CN106908528A - 蛋白类药物中唾液酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了蛋白类药物中唾液酸的检测方法。具体地，本发明提供了一种对蛋白的唾液酸含量进行检测的方法，所述方法包括步骤：(1)提供一待分析样品，其中含有待分析蛋白；(2)对步骤(1)中的样品进行酸水解，得到酸水解产物；(3)对(2)中所述的酸水解产物用标记试剂进行标记，获得经标记的混合物；(4)用有机溶剂对所述经标记的混合物进行色谱预处理，获得预处理的混合物；(5)将所述预处理的混合物上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；(6)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

Description

蛋白类药物中唾液酸的检测方法

技术领域

本发明涉及质控检测领域，具体地涉及蛋白类药物中唾液酸的检测方法。

背景技术

唾液酸(SA)是一类神经氨酸的衍生物，一个含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为5-氨基-3,5二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。

根据5号碳上不同的连接基团，构成了不同的唾液酸衍生物。最主要的两种唾液酸为5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N-乙酰神经氨酸)和3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由这两种衍生而成。而N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)是NANA的乙酰基位置上发生了羟基化而得到的。NGNA和NANA通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。

唾液酸修饰与蛋白类药物的安全性及有效性息息相关，对唾液酸进行准确定量监测既能监控生产工艺的稳定性，同时又利于药物的质量控制。

目前唾液酸检测方法主要分为两类，第一种参考药典方法，取适量蛋白样品，加入一定浓度的硫酸或其他酸性试剂，高温条件下将唾液酸水解，之后离心取上清采用阴离子交换色谱柱进行分离紫外检测，进行定量。这种方法灵敏度较低，对于目前的药物蛋白具有很大的局限性，仅能对一些唾液酸含量高的融合蛋白进行检测。对于唾液酸含量较少的蛋白无法准确定量，尤其对于占据生物药市场半壁江山的抗体类药物无法采用该方法进行唾液酸准确定量。

第二种方法为采用DMB(4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐)荧光标记，采用反相色谱柱，流动相选择ACN/MeOH/H₂O9/7/84等度分离，之后激发波长373nm，发射波长448nm检测外标定量。然而，该方法不仅成本高，而且存在以下缺点：1)处理后的样品含有干扰物质(如无法彻底去除蛋白)，会显著缩短色谱柱的寿命；(2)即使采用离心方式也无法充分去除蛋白，而采用溶剂处理，则会在色谱分离时产生溶剂效应；(3)每次样品分析后需要较长时间的色谱柱冲洗；(4)标记试剂与杂质峰可能会影响唾液酸分离及鉴定，标准品保留时间会发生漂移，重现性不好，方法的耐受性较差。

综上所述，本领域尚缺乏令人满意的高准确性和高灵敏度的对蛋白类药物中唾液酸进行检测的方法。因此，本领域迫切需要开发新的、高准确性和高灵敏度的对蛋白类药物中唾液酸进行检测的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高准确性和高灵敏度的对蛋白类药物中唾液酸进行检测的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种对蛋白的唾液酸含量进行检测的方法，包括步骤：

(1)提供一待分析样品，其中含有待分析蛋白；

(2)对步骤(1)中的样品进行酸水解，得到酸水解产物；

(3)对(2)中所述的酸水解产物用标记试剂进行标记，获得经标记的混合物；

(4)用有机溶剂对所述经标记的混合物进行色谱预处理，获得预处理的混合物；

(5)将所述预处理的混合物上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；

(6)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

在另一优选例中，所述方法的唾液酸检测信噪比大于3(如3-500，较佳地3-200，更佳地4-50，较佳地5-20)。

在另一优选例中，所述步骤(6)中，包括对将样品的检测结果与标准曲线或标准品进行比较，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

在另一优选例中，所述的样品体积≥25微升，如25-2000微升，较佳地50-1500微升。

在另一优选例中，所述的样品中，蛋白量含量≥50μg，优选500μg。

在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度达到10pmol或更低。

在另一优选例中，对于10pmol的样品，唾液酸检测信噪比大于3。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(2)之后，步骤(3)之前还包括瞬离步骤。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(4)之后，步骤(5)之前还包括振荡混匀步骤。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(4)之后，步骤(5)之前还包括离心步骤。

