CN114858949A - 克伦特罗的应用、检测药物浓度的方法、试剂盒及应用 - Google Patents

克伦特罗的应用、检测药物浓度的方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及血药浓度监测的技术领域，更具体涉及克伦特罗的应用、检测药物浓度的方法、试剂盒及其应用。本申请提供的检测方法和试剂盒通过了解化合物的性质，选择离子化稳定的一类化合物来作为内标，用来校准样品提取、HPLC进样及色谱分离和检测中产生的偏差，从而实现准确定量，解决了目前氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类等化合物内标的缺乏或者同位素内标昂贵的问题，可用于以上化合物的血药浓度监测。

Description

克伦特罗的应用、检测药物浓度的方法、试剂盒及应用
技术领域
本申请涉及血药浓度监测的技术领域，更具体地说，涉及克伦特罗的应用、检测药物浓度的方法、试剂盒及其应用。
背景技术
目前，治疗药物监测（TDM）常用的分析方法主要包括免疫学方法、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）。其中，TDM传统的分析技术主要以免疫学方法为主。免疫学方法具有灵敏度高、分析速度快、自动化程度高、操作简便等优点，适合大批量样品的测定，但是受药物抗体种类的限制，绝大多数TDM药物没有合适的抗体供应，也不能够同时测定多种药物或代谢物。HPLC具有专属性强、线性范围比较广、稳定性相对好，成本低，普及率高等优点，但是HPLC的灵敏度低，样本前处理分析周期长，有时不能兼顾多种物质同时检测。而LC-MS/MS具有灵敏度高，特异性强，分析速度快以及高通量等优点，已经成为生物样本分析定量的金标准。
相关技术中LC-MS/MS在TDM中主要采用同位素内标法和外标法进行定量检测。然而，利用同位素内标法检测人血清中的血药浓度时，需要用到同位素内标化合物，一方面，由于稳定的同位素内标化合物合成代价过高或合成难度太大，难以实现商品化，故绝大多数的血药浓度监测不存在商品化的同位素内标化合物；另一方面，由于检测人血清中的血药浓度时，绝大多数血药浓度会较高，对于存在商品化的同位素内标化合物，血药浓度监测过程中同位素内标化合物的使用量会较大，会给血药浓度监测造成昂贵的成本。外标法定量检测人血清中的血药浓度时，检测前期需要进行样本净化，样本净化需要利用蛋白沉淀法（PPT）去除血清中的蛋白，然后进行多步稀释才可进样检测；然而，多步稀释会引入较大的误差，从而导致对人血清中血药浓度的定量结果不准，给外标法定量检测造成了较大的困难。
发明内容
为了提供一种成本低，且可以用于同时检测多种药物浓度的检测方法，本申请提供克伦特罗的应用、检测药物浓度的方法、试剂盒及其应用。
第一方面，本申请提供克伦特罗在检测药物浓度的方法中作为内标化合物的应用。
优选地，所述药物选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类化合物。
优选地，所述药物选自亚胺培南、西司他丁、美罗培南、伏立康唑、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。
优选地，所述克伦特罗可用于同时检测两种及两种以上的药物。
在药物浓度的检测中，通常采用内标法。同位素内标化合物（内标）作为一种化学物质，通常与待检测化合物密切相关。在内标法中，样品为待测样，待检测化合物存在于样品中；对样品进行一系列处理后制备获得样本。在样本制备过程中添加合适的内标，能提高待检测化合物定量的准确性。在分析开始之前，将内标按已知固定的浓度添加到样品和特定基质配制的标准曲线溶液中，随后进行样品处理，获得待测样本，并在质谱仪上进行检测。内标的适宜性可以弥补样品提取、HPLC进样及色谱分离和检测中产生的偏差。如果标准曲线的基质与样本的基质不同，内标认为能矫正基质效应的影响。通过待检测化合物响应（以峰面积表示）与内标响应的比值得到标化的待检测化合物响应。将已知浓度的分析物和标准曲线中分析物与内标响应的比值拟合标准曲线，通过未知样品的响应值计算该样品中待检测化合物的浓度。
第二方面，本申请提供一种检测药物浓度的方法，采用如下技术方案：
一种检测药物浓度的方法，所述方法包括配置内标工作液；所述内标工作液中的内标化合物为克伦特罗。
优选地，所述药物选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类化合物。
优选地，所述药物选自亚胺培南、西司他丁、美罗培南、伏立康唑、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。
