CN117607306A - 一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法及试剂盒 - Google Patents

一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法及试剂盒，该检测方法包括如下步骤：将全血样品除去蛋白质制备成待测样品，通过液相色谱‑串联质谱进行检测分析，所述检测分析包括如下色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相A相：甲酸水溶液，流动相B相：甲酸甲醇溶液，洗脱梯度：0～1.5min，流动相B相由45％上升至95％，1.5～2.5min，B相保持95％，2.5～2.6min，B相下降至45％。通过一次检测，即可实现甲氨蝶呤及其直接、间接代谢产物的检测，快速高效，对于药物的安全评估、剂量调整和临床试验的设计具有重要意义。

Description

一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及药物分析相关技术领域，尤其是涉及一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法及试剂盒。
背景技术
甲氨蝶呤(MTX)主要用作抗叶酸类抗肿瘤药，通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞的合成，而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。甲氨蝶呤吸收后在肝脏中代谢产生7羟基甲氨蝶呤(7-OH-MTX)，之后MTX与7-OH-MTX被排泄到胆汁中进入肠道，肠道菌群再将MTX和7-OH-MTX代谢为2,4-二氨基-N-10-甲氨蝶呤酸(DAMPA)和7-羟基-DAMPA(7-OH-DAMPA)。在药物临床前研究中，通过监测动物体内代谢物的浓度变化为临床试验提供参考，DAMPA和7-OH-DAMPA是MTX和7-OH-MTX的主要代谢途径，因此，同时检测血液中这4种化合物浓度具有重要意义。
在药物代谢和动力学研究中，检测动物体内的代谢物浓度变化是必不可少的，通过检测体内的代谢物血药浓度变化了解药物代谢的程度、评估重要的代谢器官。小鼠作为常用的试验动物，可采集的血量很少，尤其是进行药动学研究的时候，需连续采集血样，因此传统用于检测人体内甲氨蝶呤的方法难以适用到动物的样品检测上。
尽管相关技术中存在很多同时检测甲氨蝶呤和其他抗癌药物的方法，但是针对甲氨蝶呤的代谢产物却鲜有报道，尤其是尚未有能够同时检测MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA的方法。
基于此，开发一种可同时检测甲氨蝶呤及7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA的方法具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，该方法可以同时实现MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA的检测。
根据本发明的一个方面，提出了一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，包括如下步骤：
将全血样品除去蛋白质制备成待测样品，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行检测分析，所述检测分析包括如下色谱条件：
色谱柱：C18柱；
流动相A相：甲酸水溶液，流动相B相：甲酸甲醇溶液，洗脱梯度：0～1.5min，流动相B相由45％上升至95％，1.5～2.5min，B相保持95％，2.5～2.6min，B相下降至45％。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：通过本发明方案可以有效的实现全血中MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA的分离分析，通过一次检测，即可实现甲氨蝶呤及其直接、间接代谢产物的检测，快速高效，同时，还可以更加准确有效地反应甲氨蝶呤的代谢情况，通过监测这些产物的浓度变化，可以提供关于药物在体内的代谢率、清除率和药物暴露水平，对于药物的安全评估、剂量调整和临床试验的设计具有重要意义，同时，检测时间仅需不到3min，检测效率高，适宜大批量高效检测。
在本发明的一些实施方式中，所述洗脱梯度还包括2.6～3.5min，B相保持45％比例。在检测完成后可设置平衡色谱柱的时间，以便于后续检测。
在本发明的一些实施方式中，所述检测分析还包括如下色谱条件中的至少一项：
1)液相色谱仪：SHIMADZU LC-40；
2)色谱柱：Welch XS-C18 3*100mm 3μm；
3)在线过滤器：Waters CRITICAL CLEANTM；
4)自动进样器温度：2～10℃；优选为4℃；
5)柱温：30±2℃；优选为30℃；
6)流速：0.4mL·min-1；
7)进样量：10μL。
通过本发明方案小鼠全血中MTX、7-OH-MTX的线性范围可达5～500ng·mL-1，小鼠全血中DAMPA、7-OH-DAMPA的线性范围可达1～100ng·mL-1。满足线性接受标准，线性定量效果良好。
在本发明的一些实施方式中，所述检测分析还包括如下质谱条件中的至少一项：
1)质谱仪：SCIEX 6500plus；
