CN111751460A - 一种快速测定食用油脂中苯并(a)芘的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速测定食用油脂中苯并(a)芘的方法，基于固相萃取技术处理样品后，将样品进入液相色谱‑串联质谱，以十八烷基硅烷键合硅胶和弗罗里硅土填料装填的复合固相萃取柱为净化技术，考察了固相萃取柱填料类型、填料用量、洗脱溶剂、洗脱体积等因素对提取效率的影响，并对液相色谱条件和质谱条件优化。本发明操作简便、快速、准确度高，检出限能满足食用油脂中苯并(a)芘残留的检测要求，分析成本低，可为其他产品中的苯并(a)芘测定提供参考。

Description

一种快速测定食用油脂中苯并(a)芘的方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种快速测定食用油脂中苯并(a)芘的方法，尤其是一种基于固相萃取技术快速测定食用油脂中苯并(a)芘液相色谱-串联质谱的方法。

背景技术

苯并(a)芘简称Bap，又名3,4-苯并芘，是一种由五个苯环构成的多环芳烃。苯并(a)芘是一种强致癌物质，它是有机化合物在高温条件下发生聚合反应产生的，食用油脂本身并不含有或含有很少的苯并(a)芘，但在种植、加工、运输和烹调过程中，往往受到污染，而食用油脂中苯并(a)芘检测的难点在于去除脂质干扰。目前中性氧化铝、活性硅胶、PSA、大分子共聚物等已被用于食用油脂中苯并(a)芘净化处理，但需大量使用正己烷、二氯甲烷等试剂，样品处理过程较为复杂，成本较高。因此开发操作简单、快速、无毒、成本低廉的前处理方法有重要的意义。

食用油脂中苯并(a)芘的分析方法主要有免疫学法、表面增强拉曼光谱、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)(史巧巧，席俊，陆启玉，食品中苯并芘的研究，食品工业技术，2014(35)，05:379-386)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)(林亚楠，李诗言，崔益玮，分子印迹固相萃取/液-质谱联用法测定烟熏鲟鱼中苯并芘，中国食品学报，2020，23(03)：251-257；章骅，陈旭艳，张靓文，在线净化-液相色谱法快速测定熏烤水产品中的苯并(a)芘，食品研究与开发，2020，41(02):124-128)等。由于食用油成分复杂，其中苯并(a)芘含量又较低，存在大量的干扰物质，因此灵敏度高，抗干扰强的检测方法也是必要的。GC-MS法由于灵敏度不高，热稳定性较差，在很多时候使用受到了限制。高效液相色谱法定性能力不够；表面增强拉曼光谱还不够成熟，应用较少，定量分析时还不够准确；免疫学检测灵敏度不高；LC-MS/MS法却能同时提高灵敏度和提升定性能力。

发明内容

为解决现有的技术问题，本发明提供一种快速测定食用油脂中苯并(a)芘的方法，该方法基于固相萃取技术处理食品油脂样品，采用内标法通过液相色谱-串联质谱测定食用油脂中的苯并(a)芘，前处理方法简单、成本低廉、净化效果好、快速、准确度高。

本发明的目的之一在于提供一种快速测定食用油脂中苯并(a)芘的方法，包括建立苯并(a)芘的标准曲线，采用固相萃取柱处理食用油脂样品处理后，采用内标法将待测溶液注入液相色谱-串联质谱中进行测试。具体包括以下步骤：