在另一优选例中，所述方法中，所述离心步骤为5000-20000rpm离心1-15分钟，如13000r/min离心5分钟。

在另一优选例中，步骤(2)中所述酸水解所用酸选自下组：乙酸、三氟乙酸、硫酸、盐酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(2)中所述酸水解中，所用酸的终浓度为1-3M，较佳地为2M。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(2)中酸水解的反应条件为65-85℃反应1-4小时，较佳地为70-80℃反应1.5-3小时，更佳地为70-80℃反应2小时，又更佳地为80℃反应2小时。

在另一优选例中，所述方法中，步骤(3)中标记的反应条件为40-60℃避光反应1-3小时，较佳地为40-60℃避光反应1.5-2.5小时，更佳地在约50±2℃避光反应2±0.5小时，又更佳地在50℃避光反应2小时。

在另一优选例中，所述待分析蛋白为抗体蛋白。

在另一优选例中，所述待分析蛋白为单抗蛋白。

在另一优选例中，所述待分析蛋白为融合蛋白。

在另一优选例中，所述标记试剂选自：4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)，或具有式I结构的标记化合物：

式中，

化合物1，X＝O，R＝CH₃；

化合物2，X＝O，R＝

化合物3，X＝NH，R＝H；

化合物4，X＝NH，R＝CH₃；

化合物5，X＝NH，R＝

化合物6，X＝NH，R＝

在另一优选例中，所述有机溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、DMSO、异丙醇、或其组合。

在另一优选例中，所述有机溶剂(预处理剂)选自下组：乙腈、含乙腈的混合溶剂。

在另一优选例中，在预处理步骤中，有机溶剂(预处理剂)的用量为60％-95％(终浓度)，较佳地为80％，按预处理混合物的总体积计。

在另一优选例中，所述分析方法不包括脱盐步骤。

在另一优选例中，所述的方法为产品质量控制方法。

在另一优选例中，所述的方法为特性研究方法。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断性和非治疗性的方法。

在另一优选例中，所述色谱柱为BEH amide柱。

在另一优选例中，所述BEH amide柱为聚糖BEH amide柱，例如Waters Glycan BEHAmide柱。

在另一优选例中，所述色谱分析的参数流速为0.1-0.8ml/min，较佳地为0.2-0.6ml/min，更佳地为0.4ml/min。

在另一优选例中，所述色谱分析的参数检测波长为ex＝373nm em＝448nm。

在另一优选例中，所述色谱分析的参数运行时间为8-20分钟，较佳地为12分钟。

在另一优选例中，所述色谱分析的参数进样量为0.2-15μl，较佳地为5μl。

在另一优选例中，所述色谱分析的参数进样盘温度为10℃以下，较佳地为4℃。

在另一优选例中，所述色谱分析的流动相包含水相和有机溶剂。

在另一优选例中，所述水相中添加有缓冲盐。

在另一优选例中，所述水相的起始比例不高于40％，最佳地为15％。

在另一优选例中，所述色谱分析的流动相中的有机溶剂选自：甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、或其组合。

在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和乙腈。

在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和甲醇。

在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和乙醇。

在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和丙醇。

在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)酸水解试剂；

(2)标记试剂；

(3)任选的标准品和/或标准曲线，所述标准品选自NGNA、NANA或其组合；和

(4)描述利用(1)所述酸水解试剂进行酸水解和利用(2)所述标记试剂进行唾液酸标记的使用说明书。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为唾液酸DMB标记反应原理。

