CN117330759B - 检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法。选取TGF‑α，TGF‑β1，CXCL12，VEGF，GM‑CSF，G‑CSF此六种不同的肿瘤伴随诊断因子，特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景；试剂盒中加入兔IgG、鼠IgG、HAMA阻断剂，消除检测发生假阳性的问题；添加孵育剂乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠，协同作用保持微球的长效悬浮效果，促进孵育过程的反应进行；含有一种能够避免基质效应的基质溶液，含有20％小鼠血清，能够控制回收率在100±15％以内；去除部分检测抗体的Fc段，排除了非特异性反应的干扰，提高检测结果的准确性。

Description

检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法
本申请主张中国在先申请，申请号：202211116014.0，申请日2022年9月14日的优先权，该申请的说明书，权利要求书，摘要以及附图组作为本申请的一部分全部引用。
技术领域
本发明涉及流式细胞技术领域，具体涉及一种检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法。
背景技术
肿瘤的形成与机体免疫系统息息相关，肿瘤伴随诊断因子是肿瘤相关细胞因子，常由免疫细胞产生，与传统肿标不同。肿瘤伴随诊断因子从免疫系统进行监测，弥补了传统肿瘤标志物从肿瘤自身蛋白层面的分析，增加了肿瘤早期筛查的准确度。
转化生长因子α(transforming growth factor alpha，TGF-α)是表皮生长因子家族被鉴定的第二个成员，TGF-α与细胞迁移、生长和分化有关。TGF-α失调会引起各种上皮性癌症，而且还以旁分泌方式调节肿瘤微环境，使肿瘤与周围基质和免疫系统之间产生交叉对话。TGF-α在许多原发性上皮性肿瘤中表达增加，可以作为早期分子学反应(简称EMR)的生物标志物之一，用于预测EMR和深度分子反应。EMR是慢性期慢性骨髓性白血病患者经过伊马替尼/格列卫治疗预后的有力预测因素。
转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是一种多功能细胞因子，在组织纤维化中参与炎症浸润、细胞生长、细胞凋亡和分化等过程。人类具有三种TGF-β亚型：TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β1发挥强大的抗炎功能，是免疫反应的主调节器。在肿瘤性疾病中，TGF-β抑制早期病变的发展，但是到了后期，癌细胞中的自分泌和旁分泌TGF-β信号会促进其转移，还有助于肿瘤基质的形成、血管生成和免疫抑制。
粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)能够诱导正常粒细胞集落增殖和白血病细胞系成熟，用于骨髓中性粒细胞的成熟和动员。在体内和体外给予G-CSF可能会导致细胞因子的产生发生改变，使炎症上行，并直接影响巨噬细胞和T辅助细胞的极化，促进肿瘤的发生。分泌G-CSF的肿瘤具有高度的侵略性，并与二次转移、更差的预后和低生存率直接相关。在分泌G-CSF的肿瘤内，肿瘤微环境引起的动态变化可以作为早期疾病进展和治疗反应的标志，例如G-CSF水平升高被认为是非小细胞肺癌患者生存期缩短的标志。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)最初被认为是一种CSF，属于造血细胞因子家族。GM-CSF可能对肿瘤的进展和侵袭有直接影响。GM-CSF的表达在许多人类癌症中被上调，在大多数这些癌症中，高水平的循环或肿瘤中的GM-CSF水平与不良预后相关，例如GM-CSF与血小板衍生的生长因子和血管内皮生长因子的表达增加与颈部鳞状细胞癌患者的侵袭和不良预后明显相关；GM-CSF及其受体的高水平表达与结直肠癌患者的5年生存率提高有关。GM-CSF通过免疫或非免疫机制作用于不同类型和发展阶段的肿瘤。
CXC趋化因子配体12(chemokine(C-X-C motif)ligand 12，CXCL12)，也被称为基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor，SDF-1)，属于趋化因子的CXC亚家族。在癌症中，CXCL12与其受体之间的结合导致不同的途径激活，通过癌细胞、迁移、血管生成和上皮向间质转化，参与肿瘤的发生和发展。CXCL12在肿瘤细胞与周围微环境的交流中起着重要作用。CXCL12和其受体的相互作用随后激发了下游的信号通路，影响了肿瘤的血管生成、肿瘤细胞的增殖和化疗抗性，因此是一个潜在的癌症治疗目标。测定CXCL12的表达有可能作为一种癌症生物标志物，并增加各种癌症类型的预后信息。
血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)通常被为VEGF，是VEGF家族最重要、被研究最深入的成员。VEGF-A是一种二聚体糖蛋白，具有两种主要的生物学活性：刺激血管内皮细胞增殖和增加血管通透性。肿瘤细胞的自分泌和旁分泌的VEGF信号起到促进肿瘤发生的关键作用，包括癌症干细胞的自我更新和生存，而不依赖于血管生成。VEGF的表达已被证明与瘤内Tregs呈正相关，是各种恶性肿瘤不良后果的预后标志。
肿瘤的形成与机体免疫系统息息相关，肿瘤伴随诊断因子是肿瘤相关细胞因子，常由免疫细胞产生，综上所述，以上各因子均不同程度的参与了肿瘤的发生发展过程，可通过肿瘤伴随诊断因子的联合检测从免疫系统进行监测。