2)离子源：电喷雾离子源；
3)气帘气：40psi；
4)碰撞气：8psi；
5)离子源电压：5500V；
6)源温：500℃；
7)离子源辅助气1：60psi；辅助加热气2：60psi；
8)碰撞池出口电压：10V；
9)电离模式：正离子；
10)信号采集模式：质谱多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述全血样品包括啮齿类动物和非啮齿类动物的药物代谢动力学(Pharmacokinetics，简称PK)样品以及临床试验人全血样品中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述待测样品的制备过程包括如下步骤：使全血样品与甲醇混合，滤除沉淀，加入水。加入甲醇使全血中的蛋白变性转变为沉淀后去除，操作简便，可大指处理。以甲醇为沉淀剂，水为稀释剂，试剂成本低廉。
在本发明的一些实施方式中，所述全血样品的体积为10μL以上。本发明方案的样本量最低仅需10μL即可，所取样品用量少使得本发明方案检测方法可适用于各种基质，包括啮齿类动物或非啮齿类动物等多种生物体，传统方法需要使用至少50μL血清用乙腈蛋白沉淀后用LC-MS/MS法检测血清中的MTX和7-OH-MTX或采用至少20μL血浆样品经固相萃取后用LC-MS/MS法检测MTX和7-OH-MTX浓度。样品用量50μL对于难以获取的生物基质这类方法不适用，固相萃取方法成本高，步骤繁琐，对于大批量临床样品检测操作性较弱，且样本量同样较大。
在本发明的一些实施方式中，所述全血样品的体积为10～15μL。采用本发明方案的检测方法可以大大减少血样的采集，一方面降低对受试者的身体伤害，尤其是癌症患者作为受试者时，另一方面可减少临床试验成本。
在本发明的一些实施方式中，所述全血样品与甲醇的体积比为1：12。
在本发明的一些优选实施方式中，所述待测样品中MTX、7-OH-MTX的浓度独立的在500ng·mL-1以下，DAMPA、7-OH-DAMPA的浓度独立的在100ng·mL-1以下。
在本发明的一些优选实施方式中，所述待测样品中MTX、7-OH-MTX的浓度独立为5～500ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA的浓度独立为1～100ng·mL-1。
在本发明的一些优选实施方式中，所述检测分析还包括定量分析的步骤。
在本发明的一些优选实施方式中，所述定量分析采用内标法。
在本发明的一些优选实施方式中，所述定量分析包括将含内标且已知待测成分浓度的标准工作液通过液相色谱串联质谱仪进行检测，计算标准工作液中待测成分与内标的响应比值Y为纵坐标，以待测成分浓度与内标浓度的比值X为横坐标，通过最小二乘法进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。
在本发明的一些优选实施方式中，所述已知浓度的标准工作液中MTX、7-OH-MTX的浓度分别独立地选自5、12.5、35、175、375ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别独立地选自1、2.5、7、35、75ng·mL-1。
在本发明的一些优选实施方式中，MTX的线性回归方程为Y＝0.0147X+0.0187；7-OH MTX的线性回归方程为Y＝0.00677X+0.00397；DAMPA的线性回归方程为Y＝0.0391X+0.00603；7-OH DAMPA的线性回归方程为Y＝0.0194X+0.00151。
根据本发明的另一个方面，提出了一种同时检测甲氨蝶呤及多种代谢产物的试剂盒，包括如下试剂：对照品组合、内标组合、甲醇和水，其中，所述对照品组合包括MTX对照品、7-OH-MTX对照品、DAMPA对照品和7-OH-DAMPA对照品，所述内标组合包括MTX内标、7-OH-MTX内标、DAMPA内标和7-OH-DAMPA内标。
根据本发明的一种优选的实施方式的试剂盒，至少具有以下有益效果：使用本发明方案试剂盒进行甲氨蝶呤药代动力学研究，操作简便，应用前景广阔。
在本发明的一些优选实施方式中，所述对照品组合中的各对照品均以储备液的形式提供，具体地，MTX对照品储备液的浓度为0.294mg·mL-1；7-OH-MTX对照品储备液的浓度为0.099mg·mL-1；DAMPA对照品储备液的浓度为0.280mg·mL-1；7-OH-DAMPA对照品储备液的浓度为0.095mg·mL-1。
在本发明的一些实施方式中，所述内标组合中的各内标以内标工作液的形式提供，内标工作液中含有MTX-d3、7-OH MTX-d3、7-OH DAMPA-d3。
在本发明的一些实施方式中，MTX-d3和7-OH MTX-d3浓度独立为40～60ng·mL-1，7-OH DAMPA-d3浓度为5～15ng·mL-1。
在本发明的一些优选实施方式中，MTX-d3和7-OH MTX-d3浓度独立为50ng·mL-1，7-OH DAMPA-d3浓度为10ng·mL-1。