图2显示了BEH Amide色谱柱分离的效果以及本发明方法专属性图谱。

图3显示了Glycan BEH Amide梯度优化后进样精密度。

图4显示了本发明方法检测标准品具有较宽的线性范围，其中图4A显示了NANA线性，图4B显示了NGNA线性。

图5显示了本发明方法检测限及定量限图谱。

图6显示了唾液酸标准品与进样量线性，其中图6A显示了NANA进样量线性，图6B显示了NGNA进样量线性。

图7显示了唾液酸标准品不同进样量图谱。

图8显示了蛋白处理量(μg)与唾液酸检测峰面积线性图。

图9显示了不同处理量下的唾液酸检测图谱。

图10显示了准确度实验图谱。

图11显示了本发明方法重复性图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，优化了样品处理流程及色谱分离方法，首次意外地发现，唾液酸DMB标记后的亲水相互作用色谱分离模式(HILIC)，色谱条件简单，重现性好，对蛋白药物中主要的两种唾液酸(NANA及NGNA)具有较好的分离效果；本发明人优化了蛋白样品的处理方式，酸解及标记结束后加入有机溶剂能有效去除样品中的蛋白，同时能够避免溶剂效应，并且专属性及重现性良好，耐受性较强，灵敏度高，10pmol的唾液酸检测信噪比远大于3；标准品的处理与样品同步进行，定量准确度高。此外，采用本发明，不仅可显著提高检测的效率及准确性，还使得每个样品的检测成本大幅下降。在此基础上完成了本发明。

本发明方法可以对目前的所有蛋白类药物包括唾液酸含量较少的单抗药物进行唾液酸准确定量分析，为药物的构效关系研究及质量控制提供依据。

术语

本发明中提及的缩略词与全称见下表1。

表1.缩略词与全称

唾液酸含量的检测方法

本发明提供了一种唾液酸含量的检测方法。它包括：(a)提供样品：(b)酸解；(c)标记：(d)预处理；(e)色谱分析：上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；(f)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

生物体内唾液酸种类丰富繁多，但蛋白药物根据不同的宿主细胞，主要为NANA及NGNA，而CHO细胞系表达的蛋白中，唾液酸修饰以NANA为主，本发明采用DMB试剂对酸解释放的唾液酸进行标记反应，之后采用FLD-HILIC-UHPLC方法对蛋白中的NANA及NGNA进行外标一点法定量检测。其他类型的唾液酸也可在此基础上进行检测定量。

在本发明中，采用酸(如乙酸)将糖蛋白中NGNA和NANA水解下来，并采用DMB进行荧光标记(反应机理如图1所示)，并经特殊处理后用亲水色谱分离进行分离(如通过FLD-UHPLC)，从而准确地获得NGNA和NANA的定量分析结果。

典型地，本发明的检测方法包括以下步骤：取适量蛋白，酸解一段时间(如约1-6小时，如2小时)，接着采用DMB等标记物进行标记(如0.5-6小时)；之后对标记产物进行特定的预处理(如加入乙腈沉淀蛋白，并取上清)，然后进行亲水相互作用色谱分析。

一个典型的本发明方法包括：(a)提供样品：如下配置蛋白样品溶液：取蛋白500μg，加水至25μl；(b)酸解：加入25μl 4M乙酸，80℃反应2小时，每隔30分钟，瞬离一次；(c)标记：上一反应结束后，再加入已分装的DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时；(d)预处理：上一反应结束后，加入400μl乙腈，充分涡旋振荡混匀，13000r/min离心5分钟，取上清；(e)色谱分析：上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；(f)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

预处理

在本发明的预处理步骤中，优选的(预)处理剂包括乙腈或含乙腈的混合溶剂，特别优选的是乙腈。

在本发明中，所述的含乙腈的混合溶剂指乙腈与其他溶剂构成的混合溶剂，所述其他溶剂选自下组：甲醇、乙醇、DMSO、异丙醇、或其组合。在混合溶剂中，乙腈的含量通常≥30％，较佳地≥50％，更佳地≥70％或90％，按混合溶剂的总体积计。

在本发明中，在预处理步骤中，预处理剂(如乙腈)的添加量应能够使得预被处理的混合液中的蛋白能够基本上(通常≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％)发生沉淀或析出，而经标记的NGNA和NANA基本上(通常≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％)仍保留在溶液中。

