CN115480009A - 一种同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学检验技术领域，具体公开了一种同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法及分析试剂盒。本发明的方法通过选择性、线性、准确度、精密度、基质效应、回收率、残留效应、稳定性、稀释效应等方法学验证，完全满足临床样本的检测要求，操作简便、高效，检测结果准确、可靠，可以直接运用于临床患者血浆样本的检测分析及药代动力学研究。与现有技术相比，具有以下优点：(1)前处理操作简单，血样用量少，成本低；(2)检测时间短，准确度和灵敏度高，适用于临床检验；(3)采用内标法定量，且采用氘代试剂作为内标，准确度和稳定性更高。本发明的分析试剂盒也具有定性可靠、定量准确、灵敏度高、重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法及分析试剂盒。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是成人最常见的急性白血病，是一种以骨髓与外周血中原始幼稚髓性细胞异常增生为主要特征的髓系造血干/祖细胞恶性疾病。目前，针对Bcl-2靶点的抑制剂是一种典型的可用于治疗急性髓系白血病的靶向药物，其通过调控线粒体介导的内源性途径引发细胞凋亡，为AML的治疗开辟了一条新途径。维奈克拉是全球首个获批上市的Bcl-2抑制剂，临床研究表明，维奈克拉单用或联用其他化疗药物均显示出较好的抗肿瘤活性，目前已在国内上市。
然而，临床AML患者人群通常免疫功能低下，常常观察到此类人群感染风险的增加，包括侵入性真菌感染。因此，抗感染预防是AML治疗的一个标准疗法。研究表明，广谱三唑类抗真菌药物(如泊沙康唑、伏立康唑等)的抗感染预防能够在很大程度上改善接受强化化疗方案诱导治疗的AML患者的死亡率。因此，维奈克拉在治疗AML患者时通常会与三唑类抗真菌药物联合应用。体外研究表明，唑类抗菌药物可以不同程度地抑制CYP3A4酶，而CYP3A4酶是维奈克拉的主要代谢酶，与酮康唑、泊沙康唑、利福平等均有较强的药物相互作用，个体间血药浓度差异较大(Agarwal SK等，2016；Jones AK等，2016)。当唑类抗菌药物与维奈克拉组合使用时，将会导致维奈克拉的代谢降低，从而可能会使得维奈克拉的暴露增加或潜在的毒性增加。为实现临床治疗药物监测，王磊等(2021)提出了一种采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定血液病患者血浆维奈克拉浓度的方法，为维奈克拉的个体化用药剂量调整提供了依据。
然而，当维奈克拉与三唑类抗真菌药物组合使用时，应当同时监测抗真菌药(如泊沙康唑、伏立康唑等)与维奈克拉的血药浓度，必要时还应检测相关基因的表达，以便于及时调整用药策略，保证临床用药的安全性和有效性，从而避免严重不良反应或耐药性的发生。因此，亟需开发一种能够同时测定三唑类抗真菌药物与维奈克拉血药浓度的方法。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，通过专属性、线性、准确度、精密度、残留效应、基质效应、回收率、稳定性、稀释效应等方法学验证表明，该方法能够满足临床样本的检测要求，操作简便、高效，检测结果准确、可靠，可以直接运用于临床患者血浆样本的检测分析及药代动力学研究，有助于指导临床药物应用。
同时，本发明还提供一种采用上述方法同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的分析试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，包括以下步骤：
(1)样本前处理
将血浆样本与内标、沉淀剂混合，沉淀蛋白后(离心)得到待测溶液；
(2)高效液相色谱-串联质谱分析
取待测溶液进行高效液相色谱-串联质谱分析，经计算后得到泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的血药浓度；
所述高效液相色谱分析条件为：Shimadzu VP-ODS C18色谱柱，规格：150mm×2.0mm，4.6μm；0.1％v/v甲酸水溶液为流动相A，含0.1％v/v甲酸的甲醇溶液为流动相B，采用梯度洗脱程序，流速为0.40mL/min；柱温40℃；进样量10μL。
作为本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述内标为维奈克拉-D8、伏立康唑-D3、泊沙康唑-D4。
作为本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述沉淀剂为甲醇或乙腈，优选为甲醇。沉淀剂用于沉淀血浆中蛋白。所述沉淀剂与血浆的体积比为3-5：1，优选为4：1。
具体的，取100μL血浆样本，加入400μL含内标的甲醇(含维奈克拉-D8 500ng/mL，伏立康唑-D3 200ng/mL，泊沙康唑-D4 300ng/mL)，采用一步沉淀法进行样本前处理，涡旋5min沉淀蛋白，之后于13000rpm离心10min，取上清液(即待测溶液)进样分析。
