CN108709989A - 一种基于适配子检测n-羟乙酰神经氨酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物检测技术领域，特别涉及一种基于适配子检测N‑羟乙酰神经氨酸含量的方法，采用N‑羟乙酰神经氨酸‑载体蛋白的偶联物为检测抗原，生物素化修饰的适配子为检测探针，利用包被抗原与检测样品中游离的N‑羟乙酰神经氨酸竞争结合特异性检测探针作为反应模式，经HRP标记的链酶亲和素催化底物显色，测得吸光度值，实现检测样品中N‑羟乙酰神经氨酸的定量测定。本发明检测方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定尿液、血清及动物源性食品牛奶中的N‑羟乙酰神经氨酸的含量，对肿瘤的诊断、预防、风险评估以及动物源性食品污染领域提供研究素材。

Description

一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法
技术领域
本发明属于分子生物检测技术领域，特别涉及一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法。
背景技术
N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)是含有一个氨基的9碳糖酸，唾液酸的主要成分，研究表明在动物细胞间的识别、粘附、炎症反应以及肿瘤细胞的转移中起着重要作用。除了人和鸡以外的所有哺乳动物均能够自身合成N-羟乙酰神经氨酸，人类之所以不能合成N-羟乙酰神经氨酸是因为编辑能使N-乙酰神经氨酸羟化成N-羟乙酰神经氨酸的CMP-Neu5Ac羟化酶的相关基因发生了突变。但是，近几年研究结果显示，食物(尤其是红肉、牛奶)中的N-羟乙酰神经氨酸摄入人体后能与正常细胞和肿瘤细胞上的糖蛋白和糖脂质结合，被免疫系统识别后产生抗体，引发肠道粘膜慢性炎症，而且易进入细胞与核酸结合导致核酸突变，进而增加结直肠癌、心脏病等风险。目前，在多种肿瘤细胞中均发现N-羟乙酰神经氨酸含量较高，因此，N-羟乙酰神经氨酸已成为一种潜在的致癌分子和肿瘤判别标识物。
目前，N-羟乙酰神经氨酸的检测方法主要有色谱法、液相-质谱联用及免疫法等。色谱法、液相-质谱联用法特异性强、灵敏度高，但都需要昂贵的仪器。免疫学方法主要是基于抗原抗体之间的特异性反应而建立起来，但测定N-羟乙酰神经氨酸的免疫学方法具有一定的局限性：N-羟乙酰神经氨酸并非哺乳动物的外源成分，在小鼠体内无法引起强烈的免疫应答，因此制备单抗的难度较大；人类的抗N-羟乙酰神经氨酸的抗体较复杂，而且个体差异较大；虽然可以诱导鸡产生IgY抗体，但存在多抗，特异性差的问题。
适配子是通过指数富集配基的系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)人工合成的单链DNA或RNA，能够高亲和力地与靶物质特异性结合。由于其特殊的二级结构，适配子可以通过氢键、范德华力、疏水作用等其他机制选择性和特异性的与蛋白质、肽、病毒、细菌、有机物、甚至金离子等结合。适配子具有亲和力高、特异性强、靶物质范围广、稳定性好等特点，在分子生物学、环境和食品检测、疾病治疗等研究领域都有广阔的应用前景，凡是涉及抗体的诊断领域几乎都可以用适配子代替，被誉之为“化学抗体”。为对肿瘤的诊断、预防、风险评估以及动物源性食品污染领域做出贡献，本申请设计了一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法。
发明内容
本发明检测方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定尿液、血清及动物源性食品牛奶中的N-羟乙酰神经氨酸的含量，对肿瘤的诊断、预防、风险评估以及动物源性食品污染领域提供研究素材。
本发明提供了一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，包括如下步骤：
S1，准备检测样品，所述检测样品为尿液、血液、牛奶中的其中一种；
S2，设计合成适配子，将生物素化后的适配子配制成10μmol/L的适配子溶液，然后用结合液以体积比1：250-4000稀释，得适配子反应探针溶液，该适配子的核酸序列为：
5’-tggtcccatgtacgccgcggtgtacctccgcgtgtacgctactttctgtgcgtgctgagcgtgaattcgc-3’；
S3，将S1中检测样品加入到抗原预包被处理后的微孔中，以每个微孔中的检测样品为基础样品，然后加入与基础样品等体积量的S2中的适配子反应探针溶液，混匀后37℃孵育1h；
S4，用洗涤液洗S3的微孔3-5次，然后加入相当于S3中基础样品2倍体积量的用结合液稀释了1000倍的HRP标记链酶亲和素，37℃孵育0.5-1.5h；
S5，用洗涤液洗S4的微孔3-5次，然后加入相当于S3中基础样品2倍体积量的邻苯二胺底物溶液，放置10-15min，然后加入相当于S3中基础样品等体积量的2mol/L的H2SO4，振荡混匀，得待检溶液；