典型地，在所述的预处理混合物中，预处理剂(如乙腈)的用量(终浓度)应不低于60％，如60％-95％(终浓度)，较佳地为80％，按预处理混合物的总体积计。

在本发明中，所述的预处理时间没有特别限制，通常为2-120分钟，较佳地5-30分钟。

在本发明中，所述的预处理的温度没有特别限制，通常为室温，如4-35℃，或15-25℃。

本发明的研究表明，在预处理步骤，优选的处理剂为乙腈或含乙腈的混合溶剂，特别优选的是乙腈。若不加乙腈，无法有效沉淀去除蛋白。此外，采用乙腈作为处理剂时，可在亲水色谱时有效避免出现溶剂效应。

色谱检测

本发明方法的一个特征是对经预处理的样品进行亲水相互作用色谱分析。

在本发明中，可以采用市售的或常规方法制备的亲水相互作用色谱柱进行亲水色谱分析检测。代表性的例子包括(但并不限于)：BEH amide柱，聚糖BEH柱等。一些典型的市售的BEH amide柱包括聚糖BEH amide柱，例如Waters Glycan BEH Amide柱。

在本发明中，可按亲水相互作用色谱相应的洗脱条件或厂商建议的条件下进行色谱分离。优选地，可采用乙腈与水的梯度洗脱液进行洗脱。

唾液酸含量检测试剂盒

本发明还提供了一种唾液酸含量检测试剂盒。通常，本发明试剂盒包括：

(1)酸水解试剂；

(2)标记试剂；

(3)任选的标准品和/或标准曲线，所述标准品选自NGNA、NANA或其组合；和

(4)描述利用(1)所述酸水解试剂进行酸水解和利用(2)所述标记试剂进行唾液酸标记的使用说明书。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明方法色谱条件简单，重现性好，对蛋白药物中主要的两种唾液酸(NANA及NGNA)具有较好的分离效果；

(2)本发明方法酸解及标记结束后加入有机溶剂能有效去除样品中的蛋白，同时能够避免溶剂效应；

(3)本发明方法准确可靠、专属性及重现性良好、(具有较好的稳定性、耐受性较强)、灵敏度较高，10pmol的唾液酸检测信噪比远大于3；

(4)唾液酸标准品与蛋白样品同步处理，定量准确度高，方法加标回收率较高；

(5)本发明方法对蛋白样品和唾液酸标准品同步进行酸解和标记处理，提高了方法的准确性；

(6)检测成本低，按每个样品的检测成本不高于人民币20元。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和通用方法

1试剂

本发明中用到的试剂信息如下表2所示。

表2试剂信息

2.材料、实验样品与仪器设备

本发明中用到的材料、实验样品和仪器设备信息分别见下表3-5。

表3材料信息

表4样品信息

表5仪器设备信息

2.通用方法

样品处理

酸解-标记-预处理-亲水色谱

取蛋白样品500μg，加水至25μl，之后加入25μl 4M乙酸混匀，80℃反应2小时，再加入已分装的标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，反应结束后加入400μl乙腈，混匀后13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。

标准品溶液配制

标准品溶液配制处理如下：取已分装的1μmol NANA及NGNA，于同一离心管，加入980μl超纯水混匀得到1nmol/ml。混标样品作为标准品溶液1。

取100μl标准品溶液1，加入900μl超纯水，得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混标样品，作为标准品溶液2。

取10μl标准品溶液2(1nmol)，加入15μl超纯水，加入25μl 4M乙酸，80℃酸解2小时，反应结束后加入已分装的DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，之后，加入400μl乙腈终止反应，13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。

空白处理

取25μl超纯水,分别加入25μl 4M乙酸，80℃酸解2小时，反应结束后加入已分装的DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，之后，加入400μl乙腈终止反应，13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。

色谱检测

色谱柱Waters Glycan BEH Amide；流速0.4ml/min；检测波长ex＝373nm,em＝448nm；运行时间12分钟；进样量5μl。进样盘温度设置4℃。洗脱梯度如表2所示。