优选地，所述检测药物浓度的方法是采用LC-MS/MS进行的。
优选地，所述LC-MS/MS的色谱条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8；
流动相A：含0.1%甲酸的水；
流动相B：含0.1%甲酸的甲醇：乙腈的体积比为1：1；
流速：0.35-0.45mL/min；
进样体积：4-6μL；
柱温：35-45℃；
所述LC-MS/MS的质谱条件为：
离子源为ESI+离子源：
检测方式为正离子检测；
扫描方式为多反应监测MRM。
优选地，所述色谱柱的规格为2.1x50mm，粒径为1.7μm；
梯度洗脱程序如下：
Figure 568142DEST_PATH_IMAGE001
优选地，所述内标工作液中内标化合物的浓度为150ng/mL。
在一个实施方案中，所述内标工作液的配制具体如下：称取内标化合物标准品10.000mg于玻璃样品瓶中，加入50%甲醇水溶液，溶解完全之后得到浓度为1.000mg/mL的内标储备液。取适量内标储备液，用甲醇稀释，配制成浓度为150ng/mL的内标工作液。
第三方面，本申请提供一种试剂盒，采用如下技术方案：
一种用于检测药物浓度的试剂盒，所述试剂盒包括内标化合物克伦特罗。
优选的，所述试剂盒还包括检测药物浓度必备的试剂。
优选地，所述药物选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类化合物。
优选地，所述药物选自亚胺培南、西司他丁、美罗培南、伏立康唑、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。
第四方面，本申请的试剂盒在检测药物浓度中的应用。
优选地，所述应用是在检测人血清中药物浓度的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请发现了克伦特罗在检测药物浓度中作为内标物的应用。本申请发现，在使用克伦特罗作为内标物来检测药物的浓度时，可以校准样品提取、HPLC进样及色谱分离和检测中产生的偏差，从而实现准确定量，填补了目前氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类等化合物缺乏内标物的空白，并且，克伦特罗与昂贵的现有同位素内标物相比是廉价的，降低了内标物成本。
附图说明
图1为头孢哌酮杂质A的色谱图。
图2为氯雷他定的色谱图。
图3为罗哌卡因的色谱图。
图4为来曲唑的色谱图。
图5为氯唑沙宗的色谱图。
图6为吲哚美辛的色谱图。
图7为氟比洛芬的色谱图。
图8为硫酸安普霉素的色谱图。
图9为多粘菌素B硫酸盐的色谱图。
图10为硫酸卡那霉素的色谱图。
图11为替米考星的色谱图。
图12为克伦特罗的色谱图。
图13为实施例1中伏立康唑的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图14为实施例2中亚胺培南的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图15为实施例3中西司他丁的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图16为实施例4中美罗培南的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图17为实施例5中氟康唑的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图18为实施例6中去甲万古霉素的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图19为实施例7中万古霉素的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图20为实施例8中替考拉宁的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的色谱图。
图21为实施例9同时检测多种药物种类（浓度为6.28μg/ml（0偏差））的色谱图。
具体实施方式
在检测药物浓度的方法中（例如，LC-MS/MS检测法），可以根据化合物的极性以及溶解性选择外源性离子化稳定的化合物作为内标化合物，用于弥补样品提取、HPLC进样及色谱分离和检测中产生的偏差。
本申请根据化合物的极性以及溶解性，筛选出离子化稳定的、可用于TDM的替代内标化合物——克伦特罗（Clenbuterol），解决了TDM检测过程中缺少内标化合物、同位素内标化合物价格昂贵等问题。