S6，将S5中待检测溶液置于酶标仪上读取492nm波长下的吸光度值数，再对照标准曲线计算得检测样品中N-羟乙酰神经氨酸含量。
优选的，S1中尿液是通过如下预处理步骤所得：量取原尿液，4℃、3000g条件下离心10min，取上清液并浓缩10倍，得尿液浓缩液，加入相当于9倍尿液浓缩液体积的0.06mol/L H2SO4，80℃中水浴2h，冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。
优选的，S1中血液是通过如下预处理步骤所得：量取原血液，37℃下水浴2h，4℃下过夜后3000g条件下离心15min，取上清液并浓缩10倍，得血液浓缩液，加入相当于9倍血液浓缩液体积的0.06mol/L H2SO4，80℃中水浴2h，冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。
优选的，S1中牛奶是通过如下预处理步骤所得：
B1，量取牛奶原液，4℃、3000g条件下离心30min，弃上层油脂，加入相当于牛奶原液1.5倍体积的质量浓度为10％的三氯乙酸，混匀并置于冰上10min，然后3000g离心30min，保留上清液和沉淀；
B2，在B1中离心后的沉淀中加入与牛奶原液等体积的质量浓度为5％的三氯乙酸，混匀，4℃、3000g条件下离心20min，保留上清液和沉淀，取上清液并与B1中的上清液合并，加入与合并后的上清液等体积的0.1mol/L的H2SO4，80℃中水浴2h，冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶；
或者，在B2中离心后的沉淀中加入相当于牛奶原液3倍体积的0.1mol/LH2SO4，80℃中水浴2h，冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶。
优选的，S2中结合液按照以下方法配制：20mmol Hepes、120mmol NaCl、5mmolKCl、1mmol CaCl2、1mmol MgCl2，蒸馏水定容至1L。
优选的，所述洗涤液按照以下方法配制：向S2中结合液加入吐温20，并使吐温20在洗涤液中质量比为0.05％。
优选的，S3中微孔板的抗原预包被处理步骤为：
A1，微孔板中加入相当于S3中基础样品2倍体积量的0.5-4μg/mL的N-羟乙酰神经氨酸-载体蛋白偶联物溶液，4℃包过夜或者37℃下放置1-2h；
其中，N-羟乙酰神经氨酸-载体蛋白偶联物是通过活泼酯法或碳二亚胺法制得，载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白，偶联物溶液是用pH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释；
A2，用洗涤液洗含有A1的微孔3-5次，加入相当于S3中基础样品2倍体积量的封闭液，37℃下封闭0.5-2h；
A3，用洗涤液洗含有A2的微孔3-5次，加入相当于S3中基础样品2倍体积量的质量浓度为20％蔗糖磷酸盐缓冲液，室温放置3h，干燥后密封，得抗原预包被处理后的微孔板。
优选的，A2中封闭液为质量浓度为1％的明胶溶液、0.1％的氯化铵溶液、5％脱脂奶粉溶液及1％牛血清白蛋白溶液中的一种。
优选的，S5中邻苯二胺底物溶液的组成：每100mL的0.1mol/L柠檬酸钠溶液中加入40mg邻苯二胺溶液和200μL的质量浓度为30％的H202溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明检测方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定尿液、血清及动物源性食品牛奶中的N-羟乙酰神经氨酸的含量，整个检测过程仅需2.5h，且检测灵敏度高，最低检测下限可达到1.22ng/mL，对肿瘤的诊断、预防、风险评估以及动物源性食品污染领域提供研究素材。
附图说明
图1为本发明检测反应过程原理图；
图2本发明标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图1-2对本发明的几个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，实施例中涉及的试剂均能通过公共渠道获得。
实施例1
一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，包括如下步骤：
S1，准备检测样品，所述检测样品为尿液、血液、牛奶中的其中一种；
其中，S1中尿液是通过如下预处理步骤所得：量取原尿液，4℃、3000g条件下离心10min，取上清液并浓缩10倍，得尿液浓缩液，加入相当于9倍尿液浓缩液体积的0.06mol/LH2SO4，80℃中水浴2h，流动水冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。