现有专利202210977129.2公开了一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法，能够对TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，但是，上述检测也存在亟待解决的问题：其方法局限性高，仅适用于悬浮芯片系统；操作繁琐，需要配备其一整套检测仪器和磁性微球试剂，检测成本高，难以普及；而且其检测范围窄，TGF-α：8.75–560pg/mL、TGF-β1：31.3–1000pg/mL、CXCL12：7.9–1018pg/mL、VEGF：23.4–1497.6pg/mL、GM-CSF：9.0–580pg/mL、G-CSF：31.2–2000pg/mL；由于该检测方法中没有试剂对非特异性结合进行阻断，在实际使用中会存在假阳性的问题。
因此，有必要提供一种新型的试剂盒及其检测方法以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其检测方法，能够对TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，能够在常规的流式细胞仪下实现同时检测，操作简洁、检测方便且成本低，且保持较高的灵敏度，不存在假阳性问题。
本发明为避免在上述六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测时发生假阳性，经过大量试验研究，找到了一种阻断剂溶液，使用兔IgG对患者样本中潜在的人抗兔抗体进行阻断，并用鼠IgG和HAMA阻断剂进行组合，极大改善了阻断效果，保持较高的灵敏度，不存在假阳性问题。
本发明为提高在上述六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测的过程中孵育的效果，经过大量试验研究，找到了一种孵育剂，乙二胺四乙酸二钠和透明质酸钠，能够显著降低检出限，其二者的组合能够协同作用、进一步降低检出限。透明质酸钠具有显著的增稠效果，能够提高体系的粘稠度以抑制微球沉降，促进微球分散；乙二胺四乙酸二钠能够提供络合效果，保持分散的体系结构的稳定，又能提供一定的流动性，促进孵育中反应的进行，提高灵敏度。
本发明检测过程中出现过基质效应，即基质对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。为消除这一基质效应，本发明经过大量试验研究，找到了一种基质，含有20％小鼠血清，能够避免基质对分析物的测定发生干扰，控制回收率在100±15％以内，增强检测过程的稳定性和特异性。
本发明对微球的标记抗体类型进行了筛选，发现使用兔抗标记(偶联微球的抗体为兔单克隆抗体)的微球具有更强的特异性和更高的检测灵敏度。更换兔抗后，TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF的检出限降低，检测灵敏度明显提高。上述结果可能的原因在于：兔抗能够识别人类抗原上在啮齿动物中没有免疫原性的表位，增加了可靶向表位的总数；兔抗对小分子和半抗原有强烈的免疫反应，这在啮齿类动物中并不常见；近交品系的家兔更为稀少，而大多数小鼠品系是近交系，因此家兔具有更多的免疫反应多样性；家兔使用独特的机制来遗传产生和多样化抗体，使其具有高亲和力和特异性。
抗体Fc片段是抗体的恒定区，在这个恒定区域内氨基酸的序列在不同的抗体中呈现相同的状态，抗体的不同类型，由抗体Fc片段的特异性结构来进一步决定。抗体Fc片段发生结构性改变是在免疫球蛋白与抗原结合以后，其会有各种生物效应产生，抗原与抗体的复合物通过Fc受体，从而对细胞产生一定介导作用，在免疫功能中起着比较大的作用。
本发明通过大量试验研究，发现在本发明的检测过程中，非特异性干扰会对检测产生较大影响。本发明在研究过程中，将非特异性样本稀释后测试，其测试浓度与原液测试浓度的比例明显不同于稀释倍数。使用同型对照抗体测试非特异性样本，其测试浓度明显高于本底，这表明非特异性反应主要由抗体的Fc片段引起，也表明干扰主要源于异嗜性抗体(HA)的干扰。
本发明仅对偶联生物素的抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体去除Fc片段；不对抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体去除Fc片段。不对抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体去除Fc片段的原因在于去除Fc片段会导致抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体的蛋白构型发生变化，反而降低了GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体的特异性，降低了灵敏度。
一方面，本发明提供了一种用于检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒，所述试剂盒包括偶联抗体的微球混合液、生物素偶联抗体溶液、阻断剂溶液；所述阻断剂溶液包括兔IgG、鼠IgG、HAMA阻断剂；所述抗体为抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体、抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体中的一种或多种。
进一步的，所述试剂盒还包括孵育剂，所述孵育剂包括乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠。
进一步的，所述试剂盒还包括基质溶液，所述基质溶液包括牛血清白蛋白、小鼠血清、甘氨酸；所述小鼠血清为无内源检测靶点的小鼠血清，所述小鼠血清的体积百分数为20％。
进一步的，所述偶联微球的抗体为兔单克隆抗体。
进一步的，所述偶联生物素的抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体去除Fc片段。
进一步的，还包括荧光试剂，所述荧光试剂为生物素-BSA-SA-PE，所述生物素-BSA-SA-PE为与生物素-BSA交联的链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。
进一步的，还包括校准品、质控品，所述校准品、质控品由所述基质溶液配制为对应的校准品溶液、质控品溶液。
