CN111398480A - 同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，包括提取液、稀释液、流动相、校准品和质控品，其中：所述校准品和质控品包括氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、万古霉素和替考拉宁；所述提取液包括同位素内标物和甲醇水溶液，所述同位素内标包括氟康唑‑d4、伏立康唑‑d3、泊沙康唑‑d4和伊曲康唑‑d5；所述稀释液为蒸馏水或超纯水。本发明的优点在于首次提出了一种既可以检测小分子抗真菌药物，同时还能检测大分子糖肽类抗生素的试剂盒，样品前处理简单，前处理时间短，提高了检测效率，检出药物种类多，能够满足临床上高通量样品的检测需求，具有很好的应用前景，便于推广和普及。
Description
技术领域
本发明涉及临床检测领域，尤其是涉及一种同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，还涉及一种利用该试剂盒同时检测血浆、血清中三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的方法。
背景技术
目前，侵袭性真菌感染已经成为导致重症患者发病率和死亡率提升的主要因素，如由曲霉菌引起的侵袭性肺疾病的死亡率高达82%。临床使用的抗真菌药物主要是三唑类抗真菌药物（属于小分子药物），主要包括氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑。此外，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）也是临床上常见的毒性较强的细菌，它已成为院内和社区感染的重要病原菌之一，临床使用的抗MRSA药物主要是糖肽类抗生素（属于大分子药物），包括万古霉素和替考拉宁。然而，由于三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素不仅具有较大的个体间和个体内差异，并且血药浓度还与治疗效果密切相关，导致临床上出现许多由于血药浓度过低引起的治疗失败或由血药浓度过高引起的毒性现象。因此，通过检测患者血药浓度来指导临床给药方案具有重要意义。
糖肽类抗生素的检测方法主要有荧光偏振免疫分析法（即FPIA），FPIA是利用待测样本中的化合物与用荧光标记的待测物与有限量的特异性大分子抗体进行竞争结合；当待测物浓度高时，经过竞争反应，大部分待测物与抗体结合而荧光标记的小分子多呈游离状态，因此荧光偏振程度较低；反之，则荧光偏振程度较高。在检测时通过检测待测样品的偏振光大小，确定样品中大分子抗生素的含量。但是，目前大多数抗体在测定分子结构相似的化合物时，特别容易引起交叉反应，对于低浓度的待测物准确性较低；并且替考拉宁的商业化免疫分析产品销售地区有限，并不能实现普及检测。
免疫分析对小分子化合物的检测有先天缺陷，即使采用单克隆抗体，这些抗体对小分子化合物的单个分子结构精确识别也存在很大困难。所以，现有抗真菌药物的检测方法主要采用HPLC和LC-MS/MS法等。HPLC可进行定性和定量分析，但其分离度需要在1.5以上才能实现定量，所以在样品前处理时往往需要进行萃取或衍生化步骤，操作繁琐，分析时间比较长，难以满足临床上大批量样本的快速诊断需求。
LC-MS/MS是先对化合物进行色谱分离，经色谱分离的化合物根据保留时间先后在离子源形成带电离子，串联质谱再根据母离子和碎片离子的质核比进行检测。即LC-MS/MS能够同时检测化合物的保留时间和质荷比，所以其具有更高的特异性和较高的分离效率，广泛用于小分子抗真菌药物的检测，如CN105784865A公开了一种检测动物血浆中氟唑沙宗的HPLC- MS /MS方法；CN10903067A公开了一种同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒及其应用。但是，由于三唑类抗真菌药物与糖肽类抗生素药物的理化性质差别较大，目前未出现有关利用LC-MS/MS同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，还提供了一种利用该试剂盒测定血浆、血清中三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的方法，实现了小分子抗真菌药物和糖肽类大分子抗生素的同时测定。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，包括提取液、稀释液、流动相、校准品和质控品，其中：
所述校准品和质控品包括氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、万古霉素和替考拉宁；
所述提取液包括同位素内标物和甲醇水溶液，所述同位素内标包括氟康唑-d4、伏立康唑-d3、泊沙康唑-d4和伊曲康唑-d5；
所述稀释液为蒸馏水或超纯水；
所述流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸/水、乙酸/水、甲酸铵溶液或乙酸铵溶液；所述流动相B为含有甲酸、乙酸、甲酸铵或乙酸铵的甲醇溶液，或为含有甲酸、乙酸、甲酸铵或乙酸铵的乙腈溶液，或为任意比例的甲醇/乙腈溶液。