血液是通过如下预处理步骤所得：量取原血液，37℃下水浴2h，4℃下过夜后3000g条件下离心15min，取上清液并浓缩10倍，得血液浓缩液，加入相当于9倍血液浓缩液体积的0.06mol/L H2SO4，80℃中水浴2h，流动水冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。
牛奶是通过如下预处理步骤所得：
B1，量取牛奶原液，4℃、3000g条件下离心30min，弃上层油脂，加入相当于牛奶原液1.5倍体积的质量浓度为10％的三氯乙酸，混匀并置于冰上10min，然后3000g离心30min，保留上清液和沉淀；
B2，在B1中离心后的沉淀中加入与牛奶原液等体积的质量浓度为5％的三氯乙酸，混匀，4℃、3000g条件下离心20min，保留上清液和沉淀，取上清液并与B1中的上清液合并，加入与合并后的上清液等体积的0.1mol/L的H2SO4，80℃中水浴2h，流动水冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶；
或者，在B2中离心后的沉淀中加入相当于牛奶原液3倍体积的0.1mol/LH2SO4，80℃中水浴2h，流动水冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶。
S2，设计合成适配子，将生物素化后适配子配制成10μmol/L的适配子溶液(适配子是应用SELEX技术获得的并经过截短优化后得到的70nt单链DNA，由生物公司通过在3'羟基端加上生物素标记的dUTP进行生物素化修饰)，然后用结合液以体积比1:500稀释，得适配子探针溶液，该适配子的核酸序列为：
5’-tggtcccatgtacgccgcggtgtacctccgcgtgtacgctactttctgtgcgtgctgagcgtgaattcgc-3’，如SEQ ID NO.1所示；
其中，结合液按照以下方法配制：20mmol Hepes、120mmol NaCl、5mmol KCl、1mmolCaCl2、1mmol MgCl2，超纯水定容至1L。
S3，将S1中检测样品以50μL/微孔的量加入到抗原预包被处理后的96孔微孔板中，以该微孔中的检测样品为基础样品，然后以50μL/微孔加入S2中的适配子探针溶液，混匀后37℃孵育1h；
其中，微孔板的抗原预包被处理步骤为：
A1，微孔板中以100μL/微孔加入1μg/mL的N-羟乙酰神经氨酸-牛血清蛋白溶液作为固相抗原，4℃包过夜；
其中，N-羟乙酰神经氨酸-载体蛋白偶联物是通过活泼酯法或碳二亚胺法制得，载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白，偶联物溶液是用pH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释；N-羟乙酰神经氨酸-载体蛋白偶联物的制备是现有技术，不详细阐述(本实施例选用方法可参见A novel analytical probe binding to a potential carcinogenic factorof N-glycolylneuraminic acid by SELEX.Biosensors and Bioelectronics,2013,49:547-554)，本实施例1中载体蛋白选用牛血清白蛋白。
A2，用洗涤液洗含有A1的微孔板3-5次，以100μL/微孔加入质量浓度为5％脱脂奶粉溶液作为封闭液，37℃下封闭1-1.5h；
其中，脱脂奶粉用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液溶解，磷酸盐缓冲液按照以下方法配制：KH2PO4 0.2g，Na2PO4.12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，蒸馏水定容至1L；
洗涤液按照以下方法配制：向S2中结合液加入吐温20，并使吐温20在洗涤液中质量比为0.05％。
A3，用洗涤液洗含有A1的微孔板3-5次，洗涤液用量为200-300μL/次/微孔，加入后置于振荡器上振荡60-90s，再倒出洗涤液，洗完后加入质量浓度为20％蔗糖的磷酸盐缓冲液，室温放置3h，干燥后密封，得抗原预包被处理后的微孔板。
S4，用洗涤液洗S3的微孔板3-5次，以100μL/微孔的量加入用结合液稀释了1000倍的HRP标记链酶亲和素，37℃孵育1h；
S5，用洗涤液洗S4的微孔板3-5次，以100μL/微孔的量加入邻苯二胺底物溶液，放置10-15min，然后以50μL/微孔的量加入2mol/L的H2SO4，振荡混匀，得待检溶液；
邻苯二胺底物溶液的组成：每100mL的0.1mol/L柠檬酸钠溶液中加入40mg邻苯二胺溶液和200μL的质量浓度为30％的H202溶液。
S6，将S5中待检测溶液置于酶标仪上读取492nm波长下的吸光度值数，再对照标准曲线计算得检测样品中N-羟乙酰神经氨酸含量。
其中，如图2所示，检测孔OD值(B)与0标准品OD值(B0)的比值为纵坐标，10倍标准品浓度的对数值为横坐标制作标准曲线，在3.125与100ng/mL之间线性良好，其曲线方程为y＝-0.3163x+1.3177，相关系数R2＝0.9945。
