CN114324701B - 一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速同时测定西红花苷‑1、西红花苷‑2、西红花苷‑3和西红花苷‑4含量的方法，包括以下步骤：1）对照品溶液的制备；2）供试品溶液的制备；3）上色谱柱，色谱柱使用Agilent Poroshell 120 EC‑C18（2.7um，3*150mm）；流动相以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸水为流动相B，梯度洗脱：0~9min，24%~25.5%A，76%~74.5%B；9~15min，25.5%~30%A，74.5%~70%B；15~18min，30%~35%A，70%~65%B；18~26min，35%~40%A，65%~60%B；26~28min，40%~24%A，60%~76%B；流速0.4ml/min；紫外检测器，检测波长440nm；柱温30℃；进样量5ul；4）定性检测；5）定量检测。该方法实现了西红花苷‑1、西红花苷‑2、西红花苷‑3和西红花苷‑4的同时测定，其方法简单、准确度高，大大缩短了检测时间，提高了西红花不同组分的分离鉴定效率。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法。
背景技术
西红花苷是类胡萝卜素西红花酸与糖形成的一系列酯类化合物，仅存在于西红花和栀子中，具有独特的药理活性和经济价值，其主要结构为西红花糖苷，包括西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4等成分，分子结构为：
随着结构中葡萄糖的数量增加，各西红花苷成分的极性相应增强，稳定性降低，而分离难度较高。由于西红花苷中含量最高的组分是西红花苷-1，约占 70%~80%，而与西红花苷相关的药理作用研究也以该组分为主。因此，目前对西红花和栀子药材中西红花苷类组分进行定性定量，一般以西红花苷-1为对照品，常用方法主要包括紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。
紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。用于定量时，通常在待测物质的最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
由于在西红花或栀子中，相对于西红花苷-1的含量，西红花苷-2、西红花苷-3 和西红花苷-4的含量极低。因此，目前常使用西红花苷-1作为标准品配制对照溶液，在440nm下进行检测并将结果近似作为西红花苷的含量，也有通过对样品溶液除杂处理后采用吸收系数法定量的报道。该方法操作简便，成本低廉，但由于西红花苷类成分结构相似，均在440nm处表现最大吸收，因此使用紫外-可见分光光度法不能对各西红花苷类成分的单体实现准确定量。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。一般依据物质的保留时间进行定性，根据物质对应的色谱峰峰高或峰面积通过归一化法、内标法、外标法等方法实现定量。
随着分析科学技术发展，高效液相色谱法已广泛用于栀子和西红花药材中西红花苷的分析测定。由于各西红花苷类化合物结构较为相似，差别仅在于分子中糖基种类和数量的多少，极性相差较小，在常用的反相色谱中难以通过一个实验条件实现对多组分的同时分离。同时，西红花苷类化合物以西红花苷-1和西红花苷-2为主要成分。因此，目前多以高效液相色谱法检测这两种成分来进行栀子和西红花中西红花苷类化合物鉴定及含量测定。此外，在高效液相色谱法的分析过程中一般会消耗大量有机溶剂，易对环境造成污染，且检测耗时可长达60min以上。
液相色谱-质谱联用法以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质色谱图。它体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，应用十分广泛。液相色谱-质谱联用法可实现西红花苷类混合物各成分的同时分离与鉴定，但是该方法需要用到价格昂贵的质谱仪，检测成本较高，难以普及。
综上所述，采用上述检测方法均无法通过一个实验条件实现对西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的同时分离，现有技术中也未见报道有同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，该方法实现了西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的同时测定，其方法简单、准确度高，大大缩短了检测时间，提高了西红花不同组分的分离鉴定效率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，包括以下步骤：
1）对照品溶液的制备：配制含有西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的混合对照品溶液；
2）供试品溶液的制备：取待测样品粉末，配制成供试品溶液；
3）取色谱柱，分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，色谱条件如下：
流动相以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸水溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：
4）将供试品溶液的色谱图和混合对照品溶液的色谱图进行对比，对待测样品中的西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4进行定性检测；
5）取步骤1）制备的混合对照品溶液稀释至系列质量浓度，然后按照步骤3）的色谱条件上样测定，采用外标法进行定量检测。
由于西红花苷-1和西红花苷-2在该类化合物中的含量远高于其他组分，如：西红花苷-3、西红花苷-4和西红花苦苷等，其中西红花苷-1约占70%~80。而这些含量极低的西红花苷成分因结构相似，其分离纯化的难度远高于西红花苷-1和西红花苷-2，直观的体现在于目前市售对照品基本以西红花总苷（总藏红花素）、西红花苷-1（藏红花素）和西红花苷-2为主。因此对西红花、栀子黄色素等富含西红花苷类化合物的药材进行质量评估或功效研究时常以西红花苷-1为代表，也有与西红花苷-2同时分离和检测的报道。目前未见同时检测四种成分的方案报道，本方案以西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4为对照品，使用超高效液相色谱仪，搭配极窄粒径、表面多孔颗粒的C18色谱柱，精准控制0.1%乙酸水溶液和乙腈的梯度洗脱比例，极大地提高了分离度、分析速度和灵敏度，可实现对性质相近的西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4这4种成分的高效分离和快速检测。
