CN115586338A - 用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒，所述试剂盒包括至少四种捕获抗体和至少四种检测抗体，所述至少四种捕获抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM‑1抗体，所述至少四种检测抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM‑1抗体。本发明的试剂盒能够同时检测sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM‑1四种细胞因子，可以提高检测的准确性。

Description

用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白检测技术领域，尤其涉及一种用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒及其制备方法。
背景技术
可溶性细胞因子受体(SCR)是缺乏跨膜区的受体细胞外部分的循环蛋白。SCRs是调节细胞因子及淋巴运动的正常体液组成之一。第一个被定义的SCR是可溶性白介素2受体(sIL-2R，即sCD25)可调节IL-2家族的细胞因子活性。可溶性白细胞介素-2受体(solubleinterleukin-2receptor,sCD25/sIL-2R)是一种可溶性的细胞因子受体，正常人体内可少量表达，主要来源于激活的淋巴细胞(包括B淋巴细胞和T淋巴细胞)。机体病态时，过多活化的淋巴细胞或肿瘤细胞大量释放sCD25。血清sCD25水平在多种疾病的临床进程中明显升高，如恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病及某些传染病等。噬血细胞综合征(HLH)患者体内过度活化的巨噬细胞和T淋巴细胞导致血清sCD25水平明显升高，因而HLH-2004指南中规定血清sCD25≥2400U/ml是HLH的重要诊断标准之一。以往的研究侧重于sCD25在HLH诊断方面的价值。在免疫激活相关的疾病，如自身免疫性疾病、感染和肿瘤等患者的血清中sIL-2Rs水平显著增加。在某些免疫性疾病中可以观察到sIL-2R水平与疾病进展呈正相关关系。
CD40是Ⅰ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。CD40L是CD40的配体，属Ⅱ型跨膜蛋白，TNF家族细胞因子。CD40L还以可溶型分子形式(sCD40L)存在，血液循环系统中约95％的sCD40L来自于活化的血小板。在动脉粥样硬化(AS)病变区CD40、CD40L过度表达，CD40-CD40L的相互作用参与了AS发生、发展乃至斑块破裂，血栓形成的过程。
CD130亦称gp130是一种分子量为130kD的跨膜糖蛋白,它是白介素6(IL-6)、LIF、抑瘤素(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、IL-11和心肌营养因子-l(CT-1)共同的受体和信号转导子,上述因子也因此归为IL-6家族细胞因子。有研究表明，在糖尿病视网膜病变患者血清中sCD130水平较正常组织有显著升高，且与IL-6和sIL-6R水平显著正相关。
sTREM-1为TREM-1的可溶性形式，存在于血浆、胃液、尿液等体液中。sTREM-1的分子质量根据其细胞来源不同而不同，来源于骨髓细胞和单核细胞的分子质量为17.5kDa，来源于中性粒细胞的为15kDa。目前对于sTREM-1的起源存在两种观点:一种认为其是由TREM-1mRNA的剪接变异体(缺乏跨膜区和胞内区编码的mRNA)编码而成，另一种认为其是基质金属蛋白酶将TREM-1胞外区水解释放后形成的产物。体液中sTREM-1与组织中TREM-1表达具有一致性。胰腺炎大鼠模型中，血清和腹水sTREM-1表达以及胰腺、肝、肾组织中TREM-1表达均明显升高，且两者存在一致性。但两者对炎症的调节作用并不同。TREM-1可放大炎症反应，而sTREM-1可减弱炎症反应。Baruah等使用TREM-1激动剂处理体外人中性粒细胞，并使用外源sTREM-1进行干预，发现下游炎症因子IL-1β释放减少。
目前，市面上定量检测可溶性细胞因子受体的产品主要方法学有酶联免疫法、化学发光免疫分析法。酶联免疫法较为常见，但其手工操作步骤繁琐，所需的血清量大，结果重复性差。化学发光免疫分析法虽操作简单，灵敏度高，但其化学发光物质不稳定，易水解。目前可溶性细胞因子sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1受体检测技术中一般都是单指标检测，试剂灵敏度、精密度等性能欠佳，且检测时间长、操作复杂，因此亟需一种能够同时检测出这四种标志物的性能优良的试剂。
因此，有必要提供一种新型的用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒及其制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于检测哺乳动物血清或血浆中可溶性细胞因子受体的试剂盒及其制备方法，能够同时检测待测样本中可溶性炎性因子sCD25、sCD130、sTREM-1和sCD40L的含量，多因子联合检测有助于全面评估患者的免疫功能状况，综合判断机体的免疫状态，为疾病的辅助诊断、指导用药、监测疗效以及预后提供重要参考。
