CN109856269A - 一种乳粉中游离唾液酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乳粉的质量控制领域，具体涉及一种乳粉中游离唾液酸的检测方法，包括如下步骤，将提取得到的游离唾液酸用邻苯二胺进行衍生化，然后利用高效液相色谱进行检测；衍生化的反应体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧剂，高效液相色谱检测的过程中以硫酸和乙腈的混合液作为流动相。本发明用硫酸与乙腈的混合液作为流动相，硫酸中的杂质含量少，检测的过程中杂峰少，可保证检测的准确性。为进一步地提高检测的准确性，本申请在衍生化体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧化剂，这种抗氧化剂的添加既可防止邻苯二胺因氧化而导致副反应的发生，而且它被被氧化后转化成硫酸根，与液相检测中的流动相相同，有利于进行准确地检测。

Description

一种乳粉中游离唾液酸的检测方法

技术领域

本发明涉及乳粉的质量控制领域，具体涉及一种乳粉中游离唾液酸的检测方法。

背景技术

唾液酸(SA)，化学名为“N-乙酰基神经氨酸”，具有吡喃糖结构，是一种天然的碳水化合物，在人体的脑组织中唾液酸含量最高。唾液酸通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸广泛存在于多种生物组织中，是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分。在大部分哺乳动物组织中，发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸，所以通常把N-乙酰神经氨酸称为唾液酸，它参与细胞表面的多种生理活性。另外，唾液酸是一种天然的大脑营养素，它能促进婴儿的记忆力和智力发育，因此，唾液酸被添加在很多婴幼儿奶粉中。

当前SA含量分析的方法研究主要有直接法和间接法。直接法以GB/T 30636-2014和药典方法为代表。首先对样品(燕窝或者乳粉)在一定浓度的酸性条件下使SA游离出来，获得含SA的样品液，离心取上清，采用离子交换型有机酸树脂液相色谱柱进行紫外检测。但是该法对唾液酸及其相关低聚糖无法有效区分：唾液酸和唾液酸低聚糖都含有游离羧基，利用离子交换型的有机酸树脂无法有效分离唾液酸和唾液酸低聚糖，产生检测含量比实际含量高的误差。对于唾液酸含量少的蛋白产品(如乳粉等)则无法有效测量。

间接法通过衍生试剂对SA进行衍生化产生荧光标记，采用反相色谱柱，在合适的色谱条件下分离，用激发波长激发衍生物，衍生物产生发射波长，利用发射波长检测衍生物。衍生试剂的代表有二氨基亚甲基二氧基苯(DMB)及间苯二酚(DBS)等。间接法的存在如下缺点：1)衍生试剂易被氧化，在衍生时不加保护剂，容易造成衍生试剂自氧化而引入干扰物质；2)流动相为：1.0％的四氢呋喃水溶液(含质量分数0.2％磷酸)-乙腈(92∶8)。四氢呋喃易氧化，它作为流动相使用的过程中自身带有的抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，也会引入不必要的干扰物；3)样品制样时引入有机溶剂，在色谱分离时产生溶剂效应，导致检测样品的保留时间发生漂移；4)处理后的样品含有蛋白杂质，会影响干扰检测，并缩短色谱柱寿命。

综上所述，本领域缺乏对乳粉制品中游离唾液酸进行检测的方法。在乳粉中添加SA后，由于乳粉中含有唾液酸的低聚糖、糖脂或者糖蛋白以及大量的水溶性蛋白，游离SA的检测更加复杂。当前乳粉中游离唾液酸的准确的检测方法几乎缺失。为了克服乳粉种游离唾液酸干扰物多(尤其是不受唾液酸低聚糖等唾液酸衍生物的干扰)的问题，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳粉中唾液酸的检测方法，包括如下步骤：将提取得到的游离唾液酸用邻苯二胺进行衍生化，然后利用高效液相色谱进行检测；

衍生化的反应体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧剂，高效液相色谱检测的过程中以硫酸和乙腈的混合液作为流动相。

唾液酸是含有吡喃糖环的天然产物，在溶液中存在椅式构象和链式构象的构象转化平衡。链式构象是一种邻酮酸活性结构，有酮酸构象的唾液酸与邻苯二胺在酸性条件下发生脱水缩合反应，生成苯并喹喔啉类的唾液酸衍生物，唾液酸的衍生物具有强紫外吸收的特性，可进行进一步的检测。

针对于本申请衍生化后所得的产物，本发明用硫酸与乙腈的混合液作为流动相，这种流动相既可进行有效地分析，而且硫酸中的杂质含量少，检测的过程中杂峰少，可保证检测的准确性。为进一步地提高检测的准确性，本申请在衍生化体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧化剂，这种抗氧化剂的添加既可防止邻苯二胺因氧化而导致副反应的发生，而且它被被氧化后转化成硫酸根，与液相检测中的流动相相同，不会产生新的杂质峰，有利于进行准确地检测。

