CN112649541B - 一种利用反相色谱检测唾液酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于色谱分析技术领域，具体涉及一种利用反相色谱检测唾液酸的方法。该方法通过对待测的蛋白样品进行脱盐、真空浓缩干燥、酸水解、DMB标记、去除蛋白、反相超高效液相色谱检测，最终获得蛋白样品的唾液酸含量的测定结果。本发明通过改良传统液相系统中的流动相配方和流动相梯度，使得N‑乙酰神经氨酸和N‑羟乙酰神经氨酸在色谱柱上的保留增强，与副产物的干扰峰分离度良好，不影响N‑乙酰神经氨酸和N‑羟乙酰神经氨酸的定量，并且没有干扰峰影响，可以将标准曲线最低点稀释到更低浓度，提高了方法的检测灵敏度，当蛋白样品中唾液酸含量低时仍可准确定量，具有高准确性和高灵敏度的优点。且增加了去蛋白步骤，延长色谱柱使用寿命。

Description

一种利用反相色谱检测唾液酸的方法
技术领域
本发明涉及色谱分析技术领域，具体涉及一种利用反相色谱检测唾液酸的方法。
背景技术
唾液酸是一类N-乙酰神经氨酸或其酯、其醇羟基的衍生物，位于糖蛋白侧链末端。在治疗性蛋白药物中，由于唾液酸带有较强的负电荷，唾液酸含量直接影响药物的半衰期，无唾液酸或唾液酸含量低的蛋白在人体中更容易被降解，而蛋白的唾液酸含量也可能影响其生物学活性，高唾液酸水平的突变抗体的ADCC(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)活性表现下降。唾液酸的类型对于药物免疫源性也有重要影响，蛋白药物中人源化的唾液酸类型为N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic Acid,Neu5Ac)，无免疫源性；鼠源性细胞所表达的糖蛋白中含有一种非人源化的唾液酸类型N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)，N-羟乙酰神经氨酸可引起免疫副反应。因此，为保证药物的安全性和有效性，建立一个准确的唾液酸定量分析方法，特别是人源化和非人源化唾液酸含量测定是非常重要的。
目前在唾液酸的检测过程中，因唾液酸极性大且紫外吸光度弱，直接检测难度较大，较常用的方法分为两种。第一种是参考药典方法，取适量蛋白样品，加入一定浓度的硫酸或其他酸性试剂，高温条件下将唾液酸水解，之后离心取上清采用阴离子交换色谱柱进行分离紫外检测，进行定量。该方法灵敏度较低，对于目前的药物蛋白具有很大的局限性，仅能对一些唾液酸含量高的融合蛋白进行检测，对于唾液酸含量较少的蛋白无法准确定量。第二种方法是商品化试剂盒(Ludger)收录的检测方法，采用荧光试剂DMB(4,5-亚甲二氧基-1,2–苯二胺二盐酸盐)进行荧光标记，利用反相色谱柱；流速0.5mL/min；流动相A：乙腈：甲醇：水(9：7：84)溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱的洗脱程序为：0-19min，100％A；19-19.5min，10％A，90％B；19.5-23.5min，10％A，90％B；23.5-24min，100％A；24-30min，100％A。该方法的缺点在于：1、流动相中有机相比例较高，N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸在色谱柱上的保留很弱，而DMB标记过程有很多副产物产生，副产物的保留时间与目标峰重叠，干扰了N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸的准确定量；2、酸解释放唾液酸后的蛋白在色谱柱上吸附严重，压力升高，色谱柱使用寿命短。
综上所述，针对蛋白类药物中唾液酸含量，目前尚缺乏高准确性和高灵敏度的检测方法，亟待开发新的检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明为了解决现有检测蛋白药物中唾液酸含量的方法存在准确性低、灵敏度低的问题，提供了一种利用反相色谱检测唾液酸的方法，通过改良传统液相系统中的流动相配方，降低了流动相中有机相的比例，并调整了流动相梯度，提高了方法的检测灵敏度和准确性；通过增加去蛋白处理的步骤，延长了色谱柱使用寿命。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用反相色谱检测唾液酸的方法，包括如下步骤：