优选地，所述提取液的甲醇水溶液中甲醇的体积分数为50%。
优选地，所述提取液中同位素内标物氟康唑-d4、伏立康唑-d3、泊沙康唑-d4和伊曲康唑-d5的浓度分别为10μg/mg、2μg/mg、2μg/mg和2μg/mg。
优选地，所述流动相A为0.1～1.0%甲酸/水（甲酸体积分数），或0.1～1.0%乙酸/水（乙酸体积分数）、或为浓度为2～20mmol/L的甲酸铵溶液，或为浓度为2～20mmol/L的乙酸铵溶液。更优选地，流动相A为0.1%的甲酸/水。
优选地，流动相B为含有甲酸或乙酸的甲醇溶液，或者为含有甲酸或乙酸的乙腈溶液，其中甲酸或乙酸的体积分数为0.1～1.0%。更优选地，甲酸或乙酸的体积分数为0.1%。
本发明的流动相B还可以是含有甲酸铵或乙酸铵的甲醇溶液，或含有甲酸铵或乙酸铵的乙腈溶液，其中，甲酸铵或乙酸铵的浓度为2～20mmol/L。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的方法，包括以下内容：
分别移取校准品和待测样本于离心管内，所述待测样本为血浆或血清；然后向校准品和待测样本中分别加入50～1000μL提取液，涡旋混合，离心，取上清液，向上清液内加稀释液，混匀，用LC-MS/MS检测，记录每个校准品和待测样本中化合物的峰面积和同位素内标物的峰面积；
其中，所述LC-MS/MS的液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱温为20～50℃，流动相流速为0.1～1.0mL/min（优选为0.4 mL/min），流动相采用梯度洗脱：0～1.2min，10%流动相A和90%流动相B；1.2～2.0min，10%流动相A和90%流动相B；2.0～2.1 min，95%流动相A和5%流动相B；2.0～2.1 min，95%流动相A和5%流动相B。
所述LC-MS/MS的质谱检测条件为：离子源为电喷雾电离离子源（ESI，正离子模式）；毛细管电压0.8kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速1000L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9%的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999%；扫描方式为多反应监测模式。
本发明检测时以校准品中化合物的峰面积和与其对应的同位素内标物峰面积的比值为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制各化合物的线性回归方程（即标准曲线），然后将样本中待测物的峰面积与同位素内标物的峰面积的比值代入对应的标准曲线，即可得到样本中待测物的血药浓度。
本发明的优点在于首次提出了一种既可以检测小分子抗真菌药物，同时还能检测大分子糖肽类抗生素的试剂盒，检出药物种类多，具有很好的应用前景，便于推广和普及。同时本发明采用LC-MS/MS的MRM模式进行定量检测，特异性好，精密度高，准确度高且无明显基质效应和稀释效应。
本发明的提取液可直接提取血浆或血清样本中的六种药物，无需将样本加工成干血斑，样品前处理简单，前处理时间短，提高了检测效率，且提取化合物种类多，特别适用于临床检测；同时本发明的流动相洗脱梯度不仅能够实现六种化合物的快速分离，同时还可将六种化合物的出峰时间缩短在3min以内，提高了检测效率，能够满足临床上高通量样品的检测需求。
附图说明
图1是本发明四种三唑类抗真菌药物和两种糖肽类抗生素的液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做出更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明实施例中所用的检测试剂和检测仪器均为市售产品，其中本发明所用的液相色谱仪为ACQUITY UPLC I-Class（沃特世），本发明所用的质谱仪为Xevo TQD（沃特世）。
实施例1 同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒
本发明为同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，包括校准品、质控品、稀释液、提取液和流动相，各个组分的具体制备方法如下：
1、制备校准品
移取125μL氟康唑储备液（2mg/mL）、25μL伏立康唑储备液（2mg/mL）、25μL泊沙康唑储备液（2mg/mL）、25μL伊曲康唑储备液（2mg/mL）、250μL万古霉素储备液（2mg/mL）和250μL替考拉宁储备液（2mg/mL）于2mL 样品瓶内，然后向样品瓶内加入300μL甲醇，混匀，得到混标母液；然后移取200μL混标母液于1.5mL 离心管内，加入800μL血清，混匀，静置15min，得到最高浓度校准品，具体数据见表1。
表1 混标母液和最高浓度校准品中各化合物的浓度
在检测时，用血清将最高浓度校准品稀释不同倍数，得到六个浓度水平的校准品，具体数据见表2。
表2 本发明每个校准品中各化合物的浓度
2、制备质控品
