CN109406684B - 一种测定色氨酸的杂质b、c、d含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定色氨酸的杂质B、C、D含量的检测方法，采用超高效液相色谱法，设定一定的色谱条件，分别精密取对照品溶液和待测复方氨基酸注射液样品溶液注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算得到样品溶液中色氨酸相关杂质B、C、D含量。本发明的检测方法只需取适量样品，配制成合适的浓度使用UPLC直接进行测试，样品处理简单、快捷、准确；检测方法简单，周期短，试剂为常规试剂，易获得。

Description

一种测定色氨酸的杂质B、C、D含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种测定色氨酸的杂质B、C、D含量的检测方法，尤其涉及一种采用超高效液相色谱测定含色氨酸的复方氨基酸注射液中杂质B、C、D含量的检测方法，属于复方氨基酸注射液的杂质测定领域。

背景技术

复方氨基酸注射液作为肠外营养注射液在临床应用广泛，而该注射液是由多种氨基酸原料组成配制成的无菌水溶液，由于氨基酸注射液处方组成多，工艺复杂，各个生产企业的控制水平不同，中国药典虽收载该品种但并未对该品种进行杂质控制，但从保证注射液安全性角度有必要对其杂质进行控制。

复方氨基酸注射液由多种氨基酸组成，组成复杂，其中色氨酸作为原料之一，理化性质不稳定，易被氧化而导致色氨酸含量降低，但含量降低后的生成物未见相关文献报道，因此有必要对色氨酸相关杂质进行研究。色氨酸降解杂质主要有杂质B、C、D，其结构参见图1所示。由于处方中其他氨基酸种类较多，极易干扰杂质B、C、D的测定，因此必须建立一种专属性强、准确率高的检测方法，以控制含色氨酸的复方氨基酸注射液中杂质B、C、D的含量。

本发明的检测方法建立在超高效液相色谱(UPLC)检测方法的基础上，通过对色谱条件的改进，使其处方中其他氨基酸成分不干扰杂质B、C、D的检测，并且杂质B、C、D分离效果更好，提高了专属性、准确度，大大提高了检测效率，可以更好的对含色氨酸的复方氨基酸注射液的生产工艺进行监控。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求一种更准确、通用性更好的测定色氨酸的杂质B、C、D含量的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明提供了一种测定色氨酸的杂质B、C、D含量的检测方法，采用超高效液相色谱法，所采用的色谱条件包括：色谱柱为2.1×100mm,1.7μm的C18色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，检测波长为254nm，流速为0.3～0.4ml/min，柱温为40～45℃，稀释剂为超纯水，稀释倍数为2倍，进样体积为1-5μl；

其中，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为pH＝2.1～2.3的磷酸盐缓冲液，所述流动相B为色谱纯的甲醇；

其中，所述梯度洗脱的条件为：

0min：97％流动相A，3％流动相B；

0.68min：97％流动相A，3％流动相B；

2.04min：88％流动相A，12％流动相B；

4.08min：88％流动相A，12％流动相B；

4.35min：97％流动相A，3％流动相B；

5.5min：97％流动相A，3％流动相B；

15min：97％流动相A，3％流动相B。

优选的，所述流速为0.4ml/min。

优选的，所述柱温为40℃。

优选的，所述磷酸盐缓冲液的pH＝2.3。

优选的，所述磷酸盐缓冲液由以下方法制备：在每1L 3.9g/L的磷酸二氢钠溶液中加入约800ml2.9g/L的磷酸溶液至pH达到预定值为止。

优选的，根据所述色谱条件所计算出的理论塔板数按杂质B2(杂质B为双峰，按照出峰顺序依次为B1、B2)计，大于等于3000。

采用本发明的色谱条件所测定得到的谱图中，各个已知杂质的色谱峰按照出峰顺序从左到右依次为杂质B、杂质D、杂质C、色氨酸，合格产品中杂质B、杂质C、杂质D的含量均不得大于1.95μg/ml(0.15％)。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、实验发现，流动相的组成以及梯度洗脱的条件对于检测的效果影响非常大，通过大量的筛选实验最终发现，采用本发明的流动相组成以及梯度洗脱条件，能够实现精确测定的效果，有利于优化产品的工艺，提高产品质量和安全性。

2、本发明的检测方法分离度良好，专属性强，无干扰，各个杂质(杂质B、C、D)的色谱峰之间的分离度大于1.5，且与其他未知杂质的色谱峰的分离度大于1.2，解决了复方氨基酸注射液处方复杂，干扰杂质检测的难题。