S1.对待测的蛋白样品进行脱盐处理，真空浓缩干燥1-2h；
S2.将干燥后的蛋白样品进行酸水解，得到酸水解产物；
S3.对步骤S2所得酸水解产物进行DMB标记，获得的产物用超纯水稀释，得到经标记的混合物；对不同浓度的唾液酸标准品进行DMB标记，绘制校准曲线；
S4.将步骤S3所得经标记的混合物去除蛋白，得含有唾液酸的溶液；
S5.对步骤S4所得含有唾液酸的溶液上样于色谱柱，进行反相超高效液相色谱检测，获得蛋白样品的唾液酸含量的测定结果；
其中，所述反相超高效液相色谱包括下列条件：
流动相A为乙腈的水溶液，乙腈与水的体积比为(8-10)：(90-92)；
流动相B为乙腈；
流动相梯度洗脱程序为：0-7min，100％A；7-7.1min，100％B；7.1-11min，100％B；11-11.1min，100％A；11.1-20min，100％A。
在一种具体的实施方案中，所述的流动相A中，乙腈与水的体积比为9：91。
在另一种具体的实施方案中，所述的流动相A中，乙腈与水的体积比为8：92。
在另一种具体的实施方案中，所述的流动相A中，乙腈与水的体积比为10：90。
具体地，步骤S1中所述的脱盐处理的步骤为：取一定量的蛋白样品加入10kD超滤浓缩管中，加入超纯水至400μL，于13000rpm离心换液，重复操作两次。离心结束后，倒扣含有样品的10kD超滤管于新的离心管中，1000rpm离心1min，将收集的样品转移至1.5mL离心管。
优选地，步骤S2中所述的酸水解采用的酸为冰醋酸、盐酸、三氟乙酸或甲酸中的任一种；所述的酸的浓度为2mol/L。
在一种具体的实施方案中，所述反相超高效液相色谱采用的条件还包括：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，所述色谱柱的粒径为1.7μm，规格为2.1×50mm；柱温为30℃；进样温度10℃；进样量为5μL；激发波长为373nm；发射波长为448nm；流速为0.18mL/min。
在另一种具体的实施方案中，所述反相超高效液相色谱采用的条件还包括：色谱柱为ACCQ-TAG ULTRA C18，所述色谱柱的粒径为1.7μm，规格为2.1×100mm；柱温为30℃；进样温度10℃；进样量为10μL；激发波长为373nm；发射波长为448nm；流速为0.2mL/min。
具体地，步骤S3中所述的DMB标记的步骤为：分别将步骤S2所得酸水解产物、唾液酸标准品至于离心管中，添加标记试剂，涡旋混匀并离心，于50℃金属浴中避光孵育3h。
更具体地，所述的标记试剂的配制方法为：移取3.83mL超纯水至5mL离心管，加333μL冰醋酸，混合均匀；加入233μLβ-巯基乙醇，混合均匀；称取连二亚硫酸钠40mg加入溶液中，混合均匀；最后称取7mg DMB盐酸盐加入溶液中，涡旋混匀至固体全部溶解，操作过程应注意避光。
更具体地，所述的DMB标记步骤为：分别取5μL步骤S2所得酸水解产物、唾液酸标准品和质控样品至0.5mL离心管中，各加20μL标记试剂，涡旋混匀并短暂离心，于50℃金属浴中避光孵育3小时，注意整个标记步骤需在暗处操作。
优选地，所述的酸水解产物、唾液酸标准品与标记试剂的体积比均为1：4。
优选地，步骤S3中所述的产物与超纯水的体积比为1:19。
具体地，步骤S4中所述的去除蛋白的步骤为：将步骤S3所得经标记的混合物于13000rpm离心10min，去除沉淀蛋白后取上清液。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过改良传统液相系统中的流动相配方和流动相梯度，使得N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸在色谱柱上的保留增强，与副产物的干扰峰分离度良好，不影响N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸的定量。
