CN111474268B - 一种膦甲酸钠及其杂质的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种膦甲酸钠及其杂质的高效液相色谱检测方法，所述方法在制备供试品溶液和系统适用性溶液时使用冰醋酸润湿膦甲酸钠，可有效减少杂质D的降解，实现杂质D与杂质A、B、C等的联合检测，极大简化了分析方法，提高膦甲酸钠有关物质检查的分析效率。
Description
【技术领域】
本发明涉及药物检测领域，具体而言，涉及一种膦甲酸钠及其杂质的高效液相色谱检测方法。
【背景技术】
膦甲酸钠(Foscarnet sodium,CNa3O5P·6H2O)为一种焦磷酸盐类物质，能抑制病毒RNA和DNA聚合酶，亦能抑制HIV逆转录酶。在临床上表现为对巨细胞病毒、疱疹病毒等有较好疗效，是一种高效低毒广谱的非核苷类抗病毒药物。
由于受不同条件影响膦甲酸钠在生产、储存过程中会产生杂质，影响药物疗效和安全性。常见杂质包括杂质A、杂质B、杂质C和杂质D。因此，有必要对膦甲酸钠以及杂质进行有效检测，以保障药品疗效及其安全性。膦甲酸钠现有有关物质分析方法包括欧洲药典第9版和USP41版，均采用HPLC法控制杂质A、B、C；采用GC法控制杂质D。通过两个完全不同的检测项目来检测杂质，操作较为繁琐，经济效益不高。
有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
本发明的第一目的在于提供一种膦甲酸钠及其杂质的高效液相色谱检测方法，该方法能利用高效液相色谱方法实现膦甲酸钠杂质D与包括杂质A、B或C在内的其他杂质的联合检测，极大简化了分析方法，提高膦甲酸钠有关物质检查的分析效率。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种膦甲酸钠及其杂质的高效液相色谱检测方法，所述方法包括：
(1)溶液配制：a、称量待测膦甲酸钠样品，经冰醋酸润湿后，加入流动相振摇溶解，制得供试品溶液；b、用流动相稀释所述供试品溶液，制得对照溶液；c、称量膦甲酸钠杂质，加入流动相溶解，制成杂质储备溶液；称量膦甲酸钠纯品，经冰醋酸润湿后，加入流动相振摇溶解，再加入所述杂质储备溶液，制成系统适用性溶液，其中所述膦甲酸钠杂质包括杂质A、B或C中的至少一种，以及杂质D；
(2)色谱检测：量取所述供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，注入高效液相色谱分析仪进行色谱分析，记录色谱图，根据所述色谱图分析所述待测膦甲酸钠样品的杂质情况。
发明人发现，杂质D结构中含多个酯键，在碱性条件下易降解，而系统适用性溶液、供试品溶液中膦甲酸钠浓度较高使溶液呈碱性，且需超声30分钟以上才可使膦甲酸钠完全溶解，因此杂质D在溶液制备的过程中在碱性环境下快速降解，若不临用新制可能导致杂质D无法检出。本发明所述方法通过改变供试品溶液的制备方法，取膦甲酸钠先加冰醋酸润湿，再加流动相振摇数分钟即可完全溶解，既可缩短供试品溶液的制备时间，又可调节溶液的pH值至弱酸性，防止杂质D的快速降解，可得到较稳定的供试品溶液和系统适用性溶液(达到同时检测杂质D的目的)。因此，本发明所述方法能够实现膦甲酸钠杂质D与包括杂质A、B或C在内的其他杂质的联合检测，极大简化了分析方法，提高膦甲酸钠有关物质检查的分析效率。
在一些具体实施方式中，所述步骤a采用0.3～0.7mL所述冰醋酸润湿0.2～0.3g所述待测膦甲酸钠样品；所述步骤c采用0.3～0.7mL所述冰醋酸润湿0.2～0.3g所述膦甲酸钠纯品。
在一些具体实施方式中，所述步骤a采用0.5mL所述冰醋酸润湿0.24g所述待测膦甲酸钠样品；所述步骤c采用0.5mL所述冰醋酸润湿0.24g所述膦甲酸钠纯品。
在一些具体实施方式中，步骤c所述膦甲酸钠杂质包括杂质B和杂质D，优选包括杂质A、杂质B、杂质C和杂质D。
在一些具体实施方式中，所述流动相由溶液A、溶液B、四己基硫酸氢铵和甲醇按照650～750mL：250～350mL：0.2～0.3g：100mL组成，pH4.2～4.6；其中，所述溶液A为含8～12mM硫酸钠、0.25％～0.35％v/v冰醋酸和0.4～0.8mM焦磷酸钠的水溶液；所述溶液B为含8～12mM硫酸钠、55～65mM醋酸钠和0.4～0.8mM焦磷酸钠的水溶液。