3、本发明的检测方法结果准确，检出限可以达到0.1μg/ml级别，能对产品中微量的杂质B、C、D进行有限的控制，保证产品的质量。

4、本发明的检测方法采用超高效液相色谱法(UPLC)，设备先进，方法处理简单易操作，检测周期短，试剂均为易获得的常规试剂，符合经济有效的原则。

附图说明

图1为色氨酸降解生成物中主要杂质B、C、D的结构图及控制限度；

图2为实验例1中杂质B对照溶液的紫外吸收光谱图；

图3为实验例1中杂质C对照溶液的紫外吸收光谱图；

图4为实验例1中杂质D对照溶液的紫外吸收光谱图；

图5为实验例1中色氨酸溶液的紫外吸收光谱图；

图6为实验例5中杂质B回归分析图；

图7为实验例5中杂质C回归分析图；

图8为实验例5中杂质D回归分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明的实验摸索与优化过程

(1)流动相组成及梯度变化的选择：

(2)流动相中有机相更换甲醇及梯度变化的选择：

(3)样品浓度的选择：

(4)检测波长的选择：

(5)缓冲盐pH值的影响考察：

(6)柱温的影响考察：

(7)流速的影响考察：

(8)缓冲盐浓度的影响考察：

实施例

超高效液相色谱仪：Waters UPLC高效液相色谱仪。

色谱系统：ACQUITY UPLCTM H-Class，Empower3工作站，UV检测器。

色谱条件：

色谱柱：C18色谱柱(ACQΜITY UPLC BEH C18 2.1×100mm,1.7μm)；

流动相A：pH＝2.3的磷酸盐缓冲液(通过在每1L 3.9g/L的磷酸二氢钠溶液中加入约800ml 2.9g/L的磷酸溶液至pH为2.3为止制得，后续实施例相同)；

流动相B：甲醇；

检测波长：254nm；

流速：0.4ml/min；

柱温：40℃；

梯度洗脱条件：如表1所示；

表1本发明实施例的梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	97	3
0.68	97	3
			2.04	88	12
4.08	88	12
			4.35	97	3
5.5	97	3
			15	97	3

稀释剂：超纯水；

稀释倍数：2倍；

进样体积：2μl。

对照品溶液：精密量取杂质B、杂质C和杂质D对照品各适量，分别置于10ml量瓶中，用0.1M HCL稀释至刻度，摇匀，制成对照品母液；另分别精密量取各所述对照品母液适量，再用超纯水稀释，分别制成含杂质B、杂质C、杂质D各1.0μg/ml的杂质混合对照溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液：精密量取5ml待测复方氨基酸注射液18AA-III，置10ml量瓶中，加超纯水定容，摇匀，制成相当于每1ml中含色氨酸0.65mg的溶液，用水相滤膜(孔径：0.22μm)过滤，作为供试品溶液。本实施例所使用的待测复方氨基酸注射液18AA-III为自制的不同批次的样品1和样品2，其中样品1为制备工艺改进前所制样品，样品2为制备工艺改进后所制样品。

检测方法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入UPLC液相色谱仪，记录色谱图。

检测结果：供试品溶液色谱图中如显杂质峰，用外标法以峰面积计算，杂质B(以B2峰面积计)、杂质C、杂质D的含量均不大于1.95μg/ml(0.15％)，则符合标准。本实施例的检测结果如表2所示。

表2本发明实施例的检测结果

样品来源	样品批号	杂质B(μg/ml)	杂质D(μg/ml)	杂质C(μg/ml)
					样品1	20151101	1.5	2.1	12.62
样品2	20160201	未检出	未检出	2.95
					样品2	20160301	未检出	未检出	3.36
样品2	20160531	未检出	未检出	3.10
					样品2	20160601	未检出	未检出	3.05
样品2	20161201	未检出	未检出	1.21
					样品2	20170301	未检出	未检出	1.18

实验例本发明检测方法的方法学验证

实验例1检测波长的选择

精密称取杂质B、C、D及色氨酸原料适量，用0.1M HCL溶解，并定容至刻度，稀释至适宜浓度，采用紫外-可见分光光度法，在190-400nm波长范围内扫描。结果如图2-5及表3所示。

表3紫外扫描实验结果

由上述数据可知，上述杂质B、C、D的最大吸收波长集中在205.80nm～230.00nm的近末端吸收范围内，综合考虑到复方氨基酸注射液18AA-III成分的复杂性及各个成分紫外吸收强弱的差异，为尽量避免其中18种氨基酸的紫外吸收干扰，拟选择主成分紫外吸收较弱的254nm波长处作为有关物质的检测波长。