(2)本发明方法没有干扰峰影响，可以将标准曲线最低点稀释到更低浓度，提高了方法的检测灵敏度，当蛋白样品中唾液酸含量低时仍可准确定量，具有高准确性和高灵敏度的优点。
(3)本发明方法增加了去除蛋白的步骤，去除蛋白对色谱柱的吸附作用，延长色谱柱的使用寿命。
附图说明
图1为采用传统流动相配方的色谱结果。
图2为采用本发明流动相配方的色谱结果。
图3为采用本发明流动相，不同色谱柱和流速下测定的NGNA和NANA标准品校正曲线。其中，NGNA的Equation Y＝1.00e+008X+3.19e+003；NANA的EquationY＝9.49e+007X+7.71e+004。
图4为采用本发明流动相，不同色谱柱和流速下测定的NGNA和NANA样品的色谱结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1流动相及流动相梯度的优化
本发明根据商品化的LudgerTag DMB唾液酸释放和标记试剂盒，改良了其流动相及流动相梯度，具体如下。
传统流动相(Ludger试剂盒)梯度洗脱程序如表1所示：
表1传统流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0002892871020000041
本发明流动相梯度洗脱程序如表2所示：
表2本发明流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0002892871020000042
Figure BDA0002892871020000051
用传统流动相和本专利流动相在同一仪器同一色谱柱对同一份DMB标记过的空白对照和唾液酸标准品分别进行检测：
1、DMB标记条件
(1)Blank：在0.5mL离心管中加5μL超纯水，20μL DMB标记试剂，混匀离心，置于50℃金属浴加热3小时(需避光)，加475μL超纯水终止反应。
(2)唾液酸标准品：在0.5mL离心管中加5μL唾液酸标准品溶液，20μL DMB标记试剂，混匀离心，置于50℃金属浴加热3小时(需避光)，加475μL超纯水终止反应，再将唾液酸标准品溶液稀释至指定浓度。
2、结果：
传统流动相：Blank中有一个干扰峰的出峰时间与Neu5Ac保留时间相同，影响Neu5Ac定量。具体如图1所示，结果表明，采用传统流动相及流动相梯度进行洗脱，Neu5Gc出峰时间早，与Blank溶剂峰出峰时间接近；Blank中干扰峰与Neu5Ac保留时间相同，影响Neu5Ac定量。
本发明流动相：Blank中干扰峰与Neu5Gc和Neu5Ac均分离度良好，对其定量无影响。具体如图2所示，结果表明，采用本发明流动相及流动相梯度进行洗脱，Neu5Gc出峰时间推后，与Blank溶剂峰间隔时间长；Blank中干扰峰与Neu5Gc和Neu5Ac均分离度良好，对其定量无干扰。
因此，将本发明流动相及流动相梯度替代Ludger试剂盒，进行蛋白类药品的唾液酸含量检测，能提高检测方法的准确性及灵敏度，延长色谱柱使用寿命。
实施例2
一种利用反相色谱检测唾液酸的方法，包括如下具体步骤：
(1)对待测蛋白样品进行脱盐处理，真空浓缩仪中干燥1-2小时。
脱盐处理的具体步骤为：取一定量的待测蛋白样品加入10kD超滤浓缩管中，加入超纯水至400μL，于13000rpm离心换液，重复操作两次。离心结束后，倒扣含有样品的10kD超滤管于新的离心管中，1000rpm离心1min，将收集的样品转移至1.5mL离心管。
(2)将干燥后的样品进行酸水解，得到酸水解产物。
本对比例中使用25μL 2mol/L的冰醋酸溶液进行酸水解。
(3)对步骤(2)所得酸水解产物进行DMB标记，取5μL酸水解产物，加入20μL标记试剂后，涡旋混匀并短暂离心，于50℃金属浴避光孵育3h，注意整个标记步骤需在暗处操作，获得的产物加入475μL超纯水稀释，得到经标记的混合物；对不同浓度的唾液酸标准品进行DMB标记，绘制校准曲线。
其中，标记试剂的配制方法为：移取3.83mL超纯水至5mL离心管，加333μL冰醋酸，混合均匀；加入233μLβ-巯基乙醇，混合均匀；称取连二亚硫酸钠40mg加入溶液中，混合均匀；最后称取7mg DMB盐酸盐加入溶液中，涡旋混匀至固体全部溶解，操作过程应注意避光。