作为本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述梯度洗脱程序为：0-1.99min，90％流动相A(余量为流动相B，下同)；1.99-2.0min，90％流动相A→35％流动相A；2.0-3.5min，35％流动相A→5％流动相A；3.5-5.5min，5％流动相A；5.5-5.6min，5％流动相A→90％流动相A；5.6-6.5min，90％流动相A。
作为本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述质谱分析条件为：电喷雾离子化电离源(ESI)，采用正离子模式；维奈克拉的离子对为869.50→321.50，DP(去簇电压)80V，CE(碰撞能量)55V；伏立康唑的离子对为350.20→281.00，DP 35V，CE 40V；泊沙康唑的离子对为701.30→127.00，DP 80V，CE 90V；内标维奈克拉-D8的离子对为877.40→329.70，DP 90V，CE 62V；内标伏立康唑-D3的离子对为353.20→284.00，DP 35V，CE 40V；内标泊沙康唑-D4的离子对为705.30→131.00，DP 80V，CE 90V；离子源温度500℃；碰撞气(CAD)4psi，帘气(CUR)35psi，离子源气体1(GS1)60psi，离子源气体2(GS2)60psi，均为氮气；离子喷雾电压(IS)5500V；入口电压(EP)10V；碰撞池出口电压(CXP)15V。
作为本发明一种优选的实施方案，所述方法还包括以下一个或多个步骤：使用标准曲线溶液绘制标准曲线，使用质控溶液进行质控检验。
所述标准曲线溶液的配制操作为：将系列浓度的混合标准曲线工作液分别与生物基质(如人空白血浆)、内标和沉淀剂混合，沉淀蛋白后离心，得到系列浓度的标准曲线溶液。例如，精密吸取系列浓度的混合标准曲线工作液各10μL，加入人空白血浆90μL，再加入400μL含内标的甲醇(内标维奈克拉-D8 500ng/mL，伏立康唑-D3 200ng/mL，泊沙康唑-D4300ng/mL)，涡旋5min沉淀蛋白，13000rpm离心10min，取上清液，即得到系列浓度的标准曲线溶液(7个)：从低到高，维奈克拉和伏立康唑的浓度均依次为50，100，500，1000，2000，5000，10000ng/mL，对应泊沙康唑的浓度依次为25，50，250，500，1000，2500，5000ng/mL。
所述混合标准曲线工作液的配制操作为：以甲醇为稀释剂，采用逐步稀释法对初始混合标准曲线工作液进行稀释，得到系列浓度的混合标准曲线工作液(7个)：从低到高，维奈克拉和伏立康唑的浓度均依次为500，1000，5000，10000，20000，50000，100000ng/mL，对应泊沙康唑的浓度依次为250，500，2500，5000，10000，25000，50000ng/mL。
所述初始混合标准曲线工作液的配制操作为：分别从维奈克拉储备液(10.056mg/mL)、伏立康唑储备液(10.248mg/mL)和泊沙康唑储备液(9.934mg/mL)中吸取一定量的溶液，充分混合后加入甲醇，得到维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑的初始浓度分别为100μg/mL、100μg/mL、50μg/mL的初始混合标准曲线工作液。
所述标准品储备液的配制操作为：精密称取一定量的维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑标准品，分别置于10mL容量瓶中，再分别以10％v/v DMSO+90％v/v甲醇、100％甲醇、5％v/v DMSO+95％v/v甲醇溶解并定容至刻度，混匀后得到浓度为10.056mg/mL的维奈克拉储备液、浓度为10.248mg/mL的伏立康唑储备液和浓度为9.934mg/mL的泊沙康唑储备液，于-20℃冰箱中保存备用。
所述绘制标准曲线的操作为：取系列浓度的标准曲线溶液分别进行高效液相色谱-串联质谱分析，以分析物血药浓度C为X轴、分析物峰面积(As)与对应内标峰面积(Ai)的比值f(f＝As/Ai)为Y轴进行权重线性回归(权重系数为1/x2)分析，得到标准曲线回归方程。
所述质控溶液的配制操作为：将低、中、高3个浓度梯度的质控工作液分别生物基质(如人空白血浆)、与内标和沉淀剂混合，沉淀蛋白后离心，得到低、中、高3个浓度的质控溶液。例如，精密吸取低、中、高3个浓度梯度的质控工作液各10μL，加入人空白血浆90μL，再加入400μL含内标的甲醇(内标维奈克拉-D8 500ng/mL，伏立康唑-D3 200ng/mL，泊沙康唑-D4 300ng/mL)，涡旋5min沉淀蛋白，13000rpm离心10min，取上清液，即得到低、中、高3个浓度的质控溶液。所述低浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为100ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，所述中浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为1000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL，所述高浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为8000ng/mL、8000ng/mL、4000ng/mL。
