CN110243980B - 一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法，特点是具体步骤如下：(1)基于载体辅助液液萃取技术通过一次性前处理，完成涵盖了理化性质差异很大的常见4大类工业染料，共计92种禁用工业染料的提取、净化工作；(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备；(3)利用超高效液相色谱‑全扫描高分辨质谱仪联用测定待测样品中92种禁用工业染料的浓度；优点是该方法的前处理和仪器分析过程针对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试的目标物并且降低了检测成本。

Description

一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法

技术领域

本发明涉及一种工业染料检测方法，尤其是涉及一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法。

背景技术

食品禁限用工业染料超量和超种类的滥用是目前食品安全所面对的重大问题之一。工业染料色彩鲜亮，不易褪色，且价格低廉，尤其受到不法商贩的青睐。此类染料不能为人体提供营养物质，反而会危害身体健康，甚至诱发人体癌变，国家严厉打击在食品中违法添加工业染料的行为。

工业染料分析过程主要包括样品前处理技术和仪器分析技术两方面。相关的前处理技术有固相萃取、基质分散固相萃取、凝胶渗透色谱(GPC)净化、直接溶剂萃取等。目前，关于工业染料检测的国家标准以及文献方法，多是按照某一类别建立的仅仅适用于固定食品基质中某一类染料检测的分析方法。这些方法多存在有选择性弊端，样品处理通量不高，尤其对含磺酸根的亲水性酸性染料和亲脂性偶氮类染料不能同时兼容，无法满足多染料快速筛查的需求。例如，周庆琼等采用QuEChERS-液相色谱-串联质谱法同时测定调味品中49种工业染料，前处理过程采用乙腈-甲醇(50：50，V：V)作为提取液，没有兼容到强极性物质的提取；同样的，林慧等通过液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱快速筛查食品中违禁着色剂，前处理通过甲醇和正己烷提取，对含有多个磺酸根的亲水性化合物不能保证回收率。

尽管已有学者建立了食品中多类工业染料的快速筛查方法，但前处理过程复杂，耗时较长，不能满足市场快速检测的需求。例如，赵延胜等建立了食品中46种禁限用合成色素的分级提取净化体系，整个前处理过程复杂，需要多次萃取分步净化，耗时较长；同样的，戚平等建立了食品和环境水中合成色素的高通量筛查方法，更是按照染料类别的不同分别进行多次前处理。因此，建立研究食品中多种类染料高通量筛查技术对于提高监管工作效率，保障我国人民的食品安全具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强且检测限低的食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理

A.称取5.00g样品加水定容至5mL提取，再加入20mL体积比为1：1的甲醇-三氯甲烷溶液，震荡提取5min，以4500r/min离心5min，得到水相、有机相及残渣；

B.取水相层上顶部均匀分布有聚酰胺粉的硅藻土柱，上样后平衡15分钟，然后采用步骤A得到的有机相进行洗脱，再用甲醇上柱洗脱2次，每次10ml，收集洗脱液用纯甲醇定容至20ml；

C.倒置出硅藻土柱顶部的聚酰胺粉于离心管中，加入体积比为1：9的氨水-甲醇溶液10mL，震荡5min，以4500r/min离心5min，收集离心所得液体；

D.将步骤B得到的定容液和步骤C收集的液体各取一半，混匀，氮吹至<5ml，用甲醇定容至5ml，高速离心，待分析；

(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

酸性染料类包括酸性蓝3，酸性绿16，酸性蓝1，酸性红52，酸性红27，酸性蓝113，酸性蓝7，酸性金黄G，酸性橙Ⅳ，酸性橙12，酸性铬深蓝，甲基橙，酸性橙G，酸性橙20，酸性红1，诱惑红，酸性红26，酸性蓝90，酸性红51，酸性绿光，酸性橙2，直接蓝86，直接蓝6，雷玛唑亮蓝，考马斯亮蓝R250，酸性橙3，酸性黄17，酸性蓝41，酸性红18，酸性红87，酸性蓝9，酸性紫43，酸性蓝74，柠檬黄，新红，靛蓝，胭脂红，日落黄，亮蓝，酸性红，赤藓红；