为实现上述目的，本发明提供一种应用于检测哺乳动物血清或血浆中可溶性细胞因子受体的试剂盒，所述试剂盒包括至少四种捕获抗体和至少四种检测抗体，所述至少四种捕获抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM-1抗体，所述至少四种检测抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM-1抗体。
本发明试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取4种典型可溶性细胞因子受体的组合进行检测，能够在同一样品中同时检测可溶性细胞因子受体sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1，提高了临床检测可溶性细胞因子受体的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，并且线性范围广、准确度好、精密度高、特异性好，测定结果稳定。
优选的，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤缓冲液、校准品、质控品和基质B，所述基质B包括牛血清白蛋白、胎牛血清和甘氨酸，所述样本稀释液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠和胎牛血清，所述洗涤缓冲液包括磷酸盐和牛血清白蛋白，所述校准品包括sCD25蛋白、sCD40L蛋白、sCD130蛋白和sTREM-1蛋白，所述质控品包括含有sCD25蛋白、sCD40L蛋白、sCD130蛋白和sTREM-1蛋白的冻干品。
优选的，所述试剂盒还包括微球和生物素，每个所述微球与一种所述捕获抗体结合形成包被有抗体的微球，每份所述生物素与一种所述检测抗体偶联形成生物素偶联抗体。
优选的，所述试剂盒还包括荧光试剂，所述荧光试剂为链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。
优选的，所述包被有抗体的微球中微球与抗体包被比例为每106个微球上包被10-30ug抗体。
优选的，所述试剂盒还包括固相载体，所述捕获抗体固定于所述固相载体上。
优选的，所述固相载体包括酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片，所述液相芯片包括微球。
本发明还提供所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球混合，配制成捕获微球混合液；
S2：在抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体、抗人sTREM-1抗体中分别加入生物素，分别控制抗体与生物素的摩尔比均为1:10-1:40，在室温下孵育4-6小时后，得到生物素偶联的抗人sCD25抗体、生物素偶联的抗人sCD40L抗体、生物素偶联的抗人sCD130抗体和生物素偶联的抗人sTREM-1抗体；
S3：将所述生物素偶联的抗人sCD25抗体、生物素偶联的抗人sCD40L抗体、生物素偶联的抗人sCD130抗体和生物素偶联的抗人sTREM-1抗体混合，配制成生物素偶联抗体混合液。
本发明制备方法制备的试剂盒，能够同时检测同一份样本中的至少4种可溶性细胞因子受体sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1，提高了临床检测可溶性细胞因子受体的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，并且线性范围广、准确度好、精密度高、特异性好，测定结果稳定。
优选的，所述包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球的制备包括，在若干份不同的荧光微球中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和不同抗体后，在室温下反应4-6小时，然后清洗得到的微球以去除多余抗体后加入脱脂奶粉封闭20-40分钟，然后去除所述脱脂奶粉，以分别得到不同微球，其中，控制向不同份荧光微球分别加入的不同抗体分别为sCD25抗体、sCD40L抗体、sCD130抗体和sTREM-1抗体，使得到的不同微球分别为包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球。
优选的，控制制备所述不同微球所使用的各荧光微球的荧光强度各不相同。
附图说明
图1为本发明实施例联合检测试剂盒的检测原理示意图；
图2为本发明实施例的捕获微球分布情况；
图3为本发明实施例的流式荧光检测sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1的校准曲线；
图4为本发明实施例的sCD25的线性评价结果；
图5为本发明实施例的sCD40L的线性评价结果；
图6为本发明实施例的sCD130的线性评价结果；
图7为本发明实施例的sTREM-1的线性评价结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明提供一种应用于检测哺乳动物血清或血浆中可溶性细胞因子受体的试剂盒，所述试剂盒包括至少四种捕获抗体和至少四种检测抗体，所述至少四种捕获抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM-1抗体，所述至少四种检测抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM-1抗体。