进一步，所述步骤5）中外标法的具体操作步骤为：以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，分别得到西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的线性回归方程，将待测样品的峰面积代入线性回归方程，对待测样品中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4进行定量检测。
进一步，所述步骤1）的具体操作步骤为：分别取西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷4适量，精密称定，置于25ml容量瓶中，分别使用50%甲醇将它们配制成质量浓度为100、20、20、20ug/ml的储备溶液；分别精密吸取上述各储备溶液0.60、2.40、2.40、2.40ml于同一个10ml容量瓶中，加入50%甲醇稀释定容，得混合对照品溶液。
进一步，所述步骤2）的具体操作步骤为：取适量待测样品，粉碎后加甲醇提取，过滤后取滤液加入甲醇补足失重，得供试品溶液。
进一步，所述甲醇的浓度为50%，所述待测样品与甲醇的重量体积比为1:10。
进一步，所述提取为超声提取，所述超声提取的时间为30min。
进一步，所述步骤3）中混合对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪的量为5ul。
进一步，所述步骤3）中色谱条件的色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.7um，3*150mm）；流速为0.4ml/min；紫外检测器，检测波长为440nm；柱温为30℃。
进一步，所述步骤5）之后还包括对该测定方法的精密度、稳定性、重复性和加样回收率进行考察。
进一步，所述待测样品为西红花或者栀子。
本发明一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法的有益效果：
（1）本发明采用超高效液相色谱技术并结合本发明中的洗脱程序，对西红花苷不同组分进行分离鉴定，不仅可以实现对多种西红花苷类成分的单体实现准确定性定量，无需价格高昂的质谱仪，其分析速度、分辨率及灵敏度大大提高，有机溶剂的消耗更小，检测误差小，精密度与准确性也较好，而且在检测过程中无需切换多种波长，只需要在一种波长下即可检测鉴定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4，有效减少了检测的步骤，提高了检测效率；
（2）本发明的流动相中选择了与西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4极性更为契合的乙腈与0.1%乙酸水作为流动相，替代了现有技术中常用的甲醇和高浓度甲酸或磷酸，同时通过合适的梯度洗脱程序实现了较短时间内四种组分的分离检测；
（3）本发明的方法操作简便、实用性强、耗时短，可通过一种实验条件对西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4这四种不同成分进行分离鉴定，从而对西红花及不同品种的栀子中的西红花苷各组分及比例进行鉴定，并可为厂商制备西红花苷各成分提供基础实验条件，减少生产制备过程中的经济成本。
附图说明
图1—为混合对照品溶液的色谱图；
图2—为栀子干果制备的供试品溶液的色谱图；
图3—为栀子黄色素制备的供试品溶液的色谱图；
图4—为采用甲洗脱方法考察下的栀子粗提物色谱图；
图5—为采用乙洗脱方法考察下的栀子粗提物色谱图；
图6—为采用丙洗脱方法考察下的栀子粗提物色谱图；
图7—为采用丁洗脱方法考察下的栀子粗提物色谱图；
图8-柱温为25℃考察下的栀子粗提物色谱图；
图9-柱温为30℃考察下的栀子粗提物色谱图；
图10-柱温为35℃考察下的栀子粗提物色谱图；
图11-柱温为40℃考察下的栀子粗提物色谱图；
图12-流速为0.2ml/min考察下的栀子粗提物色谱图；
图13-流速为0.4ml/min考察下的栀子粗提物色谱图；
图14-流速为0.6ml/min考察下的栀子粗提物色谱图；
图15-流速为0.8ml/min考察下的栀子粗提物色谱图；
图16-进样量为1ul考察下的栀子粗提物色谱图；
图17-进样量为2.5ul考察下的栀子粗提物色谱图；
图18-进样量为5ul考察下的栀子粗提物色谱图；
图19-进样量为10ul考察下的栀子粗提物色谱图。
注：色谱图中，1为西红花苷-1的色谱峰，2为西红花苷-2的色谱峰，3为西红花苷-3的色谱峰，4为西红花苷-4的色谱峰。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1
一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，采用超高效液相色谱仪（Agilent 1290 Infinity II），以西红花苷-1（南京景竹生物科技有限公司）、西红花苷-2（南京景竹生物科技有限公司）、西红花苷-3（南京景竹生物科技有限公司）、西红花苷-4（南京景竹生物科技有限公司）的标准品作为对照，对来自栀子干果中的西红花苷类成分含量进行检测。具体包括以下步骤：
1）对照品溶液的制备：分别取西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷4适量，精密称定，置于25ml容量瓶中，分别使用50%甲醇将它们配制成质量浓度为100、20、20、20ug/ml的储备溶液；分别精密吸取上述各储备溶液0.60、2.40、2.40、2.40ml于同一个10ml容量瓶中，加入50%甲醇稀释定容，得到混合对照品溶液；
2）供试品溶液的制备：取适量栀子干果干燥、粉碎后过20目筛，得到栀子粉末。准确称量栀子粉末3g于离心管中，依次加入15ml甲醇和15ml超纯水，混匀，置于超声波清洗器（80%功率，4℃）超声提取30min，经滤纸过滤后，取滤液进行0.22um有机系微孔滤膜过滤，得供试品溶液；3）取色谱柱，色谱柱使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 （2.7um，3*150mm）分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5ul注入超高效液相色谱仪，色谱条件如下：