所述质控工作液的配制操作为：以甲醇为稀释剂，采用逐步稀释法对初始质控工作液进行稀释，得到低、中、高3个浓度梯度的质控工作液。所述低浓度质控工作液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为1000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL，所述中浓度质控工作液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为10000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL，所述高浓度质控工作液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为80000ng/mL、80000ng/mL、40000ng/mL。
所述初始质控工作液的配制操作为：分别从维奈克拉储备液(10.056mg/mL)、伏立康唑储备液(10.248mg/mL)和泊沙康唑储备液(9.934mg/mL)中吸取一定量的溶液，充分混合后加入甲醇，得到维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑的初始浓度分别为80μg/mL、80μg/mL、40μg/mL的初始质控工作液。
所述质控检验的操作为：取低、中、高3个浓度的质控溶液分别进行高效液相色谱-串联质谱分析，经计算后得到每个质控溶液中泊沙康唑、伏立康唑、维奈克拉的检测浓度；将检测浓度与质控溶液的标准浓度进行准确度和精密度分析，得到质控检验结果。
作为本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述计算为：将分析结果代入标准曲线回归方程中，得到泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的血药浓度。
一种使用上述方法同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的分析试剂盒，所述分析试剂盒包括以下一种或多种组分：含内标的沉淀剂或者内标和沉淀剂，流动相A和流动相B，标准曲线工作液，质控工作液。
作为本发明一种优选的实施方案，所述分析试剂盒还可以包括色谱柱。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，通过选择性、线性、准确度、精密度、基质效应、回收率、残留效应、稳定性、稀释效应等方法学验证，满足临床样本的检测要求，操作简便、高效，检测结果准确、可靠，可以直接运用于临床患者血浆样本的检测分析及药代动力学研究，有助于指导临床药物应用。
与现有技术相比，本发明的方法具有以下优点：(1)采用蛋白沉淀的方法对血浆样本进行前处理，操作简单，血样用量少，成本低；(2)采用HPLC-MS/MS方法和选定的色谱/质谱分析条件，能同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的血药浓度，相较HPLC-UV方法的检测时间大幅缩短，准确度和灵敏度更高，更加适用于临床检验；(3)采用内标法定量，且采用氘代试剂作为内标，准确度和稳定性更高。
本发明提供了一种采用高效液相色谱-串联质谱同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的分析试剂盒，具有定性可靠、定量准确、灵敏度高、重复性好等优点。
附图说明
图1为泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的定量离子图；
A：伏立康唑，B：泊沙康唑，C：维奈克拉。
图2为泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的标准曲线图；
A：伏立康唑，B：泊沙康唑，C：维奈克拉。
图3为血浆样本色谱图；
A：伏立康唑，B：伏立康唑-D3，C：泊沙康唑，D：泊沙康唑-D4，E：维奈克拉，F：维奈克拉-D8。
图4为实验例中空白血浆色谱图；
A：伏立康唑，B：伏立康唑-D3，C：泊沙康唑，D：泊沙康唑-D4，E：维奈克拉，F：维奈克拉-D8。
图5为实验例中标曲空白点溶液色谱图；
A：伏立康唑，B：伏立康唑-D3，C：泊沙康唑，D：泊沙康唑-D4，E：维奈克拉，F：维奈克拉-D8。
图6为实验例中定量下限溶液色谱图；
A：伏立康唑，B：伏立康唑-D3，C：泊沙康唑，D：泊沙康唑-D4，E：维奈克拉，F：维奈克拉-D8。
图7为实验例中定量上限溶液色谱图；
A：伏立康唑，B：伏立康唑-D3，C：泊沙康唑，D：泊沙康唑-D4，E：维奈克拉，F：维奈克拉-D8。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例方案，例如修改、简单替换后得到的实施方案，均属于本发明的保护范围。
下述实施例及实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
仪器：
高效液相-串联质谱联用仪(高效液相色谱：岛津，LC-20A；质谱：AB SCIEX，API3200)；Shimadzu VP-ODS C18色谱柱，规格：150mm×2.0mm，4.6μm。
材料：
标准品维奈克拉(C45H50ClN7O7S，MW：868.439，纯度＞98％)、泊沙康唑(C37H42F2N8O4，MW：700.777，纯度＞98％)和伏立康唑(C16H14F3N5O，MW：349.310，纯度＞98％)由MOLNOVA公司提供。