本发明试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取4种典型可溶性细胞因子受体的组合进行检测，能够在同一样品中同时检测可溶性细胞因子受体sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1，提高了临床检测可溶性细胞因子受体的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，并且线性范围广、准确度好、精密度高、特异性好，测定结果稳定。
sCD25、sCD40L、sCD130和sTREM-1作为SCR的成员，在调节细胞因子及淋巴运动中发挥重要作用。sCD25、sCD40L、sCD130和sTREM-1的水平会伴随细胞因子的水平的变化而改变，其通过与IL-2、IL-6、IL-8、IL-10或TNF-α等细胞因子的相互作用，参与免疫信号传导，从而参与机体的免疫反应，因此，sCD25、sCD40L、sCD130和sTREM-1的联合检测，可为IL-2、IL-6、IL-8、IL-10或TNF-α等细胞因子检测反映机体免疫的状态提供辅助的诊断信息。
一些实施例中，所述试剂盒还包括固相载体，所述捕获抗体固定于所述固相载体上。
一些实施例中，所述固相载体包括酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片，所述液相芯片包括微球。
一些实施例中，所述试剂盒采用的信号检测方法包括可见光显色法、化学发光法或荧光发光法。
一些实施例中，所述试剂盒还包括微球和生物素，每个所述微球与一种所述捕获抗体结合形成包被有抗体的微球，每份所述生物素与一种所述检测抗体偶联形成生物素偶联抗体。
一些实施例中，所述试剂盒还包括荧光试剂，所述荧光试剂为链霉亲和素与藻红蛋白偶联物(SA-PE)。
一些实施例中，所述包被有抗体的微球中微球与抗体包被比例为每106个微球上包被10-30ug抗体。
一些实施例中，所述包被有抗体的微球中微球与抗体包被比例为每106个微球上包被20ug抗体。
一些实施例中，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤缓冲液、校准品、质控品和基质B，所述基质B包括牛血清白蛋白、胎牛血清和甘氨酸。
一些实施例中，所述样品稀释液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠和胎牛血清。
一些实施例中，所述洗涤缓冲液包括磷酸盐和牛血清白蛋白。
本发明还提供所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球混合，配制成捕获微球混合液；
S2：在抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体、抗人sTREM-1抗体中分别加入生物素，分别控制抗体与生物素的摩尔比均为1:10-1:40，在室温下孵育4-6小时后，得到生物素偶联的抗人sCD25抗体、生物素偶联的抗人sCD40L抗体、生物素偶联的抗人sCD130抗体和生物素偶联的抗人sTREM-1抗体；
S3：将所述生物素偶联的抗人sCD25抗体、生物素偶联的抗人sCD40L抗体、生物素偶联的抗人sCD130抗体和生物素偶联的抗人sTREM-1抗体混合，配制成生物素偶联抗体混合液。
本发明制备方法制备的试剂盒，能够同时检测同一份样本中的至少4种可溶性细胞因子受体sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1，提高了临床检测可溶性细胞因子受体的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，并且线性范围广、准确度好、精密度高、特异性好，测定结果稳定。
一些实施例中，所述包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球的制备包括，在若干份不同的荧光微球中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和不同抗体后，在室温下反应4-6小时，然后清洗得到的微球以去除多余抗体后加入脱脂奶粉封闭20-40分钟，然后去除所述脱脂奶粉，以分别得到不同微球，其中，控制向不同份荧光微球分别加入的不同抗体分别为sCD25抗体、sCD40L抗体、sCD130抗体和sTREM-1抗体，使得到的不同微球分别为包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球。
本发明制备方法制备的试剂盒，能够同时检测同一份样本中的可溶性细胞因子受体sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1，提高了临床检测可溶性细胞因子受体的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，并且线性范围广、准确度好、精密度高、特异性好，测定结果稳定。
一些实施例中，控制制备所述不同微球所使用的各荧光微球的荧光强度各不相同。
一些实施例中，任意一种所述荧光微球的制备方法包括：使用别藻蓝蛋白和聚苯乙烯微球进行配制；
控制制备不同荧光微球所使用的别藻蓝蛋白的浓度各不相同，或者，控制制备不同荧光微球所使用的聚苯乙烯微球的体积各不相同。
图1为本发明实施例试剂盒的检测原理示意图。参照图1，包被有抗人sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1特异性抗体2的聚苯乙烯微球1、待测样本3、生物素5偶联的抗人sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1抗体4、链霉亲和素6与藻红蛋白7偶联物结合形成免疫复合体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同荧光微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。