本申请提供了克伦特罗在检测药物浓度的方法（特别是LC-MS/MS检测法）中作为内标化合物的应用。克伦特罗可用于氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类等化合物的样本检测。具体地，上述药物可以选自亚胺培南、西司他丁、美罗培南、伏立康唑、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。同时，利用克伦特罗作为内标化合物，可以同时用于多种化合物（例如两种、三种或更多种）的检测，能够满足临床上的联合用药要求。此外，根据待检测化合物的性质，克伦特罗还可以用于可检测的化合物的其他检测项目中。
本申请提供的基于LC-MS/MS检测药物浓度的方法及试剂盒目前可适用于氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类等化合物的检测，可拓展应用于与其他溶解度和极性相似的治疗药物。上述检测方法可用于血清、血浆、全血等样本类型。
本申请中涉及到的甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（MS级）等试剂均可通过市售获得。
本申请还提供了一种基于LC-MS/MS检测药物浓度的方法。所述方法具体包括以下步骤：
一、溶液配置
（1）内标工作液的配制
精密称取内标化合物标准品10.000mg于玻璃样品瓶中，加入50%的甲醇水溶液，溶解完全之后得到浓度为1.000mg/mL的内标储备液。取适量内标储备液，用甲醇稀释，配制成浓度为150ng/mL的内标工作液。
（2）待测样品处理
待测样品为口服或静脉注射待测药物后的人全血经黄色分离胶常规血清采血管处理、分离后的血清，于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
取待测样品50μL于96孔样品板中，加入150μL内标工作液（150ng/mL），涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min，取上清液20μL，加入180μL超纯水，混匀后进样进行LC-MS/MS分析。
（3）标准曲线样品和质控样品处理
1、标准品储备液的配制
称取10mg待测药物标准品于玻璃样品瓶中，加入50%甲醇溶液，配置成浓度为1mg/mL的标准品储备液。将标准品储备液充分涡旋至完全溶解，储存于-20℃，作为线性标样储备液。
重复上述操作，配置成浓度为1mg/mL的标准品储备液。将标准品储备液充分涡旋至完全溶解，储存于-20℃，作为质控样品储备液。
2、标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制
标准曲线工作溶液：取上述步骤a制得的线性标样储备液用甲醇稀释成8个浓度点，配制成浓度为6.49μg/ml、12.98μg/ml、25.96μg/ml、51.93μg/ml、103.85μg/ml、207.70μg/ml、415.40μg/ml、830.80μg/ml的一系列标准曲线工作溶液；
质控工作溶液：取上述步骤a制得的质控样品储备液用甲醇稀释，配制成浓度为102μg/ml、125.6μg/ml的一系列血清质控工作溶液。
3、标准曲线样品和质控血清样品的配制
标准曲线样品：取上述血清标准曲线工作溶液各10μL加入到空白人血清基质中，得到浓度为0.32μg/ml、0.65μg/ml、1.30μg/ml、2.60μg/ml、5.19μg/ml、10.39μg/ml、20.77μg/ml、41.54μg/ml的一系列标准曲线样品；
质控血清样品：取上述血清质控工作溶液各10μL加入到空白生物基质中，得到质控样品，质控样品包括高值样本（6.28μg/ml）和低值样本（5.10μg/ml）；
其中，空白生物基质为健康人全血经黄色分离胶常规血清采血管处理、分离后的血清，于-80℃冰箱保存，临用前在室温条件下自然解冻即得。
4、标准曲线样品和质控样品处理
取上述各标准曲线样品和质控样品50μL于96孔样品板中，加入150μL内标工作液（150ng/mL），涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min，取上清液20μL，加入180μL超纯水，混匀后进样进行LC-MS/MS分析。
二、检测条件
采用SCIEX Triple QuadTM 4500MD 液相色谱串联质谱仪（美国SCIEX公司）检测。
（1）色谱条件如下：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8，2.1x50mm，粒径为1.7μm；
流动相A：含0.1%甲酸的水；
流动相B：含0.1%甲酸的甲醇：乙腈的体积比为1：1；
流速：0.35-0.45mL/min；进样体积：4-6μL；柱温：35-45℃；
梯度洗脱程序如表1所示。