内标维奈克拉-D8、泊沙康唑-D4和伏立康唑-D3分别由上海乾平生物医药科技有限公司和上海鸿永生物科技有限公司提供。
甲醇(分析纯)由Fisher Chemacal提供。
甲酸和DMSO由上海麦克林生物科技有限公司和阿拉丁试剂(上海)有限公司提供。
实验用水由默克-Milli-Q超纯水仪提供。
实施例1
本实施例提供了一种同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，包括以下步骤：
(1)配制标准曲线溶液
配制标准品储备液：精密称取一定量的维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑标准品，分别置于10mL容量瓶中，再分别以10％v/v DMSO+90％v/v甲醇、100％甲醇、5％v/v DMSO+95％v/v甲醇溶解并定容至刻度，混匀后得到浓度为10.056mg/mL的维奈克拉储备液、浓度为10.248mg/mL的伏立康唑储备液和浓度为9.934mg/mL的泊沙康唑储备液。
配制初始混合标准曲线工作液：分别从维奈克拉储备液(10.056mg/mL)、伏立康唑储备液(10.248mg/mL)和泊沙康唑储备液(9.934mg/mL)中吸取一定量的溶液，充分混合后加入甲醇，得到维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑的初始浓度分别为100μg/mL、100μg/mL、50μg/mL的初始混合标准曲线工作液。
配制混合标准曲线工作液：以甲醇为稀释剂，采用逐步稀释法对初始混合标准曲线工作液进行稀释，得到系列浓度的混合标准曲线工作液(7个)：从低到高，维奈克拉和伏立康唑的浓度均依次为500，1000，5000，10000，20000，50000，100000ng/mL，对应泊沙康唑的浓度依次为250，500，2500，5000，10000，25000，50000ng/mL。
配制标准曲线溶液：精密吸取系列浓度的混合标准曲线工作液各10μL，加入人空白血浆90μL，再加入400μL含内标的甲醇(内标维奈克拉-D8 500ng/mL，伏立康唑-D3200ng/mL，泊沙康唑-D4 300ng/mL)，涡旋5min沉淀蛋白，13000rpm离心10min，取上清液，即得到系列浓度的标准曲线溶液(7个)：从低到高，维奈克拉和伏立康唑的浓度均依次为50，100，500，1000，2000，5000，10000ng/mL，对应泊沙康唑的浓度依次为25，50，250，500，1000，2500，5000ng/mL。
(2)绘制标准曲线
取系列浓度的标准曲线溶液分别进行高效液相色谱-串联质谱分析，采用高效液相色谱-串联质谱联用仪(高效液相色谱：岛津，LC-20A；质谱：AB SCIEX，API 3200)。
所述高效液相色谱分析条件为：Shimadzu VP-ODS C18色谱柱，规格：150mm×2.0mm，4.6μm；0.1％v/v甲酸水溶液为流动相A，含0.1％v/v甲酸的甲醇溶液为流动性B，采用梯度洗脱程序(如下表1所示)，流速为0.40mL/min；柱温40℃；进样量10μL。
表1梯度洗脱程序
所述质谱分析条件为：电喷雾离子化电离源(ESI)，采用正离子模式；维奈克拉的离子对为869.50→321.50，DP(去簇电压)80V，CE(碰撞电压)55V；伏立康唑的离子对为350.20→281.00，DP 35V，CE 40V；泊沙康唑的离子对为701.30→127.00，DP 80V，CE 90V；内标维奈克拉-D8的离子对为877.40→329.70，DP 90V，CE 62V；内标伏立康唑-D3的离子对为353.20→284.00，DP 35V，CE 40V；内标泊沙康唑-D4的离子对为705.30→131.00，DP80V，CE 90V；离子源温度500℃；碰撞气(CAD)4psi，帘气(CUR)35psi，离子源气体1(GS1)60psi，离子源气体2(GS2)60psi，均为氮气；离子喷雾电压(IS)5500V；入口电压(EP)10V；碰撞池出口电压(CXP)15V。其中，泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的定量离子图如图1所示。
以分析物血药浓度C为X轴、分析物峰面积(As)与对应内标峰面积(Ai)的比值f(f＝As/Ai)为Y轴，进行权重线性回归(权重系数为1/x2)分析，得到标准曲线回归方程(如表2、图2所示)。
表2维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑的标准曲线及分析结果
从表2及图2可以看出，血浆中维奈克拉、伏立康唑浓度在50.0-10000ng/mL范围内，泊沙康唑浓度在25.0-5000ng/mL范围内，分析物与内标峰面积的比值与浓度成良好的线性关系，相关系数r值均大于0.99，完全满足分析测试需要。
(3)样本前处理
取100μL血浆样本，加入400μL含内标的甲醇(内标维奈克拉-D8 500ng/mL，伏立康唑-D3 200ng/mL，泊沙康唑-D4 300ng/mL)，涡旋5min沉淀蛋白，13000rpm离心10min，取上清液作为待测溶液。
(4)高效液相色谱-串联质谱分析