优选的，所述抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。

优选的，衍生化在由硫酸提供的酸性环境中进行。硫酸是液相色谱检测中的流动相，用硫酸提供酸性环境不会引入其他的杂质离子，可保证后续检测的准确性。

优选的，所述流动相为浓度5mM的H₂SO₄和乙腈的混合溶液，5mM的H₂SO₄和乙腈的体积比9：0.8～1.2。该流动相组分简单，无过多杂质干扰，洗脱基线平稳，抗干扰能力强。

更优选的，所述流动相为浓度5mM的H₂SO₄和乙腈的混合溶液，5mM的H₂SO₄和乙腈的体积比9：1。

优选的，所述高效液相色谱检测的过程中选择C₁₈柱；

进一步优选的，控制柱温为30～40℃。

优选的，采用有机溶剂提取法提取乳粉中的游离唾液酸；使用有机溶剂提取，可极大的减少提取物中蛋白质的含量，剔除了蛋白质对检测方法的影响。

进一步优选的，所述有机溶剂为乙醇、丙酮或甲醇的水溶液，所述有机溶液的水溶液的体积浓度为70～90％。

优选的，有机溶剂提取法具体包括如下步骤：

1)将乳粉与有机溶剂按质量体积比1:2～20混合，在60～80℃的条件下水浴加热20～40min，冷却后离心取上清液；

2)将所述上清液经微孔滤膜过滤，将所得滤液中的溶剂挥干，得游离唾液酸的粉末；

3)用水对所述游离唾液酸的粉末进行复溶，用微孔滤膜对其再次进行过滤，即得含有游离唾液酸的滤液。

优选的，所述衍生化具体为：将步骤3)制备得到滤液添加到邻苯二胺的溶液中，所述溶液中添加有亚硫酸基团的抗氧化剂，用浓硫酸将体系的酸度调整至pH≤2；将上述体系在60～100℃下水浴加热0.5～3h。为使唾液酸充分地衍生化，在检测之前通常会添加稍过量的邻苯二胺，邻苯二胺的出峰时间在3.542min，检测物出峰时间在5.865min，液相色谱分析的过程中二者实现了有效的分离，不会相互干扰。

作为优选的操作方式，本发明的方法包括如下步骤：

1)将乳粉与有机溶剂按质量体积比1:2～20混合，在60～80℃的条件下水浴加热20～40min，冷却后离心取上清液；

2)将所述上清液经微孔滤膜过滤，将所得滤液中的溶剂挥干，得游离唾液酸的粉末；

3)用水对所述游离唾液酸的粉末进行复溶，用微孔滤膜对其再次进行过滤，即得含有游离唾液酸的滤液；

4)将步骤3)制备得到滤液添加到邻苯二胺的溶液中，所述溶液中添加有亚硫酸基团的抗氧化剂，用浓硫酸将体系的酸度调整至pH≤2；将上述体系在60～100℃下水浴加热0.5～3h，得衍生化后的唾液酸待测样品；

5)将所述衍生化后的样品进行液相色谱检测，检测的条件为色谱柱：C18，250×4.6mm；柱温：30～40℃；流动相：5mM H₂SO₄：乙腈＝9:1。

液相色谱检测的过程中，进样量：5μL；流速：1ml/min；检测波长：DAD检测器，210nm或230nm，优选230nm。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明可有效地防止衍生化过程中副反应的发生。抗氧化剂焦亚硫酸钠及亚硫酸钠和pH调节剂H₂SO₄均不会对唾液酸(SA)衍生物的HPLC的检测产生额外的干扰。唾液酸(SA)在邻苯二胺衍生唾液酸阶段，在不增加干扰物质的情况下选择氧化保护剂，防止邻苯二氨被氧化而影响唾液酸的检测结果。流动相采用5mM H₂SO₄-乙腈(9:1)体系替代1.0％的四氢呋喃水溶液(含质量分数0.2％磷酸)-乙腈(92∶8)体系，剔除了四氢呋喃及其保护剂BHT的影响。通过上述两个措施，有效的剔除了体系中的易氧化物质造成的干扰，减少了不必要的干扰峰，实现了检测峰的有效分离。

2)利用唾液酸的高溶解性，并结合除蛋白的方法，采用友好的有机溶液溶体提取唾液酸，萃取效率提高，减少了蛋白杂质的干扰，同时有效地保护了色谱柱。唾液酸游离唾液酸在溶液中存在构象平衡，而唾液酸低聚糖等唾液酸衍生物则不存在构象平衡。利用唾液酸的酮酸链式构型与邻苯二胺进行显色反应，有效的避免了唾液酸低聚糖及唾液酸其他衍生物的干扰，提高了检测精度。唾液酸衍生过程中无有机溶剂参与反应，消除了在色谱分离时产生的溶剂效应。

附图说明

图1为本发明所述检测方法的标准曲线；

图2为标准品的液相色谱图；

图3为待检测样品的液相色谱图；

图4为对比例1的方法检测时得到的液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例涉及一种乳粉中唾液酸的检测方法，包括如下步骤：