以下通过第一至第五实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
第一实施例
本实施例提供一种试剂盒的具体组成，表1为所述试剂盒的具体组成。
表1
Figure BDA0003855119700000091
Figure BDA0003855119700000101
第二实施例
本实施例提供了联合检测试剂盒的制备方法。所述联合检测试剂盒的具体制备方法为：
(1)制备捕获微球混合液
取第一荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第一荧光微球中加入100ug的EDC和50ug的NHS放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人sCD25抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第一荧光微球去除多余所述抗人sCD25抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tirs缓冲液保存，制得包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球；
取第二荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗1-3次，在清洗后的所述第二荧光微球中加入100ug的EDC和50ug的NHS放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人sCD40L抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第二荧光微球去除多余所述抗人sCD40L抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tirs缓冲液保存，制得包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球；
取第三荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗1-3次，在清洗后的所述第三荧光微球中加入100ug的EDC和50ug的NHS放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人sCD130抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第三荧光微球去除多余所述抗人sCD130抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tirs缓冲液保存，制得包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球；
取第四荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗1-3次，在清洗后的所述第四荧光微球中加入100ug的EDC和50ug的NHS放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人sTREM-1抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第四荧光微球去除多余所述抗人sTREM-1抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tirs缓冲液保存，制得包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球；
表2为制备包被有抗体的微球中各原料的厂家、货号来源。
表2
微球 厂家 货号
第一荧光微球 Biolegend 740167
第二荧光微球 Biolegend 740168
第三荧光微球 Biolegend 740169
第四荧光微球 Biolegend 740170
取98mLpH为7.2的Tirs缓冲液，分别加入包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球各0.5mL，配制成捕获微球混合液。
(2)制备生物素偶联抗体混合液
取抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体、抗人sTREM-1抗体，分别以抗体与生物素的摩尔比比为1:30添加生物素，在室温下震荡孵育5小时后，以50K超滤管添加浓度为0.01mol/L的PBS溶液清洗3次以去除多余未结合生物素，得到所述生物素偶联的抗人sCD25抗体、所述生物素偶联的抗人sCD40L抗体、所述生物素偶联的抗人sCD130抗体和所述生物素偶联的抗人sTREM-1抗体，用0.01mol/L的PBS溶液分别稀释所述生物素偶联的抗人sCD25抗体、所述生物素偶联的抗人sCD40L抗体、所述生物素偶联的抗人sCD130抗体和所述生物素偶联的抗人sTREM-1抗体至2ug/ml；
各取稀释后浓度为2ug/ml的标记生物素的sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1抗体25ml混合，配置成生物素偶联抗体混合液，则每种生物素标记抗体的浓度为0.5ug/mL。
(3)SA-PE荧光试剂，为采购自thermofisher，稀释至4ug/mL备用。
(4)制备样品稀释液