碱性染料类包括碱性红1，碱性绿1，碱性红9，碱性蓝7，碱性紫，碱性蓝9，碱性橙22，碱性橙2，碱性蓝12，碱性蓝17，碱性蓝1，结晶紫内酯，结晶紫，隐色结晶紫，孔雀石绿，隐色孔雀石绿，碱性蓝7，碱性蓝26，碱性蓝11，阳离子橙G，碱性红14，碱性黄1，碱性嫩黄O，碱性紫10，碱性品红，还原红6B，甲苯胺红，对位红，中性红，新品红，碱性蓝41，碱性红2；

分散染料类包括分散黄23，分散黄54，分散黄3，分散黄9，分散橙3，分散橙1，分散橙76，分散橙13，分散橙25，分散橙37，分散橙149，分散红1，分散红19，分散红11，分散蓝1，分散蓝124，分散蓝35，分散蓝60，分散蓝106，分散蓝3，分散蓝14；

苏丹染料类包括苏丹蓝II，苏丹红7B，苏丹橙G，苏丹黑B，苏丹R，苏丹红197，溶剂黑5，溶剂黄，苏丹红B，溶剂黄56，苏丹红I，苏丹II，苏丹红III，苏丹红Ⅳ；将上述4大类标准品分别称取适量，其中酸性染料类用水溶解、苏丹红Ⅳ用二氯甲烷溶解后，分别用乙腈定容，其它染料均用乙腈直接定容配制成10mg/L的混合标准溶液；B.基质标准曲线定量：

在空白样品中分别加入上述4类混合标准溶液，浓度范围为0ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，以浓度为横坐标，仪器响应值(响应值＝标准品峰面积/标准品质量)为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；

(3)色谱及质谱条件

液相条件：色谱柱Hypersil Gold C₁₈，流动相A：含有0.1％甲酸+5mM甲酸铵的水溶液，流动相B：含有0.1％甲酸+5mM甲酸铵的甲醇-水溶液，其中甲醇-水溶液体积比为95:5，流速：0.3mL/min，进样量：10μL，梯度见下表1，

表1正、负离子模式HPLC洗脱程序

质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-1200，分辨率70，000，自动增益控制目标值5e⁵；酸性工业染料采用负离子模式2700V，其余成分采用正离子模式3800V，离子传输管温度为300℃，鞘气压N₂为35arb，辅助气压N₂为10arb，气化室温度350℃；

(4)浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式得到：

X＝2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L

V—定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法，其前处理中采用的提取溶剂为三氯甲烷-甲醇-水(1:1:0.5，v：v：v)，3种溶剂的极性覆盖范围广，完全满足92种工业染料的提取要求，该混合溶液无需添加任何盐类化合物，在上述比值下会主动分层为水相-有机相。水相中的待测化合物经硅藻土柱完成保留和吸附，再将下层有机相作为洗脱液，通过两相的动态分配完成不同极性物质的逐级洗脱，可实现大多数化合物的同时提取、净化、浓缩的目的。而带多个磺酸根强亲水性染料洗脱较困难，上层填充的聚酰胺粉弥补了这一不足，通过氢键吸附住了上述带磺酸根酸性染料，然后通过调节pH值解吸洗脱。因与传统液液萃取相比，SLLE无需借助分液漏斗及大量有机溶剂多次提取待测组分，操作步骤简单、溶剂用量小、重现性好等优点。

综上所述，本发明首次建立了92种禁用工业染料的一步式提取净化体系，经过极性覆盖范围广的三氯甲烷-甲醇-水按照固定比例提取后，分配得到分层后的两相：利用硅藻土柱对水分子的特有保留，和聚酰胺粉对磺酸根亲水化合物的氢键吸附，通过一次前处理，实现了理化性质差异很大的常见4大类，共计92种工业染料的提取、净化工作，并通过高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive)对该体系的效果进行了评价。结果表明，本方法对液态饮料、鱼、糕点类等食品基质具有较强的适用性，检测的92种工业染料线性范围在0.01～0.5μg/mL，定量限为0.04～0.2mg/kg，加标回收率在60％～120％范围，标准偏差小于15％。该方法的前处理和仪器分析过程对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试目标物并且大大降低了检测成本。