表1 LC-MS/MS的色谱条件中的梯度洗脱程序
Figure 422966DEST_PATH_IMAGE002
（2）质谱条件如表2所示。
表2 LC-MS/MS的质谱参数
Figure 124074DEST_PATH_IMAGE003
三、检测结果
利用MultiQuant MD进行数据处理，获得检测结果。
另外，本申请还提供了利用上述方法检测药物浓度的试剂盒，所述试剂盒包括内标化合物克伦特罗以及检测药物浓度必备的试剂。检测药物浓度必要的试剂包括不同浓度的校准品、质控品、甲醇、乙腈、甲酸等。
本申请提供了上述试剂盒在检测药物浓度中的应用。具体的，上述试剂盒在检测人血清中药物浓度的应用。
以下结合制备例、实施例1-9对本申请作进一步详细说明。
制备例
本制备例提供了一种能够替代LC-MS/MS检测中内标的内标化合物的筛选过程。
其中，备选的内标化合物有头孢哌酮杂质A、氯雷他定、罗哌卡因、来曲唑、氯唑沙宗、吲哚美辛、氟比洛芬、硫酸安普霉素、多粘菌素B硫酸盐、硫酸卡那霉素、替米考星、克伦特罗。
上述内标化合物的筛选过程具体如下：
一、溶液配制
（1）内标工作液的配制
精密称取上述备选替代内标化合物标准品10.000mg于玻璃样品瓶中，加入50%的甲醇水溶液，溶解完全之后得到浓度为1.000mg/mL的内标储备液。取适量内标储备液，用甲醇稀释，配制成浓度为150ng/mL的内标工作液。
（2）标准曲线样品和质控样品处理
1、标准品储备液的配制
称取10mg伏立康唑标准品于玻璃样品瓶中，加入50%甲醇溶液，配置成浓度为1mg/mL的标准品储备液。将标准品储备液充分涡旋至完全溶解，储存于-20℃，作为线性标样储备液。
重复上述操作，配置成浓度为1mg/mL的标准品储备液。将标准品储备液充分涡旋至完全溶解，储存于-20℃，作为质控样品储备液。
2、血清标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制
血清标准曲线工作溶液：取上述步骤a制得的线性标样储备液用甲醇稀释，配制成浓度为6.49μg/ml、12.98μg/ml、25.96μg/ml、51.93μg/ml、103.85μg/ml、207.70μg/ml、415.40μg/ml、830.80μg/ml的一系列血清标准曲线工作溶液；
质控工作溶液：取上述步骤a制得的质控样品储备液用甲醇稀释，配制成浓度为102μg/ml、125.6μg/ml的一系列血清质控工作溶液。
3、标准曲线样品和质控血清样品的配制
标准曲线样品：取上述血清标准曲线工作溶液各10μL加入到空白人血清基质中，得到浓度为0.32μg/ml、0.65μg/ml、1.30μg/ml、2.60μg/ml、5.19μg/ml、10.39μg/ml、20.77μg/ml、41.54μg/ml的一系列标准曲线样品；
质控血清样品：取上述血清质控工作溶液各10μL加入到空白生物基质中，得到质控样品，质控样品包括高值样本（6.28μg/ml）和低值样本（5.10μg/ml）；
其中，空白生物基质为健康人全血经黄色分离胶常规血清采血管处理、分离后的血清，于-80℃冰箱保存，临用前在室温条件下自然解冻即得。
4、标准曲线样品和质控样品处理
取上述各标准曲线样品和质控样品50μL于96孔样品板中，加入150μL内标工作液（150ng/mL）涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min，取上清液20μL，加入180μL超纯水，混匀后进样进行LC-MS/MS分析。
二、检测条件
采用SCIEX Triple QuadTM 4500MD 液相色谱串联质谱仪（美国SCIEX公司）检测。
（1）色谱条件如下：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8，2.1x50mm，粒径为1.7μm；
流动相A：含0.1%甲酸的水；
流动相B：含0.1%甲酸的甲醇：乙腈的体积比为1：1；
流速：0.4mL/min；进样体积：5μL；柱温：40℃；
梯度洗脱程序如表1所示。
（2）质谱条件如表2所示的伏立康唑的质谱条件，并利用MultiQuant MD进行数据处理，获得检测结果。
三、筛选第一步和筛选结果
不同备选内标化合物在可以同时检测伏立康唑的液质方法的条件下，测试备选内标化合物的响应和色谱峰的峰形等。检测结果如图1-12所示。
根据检测结果可知，不符合条件的备选内标化合物为多粘菌素B硫酸盐、来曲唑、氯唑沙宗、氟比洛芬。具体结果如下：
（1）图9为多粘菌素B硫酸盐的色谱图。如图9所示，多粘菌素B硫酸盐的色谱峰宽，分裂且响应值比较低。
（2）图4为来曲唑的色谱图。如图4所示，来曲唑的离子对的基线比较高，且响应值比较低。
