CN114019069A - 生物样品中小分子物质检测的前处理试剂 - Google Patents

生物样品中小分子物质检测的前处理试剂 Download PDF

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CN114019069A CN202111134742.XA CN202111134742A CN114019069A CN 114019069 A CN114019069 A CN 114019069A CN 202111134742 A CN202111134742 A CN 202111134742A CN 114019069 A CN114019069 A CN 114019069A
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张学东
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Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及生物样品中小分子物质检测的前处理试剂。本发明提供的试剂中，包括磁珠悬液、活化液和洗脱液。以该试剂对生物样品中待测物的提取效率高且提取回收率高，所需样本量少，能够高效、准确富集生物样品中待测物。相比于免疫生物磁珠试剂盒，开封后的有效期长，更稳定。并且，配套使用的仪器成本低，更有利于前处理流程的自动化。

Description

生物样品中小分子物质检测的前处理试剂
本申请要求于2021年05月25日提交中国专利局、申请号为 202110572013.6、发明名称为“生物样品中小分子物质检测的前处理试剂”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及生物样品中小分子物质检测的前处理试剂。
背景技术
生物样品通常是指植物的花、叶、茎、根、种子等，动物(包括人)的体液(如尿、血、唾液、胆汁、胃液、淋巴液及生物体的其他分泌液等)、毛发、肌肉和一些组织器官(如胸腺、胰腺、肝、肺、脑、胃、肾等)以及各种微生物。由于生物样品的组成复杂，易对后续分析检测产生干扰，因此需要在分析检测前进行样品前处理。
生物样品前处理，也称为样品制备、样品净化、样品提取，是生物分析过程中的重要组成部分。对于临床检验用途的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS) 方法而言，样品分析检测之前对生物样品进行处理是十分必要的。样品前处理的主要目的是从样品基质中将一个或多个目标分析物与其他组分分离。生物样品前处理是LC-MS/MS方法开发和优化极为关键的一环，因为样品前处理是高通量检测的制约瓶颈以及分析误差的主要来源。LC-MS/MS方法的失败常常是由于样品前处理不当，导致目标分析物信号被抑制或者被生物基质中的共存物干扰。
生物样品具有以下特点：①生物样品基质组成十分复杂，样品中既含有大分子的蛋白质、核酸，也含有小分子的脂肪、糖、尿酸、尿素等组分，还有钠盐等盐类，都可能对分析检测产生干扰；②生物样本中部分目标分析物的浓度太低，如不进行必要的富集浓缩，仪器灵敏度可能无法达到；③生物样品与LC-MS/MS分析系统不兼容，如不进行前处理将损害分析系统，造成色谱柱堵塞、离子源污染、产生基质效应等不良后果。因此生物样品前处理的目的在于：①净化样品，去除干扰成分(蛋白、磷脂、盐等)；②减少基质效应，提高灵敏度，浓缩样品、提高质谱检测信号；③保护进样系统和色谱柱；④简化分析过程，提高检测通量。总之，进行有效的样品前处理是开展灵敏、准确、高通量LC-MS/MS分析的前提。
目前，生物样品进行LC-MS/MS检测前的前处理方法主要包括：
1、蛋白沉淀法(PPT)：PPT是应用最早、耗时最少、已被广泛应用于生物分析的样品前处理方法，具有简单、快速、经济的特点，是常用甚至首选的样品前处理方法。血样在LC-MS/MS分析测定之前，必须首先进行去蛋白处理。通过加入蛋白沉淀剂，使蛋白质变性，然后再混合、离心，形成蛋白沉淀和上清液，直接进样或稀释后进样检测。常见的蛋白沉淀剂有：①与水混溶的有机溶剂，如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等，2-3倍体积于样品混合，使蛋白质分子内和分子间氢键改变而凝聚，经离心去除；②中性盐，饱和硫酸铵、硫酸钠等，使蛋白脱水而沉淀；③强酸：如10％三氯乙酸、6％高氯酸等，使pH低于蛋白等电点，形成不溶性盐而沉淀；④锌盐、铜盐、硫酸锌等，金属盐离子与蛋白羧基形成不溶性盐而沉淀；⑤酶、枯草菌溶素等，测定一些酸不稳定及蛋白结合牢固的物质。该方法在处理大量的样品时比较耗时，效率不高；PPT处理的样品净化程度低，如不进行适当的色谱分离，会引起很强的基质效应；处理过程中样品浓度被稀释，不适合待测物含量较少的样品前处理；处理过程中需要使用到高速离心机，成本高并且不利于整个流程的自动化。
2、液液萃取法(LLE)：LLE采用与水不相溶的有机溶剂，将目标分析物从水相提取至有机相的方法。采用手工进行LLE处理包括加有机溶剂、涡旋混合、离心、吹干重组等基本步骤，操作时需要根据分析物的性质，考虑有机溶剂的特性、溶剂体积及pH对提取效果的影响，宜选择对分析物溶解度大，沸点低，易浓缩，与水不相溶，无毒，稳定，不易乳化的溶剂。乳化可导致提取回收率降低，通过增大溶剂体积、温和混合、去蛋白等方法避免。LLE 具有灵活度高，选择性相对较高，磷脂残留量比较低，可浓缩分析物等优点。但该方法操作步骤复杂，比较耗时；对极性大的分析物提取回收率低；所需样品量大；处理过程中需要使用到高速离心机、氮吹装置、氮气发生器/氮气钢瓶等装置，成本高且不利于整个流程的自动化。