实验例2系统适应性

精密量取系统适应性溶液(样品+杂质混合溶液)、对照品溶液各2μl，注入UPLC仪，连续测定6次，计算各峰面积的RSD值不得大于2.0％，理论板数按杂质B(以杂质B2计)计算，应不低于3000，各杂质峰的分离度符合检测的要求。结果如表4所示。

表4系统适应性实验结果

表5系统适应性溶液的重复性实验结果

实验例3专属性

样品配制：

(1)酸降解

精密量取5ml复方氨基酸注射液18AA-III样品，置于10ml量瓶中，加3mol/L盐酸溶液1.0ml，摇匀，室温下放置48h，再加3mol/L氢氧化钠溶液适量调至溶液显中性，用水稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏样品。取空白溶剂和空白辅料同法操作做为酸碱破坏空白样品。

(2)碱降解

精密量取5ml复方氨基酸注射液18AA-II样品，置于10ml量瓶中，加3mol/L氢氧化钠溶液1.0ml，摇匀，室温下放置48h，再加3mol/L盐酸溶液适量调至溶液显中性，用水稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏样品。取空白溶剂和空白辅料同法操作作为酸碱破坏空白样品。

(3)氧化降解

精密量取5ml复方氨基酸注射液18AA-III样品，置于10ml量瓶中，加30％过氧化氢溶液1.0ml，摇匀，室温放置6h，用水稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏样品。取空白溶剂和空白辅料同法操作作为氧化破坏空白样品。

(4)高温降解

精密量取5ml复方氨基酸注射液18AA-III样品，置于10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，置于130℃高温烘箱条件下30分钟，作为高温破坏样品。取空白溶剂和空白辅料同法操作作为高温破坏空白样品。

(5)光照降解

精密量取5ml复方氨基酸注射液18AA-III样品，置于10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，置于紫外灯(照度4500LX)下放置5天，作为光照破坏样品1。取光照5天后并已经开封的，室温放置10天(含光照5天)的样品，作为光照破坏样品2。取空白溶剂和空白辅料同法操作作为光照破坏空白样品。

测试结果：如表6-10所示。

表6酸破坏样品产生主要杂质峰的色谱保留行为

表7碱破坏样品产生主要杂质峰的色谱保留行为

表8氧化破坏样品产生主要杂质峰的色谱保留行为

表9高温破坏样品产生主要杂质峰的色谱保留行为

表10光照破坏样品产生主要杂质峰的色谱保留行为

验证标准：

经强降解实验，产生的降解杂质能够有效检出，且与相邻色谱峰的分离度满足要求，不得小于1.5。

验证结果：

(1)复方氨基酸注射液18AA-III未破坏样品在本发明检测方法的检测下杂质B、D均未检出，杂质C检出量符合要求。空白溶剂、空白样品均无干扰。杂质B、C、D之间的分离度及于相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论踏板数按杂质B计算，不低于3000。

(2)复方氨基酸注射液18AA-III样品经酸、碱、光照、高温条件破坏后，杂质无明显的增长。在氧化条件下，杂质B、C、D均有明显的增长，氧化条件下不稳定。无其他色谱峰成分也无明显的干扰。可见本发明的检测方法专属性良好。

实验例4最小检测限和定量限

在本发明的液相色谱条件下，按仪器噪音的三倍响应值测定杂质B2、杂质C、杂质D的最小检测限,按仪器噪音的十倍响应值测定其定量限。重复6次进样(进样量均为2μl))，检测结果如表11所示，各个杂质的最小检测限和定量限重复性均良好。

表11最小检测限和定量限实验结果

验证标准：

按仪器噪音的三倍响应值测定杂质的最小检测限，测定杂质的保留时间的RSD％(n＝6)＜2.0％，峰面积的重复性RSD％(n＝6)＜10％；按仪器噪音的十倍响应值测定杂质的定量限，测定杂质的保留时间的RSD％(n＝6)＜2.0％，峰面积的重复性RSD％(n＝6)＜5.0％。