进一步的，还包括样品稀释液、洗涤缓冲液，所述样品稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、Tween20、Proclin300；所述洗涤缓冲液包括PBS缓冲液、牛血清白蛋白、Tween20、Proclin300。
另一方面，本发明还提供了上述试剂盒的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1：向样本管中依次加入所述阻断剂溶液、偶联抗体的微球混合液和待测样本；
S2：向所述步骤S1所得混合物中加入生物素偶联抗体溶液、孵育剂，将得到的混合物在室温下避光震荡孵育；
S3：向所述步骤S2所得混合物中加入荧光试剂，将得到的混合物在室温下避光孵育，得到第一复合物；
S4：在流式细胞仪上检测所述第一复合物的荧光类型和荧光信号强度，计算得到所述待测样品中所述TGF-α、TGF-β1、CXCL12、VEGF、GM-CSF、G-CSF的含量。
另一方面，本发明还提供了一种阻断剂溶液用于制备促进阻断非特异性结合的制剂的用途，所述阻断剂溶液包括兔IgG、鼠IgG、HAMA阻断剂。
本发明取得的有益效果：
1、本发明试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF此六种不同的肿瘤伴随诊断因子进行检测，能够在同一样品中同时完成上述肿瘤伴随诊断因子的检测，提高了肿瘤伴随诊断因子检测的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
2、本发明创新性地在TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF此六种不同的肿瘤伴随诊断因子的检测试剂盒中加入阻断剂溶液，阻断剂溶液包括兔IgG、鼠IgG、HAMA阻断剂，能够针对性地阻断非特异性结合的发生，消除检测发生假阳性的问题，提高检测灵敏度，扩大检测范围：TGF-α检测范围6.10–25000pg/mL、TGF-β1检测范围9.77–20000pg/mL、CXCL12检测范围9.16–75000pg/mL、VEGF检测范围12.21–50000pg/mL、GM-CSF检测范围4.88–5000pg/mL、G-CSF检测范围12.21–50000pg/mL。
3、本发明对微球的孵育过程进行了探索研究，发现在孵育过程中添加孵育剂能使微球在一定程度保持悬浮而不沉降，减少微球团聚的发生；孵育剂包括乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠，相互协同作用保持微球的长效悬浮效果，促进孵育过程的反应进行，以此改善检测效果，提高检测灵敏度。
4、本发明提供了一种能够避免基质效应的基质溶液，含有20％小鼠血清，能够控制回收率在100±15％以内，增强检测过程的稳定性和特异性。
5、本发明去除偶联生物素的抗体的Fc段，排除了非特异性反应的干扰，提高检测结果的准确性与灵敏度。
附图说明
图1a为本发明实施例试剂盒去除检测抗体的Fc片段的检测原理示意图；
图1b为本发明实施例试剂盒未去除检测抗体的Fc片段的检测原理示意图；
图2A为本发明实施例中健康者与非小细胞肺癌患者血清中TGF-α的含量；
图2B为本发明实施例中健康者与非小细胞肺癌患者血清中TGF-β1的含量；
图2C为本发明实施例中健康者与乳腺癌患者血清中VEGF的含量；
图2D为本发明实施例中健康者与乳腺癌患者血清中CXCL12的含量；
图2E为本发明实施例中健康者与大肠癌患者血清中G-CSF的含量；
图2F为本发明实施例中健康者与大肠癌患者血清中GM-CSF的含量；
图3为本发明实施例中的校准曲线图；
图4为本发明实施例中TGF-α的线性区间内的线性曲线图；
图5为本发明实施例中TGF-β1的线性区间内的线性曲线图；
图6为本发明实施例中CXCL12的线性区间内的线性曲线图；
图7为本发明实施例中VEGF的线性区间内的线性曲线图；
图8为本发明实施例中GM-CSF的线性区间内的线性曲线图；
图9为本发明实施例中G-CSF的线性区间内的线性曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
图1a和图1b为本发明实施例中捕获物、检测物、微球、生物素和藻红蛋白标记的链霉亲和素之间的关系示意图。
参照图1a，抗体蛋白2偶联的聚苯乙烯微球1、待测样本3、生物素5偶联的检测抗体4、链霉亲和素6与藻红蛋白7的偶联物和生物素偶联的BSA 8形成的网状结构结合形成免疫复合体，其中，聚苯乙烯微球1由兔抗标记，生物素5偶联有去除Fc片段的抗体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同抗体偶联的微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。
参照图1b，抗体蛋白2偶联的聚苯乙烯微球1、待测样本3、生物素5偶联的检测抗体4、链霉亲和素6与藻红蛋白7的偶联物和生物素偶联的BSA 8形成的网状结构结合形成免疫复合体，其中，聚苯乙烯微球1由兔抗标记，生物素5偶联有未去除Fc片段的抗体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同抗体偶联的微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。
实施例1：试剂盒的制备、使用与效果评价
一、试剂盒的制备
具体组成如表1所示：
表1：试剂盒组成
上表中试剂的来源如下：
原料 厂家 型号
微球 BioLegend
偶联微球的抗人TGF-α抗体 Novusbio NBP2-81082
偶联微球的抗人TGF-β1抗体 Abcam ab229856
偶联微球的抗人CXCL12抗体 Thermofisher 702313
偶联微球的抗人VEGF抗体 Abcam ab185238
偶联微球的抗人GM-CSF抗体 Abcam ab277945
偶联微球的抗人G-CSF抗体 Novusbio NBP3-08381