（3）图5为氯唑沙宗的色谱图。图7为氟比洛芬的色谱图。如图5和图7所示，氯唑沙宗、氟比洛芬：这两种化合物更容易带负电荷，不适合正离子模式下化合物的检测。
四、筛选第二步和筛选结果
模拟操作造成的稀释误差，评价经过“筛选第一步”筛选后的其他替代内标化合物的矫正作用。
模拟操作造成的稀释误差的方式为：
分别取上述质控样品（高值样本（6.28μg/ml）和低值样本（5.10μg/ml））50μL于96孔样品板中，每个浓度样本平行4份，分别加入150μL内标工作液（150ng/mL）涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min；然后分别取上清液15μL（-25%偏差）、18μL（-10%偏差）、20μL（0偏差）、22μL（+10%偏差）、25μL（+25%偏差），加入180μL超纯水，混匀后进样进行如步骤二中所述条件的LC-MS/MS分析。检测结果如表3所示。
表3 步骤二筛选后的其他替代内标化合物的矫正作用
Figure 253704DEST_PATH_IMAGE004
Figure 740180DEST_PATH_IMAGE005
根据检测结果可知，存在一定矫正作用的替代内标化合物为：罗哌卡因、吲哚美辛、硫酸卡那霉素、替米考星、克伦特罗。不存在矫正作用的替代内标化合物为：头孢哌酮杂质A、氯雷他定、硫酸安普霉素。
五、筛选第三步和筛选结果
模拟操作造成的稀释误差，评价经过“筛选第二步”筛选后获得的有矫正作用的替代内标化合物的稳定性。
根据表3的检测结果可知，可稳定矫正所有待评价化合物的备选内标化合物为克伦特罗。
采用商业化的校准品稀释8个浓度点，制作标准曲线，对样本进行检测。对于已知浓度的高值样本和低值样本，模拟在真实检测条件下样品处理操作中造成的误差。分别采用外标法、同位素内标法（金标准）、替代内标法（本申请）对样品进行检测，评价检测结果是否满足临床法规要求的精密度CV≤15%，准确度RE≤15%，并进行方法间检测效果的比较。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种基于LC-MS/MS检测人血清中药物浓度的方法。其中，本实施例检测的药物为伏立康唑，所用的替代内标化合物为克伦特罗。
模拟样本处理操作中造成的误差，对已知浓度药物的高值样本（6.28μg/ml）和低值样本（5.10μg/ml）的精密度和准确度进行分析。
上述基于LC-MS/MS检测人血清中药物浓度的方法，具体包括以下步骤：
一、溶液配制
（1）内标工作液的配制
精密称取克伦特罗标准品10.000mg于玻璃样品瓶中，加入50%的甲醇水溶液，溶解完全之后得到浓度为1.000mg/mL的内标储备液。取适量内标储备液，用甲醇稀释，配制成浓度为150ng/mL的内标工作液。
（2）标准曲线样品和质控样品处理
1、标准品储备液的配制
称取10mg待测药物标准品于玻璃样品瓶中，加入50%甲醇溶液，配置成浓度为1mg/mL的标准品储备液。将标准品储备液充分涡旋至完全溶解，储存于-20℃，作为线性标样储备液。
重复上述操作，配置成浓度为1mg/mL的标准品储备液。将标准品储备液充分涡旋至完全溶解，储存于-20℃，作为质控样品储备液。
2、血清标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制
血清标准曲线工作溶液：取上述步骤a制得的线性标样储备液用甲醇稀释，配制成浓度为6.49μg/ml、12.98μg/ml、25.96μg/ml、51.93μg/ml、103.85μg/ml、207.70μg/ml、415.40μg/ml、830.80μg/ml的一系列血清标准曲线工作溶液；
质控工作溶液：取上述步骤a制得的质控样品储备液用甲醇稀释，配制成浓度为102μg/ml、125.6μg/ml的一系列血清质控工作溶液。
3、标准曲线样品和质控样品的配制
标准曲线样品：取上述血清标准曲线工作溶液各10μL加入到空白人血清基质中，得到浓度为0.32μg/ml、0.65μg/ml、1.30μg/ml、2.60μg/ml、5.19μg/ml、10.39μg/ml、20.77μg/ml、41.54μg/ml的质控血清样品：取上述血清质控工作溶液各10μL加入到空白生物基质中，得到质控样品，质控样品包括高值样本（6.28μg/ml）和低值样本（5.10μg/ml）；
其中，空白生物基质为健康人全血经黄色分离胶常规血清采血管处理、分离后的血清，于-80℃冰箱保存，临用前在室温条件下自然解冻即得。
4、标准曲线样品和样品处理
取上述各标准曲线样品50μL于96孔样品板中，加入150μL内标工作液（150ng/mL），涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min，取上清液20μL，加入180μL超纯水，混匀后进样进行LC-MS/MS分析。