判断标准

NANA及NGNA具有较好的分离度，出峰位置无明显干扰，且具有高稳定性。

实施例1亲水色谱柱分离的效果及专属性考察

取蛋白样品500μg，加水至25μl，之后加入25μl 4M乙酸混匀，80℃反应2小时，再加入已分装的标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，反应结束后加入400μl乙腈，混匀后13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。

色谱参数为：色谱柱Waters Glycan BEH Amide；流速0.4ml/min；检测波长ex＝373nm,em＝448nm；运行时间12分钟；进样量5μl。进样盘温度设置4℃。洗脱液为乙腈/水的梯度洗脱液(85/15)。色谱分析洗脱梯度如表6.

表6 BEH amide的洗脱梯度

时间	流速	ACN(％)
				0.0	0.4	85	15
4.5	0.4	85	15
				4.6	0.4	40	60
6.0	0.4	40	60
				6.1	0.4	85	15
12.0	0.4	85	15

Waters Glycan BEH Amide色谱柱分离的效果如图2所示。结果表明，相比反相色谱分离模式，采用HILIC模式对于唾液酸的分离具有明显的优势，空白溶液在NANA及NGNA出峰位置无明显干扰，两者的分离度大于4。

专属性考察结果如图2所示。空白溶液中，NANA及NGNA出峰位置无显著干扰，IBI301a20150601WR，IBI303c20130301及IBI305e20130902三批不同项目蛋白样品在NANA及NGNA出峰位置附近无其他明显干扰峰，表明本发明的专属性非常好。

实施例2进样精密度实验

重复实施例1，制备1nmol的唾液酸标准品，连续进样6次，考察峰面积及保留时间的稳定性。

实验结果表明，连续进样6次实验的保留时间基本相同。

进样精密度实验结果如表7所示。

表7进样精密度结果

次数	NANA RT	NANA面积	NGNA RT	NGNA面积
					1	3.00	396213	3.70	410972
2	3.00	390613	3.70	407435
					3	3.00	393292	3.71	410560
4	3.00	391216	3.70	406978
					5	3.00	386582	3.70	402065
6	3.00	389568	3.70	404223
					平均值	3.00	391247	3.70	407039
RSD(％)	0.0	0.8	0.1	0.9

实验结果表明，连续六次进样的NANA及NGNA的峰面积及相对保留时间非常稳定(RSD均不大于1.0％)。

进样精密度结果如图3所示，NANA及NGNA保留时间非常稳定，表明色谱梯度较佳。

实施例3唾液酸标准品线性考察

唾液酸标准品处理

取已分装的1μmol NANA及NGNA，各取10μl于同一离心管，加入980μl超纯水混匀得到1μmol/ml混标样品作为标准品储备1，取100μl储备1加入900超纯水得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混标样品作为标准品储备2，取100μl储备2加入900超纯水得到0.01μmol/ml的NANA及NGNA的混标样品作为标准品储备3，按照表8制备不同摩尔量的标准品溶液，80℃酸解2小时，反应结束后加入已分装的标记试剂50μl,50℃避光反应2小时，之后加入400μl乙腈终止反应，13000r/min离心5分钟取上清色谱分析。

表8标准品线性样品制备

色谱检测

色谱柱Waters Glycan BEH Amide；流速0.4ml/min；检测波长ex＝373nm em＝448nm；运行时间12分钟；进样量5μl。进样盘温度设置4℃。

标准品线性实验结果如表9和图4所示。其中图4A显示了NANA线性，图4B显示了NGNA线性。

表9标准品线性检测结果

结果表明，唾液酸标准品处理量在0.01nmol～10nmol的范围内线性相关系数r均大于0.999，表明该方法检测标准品具有较宽的线性范围。

实施例4检测限及定量限考察

重复实施例3，采用线性梯度的标准品，进行检测限及定量限考察。

结果如图5所示。NANA及NGNA出峰位置无显著干扰，再次提示，本发明方法的专属性非常好。

根据线性的实验结果，唾液酸标准品0.01nmol为线性最低量(下限)，且信噪比大于3，确定为该方法的检测限。唾液酸标准品0.03nmol的信噪比大于10，确定为该方法的优选的定量限。

