CN113533594A - 用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒 - Google Patents

用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒 Download PDF

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CN113533594A CN202110738125.4A CN202110738125A CN113533594A CN 113533594 A CN113533594 A CN 113533594A CN 202110738125 A CN202110738125 A CN 202110738125A CN 113533594 A CN113533594 A CN 113533594A
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Abstract

本申请涉及化合物含量测定方法,具体涉及用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒。该方法包括:将样品中的氨甲环酸与衍生化试剂进行衍生化反应,得到氨甲环酸衍生化物;使用超高效液相色谱法或超高效液相色谱‑质谱联用法测定样品中的氨甲环酸的含量。该试剂盒包含:氨甲环酸标准曲线工作液、氨甲环酸质控工作液、内标工作液、衍生化试剂和稀释剂。该方法和试剂盒适用于检测人血浆或其他液体形式复杂基质中氨甲环酸的含量测定。

Description

用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒
技术领域
本申请涉及化合物含量测定方法,具体涉及采用超高效液相色谱法或超高效液相色谱-质谱联用法测定氨甲环酸含量的方法,以及用于该测定方法的试剂盒。
背景技术
氨甲环酸(Tranexamic Acid),又名传明酸、凝血酸、止血环酸,分子式为C8H15NO2,分子量为157.21,化学名称为反-4-氨甲基环已烷甲酸。
Figure BDA0003142274530000011
纤溶现象与机体在生理或病理状态下的纤维蛋白分解、血管通透性增加等有关,亦与纤溶引起的机体反应、各种出血症状及变态反应等的发生发展和治愈相关。氨甲环酸可抑制这种纤溶酶的作用,而表现出止血、抗变态反应、消炎效果。
氨甲环酸在治疗浓度(5-10μg/mL)时血浆蛋白结合率极低(约3%),肾、肝的药物浓度高于血液,而在其他脏器中的浓度比血液浓度低,其给药量的40-70%经肾脏代谢,以原型经尿排出。
随着我国老年人口占比逐年增加,出现肾功能下降的人群也在扩大,而这类人群也是心血管方面疾病的高发人群。肾功能下降或不全可能会使血药浓度升高,而氨甲环酸可能使这类患者有血栓稳定化的倾向。因此对于有肾功能下降或不全的患者来说,开展氨甲环酸血药浓度定量监测是非常有必要的。
在文献Qi Chang,Ophelia Q.P.Yin,Moses S.S.Liquid chromatography–tandemmass spectrometry method for the determination of tranexamic acid in humanplasma.Clinical Trial[J],J.Chromatogr.B 805(2004)275–2802001,51(3):189-196中,使用LC-MS/MS建立方法,等度洗脱,色谱柱为XtrraTM MS C18 Column,采用甲基多巴为内标,血浆用量200μL,使用高氯酸除去蛋白质提取氨甲环酸,经高速离心后取上清用于进样,进样时间5min。该方法的主要缺陷为:高氯酸具有腐蚀性,进入质谱后,对质谱造成损害,影响质谱的灵敏度,不适用于大批量样本检测;高氯酸属于易制爆化学品,其购买、保存均不方便,使用过程也存在危险性,对方法使用的单位或人员有严格要求,不适合普及;单针样品进样时间为5.5min,进样效率低;内标选择不合理。
在文献《氨甲环酸胶囊的药物动力学及生物等效性》,杨丽君、王峰、刘晓磊、朱运贵,中国医药工业杂志[J],2008,39(4):273-275中,使用LC-MS建立方法,等度洗脱,色谱柱为Thermo C18 Column,采用甲氧苄啶为内标,血浆用量300μL,使用乙腈除去蛋白质提取氨甲环酸,经高速离心后取上清用于进样,进样时间5.5min。该方法的主要缺陷为:使用的质谱检测器为单四极杆,不能做MS/MS模式,无法区分血浆中具有相同质荷比的源内性物质的干扰,且灵敏度比较差;内标物选择不合理,氨甲环酸极性大,而内标极性恰好相反,从色谱图中也可以看出两者色谱保留行相差较大;流动相盐浓度过高(30mM),一般要求盐浓度不超过10mM;因为高浓度盐对质谱的离子化效率有抑制作用,而且对色谱柱的使用寿命有较大影响;另外,液相高压泵头内存在高压析盐现象,析出的细小盐粒,容易磨损密封垫,造成漏液等故障现象;单针样品进样时间为5.5min,进样效率低。