3、固相萃取法(SPE):SPE基于样品基质各种组分不同的分配系数，使目标分析物保留并洗脱下来，同时选择性的去除样品基质中的杂质(干扰物)，分析物被浓缩。SPE利用萃取小柱或微孔板，填装不同类型的填料，实现不同的分离模式(反相、正相、离子交换等)，选择性保留分析物而使干扰物流出，或者反之，从而达到净化样品的目的。SPE操作通常经过活化、平衡、上样、清洗、洗脱步骤。通过加入有机溶剂湿润填料孔洞；然后加入与有机相溶剂混溶的平衡溶剂，取代有机溶剂；生物样品经过适当处理后加入到SPE 小柱上；再加溶剂清洗，去除杂质和干扰物；最后加入溶剂将目标分析物从 SPE填料上洗脱，收集供进样分析。SPE具有样品比较干净、所需样品量少、适合质谱分析等特点。该方法操作步骤复杂耗时，手工操作通量低；耗材成本较高，微孔板填料2mg，萃取小柱填料30mg；处理过程中需要使用到机械泵或正压装置(含氮气发生器/氮气钢瓶)等设备，成本高且不利于自动化。
4、免疫生物磁珠法：通常在磁珠的表面修饰羧基、甲苯磺酰基或链霉亲和素等，通过表面修饰的这些基团进行抗体的共价或者非共价偶联，从而形成由特定抗体包被的磁珠，实现对特定待测物抗原的分离和检测。如一种磁微粒化学发光免疫分析的原理为：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗体、待测抗原与碱性磷酸酶(AP)标记的抗体形成“三明治”结构的复合物。随后加入连有抗荧光素抗体的磁性微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁颗粒上，在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。发光强度与待测抗原含量呈正比，使用相应的计算方法便可计算出样本中待测抗原的浓度。免疫生物磁珠法的应用，需要设计针对待测物特异性强的抗体；适用于大分子化合物的检测，对于小分子待测物，采用免疫生物磁珠法容易产生交叉干扰反应；并且，因为涉及抗体，试剂盒一旦开封，保存的时间非常有限。
5、分子印迹磁珠：它是将功能单体在模板分子(目标分子,又称印迹分子) 以及磁珠的存在下,交联聚合,然后洗脱除去模板分子,这样制得由聚合物包被的磁珠,其中磁珠表面的聚合物在立体空穴和功能基排布上与目标分子具有互补的结构,因此实现对目标分子的选择与分离。如公开号为CN111474282A的专利发明了一种分子印迹磁珠用于食品样本中有机磷农药等含磷化合物的提取。分子印迹聚合物的制备方法让适量的模板分子、功能单体、磁珠、交联剂和引发剂按照一定比例混合,模板分子在合适的引发条件下反应生成聚合物,最后再用适当溶剂除去模板分子。该种方法在提取目标物时会产生很大的非特异性吸附，主要用于成分较为简单的食品样品或环境样品，不适用于基质组成复杂的血清或血浆等生物样品。另外用溶剂处理聚合反应生成的聚合物颗粒时,很难将聚合物颗粒中的模板分子完全清洗干净,当用该分子模板聚合物萃取浓度较低的样品时，会造成严重误差。
可见，以上述方法对生物样品中的小分子目标物进行富集都存在一定的缺陷，因此，仍需进一步研发能够高效、准确从生物样品中富集到小分子待测物的试剂。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供能够高效、准确富集生物样品中小分子物质的试剂。
本发明所述生物样品中小分子物质检测的前处理试剂，其包括：磁珠悬液、活化液、重悬液、清洗液和洗脱液；
所述磁珠悬液中磁珠为表面修饰十八烷基的磁珠；
所述活化液为三氯乙酸的水溶液；
所述洗脱液为甲酸、甲醇和水的混合液；
所述重悬液为水，
所述清洗液为水。
本发明所述试剂中，各组分相互独立存在。其中，磁微粒悬液：表面有亲水或疏水基团修饰的铁磁微粒悬液，在外加磁场下，可以实现磁微粒与溶液分离。活化液：含有液体改性剂的溶液。洗脱液：水相或有机相或水相与有机相一定比例的含有液体改性剂的溶液。重悬液：水相或有机相或水相与有机相一定比例的溶液。内标液：含有待测物稳定同位素内标或结构类似物的溶液。清洗液：水相或有机相或水相与有机相一定比例的溶液。本发明实施例中，以对血液样品进行处理从而对其中25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素A、维生素E和/或免疫抑制剂，进行检测为例进行验证。
一些实施例中，所述磁珠悬液中溶液为纯化水，其中磁珠的密度为 10mg/mL。
一些实施例中，所述活化液中三氯乙酸的体积分数为0.1％。
一些实施例中，所述洗脱液中，甲酸、甲醇和水的体积比为0.1:90:10。
本发明所述的前处理试剂中还包括解离剂，所述解离剂中包括：1.5g/L 十二烷基磺酸钠、100g/L二甲基亚砜、50g/L乙醇、0.05M/LTris-HCl。
一些实施例中，本发明所述的前处理试剂中还包括内标液。所述内标溶液为小分子物质的溶液，所述小分子物质包括泊沙康唑、25-羟基维生素D2、 25-羟基维生素D3、维生素A、维生素E和/或免疫抑制剂；所述免疫抑制剂为他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢霉素A、子囊霉素、西罗莫司-d3、依维莫司-d4和/或环孢霉素A-d12。
本发明还提供了一种生物样品中小分子物质检测的前处理方法，其以本发明所述的前处理试剂对生物样品进行处理。
本发明实施例中，所述生物样品为血液，所述小分子物质为泊沙康唑、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素A、维生素E和/或免疫抑制剂；所述免疫抑制剂为他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢霉素A、子囊霉素、西罗莫司-d3、依维莫司-d4和/或环孢霉素A-d12。
一些具体实施例中，所述前处理方法包括：
将所述磁珠以所述活化液活化后，以超纯水重悬，得到磁珠工作液；
将血液与所述磁珠工作液混合，孵育后分离磁珠；
磁珠经超纯水清洗后，以洗脱液洗脱，然后取上清液。
所述磁珠工作液中，磁珠的密度为10mg/mL；
所述血液与磁珠工作液的体积比为(10～100):100；
所述孵育为室温孵育2～5min；
所述磁珠与洗脱液的质量-体积比为1mg:100μL。
以对血液样品中泊沙康唑前处理为例，所述前处理方法中，所述磁珠工作液中，磁珠的密度为10mg/ml；所述血液与磁珠工作液的体积比为1:10；所述孵育为室温孵育5min；所述磁珠与洗脱液的质量-体积比为1mg:100μL。
本发明还提供了一种血液中泊沙康唑的检测方法，其包括：
以本发明前处理方法对血液进行处理后，以LC-MS/MS的液相色谱进行检测；
