la unión posterior del siguiente par de muestra de interacción. El procedimiento de regeneración no retiró el anticuerpo de captura anti-Fc directamente inmovilizado de la superficie de la microplaca.

La afinidad de unión entre los anticuerpos y el antígeno se cuantificó mediante la determinación de la constante de disociación en el equilibrio (K^d) determinada midiendo la cinética de la formación de complejos y disociación. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y la disociación de un complejo monovalente, tal como ka (velocidad de asociación) y kd (velocidad de disociación) se recogieron ajustando los datos a un modelo 1:1 de Langmuir usando el programa de evaluación ProteOn para el análisis de datos. K^d se relaciona con ka y kd mediante la ecuación K^d = kd / ka. Las curvas de unión se procesaron mediante doble referenciación (resta de señales de superficie de referencia así como inyecciones de tampón de blanco sobre anticuerpos anti-TREM-1 capturados) antes del análisis de datos. Esto permitió la corrección del ruido instrumental, el cambio de volumen y la deriva durante las inyecciones de muestra.

Tabla 5: Resultados de las mediciones de las constantes de unión ka (velocidad de asociación), kd (velocidad de disociación) y KD (constante de disociación en el equilibrio) para la interacción de TREM-1 humano a diferentes anticuer os monoclonales anti-TREM-1.

continuación

Tabla 6: Resultados de las mediciones de las constantes de unión ka (velocidad de asociación), kd (velocidad de disociación) y KD (constante de disociación en el equilibrio) para la interacción de TREM-1 de cynomolgus a diferentes anticuer os monoclonales anti-TREM-1.

Ejemplo 10: Humanización del mAb 14F69 de bloqueo de TREM-1.

Se obtuvieron las regiones variables de dos anticuerpos principales de la clonación de los hibridomas 14F128A1 y 14F113A1B1C1. Se clonaron ambos anticuerpos usando la técnica SMARTER-RACE (Clontech). El esfuerzo de humanización se llevó a cabo en forma de un bucle iterativo donde en primer lugar se evaluó la afinidad de los anticuerpos con CDR injertadas y después se volvieron a modificar para incluir más retromutaciones hasta que se conservó una afinidad aceptable, usando anticuerpos purificados de hibridoma como punto de referencia. Los anticuerpos con CDR injertadas se diseñaron in silico y se encargaron de un proveedor comercial (www.genscript.com). La posterior remodificación de los anticuerpos se llevó a cabo usando mutagénesis dirigida (Stratagene). Todos los anticuerpos se expresaron en células HEK293-6E en preparación para la prueba de afinidad. A continuación se proporciona una descripción de las principales consideraciones para la selección de la línea germinal humana adecuada y la prueba de retromutaciones. Toda la numeración de las regiones variables usada en este ejemplo se refiere al esquema de numeración de Kabat.

>m14F128A1_H (CDR marcadas en negrita y subrayadas) (SEQ ID NO 8)

>m14F128A1_L (CDR marcadas en negrita) (SEQ iD NO: 9)

>m14F113A1B1C1_H (CDR marcadas en negrita) (SEQ ID NO: 10)

>m14F113A1B1C1_L (CDR marcadas en negrita) (SEQ ID NO: 11)

A partir de un análisis de las secuencias, las CDR para m14F128A1 de acuerdo con la definición de Kabat son:

>CDR_H1

TYAMH

>CDR_H2

RIRTKS[N/S]NYATYY[V/A]DSVKD

>CDR_H3

DMG[I/A]RRQFAY

>CDR_L1

RASESVD [S/T] F [G/D] [I/Y] SF [M/L] H

>CDR_L2

RASNLES

>CDR_L3

QQSNEDPYT

Con las diferencias entre m14F128A1 y m14F113A1B1C1 proporcionadas como [m14F128A1/m14F113A1B1C1].

Se construyó un modelo en 3D de m14F128A1 usando técnicas convencionales en MOE [disponible de www.chemcomp.com] y todos los restos a 4,5 A de las regiones CDR efectivas (VH: 31-35B, 50-58, 95-102; VL: 24­ 34, 50-56, 89-97) se definieron como restos enmascarados. Los restos enmascarados son todos potencialmente importantes para sostener la unión en las CDR.

Los restos enmascarados incluyeron las posiciones 1-2, 4, 27-37, 47, 49-59, 69, 71, 73, 78, 92-103 para la cadena pesada y las posiciones 1-5, 7, 23-36, 46, 48-56, 58, 62, 67-71, 88-98 para la cadena ligera.

Usando búsquedas de línea germinal de m14F128A1 e inspección manual, se identificaron VH3_73 y JH4 como una combinación de línea germinal humana adecuada para la cadena pesada y se identificaron VKIV_B3 y JK2 como la combinación de línea germinal adecuada para la cadena ligera.

>VH3_13/JH4

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANSYATAYA

ASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTR/YFDYWGQGTLVTVSS

>VKIV_B3/JK2

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVP

DRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP/YTFGQGTKLEIKR

Después, se llevó a cabo la humanización con las siguientes reglas:

- Los restos fuera de la máscara se tomaron como humanos.

- Los restos dentro de la máscara y dentro de las CDR de Kabat se tomaron como murinos.

- Los restos dentro de la máscara y fuera de las CDR de Kabat con consenso de ratón/línea germinal se tomaron como la secuencia consenso.

- Los restos dentro de la máscara y fuera de las CDR de Kabat con diferencia de ratón/línea germinal estaban sujetos a potenciales retromutaciones.

El injerto de las regiones CDR efectivas de m14F128A1 en las líneas germinales formaron la construcción básica de humanización de m14F128A1, hz14F128A1.

>hz14F128A1_H

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMHWVRQASGKGLEWVGRIRTKSNNYATYYA

ASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDMGIRRQFAYWGQGTLVTVSS

>hz14F128A1 L

>CDR_H1

TYAMH

>CDR_H2

RIRTKSNNYATYYAASVKG

>CDR_H3

DMGIRRQFAY

>CDR_L1

RASESVDSFGISFMH

>CDR_L2

RASNLES

>CDR_L3

QQSNEDPYT

Las únicas diferencias en comparación con las CDR murinas se encontraban en CDR_H2 (mostradas en negrita). Cualquier discrepancia entre m14F128A1 y hz14F128A1 en un resto de la máscara creará una potencial retromutación y la lista incluye:

hz14F128A1_H: S30N, G49A, A78L, V93T

hz14F128A1_L: M4L, M58I, G68R

Además, la estrecha homología de m14F128A1 y m14F113A1B1C1 se usó para sugerir restos que podrían tener impacto en la afinidad de hz14F128A1.

hz14F128A1_H: N53S, I98Q

hz14F128A1_L: S27D_T, G29D, I30Y, M33L

A fin de investigar todos los mAb potencialmente humanizados, se produjeron todas las combinaciones de los mutantes anteriores y se ensayaron.

El anticuerpo anti-hTREM1 humanizado final (mAb 0170) procedente del hibridoma 14F113 contiene una retromutación de marco de LC (M4L) y una mutación de CDR3 de HC (Q98I). La mutación en CDR3 de HC se introdujo basándose en un estudio de afinidad-sinergia con un anticuerpo altamente homólogo denominado 14F128. El motivo para incluir ambas mutaciones se describe a continuación.