在文献Nicolas Fabresse,Fanta Fall,Isabelle Etting,Philippe Devillier,Jean-Claude Alvarez,Stanislas Grassin-Delyle.LC–MS/MS determination oftranexamic acid in human plasma afterphospholipid clean-up[J],Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis 141(2017)149–156中,使用LC-MS/MS建立方法,梯度洗脱,色谱柱为Accucore Urea HILIC column,采用4-氨基环己烷甲酸为内标,血浆用量50μL,使用Ludox AS-40(硅溶胶)、氯化镧除磷脂后,再用甲醇除去蛋白质提取氨甲环酸,经高速离心后取上清用于进样。该方法的主要缺陷为:生物样品分析方法的相关法规要求,定量下限应能满足测定3-5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10-1/20的药物浓度;氨甲环酸在治疗浓度(5-10μg/mL)时血浆蛋白结合率极低(约3%);药代动力学研究时,使用的药物剂量(250mg)更低,最大血药浓度约2.5μg/mL;该文献定量下限浓度为1μg/mL,明显偏高;样品前处理使用多种试剂,先后使用Ludox AS-40(硅溶胶)、氯化镧进行反应来除去血浆中磷脂,再使用甲醇除去血浆中的蛋白,涉及多个环节,操作过程繁琐、耗时,影响工作效率。
目前需要建立简便、快速、准确、可靠定量氨甲环酸在样品尤其是复杂基质样品中含量的方法,并开发用于该方法的试剂盒,使其适用于检测人血浆或其他液体形式复杂基质中氨甲环酸的含量测定。
发明内容
本申请的一个或多个实施方式提供了测定氨甲环酸含量的方法,包括:
将样品中的氨甲环酸与衍生化试剂进行衍生化反应,得到氨甲环酸衍生化物;
使用超高效液相色谱法或超高效液相色谱-质谱联用法测定样品中的氨甲环酸的含量。
在一个或多个实施方式中,超高效液相色谱-质谱联用法包括采用一级质谱法或二级质谱法进行检测。
在一个或多个实施方式中,所述样品为包含复杂基质的样品。
在一个或多个实施方式中,所述样品为包含液体复杂基质的样品。
在一个或多个实施方式中,所述样品为血浆样品。
在一个或多个实施方式中,所述样品为人血浆样品。
在一个或多个实施方式中,其中在测定所述样品中氨甲环酸的含量前,使所述样品与蛋白质沉淀剂进行沉淀反应。
在一个或多个实施方式中,将所述衍生化反应和沉淀反应同时进行。
在一个或多个实施方式中,所述蛋白质沉淀剂为乙腈和/或甲醇。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化试剂为C2-C10酸酐。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化试剂为丙酸酐或乙酸酐。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化试剂为1%-15%丙酸酐的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化试剂为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%丙酸酐的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化试剂为10%丙酸酐的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,应用外标法或内标法测定样品中的氨甲环酸的含量。
在一个或多个实施方式中,在所述内标法中使用的内标物为氨甲环酸-13C2,15N。
在一个或多个实施方式中,所述内标物为氨甲环酸-13C2,15N的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,内标物的浓度为1-100ng/mL。
在一个或多个实施方式中,内标物的浓度为1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。
在一个或多个实施方式中,内标物的浓度为50ng/mL。
在一个或多个实施方式中,使用超高效液相色谱-质谱联用法、应用内标法测定样品中的氨甲环酸的含量。
在一个或多个实施方式中,将所述样品中的氨甲环酸和内标物同时进行衍生化反应。