验证结果：

杂质B2的最小检测限为0.1μg/ml，其峰面积的RSD<10％；定量限为0.3μg/ml，其峰面积的RSD<5％。

杂质C的最小检测限为0.05μg/ml，其峰面积的RSD<10％；定量限为0.16μg/ml，其峰面积的RSD<5％。

杂质D的最小检测限为0.10μg/ml，其峰面积的RSD<10％；定量限为0.31μg/ml，其峰面积的RSD<5％。

实验例5线性范围

供试样品的配制：

分别精密称取杂质B、杂质C、杂质D适量，用0.1MHCL溶解并定容，制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为各个杂质的对照溶液；从各杂质的对照溶液中分别精密量取0.3ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml和1.5ml溶液至6个10ml量瓶中，用水稀释并定容，摇匀，制成浓度级别分别约为30％、50％、80％、100％、120％和150％的6份线性溶液。另取100％浓度的样品1.0ml至10ml量瓶中，用水定容，作为空白样品溶液。取上述7个浓度的溶液，按本发明的液相色谱条件进行实验。精密量取各溶液2μl分别注入UPLC液相色谱仪，以杂质对照浓度为横坐标和对应的峰面积为纵坐标计算线性回归方程。结果如表12所示。

表12杂质B、C、D的线性范围实验结果

验证标准：

按照限度浓度的15％～150％配制不同浓度的杂质对照品溶液，分别测定杂质的峰面积。以分别测得各个杂质的峰面积为纵坐标，以对应的浓度为横坐标作图，得峰面积A与浓度C的线性回归曲线，计算各个杂质的线性回归方程及相关系数r。且r≥0.990。

验证结果：

杂质B2的线性回归方程为：y＝2785x-4.84，P<0.001，r＝0.9997。在0.3042～1.521μg/ml(限度为0.15％，相当于限度的33.3％～150％)的浓度范围内，杂质B2的峰面积和浓度具有良好的线性关系(符合检测的要求)。如图6所示。

杂质C的线性回归方程：y＝9773x+99.89，P<0.001，r＝0.9998。在0.1563～1.563μg/ml(限度为0.15％，相当于限度的15％～150％)的浓度范围内，杂质C的峰面积和浓度具有良好的线性关系(符合检测的要求)。如图7所示。

杂质D的线性回归方程：y＝3277x+234.2，P<0.001，r＝0.9998。在0.3135～1.5675μg/ml(限度为0.15％，相当于限度浓度的33.3％～150％)的浓度范围内，杂质D的峰面积和浓度具有良好的线性关系(符合检测的要求)。如图8所示。

实验例6溶液的稳定性

考察杂质对照溶液在室温条件下放置的日内溶液稳定性，以及在低温(2-10℃)条件下放置的日间溶液稳定性。精密量取杂质混合对照溶液2μl，日间稳定性按时间间隔0h、2h、4.5h、7h、9.5h、12.5h、40h等分别进样分析，日内稳定性按0、1、2天的时间安排进行考察。结果如表13-14所示。

表13杂质混合对照溶液室温条件下的稳定性实验结果

表14杂质混合对照品溶液低温(2-10℃)条件下的稳定性实验结果

验证标准：

按照实施例的方法配制杂质混合对照溶液，测定峰面，在室温和低温(2-10℃)条件下分别贮存，在不同时间点测定杂质峰面积，每个时间点与其初始峰面积进行对比，平均偏差不得大于2.0％，并不得出现新的大于报告限度的杂质。

验证结果：

杂质混合对照溶液在室温条件下放置，杂质B和杂质D峰面积变化在7h、9.5h及40h内的RSD值均大于2.0％，且趋势一致，认为其峰面积的变化较大并不表明该杂质溶液不稳定，而是由于杂质B和杂质D的响应值较小，在系统积分时容易引起积分差别导致的；可以判定稳定性良好。杂质C在该条件下响应值较大，峰面积变化在40h内均显示RSD％小于2.0％。

杂质混合对照溶液在2天内可以保持稳定；同上。

实验例7准确度

分别精密称取杂质B、杂质C、杂质D适量，用0.1MHCL溶解并定容，制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为杂质对照贮备液；从各杂质贮备液中分别精密量取0.5ml、1.0ml和1.5ml至9个10ml量瓶中，每个浓度级别平行3份，另精密量取本品溶液5ml，至上述9个不同容量瓶中，分别用超纯水稀释并定容，摇匀，制成浓度级别分别约为50％、100％和150％的9份杂质+样品混合溶液，作为加样回收率的供试品溶液。另精密量取1.0ml复方氨基酸注射液18AA-III样品至10ml量瓶中，用超纯水稀释定容，作为空白供试品溶液。结果如表15-17所示。

表15杂质B(以杂质B2计)的准确度实验结果

表16杂质C的准确度实验结果

表17杂质D的准确度实验结果

验证标准：

按照杂质B、C、D限度浓度0.15％(1.95μg/ml)的15％～150％进行回收率实验,根据《中国药典》2015年四部通则9101规定，杂质B、C、D的准确度应在90～108％；重现性(n＝9)≤6.0％。检测结果符合要求。