Estudio de afinidad-sinergia del anticuerpo 14F128 y 14F113

Los anticuerpos de hibridoma 14F128 y 14F113 son altamente homólogos y proceden del mismo evento de recombinación somático. Los dos anticuerpos compiten en la unión a hTREM1 con 14F113, que tiene la mayor afinidad. En total, las versiones con injerto de CDR de los dos anticuerpos difieren en sus composiciones de CDR por tan solo seis aminoácidos (cuatro en la CDR de LC y dos en la CDR de HC). Las seis mutaciones, cuando se compara 14F113 con 14F128, sin LC T27dS, D29G, Y30I, L33M y HC S54N, Q98I. Aunque 14F128 con injerto de CDR tenía una afinidad inferior a 14F113 con injerto de CDR, se investigó si se suprimía un efecto de afinidad beneficioso de una o más de las seis mutaciones por el efecto general cuando estaban presentes las seis mutaciones. Por lo tanto, las seis mutaciones (excepto HC S54N) se introdujeron individualmente en el anticuerpo 14F113 con CDR injertadas y los anticuerpos se clasificaron según su actividad. Dos mutaciones (LC L33M y HC Q98I) fueron capaces individualmente de mejorar la afinidad de 14F113 con CDR injertadas. Una mutación de la HC en la posición Q98I dio lugar a una afinidad particularmente buena en el anticuerpo resultante (mAb 0170).

Análisis de afinidad de retromutación de marco

La versión de ratón del anticuerpo 14F113 tenía siete mutaciones que eran potencialmente necesarias para incluirse como retromutaciones durante la humanización. Las potenciales retromutaciones en la HC y la LC eran S30N, G49A, A78L y T93V, M4L, V58I, G68R, respectivamente. Las siete retromutaciones se introdujeron individualmente en 14F113 con CDR injertadas y después se clasificaron por afinidad. Aunque varias de las mutaciones fueron capaces de mejorar la afinidad, solo la mutación de LC M4L se seleccionó para el mAb 0170. La decisión de incluir mutaciones se equilibró frente al título de expresión (HEK2936E), la afinidad y el número total de mutaciones.

Ejemplo 11: Estudio de la cinética de interacción para anticuerpos de TREM-1 por hTREM-1 mediante resonancia de plasmón superficial (SPR): comparación entre mAb 0170 y anticuerpos de TREM-1 disponibles comercialmente.

Se llevaron a cabo estudios de unión en un dispositivo ProteOn Analyzer (BioRad) que mide las interacciones moleculares en tiempo real mediante resonancia de plasmón superficial. Los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C y las muestras se almacenaron a 15 °C en el compartimento de muestras. La señal (UR, unidades de respuesta) informada por el dispositivo ProteOn está directamente correlacionada con la masa en las superficies de la microplaca sensora individual en seis celdas de flujo paralelas. Los anticuerpos disponibles comercialmente incluidos fueron Biolegend n.° 314907, Biolegend n.° 316102 (Biolegend, EE. UU.), Hycult Biotech HM2252 (Hycult Biotech, Países Bajos), R&D n.° MAB1278 (R&D Systems, Reino Unido), SC98Z12 (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.), Sigma n.° WH0054210m4, Sigma n.° SAB1405121 (Sigma-Aldrich Denmark A/S)

Se inmovilizaron anticuerpo monoclonal anti-Fc humano o policlonal anti-Fc murino de kits de captura de Fc humano o de ratón de Biacore en dirección horizontal en las celdas de flujo de una microplaca sensora GLM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de inmovilización final de anticuerpo de captura fue de aproximadamente 2600-6000 UR en diferentes experimentos. La captura de los anticuerpos anti-hTREM-1 monoclonales de ratón o recombinantes purificados humanizados expresados se llevó a cabo diluyendo los anticuerpos a 5-10 nM en tampón de ejecución (He PES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 5 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) y se inyectaron en dirección vertical a 30 pl/min durante 60 s, creando entre puntos de referencia adyacentes a todas las celdas de flujo con solo anticuerpo anti-Fc inmovilizado. Esto dio como resultado normalmente niveles finales de captura de anticuerpos de ensayo de aproximadamente 100-300 UR y valores de Rmáx de analito de 30-90 UR. La unión de las proteínas hTREM-1 o cTREM-1 se llevó a cabo inyectando el analito en todas las celdas de flujo en dirección horizontal para permitir los análisis comparativos de la unión a diferentes anticuerpos anti-TREM-1 capturados en relación con la unión al entre punto de referencia. Las proteínas hTREM-1 o cTREM-1 se diluyeron en serie a 1:3 hasta 1,2-100 nM o en tampón de ejecución, se inyectaron a 100 pl/min durante 210 s y se dejaron disociar durante 600s. La superficie de GLM se regeneró después de cada ciclo de inyección de analito mediante dos inyecciones de glicina 10 mM, pH 1,7 y NaOH 50 mM a 100 pl/min. Esta etapa de regeneración retiró el anticuerpo anti-TREM-1 y cualquier proteína TREM-1 unida de la superficie de anticuerpo de captura inmovilizado y permitió la unión posterior del siguiente par de muestra de interacción. El procedimiento de regeneración no retiró el anticuerpo de captura anti-Fc directamente inmovilizado de la superficie de la microplaca.

La afinidad de unión entre los anticuerpos y el antígeno se cuantificó mediante la determinación de la constante de disociación en el equilibrio (K^d) determinada midiendo la cinética de la formación de complejos y disociación. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y la disociación de un complejo monovalente, tal como ka (velocidad de asociación) y kd (velocidad de disociación) se recogieron ajustando los datos a un modelo 1:1 de Langmuir usando el programa de evaluación ProteOn 3.1.0.6 para el análisis de datos. K^d se relaciona con ka y kd mediante la ecuación K^d = kd / ka.

Las curvas de unión se procesaron mediante doble referenciación (resta de señales de superficie de referencia así como inyecciones de tampón de blanco sobre anticuerpos anti-TREM-1 capturados) antes del análisis de datos. Esto permitió la corrección del ruido instrumental, el cambio de volumen y la deriva durante las inyecciones de muestra.

Tabla 7: Resultados de las mediciones de KD (constante de disociación en el equilibrio) para la interacción de TREM-1 humano de c nomol us a diferentes anticuer os monoclonales anti-TREM-1.

Ejemplo 12: Estudios de unión competitiva de anticuerpos monoclonales anti-TREM-1 humano mediante resonancia de plasmón superficial.

Se llevaron a cabo estudios de competición de unión SPR con anticuerpos monoclonales de ratón o expresados de manera recombinante humanizados anti-hTREM-1 para distinguir entre los diferentes sitios de unión (epítopos). Los anticuerpos disponibles comercialmente incluidos fueron Biolegend n.° 314907 (Biolegend, EE. UU.) y SC98Z12 (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.). Los anticuerpos anti-hTREM-1 que compiten por el mismo sitio de unión o uno solapante (epítopo) en el antígeno no son capaces de unirse simultáneamente al antígeno y por lo tanto se asignan al mismo "grupo". Los anticuerpos monoclonales anti-TREM-1 que no compiten por el mismo sitio de unión o uno solapante en el antígeno son capaces de unirse simultáneamente y por lo tanto se asignan a "grupos" diferentes. Los experimentos se llevaron a cabo con dominio extracelular de TREM-1 humano soluble como antígeno.