实施例5进样量线性考察

重复实施例3，制备1nmol的唾液酸标准品，考察不同进样量与峰面积的线性关系。

实验结果如表10和图6所示。

表10唾液酸标准品不同进样量考察结果

进样量(μl)	NANA面积	NGNA面积
			0.25	20460	21151
0.5	36638	37533
			1	76924	80107
5	389401	406572
			10	778701	814052
15	1162498	1217060
			相关系数r	1.0000	1.0000

结果表明，进样量从0.25μl到15μl范围内，NANA及NGNA的峰面积均呈线性增加，相关系数r均大于0.999。

另外峰型并未受进样量增大而受影响(如图7所示).

这些结果表明，本发明方法的进样量有较大的线性范围。

实施例6稳定性考察

在本实施例中，采用通用方法或各实施例方法制备唾液酸标记物、唾液酸分装标准品、DMB标记溶液，并考察其稳定性。

结果表明：

(1)NANA及NGNA标记物在4℃放置5天峰面积未见显著变化，回收率均在90％～110％范围内，标准品标记后4℃稳定性良好。

(2)NANA及NGNA分装标准品在-20℃保存2个月未见显著变化，回收率均在85％～115％范围内，标准品-20℃稳定性良好。为了有效期，可考虑将分装的1μmol的唾液酸标准品-80℃保存。

(3)DMB标记溶液在-20℃保存超过一天就有显著变化，标记效率明显下降，建议新鲜配置DMB标记溶液。

实施例7蛋白样品处理量线性考察

在本实施例中，取不同量的待测样品，按实施例1方法进行酸解、标记、预处理和亲水色谱，从而考察蛋白样品处理量线性。

方法：分别取待测蛋白(b20140202批次蛋白)50μg，100μg，200μg，500μg，800μg，1000μg离心管中,加水至25μl，加入25μl 4M乙酸，80℃反应2小时，再加入已分装的DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，反应结束后加入400μl乙腈，混匀13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。

实验结果如图8和9所示。

结果表明，待测蛋白(IBI302b20140202)样品中NANA含量较高，蛋白处理量从50μg到1000μg范围内，NANA的峰面积呈线性增加，峰面积与样品处理量相关系数r为0.9976，表明本发明方法的样品处理量有较大的线性范围。

NGNA因含量较低，50μg蛋白处理量无法检测到，线性较差。根据该线性结果，样品处理量可根据浓度及样品量做适当调整。若样品浓度较低或样品量较少时可减少样品的处理量进行检测；若蛋白唾液酸含量较低，为了提高灵敏度，也可根据项目需求增加样品的处理量。

实施例8准确度考察

在本实施例中，进一步考察本发明方法的准确度。

1.步骤：

标准品溶液：取已分装的1μmol NANA及NGNA，于同一离心管，加入980μl超纯水混匀得到1μmol/ml混标样品作为标准品溶液1，取100μl标准品溶液1加入900超纯水得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混标样品作为标准品溶液2，取100μl标准品溶液2加入900超纯水得到0.01μmol/ml的NANA及NGNA的混标样品作为标准品溶液3，取10μl标准品溶液3(0.1nmol)，加入15μl超纯水，加入25μl 4M乙酸，80℃酸解2小时，反应结束后加入已分装的DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，之后加入400μl乙腈终止反应，13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。平行制备三份样品。

样品溶液：分别取待测蛋白(c20130301批次)蛋白500μg，加水至25μl，之后加入25μl 4M乙酸混匀，80℃反应2小时，再加入已分装的标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，反应结束后加入400μl乙腈，混匀后13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。平行制备三份样品。