在本发明的一些优选实施方式中，所述试剂盒还包含标准曲线工作液、质控工作液、标准全血样品、质控标准全血样品，其中，所述标准曲线工作液中MTX、7-OH-MTX浓度分别为100、200、400、1000、2000、4000、8000、10000ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为20、80、100、200、400、800、1600、2000ng·mL-1；所述质控工作液中MTX、7-OH-MTX浓度分别为100、250、700、3500、7500ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为20、50、140、700、1500ng·mL-1；所述标准全血样品中MTX、7-OH-MTX浓度分别为5、10、20、50、100、200、400、500ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为1、2、4、10、20、40、80、100ng·mL-1；所述质控标准全血样品中MTX、7-OH-MTX浓度分别为5、12.5、35、175、375ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为1、2.5、7、35、75ng·mL-1。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例2测定得到的MTX的定量标准曲线图；
图2是本发明实施例2测定得到的7-OH-MTX的定量标准曲线图；
图3是本发明实施例2测定得到的DAMPA的定量标准曲线图；
图4是本发明实施例2测定得到的7-OH-DAMPA的定量标准曲线图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。如无特别说明，各实施例中同一参数取值相同。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。其中，下述实施例中使用的对照品及内标物的采购信息如下：MTX:厂家:SINCO PHARMACHEM，批号：22-07-2916；7-OH-MTX:厂家:TLC，批号：2966-041A7；DAMPA：厂家:SINCO PHARMACHEM，批号：21-01-2012；7-OH-DAMPA:厂家:TRC，批号：10-JHY-49-2；MTX-d3:厂家:CFW，批号：V-939903-ND1；7-OH-MTX-d3:厂家:TLC，批号：3585-088A5；DAMPA-d3:厂家:TRC，批号：1-TEK-173-1。本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
本发明所称“室温”是指在25±5℃均可，实施例中具体为25℃。
甲氨蝶呤(Methotrexate)：抗叶酸类抗肿瘤药，分子式C20H22N8O5，分子量454.439。
7-羟基甲氨蝶呤(7-Hydroxy Methotrexate)：甲氨蝶呤在体内的代谢产物，分子式C20H22N8O6，分子量470.44。
DAMPA:甲氨蝶呤在体内的代谢产物，分子式C15H15N7O2，分子量325.33。
7-OH DAMPA:7-羟基甲氨蝶呤在体内的代谢产物，分子式C15H15N7O3，分子量341.33。
待测物和内标物的定量离子特征如下表1所示：
表1
化合物 Q1 Q3
MTX 455.2 308.3
7-OH-MTX 471.2 324.2
DAMPA 326.1 175.1
7-OH-DAMPA 342.0 191.2
7-OH-MTX-d3 474.2 327.3
MTX-d3 458.2 311.1
DAMPA-d3 329.2 175.1
实施例1
本例制备了一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的试剂盒，具体过程为：取MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA对照品，MTX-d3、7-OH-MTX-d3和DAMPA-d3内标品，如下标准配制成溶液：
MTX对照品储备液(CSS、QCS)：0.294mg·mL-1。
7-OH-MTX对照品储备液(CSS、QCS)：0.099mg·mL-1。
DAMPA对照品储备液(CSS、QCS)：0.280mg·mL-1。
7-OH-DAMPA对照品储备液(CSS、QCS)：0.095mg·mL-1。
内标工作液：其中MTX-d3和7-OH MTX-d3浓度为50ng·mL-1，7-OH DAMPA-d3浓度为10ng·mL-1。
MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA标准曲线工作液：其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为100、200、400、1000、2000、4000、8000、10000ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为20、80、100、200、400、800、1600、2000ng·mL-1。
MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA质控工作液：其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为100、250、700、3500、7500ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为20、50、140、700、1500ng·mL-1。
MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA标准全血样品：其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为5、10、20、50、100、200、400、500ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为1、2、4、10、20、40、80、100ng·mL-1。
MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA质控标准全血样品：其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为5、12.5、35、175、375ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为1、2.5、7、35、75ng·mL-1。
具体配制过程如下：
1、储备液配制
各对照品储备液直接称量，以二甲亚砜为溶剂，溶解后即得。
2、标准曲线标准全血样品配制
分别取MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA对照品储备液适量至聚丙烯EP管中，以50％甲醇水为溶剂，经过系列稀释，得到同时含4种待测物的8个标准曲线工作液，其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为100、200、400、1000、2000、4000、8000、10000ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为20、80、100、200、400、800、1600、2000ng·mL-1；然后按标准曲线工作液:空白全血(湖南斯莱克景达实验动物有限公司，balb/c小鼠，肝素钠抗凝)＝1:20(体积比)进一步稀释配制成含2种待测物的8个标准曲线标准全血样品，其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为5、10、20、50、100、200、400、500ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为1、2、4、10、20、40、80、100ng·mL-1。
3、试剂盒中质控标准全血样品配制
分别取MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA对照品储备液适量至聚丙烯EP管中，以50％甲醇水为溶剂，经过系列稀释，得到同时含2种待测物的5个质控样品工作液，其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为100、250、700、3500、7500ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为20、50、140、700、1500ng·mL-1；然后按质控样品工作液:空白全血＝1:20(体积比)进一步稀释配制成含2种待测物的5个质控标准全血样品，其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为5、12.5、35、175、375ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为1、2.5、7、35、75ng·mL-1。
4、试剂盒中内标样品配制
分别取MTX-d3、7-OH-MTX-d3、DAMPA-d3对照品储备液适量至聚丙烯EP管中，以甲醇为溶剂，经过系列稀释，得到同时含3种内标物的内标工作液，其中MTX-d3和7-OH MTX-d3浓度为50ng·mL-1，7-OH DAMPA-d3浓度为10ng·mL-1。取20μL内标工作液加入到标准曲线和质控标准全血样品中同步使用，7-OH-DAMPA以DAMPA-d3作为内标。
MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA标准曲线和质控标准全血样品的配制，经历了储备液→标准曲线工作液→标准全血样品的阶段稀释，溶剂分别变化为二甲基亚砜→50％甲醇水→空白全血，其中全血的占比保持在90％以上，既接近了实际待测样本的真实情况，又保证了4种待测物质的基质溶解性和共同存在，该处理避免了从较高浓度的储备液直接过渡到生物基质引入的配制误差，保证标准品的回收率和准确性，还可以降低每次稀释的跨度(不超过100倍，20倍以内稀释为最佳)，有效提高人员操作重复性和准确度。
本申请所述试剂盒包含了定量结果判断标准：相关系数r2≥0.9801或r≥0.9900；校正标样的回算浓度应该在标示值的85％～115％范围内，定量下限应该在标示值的80％～120％范围内；至少75％的校正标样且最少6个浓度水平应符合上述标准。
另外，量取甲醇沉淀剂、超纯水置于试剂盒内。
实施例3
利用实施例2中的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
1、样品溶液的制备：
取全血样品10μL至2mL EP管中，加入20μL内标工作液(或甲醇，空白样品加入的是作为内标工作液溶剂的甲醇)，加入100μL甲醇，在振荡器上振荡3min，离心(13000rpm，10min)。取上清70μL转移到96孔聚丙烯板，加入100μL超纯水混匀即得。
所取样本仅为10μL相对于相关技术中的处理方法来说都非常少，大大节省了样本用量，具有减少收集受试者生物样本的特色，尤其适用于脑脊液、关节腔内液等稀有生物样本的前处理，还具有批量处理的优势。
2、LC-MS/MS分析：将上述操作制得的样品溶液及试剂盒中的质控样品、标准曲线工作液按如下条件进行分析：