步骤1)准确称取苯并(a)芘标准品，加入溶剂A，配制成2～8个不同浓度的标准溶液，注入液相色谱-串联质谱中进行测试，绘制苯并(a)芘的标准曲线；

步骤2)向食物油脂样品加入内标苯并(a)芘-D12溶液混匀后，直接进入固体萃取柱中，用溶剂B进行洗脱，收集全部流出液体，将得到的洗脱液经浓缩处理后得到浓缩液；

步骤3)将步骤2)得到的浓缩液注入液相色谱-串联质谱仪，测定食用油脂中苯并(a)芘的含量；

其中，步骤1)中所述的溶剂A选自乙腈、甲醇、石油醚中的至少一种，优选选自乙腈、甲醇中的至少一种；步骤1)中所述的标准溶液的浓度为0.5～20.0ng/mL；步骤2)中所述的内标苯并(a)芘-D12溶液浓度为1～10μg/mL；步骤2)中所述的溶剂B选自甲醇、乙腈、正己烷、石油醚中的至少一种，优选选自乙腈、甲醇中的至少一种；步骤2)中，以每克食物油脂的质量来计，所述的内标苯并(a)芘-D12溶液加入量为0.5～10ng，优选为5～10ng；所述的溶剂B用量为7.5～30mL，优选为10～15mL；所述的浓缩液体积为1～2.5mL，优选为1～2mL。从固相萃取柱中得到的洗脱液，可以采用常用浓缩方式、在常用的浓缩仪器中来实现，如旋转蒸发仪、氮吹仪等。

苯并(a)芘属于弱极性化合物，本发明选择甲醇和乙腈做洗脱溶剂，结果表明，乙腈做洗脱剂时，峰形规则，基线噪声小，响应大，可能是由于乙腈极性更弱，洗脱能力更强；而且，洗脱溶剂B用量过少的话，目标物洗脱不完全，回收率低，而洗脱溶剂B用量过大会导致一些油脂被洗脱下来，从而干扰检测，因此，溶剂B用量优选为10～15mL。

本发明提供的测定方法中采用固体萃取柱处理食品油脂样品，固体萃取柱的填料选自十八烷基硅烷键合硅胶(C18填料)、乙二胺-N-丙基硅胶(PSA)、活性硅胶、二乙稀苯/N-乙烯基吡咯烷酮聚合物、中性氧化铝、弗罗里硅土、氨丙基键合硅胶中的至少一种，优选选自十八烷基硅烷键合硅胶、乙二胺-N-丙基硅胶、弗罗里硅土中的至少一种，更优选选自十八烷基硅烷键合硅胶和弗罗里硅土。上述填料中，C18填料、PSA、弗罗里硅土填料净化后目标物图谱干扰较小，且C18填料和弗罗里硅土填料处理后回收率较高，结合成本考虑，本发明优选选择C18和弗罗里硅土作为固相萃取柱的填料，十八烷基硅烷键合硅胶和弗罗里硅土的质量比为1:1～1:2。上述固体萃取柱中可以先填入C18填料，再填入弗罗里硅土或已混合食物油脂样品的弗罗里硅土。

本发明待测的食品油脂样品可以直接注入采用上述已填入C18填料和弗罗里硅土的萃取柱中，也可以将食品油脂加入到弗罗里硅土中搅拌均匀后填入到已装有C18填料的萃取柱中。

上述方法中，步骤2)中的浓缩液还需经有机滤膜过滤，得到待测溶液，再注入液相色谱-串联质谱中进行测试，其中，所采用的有机滤膜孔径为0.22～0.45μm。

上述方法中，所述的液相色谱中色谱柱流动相流速0.2～0.8mL/min，优选为0.6～0.8mL/min；流动相选自乙腈-水、甲醇-水中的至少一种，优选选自乙腈-水；液相色谱采用梯度洗脱程序，梯度洗脱程序为：0～1min，60％乙腈；1～1.5min，60％乙腈-80％乙腈；1.5～3.5min，80％乙腈；3.5～4.5min，80％乙腈-50％乙腈；4.5～5.5min，60％乙腈保持1min；柱温为30～40℃。

上述方法中，质谱检测条件为：

离子源：正离子模式；

离子源温度：600～700℃；

气帘气：50psi；

喷雾器：40psi；

驻留时间：80～200ms；

扫描方式：多反应监测；

裂解电压：120～145V；

碰撞能量：60～100eV；

检测离子对：m/z253＞m/z250，m/z253＞m/z224，m/z253＞m/z200，其中，离子对m/z253＞m/z250的最优裂解电压为130V，最优碰撞能量为70eV；离子对m/z253＞m/z224的最优裂解电压为135V，最优碰撞能量为90eV；离子对m/z253＞m/z200的最优裂解电压为135V，最优碰撞能量为90eV。