偶联生物素的抗人TGF-α抗体 Thermofisher MA5-43705
偶联生物素的抗人TGF-β1抗体 Bio-Techne MAB2401
偶联生物素的抗人CXCL12抗体 Thermofisher MA5-43865
偶联生物素的抗人VEGF抗体 Thermofisher MA5-23719
偶联生物素的抗人GM-CSF抗体 Thermofisher MA5-15614
偶联生物素的抗人G-CSF抗体 Thermofisher MA1-26098
鼠IgG同型对照抗体 Thermofisher MA5-18095
TGF-α重组蛋白冻干品 CST 449095
TGF-β1重组蛋白冻干品 CST 753625
CXCL12重组蛋白冻干品 Bio-Techne 460-SD-050
VEGF重组蛋白冻干品 R&D 293-VE-050
GM-CSF重组蛋白冻干品 Abcam ab259376
G-CSF重组蛋白冻干品 Abcam Ab51298
生物素 Sigma B4501
牛血清白蛋白 Sigma V900933
链霉亲和素与藻红蛋白偶联物 Thermofisher 12-4317-87
兔IgG Sigma NI01
鼠IgG Sigma NI03
HAMA阻断剂 Roche 11939661103
小鼠血清 Sigma S25-M
大鼠血清 Sigma S24-M
成牛血清 Sigma B9433
胎牛血清 Sigma F4135
三羟甲基氨基甲烷 Sigma T1503
氯化钠 国药集团化学试剂有限公司 10019318
乙二胺四乙酸二钠 国药集团化学试剂有限公司 10009717
透明质酸钠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 H293485
Tween20 Sigma P2287
Proclin300 Sigma 48912-U
PBS缓冲液 sigma 806552
甘氨酸 sigma V900144-500G
其制备方法如下：
(1)制备偶联抗体的微球混合液
通过活化不同聚苯乙烯荧光微球的表面的羧基基团，将不同聚苯乙烯荧光微球的表面的羧基基团与抗人TGF-α抗体的氨基、抗人TGF-β1抗体的氨基、抗人CXCL12抗体的氨基、抗人VEGF抗体的氨基、抗人GM-CSF抗体的氨基和抗人G-CSF抗体的氨基形成共价键并混合后以得到6种不同抗体偶联的微球溶液，然后将所述6种不同抗体偶联的微球溶液混合后得到所述抗体偶联的微球溶液，每毫升抗体偶联的微球溶液中含有5.0×105个微球。
(2)制备生物素偶联抗体溶液
按照以下方法先去除抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体的Fc片段：
1、使用PH＝5的0.1mol/L醋酸钠缓冲液(含0.1mol/L NaCl)透析抗体5mg/mL；
2、将胃蛋白酶0.3mg溶解到透析后的抗体溶液中，在37℃培养18小时；
3、将PH调整为7.0，使用Sephacryl S-200HR，以0.1mol/L磷酸钠缓冲液(PH＝7.0)为洗脱液，按照速度0.35mL/min进行凝胶过滤；
4、取出F(ab)2组分进行浓缩。测量280nm处的吸光度，用以计算浓度，加入1％(V/V)的浓度为100mg/mL的叠氮化钠并保存，备用。
5、用PH＝6的磷酸钠缓冲液将上述F(ab)2稀释至0.4mg/mL，取0.9mL并加入0.1mL2-巯基乙胺溶液。在37℃培养90min。
6、用PH＝6的磷酸钠溶液(含5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠)在Ultrogel AcA44柱中按照速度0.35mL/min进行凝胶过滤。
7、取出Fab’组分，测量280nm处的吸光度并计算浓度；
将去除Fc片段的抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体以及抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体上连接生物素以得到6种不同生物素偶联抗体溶液，然后将所述6种不同生物素偶联抗体溶液混合后得到生物素偶联抗体溶液。抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体以及抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体与生物素的摩尔比均为1:20。
(3)制备荧光试剂
制备生物素-BSA，取BSA 100μg按照BSA与生物素的摩尔比为1:30添加生物素，在室温下孵育5小时后，去除未结合生物素，得到所述生物素偶联BSA，按照1μg/mL的生物素偶联BSA中含有4μg/mL链霉亲和素与藻红蛋白偶联物(SA-PE)制备得荧光试剂。
(4)制备样品稀释液
将9g氯化钠(NaCl)、6.057g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1000μL Proclin300防腐剂、500μL Tween20、5g牛血清白蛋白，配制为pH值为8.0的1000mL的溶液。
(5)制备洗涤缓冲液(10×)
所述洗涤缓冲液为洗涤缓冲液(10×)，所述洗涤缓冲液(10×)由pH值为7.4的PBS缓冲液和质量体积浓度为1％的牛血清白蛋白、0.5％的Tween20、1％的Proclin300配制而成，将所述洗涤缓冲液(10×)用去离子水稀释以得到洗涤缓冲液(1×)，备用。
(6)制备孵育剂
将6.057g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、10g乙二胺四乙酸二钠、5g透明质酸钠、1000μLProclin300防腐剂、500μL Tween20，配制为pH值为8.0的1000mL溶液。
(7)制备阻断剂溶液