标准曲线的绘制：用已知浓度(如200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL、0ng/mL)的N-羟乙酰神经氨酸溶液利用上述方法测得吸光度值数，然后除以0标准(0ng/mL的标准液)的吸光度值，得标准曲线的纵坐标，横坐标为相应的N-羟乙酰神经氨酸溶液浓度值的对数。即根据测定的OD值从标准曲线上计算出log10倍N-羟乙酰神经氨酸的浓度对数，再通过反对数求出10倍浓度值，除以10后再乘以相应的稀释倍数则为样品中实际的N-羟乙酰神经氨酸浓度。
实施例1中分别对血液、尿液和牛奶三种样品做了检测，最后测定血液中N-羟乙酰神经氨酸含17.53ng/mL，尿液中N-羟乙酰神经氨酸含16.30ng/mL，牛奶中N-羟乙酰神经氨酸含17.92ng/mL。
反应原理：如图1-2所示，本发明是将N-羟乙酰神经氨酸-牛血清白蛋白包被在96微孔板中作为固相抗原，然后加入检测样品，再加入能特异性结合N-羟乙酰神经氨酸的生物素化适配子探针，抗原N-羟乙酰神经氨酸-牛血清白蛋白与检测样品中游离的N-羟乙酰神经氨酸竞争特异性结合适配子，洗去游离的N-羟乙酰神经氨酸与适配子的复合物，与抗原N-羟乙酰神经氨酸-牛血清白蛋白结合的适配子探针再与HRP标记的链酶亲和素结合，经过底物显色后终止反应，根据底物显色OD值的变化定量检测靶标物质，用酶标仪测定各孔的吸光度(OD)值，OD值越大，样品中游离的N-羟乙酰神经氨酸含量越少。
实施例2
最佳抗原包被浓度和适配子探针稀释倍数的验证：
以浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的检测抗原(N-羟乙酰神经氨酸-牛血清白蛋白偶联物溶液)为一个变量，以10μmol/L的适配子探针分别按照，1:250，1:500，1:1000，1:2000，1：4000的体积比稀释为另一变量进行正交试验，其他步骤与实施例1相同，依据OD值在1.0-1.5之间时竞争反应变化最灵敏。根据正交实验结果，当抗原浓度为1μg/mL，适配子溶液以体积比1:500倍稀释时，对应孔所测的OD值接近1，此条件下抗原与适配子比例适合，效果最佳。
实施例3
最佳抗原包被条件的探讨：
将检测抗原与适配子稀释度选择实施例2中的优化条件，3个阳性组抗原包被条件分别按照以下3种不同条件实施：4℃包被过夜、37℃包被2h、37℃包被1h，进行不加检测样品的非竞争反应，同时各包被条件下设置不加适配反应探针溶液作为阴性对照，实施例3其余步骤按照实施例1实施，测定各组OD492nm吸光值，计算三种不同抗原处理条件下各自P(阳性组OD492nm)与N(阴性组OD492nm)的比值(P/N)，以比值最大从而确定最佳包被条件。结果表明4℃包被过夜的P/N比为20.62，37℃包被2h的P/N比为19.63，两者均明显大于37℃包被1h时的P/N比(13.85)，所以，抗原包被较佳时间确定为4℃包被过夜。
实施例4
微孔板的抗原预包被处理中封闭液及封闭时间探讨：
步骤A2中洗涤液洗后的微孔板中分别以100μL/微孔加入1％的明胶溶液、0.1％的氯化铵溶液、5％脱脂奶粉溶液及1％牛血清白蛋白四种不同的封闭液，同时设置37℃下封闭0.5h、1h和2h，以时间和封闭液为变量做正交试验，进行不加检测样品的非竞争反应，其余步骤按照实施例1实施，同时各封闭液条件下设置未进行封闭条件的试验组作为阴性对照，不加适配子组作为空白对照，测定各组OD492nm吸光值，计算P/N比值，选取比值最大从而确定最佳封闭液和封闭时间。结果显示，5％脱脂奶粉作用1h时空白组OD492nm吸光值最小0.056，表明出现的非特异性结合最少，P/N比21.71，最大，效果最好。
实施例5
最佳HRP标记的链酶亲和素作用时间验证：
实施例5与实施例1的区别是步骤S4中HRP标记链酶亲和素37℃孵育时间分别为0.5h、1h、1.5h，进行不加样品的非竞争反应，同时各孵育时间条件下以不加适配子孔作为阴性对照组，酶标亲和素作用的最佳时间根据P/N比值最大确定，其余步骤按照实施例1实施。结果显示，当链酶亲和素作用时间达到1h时，其P/N比为23.57，与作用1.5h时的P/N比相当，明显大于作用0.5h时的P/N比(18.04)，为了节省时间，酶标亲和素作用最佳时间确定为1h。
需要说明的是，本发明检测体系可以等比例放大或缩小，但实际中采用96微孔板验证，所以实施例1中所述检测样品仅披露50μL/微孔，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggtcccatg tacgccgcgg tgtacctccg cgtgtacgct actttctgtg cgtgctgagc 60
gtgaattcgc 70

Claims (9)

1.一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，准备检测样品，所述检测样品为尿液、血液、牛奶中的其中一种；