附图说明

图1为部分工业染料标准物质色谱图；

图2为饮料基质中有机提取液添加体积对4大类代表性工业染料回收率的影响

图3为鱼肉基质中有机提取液添加体积对4大类代表性工业染料回收率的影响

图4为工业染料的一步式提取净化体系及改进示意图；

图5为净化条件对饮料和鱼肉基质中4大类代表性工业染料回收率的影响；

图6为甲醇洗脱体积(10mL，10mL*2，10mL*3)和氨水的添加量(5％，10％，15％)对4种代表性工业染料回收率的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技ThermoFisherScientific公司)，配置有H-ESI II源。液相色谱系统为UltiMate3000高压液相色谱带自动进样器。色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18柱(2.1mm x 100mm,1.9um)。Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司)。冷冻离心机(德国SIGMA公司)。漩涡振动器(德国Heldolph公司)。滤膜(DIKMA,Nylon 0.22μm)。大孔硅藻土柱(Chromabond XTR,1000mg)：填充的聚酰胺粉均匀分布在顶端。工业染料标准品购自Sigma和Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥95％。基质样品来自国家残留监控抽样和进出口送检企业。聚酰胺粉(80-100目)(美国Fluka公司)；色谱纯甲酸铵和甲酸(美国Sigma-Aldrich公司)。其他试剂(色谱纯，德国Merck公司)。实验用水为Milli-Q超纯水(18.2ΩM)。

1、一步式提取净化流程由于92种工业染料覆盖种类不同，极性差异较大，根据提取溶剂的pKa值及极性范围，采用的提取溶剂依次为5mL水，20mL甲醇-三氯甲烷(1：1，v：v)。在固定比值下，即：三氯甲烷-甲醇-水(1：1：0.5，v：v：v)，溶液会主动分层为水相层-有机相层。步骤如下：

(1)称取5.00g样品，加水定容至5mL提取，再加入20mL甲醇-三氯甲烷(1：1，v：v)，震荡提取5min，以4500r/min离心5min，得到水相(上)-有机相(下)及残渣；

(2)取水相层上硅藻土柱(聚酰胺粉均匀分布在顶端)，上样后平衡15分钟后，采用步骤(1)得到的下层有机相进行洗脱，再用甲醇上柱洗脱2次，每次10ml，收集洗脱液用纯甲醇定容至20ml；

(3)倒置出硅藻土柱顶端的聚酰胺粉于50mL离心管中，加入氨水-甲醇(1：9，V/V)溶液10mL，震荡5min，以4500r/min离心5min，收集液体；

(4)将步骤(2)和步骤(3)的收集液各取一半，混匀，氮吹至<5ml，用甲醇定容至5ml，高速离心，待分析。

2、混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

酸性染料类包括酸性蓝3，酸性绿16，酸性蓝1，酸性红52，酸性红27，酸性蓝113，酸性蓝7，酸性金黄G，酸性橙Ⅳ，酸性橙12，酸性铬深蓝，甲基橙，酸性橙G，酸性橙20，酸性红1，诱惑红，酸性红26，酸性蓝90，酸性红51，酸性绿光，酸性橙2，直接蓝86，直接蓝6，雷玛唑亮蓝，考马斯亮蓝R250，酸性橙3，酸性黄17，酸性蓝41，酸性红18，酸性红87，酸性蓝9，酸性紫43，酸性蓝74，柠檬黄，新红，靛蓝，胭脂红，日落黄，亮蓝，酸性红，赤藓红；

碱性染料类包括碱性红1，碱性绿1，碱性红9，碱性蓝7，碱性紫，碱性蓝9，碱性橙22，碱性橙2，碱性蓝12，碱性蓝17，碱性蓝1，结晶紫内酯，结晶紫，隐色结晶紫，孔雀石绿，隐色孔雀石绿，碱性蓝7，碱性蓝26，碱性蓝11，阳离子橙G，碱性红14，碱性黄1，碱性嫩黄O，碱性紫10，碱性品红，还原红6B，甲苯胺红，对位红，中性红，新品红，碱性蓝41，碱性红2；

分散染料类包括分散黄23，分散黄54，分散黄3，分散黄9，分散橙3，分散橙1，分散橙76，分散橙13，分散橙25，分散橙37，分散橙149，分散红1，分散红19，分散红11，分散蓝1，分散蓝124，分散蓝35，分散蓝60，分散蓝106，分散蓝3，分散蓝14；