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为50℃，流动相流速为0.4mL/min；
流动相A为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～1.2min，流动相A的体积分数由95％至10％，
1.2～2.0min，流动相A的体积分数为10％，
2.0～2.1min，流动相A的体积分数由10％至95％，
2.1～3.0min，流动相A的体积分数为95％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模式；毛细管电压0.8kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速1000L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999％；扫描方式为多反应监测模式，泊沙康唑的离子对为701.4/127.0，锥孔电压70V，碰撞能量56eV。
以对血液样品中25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3前处理为例，所述前处理方法包括：
将血液样品与解析液混合，涡旋1min后37℃解离30min；所述血液样品与解析液的体积比为1:2；
将解离后的样品与磁珠悬液混合，孵育2min；磁珠悬液与血液样品的体积比为1：1；
离心取沉淀，以洗涤液进行洗涤后，以洗脱液进行洗脱。
所述磁珠工作液中，磁珠的密度为1mg/ml；所述血液与磁珠工作液的体积比为1:10；所述孵育为室温孵育5min；所述磁珠与洗脱液的质量-体积比为 1mg:100μL。
本发明还提供了一种25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3的检测方法，其包括：以本发明前处理方法对血液进行处理后，以LC-MS/MS的液相色谱进行检测。
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为45℃，流动相流速为0.4mL/min；
流动相A为含0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～1.0min，流动相A体积分数为20％，
1.0～1.8min，流动相A体积分数由20％至10％，
1.8～2.6min，流动相A体积分数由10％至2％，
2.6～3.0min，流动相A体积分数为2％，
3.0～4.0min，流动相A体积分数由2％至20％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模式；毛细管电压2.0kV；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流速800L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999％；扫描方式为多反应监测模式。
以对血液样品中维生素A、维生素E前处理为例，所述前处理方法中，
所述前处理方法中，所述磁珠工作液中，磁珠的密度为10mg/ml；所述血液与磁珠工作液的体积比为1:1；所述孵育为室温孵育2min；所述磁珠与洗脱液的质量-体积比为1mg:100μL。
本发明还提供了一种维生素A、维生素E的检测方法，其包括：以本发明前处理方法对血液进行处理后，以LC-MS/MS的液相色谱进行检测。
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为45℃，进样温度为8℃，流动相流速为0.4mL/min；
流动相A为含0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～0.4min，流动相A体积分数由15％至5％，
0.4～2min，流动相A体积分数由5％至0％，
2～2.7min，流动相A体积分数为0％，
2.7～3.3min，流动相A体积分数由0％至15％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模式；毛细管电压3.0kV；脱溶剂气温度600℃；脱溶剂气流速1100L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999％；扫描方式为多反应监测模式。
以对血液样品中免疫抑制剂前处理为例，所述前处理方法中，
所述免疫抑制剂为他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢霉素A、子囊霉素、西罗莫司-d3、依维莫司-d4和/或环孢霉素A-d12。
本发明还提供了一种免疫抑制剂的检测方法，其包括：以本发明前处理方法对血液进行处理后，以LC-MS/MS的液相色谱进行检测。
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为50℃，进样温度为2～8℃，流动相流速为0.5 mL/min；
流动相A为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～0.2min，流动相A体积分数为50％，
0.2～1min，流动相A体积分数由50％至0％，
1～2min，流动相A体积分数为0％，
2～2.1min，流动相A体积分数由0％至50％，
2.1～3min，流动相A体积分数为50％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模，扫描方式为多反应监测模式；离子源参数包括：离子化电压5.5kV，温度550℃、气帘气35psi、碰撞气7、喷雾气50psi、辅助加热气50psi，MRM离子通道采用氨加合离子。
本发明提供的试剂中，包括磁珠悬液、活化液和洗脱液。以该试剂对生物样品中待测物的提取效率高且提取回收率高，所需样本量少，能够高效、准确富集生物样品中待测物。相比于免疫生物磁珠试剂盒，开封后的有效期长，更稳定。并且，配套使用的仪器成本低，更有利于前处理流程的自动化。
附图说明