1)标准曲线的测定：精确配制唾液酸10g/L的标准液100ml。分别精确量取唾液酸储备液0.1，0.5，1，2.5，5，10mL，置于100mL容量瓶中，再加入质量浓度1mg/mL的邻苯二胺溶液和0.01mol/L的亚硫酸钠溶液各10mL，最后加浓硫酸10ml，于温度80℃下水浴加热2h，取出冷却，用水稀释并定容至100mL，获得质量浓度为10，50，100，250，500，1000μg/mL的唾液酸标准溶液。将上述标准溶液采用本发明所述的液相色谱法进行检测，检测条件为a.色谱柱：C18，250×4.6mm；b.柱温：30℃；c.流动相：5mM H₂SO₄：乙腈＝9:1；d.进样量：5μL；e.流速：1ml/min；f.检测波长：DAD检测器230nm，根据标准溶液的浓度和所得峰面积绘制标准曲线，如图1和图2所示。

2)乳粉样品制备：配制80％的丙酮溶液备用。称取2g乳粉样品置入具塞比色管，加入10ml的80％丙酮溶液，具塞摇匀，50℃水浴1h，然后超声60s，冷却静置。取上层液体微孔滤膜过滤，得含SA的丙酮清液。丙酮清液于40℃挥发干。然后用水复溶，过滤得含有游离SA的水样。按照与步骤1)相同的方法进行衍生化和检测测得乳粉中的游离唾液酸衍生物(其结果见图3)。

实施例2

精密度检测：分别取0.5g/L和0.75g/L的游离唾液酸溶液进行衍生化反应，然后进行HPLC检测。

表1精密度结果

由以上数据可以看出，本发明的方法精密度高，具有较好的平行性。

实施例3

回收率检测：以不含游离唾液酸的乳清粉作为奶粉样本，分别配制含游离唾液酸1g/Kg的试验样品，分别进行回收率实验。

表2乳清粉中SA加样回收实验结果

由上述的回收率的数据可知，本发明的方法可有效地提取和检测乳粉中唾液酸的含量。

对比例1

采用文献“婴幼儿配方乳粉中唾液酸含量的测定来源”中所公开的方法测定乳粉中的唾液酸，其结果见图4，上述文献的著录信息为：[J].西北大学学报(自然科学版)，2014,44(4):583-587：钱振杰，张恒。由图4可以看出，采用传统的检测杂峰多，干扰物质多，分离度差，不利于检测物和干扰的有效区分。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种唾液中游离唾液酸的检测方法，其特征在于，将提取得到的游离唾液酸用邻苯二胺进行衍生化，然后利用高效液相色谱进行检测；

衍生化的反应体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧剂，高效液相色谱检测的过程中以硫酸和乙腈的混合液作为流动相。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含有亚硫酸基团的抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。

3.根据权利要求1或2的所述的检测方法，其特征在于，衍生化过程在由硫酸提供的酸性环境中进行。

4.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相为浓度5mM的H₂SO₄和乙腈的混合溶液，5mM的H₂SO₄和乙腈的体积比9：0.8～1.2。

5.根据权利要求1～4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的过程中选择C₁₈柱；优选的，控制柱温为30～40℃。

6.根据权利要求1～5任一项所述的检测方法，其特征在于，采用有机溶剂提取法提取乳粉中的游离唾液酸；优选的，所述有机溶剂为乙醇、丙酮或甲醇的水溶液，所述有机溶液的水溶液的体积浓度为70～90％。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，

1)将乳粉与有机溶剂按质量体积比1:2～20混合，在60～80℃的条件下水浴加热20～40min，冷却后离心取上清液；

2)将所述上清液经微孔滤膜过滤，将所得滤液中的溶剂挥干，得游离唾液酸的粉末；

3)用水对所述游离唾液酸的粉末进行复溶，用微孔滤膜对其再次进行过滤，即得含有游离唾液酸的滤液。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述衍生化具体为：将步骤3)制备得到滤液添加到邻苯二胺的溶液中，所述溶液中添加有亚硫酸基团的抗氧化剂，用浓硫酸将体系的酸度调整至pH≤2；将上述体系在60～100℃下水浴加热0.5～3h。

9.根据权利要求1～8任一项所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将乳粉与有机溶剂按质量体积比1:2～20混合，在60～80℃的条件下水浴加热20～40min，冷却后离心取上清液；

2)将所述上清液经微孔滤膜过滤，将所得滤液中的溶剂挥干，得游离唾液酸的粉末；

3)用水对所述游离唾液酸的粉末进行复溶，用微孔滤膜对其再次进行过滤，即得含有游离唾液酸的滤液；

4)将步骤3)制备得到滤液添加到邻苯二胺的溶液中，所述溶液中添加有亚硫酸基团的抗氧化剂，用浓硫酸将体系的酸度调整至pH≤2；将上述体系在60～100℃下水浴加热0.5～3h，得衍生化后的唾液酸待测样品；

5)将所述衍生化后的样品进行液相色谱检测，检测的条件为色谱柱：C18，250×4.6mm；柱温：30～40℃；流动相：5mM H₂SO₄：乙腈＝9:1。