苏丹染料类包括苏丹蓝II，苏丹红7B，苏丹橙G，苏丹黑B，苏丹R，苏丹红197，溶剂黑5，溶剂黄，苏丹红B，溶剂黄56，苏丹红I，苏丹II，苏丹红III，苏丹红Ⅳ；将上述4大类标准品分别称取适量，其中酸性染料类用水溶解、苏丹红Ⅳ用二氯甲烷溶解后，分别用乙腈定容，其它染料均用乙腈直接定容配制成10mg/L的混合标准溶液；B.基质标准曲线定量：

在空白样品中分别加入上述4类混合标准溶液，浓度范围为0ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，以浓度为横坐标，仪器响应值(响应值＝标准品峰面积/标准品质量)为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据。

3、色谱及质谱条件液相条件：色谱柱Hypersile Gold C18(100mm x 2.1mm,1.9μm)，流动相A：含有0.1％甲酸+5mM甲酸铵的水溶液，流动相B：含有0.1％甲酸+5mM甲酸铵的甲醇-水(95:5，v:v)溶液，流速：0.3mL/min，进样量：10μL，梯度见下表1，

表1正、负离子模式HPLC洗脱程序

质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-1200，分辨率70，000，自动增益控制(AGC)目标值5e⁵；酸性工业染料采用负离子模式2700V，其余成分采用正离子模式3800V，离子传输管温度为300℃，鞘气压(N₂)35arb，辅助气压(N₂)10arb，气化室温度350℃；在样品运行前对仪器分别进行正负离子校正；二级采用自动触发模式，分辨率35，000，自动增益控制(AGC)目标值2e⁵，碰撞能量范围25-40％，保留时间根据目标物RT±1.0min。

4、浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

X＝2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L

V—定容体积，单位为mL；

m－试样体积或质量，单位为g。

5、验证试验

仪器分析技术随着质谱的发展和推广，一次分析检测完成多个或多类残留已成为可能。工业染料检测正逐渐由用液相色谱-三重四级杆质谱(LC-MS/MS)进行目标型检测向用高分辨质谱(HRMS)进行精确质量非目标型全扫描检测转变。全扫描高分辨质谱仪与常规三重四级杆质谱的区别在于，它不需要已知待测化合物的特征离子碎片，而是直接采用高分辨率和高准确度质量数(分辨率在70,000以上)对待测样品进行非定向和未知化合物的全扫描实验，需要增加目标化合物时，不必再次处理样品和进样，重新分析已有的全扫描数据即可，通过再打碎得到MS/MS谱图建立数据库，特别适合建立高通量的检测筛查。QExactive质谱仪还配备了全自动筛选软件ExactFinder^TM。

Exactfinder是一款基于高分辨色谱质谱联用的数据处理辅助软件，用于多组分同时筛查及定性定量分析。对化合物的定性确认，除了质量误差在5ppm以内精确质量数外，Exactfinder还提供保留时间、同位素分布、主要二级碎片确认和二级质谱图相识度比对等多种方法，综合判断，以得到准确度定性结果，避免假阳性检测结果的出现。Q-Exactive能够得到化合物准确的同位素峰形，可以用来作定性确认，部分标准物质的色谱图见图1。

二、实验结果分析

1、提取溶剂及比值的选择

采用的提取溶剂依次为5mL水，20mL甲醇-三氯甲烷(1:1,v:v)。3种溶剂的极性覆盖广，范围完全满足92种工业染料的提取要求。其中，水溶液很好的保证了强亲水性的含磺酸根酸性工业染料的提取效率，然后通过甲醇，进一步提取得到极性偏弱的碱性染料和中性染料(分散染料和苏丹染料)，并可以很好地沉淀提取液中的蛋白质组分，甲醇的溶解性好、渗透强已经成为食品基质中提取常用溶剂，三氯甲烷提取的部分则主要包括低极性的苏丹类染料。