在一个或多个实施方式中,将所述样品中的氨甲环酸和内标物的衍生化反应与沉淀反应同时进行。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合并振荡。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合后离心取上清液。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合后离心取上清液,将所述上清液稀释。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合后离心取上清液,将所述上清液使用甲酸水溶液稀释。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合后离心取上清液,将所述上清液使用甲酸水溶液稀释,所述甲酸水溶液的浓度为0.1%-1%。
在一个或多个实施方式中,所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合后离心取上清液,将所述上清液使用甲酸水溶液稀释,所述甲酸水溶液的浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%。
在一个或多个实施方式中,所述甲酸水溶液的浓度为0.3%。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,色谱柱为C18色谱柱。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,色谱柱为Waters ACQUITY
Figure BDA0003142274530000041
HSS T3 1.8μm,2.1×50mm。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,流动相为乙酸铵-乙腈。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,乙酸铵的浓度为1-10mM。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,乙酸铵的浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,乙酸铵的浓度为5mM。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,所述乙酸铵含0.1-1%(V/V)甲酸。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,所述乙酸铵含0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%(V/V)甲酸。
在一个或多个实施方式中,所述超高效液相色谱法中,所述乙酸铵含0.3%(V/V)甲酸。
本申请的一个或多个实施方式提供了测定氨甲环酸含量的试剂盒,包含:
氨甲环酸标准曲线工作液;
氨甲环酸质控工作液;
内标工作液;
衍生化试剂;
稀释剂。
在一个或多个实施方式中,氨甲环酸标准曲线工作液的浓度为100000.000、80000.000、54000.000、18000.000、9000.000、3000.000、1000.000、500.000ng·mL-1
在一个或多个实施方式中,氨甲环酸质控工作液的浓度为75000.000、40000.000、17000.000、1500.000ng·mL-1
在一个或多个实施方式中,内标工作液为氨甲环酸-13C2,15N的溶液。
在一个或多个实施方式中,内标工作液为氨甲环酸-13C2,15N的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,内标工作液的浓度为1-100ng·mL-1
在一个或多个实施方式中,内标工作液的浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100ng·mL-1
在一个或多个实施方式中,内标工作液的浓度为50ng·mL-1
在一个或多个实施方式中,衍生化试剂为C2-C10酸酐。
在一个或多个实施方式中,衍生化试剂为丙酸酐或乙酸酐。
在一个或多个实施方式中,衍生化试剂为1%-15%丙酸酐的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,衍生化试剂为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%丙酸酐的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,衍生化试剂为10%丙酸酐的乙腈溶液。
在一个或多个实施方式中,稀释剂为甲酸水溶液。
在一个或多个实施方式中,稀释剂为0.1%-1%甲酸水溶液。