图1示4个批次检测泊沙康唑线性回归方程；
图2示25-羟基维生素D2工作曲线和25-羟基维生素D3工作曲线；
图3示维生素A和维生素E的工作曲线。
具体实施方式
本发明提供了生物样品中小分子物质检测的前处理试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、提取血清/血浆中泊沙康唑的前处理试剂盒
磁微粒悬液(Dynabeads RPC18，粒径1微米)：表面有十八烷基修饰的铁磁微粒悬液，浓度10mg/ml(1mL)，在外加磁场下，可以实现磁微粒与溶液分离。
活化液(0.1％三氯乙酸)：在2mL超纯水中加入2μL三氯乙酸制成0.1％三氯乙酸溶液。
重悬液：超纯水，3mL。
内标液：移取泊沙康唑-d4标准液体(1mg/ml)10μL，加入4.92mL50％甲醇水，混匀后得到内标液。
清洗液：超纯水，30mL。
洗脱液(含0.1％甲酸的90％甲醇水)：取1000μL超纯水加9000μL乙腈，再加入10μL甲酸，混匀。
2、泊沙康唑前处理试剂盒的使用步骤及回收率
取1mL磁微粒悬液于EP管中并放置于磁微粒分离器中，该分离装置中含有一个磁铁，可以将磁微粒固定在管壁上。用移液枪去除上清液体，然后将EP管从分离器中取出。随后取1mL的活化液加入EP管中，经过多次移液使磁微粒重悬。再次引入磁铁，去除活化液。然后磁珠重悬于2.5mL重悬液中，得到磁微粒工作液。
另取一个1.5mL EP管进行样品制备：加入10μL内标液和10μL血清样本 (泊沙康唑浓度为1mg/L)。混匀后加入100μL制备好的磁微粒工作液。混匀后室温孵育5分钟，再次引入磁铁，去除上清中的样品基质。去除磁铁，加入500μL清洗液对磁珠进行洗涤。再次在磁场下固定磁珠，移除上清液。最后加入100μL洗脱液使磁珠重悬。固定磁珠后，取上清进行LC-MS/MS的 MRM模式进行检测，记录泊沙康唑的峰面积。为了进行比较，还分析了同浓度泊沙康唑的纯溶剂(不需要进行提取)，记录峰面积。
LC-MS/MS的液相色谱检测条件：色谱柱为C18柱，柱温为50℃，流动相流速为0.4mL/min。
流动相A：含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水，
流动相B：含2mM乙酸铵的0.1％甲酸甲醇；
0～1.2min，流动相A的体积分数由95％至10％，
1.2～2.0min，流动相A的体积分数为10％，
2.0～2.1min，流动相A的体积分数由10％至95％，
2.1～3.0min，流动相A的体积分数为95％；
液相色谱仪为ACQUITY UPLC I-Class(沃特世)。
LC-MS/MS的质谱检测条件为：离子源为电喷雾电离离子源(ESI，正离子模式)；毛细管电压0.8kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速1000L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999％；扫描方式为多反应监测模式，泊沙康唑的离子对为 701.4/127.0，锥孔电压70V，碰撞能量56eV。液相色谱仪为ACQUITY UPLC I-Class(沃特世)。
结果显示，泊沙康唑纯溶液和血清提取液的峰面积差异小于5％，说明基于磁珠的前处理方法提取回收率高。另外，可以说明40μg的磁微粒足以使分析物从1μL的血清中完全提取，而基于小柱的固相萃取方案通常用1mg的填料来提取1μL的样品，因此本发明提出的基于磁珠的前处理方法的提取效率更高。
3、泊沙康唑前处理试剂盒的线性验证
配制一套泊沙康唑血清校准品(6个浓度水平)，浓度分别为0.2μg/mL、 0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL和10μg/mL。使用实施例1的前处理试剂盒平行处理四批校准品(前处理步骤同上),将提取后的溶液进行LC-MS/MS 检测(检测条件同上)。以泊沙康唑的浓度为横坐标，以泊沙康唑的峰面积与其内标(泊沙康唑-d4)峰面积的比值为纵坐标进行线性回归，获得泊沙康唑的线性回归方程(即标准曲线)，4个批次的线性回归方程如下表所示，拟合的标准曲线如附图1～3所示。所有批次中线性相关系数R2均大于0.999，线性良好。
批次 线性回归方程 相关系数(R<sup>2</sup>)
1 y＝1.3093×x+0.00508921 0.999203
2 y＝1.41915×x+0.0111105 0.999542
3 y＝1.34366×x+0.0127576 0.999640
4 y＝1.21213×x+0.0134247 0.999809
4、抗真菌药物的前处理试剂盒的准确性评价
按上述检测方法检测泊沙康唑血清质控品，低浓度泊沙康唑血清质控品浓度为0.85μg/mL，高浓度泊沙康唑血清质控品为4.4μg/mL。经前处理试剂盒按上述方法进行平行三个批次的处理后进行LC-MS/MS检测。根据质控品中泊沙康唑峰面积与同位素内标物峰面积的比值，以及泊沙康唑的线性回归方程，计算质控品中各化合物的浓度和准确度，具体数据见下表。
Figure BDA0003281600260000111
由表可知，三个批次低浓度和高浓度质控品的准确度在97.9％-99.1％之间，说明该前处理方法的准确度和重复性较高。
5、不同磁珠工作液浓度对泊沙康唑提取率的影响
由10mg/ml的磁珠悬液分别制备成0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、 2mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的磁珠工作液，用制备的不同浓度的磁珠工作液对血清中泊沙康唑进行提取，不同浓度磁珠工作液的提取率和CV如下表所示。由表可知，4mg/ml的磁珠工作液浓度提取率最高，效果最佳。
磁珠浓度(mg/ml) 0.5 0.8 1.2 2 4 5
提取率/％ 57.4 58.6 56.5 66.8 95.4 80.3
CV/％ 2.8 2.6 5.0 2.3 1.8 3.9
6、不同基团修饰磁珠对泊沙康唑提取率对比