该混合溶液无需添加任何盐类化合物，在固定比值下，即：三氯甲烷-甲醇-水(1:1:0.5,v:v:v)会主动分层为水相层-有机相层。实验中尝试了不同比值下三氯甲烷-甲醇-水的分层情况，包括：三氯甲烷-甲醇-水(1:2:1,v:v:v)，三氯甲烷-甲醇-水(1:2:0.5,v:v:v)，三氯甲烷-甲醇-水(1:1:1,v:v:v)和三氯甲烷-甲醇-水(1:1:0.5,v:v:v)。结果表明：在甲醇溶剂占比为2的情况下，该混合溶液均匀分配，在高速离心情况下也很难达到分层的效果；在甲醇溶剂占比为1时，即：三氯甲烷-甲醇-水(1:1:1，v:v:v)和三氯甲烷-甲醇-水(1:1:0.5，v:v:v)，混合溶液会主动分层为水相(上层)-有机相(下层)，由于甲醇与水的互溶性更高，混匀后，甲醇会逐级进入到水相层中，有机相层则主要是指三氯甲烷。该方法选择的硅藻土柱型号为Chromabond XTR(1000mg)，考虑到柱子的负载情况，在水相上样量大于15mL时，柱子达到饱和并渗出，水溶液的渗出会导致最后的氮吹浓缩过程大大延长。另外，当上样量为10mL及以下的时候，柱子的填料未充分浸入水溶液，大大降低了柱子的利用率，同时对于待测物本就很低的检出限量来说，也增加了仪器检出的难度。因此，本研究最终将提取溶剂确定为5mL水，20mL甲醇-三氯甲烷(1:1，v:v)，三氯甲烷-甲醇-水体积占比为1:1:0.5。

2、有机提取液的添加量对回收率的影响

在分级提取过程中，水相提取液是亲水性酸性染料以及部分强极性染料高提收率的前提，甲醇-三氯甲烷作为有机提取液，其加入量则对中、低极性工业染料的提取率有很大的影响。该方法通过向液体基质饮料和固体基质鱼肉样品中添加92种禁限用工业染料，通过加入不同体积的有机提取液，即5mL，10mL，20mL和30mL考察有机提取液添加体积对上述待测物添加回收率的影响。结果表明，酸性染料主要存在水相提取液中，提取率受有机提取液加入量影响不大，回收率稳定维持在60-80％之间；碱性染料和中性染料的提取率受有机提取液占比的影响很大，当体积为5mL和10mL时，提取效率低，回收率低于60％，乙腈体积为20mL和30mL时，提取率趋于稳定，能达到80％以上，考虑到鱼肉样品中脂肪成分的影响，最终确定其加入量为20mL(图2和图3)。以代表性的4类工业染料为例，包括酸性染料：橙G，酸性蓝1，酸性蓝113；碱性染料：碱性橙2，碱性红1，碱性紫；分散染料：分散蓝3，分散黄3，分散橙13；苏丹染料：苏丹红197，苏丹R，苏丹红IV，保留时间范围完全涵盖了上述4大类工业染料的洗脱时间。从图2和图3可见，4大类的代表性工业染料在饮料基质(图2)和鱼肉基质(图3)中的回收率均平稳地保持在60％以上。

3、净化条件的选择

经过三氯甲烷-甲醇-水按照固定比例提取后，分配得到分层后的两相：水相(上层)和有机相(下层)。水相层上样后，水溶液在化学惰性的基质颗粒表面，分散形成覆盖于其上的薄层，水相中的待测染料分布在载体表面的水相薄层中。采用下层有机提取液进行初次洗脱，再加入10mL*2甲醇进行洗脱，在两相之间形成一个高比表面积的界面，通过甲醇的逐级渗入，化合物则按照极性大小依次完成洗脱。然而含多个磺酸根的酸性化合物，具有强烈的亲水性，甲醇难以完成洗脱，所以实验前对现有硅藻土柱进行了改进，通过填充聚酰胺粉，专一性的保留住含磺酸根的酸性染料，最后倒置出聚酰胺粉，通过调节pH值解吸附。整个过程水溶液均保留在硅藻土柱上，得到的洗脱液(甲醇)可直接通过氮气完成浓缩，过滤后无需进一步净化，如图4所示。

通过向液体基质饮料和固体基质鱼肉样品中添加上述92种工业染料，考察上述方法对待测物添加回收率的影响。结果表明，在上述两种基质中，4类工业染料的回收率趋于稳定，均能达到60％以上。以代表性的4类工业染料为例，包括酸性染料：橙G，酸性蓝1，酸性蓝113；碱性染料：碱性橙2，碱性红1，碱性紫；分散染料：分散蓝3，分散黄3，分散橙13；苏丹染料：苏丹红197，苏丹R，苏丹红IV，保留时间范围完涵盖了上述4大类工业染料的洗脱时间。从图5可见，4大类的代表性工业染料在饮料和鱼肉基质中的回收率均平稳地保持在60％以上，除酸性染料外，其他类别染料的回收率则能达到80％以上，充分验证了该净化方法的可行性。