上述质谱检测过程中，检测溶液驻留时间长短会影响灵敏度，如果驻留时间太短，固定时间内通过质量分析仪到达检测器的粒子数太少，不能真实再现原始峰形，且响应太小；如果驻留时间太长，会影响峰形。结合循环时间，本发明选择80ms、100ms、120ms、200ms四个驻留时间进行优化，结果表明，驻留时间优选100～120ms最合适。

本发明中对液相色谱条件进行如下优化：色谱柱的选择：采用大气压化学电离法，选择长度为50mm长的色谱柱，比较不同规格的SB-C18(50×2.1mm1.8μm)、EclipsePlus-C18(50×2.1mm1.8μm)、EC-C18(50×3.0mm2.7μm)发现，苯并(a)芘在EclipsePlus-C18(50×2.1mm1.8μm)上的图谱峰形较好，响应最高，溶剂效应小；流动相的选择：以乙腈-水和甲醇-水比较流动相对苯并(a)芘的影响，发现乙腈-水作为流动相出峰快，响应高，基质效应小。

为了使出峰时间合理，提高分离度，降低最小检测量及提高分离精度，本发明中设置了梯度洗脱程序，结果显示梯度洗脱后分离效率提高、灵敏度增加。采用本发明提供的方法，整个操作过程进样快，5min内可以完成测试，而且采用内标法定量，灵敏度进一步提高，线性良好，可以获得较好的分析谱图。

本发明利用C18填料和弗罗里硅土填料分层装填的自制复合固相萃取柱净化，建立了一种液相色谱-串联质谱法测定食用油脂中苯并(a)芘的方法，试剂消耗少，基质干扰弱，方法性能指标可满足实际检测需求，可用于批量样品的高通量筛查，提高工作效率，也可用于突发食品中毒分析，保证了准确度和灵敏度，也为其他食品中苯并(a)芘的检测提供了新的选择，具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1～3为苯并(a)芘的液相色谱-串联质谱谱图，其中，图1为苯并(a)芘总峰图；图2为苯并(a)芘子离子峰图，三条曲线自上而下依次为苯并(a)芘离子对m/z253＞m/z250，m/z253＞m/z224，m/z253＞m/z200；图3为苯并(a)芘子离子棒状图；

图4～6为苯并(a)芘-D12的液相色谱-串联质谱谱图，其中，图4为苯并(a)芘-D12总峰图；图5为苯并(a)芘-D12子离子峰图；图6为苯并(a)芘-D12子离子棒状图；

图7为苯并(a)芘的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

实施例中所采用的测试仪器：

Agilent-1260-6430液质联用仪，安捷伦科技有限公司

实施例中所采用的试剂来源如下：

苯并(a)芘标准品：100μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司

苯并(a)芘-D12标准品：100μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司

乙腈(色谱纯)：德国默克有限公司

十八烷基硅烷键合硅胶(C18填料)：无锡科奥美萃生物科技有限公司

弗罗里硅土：无锡科奥美萃生物科技有限公司

实施例1：液态食用油脂中苯并(a)芘的测定

(1)标准曲线配制：苯并(a)芘标准储备溶液的制备：准确移取1mL100μg/mL苯并(a)芘标准品于10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度线，-20℃保存备用。内标苯并(a)芘-D12标准储备溶液的制备：准确移取1mL100μg/mL苯并(a)芘-D12标准品于10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度线，-20℃保存备用。取适量苯并(a)芘标准储备液逐级稀释配置成为浓度为：0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL的标准工作溶液。

(2)样品前处理：称取约0.4g液体食用油脂(福临门玉米油，市售)，加入4μL浓度为1μg/mL的内标苯并(a)芘-D12溶液(准确移取1mL10μg/mL苯并(a)芘-D12标准品于10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度线)，混合均匀后，直接进入由500mgC18填料和1000mg弗罗里硅土填料分层装填的6mL复合固相萃取柱中，用6mL乙腈洗脱，收集全部流出液，浓缩至0.4mL，经0.45μm有机滤膜(