液相色谱仪：SHIMADZU LC-40；色谱柱：Welch XS-C18 3*100mm 3μm；在线过滤器：Waters CRITICAL CLEANTM；自动进样器温度：4℃；柱温：30℃；流速：0.4mL·min-1；进样量：10μL；流动相A相：0.1％甲酸水；流动相B相：0.1％甲酸甲醇。液相洗脱梯度：0～1.5min，流动相B相由45％上升至95％，1.5～2.5min，B相保持95％，2.5～2.6min，B相下降至45％，2.6～3.5min，B相保持45％比例。
质谱仪：SCIEX 6500plus；离子源：电喷雾离子源；气帘气(psi)40；碰撞气(psi)8；离子源电压(V)5500；源温(℃)500；离子源辅助气1(psi)60；辅助加热气2(psi)60；碰撞池出口电压(V)10；电离模式：正离子；信号采集模式：MRM。
进样到质谱系统分析，分别记录4个待测物与内标的响应，并分别计算4个待测物与各自内标的响应比值。以MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA与其内标的响应比值(Y)为纵坐标，以系列标准全血样品浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。将系列标准全血样品中待测物与内标的响应比值，代入线性回归方程计算，标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。
3、标准曲线的绘制
取标准曲线和质控标准全血样品，添加内标物后经过蛋白沉淀，进样到质谱系统分析，记录待测物与内标的响应，并计算待测药物与内标的响应比值。以MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA与其内标的响应比值(简称“面积比”)Y为纵坐标，以系列标准全血样品浓度(简称“浓度比”)X为横坐标，使用权重因子(1/X2)，通过最小二乘法进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。将系列标准全血样品中待测物与内标的响应比值，代入线性回归方程计算，标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。
全血中MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA的定量标准曲线如图1～4所示。四种待测物的线性分析结果如下：MTX的线性回归方程为Y＝0.0147X+0.0187(r＝0.9974)；7-OHMTX的线性回归方程为Y＝0.00677X+0.00397(r＝0.9948)；DAMPA的线性回归方程为Y＝0.0391X+0.00603(r＝0.9974)(r＝0.9995)；7-OH DAMPA的线性回归方程为Y＝0.0194X+0.00151(r＝0.9987)。结果表明，利用本发明检测方法测试小鼠全血中MTX、7-OH-MTX的线性范围可达5～500ng·mL-1，小鼠全血中DAMPA、7-OH-DAMPA的线性范围可达1～100ng·mL-1。满足线性接受标准，线性定量效果良好。
4、准确度和精密度验证
取试剂盒中的MTX、7-OH-MTX、DAMPA、7-OH-DAMPA质控标准全血样品LLOQ、LQC、LMQC、HMQC、HQC各6份，其中MTX、7-OH-MTX浓度分别为5、12.5、35、175、375ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA浓度分别为1、2.5、7、35、75ng·mL-1，进样到质谱系统分析。记录待测物与内标响应的比值并代入对应所得线性回归方程，计算各样品浓度，将其与样品标示值比较，并据此计算批内精密度和准确度。
接受标准：LLOQ测得浓度均值的准确度应在标示值的80％～120％范围内，且至少2/3样品准确度偏差在标示值的±20％之内；其它质控浓度标准尿液样品测得浓度的均值的准确度应在标示值的85％～115％范围内，且每个浓度至少2/3样品准确度偏差在标示值的±15％之内；定量下限精密度不得超过20％，其它质控浓度的精密度不得超过15％。
准确度和精密度验证实验结果见表2。
表2
结果表明，本试剂盒对5个不同浓度质控品各重复测定6次，均符合接受标准，方法和试剂盒的准确度合格。各质控品6次测量结果中，精密度CV％均符合≤15％的接受标准。本方法和试剂盒的精密度合格。
5、回收率评价
取同一个来源的空白全血，取试剂盒中质控标准全血样品(LMQC)平行6份，其中MTX、7-OH-MTX的浓度为35ng·mL-1，DAMPA、7-OH-DAMPA的浓度为7ng·mL-1，将质控标准全血样品加入到空白全血中，各质控样品进样10μL到色谱/质谱系统分析。分别记录MTX(A1)、7-OH-MTX(A2)、DAMPA(A3)、7-OH-DAMPA(A4)的响应，作为待测物提取后面积。
取同一个来源的空白小鼠全血除不加内标外进行同样的处理以获取空白小鼠全血上清液。往该空白小鼠全血上清液中加入分析物和内标使其终浓度与正常处理后的样品相同。进样10μL到色谱/质谱系统分析。分别记录MTX(B1)、7-OH-MTX(B2)、DAMPA(B3)、7-OH-DAMPA(B4)的响应，作为待测物未提取面积。
标准全血样品中MTX的回收率为R1＝A1/B1×100％，7-OH-MTX的回收率为R2＝A2/B2×100％，DAMPA的回收率为R3＝A3/B3×100％，7-OH-DAMPA的回收率为R4＝A4/B4×100％。
回收率比对结果见表3。
表3