4、洗脱体积的优化

洗脱液主要来自于两部分，第一部分是硅藻土柱上吸附的碱性染料和中性染料(分散染料和苏丹染料)的洗脱，另一部分是聚酰胺粉上酸性染料的解析附。实验中分别考察甲醇作为洗脱溶剂的添加量10mL,10mL*2和10mL*3对硅藻土柱吸附化合物回收率的影响。同时，考察了氨水的添加量5％氨水-甲醇，10％氨水-甲醇和15％氨水-甲醇对聚酰胺粉上吸附化合物回收率的影响。

以代表性的4类工业染料为例，包括酸性染料：橙G，酸性蓝1，酸性蓝113；碱性染料：碱性橙2，碱性红1，碱性紫；分散染料：分散蓝3，分散黄3，分散橙13；苏丹染料：苏丹红197，苏丹R，苏丹红IV，保留时间范围完全涵盖了上述4大类工业染料的洗脱时间。由图6可见，当甲醇体积为10mL*2和10mL*3，代表性的3类工业染料(碱性染料，分散染料，苏丹染料)回收率均平稳地保持在70％以上；氨水添加量为10％时，代表性的酸性染料回收率均平稳地保持在60％以上。从节约氮吹浓缩的时间和成本的角度出发，确定甲醇作为洗脱液的洗脱体积为10mL*2，10％氨水-甲醇用于聚酰胺粉上酸性染料的解析附。

5、液相质谱条件的优化

92种禁限用工业染料种类和性质差别较大，为防止在混和标准溶液进样时不同性质化合物发生相互反应，根据各物质的性质将其分为4组：第一组为31种酸性染料，第二组为33种碱性染料，第三组为30种中性染料，包括：19种分散染料和11种苏丹染料。参照待测化合物的电离性质，通过流动注射泵连续进样，对每种工业染料的单标溶液进行全扫描，确定每种染料的电离方式和分子离子峰。其中酸性染料类化合物采用ESI-模式,其余化合物采用ESI+模式。

在流动相中加入0.1％甲酸能增加正离子检测模式下化合物的电离效率,促进[M+H]+离子生成，因此，针对正离子模式下检测的工业染料，添加了0.1％甲酸，同时也进一步考察了甲酸铵缓冲液离子强度的影响，甲酸铵溶液浓度从2mmol/L变化到10mmol/L的结果表明，以甲醇-5mmol/甲酸铵溶液(0.1％甲酸)作为流动相时获得了最优的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应。全过程选择梯度洗脱方式，通过优化流动相梯度洗脱条件实现了92种工业染料的有效分离。另外，比较了Hypersile Gold C18色谱柱和Hypersile Gold C8色谱柱，发现两柱只显示出组分保留时间的差异，在分离度方面均可满足质谱检测的需要。另外，针对2款不同规格的色谱柱进行了比较：100mm×2.1mm，1.9μm和100mm x 2.1mm，3μm，同样压力下，结果也只显示出保留时间的极小差异，由于小粒径色谱柱流速更低，可以很好的节约有机溶剂，因此最终选择色谱柱为Hypersile Gold C18(100mm×2.1mm，1.9μm)。

6、加标回收结果分析

将工业染料标准品添加在不同的样品基质中，采用自动触发模式采集提取离子流色谱图和全扫描二级质谱图。通过与建立的目标数据库中化合物的分子式对应的质量数匹配、同位素丰度匹配，并结合色谱保留时间，二级碎裂片段，所有样品基质加标与标准品的二级质谱图碎片质量数和丰度基本一致。二级全扫描质谱的使用提高了定性的准确性，进一步降低了假阳性出现的几率。各工业染料的线性范围在0.01～0.5μg/mL，测定低限为0.04～0.2mg/kg，加标回收率在60％～120％范围，标准偏差在15％以内。结果表明，本方法对液态饮料、鱼肉、虾、糕点等食品基质具有较强的适用性，可一步式解决无论是亲脂性还是亲水性的工业染料提取、净化工作。