加标样品溶液：分别取待测蛋白(c20130301批次蛋白)500μg，加入10μl标准品溶液3，加超纯水至25μl，之后加入25μl 4M乙酸混匀，80℃反应2小时，反应结束后加入DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，反应结束后加入400μl乙腈，混匀13000r/min离心10 5分钟，取上清色谱分析。平行制备三份样品。

2.结果

准确性实验结果如表11和图10所示。

表11准确度结果

结果表明，0.1nmol NANA及NGNA的加标回收率均在80％-120％范围内，表明该方法具有较好的准确性。其中回收率计算公式为：(加标回收率样品平均峰面积-样品检测平均峰面积)/标准品检测平均峰面积*100％。

实施例9精密度考察

在本实施例中，进一步考察本发明方法的精密度。

1.步骤：

标准品溶液：取已分装的1μmol NANA及NGNA，于同一离心管，加入980μl超纯水混匀得到1μmol/ml混标样品作为标准品溶液1，取100μl标准品溶液1加入900超纯水得到0.1μmol/ml的NANA及NGNA的混标样品作为标准品溶液2，取10μl标准品溶液2(1nmol)，加入15μl超纯水，加入25μl 4M乙酸，80℃酸解2小时，反应结束后加入已分装的DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，之后加入400μl乙腈终止反应，13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析。平行制备三份样品。

蛋白样品溶液：取待测蛋白(b20140202批次蛋白)500μg，加水至25μl，之后加入25μl 4M乙酸，80℃反应2小时，每隔30分钟，瞬离一次，反应结束后再加入已分装的DMB标记试剂50μl，50℃避光反应2小时，反应结束后加入400μl乙腈，充分涡旋振荡混匀，13000r/min离心5分钟，取上清色谱分析，平行制备六份样品，检测唾液酸摩尔比，考察方法精密度。

2.试验结果

精密度结果见表12及图11所示。

表12精密度结果

结果表明，由两名实验人员不同天做重复性试验，NANA及NGNA的检测结果均符合要求，两次重复实验各六组数据NANA含量的RSD均小于5％，NGNA含量因较低，RSD均小于10％；总共12组数据NANA及NGNA含量的RSD均小于10％，表明方法具有很好的精密度。

实施例10耐受性考察

重复实施例11(精密度考察)，制备标准品及样品分别用不同色谱柱及不同仪器进行检测，考察方法的耐受性。结果如表13所示。

表13耐受性结果

结果表明，不同色谱柱及不同仪器对待测蛋白(IBI302b20140202)进行唾液酸检测无明显差异，均在可接受范围内，表明方法对色谱柱及仪器的耐受性较好。

实施例11唾液酸含量检测试剂盒

制备唾液酸含量检测试剂盒，其组成及配制方法如下表14所示。

表14.唾液酸含量检测试剂盒制备

结论

本研究建立了唾液酸含量FLD-UHPLC的检测方法，确定了蛋白的处理量为500μg，酸解2小时后采用DMB标记2小时，之后加入乙腈沉淀蛋白取上清色谱分析。

本发明方法的专属性、检测限、线性、准确性、精密度及稳定性等结果，汇总于表15。

表15汇总分析表

结果表明：

(1)空白溶液在NANA及NGNA出峰位置无明显干扰，方法具有非常好的专属性；

(2)标准品在0.01nmol～10nmol具有优良的线性关系；

(3)唾液酸标准品0.01nmol的信噪比均大于3，设为方法的检测限，表明方法具有很高的灵敏度；

(4)各批次样品在唾液酸0.1nmol水平的加标回收率在80％～120％范围内，方法具有较好的准确性；

(5)不同人员不同日期测定12份平行样本唾液酸含量RSD小于10％，提示本发明方法具有较好的精密度；

(6)DMB标记后的样品在4℃放置5天依然稳定；

(7)分装的1μmol唾液酸标准品-20℃放置2个月依然稳定；

(8)不同仪器及不同色谱柱对检测结果无显著影响，方法具有较好的耐受性。

此外，本发明研究还发现，样品浓缩脱盐会造成蛋白的一定损失，从而影响唾液酸含量检测值，因此优选取消脱盐步骤。酸解过程中反应体积较小仅50μl，高温条件下溶液会蒸发，导致唾液酸水解不充分，应该定时瞬离样品，使乙酸溶液处于离心管底部，保证唾液酸充分水解。蛋白处理量优选在50μg-1000μg范围内。