(4)将步骤(3)所得经标记的混合物于13000rpm离心10min，去除沉淀蛋白后取上清液，得含有唾液酸的溶液。
(5)取步骤(4)所得含有唾液酸的溶液上样于色谱柱，进行反相超高效液相色谱检测，获得蛋白样品的唾液酸含量的测定结果。
其中，反相超高效液相色谱采用下列条件：
色谱柱为ACCQ-TAG ULTRA C18，所述色谱柱的粒径为1.7μm，规格为2.1×100mm；柱温为30℃；进样温度10℃；进样量为10μL；激发波长为373nm；发射波长为448nm；
流速为0.2mL/min；
流动相A为乙腈的水溶液，乙腈与水的体积比为9：91；
流动相B为乙腈；
流动相梯度洗脱程序为：0-7min，100％A；7-7.1min，100％B；7.1-11min，100％B；11-11.1min，100％A；11.1-20min，100％A。
结果：
(1)NGNA(N-羟乙酰神经氨酸)和NANA(N-乙酰神经氨酸)标准品校正曲线的R2均大于0.9999，定量准确度高。校正曲线见图3。
(2)NGNA的最低进样浓度0.0005pmol/μL，信噪比大于10，检测灵敏度高。见图4。
以上结果表明，采用本发明流动，在其他色谱柱和流速条件下进行唾液酸的检测，也能有较高的灵敏度和准确度。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种利用反相色谱检测唾液酸的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
S1.对待测的蛋白样品进行脱盐处理，真空浓缩干燥1-2h；
S2.将干燥后的蛋白样品进行酸水解，得到酸水解产物；
S3 .对步骤S2所得酸水解产物进行DMB标记，获得的产物用超纯水稀释，得到经标记的混合物；对不同浓度的唾液酸标准品进行DMB标记，绘制校准曲线；
S4.将步骤S3所得经标记的混合物去除蛋白，得含有唾液酸的溶液；
S5.对步骤S4所得含有唾液酸的溶液上样于色谱柱，进行反相超高效液相色谱检测，获得蛋白样品的唾液酸含量的测定结果；
其中，所述反相超高效液相色谱包括下列条件：
流动相A为乙腈的水溶液，乙腈与水的体积比为9：91、8：92或10：90；
流动相B为乙腈；
流动相梯度洗脱程序为：0-7min，100%A；7-7.1min，100%B；7.1-11min，100%B；11-11.1min，100%A；11.1-20min，100%A；
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，所述色谱柱的粒径为1.7μm，规格为2.1×50mm；柱温为30℃；进样温度10℃；进样量为5μL；激发波长为373nm；发射波长为448nm；流速为0.18mL/min；
或，色谱柱为ACCQ-TAG ULTRA C18，所述色谱柱的粒径为1.7μm，规格为2.1×100mm；柱温为30℃；进样温度10℃；进样量为10μL；激发波长为373nm；发射波长为448nm；流速为0.2mL/min；
所述的唾液酸为N-乙酰神经氨酸Neu5Ac和N-羟乙酰神经氨酸Neu5Gc。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述的酸水解采用的酸为冰醋酸、盐酸、三氟乙酸或甲酸中的任一种；所述的酸的浓度为2mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述的DMB标记的步骤为：分别将步骤S2所得酸水解产物、唾液酸标准品置于离心管中，添加标记试剂，涡旋混匀并离心，于50℃金属浴中避光孵育3h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酸水解产物、唾液酸标准品与标记试剂的体积比均为1：4。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述的产物与超纯水的体积比为1：19。
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