Todos los estudios se llevaron a cabo a 25 °C y las muestras se almacenaron a 15 °C en el compartimento de muestras. Se inmovilizaron anticuerpos monoclonales anti-TREM-1 individuales y un anticuerpo monoclonal de control no relacionado sobre celdas de flujo separadas de una microplaca sensora g Lc usando una mezcla 1:1 de EDAC [clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida] 0,4 M y Sulfo-NHS [N-hidroxisulfosuccinimida] 0,1 M. Cada anticuerpo se diluyó en acetato de sodio 1o mM a pH 5,0 a una concentración de 25 o 10 (SC98Z12 (80394)) pg/ml y se inmovilizó en una celda de flujo individual a 30 pl/min durante 240 s. Los anticuerpos se inmovilizaron en las celdas de flujo L1-L6 (incluyendo el control). Tras la inmovilización del anticuerpo, se bloquearon los sitios activos en la celda de flujo con etanolamina 1 M. Las inmovilizaciones se llevaron a cabo con activación y desactivación en dirección horizontal creando puntos de referencia entre puntos sin proteína inmovilizada. El nivel de inmovilización final de los anticuerpos de ensayo varío de aproximadamente 1100 a 1300 UR en un experimento, excepto para un anticuerpo (SC98Z12), donde solo se inmovilizaron 390 UR. Se diluyó TREM-1 humano recombinante a 100 nM en tampón de ejecución (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 5 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, a pH 7,4). El antígeno se inyectó sobre anticuerpos inmovilizados en dirección horizontal a 30 pl/min durante 300 s, permitiendo el control de la potencial unión inespecífica tanto en las referencias entre puntos y los anticuerpos de control inmovilizados, dando como resultado 150-600 UR de TREM-1 capturado, excepto para un anticuerpo (SC98Z12) con bajo nivel de inmovilización, donde solo se capturaron 4 UR.

Cada anticuerpo (los mismos que se habían inmovilizado) se inyectó sobre celdas de flujo paralelas en una dirección horizontal para permitir el análisis comparativo de la unión a hTREM-1 capturado por los anticuerpos primarios en relación con la unión tanto a las referencias entre puntos y a los anticuerpos de control inmovilizados. Cada anticuerpo de competición se diluyó a 100 nM y se inyectó a 100 pl/min durante 250 s. La microplaca de GLC se regeneró después de cada ciclo de inyección de analito mediante dos inyecciones de 18 s de ácido fórmico 1M, pH 3,5, MgCl2 3m y NaOH 50 mM a 100 pl/min. Esta etapa de regeneración retiró el antígeno TREM-1 y cualquier anticuerpo secundario unido de la superficie de anticuerpo inmovilizado y permitió la unión posterior de la siguiente muestra de ensayo. El procedimiento de regeneración no retiró el anticuerpo de ensayo anti-TREM-1 directamente inmovilizado (anticuerpo primario) de la superficie de la microplaca. El análisis de datos se llevó a cabo con el programa informático ProteOn ManagerTM 3.1.0.6. Se evaluaron los niveles de captura para asegurar que la etapa de regeneración proporcionaba una superficie de unión consistente a lo largo de la secuencia de inyecciones. No se observó una unión no específica significativa de TREM-1 humano ni a las superficies de control entre puntos ni al anticuerpo de control inmovilizado. Las curvas de unión se procesaron restando las señales de la superficie de control entre puntos. Esto permitió la corrección del ruido instrumental y el cambio de volumen durante las inyecciones de muestra.

Los resultados de competición se comunicaron como unión positiva o negativa (tabla 8). La unión positiva (+) indica que el anticuerpo de competición era capaz de unirse a hTREM-1 de manera simultánea con el anticuerpo primario (es decir, no compiten) y por consiguiente, los anticuerpos primario y de competición se asignaron a diferentes grupos de epítopo. La unión negativa indica que el anticuerpo de competición era incapaz de unirse a hTREM-1 de manera simultánea con el anticuerpo primario (es decir, no compiten) y por lo tanto, los anticuerpos primarios y de competición se asignaron al mismo grupo de epítopo. Los valores de respuesta en estos experimentos fueron significativos y permitieron la determinación inequívoca de los grupos de epítopos de los anticuerpos monoclonales anti-TREM-1.

Tabla 8: Capacidad para unirse (+) o para competir (-) para anticuerpos evaluados en el ensayo de competición de SPR. SC98Z12 no proporcionó una captura suficientemente elevada de TREM-1 para evaluarlo como anticuerpo rimario *.

MAb 0170 y mAb 0048 (purificados del hibridoma 14F11, que es idéntico a 14F128) mostraron competición por la unión a TREM-1 humano. Biolegend n.° 314907 y SC98Z12 no compitió con ninguno de estos por la unión a TREM-1 humano pero compitieron entre sí. Estos hallazgos hacen llegar a la conclusión de que los dos primeros (mAb 0048 y mAb 0170) pertenecen al mismo grupo (grupo 1) mientras que Biolegend n.° 314907 y SC98Z12 pertenecen a otro grupo (grupo 2).

Ejemplo 13: Análisis cinético de la interacción entre la unión de Fab 0011 y Fab 0170 a versiones mutadas de TREM-1 de ser humano y de cynomolgus

Se llevaron a cabo estudios de interacción mediante SPR para definir diferencias en los epítopos para los anticuerpos anti-TREM-1 humano 0011 y 0170 en TREM-1 humano. Al comparar la cinética de unión a variantes de TREM-1 humano con mutaciones de alanina introducidas en epítopos conocidos, así como variantes parcialmente "humanizadas" de TREM-1 de cynomolgus, estas últimas debido a que solo mAb 0170 reacciona de manera cruzada con TREM-1 de cynomolgus, se identificaron restos de aminoácidos únicos para los respectivos epítopos.

Las construcciones de mutantes de alanina del dominio extracelular de hTREM-1 y las construcciones mutantes de cynomolgus parcialmente humanizadas usadas en este estudio se resumen en la tabla 9. Todas las construcciones usadas eran variantes de SEQ ID NO:19 (variantes de TREM-1 de cynomolgus) o SEQ ID NO: 20 (variantes de TREM-1 humano) e incluyeron un marcador C-terminal de cmyc2-His6 para la captura en el ensayo de cinética de unión de SPR. A menos que se indique lo contrario, las secuencias citadas en este ejemplo se numeran de acuerdo con la fig.

11.

Tabla 9

continuación

Se llevaron a cabo estudios de unión en un dispositivo ProteOn Analyzer que mide las interacciones moleculares en tiempo real mediante resonancia de plasmón superficial. Los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C y las muestras se almacenaron a 15 °C en el compartimento de muestras. La señal (UR, unidades de respuesta) informada por el dispositivo ProteOn está directamente correlacionada con la masa en las superficies de la microplaca sensora individual en seis celdas de flujo paralelas. El anticuerpo monoclonal anti-His se inmovilizó en 6 celdas de flujo paralelas de una microplaca sensora de GLM usando una mezcla 1:1 de EDAC [clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida] 0,4 M y Sulfo-NHS [N-hidroxisulfosuccinimida] 0,1 M. El anticuerpo se diluyó en acetato de sodio 10 mM a pH 5,0 a una concentración de 25 pg/ml y se inmovilizó sobre celdas de flujo individuales a 30 pl/min durante 240s. Tras la inmovilización del anticuerpo, se bloquearon los sitios activos en las celdas de flujo con etanolamina 1 M. La inmovilización se llevó a cabo con todas las etapas en dirección horizontal. El nivel de inmovilización final del anticuerpo de captura fue de aproximadamente 8000 UR en un experimento. El medio de cultivo celular de células HEK 293 que expresaban ECD de TREM-1 humano o de cynomolgus de tipo silvestre o diferentes variantes mutadas se diluyó 40-60 veces en tampón de ejecución (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, a pH 7,4). Las proteínas TREM-1 se inyectaron sobre anticuerpo de captura anti-His inmovilizado en la dirección vertical a 30 pl/min durante 60 s. Esto dio como resultado 50-250 UR de TREM-1 capturado y crearon referencias entre puntos con solo anticuerpos de captura inmovilizados pero sin TREM-1 capturado en la dirección horizontal. Cada Fab se inyectó sobre celdas de flujo paralelas en la dirección horizontal para permitir el análisis cinético de la unión a variantes de TREM-1 capturadas por el anticuerpo anti-His. Antes de la inyección, cada Fab se diluyó a 0, 5,5 (en un experimento), 16,7 y 50 nM en tampón de ejecución y se inyectaron a 100 pl/min durante 250 s (tiempo de asociación). Se monitorizó durante 10 minutos el tiempo de disociación después de estas inyecciones. La microplaca de GLM se regeneró después de cada ciclo de interacción de TREM-1 y Fab mediante dos inyecciones de 18 s de glicina 10 mM y NaOH 50 mM a 100 pl/min. Esta etapa de regeneración retiró las variantes de TREM-1 y cualquier Fab unido de la superficie de anticuerpo anti-His y permitió la unión posterior del siguiente par de interacción. El procedimiento de regeneración no retiró el anticuerpo de captura anti-His directamente inmovilizado de la superficie de la microplaca.