将4.76g羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)溶于2000mL纯水制成浓度为0.01mol/L的HEPES溶液，加入16.0g氯化钠(NaCl)、质量浓度为0.05％的Proclin300防腐剂以及质量浓度为10％的胎牛血清，调节pH至7.4，备用。
(5)制备洗涤缓冲液(10×)
将2.4g磷酸二氢钾(KH2PO4)、36.32g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、8g的NaCl、2g氯化钾(KCl)溶于1000mL纯水中，加入25g牛血清白蛋白(BSA)、质量浓度为1％的proclin300防腐剂、质量浓度为0.5％的吐温20(TWeen-20)，混合后备用。
(6)制备校准品，所述校准品由不同浓度的sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1蛋白组成，用以建立检测时的校准曲线。表3为校准品蛋白sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1的厂家、货号来源
表3
校准品蛋白 厂家 货号
sCD25 R&Dsystems 223-2A-025
sCD40L R&Dsystems 6420-CL-025
sCD130 R&Dsystems 228-GP-050
sTREM-1 R&Dsystems 10337-TR-050
(7)制备质控品，所述质控品由sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1重组蛋白的高值和中值冻干品，用于试剂盒的室内质量控制。所述质控品蛋白的来源参照表3。
(8)制备基质B，由牛血清白蛋白、胎牛血清、甘氨酸组成，用以模拟血清基质，消除基质效应。
第三实施例
本实施例提供了第一实施例中试剂盒的具体使用方法，试剂盒的具体使用方法为：
向校准曲线管中加入25μL基质B，向样本管和质控管中分别加入25μL样品稀释液；
向样本管加入样本，向校准曲线管加入校准品，向质控管中加入质控品；
向样本管、校准曲线管和质控管分别中加入25μL捕获微球混合液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入25μL生物素偶联抗体混合液，在室温下以1000-2000rpm的转速避光震荡2小时；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入25μL的SA-PE荧光试剂，室温避光震荡0.5h；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入1000μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后300g离心5分钟，弃掉上清；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入150-300μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的BriCyte E6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度，具体的检测过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
本发明的试剂盒所需样本量少，需25μL血清即可。
图2为本发明实施例的捕获微球分布情况。参照图2，以侧向散射光(sidescatter,SSC)为纵坐标，别藻蓝蛋白(APC)为横坐标。纵坐标确定微球复杂程度位置区间，横坐标区分不同微球所带APC荧光强度，图2可以区分四种结合了包被有抗人sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球，其中P1代表本发明实施例的包被有sCD25抗体的聚苯乙烯微球的SSC和APC分布，P2代表本发明实施例的包被有sCD40L抗体的聚苯乙烯微球的SSC和APC分布，P3代表本发明实施例的包被有sCD130抗体的聚苯乙烯微球的SSC和APC分布，P4代表本发明实施例的包被有sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球的SSC和APC分布。
第四实施例
本实施例提供第一实施例的试剂盒检测样品中的sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1的性能评价方法。具体的性能评价方法为：
(a)基质B的准备：将5.0mL样品稀释液加入到冻干粉基质B中，静置至少15分钟待冻干粉溶解，涡旋使其充分混匀。
(b)校准品的制备：
向校准品冻干粉中加入250μL样品稀释液，使冻干粉完全溶解；
室温下静置15分钟，此溶液浓度为最高浓度，将其标记为C1；
准备14只空管，分别标记为C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C0，每只管中加入75μL样品稀释液，并进行2倍倍比稀释，即取75μL的C1溶液到C2中，充分混匀；
同样的方法进行稀释，分别得到C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14校准品。C0中只加入样品稀释液。
(c)洗涤缓冲液的配制：
将10×洗涤缓冲液稳定到室温，待所有盐溶解；
将10mL的10×洗涤缓冲液加入到90mL纯化水中，配置成洗涤缓冲液。
(d)性能评价
向校准曲线管中加入25μL基质B，向样本管和质控管中分别加入25μL样品稀释液；