将9g氯化钠(NaCl)、6.057g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1000μL Proclin300防腐剂、500μL Tween20、5g牛血清白蛋白、0.1g兔IgG、0.2g鼠IgG、0.02gHAMA阻断剂，配制为pH值为8.0的1000mL溶液。
(8)制备基质溶液
将9g氯化钠(NaCl)、6.057g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1000μL Proclin300防腐剂、500μL Tween20、0.1g兔IgG、0.2g鼠IgG、0.02gHAMA阻断剂、200mL小鼠血清、5g牛血清白蛋白、2g甘氨酸，配制为pH值为8.0的1000mL溶液。
(9)制备校准品
校准品由TGF-β1重组蛋白冻干品、G-CSF重组蛋白冻干品、GM-CSF重组蛋白冻干品、CXCL12重组蛋白冻干品、TGF-α重组蛋白冻干品、VEGF重组蛋白冻干品组成。
(10)制备质控品
质控品由TGF-β1重组蛋白冻干品、G-CSF重组蛋白冻干品、GM-CSF重组蛋白冻干品、CXCL12重组蛋白冻干品、TGF-α重组蛋白冻干品、VEGF重组蛋白冻干品组成。
二、试剂盒的使用方法
将洗涤缓冲液(10×)恢复至室温，使用纯水稀释为洗涤缓冲液(1×)；
向样本管加入25μL阻断剂溶液、25μL偶联抗体的微球混合液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
校准曲线管和质控管加入25μL基质溶液、25μL偶联抗体的微球混合液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
向样本管加入样本25μL，向校准曲线管加入对应校准品25μL，向质控管中加入质控品25μL；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μL生物素偶联抗体溶液，加入25μL孵育剂；
将样本管、校准曲线管和质控管在室温避光条件下，通过微孔板恒温振荡器振荡孵育2h，微孔板恒温振荡器的振荡频率为500～1000rpm；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入荧光试剂，在室温避光条件下，通过微孔板恒温振荡器振荡孵育0.5h，微孔板恒温振荡器的振荡频率为500～1000rpm；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入1000μL的洗涤缓冲液(1×)，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后在300g下离心5分钟，弃掉上清；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入150μL-300μL的洗涤缓冲液(1×)，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的BriCyte E6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度；
使用FCAP ArrayTM Software Version 3.0对检测结果进行分析，通过校准曲线计算得到浓度值。
通过上述步骤使用本发明的试剂盒对60例健康者、60例非小细胞肺癌患者、60例乳腺癌患者和60例大肠癌患者血清中抗体的含量进行检测。
图2A为本发明实施例中健康者与非小细胞肺癌患者血清中TGF-α的含量；图2B为本发明实施例中健康者与非小细胞肺癌患者血清中TGF-β1的含量；图2C为本发明实施例中健康者与乳腺癌患者血清中VEGF的含量；图2D为本发明实施例中健康者与乳腺癌患者血清中CXCL12的含量；图2E为本发明实施例中健康者与大肠癌患者血清中G-CSF的含量；图2F为本发明实施例中健康者与大肠癌患者血清中GM-CSF的含量。
检测结果显示，TGF-β1、G-CSF、GM-CSF、CXCL12、TGF-α和VEGF六种细胞因子在健康者与癌症患者血清中的含量具有显著差异(P<0.0001)，可为癌症的伴随诊断提供有价值的参考。本次检测中健康人群六种细胞因子80％的正常参考值范围为TGF-α：≤83.84pg/mL；TGF-β1：≤38.76pg/mL；CXCL12：5391.39～12179.48pg/mL；VEGF：≤174.65pg/mL；GM-CSF：≤12.09pg/mL；G-CSF：≤46.89pg/mL。
三、试剂盒检测结果评价
(1)校准曲线
使用本发明提供的试剂盒建立TGF-β1、G-CSF、GM-CSF、CXCL12、TGF-α和VEGF六种细胞因子的校准曲线，方法如下：
将洗涤缓冲液(10×)恢复至室温，使用纯水稀释为洗涤缓冲液(1×)；
使用250μL样品稀释液溶解校准品，室温下静置15min，得校准品母液；
使用样品稀释液2倍比稀释校准品，共稀释13次；浓度从高到底分别取25μL至14支流式管中，校准品母液为最高浓度，再取25μL样品稀释液至1支流式管中作为0浓度；
在所有流式管中加入25μL基质溶液、25μL偶联抗体的微球混合液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
在所有流式管加入25μL生物素偶联抗体溶液，加入25μL孵育剂；
在室温避光条件下，通过微孔板恒温振荡器振荡孵育2h，微孔板恒温振荡器的振荡频率为500～1000rpm；
在所有流式管加入荧光试剂，在室温避光条件下，通过微孔板恒温振荡器振荡孵育0.5h，微孔板恒温振荡器的振荡频率为500～1000rpm；
在所有流式管加入1000μL的洗涤缓冲液(1×)，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后在300g下离心5分钟，弃掉上清；
在所有流式管加入150μL-300μL的洗涤缓冲液(1×)，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的BriCyte E6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度；