A fin de obtener datos cinéticos, tales como ka (velocidad de asociación), kd (velocidad de disociación) y KD (constante de disociación en equilibrio), el análisis de datos se llevó a cabo usando el programa informático ProteOn Manager™ 3.1.0.6. Los niveles de captura y unión de las muestras ejecutadas en duplicados o triplicados se evaluaron para asegurar que la etapa de regeneración proporcionaba una superficie de unión consistente a lo largo de la secuencia de inyecciones. No se observó una unión inespecífica significativa a las referencias entre puntos con solo anticuerpo de captura inmovilizado. Las curvas de unión se procesaron restando las señales de la superficie de control entre puntos, así como la inyección de tampón de ejecución. Esto permitió la corrección del ruido instrumental y el cambio de volumen durante las inyecciones de muestra. La afinidad del Fab 0170 y del Fab 0011 a diferentes variantes de ECD de TREM-1 se compararon con la afinidad a ECD de TREM-1 de tipo silvestre humano o de cynomolgus.

El nivel de unión 10 s después de finalizar la inyección del Fab, normalizado con el nivel de variante de TREM-1 capturada, también se evaluó para identificar versiones mutadas con unión suprimida o muy baja. Una reducción en la afinidad combinada con un nivel de unión normalizado significativamente menor pueden indicar un plegamiento alterado debido a las mutaciones introducidas. Sin embargo, cabe destacar que los cambios en la cinética también afectarán a este valor. Por lo tanto, se inspeccionó cada curva de unión para su conclusión (datos no mostrados).

Los resultados para TREM-1 con mutaciones individuales de alanina (tabla 10) muestran que dos posiciones (E46 y D92) eran únicas, en tanto que redujeron la unión más de dos veces al Fab 0170.

Tabla 10: Afinidad del Fab 0170 y el Fab 0011 a TREM-1 humano con mutaciones de alanina en relación con TREM-1 humano de ts. Nivel de unión del Fab 0170 y el Fab 0011 10 s después de finalizarse la asociación, expresado como el rado de nivel de unión teórico máximo.

continuación

El mAb -0170 fue, a diferencia del mAb -0011, capaz de unirse a TREM-1 de cynomolgus. La humanización de TREM-1 de cynomolgus en el área seleccionada no dio como resultado una recuperación de la afinidad de 0177 en comparación con TREM-1 humano (0247), lo que indica que otros restos o combinaciones de restos son importantes para las diferencias en la afinidad por TREM-1 humano y de cynomolgus.

0243 no muestra unión al Fab 0170 o al Fab 0011. Para esta construcción no puede descartarse que las mutaciones hayan afectado a la estructura general y por lo tanto, no puede determinarse si Q52 está implicado en la unión de los Fab estudiados a TREM-1 humano.

Tabla 11: Afinidad de Fab 0170 y Fab 0011 a ECD de TREM-1 de cynomolgus de ts, variantes de ECD de TREM-1 de cynomolgus parcialmente humanizadas y ECD de TREM-1 humano de ts. Nivel de unión del Fab 0170 y el Fab 11 1 fin liz r l i i n x r m l r ni l ni n ri m xim

Ejemplo 14: mAb 0170 bloquea eficazmente la activación de TREM-1 en el ensayo de célula indicadora BWZ/hTREM-1

Se usó el ensayo de célula indicadora BWZ/hTREM-1 descrito en el ejemplo 6 para calcular la potencia del mAb 0170 en el bloqueo de TREM-1. Se estimularon células indicadoras BWZ/hTREM-1 con complejo de ligando TREM-1 y mAb 0170 añadido a diversas concentraciones. La figura 9 muestra un bloqueo dependiente de la dosis de la señal de TREM-1, dando como resultado un bloqueo total de la señal a concentraciones mayores de 0,2 ug/ml. Se determinó que el valor de CI50 era de 2,4 nM usando el programa informático GraphPad Prism, ecuación: log(inhibidor) frente a respuesta -- Pendiente variable.

Ejemplo 15: Los anticuerpos de TREM-1 disponibles comercialmente no bloquean la activación de TREM-1 en el ensayo de célula indicadora BWZ/hTREM-1.

Se incluyeron múltiples dosis de anticuerpo en el ensayo de célula indicadora BWZ/hTREM-1, como se ha descrito previamente. SAB1405121 (clon 3F5 de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), WH0054210M4 (clon 2E2 de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), sc-80394 (clon 98Z12 de Santa Cruz, California, EE. UU.), HM2252 (clon 6B1 de Hycult biotech, 5405 PB UDEN, Países Bajos), 316102 (clon TREM-37 de Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.) y 314907 (clon TREM-26 de Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.), no fueron capaces de bloquear significativamente la actividad de TREM-1, mientras que el mAb 0170 desvelado en el presente documento pudo bloquear la actividad de TREM-1 en más de un 99 % a 0,3 ug/ml. Los controles de isotipo tuvieron >95 % de reactividad restante incluso a 3 ug/ml.

Tabla 12

Ejemplo 16: mAb 0170 bloqueó TREM-1 de cynomolgus

Para evaluar la funcionalidad contra TREM-1 de otras especies, se transfectó TREM-1 de ratón y de mono cynomolgus junto con DAP12 de humano y ratón, respectivamente, para generar un ensayo de célula indicadora como el de humano. Esto se llevó a cabo esencialmente como se describe para el sistema humano (ejemplos 1, 2 y 6) pero reemplazando TREM-1 humano con (m)TREM-1 murino de longitud completa (SEQ ID NO: 22) o (c)TREM-1 de mono cynomolgus de longitud completa (s Eq ID NO: 21). El ADNc que codifica ctRe M-1 (SEQ ID NO: 22) se sintetizó en GeneArt y se clonó en pHLEF38 (con licencia de CMC ICOS), en la orientación Xhol - Xbal. Se cotransfectaron células TE alfa NFAT Luc con pHLEF38.cynoTrem1 y pNEF38.NFlag hDAP12 usando 10 ug de cada plásmido y se electroporaron 8e6 células en aprox. 500 ul de volumen total (400 ul de medio de crecimiento y 100ul de ADN) usando el electroporador BTX (260 V, 1050 uF, 720 ohm; la constante de tiempo fue 23 ms). Las células se emplacaron durante 48 horas en una placa de 10 cm, en 10 ml de medio acondicionado al 50 % y se emplacaron directamente en selección a 8e3 células/pocillo de placas de fondo plano 96W (5 placas) en 200 ul/pocillo de medio acondicionado al 30 % con 800ug/ml de G418 y L-histidinol 0,5 mM. Después de 2 semanas de incubación, se identificaron 40 colonias individuales usando el dispositivo Genetix Clone Select Imager.