向样本管加入样本，向校准曲线管加入校准品，向质控管中加入质控品；
向样本管、校准曲线管和质控管分别中加入25μL捕获微球混合液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入25μL生物素偶联抗体混合液，在室温下以1000-2000rpm的转速避光震荡2小时；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入25μL的SA-PE荧光试剂，室温避光震荡0.5h；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入1000μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后300g离心5分钟，弃掉上清；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入150-300μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的BriCyte E6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度。
图3为本发明实施例的流式荧光检测sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1的校准曲线。在流式细胞仪上分别检测sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1的不同浓度的校准品，得到图3的校准曲线。
(e)线性及空白限评价
线性评价：选取线性范围上限的高浓度样本稀释成至少7个不同浓度(xi)的样本，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(R)。
空白限试验：选取sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1空白样本重复检测20次，计算测量结果平均值
Figure BDA0003855119700000162
和标准差SD值，空白限为
Figure BDA0003855119700000163
图4为本发明实施例的sCD25的线性评价结果，图5为本发明实施例的sCD40L的线性评价结果，图6为本发明实施例的sCD130的线性评价结果，图7为本发明实施例的sTREM-1的线性评价结果。参照图4-7，sCD25线性回归方程为y＝1.0119x-9.6422，R2＝0.9993；sCD40L线性回归方程为y＝1.0429x-40.797，R2＝0.9995；sCD130线性回归方程为y＝1.0519x-2005.9，R2＝0.9988；sTREM-1线性回归方程为y＝1.0211x-85.745，R2＝0.9981。采用本发明的试剂盒，可以检测到的sCD25线性区间不窄于[9.77,40000]pg/mL，sCD40L线性区间不窄于[43.95,180000]pg/mL，sCD130线性区间不窄于[219.73，450000]pg/mL，sTREM-1线性区间不窄于[12.21,50000]pg/mL，线性区间内，线性相关系数∣R∣不小于0.990。
表4为空白限试验(pg/ml)结果。参照表4，sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1空白限分别为：1.61pg/ml、1.45pg/ml、0.63pg/ml、0.67pg/ml。可见sCD25空白限不高于5pg/mL、sCD40L空白限不高于17.8pg/mL、sCD130空白限不高于200pg/mL、sTREM-1空白限不高于5g/mL，因此本发明的试剂盒的检测灵敏度高。
表4
Figure BDA0003855119700000161
Figure BDA0003855119700000171
(f)回收率评价
将已知浓度的高水平待测物A加入到低浓度的血清或基质B中，所加待测物A与血清或基质B之间的体积比例不大于1：9，各重复检测3次，取平均值。表5为回收率试验(pg/ml，n＝3)结果，参照表5，sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1回收率均在90％以上。
表5
sCD25 sCD40L sCD130 sTREM-1
理论浓度 2000.00 9000.00 22500.00 2500.00
检测浓度 1875.68 8541.30 22052.05 2318.37
回收率 94％ 95％ 98％ 93％
(g)重复性与批间差评价
重复性：检测2份不同浓度水平的sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1校准品，按(a)-(d)操作要求进行10次平行检测，计算变异系数CV。
批间差：取三个批次的试剂盒，每个批次10份，分别重复检测同1份参考品，计算30次测量结果的平均值x和标准差s，计算变异系数CV。
表6为重复性试验(pg/ml)结果，参照表6，sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1高值、低值校准品重复性变异系数CV均在10％以内。
表6
Figure BDA0003855119700000181
表7为批间差(pg/ml)评价结果，参照表7，CD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1的3个批次批间差CV均在10％以内。
表7
Figure BDA0003855119700000182