分别使用氨基修饰、羧基修饰、甲苯磺酰基以及十八烷基修饰的磁珠(粒径均为1微米，磁珠工作液浓度均为4mg/ml)对血清中泊沙康唑进行提取，磁珠处理步骤以及前处理步骤同上，结果如下表
磁珠修饰基团 氨基 羧基 甲苯磺酰基 十八烷基
提取率/％ 1.4 0.5 0.4 95.0
CV/％ 106 137 145 2.3
由表可知，十八烷基修饰的磁珠提取率最高，而其他基团修饰的磁珠几乎无提取。
7、不同比例洗脱液对泊沙康唑提取率对比
在进行泊沙康唑样品提取时，分别使用10％-100％甲醇水(含0.1％甲酸) 的洗脱液对十八烷基磁珠进行洗脱，计算不同比例洗脱液对提取率的影响，结果如下表。
甲醇比例 10％ 20％ 30％ 40％ 50％ 60％ 70％ 80％ 90％
提取率％ 6.3 10.2 12.6 32.5 43.8 70.6 73.2 89.7 95.8
由表可知，使用90％甲醇水(含0.1％甲酸)进行洗脱时提取率最高。
实施例2
1、提取血清中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的前处理试剂盒
磁微粒悬液(Dynabeads RPC18，粒径1微米)：表面有十八烷基修饰的铁磁微粒悬液，浓度10mg/ml(1mL)，在外加磁场下，可以实现磁微粒与溶液分离。
解离剂：含二甲基亚砜的缓冲液；称量1.5g十二烷基磺酸钠，加入少量的0.05MTris-HCl缓冲液后溶解，称量100g二甲基亚砜、50g乙醇，置于1L 容量瓶中，0.05M Tris-HCl缓冲液定容。
活化液(0.1％三氯乙酸)：在2mL超纯水中加入2μL三氯乙酸制成0.1％三氯乙酸溶液。
重悬液：超纯水，3mL。
内标液：500ng/mL的25-羟基维生素D2-d3和500ng/mL的25-羟基维生素D3-d3。
清洗液：超纯水，30mL。
洗脱液(含0.1％甲酸的90％甲醇水)：取1000μL超纯水加9000μL乙腈，再加入10μL甲酸，混匀。
2、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3前处理试剂盒的使用步骤
步骤一、样本中25-羟基维生素D解离
1)取100μL血液样本样本/校准品/质控品、10μL内标液、200μL 解离剂于样本管中涡旋1min混匀；
2)将混匀后的混合液放入37℃环境下解离30min。
步骤二、25-羟基维生素D富集纯化
1)解离后，在混合液中加入100μL磁微粒混悬液，混匀后孵育2min；
2)去除溶液后加入500μL洗涤液，混匀后洗涤。
步骤三、25-羟基维生素D洗脱复溶
1)洗涤后去除溶液，加入100μL洗脱液，混匀。
步骤四、转移检测
移取溶液至微孔板中，采用液相色谱-串联质谱仪进行检测。
步骤五、结果处理
1)根据校准品中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D2-d3峰面积比值、25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D3-d3峰面积比值，与校准品中25- 羟基维生素D2浓度、25-羟基维生素D3浓度相应关系，拟合一条校准曲线。
依据待测血液样本中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D2-d3峰面积比值、25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D3-d3峰面积比值来得出待测血液样本中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量。
其中，液相色谱-串联质谱法(Waters I-Class TQD)检测时的色谱条件如下：色谱柱：十八烷基(C18)2.1×50mm，2.6μm；流动相A为含0.1wt％甲酸的水溶液；流动相B为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液；柱温：45℃；进样量20 μL，检测时间4min，采用梯度洗脱程序，梯度洗脱参数如下：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A体积比％ 流动相B体积比％
0 0.4 20 80
1.00 0.4 20 80
1.80 0.4 10 90
2.60 0.4 2 98
3.00 0.4 2 98
4.00 0.4 20 80
其中，液相色谱-串联质谱法(Waters I-Class TQD)检测时的质谱条件如下：电离模式：电喷雾电离源(ESI)，正离子模式；毛细管电压2.0Kv；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：800L/h；采集模式：多反应监测(MRM) 模式。具体离子参数如下：
Figure BDA0003281600260000141
3、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3前处理试剂盒的线性
如图2所示为检测物的工作曲线图，横坐标代表检测物浓度，纵坐标代表检测物峰面积与相应内标峰面积比值，可以看出良好的线性关系，其中， 25-羟基维生素D2的线性关系为y＝0.0107x+0.00294，线性系数r＝0.9995， r2＝0.9990；25-羟基维生素D3的线性关系为y＝0.0260x-0.000193，线性系数 r＝0.9995，r2＝0.9990。
化合物 线性关系 线性系数r 线性系数r2
25-羟基维生素D2 y＝0.0107x+0.00294 r＝0.9995 r2＝0.9990
25-羟基维生素D3 y＝0.0260x-0.000193 r＝0.9995 r2＝0.9990
4、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3前处理试剂盒的准确性评价
按上述检测方法检测相应的血清质控品，经前处理试剂盒按上述方法进行平行三个批次的处理后进行LC-MS/MS检测。根据质控品中待测物峰面积与同位素内标物峰面积的比值，以及待测物的线性回归方程，计算质控品中各化合物的浓度和准确度，具体数据见下表。
Figure BDA0003281600260000151