在一些具体实施方式中，所述流动相由溶液A、溶液B、四己基硫酸氢铵和甲醇按照700mL：300mL：0.25g：100mL组成，pH4.4；其中，所述溶液A为含10mM硫酸钠、0.3％v/v冰醋酸和0.6mM焦磷酸钠的水溶液；所述溶液B为含10mM硫酸钠、60mM醋酸钠和0.6mM焦磷酸钠的水溶液。
在一些具体实施方式中，所述色谱分析条件包括：C18色谱柱，流速1.0±0.1mL/min，温度35±2℃，波长230±5nm。
在一些具体的实施方式中，所述供试品溶液和系统适用性溶液在配制好24h内注入所述色谱仪加以分析，优选12h内，8h内，6h内，4h内，2h内或配制后立即注入所述色谱仪加以分析。
术语定义：本发明所述“mM”是指mmol/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所述方法克服膦甲酸钠杂质D在高效液相色谱系统适用性溶液、供试品溶液中容易快速降解的问题，成功实现利用HPLC技术实现杂质D与杂质A、B、C等的联合检测，极大简化了分析方法，提高膦甲酸钠有关物质检查的分析效率。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为膦甲酸钠结构式；
图2为杂质A、杂质B、杂质C和杂质D相关信息；
图3为系统适用性溶液分离色谱图，膦甲酸钠(15.90min)杂质I(24.44min)，杂质II(26.72min)；其中，杂质I即本发明所述杂质B，杂质II即本发明所述杂质D；
图4为空白溶剂分离色谱图；
图5为未破坏的供试品溶液分离色谱图；
图6为酸破坏溶液分离色谱图；
图7为碱破坏溶液分离色谱图；
图8为氧化破坏溶液分离色谱图；
图9为加热破坏溶液分离色谱图；
图10为光照破坏溶液分离色谱图；
图11为膦甲酸钠线性图；
图12为0.2％杂质D的供试品溶液(对比例)配制后立即进样的色谱图，其中，杂质I即本发明所述杂质B，杂质II即本发明所述杂质D；
图13为0.2％杂质D的供试品(对比例)溶液配制好36min后进样的色谱图，其中，杂质I即本发明所述杂质B，杂质II即本发明所述杂质D。
【具体实施方式】
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种膦甲酸钠及其杂质的高效液相色谱检测方法，包括：
1.色谱条件
色谱柱：资生堂PAK C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
流动相：取无水硫酸钠1.42g，加冰醋酸3mL与0.1mol/L焦磷酸钠溶液6mL，加水1000mL使溶解，作为溶液A；取无水硫酸钠1.42g，加无水醋酸钠4.2g与0.1mol/L焦磷酸钠溶液6mL，加水1000mL使溶解，作为溶液B；取溶液A-溶液B(70∶30)混合溶液(pH值约为4.4)1000mL，加四己基硫酸氢铵0.25g，振摇使溶解，加甲醇100mL，摇匀。
流速：1.0mL/min。
柱温：35℃。
波长：230nm。
2.溶液的制备
①供试品溶液取本品0.24g，精密称量，置10mL量瓶中，加冰醋酸0.5mL润湿，加流动相适量，振摇使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀。
②对照溶液精密量取供试品溶液适量，用流动相稀释制成每1mL中约含48μg的溶液。
③系统适用性溶液取杂质B对照品与杂质D对照品各适量，用流动相溶解并稀释制成每1mL中分别含0.48mg与0.24mg的溶液，作为杂质储备溶液；取本品0.24g，置10mL量瓶中，加冰醋酸0.5mL，振摇，加杂质储备溶液1mL，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。
④灵敏度溶液精密量取对照溶液适量，用流动相稀释制成每1mL中约含7.2μg的溶液。
3.色谱检测：分别精密量取前述供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液和灵敏度溶液，注入高效液相色谱分析仪，按照步骤1所述色谱条件操作，获得相应色谱图，据此对本发明所述高效液相色谱分析方法进行方法学验证。
4.方法学验证结果