在一个或多个实施方式中,稀释剂为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%甲酸水溶液。
在一个或多个实施方式中,稀释剂为0.3%甲酸水溶液。
本申请的一个或多个实施方式提供了本申请的试剂盒在测定氨甲环酸含量中的用途。
本申请的一个或多个实施方式提供了C2-C10酸酐在测定氨甲环酸含量中的用途。
本申请的一个或多个实施方式提供了乙酸酐或丙酸酐在测定氨甲环酸含量中的用途。
本申请的一个或多个实施方式提供了
Figure BDA0003142274530000051
在测定氨甲环酸含量中的用途,其中R为H、甲基、乙基或丙基。
本申请的一个或多个实施方式提供了
Figure BDA0003142274530000052
在测定氨甲环酸含量中的用途。
在一个或多个实施方式中,采用本申请的检测方法,进样时间(UPLC-MS运行时间)可缩短至2分钟。
在一个或多个实施方式中,采用本申请的检测方法,目标物氨甲环酸的在样品中的检测下限浓度为25ng/ml。
在一个或多个实施方式中,采用C18柱色谱柱,衍生化后的氨甲环酸极性降低,有利于实现目标物在色谱柱中适当的保留时间,进而使目标物在质谱上远离低质量轴端,从而使目标质谱峰远离低质量轴端的干扰,提高响应度,更利于检测。
本申请通过大量实验摸索,筛选出合适的衍生化试剂,优化了方法参数,设定并设定了合理的线性范围,并且验证了方法灵敏度、准确度和精密度、稳定性、干扰试验等各项性能,获得了定量试剂盒所需的基本参数,并应用到实际生物样本中的定量测试与评估。
具体而言,本申请的一个或多个技术方案具有如下有益效果的至少一种:
确定了衍生化试剂和条件,具体而言,样品中的氨甲环酸和的氨甲环酸-13C2,15N参与衍生化反应,其他物质不参与衍生化反应;
衍生化改变了氨甲环酸原型化合物的极性,改善了色谱行为,且远离质谱低质量轴端;
降低了氨甲环酸样品的干扰、噪音,提高了灵敏度;
克服了现有方法的样品前处理方法或液相条件对仪器性能的影响;
克服了现有方法单针进样时间长、进样效率低的缺点;和/或
克服了现有方法内标性质与待测物性质相差较大、校正作用差、影响数据可靠性的缺点。
附图说明
图1:血浆中氨甲环酸的定量标准曲线。
具体实施方式
本申请所有仪器和试剂均可通过市售途径获得,其中氨甲环酸内标物购自Toronto Research Chemicals(TRC),产品批号:21-IHB-39-2。
实施例1
样品衍生化方法
使氨甲环酸与衍生化试剂进行衍生化反应,得到新的化合物,再进行定量。具体操作如下:
取血浆样品100μL转移至96孔聚丙烯板(或聚丙烯EP管),加入200μL的50.000ng·mL-1的氨甲环酸-13C2,15N乙腈溶液作为含内标物(氨甲环酸-13C2,15N)的沉淀剂(含内标),再加入100μL衍生试剂,室温振荡10min,进行衍生化反应,然后室温条件下离心(4000rpm,20min),取上清50μL转移到96孔聚丙烯板(或聚丙烯EP管),加入500μL稀释剂(0.3%甲酸水溶液),混匀即可进样分析。具体方法步骤如下:
(1)衍生化方法
氨甲环酸结构中存在游离的氨基,选择含10%丙酸酐的乙腈溶液作为衍生化试剂,反应条件如下:
取含氨甲环酸的血浆样品100μL,加入200μL内标工作液(50.000ng·mL-1的氨甲环酸-13C2,15N的乙腈溶液),再加入100μL衍生试剂(10%丙酸酐的乙腈溶液),室温振荡10min,即完成衍生化(V血浆:V乙腈/内标:V=1:2:1)。
通过衍生化后,氨甲环酸氨基与丙酸酐发生反应,得到分子量为213.21的化合物
Figure BDA0003142274530000071
远离质谱低质量轴端。
(2)样品前处理方法
衍生化完成后,在室温条件下离心(4000rpm,20min),取上清50μL转移到96孔聚丙烯板,加入500μL稀释剂混匀,即可进样分析。
(3)液相条件
流动相:A相:5mM乙酸铵水溶液(0.3%甲酸);B相:乙腈
洗脱条件:梯度洗脱。
(4)内标物选择
采用同位素内标物:氨甲环酸-13C2,15N,其理化性质和氨甲环酸几乎一致,在样品前处理过程及进样过程中均能起到很好的校正作用。
实施例2
定量试剂盒的制备
制备氨甲环酸标准曲线工作液:浓度分别为100000.000、80000.000、54000.000、18000.000、9000.000、3000.000、1000.000、500.000ng·mL-1
制备氨甲环酸质控工作液:浓度分别为75000.000、40000.000、17000.000、1500.000ng·mL-1
制备内标工作液浓度:50ng·mL-1的氨甲环酸-13C215N乙腈溶液(蛋白沉淀剂)。
制备衍生化试剂:10%丙酸酐乙腈溶液。
制备稀释剂:0.3%甲酸水溶液。
实施例3
测定待测物和内标物的定量离子特征,结果如下:
化合物 母离子 子离子