使用FCAP ArrayTM Software Version 3.0和Graphpad Prism9分析检测结果并绘制校准曲线。
图3为本发明实施例中TGF-α、TGF-β1、CXCL12、VEGF、GM-CSF、G-CSF的校准曲线图。
(2)质量控制
质控品I及质控品II中分别加入5mL样品稀释液，室温静置15min并混匀；再按质控品检测步骤检测质控品；检测结果及靶值范围见表2，单位为pg/mL。
表2：质控品I和质控品II中6种抗体的靶值范围(pg/mL)
通过表2可知，质控品中6种抗体的含量均在靶值范围内，表明试剂盒的质控通过。
(3)线性评价
用接近线性范围上限的高浓度样本稀释成至少5个不同浓度(xi)的样本，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(R)。
图4为本发明实施例中TGF-α的线性区间内的线性曲线图；图5为本发明实施例中TGF-β1的线性区间内的线性曲线图；图6为本发明实施例中CXCL12的线性区间内的线性曲线图；图7为本发明实施例中VEGF的线性区间内的线性曲线图；图8为本发明实施例中GM-CSF的线性区间内的线性曲线图；图9为本发明实施例中G-CSF的线性区间内的线性曲线图。
检测到的TGF-α的线性区间为[6.10,25000]pg/mL，检测到的TGF-β1的线性区间为[9.77,20000]pg/mL，检测到的CXCL12的线性区间为[9.16,75000]pg/mL，检测到的VEGF的线性区间为[12.21,50000]pg/mL，检测到的GM-CSF的线性区间为[4.88,5000]pg/mL，检测到的G-CSF的线性区间为[12.21,50000]pg/mL，线性区间内的线性相关系数R的绝对值不小于0.975。参照图4，TGF-α的线性区间内的线性相关系数R的绝对值为0.9986；参照图5，TGF-β1的线性区间内的线性相关系数R的绝对值为1；参照图6，CXCL12的线性区间内的线性相关系数R的绝对值为0.9921；参照图7，VEGF的线性区间内的线性相关系数R的绝对值为0.9981；参照图8，GM-CSF的线性区间内的线性相关系数R的绝对值为0.9995；参照图9，G-CSF的线性区间内的线性相关系数R的绝对值为0.9999。
(4)空白限、检出限评价
空白限的检测方法：用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，根据试剂盒所用校准品的曲线方程得出20次测量结果的浓度值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，即为空白限值。
检出限的检测方法：对5份浓度近似检出限的低值样本(近似检出限按照所得空白限值进行估计，略高于空白限)进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。
按照上述方法测定得到的空白限与检出限结果如表3所示，表3中的单位为pg/mL。
表3：空白限、检出限结果(pg/mL)
空白限 检出限
TGF-α 2.1 3.0
TGF-β1 1.6 5.0
CXCL12 4.0 6.0
VEGF 6.2 8.0
GM-CSF 1.2 4.0
G-CSF 6.4 9.5
(5)批内实验与批间实验评价
从批次I中得到的试剂盒中抽取10个，并在试剂盒上分别标记为1～10，批内试验结果详见表4，表4中的单位为pg/mL。
表4：批内实验结果(pg/mL)
批间差：从批次I、批次II和批次III中得到的试剂盒中分别抽取10个，并分别在试剂盒上标记为1～10，批间试验结果详见表5，表5中的单位为pg/mL。
表5：批间实验结果(pg/mL)
通过批内实验和批间实验结果可知：本发明试剂盒具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数(CV)不大于10％，批间差CV不大于15％。
由上述实例可知本发明提供的试剂盒能够用于不同样本中TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF浓度的测定，线性范围广、灵敏度高、特异性好，测定结果稳定。
实施例2：阻断剂的筛选试验
在本发明的前期研究过程中，发现时常出现假阳性，即把阴性样本测试为阳性，在对误差进行了精细控制后仍然存在。对已验证的健康样本进行测试，按照实施例1的方法进行测试浓度，区别在于不加入阻断剂，测试5例样本，结果如表6所示。
表6：已验证的阴性样本测定结果(pg/mL)
浓度 TGF-α TGF-β1 CXCL12 VEGF GM-CSF G-CSF
样本1 68.844 26.41 9918.89 125.33 8.77 31.74
样本2 212.72 95.83 23164.12 121.95 11.79 13.95
样本3 216.47 153.31 35348.78 514.63 5.73 17.48
样本4 50.77 18.09 6883.27 78.74 6.89 22.24
样本5 311.91 215.55 21044.62 315.76 4.11 24.5
上述5次测试中，6种伴随因子均出现了假阳性(测试值不在正常参考值范围内)；我们认为上述假阳性的原因在于存在非特异性结合，本发明对假阳性的解决方式是找到并加入适合本发明试剂盒的阻断剂。
首先需要加入兔IgG；原因在于我们选取了兔单克隆抗体作为偶联微球的抗体，兔IgG能够避免患者样品中任何潜在的人抗兔抗体结合从而避免其与偶联微球的抗体发生结合。
但是经过实验测定，加入兔IgG作为阻断剂不能完全阻断非特异性结合的发生，仍然存在假阳性，我们按照实施例1的方式制备了试剂盒，区别仅在于不加阻断剂和加入阻断剂为含有不同浓度的兔IgG的Tris缓冲液，并对已验证的健康样本进行测试，不同兔IgG浓度的各组均重复测试20次，任何一个伴随因子出现假阳性即称该次试验出现假阳性，统计每组试验20次测试中出现假阳性的次数，结果如表7所示。
表7：兔IgG阻断剂与假阳性次数(20次测试)