5、不同磁珠工作液浓度对25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3提取率的影响
由10mg/ml的磁珠悬液分别制备成0.5mg/ml、1.0/ml、2.0/ml、4.0ml、5.0ml 和6.0ml的磁珠工作液，用制备的不同浓度的磁珠工作液对血清中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3进行提取，不同浓度磁珠工作液的提取率如下表所示。由表可知，4mg/ml的磁珠工作液浓度提取率最高，效果最佳。
Figure BDA0003281600260000152
6、不同基团修饰磁珠对25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3提取率对比
分别使用氨基修饰、羧基修饰、甲苯磺酰基以及十八烷基修饰的磁珠(粒径均为1微米，磁珠工作液浓度均为4mg/ml)对血清中25-羟基维生素D2和 25-羟基维生素D3进行提取，磁珠处理步骤以及前处理步骤同上，结果如下表。由表可知，十八烷基修饰的磁珠提取率最高，而其他基团修饰的磁珠几乎无提取。
Figure BDA0003281600260000161
实施例3
1、提取血清中维生素A和维生素E的前处理试剂盒
磁微粒悬液(Dynabeads RPC18，粒径1微米)：表面有十八烷基修饰的铁磁微粒悬液，浓度10mg/ml(1mL)，在外加磁场下，可以实现磁微粒与溶液分离。
活化液(0.1％三氯乙酸)：在2mL超纯水中加入2μL三氯乙酸制成0.1％三氯乙酸溶液。
重悬液：超纯水，3mL。
内标液：50μL维生素A-D6(50μg/mL，50％甲醇水(v/v)配制)和50μ L维生素E-D6(50μg/mL，50％甲醇水(v/v)配制)混合。
清洗液：超纯水，30mL。
洗脱液(含0.1％甲酸的90％甲醇水)：取1000μL超纯水加9000μL乙腈，再加入10μL甲酸，混匀。
2、维生素A和维生素E前处理试剂盒的使用步骤
富集纯化：取100μL样品到1.5mL离心管中，加入10μL内标工作液，混匀，然后加入100μL磁珠溶液混匀，孵育2min，将离心管放到磁力架上静置1min，用移液器移去溶液；
洗涤：加入500μL蒸馏水，混匀，再次将离心管放到磁力架上静置1min，用移液器移去蒸馏水，再次加入500μL蒸馏水，混匀，再次将离心管放到磁力架上静置1min，用移液器移去蒸馏水；
洗脱：加入100μL 90％甲醇水(含0.1％甲酸)混匀，将离心管放到磁力架上静置1min，用移液器吸取洗脱液至96孔板中，进行上机检测。
仪器：液相：Waters ACQUITY UPLC I-Class；质谱：WatersXTQD。
质谱条件：离子源模式：ESI+；数据采集模式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂温度：600℃；脱溶剂气流：1100L/Hr。维生素 A/E的离子对参数如下表所示。
化合物 母离子 子离子 锥孔能量(V) 碰撞能量(V)
维生素A 269.2 92.9 24 20
维生素A-D6 275.2 96.0 26 23
维生素E 431.4 165.1 30 15
维生素E-D6 437.4 171.1 44 20
液相条件：色谱柱：Kinetex C18(2.6μm，2.1×50mm)，流动相A为含 0.1wt％甲酸的水溶液；流动相B为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
柱温：45℃，进样量10μL，进样温度：8℃，流速：0.4mL/min；采用梯度洗脱程序，如下表。
时间(min) A(V，％) B(V，％)
0 15 85
0.4 5 95
2.0 0 100
2.7 0 100
3.3 15 85
数据处理：以校准品浓度为横坐标，校准品面积/内标面积为纵坐标拟合出校准曲线，将待测血清中物质的面积/内标面积代入到校准曲线中从而得出待检测物中维生素A/E的含量。
3、维生素A和E前处理试剂盒的线性
如图所示为检测物的工作曲线图，横坐标代表检测物浓度，纵坐标代表检测物峰面积与相应内标峰面积比值，可以看出良好的线性关系。
Figure BDA0003281600260000171
Figure BDA0003281600260000181
4、维生素A和维生素E前处理试剂盒的准确性评价
按上述检测方法检测相应的血清质控品，经前处理试剂盒按上述方法进行平行三个批次的处理后进行LC-MS/MS检测。根据质控品中待测物峰面积与同位素内标物峰面积的比值，以及待测物的线性回归方程，计算质控品中各化合物的浓度和准确度，具体数据见下表。
Figure BDA0003281600260000182
5、磁珠工作液浓度对维生素A和维生素E提取率的影响
由10mg/ml的磁珠悬液分别制备成0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、 2mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的磁珠工作液，用制备的不同浓度的磁珠工作液对血清中待测物进行提取，不同浓度磁珠工作液的提取率和CV如下表所示。由表可知，4mg/ml的磁珠工作液浓度提取率最高，效果最佳。
Figure BDA0003281600260000183
6、不同修饰基团磁珠对维生素A和维生素E提取率对比
分别使用不同基团修饰的磁珠(粒径均为1微米，磁珠工作液浓度均为 4mg/ml)对血清中维生素A和维生素E进行提取，磁珠处理步骤以及前处理步骤同上，结果如下表。由表可知，十八烷基修饰的磁珠提取率最高，而其他基团修饰的磁珠几乎无提取。
Figure BDA0003281600260000191
实施例4
1、免疫抑制剂前处理试剂盒的使用步骤
待测全血样本分别加入内标溶液、经处理过的疏水基磁珠溶液震荡孵育，之后进行磁分离，然后使用磁珠清洗液洗涤，洗涤后再次进行磁分离，之后加入洗脱液洗脱，磁分离后得到上清液，完成样本处理过程。最后，上清液进入液相色谱串联质谱，完成最终检测。