取待测溶液进行高效液相色谱-串联质谱分析，分析条件同步骤(2)，色谱图如图3所示；将分析结果代入标准曲线回归方程中，得到泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的血药浓度。
在本发明的其他实施例中，测定方法中含内标的甲醇的用量等均可在给定的取值范围中任意选择，基本不影响测定结果。
实施例2
本实施例提供了一种使用实施例1中方法同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的分析试剂盒，包括以下组分：标准曲线溶液，含内标的甲醇，流动相A和流动相B，以上组分均同实施例1；以及低、中、高3个浓度的质控溶液，低浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为100ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，中浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为1000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL，高浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为8000ng/mL、8000ng/mL、4000ng/mL。
在本发明的其他实施例中，分析试剂盒还包括Shimadzu VP-ODS C18色谱柱，规格：150mm×2.0mm，4.6μm。
实验例
方法学验证内容包括：选择性、标准曲线与线性、定量下限、准确度和精密度、残留效应、基质效应、提取回收率、稳定性、稀释效应等。其中，稳定性研究包括：生物样本长期冻存、反复冻融、处理过程、样本制备后分析过程中的稳定性，以及分析物溶液在室温放置和长期储存的稳定性。实验例中采用新鲜配制的标准品溶液来考察经过一定储存条件存放后的血样稳定性。
1、选择性
取6个不同来源的人空白血浆，以400μL甲醇为沉淀剂，分别按照实施例1中前处理方法处理后取上清液进行HPLC-MS/MS分析，记录色谱图(如图4所示)，考察空白基质的干扰。
取标曲空白点工作液(即三种药物浓度均为0.0ng/mL的溶液)、定量下限工作液(即维奈克拉、伏立康唑浓度均为500.0ng/mL，泊沙康唑浓度为250.0ng/mL的混合标准曲线工作液)和定量上限工作液(即维奈克拉、伏立康唑浓度均为100000ng/mL，泊沙康唑浓度为50000ng/mL的混合标准曲线工作液)各10μL，加入人空白血浆90μL，按照实施例1中前处理方法处理后取上清液进行HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)，记录色谱图(如图5-7所示)，与标曲空白点色谱图比较，定量下限、定量上限出峰位置和峰形符合定量要求。
接受标准：在获得的色谱图中根据保留时间来判断有无干扰峰，干扰峰的峰面积应小于LLOQ峰面积的20％，同时对内标测定的干扰应不超过5％内标峰面积均值。
从图4、6可以看出，空白血浆在维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑的保留时间处无杂质峰干扰分析物和内标；空白基质中维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑保留时间处的干扰峰的最大峰面积均小于2.21％的LLOQ分析物峰面积，无内标干扰峰。
2、标准曲线与线性范围
参照实施例1的方法配制标准曲线溶液和绘制标准曲线，同时计算每个浓度点实测浓度值及其准确度(Ac％)和变异系数(％CV)。方法验证中至少评价3条标准曲线。
标准曲线回归方程：f＝a×C+b(f：As/Ai，a：斜率，b：截距)。
Ac％＝(C实测/C加入)×100％。
接受标准：LLOQ的Ac％在80％-120％以内，％CV不超过20％，其余浓度点的Ac％在85％-115％以内，％CV不超过15％。至少75％非零浓度溶液应满足上述条件，含最少6个有效浓度且标准曲线的定量下限和定量上限溶液均应符合此要求；相关系数r≥0.99。
实验期间有3批血浆样本随行标准曲线，共制备和测定标准曲线3条。结果表明，血浆中维奈克拉、伏立康唑浓度在50.0-10000ng/mL范围内，泊沙康唑浓度在25.0-5000ng/mL范围内，分析物与内标峰面积的比值与浓度成良好的线性关系，相关系数r值均大于0.99，完全满足分析测试需要。
3、定量下限
配制定量下限溶液(维奈克拉和伏立康唑：50ng/mL，泊沙康唑：25ng/mL)，按照实施例1中前处理方法处理后取上清液进行HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)，每批平行制备6个样品，连续且多日制备并测定3批，每批随行一条标准曲线，记录色谱图、分析物峰面积As和内标峰面积Ai，计算As和Ai的比值f(f＝As/Ai)，将f值代入随行的标准曲线，求得实测浓度及其Ac％。批内和批间精密度分别用批内和3批间的浓度实测值的％CV表示，结果如下表3所示。
接受标准：Ac％应在标示浓度的80％-120％范围内，同批和不同批的％CV不超过20％，且至少5个样品满足要求。
从表3可以看出，维奈克拉和伏立康唑的LLOQ为50.0ng/mL，泊沙康唑的LLOQ为25ng/mL，批内准确度范围、％CV和批间准确度范围、％CV均在要求范围内。
4、准确度和精密度