试验结果表明了兔IgG作为阻断剂能够避免假阳性的出现，但是兔IgG的浓度上限为0.1mg/mL，超出这一浓度后兔IgG的阻断效果没有明显提高，可能是因为在测试中存在其他非特异性干扰，相关物质与偶联微球的抗体发生了非特异性结合所导致的。
为了进一步抑制非特异性结合以排除假阳性，我们需要对阻断剂进行更进一步的研究，加入其他可能有助于提高阻断效果的物质，与上述试验相同的方法进行假阳性的测试，部分试验结果如表8所示。
表8：阻断剂溶液配方与假阳性
试验结果显示，大部分添加的物质对阻断都没有有益效果，只有鼠IgG和HAMA阻断剂能够在本发明的试剂盒和检测过程中与兔IgG协同进一步阻断非特异结合，减少假阳性的出现；进一步的实验证明鼠IgG和HAMA阻断剂同时加入，能够彻底消除假阳性，其他组合在本发明的试剂盒和检测过程中均无法彻底消除假阳性。
实施例3：消除基质效应
校准品使用阻断剂溶液测试时，多数因子的回收率不在85％到115％区间内，如表9所示，表明存在基质效应。因此在测试校准品时加入无内源检测靶点的小鼠血清(20％)，以模拟人血清中的基质环境，此时回收率在85％到115％区间内，基质效应消失，本实施例对小鼠血清、大鼠血清、成牛血清、胎牛血清及其不同比例进行了试验，分别按照实施例1的方法制备为基质溶液，并按照实施例1的测试方法进行基质效应的评估(回收率)，结果如表10～表16所示。回收率＝(加校准品的样本血清测试浓度-不加校准品的样本血清测试浓度)/校准品的测试浓度。
表9：校准品使用阻断剂溶液测试时基质效应评估(pg/mL)
表10：小鼠血清10％测试基质效应评估(pg/mL)
表11：小鼠血清20％测试基质效应评估(pg/mL)
表12：小鼠血清30％测试基质效应评估(pg/mL)
表13：小鼠血清50％测试基质效应评估(pg/mL)
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表14：大鼠血清测试基质效应评估
表15：成牛血清测试基质效应评估
表16：胎牛血清测试基质效应评估
根据上述试验结果，大鼠血清、胎牛血清、成牛血清在不同的含量下都无法消除基质效应，小鼠血清消除基质效应的效果最佳，且当小鼠血清含量20％时，能够完全消除基质效应。
实施例4：孵育剂的筛选试验
本发明为了促进孵育过程中反应的进行、提高灵敏度，在孵育液中增加孵育剂，孵育剂可以选择螯合剂，螯合剂有促进分散的功效，可能能够提高微球悬浮，还有保持稳定、提高流动的功效，促进反应的进行，我们对大量不同的螯合剂进行了试验，试验方法同上，结果如表17所示。
表17：孵育剂与检出限(pg/mL)
螯合剂 TGF-α TGF-β1 CXCL12 VEGF GM-CSF G-CSF
空白 14.8 10.2 13.7 17.6 12.4 19.2
柠檬酸钠 14.0 9.6 17.9 15.1 12.3 15.5
乙二胺四乙酸二钠 10.2 8.3 9.3 11.2 9.4 11.0
透明质酸钠 9.5 8.4 10.4 11.9 9.5 12.3
乙二胺四乙酸二钠+透明质酸钠 3.0 5.0 6.0 8.0 4.0 9.5
柠檬酸钠+透明质酸钠 9.2 7.6 7.1 11.7 9.6 12.1
柠檬酸钠+乙二胺四乙酸二钠 9.5 8.0 8.4 11.8 9.3 11.0
试验结果显示，三种螯合剂对检出限都有不同程度的降低作用，其中乙二胺四乙酸二钠和透明质酸钠能够显著降低检出限，其二者的组合能够协同作用、进一步降低检出限。
从原理上看：透明质酸钠具有显著的增稠效果，能够提高体系的粘稠度以抑制微球沉降，促进微球分散；乙二胺四乙酸二钠能够提供络合效果，保持分散的体系结构的稳定，又能提供一定的流动性，促进孵育中反应的进行，提高灵敏度。
实施例5：微球抗体的筛选试验
与微球偶联的抗体，其生物活性与免疫特性对检测灵敏度有重要的影响，本实施例通过筛选不同的抗体，其他步骤同实施例1，并按照实施例1的方法测定检出限，结果如表18所示。
表18：微球偶联抗体与检出限(pg/mL)
TGF-α TGF-β1 CXCL12 VEGF GM-CSF G-CSF
鼠抗 4.5 5.5 7.5 14.0 5.5 11.5
兔抗 3.0 5.0 6.0 8.0 4.0 9.5
羊抗 3.5 8.5 6.5 10.0 6.0 13
上述羊抗来源如下，鼠抗和兔抗来源见实施例1中试剂的来源：
原料 厂家 型号
羊抗人TGF-α抗体 Bio-techne AF-239-NA
羊抗人TGF-β1抗体 Abcam Ab99562
羊抗人CXCL12抗体 thermofisher PA1-20154
羊抗人VEGF抗体 thermofisher PA1-84331
羊抗人GM-CSF抗体 Novus AB-215-NA
羊抗人G-CSF抗体 Novus AF-214-NA
结果显示：使用兔抗标记微球，检测具有更强的特异性和更高的灵敏度，检出限降低，检测灵敏度明显提高。
上述结果可能的原因在于：兔抗能够识别人类抗原上在啮齿动物中没有免疫原性的表位，增加了可靶向表位的总数；兔抗对小分子和半抗原有强烈的免疫反应，这在啮齿类动物中并不常见；近交品系的家兔更为稀少，而大多数小鼠品系是近交系，因此家兔具有更多的免疫反应多样性；家兔使用独特的机制来遗传产生和多样化抗体，使其具有高亲和力和特异性。
实施例6：抗体处理的试验
在免疫定量反应中，非特异性干扰会对检测产生较大影响。本发明在研究过程中，将非特异性样本稀释后测试，其测试浓度与原液测试浓度的比例明显不同于稀释倍数，试验结果如表19-1所示。使用同型对照抗体测试非特异性样本，其测试浓度明显高于本底浓度(本底浓度值为0)，试验结果如表19-2所示。这表明非特异性反应主要由抗体的Fc片段引起。
表19-1：检测抗体保留FC段测试非特异性样本(pg/mL)
表19-2：检测抗体鼠IgG同型对照测试非特异性样本(pg/mL)
TGF-α TGF-β1 CXCL12 VEGF GM-CSF G-CSF
测试浓度 测试浓度 测试浓度 测试浓度 测试浓度 测试浓度
样本1 33.00 8.03 576.05 65.02 0.00 0.00
样本2 89.17 28.07 2214.96 238.73 35.38 34.98