取上述低值样本（5.10μg/ml）和高值样本（6.28μg/ml）50μL于96孔样品板中，加入150μL内标工作液（150ng/mL），涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min，分别取15μL（-25%偏差）、18μL（-10%偏差）、20μL（0偏差）、22μL（+10%偏差）、25μL（+25%偏差）的上清液（模拟操作造成的稀释误差），加入180μL超纯水，混匀后进样进行LC-MS/MS分析。
二、检测条件
采用SCIEX Triple QuadTM 4500MD 液相色谱串联质谱仪（美国SCIEX公司）检测。
（1）色谱条件：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8，2.1x50mm，粒径为1.7μm；
流动相A：含0.1%甲酸的水；
流动相B：含0.1%甲酸的甲醇：乙腈的体积比为1：1；
流速：0.4 mL/min；进样体积：5μL；柱温：40℃；
梯度洗脱程序如表1所示。
（2）质谱条件如表2所示。
三、检测结果
利用MultiQuant MD进行数据处理，获得检测结果。
对比例
对比例1
本对比例提供了一种外标法检测人血清中药物浓度的方法。其中，本对比例检测的药物为伏立康唑。
上述外标法检测人血清中药物浓度的方法，具体包括以下步骤：
一、溶液配制
（1）标准曲线样品和质控样品处理
1、标准品储备液的配制
与实施例1中的相应步骤一致。
2、血清标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制
与实施例1中的相应步骤一致。
3、标准曲线样品和质控样品的配制
与实施例1中的相应步骤一致。
4、标准曲线样品和样品处理
取上述各标准曲线样品50μL于96孔样品板中，加入150μL甲醇，涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min，取上清液20μL，加入180μL超纯水，混匀后进样进行LC-MS/MS分析。
取上述低值样本（5.10μg/ml）和高值样本（6.28μg/ml）50μL于96孔样品板中，加入150μL甲醇，涡旋10min，并于4000g、4℃下离心10min，分别取15μL（-25%偏差）、18μL（-10%偏差）、20μL（0偏差）、22μL（+10%偏差）、25μL（+25%偏差）的上清液（模拟操作造成的稀释误差），加入180μL超纯水，混匀后进样进行LC-MS/MS分析。
二、检测条件
与实施例1中的相应步骤一致。
三、检测结果
利用MultiQuant MD进行数据处理，获得检测结果。
对比例9
本对比例提供了一种基于LC-MS/MS检测人血清中药物浓度的方法。其中，本对比例检测的药物为伏立康唑，内标化合物为D3伏立康唑。
本对比例与实施例1的不同之处在于：内标化合物的不同。
检测结果一
实施例1以及对比例1、对比例9的检测结果如表4所示。
其中，实施例1伏立康唑的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的检测结果如图13所示。
表4 内标法、外标法与同位素内标法精密度和准确度对比
Figure 484014DEST_PATH_IMAGE006
由表4可知，在操作存在偏差的情况下，对比例1提供的外标法检测结果的精密度均大于10%，准确度的偏差大于±15%，不能够满足临床法规的要求。而采用同位素内标和本申请提供的替代内标化合物克伦特罗作为内标，检测结果的精密度在10%以内，准确度在±10%以内。因此，可以利用克伦特罗替代同位素内标。从而使得所用到的内内标化合物商品化，同时能够有效降低检测成本。
实施例2-8
实施例2-8分别提供了一种基于LC-MS/MS检测人血清中药物浓度的方法。上述实施例与实施例1的不同之处在于：检测的药物种类不同，具体如表5所示。
表5 实施例2-8提供的方法中所检测的药物种类
Figure 663630DEST_PATH_IMAGE007
对比例2-8
对比例2-8分别提供了一种外标法检测人血清中血药浓度的方法。上述对比例与对比例1的不同之处在于：检测的药物种类不同，具体如表6所示。
表6 对比例2-8提供的方法中所检测的药物种类
Figure 534634DEST_PATH_IMAGE008
检测结果二
实施例2-8以及对比例2-8的检测结果如表7所示。
其中，实施例2-8中各药物的浓度为6.28μg/ml（0偏差）的检测结果如图14-20所示。
表7 替代内标化合物（克伦特罗）和外标法精密度和准确度对比
Figure 124884DEST_PATH_IMAGE009