科晶生物科技有限公司)过滤，供液相色谱-串联质谱仪分析。

(3)液相色谱-串联质谱测定：将上述步骤(2)得到的样品溶液与苯并(a)芘标准系列溶液注入液相色谱-串联质谱仪，采用的液相色谱仪器参数条件为：色谱柱：EclipsePlus-C1850×2.1mm1.8μm，流动相：乙腈/水；梯度洗脱程序为：0～1min，60％乙腈；1～1.5min，60％乙腈-80％乙腈；1.5～3.5min，80％乙腈；3.5～4.5min，80％乙腈-50％乙腈；4.5～5.5min，60％乙腈保持1min；流速：0.6mL/min；柱温：30℃，进样量：20μL。

采用的质谱参数条件为：离子源：APCI，正离子模式；离子源温度：600℃；气帘气50psi，喷雾器40psi；驻留时间100ms；扫描方式：多反应监测MRM，苯并(a)芘离子对m/z253＞m/z250，m/z253＞m/z224，m/z253＞m/z200，Fragmentor分别为130V，135V，135V，CollisionEnergy分别为70eV，90eV，90eV；苯并(a)芘-D12离子对m/z265＞m/z259，Fragmentor为145V，CollisionEnergy为80eV。

(4)加标回收率和重复性：选择玉米油作为基质，向基质中添加苯并(a)芘和苯并(a)芘-D12标准储备液进行加标回收率和精密度实验，加标量分别为0.4、1.0、10.0μg/kg每个水平重复三次，结果表明在3个加标量下，苯并(a)芘的回收率为77.5％～94.8％，相对标准偏差(RSD)为0.65％～4.72％，见表1。

加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100％

表1液体油脂不同添加水平对苯并(a)芘加标回收率和精密度的影响

(5)检出限与定量限：以信噪比≥3时的样品浓度为检出限，信噪比≥10时的样品浓度为定量限，本实例中苯并(a)芘检出限为0.1μg/kg，定量限为0.4μg/kg。

实施例2：固态食用油脂中苯并(a)芘的测定

(1)标准曲线配制：操作方法与上述实施例1步骤(1)方法一致。

(2)样品前处理：称取约0.4g固体油脂(牛油，重庆市帅克食品有限公司)，将上述油脂样品加入到1000mg弗罗里硅土，用玻璃棒搅拌混匀后填充到已填入500mgC18填料的萃取柱中，加入6mL乙腈直接进行洗脱，收集全部流出液，浓缩至0.4mL，经0.45μm有机滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪分析。

(3)液相色谱-串联质谱测定：操作步骤、色谱条件与上述实施例1步骤(3)测定方法一致。

(4)加标回收率和重复性：选择牛油作为基质，向基质中添加苯并(a)芘和苯并(a)芘-D12标准储备液进行加标回收率和精密度实验，加标量分别为0.4、1.0、10.0μg/kg每个水平重复三次。结果表明在3个添加量下，苯并(a)芘的回收率为77.5％～93.1％，相对标准偏差(RSD)为1.71％～3.65％。见表2。

表2.固体油脂不同添加水平对苯并(a)芘加标回收率和精密度的影响

(5)检出限与定量限：操作方法与上述实例1步骤(5)方法一致。

结果表明：本发明建立的这种基于固相萃取技术快速测定食用油脂中苯并(a)芘液相色谱-串联质谱的方法，操作简便、快速、试剂消耗少，基质干扰弱，准确度高、成本低廉，检出限能满足食用油脂中苯并(a)芘残留的检测要求，同时也为其他食品中苯并(a)芘的检测提供了新的选择，具有较好的推广应用价值。

Claims (10)