配制低、中、高3个浓度的质控溶液(维奈克拉和伏立康唑：QCL 100ng/mL、QCM1000ng/mL、QCH 8000ng/mL，泊沙康唑：QCL 50ng/mL、QCM 500ng/mL、QCH 4000ng/mL)，按照实施例1中前处理方法处理后取上清液进行HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)。上述每个浓度每批平行制备6个样品，连续并多日制备并测定3批，每批随行一条标准曲线。记录色谱图、分析物峰面积As和内标峰面积Ai，计算As和Ai的比值f(f＝As/Ai)，将f值代入随行的标准曲线，求得实测浓度及其Ac％。批内和批间精密度分别用批内和3批间的浓度实测值的％CV值表示，结果如下表3所示。
接受标准：Ac％均应在85％-115％以内，方法验证每一分析批每一浓度水平QC溶液测定值的％CV不超过15％，且每个浓度至少5个样品满足要求。
表3三种药物的定量下限、批间和批内准确度和精密度
从表3可以看出，维奈克拉和伏立康唑的QCL为100ng/mL，泊沙康唑的QCL为50ng/mL，批内准确度范围、％CV和批间准确度范围、％CV均在要求范围内；维奈克拉和伏立康唑的QCM为1000ng/mL，泊沙康唑的QCM为500ng/mL，批内准确度范围、％CV和批间准确度范围、％CV均在要求范围内；维奈克拉和伏立康唑的QCH为8000ng/mL，泊沙康唑的QCH为4000ng/mL，批内准确度范围、％CV和批间准确度范围、％CV均在要求范围内。
5、基质效应
处理6份不同来源的空白血浆，获得其相应的空白基质400μL，用于配制未经提取的含药基质(即混合空白血浆)。在90μL空白基质中分别加入10μL的低、高浓度质控工作液，按照实施例1中前处理方法处理后取上清液进行HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)，记录色谱图、分析物峰面积As和内标峰面积Ai。
分别精密吸取10μL的低、高浓度质控工作液，分别加入90μL的水、400μL含内标的甲醇，涡旋混匀后取清液进行HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)，每个浓度平行制备6个样品，记录色谱图、分析物峰面积(As)C和内标峰面积(Ai)C。
计算分析物基质因子fA，内标基质因子fi，进一步计算经内标归一化的基质因子fAi，计算公式如下所示，结果如下表4所示。
fA＝As/(As)Cmean×100％。
fi＝Ai/(Ai)Cmean×100％。
fAi＝fA/fi×100％。
接受标准：利用获得的内标归一化基质效应因子计算％CV，其值应不超过15％。
从表4可以看出，维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑的质控溶液内标归一化基质效应因子的％CV均小于11.52％，表明该方法中分析物的基质效应精密且可重现。
6、提取回收率
处理并测定低、中、高3个浓度的质控溶液(方法同实验例4)，每个浓度平行制备6个样品，记录色谱图、分析物峰面积(As)B和内标峰面积(Ai)B。
处理空白血浆，获得其相应的空白基质400μL，用于配制未经提取的含药基质。在90μL空白基质中分别加入10μL的低、中、高浓度质控工作液，按照实施例1中前处理方法处理后取上清液进行HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)，记录色谱图、分析物峰面积(As)A和内标峰面积(Ai)A。
计算分析物的提取回收率Rec％、内标的提取回收率Rec％，计算公式如下所示，结果如下表4所示。
分析物的提取回收率Rec％＝(As)B/(As)Amean×100％。
内标的提取回收率Rec％＝(Ai)B/(Ai)Amean×100％。
接受标准：分析物在每个浓度水平的提取回收率的％CV均不超过15％；内标的提取回收率的％CV均不超过15％。
表4三种药物的基质效应与提取回收率
从表4可以看出，三种药物的低、中、高3个浓度质控溶液的平均提取回收率均在94.04％-104.06％之间，％CV均小于7.32％，表明该方法中分析物的提取回收率精密且可重现。
7、残留效应
在进样标准曲线的定量上限溶液(维奈克拉和伏立康唑ULOQ：10000ng/mL；泊沙康唑ULOQ：5000ng/mL)及高浓度质控溶液之后进样空白样品(空白样品的制备操作为：在100μL人空白血浆中加入400μL甲醇作为沉淀剂，按照实施例1中前处理方法处理后取上清液，即为空白样品)，HPLC-MS/MS分析条件同实施例1，考察系统残留。
接受标准：空白样品中分析物峰面积最大值应不超过分析批内所有LLOQ样品分析物峰面积最小值的20％；内标峰面积最大值应不超过分析批内所有LLOQ样品内标峰面积最小值的5％。
实验结果表明，在进样标准曲线ULOQ及高浓度质控溶液之后进样空白样品，三种药物及其内标基本无残留，残留最大为2.28％，表明在选定的HPLC-MS/MS分析条件下，系统的残留效应在可接受范围内，不影响测定准确度。
8、稳定性
(1)血浆样本稳定性