验证结果：

杂质B的回收率范围为96.57％～102.78％，平均回收率为100.18％，9份样品的RSD为2.24％；

杂质C的回收率范围为101.68％～104.64％，平均回收率为103.53％，9份样品的RSD为1.15％；

杂质D的回收率范围为100.93％～103.77％，平均回收率为102.51％，9份样品的RSD为1.10％。

可见本发明的检测方法检测杂质B、C、D的准确度良好。

实验例8精密度

精密量取系统适应性溶液(样品+杂质混合溶液)，重复进样6次，依本发明的检测方法进行检测。结果如表18所示。

表18精密度实验结果

验证标准：

因为样品中未检出杂质B、杂质D，只检出杂质C，故采用样品加杂质对照品限度浓度的混合样品进行试验。

根据《中国药典》2015年四部通则9101规定，本品杂质含量限度是0.15％，应为重复性(n＝6)≤3.0％；重现性(n＝12)≤6.0％作为判断标准。

验证结果：

重复性实验的样品+杂质混合溶液连续重复进样6针，杂质B、D、C的保留时间和峰面积的RSD均小于3.0％，重复性良好。

两次中间精密度的12组数据的实验结果为：杂质B(以杂质B2计)的含量为2.14μg/ml，RSD为2.01％；杂质D的含量为2.30μg/ml，RSD为1.89％；杂质C的含量为2.17μg/ml，RSD为0.81％。检出结果符合要求，该测定方法的精密度良好。

实验例9耐用性

按照本发明的方法制备对照品溶液、样品溶液及样品+杂质混合溶液，通过改变进样量、柱温、流速、波长和更换不同色谱柱等条件，考察影响条件下各个杂质含量的变化。结果如表19-20所示。

表19耐用性实验结果(样品)

表20耐用性实验结果(样品+杂质混合)

结果表明，在本色谱条件下，波长，流速、进样量、柱温及不同厂家的色谱柱等条件稍做改变时对本品中杂质的检测结果影响不大；且各个杂质的分离度和响应值均未发生明显改变，方法耐用性良好，均能很好的检出杂质。

验证标准：

改变进样量、柱温、流速、波长和更换不同色谱柱等条件，考察影响条件下各个杂质含量的变化。根据复方氨基酸注射液18AA-III样品的实际情况考虑，建议将系统变化范围内的含量检出偏差的要求适当放宽至不得大于5.0％即可。

验证结果：

流速、柱温、波长的适当变化，对杂质B、C的含量检测影响不明显，但是对杂质D的含量检测影响较为明显，却不是很大，可能是由于杂质D响应值较小，系统积分的差别引起，可以在接受范围内。

综上，按照2015版药典四部通则9101中要求，本发明针对专属性、检测限、定量限、线性范围、溶液稳定性、准确度、精密度、耐用性对本发明的检测方法进行了验证，验证结果符合预期要求，因此认为本发明用于检测复方氨基酸注射液18AA-III中杂质B、C、D的方法准确、可靠。

Claims (6)

1.一种测定含色氨酸的复方氨基酸注射液中杂质B、C、D含量的检测方法，其特征在于，采用超高效液相色谱法，所采用的色谱条件包括：色谱柱为2.1×100mm,1.7μm的C18色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，检测波长为254nm，流速为0.3～0.4ml/min，柱温为40～45℃，稀释剂为超纯水，稀释倍数为2倍，进样体积为1-5μl；

其中，所述杂质B、C、D分别为二吲哚基-L-丙氨酸、N-甲酰-L-犬尿氨酸、5-羟基色氨酸；

其中，所述流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为pH＝2.1～2.3的磷酸盐缓冲液，所述流动相B为色谱纯的甲醇；

其中，所述梯度洗脱的条件为：

0min：97％流动相A，3％流动相B；

0.68min：97％流动相A，3％流动相B；

2.04min：88％流动相A，12％流动相B；

4.08min：88％流动相A，12％流动相B；

4.35min：97％流动相A，3％流动相B；

5.5min：97％流动相A，3％流动相B；

15min：97％流动相A，3％流动相B。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流速为0.4ml/min。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述柱温为40℃。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH＝2.3。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液由以下方法制备：在每1L 3.9g/L的磷酸二氢钠溶液中加入约800ml2.9g/L的磷酸溶液至pH达到预定值为止。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，根据所述色谱条件所计算出的理论塔板数按杂质B2计，大于等于3000；

其中，所述B2是指在杂质B的双峰中，按照出峰顺序所出的第二个峰。

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