氨甲环酸衍生物 214.07 95.38
氨甲环酸-<sup>13</sup>C<sub>2,</sub><sup>15</sup>N衍生物 217.11 170.21
实施例4
用试剂盒进行衍生化、制作标准曲线、检测待测物浓度
(1)试剂盒组成
本申请所述试剂盒包含了实物:氨甲环酸标准曲线工作液,质控工作液,乙腈配制的内标工作液,衍生化试剂,稀释剂。
试剂盒包含LC-MS/MS检测参数:
液相色谱条件:见如下表1
Figure BDA0003142274530000081
质谱仪条件:见如下表2
Figure BDA0003142274530000091
本申请的试剂盒包含了定量结果判断标准:相关系数r2≥0.9801或r≥0.9900;校正标样的回算浓度在标示值的85%~115%范围内,定量下限在标示值的80%~120%范围内;至少75%的校正标样且最少6个浓度水平应符合上述标准。
(2)试剂盒规定的衍生化方法
取含氨甲环酸的血浆样品100μL,加入200μL内标工作液(50.000ng·mL-1的氨甲环酸-13C215N乙腈溶液),再加入100μL衍生试剂(10%丙酸酐乙腈),室温振荡10min,即完成衍生化(V血浆:V乙腈/内标:V=1:2:1)。
(3)试剂盒规定的前处理化方法
衍生化完成后,在室温条件下离心(4000rpm,20min),取上清50μL转移到96孔聚丙烯板,加入500μL稀释剂混匀,即可进样分析。
(4)试剂盒中标准曲线标准血浆样品配制
取氨甲环酸标准曲线工作液,用空白血浆稀释20倍,配制成含不同待测物浓度的8个标准曲线标准血浆样品,浓度分别为25、50、150、450、900、2700、4000、5000ng·mL-1
(5)试剂盒中质控标准血浆样品配制
取氨甲环酸标准曲线工作液,用空白血浆稀释20倍,配制成含不同待测物浓度的8个标准曲线标准血浆样品,浓度分别为75、850、2000、3750ng·mL-1
(6)试剂盒的结果计算与统计方式
进样到质谱系统分析,记录待测物与内标的响应,并计算待测物与内标的响应比值。以氨甲环酸与内标的响应比值(Y)为纵坐标,以系列标准血浆样品浓度(X)为横坐标,进行线性回归,得到线性回归方程及相关系数。将系列标准血浆样品中待测物与内标的响应比值,代入线性回归方程计算,标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。
(7)试剂盒相关指标验证例——标准曲线
按照(2)-(5)的方法配制并处理进样标准曲线和质控标准血浆样品,进样到质谱系统分析,记录待测物与内标的响应,并计算待测药物与内标的响应比值。以氨甲环酸与内标的响应比值(Y)为纵坐标,以系列标准血浆样品浓度(X)为横坐标,使用权重因子(1/X2),通过最小二乘法进行线性回归,得到线性回归方程及相关系数。将系列标准血清样品中待测物与内标的响应比值,代入线性回归方程计算,标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。
血浆中氨甲环酸的定量标准曲线见图1,各标准曲线样品准确度及线性关系均满足要求,表明线性定量效果良好,本试剂盒测试人血浆中氨甲环酸的线性范围可达25~5000ng·mL-1
(8)试剂盒相关指标验证例——准确度和精密度验证
配制氨甲环酸质控标准血浆样品LLOQ、LQC、LMQC、HMQC、HQC各6份,其中多塞平的浓度依次为25、75、850、2000、3750ng·mL-1,按照(2)-(5)的所述方法处理,进样到质谱系统分析。记录待测物与内标响应的比值并代入对应所得线性回归方程,计算各样品浓度,将其与样品标示值比较,并据此计算批内精密度和准确度。
接受标准:LLOQ测得浓度均值的准确度应在标示值的80%~120%范围内,且至少2/3样品准确度偏差在标示值的±20%之内;其它质控浓度标准尿液样品测得浓度的均值的准确度应在标示值的85%~115%范围内,且每个浓度至少2/3样品准确度偏差在标示值的±15%之内;定量下限精密度不得超过20%,其它质控浓度的精密度不得超过15%。
本申请的准确度和精密度验证实验结果见下表3。结果表明,本试剂盒对5个不同浓度质控品各重复测定6次,氨甲环酸的准确度偏差不超过标示值的-5.21%~8.05%,符合接受标准,方法和试剂盒的准确度合格。各质控品6次测量结果中,氨甲环酸的精密度CV%在1.15%~2.20%,符合接受标准,方法和试剂盒的精密度合格。
表3试剂盒准确度和精密度验证结果
Figure BDA0003142274530000111
(9)试剂盒相关指标验证例——回收率评价
取6份不同来源的空白血浆,配制低、高浓度质控血浆样品(LQC、HQC)各6份,氨甲环酸的浓度依次为75、3750ng·mL-1,按本申请描述的衍生化方法处理,然后进样到色谱/质谱系统分析,记录氨甲环酸的响应(A1)作为待测物提取后面积。