第一步：100μL校准品/质控样本/待测全血样本至1.5mL离心管/玻璃瓶中；
第二步：加入10μL内标溶液，1500rpm,振荡器涡旋混合1min，使内标充分混合；
第三步：加入100μL磁珠溶液，1500rpm,振荡器涡旋混合1min，孵育 2min，使磁珠充分结合提取目标物；
第四步：放置于磁力架上，进行磁分离，移液枪吸取液体并弃掉；
第五步：于1.5mL离心管/玻璃瓶中加入500μL磁珠清洗液，振荡器涡旋混合1min；
第六步：放置于磁力架上，进行磁分离，移液枪吸取液体并弃掉；
第七步：重复第五步和第六步操作，以充分清洗去除样本中的杂质；
第八步：加入100μL磁珠洗脱液，振荡器涡旋混合1min；
第九步：放置于磁力架上，进行磁分离，移液枪吸取液体至进样小瓶中用于液相色谱串联质谱检测。
液相系统：AB SCIEX
Figure BDA0003281600260000201
HPLC
分析柱：
Figure BDA0003281600260000202
C18(2.1×50mm，2.6μm)色谱柱
流动相：A：2mM乙酸铵+0.1％甲酸+水B：2mM乙酸铵+0.1％甲酸+ 甲醇
流速：0.5ml/min
柱温：50℃
进样室温度：2-8℃
进样体积：10μl
梯度洗脱程序如表所示：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A 流动相B
0.00 0.5 50 50
0.20 0.5 50 50
1.00 0.5 0 100
2.00 0.5 0 100
2.10 0.5 50 50
3.00 0.5 50 50
质谱方法：采用电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描分析，包括离子源参数和MRM离子通道。离子源参数包括离子化电压及温度、气帘气、碰撞气、喷雾气、辅助加热气，具体信息如表所示：
离子化电压(V) 5500
温度(℃) 550
气帘气(psi) 35
碰撞气 7
喷雾气(psi) 50
辅助加热气(psi) 50
MRM离子通道：均采用氨加合离子，具体离子对信息如表所示：
Figure BDA0003281600260000203
Figure BDA0003281600260000211
结果计算：采用液相色谱串联质谱仪数据分析软件，按照校准品峰面积/ 内标峰面积的比值作为纵坐标，对应校准品浓度作为横坐标，建立线性回归，待测全血样本中的四种免疫抑制剂按照数据分析软件设定的方法自动计算。
2、免疫抑制剂前处理试剂盒的线性
如图所示为检测物的工作曲线图，横坐标代表检测物浓度，纵坐标代表检测物峰面积与相应内标峰面积比值，可以看出良好的线性关系。
Figure BDA0003281600260000212
3、免疫抑制剂前处理试剂盒的准确性评价
按上述检测方法检测相应的质控品，经前处理试剂盒按上述方法进行平行三个批次的处理后进行LC-MS/MS检测。根据质控品中待测物峰面积与同位素内标物峰面积的比值，以及待测物的线性回归方程，计算质控品中各化合物的浓度和准确度，具体数据见下表。
Figure BDA0003281600260000221
4、磁珠工作液浓度对免疫抑制剂提取率的影响
由10mg/ml的磁珠悬液分别制备成不同浓度的磁珠工作液，用制备的不同浓度的磁珠工作液对全血中免疫抑制剂进行提取，不同浓度磁珠工作液的提取率如下表所示。由表可知，4mg/ml的磁珠工作液浓度提取率最高，效果最佳。
Figure BDA0003281600260000222
5、不同修饰基团磁珠对免疫抑制剂提取率的影响
分别使用不同基团修饰的磁珠(粒径均为1微米，磁珠工作液浓度均为 4mg/ml)对全血中免疫抑制剂进行提取，磁珠处理步骤以及前处理步骤同上，结果如下表。由表可知，十八烷基修饰的磁珠提取率最高。
磁珠类型 他克莫司 西罗莫司 环孢霉素A 依维莫司
十八烷基磁珠 95.32％ 96.17％ 94.46％ 95.87％
氨基磁珠 0.34％ 1.06％ 1.78％ 0.98％
羧基磁珠 0.87％ 0.78％ 1.02％ 1.14％
环氧基磁珠 0.23％ 0.44％ 0.52％ 0.37％
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (15)

1.生物样品中小分子物质检测的前处理试剂，其包括：磁珠悬液、活化液、重悬液、清洗液和洗脱液；
所述磁珠悬液中磁珠为表面修饰十八烷基的磁珠；
所述活化液为三氯乙酸的水溶液；
所述洗脱液为甲酸、甲醇和水的混合液；
所述重悬液为水，
所述清洗液为水。
2.根据权利要求1所述的前处理试剂，其特征在于，所述磁珠悬液中溶液为纯化水，其中磁珠的密度为10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的前处理试剂，其特征在于，所述活化液中三氯乙酸的体积分数为0.1％。
4.根据权利要求1所述的前处理试剂，其特征在于，所述洗脱液中，甲酸、甲醇和水的体积比为0.1:90:10。
5.根据权利要求1～4任一项所述的前处理试剂，其特征在于，其中还包括解离剂，所述解离剂中包括：1.5g/L十二烷基磺酸钠、100g/L二甲基亚砜、50g/L乙醇、0.05M/LTris-HCl。
6.根据权利要求1～4任一项所述的前处理试剂，其特征在于，其中还包括内标溶液，所述内标溶液为小分子物质的溶液，所述小分子物质包括泊沙康唑、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素A、维生素E和/或免疫抑制剂；所述免疫抑制剂为他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢霉素A、子囊霉素、西罗莫司-d3、依维莫司-d4和/或环孢霉素A-d12。
7.生物样品中小分子物质检测的前处理方法，其特征在于，以权利要求1～6任一项所述的前处理试剂对生物样品进行处理。
8.根据权利要求7所述的前处理方法，其特征在于，所述生物样品为血液；所述小分子物质为泊沙康唑、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素A、维生素E和/或免疫抑制剂；所述免疫抑制剂为他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢霉素A、子囊霉素、西罗莫司-d3、依维莫司-d4和/或环孢霉素A-d12。