流动相以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸水溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：
流速为0.4ml/min；紫外检测器，检测波长为440nm；柱温为30℃。
4）将供试品溶液的色谱图和混合对照品溶液的色谱图进行对比，对待测样品中的西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4进行定性检测；其混合对照品溶液的色谱图如图1所示，供试样品溶液的色谱图如图2所示，由图1和2可知，四种西红花苷成分基本实现基线分离，峰形对称，表明本发明的检测方法可同时将西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4进行鉴定分离；
5）取步骤1）制备的混合对照品溶液稀释至系列质量浓度，分别精密吸取混合对照品系列溶液和供试品溶液各5ul，然后按照步骤3）的色谱条件，注入超高效液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，分别得到西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的线性回归方程，西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的线性回归方程分别为Y1=75.708X+22.329，r=0.9999；Y2=107.81X-0.2591，r=1；Y3=90.806X+19.598，r=0.9992；Y4=33.508X-3.2139，r=0.9998。混合对照品溶液的色谱图如图1所示，栀子干果的色谱图如图2所示，结果表明，西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4分别在1~96、0.2~19.2、0.4~19.2、0.1~19.2ug/ml范围内线性关系良好。
将待测样品的峰面积代入线性回归方程，对待测样品中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4进行定量检测；检测结果为：栀子干果经50%甲醇超声提取后西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4的含量分别为5.16、0.07、0.55、0.04mg/g。
实施例2
本实施例以栀子黄色素为样品，制备供试样品溶液，对栀子黄色素中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4的含量进行测定，其测定方法与实施例1的不同之处仅在于：供试品溶液制备步骤为：精密称取栀子黄色素1mg于10ml离心管中，加入50%甲醇定容，经0.22um有机系微孔滤膜过滤，得100ug/ml供试品溶液。经测定，栀子黄粉末中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4的含量分别为351.56、20.84、42.51、3.37mg/g。
实施例3 方法学考察
本实施例中采用栀子黄色素为样品，制备供试品溶液，对本发明中的测定方法进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率考察，以栀子黄色素为样品的供试品溶液制备步骤为：精密称取栀子黄色素1mg于10ml离心管中，加入50%甲醇定容，经0.22um有机系微孔滤膜过滤，得100ug/ml供试品溶液。采用实施例1中的步骤3）所述色谱条件对该供试品溶液进行色谱检测，其色谱图如图3所示。
（1）精密度考察
按照实施例1中的步骤3）所述色谱条件检测，分别于1d内连续进样6次和连续3d内重复进样3次，测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的峰面积，西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的日内精密度分别为0.32%、0.36%、0.58%、2.70%，日间精密度分别为0.38%、1.33%、0.71%、2.92%，表明仪器精密度良好。
（2）稳定性考察
将制备的供试品溶液置于4°C放置0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、96h后进样，按照实施例1中的步骤3）所述色谱条件测定，结果西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4峰面积的RSD分别为0.38%、0.87%、0.87%、2.90%，表明供试品溶液在96h稳定性良好。
（3）重复性考察
取供试品溶液6份，按照实施例1中的步骤3）所述色谱条件进样分析，计算西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4平均质量分数（n=6）分别为35.16%、2.08%、12.20%、0.34%，RSD分别为7.00%、7.12%、7.32%、10.77%，表明方法重复性良好。
（4）加样回收率
取已知含量的栀子黄色素6份，每份约1mg，精密称定，置25ml容量瓶中，分别精密加入相当于样品成分量100%的各对照品溶液，得到测试样液，根据实施例1中的步骤3）所述色谱条件对该测试样液进样分析，计算西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4平均加样回收率（n=6），结果下表所示，结果表明，西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的回收率平均分别为100.14%、98.91%、100.16%、103.53%，各组分对应的RSD分别为0.58%、1.49%、2.96%、5.11%。
实验例4
本实施例采用实施例3制备的供试品溶液对本发明的检测方法中色谱检测的洗脱方法、柱温、流速和进样量进行单因素实验考察。
1、洗脱方法的考察
分别采用甲、乙、丙、丁四种洗脱方法对供试样品溶液中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的分离效果进行考察。
甲：以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸水为流动相B，等度洗脱：0~40min，23%A；
乙：以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸水为流动相B，梯度洗脱：0~3min，20%~23%A；3~12min，23%~26%A；12~14min，26%~46%A；14~16min，46%~56%A；16~19min，56%~20%A；19~20min，20%A；