El único anticuerpo de TREM-1 comercialmente disponible capaz de reaccionar de manera cruzada con TREM-1 de mono cynomolgus fue 314907 (clon TREM-26 de Biolegend, San Diego, CA 92121, EE. UU.) (véase el ejemplo 11). Ninguno de los anticuerpos comercialmente disponibles ensayados en el ejemplo 15 fueron capaces de bloquear la función de TREM-1 de cynomolgus, ni siquiera el que podía unirse a TREM-1 de mono cynomolgus.

Tabla 13

Igualmente, se generó una línea celular indicadora con TREM-1 de ratón. Ninguno de los anticuerpos capaces de unirse a TREM-1 humano o a TREM-1 de cynomolgus y humano pudo unirse de manera cruzada a TREM-1 de ratón. Por lo tanto, se generaron anticuerpos contra TREM-1 de ratón esencialmente como se ha descrito para generar anticuerpos contra TREM-1 humano pero con TREM-1 de ratón como antígeno. Estos anticuerpos se exploraron respecto de su unión y función de bloqueo a TREM-1 en el ensayo de gen indicador murino. Uno de dichos anticuerpos (mAb 0174) fue capaz de unirse a y bloquear la función de TREM-1 de ratón.

Ejemplo 17: La liberación de TNF alfa por macrófagos M2 que se habían estimulados por PGLYRP-1 fue bloqueada por los anticuerpos de TREM-1

Los expertos en la materia reconocerán el valor de establecer una colección de banco criopreservada de células primarias de múltiples donantes, posibilitando de este modo la replicación conveniente de los experimentos. Se produjeron macrófagos derivados in vitro a partir de monocitos de sangre periférica, como se expone a continuación. Se aislaron monocitos enriquecidos negativamente de un "leukopak" de sangre periférica obtenido de Research Blood Componentes (Brighton, MA, EE. UU.) usando un kit Rosette Sep (n.° de cat. 15068) de Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canadá) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se suspendieron monocitos aislados en alícuotas en DMSO/FBS al 10 % de 50e6 células/ml y se enfriaron gradualmente hasta -80 °C. Para producir macrófagos, se descongelaron rápidamente uno o más viales congelados de monocitos en un baño de agua a 37 °C, se diluyeron a 10 ml con medio de crecimiento [RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad CA, EE. UU.), n.° de cat. 72400-047) con FBS al 10 % (Fisher Scientific n.° de cat. 03-600-511] y se centrifugaron 5 minutos a 250 g. Las células se suspendieron a 2e6 células/ml en medio de crecimiento complementado con 50 ng/ml de MCSF humano (Gibco n.° de cat. PHC9501), colocadas en placas de cultivo tisular similares a placas de Petri tratadas para cultivo tisular y en una incubadora humidificada programada para mantener una atmósfera "hipóxica" de CO2 al 5 % y O2 al 2 %. En el tercer día en cultivo, se alimentó a las células con la adición de un volumen igual de medio de crecimiento complementado con 50 ng/ml de MCSF humano. Después de 6 días en cultivo, los monocitos se habían diferenciado en macrófagos M0. Las células M0 se diferenciaron adicionalmente cambiando el medio a medio de crecimiento complementado con 50 ng/ml de IFNg humano (Gibco, n.° de cat. PHC4031) para macrófagos M1 o 40 ng/ml de IL-4 humana (Gibco, n.° de cat. PHC0045) para macrófagos M2 y devolviéndolos a la incubadora durante 22 horas adicionales. En el séptimo día, los macrófagos estaban diferenciados de manera adecuada para su uso en un bioensayo. En resumen, se recuperaron los macrófagos de las placas de Petri mediante lavado con PBS 1X, seguido de EDTA 5 mM en PBS. Después, se retornaron las placas a 37 °C durante 30 minutos y se "lavaron a presión" las células de la placa usando una jeringuilla de 10 ml y una aguja 22G. Después, las células se diluyeron en medio de crecimiento, se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos, tras lo cual se suspendió el sedimento celular a una concentración final de 1e6/ml.

Los macrófagos preparados como se ha expuesto anteriormente se usaron en bioensayos donde se midieron las citocinas, tales como TNF-alfa, producidas en respuesta a la estimulación de las células con ligando de TREM-1, en el medio acondicionado mediante ELISA. Dicho bioensayo se utilizó adicionalmente para medir el bloqueo de dicha estimulación con ligando de TREM-1 mediante anticuerpos específicos para TREM-1. Se prepararon el ligando de TREM o los controles negativos a concentraciones 4X y se añadieron 50 microlitros/pocillo en medio de crecimiento a placas de microtitulación de 96 pocillos. Las concentraciones finales de ligando de TREM-1 consistieron en 7,5 ng/ml de PGLYRP1 humana recombinante (véase el ejemplo 5) y 3 pg/ml de PGN-BS (Invivogen, tlrl-pgnbs, San Diego CA, EE. UU.). Las células se cultivaron en condiciones hipóxicas humidificadas como se ha descrito anteriormente durante 22 horas, tras lo cual se recogió el medio acondicionado y se midieron los niveles de TNFalfa mediante ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (R&D Systems, n.° de catálogo DY210, MN, EE.UU.). La figura 10 muestra que los anticuerpos de TREM-1 reducen la liberación de TNFalfa de estos macrófagos M2 estimulados.

La tabla 12, a continuación, muestra los valores de CI50 de dicho experimento, indicando que los anticuerpos divulgados en el presente documento son muy potentes para bloquear la liberación de citocinas dependiente de TREM-1.

Tabla 14

Ejemplo 18: La liberación de TNFalfa de macrófagos de cynom olgus puede bloquearse mediante mAb 0170

Los macrófagos procedentes de sangre periférica sirven como un excelente modelo in vitro en el estudio de la modulación y activación inmunitaria innata. Se sabe que TREM-1 desempeña un papel clave en el control de este proceso. El uso de la especie de primate no humano, Macaca fascicularis, conocida comúnmente como mono cynomolgus, es crítico para comprender los efectos in vivo de la modulación de la señalización de TREM1. En este ejemplo, se ensayaron anticuerpos anti-TREM-1 respecto de su capacidad para bloquear la producción de citocinas en cultivos de macrófagos M2 de cynomolgus.

Los macrófagos se generaron como se expone a continuación. Se recogió sangre completa de animales adultos macho sanos (SNBL, Everett WA, EE. UU.) mediante venopunción usando tubos vacutainer con heparina sódica (n.° de cat.

3664870, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). La sangre completa se diluyó al 30 % con PBS, después se dispusieron cuidadosamente 30 ml en capas sobre 15 ml de Ficoll-Paque (n.° de cat. 17-1440-03, GE Healthcare, Uppsala Suecia) prediluido al 96 % con p Bs en un tubo cónico de 50 ml. Después de la centrifugación: 30 min, temperatura ambiente, 400 g con baja aceleración y sin freno; se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la interfase de Ficoll/plasma, se diluyeron 3X con PBS y se centrifugaron 7 minutos, temperatura ambiente, 200 g. El sobrenadante que contenía plaquetas contaminantes se aspiró y se desechó y el sedimento celular se resuspendió en 30 ml de PBS FBS al 0,2 % (suero fetal bovino). Este proceso de lavado de células se repitió 2 ciclos adicionales, tras lo cual se resuspendió el sedimento celular de PBMC en medio de cultivo RPMI (n.° de cat. 61870-036, Life Technologies, Grand Island NY, EE. UU.) más FBS al 10 % a 2E6 células/ml y se dispensó en placas de Petri de 15 cm (n.° de cat.430599 Corning, Tewksbury MA, EE. UU.) a 20 ml/placa. Se dejó que se adhirieran los monocitos al plástico incubando durante una noche a 37 °C, CO2 al 5 %, humedad al 100 % tras lo cual se retiraron las células no adherentes removiendo suavemente y meciendo las placas durante 20 segundos, seguido de aspiración.