S2，设计合成适配子，将生物素化后的适配子配制成10μmol/L的适配子溶液，然后用结合液以体积比1：250-4000稀释，得适配子反应探针溶液，该适配子的核酸序列为：
5’-tggtcccatgtacgccgcggtgtacctccgcgtgtacgctactttctgtgcgtgctgagcgtgaattcgc-3’；
S3，将S1中检测样品加入到抗原预包被处理后的微孔中，以每个微孔中的检测样品为基础样品，然后加入与基础样品等体积量的S2中的适配子反应探针溶液，混匀后37℃孵育1h；
S4，用洗涤液洗S3的微孔3-5次，然后加入相当于S3中基础样品2倍体积量的用结合液稀释了1000倍的HRP标记链酶亲和素，37℃孵育0.5-1.5h；
S5，用洗涤液洗S4的微孔3-5次，然后加入相当于S3中基础样品2倍体积量的邻苯二胺底物溶液，放置10-15min，然后加入相当于S3中基础样品等体积量的2mol/L的H2SO4，振荡混匀，得待检溶液；
S6，将S5中待检测溶液置于酶标仪上读取492nm波长下的吸光度值数，再对照标准曲线计算得检测样品中N-羟乙酰神经氨酸含量。
2.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S1中尿液是通过如下预处理步骤所得：量取原尿液，4℃、3000g条件下离心10min，取上清液并浓缩10倍，得尿液浓缩液，加入相当于9倍尿液浓缩液体积的0.06mol/L H2SO4，80℃中水浴2h，冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。
3.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S1中血液是通过如下预处理步骤所得：量取原血液，37℃下水浴2h，4℃下过夜后3000g条件下离心15min，取上清液并浓缩10倍，得血液浓缩液，加入相当于9倍血液浓缩液体积的0.06mol/L H2SO4，80℃中水浴2h，冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。
4.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S1中牛奶是通过如下预处理步骤所得：
B1，量取牛奶原液，4℃、3000g条件下离心30min，弃上层油脂，加入相当于牛奶原液1.5倍体积的质量浓度为10％的三氯乙酸，混匀并置于冰上10min，然后3000g离心30min，保留上清液和沉淀；
B2，在B1中离心后的沉淀中加入与牛奶原液等体积的质量浓度为5％的三氯乙酸，混匀，4℃、3000g条件下离心20min，保留上清液和沉淀，取上清液并与B1中的上清液合并，加入与合并后的上清液等体积的0.1mol/L的H2SO4，80℃中水浴2h，冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶；
或者，在B2中离心后的沉淀中加入相当于牛奶原液3倍体积的0.1mol/L H2SO4，80℃中水浴2h，冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶。
5.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S2中结合液按照以下方法配制：20mmol Hepes、120mmol NaCl、5mmol KCl、1mmol CaCl2、1mmol MgCl2，蒸馏水定容至1L。
6.如权利要求5所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，所述洗涤液按照以下方法配制：向S2中结合液加入吐温20，并使吐温20在洗涤液中质量比为0.05％。
7.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S3中微孔板的抗原预包被处理步骤为：
A1，微孔板中加入相当于S3中基础样品2倍体积量的0.5-4μg/mL的N-羟乙酰神经氨酸-载体蛋白偶联物溶液，4℃包过夜或者37℃下放置1-2h；
其中，N-羟乙酰神经氨酸-载体蛋白偶联物是通过活泼酯法或碳二亚胺法制得，载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白，偶联物溶液是用pH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释；
A2，用洗涤液洗含有A1的微孔3-5次，加入相当于S3中基础样品2倍体积量的封闭液，37℃下封闭0.5-2h；
A3，用洗涤液洗含有A2的微孔3-5次，加入相当于S3中基础样品2倍体积量的质量浓度为20％蔗糖磷酸盐缓冲液，室温放置3h，干燥后密封，得抗原预包被处理后的微孔板。
8.如权利要求7所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，A2中封闭液为质量浓度为1％的明胶溶液、0.1％的氯化铵溶液、5％脱脂奶粉溶液及1％牛血清白蛋白溶液中的一种。