①系统适用性试验：系统适用性溶液色谱图中杂质B峰与杂质D峰均能与膦甲酸钠峰完全分开。见附图3。
②专属性试验：供试品溶液，经酸、碱、氧化、加热和光照等条件下破坏，降解产物均能与膦甲酸钠峰分离。见附图5-10。
③线性关系考察：取膦甲酸钠，制成每1mL中分别约含5μg、25μg、50μg、124μg与248μg的溶液，照本实施例所述色谱方法测定，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A＝1.8C-0.029，r＝0.9999；线性范围为5～248μg/mL。见附图11。
④精密度试验：取对照溶液连续进样6针，膦甲酸钠峰面积的RSD为1.1％。
⑤加样回收率实验：杂质B平均回收率(n＝6)为100.8％，RSD＝2.0％，见表1；杂质D平均回收率(n＝9)为98.6％，RSD＝2.7％，见表2。
表1膦甲酸钠杂质B回收率汇总表
表2膦甲酸钠杂质D回收率汇总表
⑥检出限：膦甲酸钠与杂质D的检出限分别为23ng和62ng。
⑦溶液的稳定性：取供试品溶液和系统适用性溶液，进行溶液的稳定性考察，其中供试品溶液在24小时内均未检出杂质峰；系统适用性溶液在24小时内均可检出杂质B和杂质D，但峰面积有减小趋势，详见表3。故临用新制溶液更利用本发明所述方法的检测。
表3系统适用性溶液中杂质B、D稳定性汇总表
对比例
本对比例配制含0.2％杂质D的供试品溶液(未使用冰醋酸溶液润湿，即欧洲药典第9版和USP41版供试品溶液的处理方法)，采用本发明前述高效液相色谱分析方法，分别检测立即进样和36min后进样条件下杂质D的检出情况，具体参见表4、图12-13。
根据表4以及图12-13所示结果可知，供试品溶液在36分钟进样可检出杂质D，但峰面积大幅度减小。表明未经冰醋酸润湿的传统供试品制备方法对杂质D具有很大降解作用，不适合通过HPLC检测杂质D。
表4不同进样时间杂质D检测情况
| 进样时间 | 杂质D峰面积 | 备注 |
| 配制后立即进样 | 32.208 | 附图12 |
| 36min后 | 10.979 | 附图13 |
实验例
按本实施例所述色谱方法，对济南某制药生产企业的3批膦甲酸钠样品进行了有关物质检查，结果均未检出杂质峰。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (2)
1.一种膦甲酸钠及其杂质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)溶液配制：a、称量待测膦甲酸钠样品，经冰醋酸润湿后，加入流动相振摇溶解，制得供试品溶液；b、用流动相稀释所述供试品溶液，制得对照溶液；c、称量膦甲酸钠杂质，加入流动相溶解，制成杂质储备溶液；称量膦甲酸钠纯品，经冰醋酸润湿后，加入流动相振摇溶解，再加入所述杂质储备溶液，制成系统适用性溶液，其中所述膦甲酸钠杂质包括杂质B和杂质D，所述杂质B和杂质D的结构式如下：
B.R1＝R2＝ONa,R3＝OC2H5:disodium
(ethoxyoxydophosphanyl)formate,
D.R1＝R2＝R3＝OC2H5:ethyl(diethoxyphosphoryl)formate；
(2)色谱检测：量取所述供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，注入高效液相色谱分析仪进行色谱分析，记录色谱图，根据所述色谱图分析所述待测膦甲酸钠样品的杂质情况；
其中，色谱分析条件包括：C18色谱柱，流速1.0mL/min，温度35℃，波长230nm；所述流动相由溶液A、溶液B、四己基硫酸氢铵和甲醇按照700mL：300mL：0.25g：100mL组成，pH4.4；其中，所述溶液A为含10mM硫酸钠、0.3％v/v冰醋酸和0.6mM焦磷酸钠的水溶液；所述溶液B为含10mM硫酸钠、60mM醋酸钠和0.6mM焦磷酸钠的水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a采用0.5mL所述冰醋酸润湿0.24g所述待测膦甲酸钠样品；步骤c采用0.5mL所述冰醋酸润湿0.24g所述膦甲酸钠纯品。
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