20 ml de medio de crecimiento fresco complementado con 50ng/ml de hMCSF (n.° de cat. PHC9501, Life Technologies, Grand Island NY, EE. UU.) se añadieron a cada placa y se colocaron en condiciones de cultivo hipóxicas de 37 °C, CO2 al 5 %, O2 al 2 %, humedad del 100 % durante 7 días. En el tercer día en cultivo, se alimentó a las células con la adición de un volumen igual de medio de crecimiento complementado con 50 ng/ml de MCSF humano. Después de 6 días en cultivo, los monocitos se habían diferenciado en macrófagos M0. Las células M0 se diferenciaron adicionalmente cambiando el medio a medio de crecimiento complementado con 50 ng/ml de IFNg humano (Gibco n.° de cat. PHC4031) para macrófagos M1 o 40 ng/ml de IL-4 humana (n.° de cat. PHC0045, Life Technologies, Grand Island NY, EE. UU.) para los macrófagos M2 y devolviéndolos a la incubadora durante 22 horas adicionales. En el séptimo día, los macrófagos estaban diferenciados de manera adecuada para su uso en un bioensayo. En resumen, se recuperaron los macrófagos de las placas de Petri mediante lavado con PBS 1X, seguido de EDTA 5 mM en PBS. Después, se retornaron las placas a 37 °C durante 30 minutos y se "lavaron a presión" las células de la placa usando una jeringuilla de 10 ml y una aguja 22G. Después, las células se diluyeron en medio de crecimiento, se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos, tras lo cual se suspendió el sedimento celular a una concentración final de 1e6/ml.

Los macrófagos preparados como se ha expuesto anteriormente se usaron en bioensayos donde se midieron las citocinas, tales como TNF-alfa, producidas en respuesta a la estimulación de las células con ligando de TREM-1, en el medio acondicionado mediante ELISA. Dicho bioensayo se utilizó adicionalmente para medir el bloqueo de dicha estimulación con ligando de TREM-1 mediante anticuerpos específicos para TREM-1. Se prepararon el ligando de TREM-1 o los controles negativos a concentraciones 4X y se añadieron 50 microlitros/pocillo en medio de crecimiento a placas de microtitulación de 96 pocillos. Las concentraciones finales de ligando TREM-1 consistían en 7,5 ng/ml de PGLYRP1 humana recombinante (generada como se describe en el ejemplo 5) y 3 pg/ml de PGN-BS (n.° de cat. tlrlpgnbs, Invivogen San Diego CA, EE. UU.). Se añadieron anticuerpos en 50 microlitros/pocillo de medio de crecimiento seguido de células en 50 microlitros/pocillo de macrófagos. Las células se cultivaron en condiciones hipóxicas humidificadas como se ha descrito anteriormente durante 22 horas, tras lo cual se recogió el medio acondicionado y se midieron los niveles de TNF-alfa mediante ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (n.° de cat. DY1070 R&D Systems, Minneapolis MN, EE. UU.). La tabla a continuación muestra los valores de TNFa de los cultivos de macrófagos M2 estimulados con ligando de TREM-1 (PGLYRP1+PGN) en presencia de anticuerpo de control o de anticuerpo anti-TREM-1.

continuación

Este ejemplo ilustra que el Ab-0170 anti-TREM-1 puede bloquear eficazmente la producción de citocinas dependiente de TREM en macrófagos obtenidos de monos cynomolgus. La eficacia de este Ab respalda su uso en modelos de toxicología y tratamiento de enfermedades de mono cynomolgus in vivo.

Ejemplo 19: La liberación de TNFalfa de células mononucleares de sangre periférica estimuladas puede bloquearse mediante anticuerpos de TREM-1

PBMC procedentes de una capa leucocitaria y congelados en RPMI 1640 (n.° de cat. 61870, Gibco, Nueva York, EE. UU.), FBS al 20 % (n.° de cat. 16140-071, Gibco, Nueva York, EE. UU., DMSO al 10 % (n.° de cat. D2650, Sigma, Steinheim, Alemania), se descongelaron y lavaron dos veces en RPMI, 10 % de FBS, Pen/Strep al 1 % (n.° de cat. 15070-06, Gibco, Nueva York, EE. UU.) y se resuspendieron en el mismo medio a 4x10E6/ml. Después, se distribuyeron las células con 400,000 células/pocillo. 10 pg/ml de PGN-SA (n.° de cat. tlrl-pgnsa, Invivogen, San Diego, EE. UU.) y 0,2 pg/ml de PGLYRP1 se añadieron a los pocillos para estimular las células. Posteriormente, se diluyeron el isotipo relevante y los anticuerpos de TREM-1 en RpMI y se añadieron al 1,34 nM y 0,167 nM, respectivamente. Se midió la liberación de TNFalfa mediante diaplex (n.° de cat. 880.090.001, Genprobe, Besangon, Francia) de acuerdo con el protocolo del fabricante después de 20 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %. Como se muestra en la tabla 13, a continuación, los anticuerpos de TREM-1 divulgados en el presente documento (los mAb 0044, 0070 y 0059) son capaces de reducir la liberación de TNFalfa de células PBMC.

Tabla 15

La inhibición de aproximadamente el 70 % de la liberación de TNFalfa en las PBMC usando un anticuerpo de bloqueo de TREM-1 indica un impacto significativo en los niveles de citocinas en un cultivo de células estimuladas.

Ejemplo 20: El mAb anti-TREM-1 puede inh ibir la producción de TNFa inducida por PGN+PGLYRP1 en macrófagos normóxicos

La estimulación de macrófagos usando PGN-BS PGLYRP1 humana como estimulante del receptor de TREM-1 puede bloquearse mediante anticuerpos anti-TREM-1.

Se diferenciaron monocitos en macrófagos M2 como en el ejemplo 15. Todas las etapas de diferenciación y estimulación de las células se llevaron a cabo a 37 °C, incubadora con CO2 al 5 % con niveles de oxígeno atmosférico normales (normoxia). Los macrófagos M2 diferenciados se resuspendieron en RPMI/FBS al 10 % y se sembraron a 5x10E5 células/ml en pocillos de ensayo por triplicado (salvo que se indique lo contrario). Después, se estimularon las células durante 24 horas con las siguientes estimulaciones: sin adición, PGLYRP1, PGN-BS (InVivogen, tlrl-pgnbs) (dos conjuntos de triplicados), PGN-BS+PGLYRP1 (tres conjuntos de triplicados) o PGN-BS+PGLYRP1 en presencia de anticuerpo anti-TREM-1 o de control de isotipo. Después, se recogieron los sobrenadantes y se analizó su expresión de TNFa usando BioPlex (Bio-Rad, 171-B5026M). Los anticuerpos (0,1 pg/ml) mAb-0122 y -0170 dirigidos contra TREM-1 fueron capaces de reducir la liberación de TNF-alfa.

Tabla 16

Este ejemplo ilustra que el mAb-0122 y -0170 anti-TREM-1 pueden inhibir la producción de TNFa de macrófagos cultivados en condiciones normóxicas.

Ejemplo 21: El anticuerpo de TREM-1 inhibe específicamente la respuesta inducida en fluido sinovial de artritis reumatoide.