1.一种快速测定食用油脂中苯并(a)芘的方法，包括建立苯并(a)芘的标准曲线，用固相萃取柱处理食用油脂样品，然后采用内标法将待测溶液注入液相色谱-串联质谱中进行测试。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1)准确称取苯并(a)芘标准品，加入溶剂A，配制成2～8个不同浓度的标准溶液，注入液相色谱-串联质谱中进行测试，绘制苯并(a)芘的标准曲线；

步骤2)向食物油脂样品加入内标苯并(a)芘-D12溶液混匀后，直接进入固体萃取柱中，用溶剂B进行洗脱，收集全部流出液体，将得到的洗脱液经浓缩处理后得到浓缩液；

步骤3)将步骤2)得到的浓缩液注入液相色谱-串联质谱仪，测定食用油脂中苯并(a)芘的含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

步骤1)中所述的溶剂A选自乙腈、甲醇、石油醚中的至少一种，优选选自乙腈、甲醇中的至少一种；和/或，

步骤1)中所述的标准溶液的浓度为0.5～20.0ng/mL；和/或，

步骤2)中所述的内标苯并(a)芘-D12溶液浓度为1～10μg/mL；和/或，

步骤2)中所述的溶剂B选自甲醇、乙腈、正己烷、石油醚中的至少一种，优选选自乙腈、甲醇中的至少一种；和/或，

步骤2)中，以每克食物油脂的质量来计，所述的内标苯并(a)芘-D12加入量为0.5～10ng，优选为5～10ng，所述的溶剂B用量为7.5～30mL，优选为10～15mL，所述的浓缩液体积为1～2.5mL，优选为1～2mL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

步骤2)中所述的固体萃取柱中填料选自十八烷基硅烷键合硅胶、乙二胺-N-丙基硅胶、活性硅胶、二乙稀苯/N-乙烯基吡咯烷酮聚合物、中性氧化铝、弗罗里硅土、氨丙基键合硅胶中的至少一种，优选选自十八烷基硅烷键合硅胶、乙二胺-N-丙基硅胶、弗罗里硅土中的至少一种，更优选选自十八烷基硅烷键合硅胶和弗罗里硅土。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

所述的十八烷基硅烷键合硅胶和弗罗里硅土的质量比为1:1～1:2；和/或，

所述的固体萃取柱中先填入十八烷基硅烷键合硅胶，再填入弗罗里硅土或已混合食物油脂的弗罗里硅土。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的浓缩液还需经有机滤膜过滤，得到待测溶液，其中，所述的有机滤膜孔径为0.22～0.45μm。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述的液相色谱色谱柱流动相流速为0.2～0.8mL/min；和/或，

所述的液相色谱流动相选自乙腈-水、甲醇-水中的至少一种；和/或，

所述的液相色谱采用梯度洗脱程序。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述的液相色谱色谱柱流动相流速为0.6～0.8mL/min；和/或，

所述的液相色谱流动相选自乙腈-水；和/或，

所述的梯度洗脱程序为：0～1min，60％乙腈；1～1.5min，60％乙腈-80％乙腈；1.5～3.5min，80％乙腈；3.5～4.5min，80％乙腈-50％乙腈；4.5～5.5min，60％乙腈保持1min；和/或，

所述的梯度洗脱程序柱温为30～40℃。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述的质谱检测条件为：

离子源：正离子模式；

离子源温度：600～700℃；

气帘气：50psi；

喷雾器：40psi；

驻留时间：80～200ms；

扫描方式：多反应监测；

裂解电压：120～145V；

碰撞能量：60～100eV；

检测离子对：m/z 253＞m/z 250，m/z 253＞m/z 224，m/z 253＞m/z 200。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，

驻留时间优选为100～120ms；和/或，

所述离子对m/z 253＞m/z 250的最优裂解电压为130V，最优碰撞能量为70eV；和/或，

所述离子对m/z 253＞m/z 224的最优裂解电压为135V，最优碰撞能量为90eV；和/或，

所述离子对m/z 253＞m/z 200的最优裂解电压为135V，最优碰撞能量为90eV。

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