Figure BDA0003855119700000191
通过重复性与批间差评价可知，本发明试剂盒具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数(CV)不大于15％，批间差CV不大于15％。
第五实施例
本实施使用第一实施例中试剂盒及第三实施例中检测方法检测健康人与噬血细胞综合征患者样本各1例，并进行比对分析。
表8为检测健康人与噬血细胞综合征患者样本比对试验(pg/ml)的结果。参照表8，HLH患者sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1各项高于所测1例的健康人样本，其中sCD25最为明显，且测值大于6400pg/ml，与2018年《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》所述一致。
表8
健康人 HLH患者
sCD25 1367.24 8872.54
sCD40L 6030.58 8625.43
sCD130 112526.78 156562.89
sTREM-1 50.05 110.22
由上述实例可知本发明提供的流式荧光技术的同时检测sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1的试剂盒能够用于不同样本中sCD25、sCD40L、sCD130、sTREM-1浓度的测定，更方便了临床的检测和应用，提高检测的准确性。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (10)

1.一种用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少四种捕获抗体和至少四种检测抗体，所述至少四种捕获抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM-1抗体，所述至少四种检测抗体包括抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体和抗人sTREM-1抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤缓冲液、校准品、质控品和基质B，所述基质B包括牛血清白蛋白、胎牛血清和甘氨酸，所述样本稀释液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠和胎牛血清，所述洗涤缓冲液包括磷酸盐和牛血清白蛋白，所述校准品包括sCD25蛋白、sCD40L蛋白、sCD130蛋白和sTREM-1蛋白，所述质控品包括含有sCD25蛋白、sCD40L蛋白、sCD130蛋白和sTREM-1蛋白的冻干品。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括微球和生物素，每个所述微球与一种所述捕获抗体结合形成包被有抗体的微球，每份所述生物素与一种所述检测抗体偶联形成生物素偶联抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光试剂，所述荧光试剂为链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有抗体的微球中微球与抗体包被比例为每106个微球上包被10-30ug抗体。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括固相载体，所述捕获抗体固定于所述固相载体上。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片，所述液相芯片包括微球。
8.一种权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球混合，配制成捕获微球混合液；
S2：在抗人sCD25抗体、抗人sCD40L抗体、抗人sCD130抗体、抗人sTREM-1抗体中分别加入生物素，分别控制抗体与生物素的摩尔比均为1:10-1:40，在室温下孵育4-6小时后，得到生物素偶联的抗人sCD25抗体、生物素偶联的抗人sCD40L抗体、生物素偶联的抗人sCD130抗体和生物素偶联的抗人sTREM-1抗体；
S3：将所述生物素偶联的抗人sCD25抗体、生物素偶联的抗人sCD40L抗体、生物素偶联的抗人sCD130抗体和生物素偶联的抗人sTREM-1抗体混合，配制成生物素偶联抗体混合液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球的制备包括，在若干份不同的荧光微球中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和不同抗体后，在室温下反应4-6小时，然后清洗得到的微球以去除多余抗体后加入脱脂奶粉封闭20-40分钟，然后去除所述脱脂奶粉，以分别得到不同微球，其中，控制向不同份荧光微球分别加入的不同抗体分别为sCD25抗体、sCD40L抗体、sCD130抗体和sTREM-1抗体，使得到的不同微球分别为包被有抗人sCD25抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD40L抗体的聚苯乙烯微球、包被有抗人sCD130抗体的聚苯乙烯微球和包被有抗人sTREM-1抗体的聚苯乙烯微球。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，控制制备所述不同微球所使用的各荧光微球的荧光强度各不相同。
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