Se sometieron muestras de fluido sinovial de pacientes con AR que padecen artritis reumatoide a ensayo para la actividad del ligando TREM-1 en el ensayo indicador de BWZ como se ha descrito en el ejemplo 6. En resumen, se descongeló el fluido sinovial, se agitó vorticialmente y se diluyó en serie, se ensayó por duplicado /-10 pg/ml de PGNECndi (Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.) con la adición de anticuerpos de TREM-1 o un control de isotipo negativo. El fluido sinovial de un paciente con artritis reumatoide es capaz de desencadenar el ensayo de célula indicadora BWZ/hTREM-1 de una manera dependiente de TREM-1, que se ve potenciado adicionalmente añadiendo MAB1278 (R&D Systems, Mineápolis, MN 55413, EE. UU.: n.° de cat. MAB1278)) mientras que los anticuerpos de bloqueo de TREM-1 divulgados en el presente documento son capaces de reducir esta activación.

Los anticuerpos se ensayaron en dos ensayos indicados por las dos columnas a continuación, cada anticuerpo en concentraciones en el intervalo de 0,1 a 10 ug/ml. El MAB1278 claramente potenció la señal, mientras que los mAb 0122 y 0170 redujeron la señal en comparación con el control de isotipo.

Tabla 17

Ejemplo 22: La liberación de citocinas de células de tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide tras la estimulación con PGLYRP-1 puede bloquearse por mAb 0170.

Se obtuvieron muestras de tejido sinovial de pacientes con AR durante un reemplazo total de rodilla. La suspensión de células de tejido sinovial individuales se aisló mediante una digestión con 4 mg/ml de colagenasa (n.° de cat.

11088793001, Roche, Mannheim, Alemania) y 0,1 mg/ml de DNasa (n.° de cat. 11284932001, Roche, Mannheim, Alemania) durante 1h a 37 °C.

Las células de tejido sinovial a 1x10A5/pocillo en medio de cultivo RPMI (n.° de cat. R0883, St Louis, MO, EE. UU.) 10 % de FCS (n.° de cat. S0115, BioChrom AG, Grand Island, NY 14072, EE. UU.) se estimularon con 4ug/ml de PGLYRP1 y 1ug/ml de PGN-ECNDi (n.° de cat. tlrl-kipgn, Invivogen, San Diego, CA 92121, EE. UU.) en condiciones hipóxicas en presencia o ausencia de diversas concentraciones de mAb 0170 o un control de isotipo de IgG4. Después de 24h de incubación, se recogieron los sobrenadantes celulares y se midieron las citocinas mediante ELISA (TNFa (n.° de cat. DY210, R&D, Mineápolis, MN55413, EE. UU.), IL-1b (88-7010-88, eBioscience, San Diego, CA 92121, EE. UU.), GM-CSF (n.° de cat. 88-7339-88, eBioscience)) o Flowcytomix (TNFa, IL-1b, MIP-1b, MCP-1, IL-6 e IL-8 (n.° de cat. BMS, eBioscience). Las citocinas se secretaron por las células de tejido sinovial tras la estimulación con el ligando de TREM-1 y se bloquearon específicamente mediante el anticuerpo de TREM-1 mAb 0170.

A continuación se expone un ejemplo de dicho experimento, donde se usaron 4 ng/ml o 10 ng/ml de mAb, dando como resultado una reducción de la liberación de citocinas cuando se trataron con anticuerpo de TREM-1 mAb 0170.

Tabla 18

Tabla 19

Este ejemplo demuestra que las células de tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide responderán a la estimulación con el ligando de TREM-1, PGLYRP1, secretando numerosas citocinas que pueden inhibirse mediante mAb 0170.

Ejemplo 23: La liberación de TNFalfa inducida por PGLYRP1 de tipo II en células de tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide puede inhibirse mediante el anticuerpo de TREM-1 mAb 0170.

Se obtuvieron muestras de tejido sinovial de pacientes con AR durante un reemplazo total de rodilla. La suspensión de células de tejido sinovial individuales se aisló mediante una digestión con 4 mg/ml de colagenasa (n.° de cat. 11088793001, Roche, Mannheim, Alemania) y 0,1 mg/ml de DNasa (n.° de cat. 11284932001, Roche, Mannheim, Alemania) durante 1h a 37 °C. Las células de tejido sinovial (1x10A5/pocillo en medio de cultivo RPMI (n.° de cat. 22400105, Gibco, NY 14072, EE. UU.) 10 % de FCS (n.° de cat. S0115, BioChrom AG, Berlín, Alemania)) se cocultivaron con varias dosis de células HEK transfectadas de manera transitoria con PGLYRP1 de tipo II en condiciones hipóxicas en presencia o ausencia de 1ug/ml de mAb 0170 o control de isotipo de IgG4. Después de 24h de incubación, se recogieron los sobrenadantes celulares y se midieron las citocinas mediante ELISA para TNFa (n.° de cat. DY210, R&D, Mineápolis, MN55413 EE. UU.).

Tabla 20

Este ejemplo demuestra que el ligando de TREM-1 (células de tipo II) indujeron la liberación de TNF-alfa de una manera dependiente de la dosis en células de tejido sinovial procedentes de pacientes con artritis reumatoide en comparación con células de control (transfectadas de manera simulada). Esta respuesta de TNFalfa se bloqueó mediante mAb 0170 pero no con IgG4 de isotipo. Las células de control no se vieron afectadas.

Ejemplo 24: MAB1278 unido a placa indujo respuesta de IL-6 y TNFalfa en macrófagos, mostrando características agonistas, mientras que los mAb 0122 y 0170 no.

La estimulación de macrófagos sobre anticuerpos anti-TREM-1 agonistas unidos a la placa indujo la producción de IL-6 y TNFa. Se purificaron monocitos de capas leucocitarias de donantes sanos usando RosetteSep (StemCell Technologies, 15068) y se diferenciaron en macrófagos cultivando durante 6 días en RPMI/FBS al 10 % en presencia de 40 ng/ml de MCSF humano. Después, los macrófagos se diferenciaron adicionalmente en macrófagos M2 cambiando el medio a medio de crecimiento complementado con 50 ng/ml de IL-4 humana y volviendo a la incubadora durante 24 horas adicionales. En el séptimo día, se recuperaron macrófagos de las placas de cultivo mediante lavado con PBS 1X, seguido de EDTA 5 mM en PBS. Después, se devolvieron las placas a 37 °C durante 30 minutos antes de retirarse los macrófagos de las placas mediante lavado. Los macrófagos se lavaron en RPMI/FBS al 10 % antes de su resuspensión y emplacado. Los pocillos de ensayo se habían recubierto previamente con los anticuerpos especificados incubándolos durante una noche con anticuerpo diluido en PBS, seguido de lavado x3 en PBS. Los macrófagos resuspendidos se emplacaron a 5x10E5 células/ml en pocillos de ensayo por triplicado, seguido de incubación durante 24 horas. (Todas las etapas de diferenciación y estimulación de las células se llevaron a cabo a 37 °C, incubadora con CO2 al 5 % con niveles de oxígeno atmosférico normales (normoxia)). Después, se recogieron los sobrenadantes y se analizó su expresión de IL-6 y TNFa usando BioPlex (Bio-Rad, 171-B5006M y 171-B5026M).

Los anticuerpos mAb-0122 y -0170 mostraron un agonismo muy bajo, mientras que el anticuerpo MAB1278 (RnD Systems, MAB1278) mostraron una potente inducción tanto de IL-6 como de TNFa.

Tabla 21

Este ejemplo ilustra que mAb-0122 y -0170 solo muestran una actividad agonista muy baja en macrófagos e indica auténticas características de bloqueo de estos mAb.