精密吸取低、高浓度质控工作液10μL于90μL空白血浆中，涡旋混匀，每个浓度平行制备6个样品，作为1份，共制备3分，制备后在不同条件下保存并按照实施例1的方法进行前处理及HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)。其中，1份于室温下放置8小时，考察血浆样本的室温稳定性；1份置于-20℃冰箱中保存24h，考察-20℃下储存稳定性；1份置于-70℃冰箱中保存3周，考察-70℃下储存稳定性；1份置于-70℃下并反复冻融3次，考察血浆样本反复冻融的稳定性。以上分别记录色谱图、分析物峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f(f＝As/Ai)，将f值代入随行的标准曲线中，求得实测浓度和Ac％，并计算％CV，结果如下表5所示。
接受标准：Ac％均应在85％-115％以内，％CV不超过15％。
(2)制备后样本自动进样器放置稳定性
将低浓度质控溶液以及高浓度质控溶液按照实施例1的方法进行前处理，处理后先于4℃下放置24h，之后HPLC-MS/MS分析(分析条件同实施例1)。每个浓度至少6个样品，记录色谱图、分析物峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f(f＝As/Ai)，将f值代入新鲜配制后绘制的标准曲线中，求得实测浓度和Ac％，并计算％CV(n＝6)，结果如下表5所示。
接受标准：Ac％应在85％＝115％以内，CV不超过15％。
表5三种药物的稳定性实验结果
从表5可以看出，血浆样本于室温放置8小时、-20℃放置24小时、-70℃冷冻保存3周及-70℃反复冻融3次的条件下，维奈克拉的低、高浓度质控溶液实测浓度的准确度在86.47％-107.67％范围内，％CV不超过13.99％，伏立康唑的低、高浓度质控溶液实测浓度的准确度在96.55％-109.17％范围内，％CV不超过4.98％；泊沙康唑的低、高浓度质控溶液实测浓度的准确度在94.17％-109.00％范围内，％CV不超过8.16％，即血浆样本于室温放置4小时及反复冻融5次的情况下均稳定。
从表5可以看出，三种药物低、高浓度质控溶液处理后于4℃进样器中放置24小时，维奈克拉实测浓度的准确度范围为109.00％-109.29％，％CV分别为4.50％和3.23％，伏立康唑实测浓度的准确度范围为97.75％-108.50％，％CV分别为4.85％和3.44％，泊沙康唑实测浓度的准确度范围为100.35％-108.83％，％CV分别为6.30％和2.43％，即血浆样本处理后于2-8℃下放置24小时是稳定的。
9、稀释效应
用维奈克拉储备液、伏立康唑储备液和泊沙康唑储备液配制稀释效应工作液(维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑浓度分别为500000ng/mL、500000ng/mL和250000ng/mL)，吸取稀释效应工作液10μL，加入混合空白血浆90μL，获得初始浓度样本(维奈克拉50000ng/mL，伏立康唑50000ng/mL，泊沙康唑25000ng/mL)，然后采用空白血浆进行10倍和100倍的稀释，获得稀释样本(10倍稀释后，维奈克拉5000ng/mL，伏立康唑5000ng/mL，泊沙康唑2500ng/mL；100倍稀释后，维奈克拉500ng/mL，伏立康唑500ng/mL，泊沙康唑250ng/mL；n＝6)，之后按照实施例1中前处理方法处理后进行HPLC-MS/MS分析，记录色谱图、分析物峰面积As和内标峰面积Ai，计算As和Ai的比值f(f＝As/Ai)，将f值代入随行的标准曲线中，求得实测浓度及Ac％，实测浓度乘以稀释倍数10或者100可得稀释前的浓度。
接受标准：Ac％均应在85％-115％以内，且实测值的％CV不超过15％。
实验结果表明，维奈克拉、伏立康唑和泊沙康唑的浓度高于定量上限后，稀释10后准确度范围分别是89.02％-92.01％，实测值的％CV为1.08％-6.38％；稀释100后准确度范围分别是92.08％-98.96％，实测值的％CV为2.28％-7.00％；表明分析物在稀释10倍或100倍后的精密度和准确度在可接受范围内。
本发明提供了一种采用高效液相色谱-串联质谱同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，通过选择性、线性、准确度、精密度、基质效应、回收率、残留效应、稳定性、稀释效应等方法学验证，满足临床样本的检测要求。其中，精密度、准确度以及人员操作等的误差RSD均小于20％，连续3天拟合曲线的拟合常数R2均大于0.99。因此，采用本发明提供的方法能够简便、准确、高效地测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉三种药物的血药浓度，这对于三种药物的临床合理使用，避免不良反应和耐药性的发生具有重要的意义。
本发明提供了一种采用高效液相色谱-串联质谱同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的分析试剂盒，具有定性可靠、定量准确、灵敏度高、重复性好等优点，对于三种药物的临床合理应用具有重要的意义。
虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不应视为对本发明保护范围的任何限制。基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样本前处理
将血浆样本与内标、沉淀剂混合，沉淀蛋白后得到待测溶液；
(2)高效液相色谱-串联质谱分析
取待测溶液进行高效液相色谱-串联质谱分析，经计算后得到泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的血药浓度；