9.根据权利要求8所述的前处理方法，其特征在于，包括：
将所述磁珠以所述活化液活化后，以超纯水重悬，得到磁珠工作液；
将血液与所述磁珠工作液混合，孵育后分离磁珠；
磁珠经超纯水清洗后，以洗脱液洗脱，然后取上清液；
所述磁珠工作液中，磁珠的密度为10mg/mL；
所述血液与磁珠工作液的体积比为(10～100):100；
所述孵育为室温孵育2～5min；
所述磁珠与洗脱液的质量-体积比为1mg:100μL。
10.根据权利要求9所述的前处理方法，其特征在于，还包括
血液与磁珠混合前，将血液以所述解析剂进行解析；
所述血液与解析剂的体积比为1:2；所述解析的条件为37℃，30min。
11.一种血液中小分子物质的检测方法，其特征在于，包括：
以权利要求6～9任一项所述的前处理方法对血液进行处理后，以LC-MS/MS的液相色谱进行检测。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述小分子物质为泊沙康唑：
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为50℃，流动相流速为0.4mL/min；
流动相A为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～1.2min，流动相A的体积分数由95％至10％，
1.2～2.0min，流动相A的体积分数为10％，
2.0～2.1min，流动相A的体积分数由10％至95％，
2.1～3.0min，流动相A的体积分数为95％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模式；毛细管电压0.8kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速1000L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999％；扫描方式为多反应监测模式。
13.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述小分子物质为25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为45℃，流动相流速为0.4mL/min；
流动相A为含0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～1.0min，流动相A体积分数为20％，
1.0～1.8min，流动相A体积分数由20％至10％，
1.8～2.6min，流动相A体积分数由10％至2％，
2.6～3.0min，流动相A体积分数为2％，
3.0～4.0min，流动相A体积分数由2％至20％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模式；毛细管电压2.0kV；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流速800L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999％；扫描方式为多反应监测模式。
14.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述小分子物质为维生素A和/或维生素E，
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为45℃，进样温度为8℃，流动相流速为0.4mL/min；
流动相A为含0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～0.4min，流动相A体积分数由15％至5％，
0.4～2min，流动相A体积分数由5％至0％，
2～2.7min，流动相A体积分数为0％，
2.7～3.3min，流动相A体积分数由0％至15％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模式；毛细管电压3.0kV；脱溶剂气温度600℃；脱溶剂气流速1100L/h；反吹气流速50L/h；脱溶剂气和反吹气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氩气，其纯度99.999％；扫描方式为多反应监测模式。
15.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述小分子物质为免疫抑制剂；所述免疫抑制剂为他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢霉素A、子囊霉素、西罗莫司-d3、依维莫司-d4和/或环孢霉素A-d12；
所述LC-MS/MS的液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱，柱温为50℃，进样温度为2～8℃，流动相流速为0.5mL/min；
流动相A为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的水溶液；
流动相B为含2mM乙酸铵、0.1wt％甲酸的甲醇溶液；
洗脱程序包括：
0～0.2min，流动相A体积分数为50％，
0.2～1min，流动相A体积分数由50％至0％，
1～2min，流动相A体积分数为0％，
2～2.1min，流动相A体积分数由0％至50％，
2.1～3min，流动相A体积分数为50％；
所述LC-MS/MS的质谱检测条件包括：
离子源为电喷雾电离离子源，正离子模，扫描方式为多反应监测模式；离子源参数包括：离子化电压5.5kV，温度550℃、气帘气35psi、碰撞气7、喷雾气50psi、辅助加热气50psi，MRM离子通道采用氨加合离子。
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