表2 92种工业染料在饮料，鱼和糕点中的添加浓度及其回收率的实验数据

综上所述，本方法基于三氯甲烷-甲醇-水(1:1:0.5，v:v:v)按照固定比例提取后，分配得到分层后的两相：水相(上层)和有机相(下层)，利用硅藻土柱对水分子的特有保留，和聚酰胺粉对磺酸根亲水化合物的氢键吸附，通过一次前处理，实现了理化性质差异很大的常见4大类，共计92种工业染料的提取、净化工作，并通过高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive)对该体系的效果进行了评价。高分辨率质谱在复杂基质样品分析中消除了基质干扰，提高了定量的准确性，自动触发模式提供的二级碎片进一步提高了定性的准确性。方法的检测低限可满足国内外相关工业染料限量的要求，可作为一种快速筛选和确证检测技术广泛使用。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品前处理

A.称取5.00g样品加水定容至5mL提取，再加入20mL体积比为1：1的甲醇-三氯甲烷溶液，震荡提取5min，以4500r/min离心5min，得到水相、有机相及残渣；

B.取水相层上顶部均匀分布有聚酰胺粉的硅藻土柱，上样后平衡15分钟后，采用步骤A得到的有机相进行洗脱，再用甲醇上柱洗脱2次，每次10ml，收集洗脱液用纯甲醇定容至20ml；

C.倒置出硅藻土柱顶部的聚酰胺粉于离心管中，加入体积比为1：9的氨水-甲醇溶液10mL，震荡5min，以4500r/min离心5min，收集离心所得液体；

D.将步骤B得到的定容液和步骤C收集的液体各取一半，混匀，氮吹至<5ml，用甲醇定容至5ml，高速离心，待分析；

(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A.混合标准溶液组成

酸性染料类包括酸性蓝3，酸性绿16，酸性蓝1，酸性红52，酸性红27，酸性蓝113，酸性蓝7，甲基橙，酸性橙20，酸性红1，诱惑红，酸性红26，酸性蓝90，酸性红51，直接蓝86，考马斯亮蓝R250，酸性橙3，酸性黄17，酸性蓝41，酸性红87，酸性蓝9，酸性紫43，酸性蓝74，藏花橙，橙黄II，橙G，直接黑38，活性艳蓝KN-R，铬蓝SE；

碱性染料类包括碱性红1，碱性绿1，碱性红9，碱性紫，碱性蓝9，碱性橙22，碱性橙2，碱性蓝12，碱性蓝17，碱性蓝1，结晶紫内酯，结晶紫，隐色结晶紫，孔雀石绿，隐色孔雀石绿，碱性蓝7，碱性蓝26，碱性蓝11，碱性黄1，碱性嫩黄O，碱性紫10，碱性品红，还原红6B，甲苯胺红，对位红，中性红，新品红，碱性红2，碱性橙21，天青，罗丹明110，杨梅红，亮绿；

分散染料类包括分散黄23，分散黄54，分散黄3，分散黄9，分散橙3，分散橙1，分散橙76，分散橙13，分散橙25，分散橙149，分散红1，分散红19，分散红11，分散蓝124，分散蓝35，分散蓝60，分散蓝106，分散蓝3，分散蓝14；

苏丹染料类包括苏丹蓝II，苏丹红7B，苏丹橙G，苏丹黑B，苏丹R，苏丹红197，溶剂黄56，苏丹红I，苏丹II，苏丹红III，苏丹红Ⅳ；

将上述酸性染料类、碱性染料类、分散染料类和苏丹染料类4大类标准品分别称取适量，其中酸性染料类用水溶解、苏丹红Ⅳ用二氯甲烷溶解后，分别用乙腈定容，其它染料均用乙腈直接定容配制成10mg/L的混合标准溶液；

B.基质标准曲线定量：

在空白样品中分别加入上述4大类混合标准溶液，浓度范围为0ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；

(3)色谱及质谱条件

液相条件：色谱柱Hypersil Gold C₁₈，流动相A：含有0.1％甲酸+5mM甲酸铵的水溶液，流动相B：含有0.1％甲酸+5mM甲酸铵的甲醇-水溶液，其中甲醇-水溶液体积比为95:5，流速：0.3mL/min，进样量：10μL，梯度见下表1，

表1正、负离子模式HPLC洗脱程序

；

质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z100-1200，分辨率70，000，自动增益控制目标值5e⁵；酸性工业染料采用负离子模式2700V，其余成分采用正离子模式3800V，离子传输管温度为300℃，鞘气压N₂为35arb，辅助气压N₂为10arb，气化室温度350℃；

(4)浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式得到：

X＝2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L

V—定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g。

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