Figure 587090DEST_PATH_IMAGE010
Figure 793949DEST_PATH_IMAGE011
Figure 468644DEST_PATH_IMAGE012
由表7可知，在操作存在偏差的情况下，外标法检测结果精密度均大于10%，准确度的偏差大于±15%，不能够满足临床要求的精密度CV≤15%，准确度RE≤15%。而采用克伦特罗作为替代内标化合物，检测结果的精密度在10%以内，准确度在±10%以内，可以满足临床要求。
实施例9
实施例9提供了一种基于LC-MS/MS检测人血清中药物浓度的方法。与实施例1的不同之处在于：检测的药物种类包括伏立康唑、亚胺培南、西司他丁、美罗培南、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。上述各种类药物的浓度为6.28μg/ml（0偏差）。
检测结果如图21所示。
由图21可知，利用克伦特罗可同时用于多种药物种类的检测，能够满足临床上联合用药的需求。
综上所述，本申请提供的检测方法及试剂盒可适用于氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类等化合物缺乏或者同位素内标昂贵的问题，可用于以上化合物LC-MS/MS方法的血药浓度监测。替代内标化合物在精密度和准确度符合TDM的临床检测需求。利用一种替代内标化合物可同时用于多个化合物的检测，能够满足临床上联合用药的需求，从而降低检测的成本。另外，根据待测化合物的性质，可将替代内标化合物扩展到其他项目的检测中。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.克伦特罗在检测药物浓度的方法中作为内标化合物的应用。
2.根据权利要求1所述的克伦特罗在检测药物浓度的方法中作为内标化合物的应用，其特征在于，所述药物选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类化合物；
所述药物选自亚胺培南、西司他丁、美罗培南、伏立康唑、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。
3.根据权利要求2所述的克伦特罗在检测药物浓度的方法中作为内标化合物的应用，其特征在于，所述克伦特罗可用于同时检测两种及两种以上的药物。
4.一种检测药物浓度的方法，其特征在于，所述方法包括配置内标工作液；所述内标工作液中的内标化合物为克伦特罗。
5.根据权利要求4所述的检测药物浓度的方法，其特征在于，所述药物选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类化合物；
所述药物选自亚胺培南、西司他丁、美罗培南、伏立康唑、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。
6.根据权利要求4所述的检测药物浓度的方法，其特征在于，采用LC-MS/MS进行检测；
所述LC-MS/MS的色谱条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8；
流动相A：含0.1%甲酸的水；
流动相B：含0.1%甲酸的甲醇：乙腈的体积比为1：1；
流速：0.35-0.45mL/min；
进样体积：4-6μL；
柱温：35-45℃；
所述LC-MS/MS的质谱条件为：
离子源为ESI+离子源：
检测方式为正离子检测；
扫描方式为多反应监测MRM。
7.根据权利要求6所述的检测药物浓度的方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为2.1x50mm，粒径为1.7μm；梯度洗脱程序如下：
Figure 552210DEST_PATH_IMAGE001
。
8.根据权利要求4所述的检测药物浓度的方法，其特征在于，所述内标工作液中内标化合物的浓度为150ng/mL。
9.一种用于检测药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括内标化合物克伦特罗；
所述药物选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、糖肽类、三唑类化合物；
所述药物选自亚胺培南、西司他丁、美罗培南、伏立康唑、氟康唑、去甲万古霉素、万古霉素、替考拉宁。
10.如权利要求9所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒在检测药物浓度中的应用；所述试剂盒在检测人血清中药物浓度的应用。
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