所述高效液相色谱分析条件为：Shimadzu VP-ODS C18色谱柱，规格：150mm×2.0mm，4.6μm；0.1％v/v甲酸水溶液为流动相A，含0.1％v/v甲酸的甲醇溶液为流动相B，采用梯度洗脱程序，流速为0.40mL/min；柱温40℃；进样量10μL。
2.根据权利要求1所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述内标为维奈克拉-D8、伏立康唑-D3、泊沙康唑-D4；
和/或，步骤(1)中，所述沉淀剂为甲醇或乙腈，优选为甲醇。
3.根据权利要求1所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述梯度洗脱程序为：0-1.99min，90％流动相A(余量为流动相B，下同)；1.99-2.0min，90％流动相A→35％流动相A；2.0-3.5min，35％流动相A→5％流动相A；3.5-5.5min，5％流动相A；5.5-5.6min，5％流动相A→90％流动相A；5.6-6.5min，90％流动相A。
4.根据权利要求1所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述质谱分析条件为：电喷雾离子化电离源，采用正离子模式；维奈克拉的离子对为869.50→321.50，DP 80V，CE 55V；伏立康唑的离子对为350.20→281.00，DP 35V，CE 40V；泊沙康唑的离子对为701.30→127.00，DP 80V，CE 90V；内标维奈克拉-D8的离子对为877.40→329.70，DP 90V，CE 62V；内标伏立康唑-D3的离子对为353.20→284.00，DP 35V，CE 40V；内标泊沙康唑-D4的离子对为705.30→131.00，DP 80V，CE90V；离子源温度500℃；碰撞气4psi，帘气35psi，离子源气体1 60psi，离子源气体2 60psi，均为氮气；离子喷雾电压5500V；入口电压10V；碰撞池出口电压15V。
5.根据权利要求1所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：所述方法还包括以下一个或多个步骤：使用标准曲线溶液绘制标准曲线，使用质控溶液进行质控检验。
6.根据权利要求5所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：所述标准曲线溶液的配制操作为：将系列浓度的混合标准曲线工作液分别与生物基质、内标和沉淀剂混合，沉淀蛋白后得到系列浓度的标准曲线溶液，其中维奈克拉和伏立康唑的浓度均依次为50，100，500，1000，2000，5000，10000ng/mL，对应泊沙康唑的浓度依次为25，50，250，500，1000，2500，5000ng/mL；
和/或，所述绘制标准曲线的操作为：取系列浓度的标准曲线溶液分别进行高效液相色谱-串联质谱分析，以分析物血药浓度为X轴、分析物峰面积与对应内标峰面积的比值f为Y轴进行权重线性回归分析，得到标准曲线回归方程。
7.根据权利要求5所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：所述质控溶液的配制操作为：将低、中、高3个浓度梯度的质控工作液分别与生物基质、内标和沉淀剂混合，沉淀蛋白后得到低、中、高3个浓度的质控溶液；所述低浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为100ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，所述中浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为1000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL，所述高浓度质控溶液中维奈克拉、伏立康唑、泊沙康唑的浓度分别为8000ng/mL、8000ng/mL、4000ng/mL；
和/或，所述质控检验的操作为：取低、中、高3个浓度的质控溶液分别进行高效液相色谱-串联质谱分析，经计算后得到每个质控溶液中泊沙康唑、伏立康唑、维奈克拉的检测浓度；将检测浓度与质控溶液的标准浓度进行准确度和精密度分析，得到质控检验结果。
8.根据权利要求1所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述计算为：将分析结果代入标准曲线回归方程中，得到泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉的血药浓度。
9.一种使用如权利要求1-8中任一项所述的方法同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的分析试剂盒，其特征在于：所述分析试剂盒包括以下一种或多种组分：含内标的沉淀剂或者内标和沉淀剂，流动相A和流动相B，标准曲线工作液，质控工作液。
10.根据权利要求9所述的同时测定泊沙康唑、伏立康唑和维奈克拉血药浓度的分析试剂盒，其特征在于：所述分析试剂盒还包括色谱柱。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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