从表3可以看出，MTX的平均回收率为81.27％，7-OH-MTX的平均回收率为55.12％，DAMPA的平均回收率为85.90％，7-OH-DAMPA的平均回收率为74.33％，4个分析物提取后的回收率与内标在同一水平。
6、基质效应
基质样品：取空白小鼠全血除不加内标外进行同样的处理以获取空白小鼠全血上清液。往该空白小鼠全血上清液中加入分析物和内标使其终浓度与正常处理后的LMQC样品相同。平行3份。取混匀后的溶液进样到色谱/质谱系统分析。
溶液样品：取超纯水代替全血，除不加内标外进行同样的处理以获取空白标准溶液样品。往该空白标准溶液样品中加入分析物和内标使其终浓度与正常处理后的LMQC样品相同。平行3份样品。取混匀后的溶液进样到色谱/质谱系统分析。
计算方式：基质因子＝(含基质样品的响应)÷(溶液样品的响应)
内标归一化基质因子＝(分析物基质因子)÷(内标基质因子)
检测结果见表4。
表4
从表4可以看出，MTX内标归一化后的基质效应为1.127，7-OH-MTX内标归一化后的基质效应为1.281，DAMPA内标归一化后的基质效应为0.979，7-OH-DAMPA内标归一化后的基质效应为0.903，4个化合物受基质效应影响小，尤其是7-OH-DAMPA采用DAMPA-d3作为内标，分析物基质因子与内标相差很小，能有效的起到内标校正的作用。
上面对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将全血样品除去蛋白质制备成待测样品，通过液相色谱-串联质谱进行检测分析，所述检测分析包括如下色谱条件：
色谱柱：C18柱；
流动相A相：甲酸水溶液，流动相B相：甲酸甲醇溶液，洗脱梯度：0～1.5min，流动相B相由45％上升至95％，1.5～2.5min，B相保持95％，2.5～2.6min，B相下降至45％。
2.根据权利要求1所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述洗脱梯度还包括2.6～3.5min，B相保持45％比例。
3.根据权利要求1所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述检测分析还包括如下色谱条件中的至少一项：
1)液相色谱仪：SHIMADZU LC-40；
2)色谱柱：Welch XS-C18 3*100mm 3μm；
3)在线过滤器：Waters CRITICAL CLEANTM；
4)自动进样器温度：2～10℃；优选为4℃；
5)柱温：30±2℃；优选为30℃；
6)流速：0.4mL·min-1；
7)进样量：10μL。
4.根据权利要求1所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述检测分析还包括如下质谱条件中的至少一项：
1)质谱仪：SCIEX 6500plus；
2)离子源：电喷雾离子源；
3)气帘气：40psi；
4)碰撞气：8psi；
5)离子源电压：5500V；
6)源温：500℃；
7)离子源辅助气1：60psi；辅助加热气2：60psi；
8)碰撞池出口电压：10V；
9)电离模式：正离子；
10)信号采集模式：质谱多反应监测。
5.根据权利要求1至4任一项所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述全血样品包括啮齿类动物和非啮齿类动物的药物代谢动力学样品以及临床试验人全血样品中的至少一种。
6.根据权利要求1至4任一项所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述待测样品的制备过程包括如下步骤：使全血样品与甲醇混合，滤除沉淀，加入水；优选地，所述全血样品与甲醇的体积比为1：12。
7.根据权利要求6所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述全血样品的体积为10μL以上；优选地，所述全血样品的体积为10～15μL。
8.根据权利要求6所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述待测样品中MTX、7-OH-MTX的浓度独立的在500ng·mL-1以下，DAMPA、7-OH-DAMPA的浓度独立的在100ng·mL-1以下。
9.根据权利要求6所述的同时检测甲氨蝶呤及其多种代谢产物的方法，其特征在于：所述检测分析还包括定量分析的步骤，所述定量分析包括将含内标且已知待测成分浓度的标准工作液通过液相色谱串联质谱仪进行检测，计算标准工作液中待测成分与内标的响应比值Y为纵坐标，以待测成分浓度与内标浓度的比值X为横坐标，通过最小二乘法进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数；优选地，MTX的线性回归方程为Y＝0.0147X+0.0187；7-OH MTX的线性回归方程为Y＝0.00677X+0.00397；DAMPA的线性回归方程为Y＝0.0391X+0.00603；7-OH DAMPA的线性回归方程为Y＝0.0194X+0.00151。
10.一种同时检测甲氨蝶呤及多种代谢产物的试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：对照品组合、内标组合、甲醇和水，其中，所述对照品组合包括MTX对照品、7-OH-MTX对照品、DAMPA对照品和7-OH-DAMPA对照品，所述内标组合包括MTX内标、7-OH-MTX内标、DAMPA内标和7-OH-DAMPA内标。
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