样本3 82.53 1.53 270.85 299.55 0.00 0.00
样本4 102.79 7.26 851.20 304.88 17.56 2.69
样本5 0.00 12.06 762.52 46.88 0.00 0.00
2倍稀释样本1 0.00 0.00 559.71 52.06 0.00 0.00
2倍稀释样本2 51.73 20.69 2207.12 231.43 0.00 26.56
2倍稀释样本3 1.91 0.00 269.66 291.70 0.00 0.00
2倍稀释样本4 87.93 3.87 828.34 293.64 0.00 0.00
2倍稀释样本5 0.00 3.61 730.42 34.60 0.00 0.00
因此，本实施例对抗体处理的方法进行筛选试验，尝试找到一种抗体处理的方法使得检测能够最大限度避免非特异性反应的干扰。我们尝试去除抗体的Fc片段，方法如实施例1所述，去除Fc片段后效果最为明显，这表明此处的非特异性反应的干扰为异嗜性抗体(HA)的干扰，去除Fc片段能够有效避免异嗜性抗体的干扰；此外，我们也尝试使用HAMA阻断剂进行主动阻断。
用于测试的非特异性样本为实验内筛选稀释后不成比例的异常样本；原液用样品稀释液稀释10倍得稀释后溶液，按照实施例1的方法上机测试原液和稀释后溶液的浓度值，求原液浓度值与稀释后溶液浓度值的比例；当进行主动阻断时，阻断剂溶液中含有200μg/mL的HAMA阻断剂，不对抗体去除Fc片段；当进行去除Fc片段时，阻断剂溶液中不含有HAMA阻断剂。其中TGF-α、TGF-β1、CXCL12、VEGF的浓度值测定结果显示这四种检测指标的趋势相同，此处以TGF-α为例，试验结果如表20所示。
表20：不同处理方法下非特异性样本TGF-α的浓度值(pg/mL)
结果显示：不作任何处理的情况下(空白组)，原液测得浓度与稀释后溶液测得浓度之间的比值与实际稀释比例存在极大偏差；加入HAMA阻断剂进行主动阻断，这一比例较空白组更接近实际稀释比例，但是仍然存在较大偏差；只有去除抗体的Fc片段才能使这一比例最接近实际稀释比例；因此，最优选去除抗体的Fc片段。
GM-CSF、G-CSF的浓度值测定结果呈现与上述TGF-α、TGF-β1、CXCL12、VEGF的浓度值测定结果完全不同的趋势，GM-CSF、G-CSF之间的测试结果呈现相同趋势，此处以GM-CSF为例，试验结果如表21所示。
表21：不同处理方法下非特异性样本GM-CSF的浓度值(pg/mL)
处理 原液浓度值 稀释后溶液浓度值 比例
空白组 30.83 5.49 5.62
添加主动阻断剂 33.56 3.64 9.22
检测抗体去除Fc片段 31.72 5.13 6.18
根据试验结果，对GM-CSF不去除Fc片段，加入HAMA阻断剂稀释效果好；去除Fc片段，原液和稀释后溶液的测定浓度值降低，灵敏度降低，G-CSF与GM-CSF趋势相同；因此在本发明中，我们不去除Fc片段，依靠HAMA阻断剂的主动阻断保证GM-CSF、G-CSF检测的灵敏度。
可能的原因在于，对抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体去除Fc片段导致了抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体的蛋白构型发现了变化，反而降低了GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体的特异性。
综上所述，本发明仅对偶联生物素的抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体去除Fc片段；不对抗人GM-CSF抗体、抗人G-CSF抗体去除Fc片段。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (6)

1.一种用于检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括偶联抗体的微球混合液、生物素偶联抗体溶液、阻断剂溶液；所述阻断剂溶液包括兔IgG、鼠IgG、HAMA阻断剂；所述抗体为抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体、抗人GM-CSF抗体和抗人G-CSF抗体；所述试剂盒还包括孵育剂，所述孵育剂包括乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠；所述试剂盒还包括荧光试剂，所述荧光试剂为生物素-BSA-SA-PE，所述生物素-BSA-SA-PE为与生物素-BSA交联的链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基质溶液，所述基质溶液包括牛血清白蛋白、小鼠血清、甘氨酸；所述小鼠血清为无内源检测靶点的小鼠血清，所述小鼠血清的体积百分数为20%。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，与微球偶联的抗体为兔单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，与生物素偶联的抗人TGF-α抗体、抗人TGF-β1抗体、抗人CXCL12抗体、抗人VEGF抗体去除Fc片段。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括校准品、质控品，所述校准品、质控品由所述基质溶液配制为对应的校准品溶液、质控品溶液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括样品稀释液、洗涤缓冲液，所述样品稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、Tween20、Proclin300；所述洗涤缓冲液包括PBS缓冲液、牛血清白蛋白、Tween20、Proclin300。
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