移取22μL氟康唑储备液（2mg/mL）、8.5μL伏立康唑储备液（2mg/mL）、6.3μL泊沙康唑储备液（2mg/mL）、3.7μL伊曲康唑储备液（2mg/mL）、38μL万古霉素储备液（2mg/mL）和56μL替考拉宁储备液（2mg/mL）于样品瓶内，然后向样品瓶内加入1865.5μL甲醇，混匀，得到低浓度混合液；然后将低浓度混合液用血清稀释10倍得到低浓度质控品（即质控品1），具体见表3。
移取65μL氟康唑储备液（2mg/mL）、22μL伏立康唑储备液（2mg/mL）、16.5μL泊沙康唑储备液（2mg/mL）、7μL伊曲康唑储备液（2mg/mL）、135μL万古霉素储备液（2mg/mL）和305μL替考拉宁储备液（2mg/mL）于样品瓶（容积为2mL）内，然后向样品瓶内加入449.5μL甲醇，混匀，得到高浓度混合液；然后将高浓度混合液用血清稀释10倍得到高浓度质控品（即质控品2），具体见表3。
表3 本发明质控品中各化合物的浓度
3、制备提取液
移取氟康唑-d4储备液（1mg/mL）500μL，伏立康唑-d3、泊沙康唑-d4、伊曲康唑-d5储备液（1mg/mL）各100μL于样品瓶中，然后加入49.2mL 50%甲醇水（体积分数），混匀，得到50mL提取液，提取液中各同位素内标物的浓度见表4。
表4 提取液中各同位素内标物的浓度
4、制备流动相
流动相A为甲酸/水（甲酸体积分数为0.1%）：量取300mL超纯水，移出300μL水，然后再加入300μL甲酸，超声10min充分混匀，用0.22μm水相膜过滤；
流动相B为甲酸/甲醇（甲酸体积分水为0.1%）：量取300mL甲醇，移出300μL甲醇，然后再加入300μL甲酸，超声10min充分混匀，用0.22μm有机相膜过滤。
当然，流动相A中的甲酸的体积分数还可以为0.1%～1.0%范围内的其它数值，且甲酸还可以替换为乙酸、浓度为2～20mmol/L的甲酸铵或乙酸铵；流动相B中甲酸的体积分数还可以为0.1%～1.0%范围内的其它数值，并且甲酸还可以替换为乙酸、浓度为2～20mmol/L的甲酸铵或乙酸铵，甲醇还可以用乙腈代替；流动相B还可以替换为任意比例的甲醇、乙腈混合液。
5、稀释液
稀释液为屈臣氏蒸馏水或超纯水（20mL/瓶）。
实施例2 采用实施例1试剂盒同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的方法，包括以下具体内容：
分别取50μL校准品和待测样本（即血清）于1.5mL离心管内；向离心管内分别加入950μL提取液，涡旋混合5min，然后于4℃、13000 rpm离心5min，取100μL上清液于样品瓶内，向样品瓶内加100μL稀释液（即蒸馏水或超纯水），混匀，用LC-MS/MS进行检测，记录每个样品（包括校准品和样本）中各化合物的峰面积和同位素内标物的峰面积。
本发明在检测时LC-MS/MS的质谱检测条件为：离子源为电喷雾电离离子源（ESI，正离子模式）；毛细管电压0.8kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速1000L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为氮气（纯度99.9%）；碰撞气为氩气（纯度99.999%）；扫描方式为多反应监测模式（MRM），优化后的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量参数值如表5所示。
表5 各化合物的多反应监测参数
检测时，本发明的高效液相色谱条件为：色谱柱为C18柱；柱温为20℃～50℃，优选50℃；流动相流速为0.1～1.0mL/min，优选0.4mL/min；流动相采用梯度洗脱，具体见表6。
表6 本发明流动相的洗脱梯度
从表6可知，在检测时本发明所述流动相的初始配比为95%流动相A和5%流动相B；在0～1.2min，10%流动相A和90%流动相B；1.2～2.0min，10%流动相A和90%流动相B；2.0～2.1min，95%流动相A和5%流动相B；2.0～2.1 min，95%流动相A和5%流动相B。
采用本发明检测方法检测得到六种化合物的液相色谱图，具体如图1所示。从图1可以看出，图1中的六个色谱图自上而下依次对应替考拉宁、万古霉素、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑和氟康唑。
本发明分别以各化合物的浓度为横坐标，以校准品中化合物的峰面积和与其对应的同位素内标物峰面积的比值为纵坐标进行线性回归（其中，万古霉素和替考拉宁均的内标物均为氟康唑-d3），获得各化合物的线性回归方程（即标准曲线），具体见表7。
表7 各化合物的线性回归方程
由表7可知，氟康唑在0.25～50μg/mL内线性关系良好（R2=0.999884），伏立康唑在0.05～10μg/mL内线性关系良好（R2=0.998315），泊沙康唑在0.05～10μg/mL内线性关系良好（R2=0.998673），伊曲康唑在0.05～10μg/mL内线性关系良好（R2=0.999609），万古霉素在0.5～100μg/mL内线性关系良好（R2=999649），替考拉宁在2～100μg/mL内线性关系良好（R2=0.992732）。