9.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S5中邻苯二胺底物溶液的组成：每100mL的0.1mol/L柠檬酸钠溶液中加入40mg邻苯二胺溶液和200μL的质量浓度为30％的H202溶液。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112649541A (zh) * 2021-01-11 2021-04-13 苏桥生物(苏州)有限公司 一种利用反相色谱检测唾液酸的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0767630A (ja) * 1985-12-24 1995-03-14 Konica Corp 抗体産生ハイブリドーマの作製方法
WO2005010485A2 (en) * 2003-07-15 2005-02-03 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and analyzing n-glycolylneuraminic acid (neu5gc) in biological materials
CN104374907A (zh) * 2013-09-06 2015-02-25 新疆农垦科学院 一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法
CN104655846A (zh) * 2013-11-20 2015-05-27 镇江先创生物科技有限公司 一种检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN107192816A (zh) * 2017-05-15 2017-09-22 中国科学院生态环境研究中心 一种利用酶标记核酸适配体检测黄曲霉毒素b1的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0767630A (ja) * 1985-12-24 1995-03-14 Konica Corp 抗体産生ハイブリドーマの作製方法
WO2005010485A2 (en) * 2003-07-15 2005-02-03 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and analyzing n-glycolylneuraminic acid (neu5gc) in biological materials
CN104374907A (zh) * 2013-09-06 2015-02-25 新疆农垦科学院 一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法
CN104655846A (zh) * 2013-11-20 2015-05-27 镇江先创生物科技有限公司 一种检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN107192816A (zh) * 2017-05-15 2017-09-22 中国科学院生态环境研究中心 一种利用酶标记核酸适配体检测黄曲霉毒素b1的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINGRUOGUO主编；郭明若主译: "《人乳生物化学与婴儿配方乳粉工艺学》", 30 April 2018, 北京：中国轻工业出版社 *
SHENG GONG ET AL.: "A novel analytical probe binding to a potential carcinogenic factor of N-glycolylneuraminic acid by SELEX", 《BIOSENS BIOELECTRON》 *
吴宗澄 等: "N-羟乙酰神经氨酸lgY抗体的制备及鉴定", 《中国畜牧兽医> *
张怡轩主编: "《生物药物分析》", 31 December 2015, 北京：中国医药科技出版社 *
张改平主编: "《免疫层析试纸快速检测技术》", 31 August 2015, 河南科学技术出版社 *
朱涪坤著: "《免疫酶技术》", 31 May 1983, 济南：山东科学技术出版社 *
邵宁生等主编: "《生物文库技术 噬菌体展示与SELEX技术》", 31 October 2011 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112649541A (zh) * 2021-01-11 2021-04-13 苏桥生物(苏州)有限公司 一种利用反相色谱检测唾液酸的方法
CN112649541B (zh) * 2021-01-11 2021-09-24 苏桥生物(苏州)有限公司 一种利用反相色谱检测唾液酸的方法

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