对比例1

脱盐-酸解-标记-反向色谱(对照方法)

取测试样品500μg，加水至500μl，13000r/min离心15min进行超滤浓缩脱盐，之后回收蛋白(约20μl)，加入200μl 2M乙酸，80℃反应2小时，反应结束后13000r/min离心10分钟，取上清100μl，再加入已分装的DMB标记试剂100μl，50℃避光反应2小时，反应结束后离心，取上清，进行反向色谱分析。

反向色谱分析的条件：色谱柱Waters BEH C18；流速0.25ml/min；检测波长ex＝373nm em＝448nm；流动相ACN/MeOH/H₂O 9/7/84；运行时间10分钟；进样盘温度设置4℃。并根据实验结果进行实时调整。

结果

检测结果表明，采用反向色谱分析时，当流速为0.25ml/min时，NANA及NGNA出峰位置可以实现基线分离，但分离度约为1.5；当流速降为0.2ml/min，出峰时间虽有延后，分离度没有改善，仍为约1.5，难以达到准确检测的分离度要求。

此外，反向色谱分析还具有如下缺点：

1)处理后的样品无法彻底去除蛋白，会显著缩短色谱柱的寿命，每次样品分析后需要较长时间的色谱柱冲洗。

2)标记试剂与杂质峰可能会影响唾液酸分离及鉴定，标准品保留时间会发生漂移，重现性不好，方法的耐受性较差。

3)唾液酸高温条件下会有降解，外标定量准确度较低。

实施例12采用不同溶剂作为预处理剂进行预处理

重复实施例1，不同点在于，采用不同的溶剂替代乙腈作为预处理剂，用量为400μl。

结果表明，大多数溶剂无法进行有效进行预处理且分离度不高。C1-C3烷醇可以用于预处理，但是存在一定的溶剂效应。

按处理效果排序，(a)乙腈＞(b)乙腈与C1-C3烷醇的混合溶剂(其中，在混合溶剂中，乙腈的含量通常≥30％，较佳地≥50％，更佳地≥70％或90％，按混合溶剂的总体积计)＞C1-C3烷醇(如异丙醇、乙醇、甲醇)，其中，“＞”表示“优于”。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对蛋白的唾液酸含量进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供一待分析样品，其中含有待分析蛋白；

(2)对步骤(1)中的样品进行酸水解，得到酸水解产物；

(3)对(2)中所述的酸水解产物用标记试剂进行标记，获得经标记的混合物；

(4)用有机溶剂对所述经标记的混合物进行色谱预处理，获得预处理的混合物；

(5)将所述预处理的混合物上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；

(6)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述酸水解所用酸选自下组：乙酸、三氟乙酸、硫酸、盐酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待分析蛋白为抗体蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待分析蛋白为融合蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记试剂选自：4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)，或具有式I结构的标记化合物：

式中，

化合物1，X＝O，R＝CH₃；

化合物2，X＝O，

化合物3，X＝NH，R＝H；

化合物4，X＝NH，R＝CH₃；

化合物5，X＝NH，

化合物6，X＝NH，

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、DMSO、异丙醇、或其组合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为BEH amide柱。

8.如权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于，所述色谱分析的参数流速为0.1-0.8ml/min，较佳地为0.2-0.6ml/min，更佳地为0.4ml/min。

9.如权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于，所述色谱分析的流动相包含水相和有机溶剂。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)酸水解试剂；

(2)标记试剂；

(3)任选的标准品和/或标准曲线，所述标准品选自NGNA、NANA或其组合；和

(4)描述利用(1)所述酸水解试剂进行酸水解和利用(2)所述标记试剂进行唾液酸标记的使用说明书。