实施例3 本发明试剂盒的准确性评价
按实施例2中的检测方法检测实施例1中质控品1和质控品2，然后根据质控品中各化合物峰面积的比值与同位素内标物的比值，以及各化合物的线性回归方程，计算质控品中各化合物的浓度和回收率，具体数据见下表8。
表8
由表8可知， 质控品1中氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、万古霉素和替考拉宁的回收率依次为99.1%、99.5%、99.2%、99.2%、99.5%、99.6%，质控品2中氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、万古霉素和替考拉宁的回收率依次为100.1%、99.8%、100.6%、101.4%、100.4%、99.2%，说明本发明检测方法的准确度较高。
Claims (9)
1.一种同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，其特征在于：包括提取液、稀释液、流动相、校准品和质控品，其中：
所述校准品和质控品均包括氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、万古霉素和替考拉宁；
所述提取液包括同位素内标物和甲醇水溶液，所述同位素内标包括氟康唑-d4、伏立康唑-d3、泊沙康唑-d4和伊曲康唑-d5；
所述稀释液为蒸馏水或超纯水；
所述流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸/水、乙酸/水、甲酸铵溶液或乙酸铵溶液；所述流动相B为含有甲酸、乙酸、甲酸铵或乙酸铵的甲醇溶液，或为含有甲酸、乙酸、甲酸铵或乙酸铵的乙腈溶液，或为甲醇/乙腈。
2.根据权利要求1所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，其特征在于：所述提取液的甲醇水溶液中甲醇的体积分数为50%。
3.根据权利要求1所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，其特征在于：所述提取液中的同位素内标物氟康唑-d4、伏立康唑-d3、泊沙康唑-d4和伊曲康唑-d5的浓度依次为10μg/mg、2μg/mg、2μg/mg和2μg/mg。
4.根据权利要求1所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为甲酸/水或乙酸/水，甲酸或乙酸的体积分数为0.1～1.0%。
5.根据权利要求1所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为浓度为2～20mmol/L的甲酸铵溶液或乙酸铵溶液。
6.根据权利要求1所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，其特征在于：所述流动相B中甲酸或乙酸的体积分数为0.1～1.0%。
7.根据权利要求1所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒，其特征在于：所述流动相B中甲酸铵溶液或乙酸铵溶液的浓度为2～20mmol/L。
8.使用权利要求1-7任一项所述试剂盒同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的方法，其特征在于：包括以下内容：
分别移取校准品和待测样本于离心管内，所述待测样本为血浆或血清；然后向校准品和待测样本中分别加入50～1000μL提取液，涡旋混合，离心，取上清液，向上清液内加稀释液，混匀，用LC-MS/MS检测，记录每个校准品和待测样本中化合物的峰面积和同位素内标物的峰面积；
其中，所述LC-MS/MS的液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱温为20～50℃，流动相流速为0.1～1.0mL/min，流动相采用梯度洗脱：0～1.2min，10%流动相A和90%流动相B；1.2～2.0min，10%流动相A和90%流动相B；2.0～2.1 min，95%流动相A和5%流动相B；2.0～2.1min，95%流动相A和5%流动相B。
9.根据权利要求8所述的同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的方法，其特征在于：所述LC-MS/MS的质谱检测条件为：离子源为电喷雾电离离子源，正离子模式；毛细管电压0.8kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速1000L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9%的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999%；扫描方式为多反应监测模式。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200710 |
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