取6份不同来源的空白血浆,按本申请描述的衍生化方法处理获得空白提取基质,然后分别加入低、高质控工作溶液,然后进样到色谱/质谱系统分析。记录氨甲环酸的响应(B1)作为待测物未提取面积。
血浆样品中氨甲环酸的回收率为R1=A1/B1×100%。
接受标准:同一浓度样品回收率变异系数不超过15%,不同浓度样品之间的回收率无明显差别。
回收率比对结果见表4。低、高质控浓度的平均提取回收率分别为98.46%、92.98%,变异系数分别为1.79%、1.36%,均符合接受标准,表明方法和试剂盒的回收率高、稳定。
表4试剂盒固相萃取处理2种待测物的回收率评价
Figure BDA0003142274530000121

Claims (10)

1.测定氨甲环酸含量的方法,包括:
将样品中的氨甲环酸与衍生化试剂进行衍生化反应,得到氨甲环酸衍生化物;
使用超高效液相色谱法或超高效液相色谱-质谱联用法测定样品中的氨甲环酸的含量。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述样品为包含复杂基质的样品;优选地,所述样品为包含液体复杂基质的样品;更优选地,所述样品为血浆样品;更优选地,所述样品为人血浆样品。
3.如权利要求1所述的方法,其中在测定所述样品中氨甲环酸的含量前,使所述样品与蛋白质沉淀剂进行沉淀反应;优选地,将所述衍生化反应和沉淀反应同时进行;更优选地,所述蛋白质沉淀剂为乙腈和/或甲醇。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述衍生化试剂为C2-C10酸酐;优选地,所述衍生化试剂为丙酸酐或乙酸酐;更优选地,所述衍生化试剂为1%-15%丙酸酐的乙腈溶液;更优选地,所述衍生化试剂为10%丙酸酐的乙腈溶液。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中应用外标法或内标法测定样品中的氨甲环酸的含量;优选地,在所述内标法中使用的内标物为氨甲环酸-13C2,15N;更优选地,所述内标物为氨甲环酸-13C2,15N的乙腈溶液;更优选地,内标物的浓度为1-100ng/mL;更优选地,内标物的浓度为50ng/mL。
6.如权利要求5所述的方法,其中使用超高效液相色谱-质谱联用法、应用内标法测定样品中的氨甲环酸的含量;优选地,将所述样品中的氨甲环酸和内标物同时进行衍生化反应;更优选地,其中将所述样品中的氨甲环酸和内标物的衍生化反应与沉淀反应同时进行。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述衍生化反应为将氨甲环酸与衍生化试剂混合;优选地混合并振荡;优选地,混合后离心取上清液;更优选地,将所述上清液稀释;更优选地,使用甲酸水溶液稀释;更优选地,所述甲酸水溶液的浓度为0.1%-1%;更优选地,所述甲酸水溶液的浓度为0.3%。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述超高效液相色谱法中,色谱柱为C18色谱柱,更优选地所述色谱柱为Waters ACQUITY
Figure FDA0003142274520000011
HSS T3 1.8μm,2.1×50mm;更优选地,所述流动相为乙酸铵-乙腈;优选地所述乙酸铵的浓度为1-10mM,优选地5mM;更有效地,所述乙酸铵含0.1-0.5%(V/V)甲酸,优选地0.3%(V/V)甲酸。
9.测定氨甲环酸含量的试剂盒,包含:
氨甲环酸标准曲线工作液;优选地,其浓度为100000.000、80000.000、54000.000、18000.000、9000.000、3000.000、1000.000、500.000ng·mL-1
氨甲环酸质控工作液;优选地,其浓度为75000.000、40000.000、17000.000、1500.000ng·mL-1
内标工作液;优选地,其为氨甲环酸-13C2,15N的溶液;更优选地,其为氨甲环酸-13C2,15N的乙腈溶液;更优选地,其浓度为1-100ng·mL-1;更优选地,其浓度为50ng·mL-1
衍生化试剂;优选地,其为C2-C10酸酐;优选地,其为丙酸酐或乙酸酐;更优选地,其为1%-15%丙酸酐的乙腈溶液;更优选地,其为10%丙酸酐的乙腈溶液;
稀释剂;优选地,其为甲酸水溶液;更优选地,其为0.1%-1%甲酸水溶液;更优选地,其为0.3%甲酸水溶液。
10.权利要求9所述的试剂盒以及以下物质在测定氨甲环酸含量中的用途:
C2-C10酸酐,优选地乙酸酐、丙酸酐;
Figure FDA0003142274520000021
其中R为H、甲基、乙基或丙基;优选地,R为甲基或乙基;更优选地
Figure FDA0003142274520000022
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