Ejemplo 25: El bloqueo de TREM-1 en un modelo de artritis de ratón reduce la enfermedad.

Los experimentos indicados en la tabla 22 se obtuvieron en el modelo de artritis de DTH, que es un modelo de artritis en una sola pata. Se indujo artritis en una sola pata en ratones C57BL/6 provocando una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado clásica (DTH) en la pata trasera derecha mediante inmunización y posterior exposición a seroalbúmina bovina metilada (mBSA), con la modificación de que se administró un cóctel de anticuerpos monoclonales contra colágeno de tipo II (anti-CII) por vía IV entre las etapas de inmunización y exposición. La pata trasera izquierda recibió exposición a PBS y funcionó como control intraanimal. Los ratones (10 ratones/grupo) se trataron 3 veces/semana con un anticuerpo monoclonal para TREM que se une específicamente a y bloquea a TREM-1 murino, según se determina usando una versión murina del ensayo indicador descrito en el ejemplo 6. La primera dosis se administró en el día de la inmunización. Los ratones (9-10 ratones/grupo) se trataron con un anticuerpo de control o PBS como control. La inflamación de la pata se midió desde el día de la inducción de la artritis y en los 11 días posteriores. Los resultados se presentan como área media bajo la curva (ABC) ± EEM. La significación estadística se evaluó usando una prueba de t no emparejada de dos caras, intervalo de confianza del 95 %.

Tabla 22: Efecto del tratamiento con TREM-1 en la inflamación de la pata (ABC-mm) en un modelo de artritis de ratón.

Ejemplo 26: Los neutrófilos activados liberan IL-8, que puede bloquearse mediante mAb para TREM-1

Los neutrófilos expresan TREM-1 y los neutrófilos también expresan el ligando de TREM-1. Para evaluar si TREM-1 está implicado en un bucle de regulación autocrino en neutrófilos, se estimularon neutrófilos aislados con PGN-SA (InVivogen, tlrl-pgnsa) y se midió la liberación de IL-8 en el medio de cultivo. Los anticuerpos de TREM-1 mAb-0059, -0067, -0122 y -0170 fueron capaces de reducir la liberación de IL-8 inducida por PGN-SA. Se aislaron neutrófilos de sangre completa de donante humano sano y se resuspendieron en RPMI/f Bs al 10% a 1,5x10E6 células/ml y se emplacaron en pocillos triplicados pre-recubiertos con fibrinógeno (pre-recubiertos con 50 l de fibrinógeno a 1 mg/ml (Sigma, F3879) en PBS durante 2 horas a 37 °C, seguido de lavado x3 en PBS). Las células se ensayaron en las siguientes condiciones: sin estimulación añadida, 10 g/ml de PGN-SA solo o 10 g/ml de PGN-SA en presencia de mAb-0059, -0067, -0122, -0170 o anticuerpo de control de isotipo a 0,25 g/ml. Las muestras se cultivaron 24 horas en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 %. Después, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para IL-8 usando el kit Bio-plex Pro Human Cytokine IL-8 (BioRad, 171-B5008M).

Tabla 23

Este ejemplo ilustra que la liberación de IL-8 por los neutrófilos inducida mediante estimulación con PGN de origen bacteriano puede reducirse mediante anticuerpos de TREM-1. De este modo, se demuestra que TREM-1 está implicado en un bucle de activación autocrino en neutrófilos y los anticuerpos de TREM-1 son potencialmente útiles en la regulación negativa de las respuestas de neutrófilos.

Ejemplo 27: Los neutrófilos activados pueden estimular a monocitos, que pueden bloquearse mediante mAb anti-TREM-1

Los neutrófilos activados expresan el ligando de TREM-1. Para evaluar si los neutrófilos activados pueden estimular otras células inmunitarias de una manera dependiente de TREM-1, se usaron neutrófilos activados para estimular a monocitos aislados y se midió la liberación de TNFa en el medio de cultivo. Los anticuerpos de TREM-1 mAb-0059 y -0170 fueron capaces de reducir la liberación de TNFa inducida por neutrófilos de los monocitos.

Se aislaron neutrófilos de sangre completa de donantes humanos sanos y se resuspendieron en RPMI/FBS al 10 % y se sembraron a razón de 1,5x10E5 células/pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos recubiertas de poli-D-lisina (Corning, 3841). Después, se estimularon los neutrófilos con 1ng/ml de PMA (Sigma, P1585) 20 g/ml de PGN-SA (InVivogen, tlrl-pgnsa) durante 24 horas en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 %. Después, se lavaron cuidadosamente las células x3 con medio antes de añadir los monocitos frescos aislados. Los monocitos se purificaron de capas leucocitarias de donantes sanos usando un kit EasySep (Stem Cell Technologies, 19059) y se emplacaron con 5x10E4 células/pocillo en los pocillos que ya contenían neutrófilos activados y lavados. Se añadieron los siguientes anticuerpos a 1 g/ml: mAb-0059, mAb-0170 o control de isotipo de hIgG4. Después, se cultivaron las células durante otras 24 horas antes de recoger el sobrenadante. El sobrenadante se diluyó a 1:10 en RPMI/FBS al 10 % antes de medir el TNFa mediante ELISA (eBioscience, BMS223INST).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que es capaz de unirse específicamente a TREM-1 y de bloquearlo, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo son capaces de bloquear la activación de TREM-1 inducida por PGLYRP1;

en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprenden:

una secuencia de CDRH1 TYAMH correspondiente a los restos de aminoácido 31 a 35 de la SEQ ID NO: 6; una secuencia de CDRH2 RIRTKSSNYATYYAASVKG correspondiente a los aminoácidos 50 a 68 de la SEQ ID NO: 6; y

una secuencia de CDRH3 DMGQRRQFAY correspondiente a los restos de aminoácido 101 a 110 de la SEQ ID NO: 6; y en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprenden:

una secuencia de CDRL1 RASESVDTFDYSFLH correspondiente a los restos de aminoácido 24 a 38 de la SEQ ID NO: 7;

una secuencia de CDRL2 RASNLES correspondiente a los restos de aminoácido 54 a 60 de la SEQ ID NO: 7; y

una secuencia de CDRL3 QQSNEDPYT correspondiente a los restos de aminoácido 93 a 101 de la SEQ ID NO: 7.

2. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 y la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.

3. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo están humanizados.

4. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se une a TREM-1 humano con una afinidad de unión que es de 1 x10'7 M o menor, determinada usando resonancia de plasmón superficial.

5. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se une a TREM-1 de mono cynomolgus con una afinidad de unión que es de 1 x10'7 M o menor, determinada usando resonancia de plasmón superficial.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso como medicamento.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso como medicamento.

9. El anticuerpo o el fragmento del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se usan para tratar una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria que es el resultado de una inflamación aguda o crónica, en un sujeto que lo necesite.

10. El anticuerpo o un fragmento del mismo o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la enfermedad inflamatoria o la enfermedad autoinmunitaria se seleccionan entre el grupo que consiste en: enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable, artritis reumatoide, psoriasis, artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, diabetes de tipo I, enfermedad de Grave, esclerosis múltiple, miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Kawasaki, arteriopatía coronaria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad pulmonar intersticial, tiroiditis autoinmunitaria, esclerodermia, esclerosis sistémica, artrosis, dermatitis atópica, vitíligo, enfermedad del injerto contra hospedador, síndrome de Sjogren, nefritis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, alergia y asma.

11. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ex vivo, que comprende expresar de manera recombinante el anticuerpo o el fragmento del mismo en una célula procariota o eucariota.