丙：以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸水为流动相B，梯度洗脱：0~9min，24%~25.5%A；9~15min，25.5%~30%A；15~18min，30%~35%A；18~26min，35%~40%A；26~28min，40%~24%A；
丁：以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸水为流动相B，梯度洗脱：0~12min，24%~26%A；12~14min，26%~31%A；14~30min，31%~35%A；30~35min，35%~24%A。
采用甲、乙、丙、丁四种洗脱方法对应的色谱图如图4-7所示，结果表明，甲种洗脱方法中西红花苷-3在检测时间（40min）内未被洗脱，洗脱方法为丙时，4种成分色谱图峰形均较为对称，分离度均好，方法耐用性较好。故确定丙种洗脱方法进行后续考察。
2、柱温的考察
在拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱温为25℃、30℃、35℃、40℃时栀子粗提物中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的分离效果进行考察。色谱图见图8-11。结果表明，柱温在30~35℃时，4种成分色谱图峰形均较为对称，分离度均好，方法耐用性较好。但柱温在25℃或40℃时，对西红花苷-3色谱峰影响较大，故确定柱温为30℃进行后续考察。
3、流速的考察
在拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.2、0.4、0.6、0.8 ml/min时栀子粗提物中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的分离效果进行考察。色谱图见图12-15。结果表明，流速在0.4~0.8 ml/min时，4种成分色谱图峰形均较为对称，分离度均好，方法耐用性较好。但流速在0.2 ml/min时，对西红花苷-3色谱峰影响较大，故确定流速为0.4 ml/min进行后续考察。
4、进样量的考察
在拟定的实验条件基础上，分别对进样量为1、2.5、5、10ul时栀子粗提物中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的分离效果进行考察。色谱图见图16-19。结果表明，进样量在1~10 ul时，4种成分色谱图峰形均较为对称，分离度均好，方法耐用性较好。故确定进样量为5 ul进行后续考察。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备：配制含有西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的混合对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取待测样品粉末，配制成供试品溶液；
3)取色谱柱，分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，所述混合对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪的量为5μl，色谱条件如下：
流动相以乙腈为流动相A，以0.1％乙酸水溶液为流动相B梯度洗脱，色谱柱为AgilentPoroshell 120 EC-C18，2.7μm，3*150mm，流速为0.4ml/min，紫外检测器，检测波长为440nm，柱温为30℃，梯度洗脱程序如下：
；
4)将供试品溶液的色谱图和混合对照品溶液的色谱图进行对比，对待测样品中的西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4进行定性检测；
5)取步骤1)制备的混合对照品溶液稀释至系列质量浓度，然后按照步骤3)的色谱条件上样测定，采用外标法进行定量检测。
2.如权利要求1所述一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：所述步骤5)中外标法的具体操作步骤为：以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，分别得到西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4的线性回归方程，将待测样品的峰面积代入线性回归方程，对待测样品中西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4进行定量检测。
3.如权利要求1所述一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：所述步骤1)的具体操作步骤为：分别取西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4适量，精密称定，置于25ml容量瓶中，分别使用50％甲醇将它们配制成质量浓度为100、20、20、20μg/ml的储备溶液；分别精密吸取上述各储备溶液0.60、2.40、2.40、2.40ml于同一个10ml容量瓶中，加入50％甲醇稀释定容，得混合对照品溶液。
4.如权利要求1所述一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：所述步骤2)的具体操作步骤为：取适量待测样品，粉碎后加甲醇提取，过滤后取滤液加入甲醇补足失重，得供试品溶液。
5.如权利要求4所述一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：所述甲醇的浓度为50％，所述待测样品与甲醇的重量体积比为1:10。
6.如权利要求4所述一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：所述提取为超声提取，所述超声提取的时间为30min。
7.如权利要求1所述一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：所述步骤5)之后还包括对该测定方法的精密度、稳定性、重复性和加样回收率进行考察。
8.如权利要求1-7任一项所述一种快速同时测定西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3和西红花苷-4含量的方法，其特征在于：所述待测样品为西红花或者栀子。
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